ｈＥＲＧチャネル発現細胞
本発明の課題は、薬剤研究開発におけるｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高いｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより高感度・高処理能力を有する評価法を確立することにある。 ｈＥＲＧ遺伝子をレトロウイルスベクタープラスミドあるいはレンチウイルスベクタープラスミドに挿入し、ウイルスベクターを調製後、必要に応じて超遠心による濃縮を行い、細胞にｈＥＲＧ遺伝子を導入、ｈＥＲＧチャネルを発現させることにより、全自動ハイスループットパッチクランプシステムあるいは色素を用いた測定法においても有効な発現量を確保することが可能となった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は安全性の面において薬剤研究開発時に大きな問題となっている心電図ＱＴ間隔延長による心臓への副作用のリスクを回避するための評価細胞とその細胞樹立法およびそれらによる薬物の評価に関するものである。
【背景技術】
安全性薬理試験は、新規医薬品のヒトに対する安全性を薬理学的観点から検討する非臨床試験である。被験物質のヒトに対する安全性の検討と副作用予測などを目的とした安全性薬理試験ガイドラインが日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）において制定されており、そのガイドラインによれば、安全性薬理試験の一環として、被験物質の催不整脈作用、特に心電図ＱＴ間隔延長作用の有無を検討することが求められている。薬物の投与によって引き起こされるＱＴ間隔延長に伴う、心室性頻脈、ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ、および致死的な不整脈から患者を保護するために、このような重篤な副作用を誘発する可能性を有するＱＴ間隔延長作用を検出することは、医薬品開発において非常に重要である。
これまでに、ＱＴ間隔延長作用を有する多くの医薬品は、心筋細胞遅延型整流カリウムチャネルを抑制することが知られており、ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）チャネルがそのチャネルの主たる構成タンパクとして機能していると考えられている。従って、ヒト用医薬品による心室再分極遅延（ＱＴ間隔延長）の潜在的可能性を評価するためのガイドライン（ＩＣＨ−Ｓ７Ｂ）案では、非臨床試験としてｈＥＲＧチャネルを導入した細胞を用いたイオンチャネルアッセイが推奨されている。
従来、ｈＥＲＧチャネルに対する化合物の作用を適切に評価する方法として、ｈＥＲＧチャネルを発現させた細胞またはｈＥＲＧチャネルを本来保持している心筋細胞に対して直接ガラス微小電極を用いてチャネル活性を記録するパッチクランプ法が用いられてきた（Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ ２６０，７７９−８０２，（１９７６））。しかし、このパッチクランプ法は、高い精度でｈＥＲＧチャネルに対する薬物の評価を適切に行えるものであるが、熟練した高度な技術を必要とするものであり、その処理能力は著しく低く（１−５化合物／日／人）、薬剤開発段階での数多くの薬剤候補化合物に対して処理能力が著しく不足しているという問題があった。
一方、ｈＥＲＧチャネルの評価の処理能力を高める方法として、放射性同位元素であるＲｂ３＋の放出を検出する方法（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．ｖｏｌ．２８，１７７−１９１，（２００２））、放射性同位元素であるトリチウム（３Ｈ）で標識したｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅの結合との競合により評価する方法（Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ｖｏｌ．４３０，１４７−１４８（２００１））、および膜電位感受性色素を利用した方法（Ｔａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ ｖｏｌ．６，３２５−３３１（２００１）、Ｂａｘｔｅｒ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．ｉｂｉｄ．ｖｏｌ．７，７９−８５（２００３））などが報告されている。しかし、これらの方法は、放射性物質を用いる点で操作が煩雑であり、また、間接的な検出方法であるために感度および精度が低くなることから、パッチクランプ法で得られるｈＥＲＧチャネル阻害活性の測定精度と大きく乖離していた。
近年、上記問題点を解決する手段としてｈＥＲＧチャネルによる影響を適切に評価しつつ処理能力の高い機器である全自動ハイスループットパッチクランプシステムが開発されており、その中のいくつかの機器（Ｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ＨＴＴＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓＴＭ ７０００Ａ；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）が発売されている。これらの装置は、ｈＥＲＧチャネルを発現した細胞を浮遊状として、重力による落下および陰圧によって、各ウェルの中央にある小径の穴へ細胞を吸引し、電流記録可能な状態にするものであるため、パッチクランプ法のように熟練した高度な技術を必要としない。また、化合物の処理能力も非常に高く、１日に３０００ポイント以上のデータを取得することができる。ただし、この装置を用いて評価するに当たっては、実験に用いるｈＥＲＧチャネル発現細胞が非常に重要になる。すなわち、古典的なパッチクランプ法による測定では、細胞１つ１つを選択して評価するため、ｈＥＲＧチャネルの発現量の高い細胞を選び出して測定することができるのに対し、全自動ハイスループットパッチクランプシステムによる測定では、存在する細胞をランダムに使用するために発現量の高い細胞を選ぶことができない。従って、全自動ハイスループットパッチクランプシステムにより多検体を正確に評価するためには、一定割合以上の細胞がｈＥＲＧチャネルを発現していること、かつ、その発現量も十分に多いことが求められる。そこで、この全自動ハイスループットパッチクランプシステムで使用できるｈＥＲＧチャネル発現細胞を作製するために、種々の試みがなされている。
これまでの報告では、ある細胞にリン酸カルシウム法やリポフェクション法を用いたトランスフェクションによりｈＥＲＧ遺伝子を細胞に導入し、限界希釈によるクローニングおよびｈＥＲＧ遺伝子導入量確認、あるいはｈＥＲＧチャネルによる電流測定等の著しく労働消費的な手順を経て安定発現細胞を得ていた（Ｔａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．ｖｏｌ．６ ３２５−３３１（２００１）、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．１（２−３），１２７−１３５，２００３．）。しかしながら、限界希釈によるクローニングという大変な労力を割いても、これらの手法ではｈＥＲＧ遺伝子導入量が充分でないため、細胞あたりのｈＥＲＧ電流は微弱なものとなる。ｈＥＲＧ電流が小さい場合には、十分なＳ／Ｎ比を取ることができず、その分測定感度は低下することになる。また、クローニングによりいかにｈＥＲＧ電流の大きな細胞を取得しても、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いた場合、そのｈＥＲＧ電流の大きさを高感度に測定することが困難であることが多い。
また、ｈＥＲＧチャネルが分類されるイオンチャンネルの電流の測定では、細胞が内在的にもつイオンチャンネルの影響が細胞種毎に異なるために、細胞種を変えることで測定実用度が大きく影響を受けることが多く、そのために、別種の細胞で測定を行う際にも上記と同様の労働消費的な操作を繰り返す必要があった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、薬剤研究開発におけるｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高いｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより、高感度かつ高処理能力を有する被験物質評価法を確立するものである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ｈＥＲＧ遺伝子をレトロウイルスベクタープラスミドまたはレンチウイルスベクタープラスミドに挿入し、ウイルスベクターを調製後、必要に応じて超遠心による濃縮を行い、細胞にｈＥＲＧ遺伝子を導入することにより、ｈＥＲＧチャネルを高発現する細胞を得ることに成功した。また、この細胞は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムまたは色素を用いた測定法において有効な発現量を確保し得るものであることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のチャネルを発現することができる細胞を、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体の４０％以上含むｈＥＲＧチャネル発現細胞集団。
（２）ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである（１）記載の細胞集団。
（３）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（２）記載の細胞集団。
（４）ｈＥＲＧ電流の細胞全体の平均が０．３ｎＡ以上である（１）から（３）のいずれか１項に記載の細胞集団。
（５）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が１．０ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネルを発現することができる細胞。
（６）ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである（５）記載の細胞。
（７）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（６）記載の細胞。
（８）ウイルスベクターを用いてｈＥＲＧチャネルを発現させることを特徴とする、（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法。
（９）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（８）記載の方法。
（１０）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである（８）記載の方法。
（１１）ウイルスベクターを超遠心により濃縮する工程を含むことを特徴とする、（８）から（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
（１３）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１２）記載の方法。
（１４）（８）から（１１）のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
（１５）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴する（１４）記載の方法。
（１６）（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１７）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１６）記載の方法。
（１８）（８）から（１１）のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１９）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１８）記載の方法。
本発明により、薬剤研究開発におけるｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高い、ｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより高感度で処理能力の高い評価を可能とした。
本発明により、同時に効率よくｈＥＲＧチャネルの高発現細胞を得られることを利用して、多様な細胞種に対してｈＥＲＧチャネルを高レベルで発現させることにより、各細胞種間で内在性のイオンチャンネルの影響を比較することで、薬剤研究開発における副作用予測を行う上で最も適切な細胞種を選択することを可能としている。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＸＩＰ）の構造を示す。
図２は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＸＩＨ）の構造を示す。
図３は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩＰ）の構造を示す。
図４は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨ）の構造を示す。
図５は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇ）の構造を示す。
図６は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮ）の構造を示す。
図７は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ａＩＮ）の構造を示す。
図８は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＨ）の構造を示す。
図９は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＰ）の構造を示す。
図１０は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ）の構造を示す。
図１１は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ））の構造を示す。
図１２は、レンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳ）の構造を示す。
図１３は、レンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２Ｇ）の構造を示す。
図１４は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ）の構造を示す。
図１５は、ウェスタンブロット法によるｈＥＲＧチャネルタンパクの検出結果を示す。（Ｌａｎｅ１：ｎｏｒｍａｌ ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｌａｎｅ２：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｌａｎｅ３：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株）
図１６は、ｈＥＲＧ電流の分布を表す。（Ａ：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｂ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、Ｃ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株）
図１７は、カットオフ値を設定して解析したｈＥＲＧ電流の分布を示す。（Ａ：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｂ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、Ｃ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｄ：レンチウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞群）
図１８は、既知化合物のｈＥＲＧ阻害活性を表す。
図１９は、ＫＣｌおよびｈＥＲＧ阻害剤であるＥ４０３１およびＤｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅによる膜電位変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
本発明において、レトロウイルスベクタープラスミドまたはレンチウイルスベクタープラスミドを利用してｈＥＲＧ遺伝子を含むウイルスベクターを調製し、得られたウイルスベクターによって細胞にｈＥＲＧチャネルを高発現させることができる。本発明は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムまたは色素を用いた測定法において、本発明により得られるｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を用いることにより、ｈＥＲＧ電流を阻害する物質を同定することができる。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
本発明において、パッチクランプ法とは、細胞膜上に存在するイオンチャネルを通過するイオンの流れを高感度で検出する手法である（新パッチクランプ実験技術法、岡田泰伸編、吉岡書店）。また、本発明において古典的なパッチクランプ法とは、高度な技術を要する研究員が、顕微鏡観察下で、直径０．５〜３μｍのガラス微小電極を細胞に押し当てて、非常に高い抵抗状態を作り上げた後にそのパッチを破壊することで、細胞膜表面上に存在するイオンチャネルを流れる電流を記録するホールセルパッチクランプ法である。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法とは、細胞をＰＢＳ等に浮遊状態で測定装置にセットし、アンフォテリシンＢ等を用いて細胞膜表面に穿孔を形成させ、細胞表面に存在するイオンチャネルを通って流れるイオンの動きを電流として検出する穿孔ホールセルパッチクランプ法である。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムとは、浮遊状にした細胞を、重力による落下および陰圧によって、各ウェルの小径の穴へ吸引し、電流記録を可能とする装置をいう。全自動ハイスループットパッチクランプシステムとしては、例えば、Ｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ＨＴＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓＴＭ ７０００Ａ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）があげられる。
本発明において、ｈＥＲＧチャネルとは、心筋細胞における遅延整流型カリウムチャネルの構成タンパク質の一つであり、詳細については後述する。
本発明において、ｈＥＲＧ電流とは、細胞膜表面に存在するｈＥＲＧチャネルを流れるカリウムイオンの流れのことである。このチャネルは、心臓において、心筋細胞の電気的な興奮を鎮めるために重要な役割を担っている。また、このｈＥＲＧ電流を抑制する薬剤は、重篤な心室性不整脈を誘発する危険性があるという理由により、市場からの撤退を余儀無くされる。従って、新規薬剤の開発において、このｈＥＲＧチャネルに対する作用がない、もしくは極力弱い薬剤の開発が必須となっている。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流とは、ｈＥＲＧチャネルを発現した細胞の膜電位を変化させた時に観察されるイオン電流をいう。より具体的には、細胞の膜電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、引き続き−５０ｍＶに１秒間変化させた時に検出されるイオン電流であり、このｈＥＲＧ電流の大きさとしては、−５０ｍＶに変化させた時に観察される末尾電流のピーク値をｈＥＲＧ電流の大きさとする。
本発明において、ｈＥＲＧチャネル発現細胞とは、ｈＥＲＧチャネルを発現している細胞をいう。以下にｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団の作製方法を記載する。
＜ｈＥＲＧチャネル＞
本発明において細胞に発現させるｈＥＲＧチャネルは、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）を含むものである。
以下、本発明のポリペプチドについて詳細に説明する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において１個または複数個（例えば１個または数個）のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じたアミノ酸配列であって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において１個または複数個（例えば１個または数個）のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じたアミノ酸配列としては、例えば、（ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
また、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されるポリペプチドも、本発明の範囲に含まれる（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９−１３）。
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のｈＥＲＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ）、非荷電性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ）、中性アミノ酸（Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｇｌｙ）、分枝アミノ酸（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、ヒドロキシアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ，Ｍｅｔ）、芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、複素環式アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ）、イミノ酸（Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ）等に分類することができる。
従って、非極性アミノ酸同士、あるいは非荷電性アミノ酸同士で置換させることが好ましい。中でも、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒおよびＴｈｒの間、ＡｓｐおよびＧｌｕの間、ＡｓｎおよびＧｌｎの間、ＬｙｓおよびＡｒｇの間、ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数および部位は特に制限ない。
このような配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、ＧＰＩアンカー形成、架橋、γ−カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、タンパク質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ＡＤＰ−リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。
さらに、本発明のポリペプチドには他のペプチド配列により付加された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、サブスタンスＰ、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、プロテインＣ断片、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリン定常領域断片、α−チューブリン断片、β−ガラクトシダーゼ、Ｂ−タグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｈｃｎｏｌ．６：１２０４−１０）、ｌｃｋタグ、ｐ１８ ＨＩＶ断片、ＨＳＶ−タグ（ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、Ｔ７−タグ（Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質）、ＶＳＶ−ＧＰ断片（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質）等のタンパク質の識別を容易にする配列、組換え技術によりタンパク質を発現させる際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
本発明のポリペプチドとしては、以上のようなポリペプチドがあげられ、例えば、前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質のｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドなどが好ましい。ここで、「ｈＥＲＧ活性」とは、カリウムイオンチャネルとして機能する活性を意味する。実質的に同質の活性とは、その活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
＜ｈＥＲＧ遺伝子＞
本発明において、ｈＥＲＧ遺伝子とは、ｈＥＲＧチャネルをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドをいう。本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むものである。配列番号１で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、前記本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば何でもよい。例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。また、天然以外の塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。天然以外の塩基としては、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルギュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リポフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等が挙げられる。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列の遺伝子多型を含む。遺伝子多型は、データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を利用することにより、容易に知ることができる。遺伝子多型には、一塩基多型（ＳＮＰ）、および塩基配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型が含まれる。また、複数の塩基（例えば２個〜数十塩基）の欠失または挿入による多型も遺伝子多型に含まれる。さらに、２〜数十塩基の配列が繰り返されている多型も遺伝子多型に含まれる。このような多型として、ＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（繰り返しの単位が数塩基から数十塩基のもの）、およびマイクロサテライト多型（２〜４塩基単位程度のもの）がある。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。配列番号１で表される塩基配列のほか、非コード領域を除いた領域のみであってもよい。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する細胞のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：４３−７４）。
さらに、本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドとしては、アイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、およびアレリック変異体があげられ、これらは、本発明のｈＥＲＧ遺伝子に含まれる。このようなｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーを用いてもよい。
より具体的に、ｃＤＮＡライブラリーの作製においては、まず、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の、細胞、臓器、組織等から直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットを使用することもできる。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２９１９−３２）により合成、および増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ（１９９４）Ｇｅｎｅ １３８：１７１−４；Ｓｕｚｕｋｉ（１９９７）Ｇｅｎｅ ２００：１４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込むことができる。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のｈＥＲＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムのうち、配列の同一性を決定するプログラムとして、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＸ、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．等を参照することができる。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子に含まれるｈＥＲＧのアイソフォームやアレリック変異体等、ｈＥＲＧと類似した構造および機能を有する遺伝子は、配列番号１で表さる塩基配列を基にプライマーを設計し、ヒトのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）により得ることができる。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これら本発明のポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。また、変異の誘発は前記の通り市販のキットを用いることもできる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
＜ウイルスベクタープラスミド＞
本発明により、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を含むウイルスベクタープラスミド（以下、本発明のウイルスベクタープラスミドと称する場合がある）が提供される。ここで、ウイルスベクタープラスミドとは、ウイルス由来の塩基配列を利用して、任意の塩基配列を任意の細胞に組み込むことができるようにしたプラスミドをいう。本発明のウイルスベクタープラスミドは、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を宿主細胞内に保持したり、該ｈＥＲＧ遺伝子にコードされるｈＥＲＧチャネルを発現させたりするのに有用である。
ウイルスベクタープラスミドを使用する場合に基となるウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＭｏＭＬＶ）などのオンコレトロウイルス由来のものや、ヒト後天性免疫不全症候群ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）などのレンチウイルス由来のものが挙げられる。
本発明において、レトロウイルスとは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オンコウイルス亜科（Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ）のオンコウイルス属（Ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）に属するウイルスをいい、レンチウイルスとは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、レンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）のレンチウイルス属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスをいう。
これまでにレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターにより効率良く細胞の染色体中に安定した遺伝子導入・発現が可能であることが示されている（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．ｖｏｌ．７ ３３−４０（２００１））。本発明のウイルスベクタープラスミドには、ｐＺＩＰｎｅｏ（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｃｅｌｌ．３７：１０５３−１０６２）、ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８３５８７−３５９６）、ｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社 ｃａｔａｌｏｇ １００４１Ｐ）、ＶｉｒａＰｏｒｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ ２１７５６３）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（Ｔａｋａｒａ ｃａｔａｌｏｇ ３６５０）等のレトロウイルスベクタープラスミド、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ Ｋ４９５５−１０）等のレンチウイルスベクタープラスミド等様々なウイルスベクタープラスミドを用いることができる。また、レトロウイルスおよびレンチウイルス以外由来のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、シンビスウイルス、センダイウイルス、トガウイルス、パラミクソウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス等を元に作製されたベクタープラスミドを利用することもできる。
レトロウイルスベクターの中では、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレトロウイルスベクターを使用することが望ましい。シュードタイプとは、一つのウイルスゲノムが別種のウイルスの外皮タンパク質に囲まれて発芽してくる現象である（Ｚａｖａｄａ，Ｊ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．１５ １８３−１９１（１９７２））。ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）は、ラブドウイルス科に属するネガティブ１本鎖ＲＮＡゲノムを持つウイルスであり、その外皮タンパク質（Ｇタンパク質）の細胞側のレセプターはホスファチジルセリンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．３２ ６３９−６４６（１９８３），Ｍａｓｔｒｏｍａｒｉｎｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８ ２３５９−２３６９（１９８７））、通常用いられる両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）のレトロウイルスベクターに比較してきわめて広い宿主域を有する（Ｅｍｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．６５ １２０２−１２０７（１９９１），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．２６０ １０９−１１５（１９９９））と共に超遠心操作により遺伝子導入能力を向上できることが報告されている（Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．９０ ８０３３−８０３７（１９９３））。従って、このＶＳＶ−Ｇ遺伝子産物を外皮に持つシュードタイプレトロウイルスを作製することにより、本来の外皮タンパク質を持つレトロウイルスに比較して効率よく各種細胞にｈＥＲＧ遺伝子を導入することが可能となる。
これらＶＳＶ−Ｇシュードタイプベクターの性質はレンチウイルスベクターにおいても同様であり、報告されているレンチウイルスベクターの多くがこのシュードタイプベクターである（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．ｖｏｌ．７ ３３−４０（２００１））。
ウイルスベクタープラスミドの好ましい態様においては、ウイルスベクタープラスミドを導入した宿主細胞内で本発明のｈＥＲＧ遺伝子が発現されるように制御配列下に結合する。ここで「制御配列」とは、プロモーターおよびターミネーターであり、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されたポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての構成成分を含むものである。
また、本発明のウイルスベクターは、選択可能なマーカーを含んでいてもよい。選択可能なマーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子（ネオマイシシ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）や蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ等）などが挙げられる。さらに、細胞内で発現されたポリペプチドを細胞膜上へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドをポリペプチドに付加するようにしてウイルスベクタープラスミドへ組み込むこともできる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
哺乳動物およびその他の動物細胞を宿主とする場合には、アデノウイルスｌａｔｅプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００）、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙプロモーター（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５−９）、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２１７−２３）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８）、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．３，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）ｐｐ．８３−１４１）、ＳＶ４０ ｌａｔｅプロモーター（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３８５−９４）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）−ＬＴＲプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６８４−７０４）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンサー、ｃＰＰＴ（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）配列およびグロビンイントロン等を使用することができる。
ウイルスベクタープラスミドへのｈＥＲＧ遺伝子の挿入は、リガーゼ反応により行うことができる。このとき、制限酵素サイトを利用することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）Ｓｅｃｔｉｏｎ ５．６１−５．６３）。
＜ウイルスベクターの調製＞
本発明において、ウイルスベクターとは、ウイルスベクタープラスミドを含有するウイルスをいう。ウイルスベクターを調製するために、ウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞には、２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）等用いることができる。ウイルスベクタープラスミドは、アデノウイルス法、エレクトポレーション（電気穿孔）法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１３３（１９９０））、カチオニックリポソーム法（カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等）、正電荷ポリマーによる導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｒｉａｌ ｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、パーティクルガンを用いる方法、リポソーム法、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）など））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、レセプター介在遺伝子導入法、レトロウイルス法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス−リポソーム法（別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社（１９９７）；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社（１９９７）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１４５８−６４（１９９４）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ１２１２−２０（１９９６）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０：１４４０−８（１９９３）；実験医学１２：１８２２−６（１９９４）；蛋白質核酸酵素４２：１８０６−１３（１９９７）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）：４７９−８２（１９９５））、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法等によりパッケージング細胞に導入することができる。
パッケージング細胞を適当な培地にて培養し、上記方法によりウイルスベクタープラスミドをトランスフェクションし、その後、一定時間培養し、培養液を回収することでウイルスベクターを得ることができる。また、トランスフェクション後、必要に応じて２から２４時間後、好ましくは６から１２時間後に培地を交換することができる。培地を交換した後、さらに１２時間から７２時間培養し、培養液を回収することでウイルスベクターを得ることができる。回収した培養液は、必要に応じて遠心操作、フィルター（０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）等）によるろ過を行うことができる。
＜ウイルスベクターの濃縮＞
本発明のウイルスベクターは、そのままでも用いることができるが、濃縮した方が、より好ましい。前記操作により得られたウイルスベクターを超遠心操作することで、濃縮ウイルスベクターを得ることができる。超遠心は、少なくとも３５，０００ｇ（ｇは重力加速度を表す）以上、好ましくは５５，０００ｇ以上を、少なくとも１００分以上、好ましくは１２０分以上行う。超遠心は、例えば、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）および超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、１９５００ｒｐｍ，１００分行うことによりできる。
＜ｈＥＲＧ遺伝子の導入＞
本発明において、ｈＥＲＧ遺伝子の細胞への導入は、本発明のウイルスベクターをそのまま用いることもできるが、濃縮したものを用いた方がより好ましい。
本発明のｈＥＲＧチャネル癸現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団における宿主細胞には、哺乳類由来の真核細胞を用いることができ、好ましくは、ＣＨＯ（中でもＤＨＦＲ遺伝子欠損ｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−２０（１９８０）およびＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０：１２７５（１９６８））が好適である）、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞等である。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団における宿主細胞には、心臓由来のセルライン、または単離した心筋細胞若しくは洞房結節細胞を用いることもできる。本発明のｈＥＲＧ発現細胞または細胞集団には、一定条件下、例えば、薬剤刺激、電気刺激、熱刺激、光刺激などにより、転写を調節し、発現を調節することができる細胞も含まれる。
宿主細胞を培養し、培養液にウイルスベクターを添加し、さらに培養することで遺伝子導入することができる。ウイルスベクターは、濃縮したものを用いるのが好ましい。添加するウイルスベクターには、必要に応じてｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）を加えることができる。ウイルスを加えた後、２４時間後に培地を交換することが好ましい。また、培地を交換した後、７２時間程度培養することで細胞あたりの発現量を最大とすることができる。
＜ｈＥＲＧチャネル発現細胞、ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団＞
以上の方法により、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞およびｈＥＲＧチャネル発現細胞集団が提供される。培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ、Ｆ１２等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリンまたはストレプトマイシンなどを添加することができ、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気および攪拌を行ったりすることができる。
本発明の方法により得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞の細胞集団（以下、「本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団」と称することがある）の中には、チャネル発現細胞（以下、本発現のｈＥＲＧチャネル発現細胞と称することがある）が多数存在しており、中でも、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネル発現細胞を多く含むものである。その含有率は、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体のうち、少なくとも４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞は、遺伝子の導入操作内容が同一の操作内容である限り、同一実験系で導入された細胞全体を母数としてもよく、異なる実験系（例えば異なる実験日に行われた場合等）で導入された細胞を全体にまとめて母数としてもよい。ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団のｈＥＲＧ電流の平均は０．３ｎＡ以上であり、好ましくは０．６ｎＡ以上であり、より好ましくは０．８ｎＡ以上であり、さらに好ましくは１．０ｎＡ以上である。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団の全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流は、後述のパッチクランプ法により測定することができる。なお、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネル発現細胞の含有率は、無作為に選び出した複数の細胞それぞれについて、ｈＥＲＧ電流を測定することにより、ｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上の細胞の割合を算出することができる。
また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団は、後述のクローニングにより得られる細胞、細胞株も含まれる。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団は、クローニングで得られた細胞株に、さらにｈＥＲＧ遺伝子を導入して得られる細胞、細胞集団も含まれる。
＜ｈＥＲＧチャネル発現細胞のクローニング＞
本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、そのまま用いることも可能であるが、培養中に性質が偏ることを避け、安定した薬物評価を可能とするためにクローニングを行うことができる。細胞クローニングは、定法（例えば、限外希釈法、フローサイトメトリーによるセルソーティング等）により行うことができる。クローニング後の細胞株から、発現量の測定、パッチクランプ法によるｈＥＲＧチャネルの機能的解析により最適なｈＥＲＧチャネル発現細胞株を選別することができる。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞における発現量は、抗ｈＥＲＧチャネル抗体を用いた免疫組織学的な解析方法により測定できる。抗体は、定法により作製してもよく、市販のもの（例えば、Ａｌｏｍｅｎｅ Ｌａｂｓ）を用いてもよい。免疫組織学的な解析方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色等があげられる。
このクローニングにより、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上の細胞がより容易に提供される。
＜ｈＥＲＧ電流の測定方法＞
本発明は、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流を測定する方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を用いて、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムにより、ｈＥＲＧ電流を測定する方法を提供する。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、前述の本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を作製する方法などにより得ることができる。本発明のｈＥＲＧ電流の測定方法において使用されるｈＥＲＧチャネル発現細胞のｈＥＲＧチャネル発現量は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上であることが望ましく、当該細胞あるいは当該細胞集団も本発明の範囲に含まれる。なお、発現量が多いほどパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が高くなる。
本発明のｈＥＲＧ電流の測定方法を実施するためには、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーは、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよい。好ましくはｐＨ７．４のｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。
次に、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、種々の保持電位および脱分極パルスを細胞に与えることにより誘発することができる。これらの条件については、当業者であれば容易に設定することができる（Ｚｈｏｕ，Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７４，２３０−２４１（１９９８））。例えば、保持電位を、−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて、脱分極パルスを−５０ｍＶへ１秒間与えることにより誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、−５０ｍＶへ電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
＜本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を用いたｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法＞
ｈＥＲＧ電流の阻害活性を有する化合物は、ＱＴ延長作用を伴う催不整脈作用を有することが知られており、心室頻拍や突然死といった重篤な副作用を誘発することがある。そのため、安全性の高い医薬品開発には、その開発の対象となる被検物質がｈＥＲＧ電流に影響を与えないことを確認することが必須である。よって、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を用いたｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法は、ｈＥＲＧ電流に影響を与えない被検化合物を選択することを容易とするものであり、従って、本発明の阻害活性測定方法は、種々の疾病の治療・予防剤などの医薬の開発に有用である。
すなわち、本発明は、
（Ａ）ｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させることを特徴とするｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法を提供する。本発明のｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法においては、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させる前と接触させた後における、例えば、当該細胞のｈＥＲＧ電流を測定して比較することができる。たとえば、ｈＥＲＧ電流の阻害活性は、被検化合物を接触させる前のｈＥＲＧ電流の大きさに対する当該化合物を接触させた後のｈＥＲＧ電流の大きさの比を指標に用いることができる。
（Ｂ）ｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流を変化させもしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させた場合と接触させない場合との比較を行うことを特徴とするｈＥＲＧ電流を変化させもしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させた場合と接触させない場合における、例えば、当該細胞のｈＥＲＧ電流を測定して比較することができる。例えば、被検化合物を接触させない場合よりも接触させた場合のｈＥＲＧチャネル電流が小さいとき、当該被検化合物をｈＥＲＧチャネル電流を阻害する化合物とすることができる。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、本発明のｈＥＲＧ発現細胞、本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団を用いることができ、あるいは前述の本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を作製する方法などにより得ることができる。本発明のｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法において、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団のｈＥＲＧチャネル発現量は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上である。なお、発現量が多いほどパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が高くなり、高感度な測定系の構築が可能になる。
本発明の（Ａ）または（Ｂ）の前記の方法を実施するためには、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーには、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよい。好ましくは、ｐＨ７．４ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。
まず、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、種々の保持電位および脱分極パルスを細胞に与えることにより誘発することができる。これらの条件については、当業者であれば容易に設定することができる。例えば、保持電位を、−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて、脱分極パルスを−５０ｍＶへ１秒間与えることにより誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
次に、ｈＥＲＧチャネル発現細胞に被検化合物を共存させる。このとき、コントロールとして、被検化合物を含まないものやｈＥＲＧ電流を阻害することが知られている化合物を加えた細胞も用意することができる。ｈＥＲＧ電流を阻害する化合物としては、アステミゾール（Ｔａｌｉａｌａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５４：１１３−２１）、Ｅ−４０３１（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．（１９９８）７４：２３０−４１）、リスペリドン（Ｋｏｎｇｓａｍｕｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）４５０：３７−４１））、ベラパミル（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：９８９−９８）、キニジン（Ｊｉｅｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２００１）２９９：２９０−６．）があげられる。反応は、例えば、１５℃から３７℃、好ましくは２０℃から３０℃で、１０秒から６０分、好ましくは３分から１０分行う。
そして、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステ厶を用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、被検化合物共存前と同条件により誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
例えば、被検化合物を接触させる前のｈＥＲＧ電流の大きさを１００％、０ｎＡを０％とすることで、被検化合物を接触させた後のｈＥＲＧ電流の大きさから抑制率を算出し、被検化合物のｈＥＲＧ電流に対する阻害活性を測定できる。さらに、被検化合物の用量を変化させることで、被検化合物固有の阻害活性値を算出することも可能である。また、ｈＥＲＧ電流を５０％阻害する濃度が、少なくとも０．３μＭ以上、好ましくは１．０μＭ以上、より好ましくは３．０μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上、最も好ましくは３０μＭ以上である場合には、ｈＥＲＧ電流に影響を与えない、あるいは阻害活性を有さないと判断することができる。
被検化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
＜本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞によるＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いた膜電位変化の測定方法＞
本発明は、ｈＥＲＧチャネル発現細胞によるＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた膜電位変化の測定方法を提供する。
具体的には、以下のように操作を行うことで、測定することができる。本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーには、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよく、好ましくは、ｐＨ７．４ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。細胞懸濁液は、０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌから１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製することが好ましい。次に、懸濁した細胞をプレート（例えば、Ｂｉｏｃｏａｔ Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｐｌａｔｅ（ＢＥＣＫＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）等を利用する）に蒔き、さらに培養する。細胞は、５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔くことができる。また、２日間程度培養することが好ましい。次に、ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＣｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを測定用緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２４ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、（最終ｐＨ約７．２５））に溶解し、１ウェル当たり２５μｌ加える。Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを添加してから約１時間後、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社）を用いて膜電位変化の測定を行うことができる。測定プログラムは、当業者にとって適当な条件を設定でき、例えば、被検化合物添加前に１０回、添加後に５０回、６秒毎とすることができる。測定は室温で行うことができる。ｈＥＲＧ阻害活性は、被検化合物添加により変化した蛍光強度から算出することができる。陽性対照として、Ｅ４０３１、Ｄｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅ等を用いることができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＶａｌまたはＶ：バリン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号１〕ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０で表される塩基配列を示す。
〔配列番号２〕ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０で表されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号３〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号４〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号５〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号６〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプラィマー塩基配列を示す。
〔配列番号７〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号８〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号９〕ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１０〕ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１１〕ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１２〕ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１３〕ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏの塩基配列を示す。
【実施例】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［実施例１］ｈＥＲＧ遺伝子の調製
ｈＥＲＧ遺伝子の単離は、配列番号１で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。ここでは４０７０ ｂｐｓが示されており、ｈＥＲＧチャネルをコードする領域（ストップコドンを除く）は、１８４−３６６０（３４７７ ｂｐｓ，１１５９アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号３から８までに示すｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを作製した（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。
ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６５１６−１）を鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ）によりｃＤＮＡを作製した。次に、このｃＤＮＡ鋳型とし、配列番号３および４、配列番号５および６並びに配列番号７および８からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡをプライマーとして、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、（９５℃３０秒−６１℃３０秒−６８℃１分）を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。プライマーの塩基配列は以下の通りである。
その結果、それぞれ約１．２，１．２，１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
これらのＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔａｌｏｇ６９９６７−３）に挿入し、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により配列を確認した。その結果、配列番号３および４からなるプライマーの組み合わせによって得られた１１７９ｂｐｓの配列は、配列番号１における１７３ｂｐから１３５１ｂｐと同一であった。一方、配列番号５および６ならなるプライマーの組み合わせによって得られた１１６８ｂｐｓの配列中には２つの変異（Ａ１８７５Ｇ，Ｔ２１４９Ｃ）が見られたが、これらの変異は、該当部位の塩基配列から翻訳されるアミノ酸（Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）には影響を与えないことが明らかである。また、配列番号７および８からなるプライマーの組み合わせによって得られた１６４２ｂｐｓの配列中には２つの変異（Ｃ２４２０Ｔ，Ａ３３６７Ｇ）が見られたが、今回得られた複数のクローンで同一の変異を有していたことから、今回使用している試料中（ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６５１６−１））のｈＥＲＧ遺伝子として正しいと判断した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断した。また、配列番号３および４からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、配列番号５および６からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へ、リガーゼ反応（ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．６０２２）により挿入してｐＢＳ−１＆１４＆１５＆１８を作製した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。また、配列番号７および８からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へ、リガーゼ反応により挿入してｐＢＳ−６＆４を作製した。
さらに、ｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。また、ｐＢＳ−１＆１４＆１５＆１８をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで、ｐＢＳ−６＆４をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＲＥＰ７中へリガーゼ反応により挿入して、ｈＥＲＧ遺伝子を含むｐＲＥＰ７ＨＥＲＧを得た。
［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８ ３５８７−３５９６）（配列番号１３）から、制限酵素ＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）により平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６０３ｌ−１）から制限酵素ＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＰを得た（図１）。
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８ ３５８７−３５９６）（配列番号１３）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６０６１−１）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た（図２）。
ｐＢａｂｅＸＩＰから制限酵素ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃１００４１Ｐ）から制限酵素ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＰを得た（図３）。
ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃１００４１Ｐ）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た（図４）。
ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨから制限酵素ＢｇｌＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ ＃６０２９−１）から制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを切り出したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇを得た（図５）。
ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨからＢｇｌＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６９３８−１）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｎｅｏ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮを得た（図６）。
［実施例３］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ａＩＮを得た（図７）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＨを得た（図８）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＰをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＰを得た（図９）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩ２ＧをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇを得た（図１０）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨをＢｇｌＩＩで切断し、ＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）を得た（図１１）。
［実施例４］レンチウイルスベクタープラスミドの調製
マルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）挿入のために配列番号：９および１０からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡを作製した（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。ｏｌｉｇｏ ＤＮＡの塩基配列を以下に示す。
配列番号９及び１０のｏｌｉｇｏ ＤＮＡを、９８℃、５分間の熱変性後に緩やかに室温に戻すことでアニーリングさせた。
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ Ｋ４９５５−１０）からＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断することによりｌａｃＺ−Ｖ５ ｅｐｉｔｏｐｅ−ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＥＭ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（ｒ）を除き、ここへ上記ｏｌｉｇｏ ＤＮＡを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳを得た（図１２）。
ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ（ｃＰＰＴ）を導入し遺伝子導入能力を上昇させるために報告されている方法を参考にして、配列番号：１１および１２に示すｏｌｉｇｏ ＤＮＡプライマーを作製した（Ｚｅｎｎｏｕ，Ｖ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１０１ １７３−１８５（２０００））（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。
配列番号：１１および１２からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡをプライマーとして、ｐＬＰ１（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｇａｔｅｗａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋ４９６０−００）プラスミドを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、（９５℃３０秒−６１℃３０秒−６８℃１分）を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。その結果、約０．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔａｌｏｇ ６９９６７−３）に挿入し、ｃＰＰＴ−ｐＴ７Ｂｌｕｅを得た。このＤＮＡ断片の塩基配列は、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により配列が報告されているｃＰＰＴ（Ｚｅｎｎｏｕ，Ｖ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１０１ １７３−１８５（２０００））と同一であることを確認した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ここへｃＰＰＴを含むＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｃＰＰＴ−ｐＴ７Ｂｌｕｅ並びにＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳを挿入しｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｐＢＳを得た。
ｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断してＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを除き、ここへｃＰＰＴ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｐＢＳを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＭＣＳを得た。ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＭＣＳをＫｐｎＩで切断し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｃａｔａｌｏｇ ６０２９−１）からＨｉｎｃＩＩによりＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ断片を切り出したものを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２Ｇを得た（図１３）。
［実施例５］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクタープラスミドの調製
実施例４で得たｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２ＧをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。ここへ実施例３で得たｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２ＧからＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇを得た（図１４）。
［実施例６］ベクタープラスミドの調製
実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開環したｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入しｐＺｅｏｈＥＲＧを得た。
ｐＺｅｏｈＥＲＧをｄａｍ−大腸菌株ＳＣＳ１１０に導入し、大量培養に続いてプラスミドを調製した後、当該プラスミドから得られたＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｈＥＲＧ遺伝子（ＣｌａＩ／ｆｉｌｌ−ｉｎ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を、ｐｃＤＮＡ３．１ ＮｅｏからＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを除いたＤＮＡ断片（ＮｕｒＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで開環した物）に導入しｐＳＶ ｈＥＲＧ−Ｎｅｏを作製した。発現ベクターを導入した大腸菌の大量培養は定法にて行い、ベクターの精製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。
［実施例７］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０６の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ 東京 ｃａｔａｌｏｇ４０２０−０１０）にＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ Ｄ５７９６）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＥＢＮＡ培養液とする）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ＃２１７５６６）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ｃａｔａｌｏｇ＃２１７５６７）、および実施例３で得たｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ、それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．ｃａｔａｌｏｇ ＭＩＲ２３００）を用いてトランスフェクションした。その６−１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして以後の実験に供した。
［実施例８］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターの調製
４×１０６の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ 東京 ｃａｔａｌｏｇ４０２０−０１０）にＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ Ｄ５７９６）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＥＢＮＡ培養液とする）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＬＰ１，ｐＬＰ２，ｐＬＰ／ＶＳＶＧ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇＫ４９７０−１０）、および実施例５で得たヒトｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクタープラスミド、それぞれ２．５μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．ｃａｔａｌｏｇ ＭＩＲ２３００）を用いてトランスフェクションした。その６−１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）でろ過したものを非濃縮レンチウイルスベクターとして以後の実験に供した。
［実施例９］レトロウイルスベクターの濃縮
実施例７で調製したウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ５０Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ３４４０５８）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って１９，５００ｒｐｍ１００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。一時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。必要に応じて、濃縮ウイルスベクター溶液を集め再度超遠心操作を行って再濃縮ウイルスベクター溶液を調製した。
［実施例１０］レンチウイルスベクターの濃縮
実施例８で調製したウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。超遠心用チューブ５０Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ３４４０５８）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って１９，５００ｒｐｍ １００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。一時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。必要に応じて、濃縮ウイルスベクター溶液を集め再度超遠心操作を行って再濃縮ウイルスベクター溶液を調製した。
［実施例１１］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
実施例７で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３８）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例７で調製したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１２］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
実施例８で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例８で調製したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１７、および実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１３］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−２
実施例９で遠心濃縮したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１４］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−３
実施例１８に示す細胞クローニングを行い、適切なｈＥＲＧ電流が記録できた細胞株に対して、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
実施例１３で得られたｈＥＲＧ発現細胞株（３×１０３）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを最終濃度８μｇ／ｍｌとなるように、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１５］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−２
実施例１０で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例１０で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１７および実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１６］リポフェクション法を用いたｈＥＲＧ遺伝子導入用ベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研ジーンバンク・細胞開発銀行）へのｈＥＲＧ遺伝子導入用ベクターの導入をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従って以下のように行った。
直径６ｃｍ培養シャーレに２日間培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＴＥ溶液に溶解した約１μｇのｈＥＲＧ発現ベクター（ＳＶ−ｈＥＲＧ−ｎｅｏ）と８μＬのＥｎｈａｎｃｅｒを最終容量１５０μＬになるように混和し、約１秒間攪拌した後、室温で２−５分間静置した。次に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μＬ加え約１０秒間攪拌した後、室温で５−１０分間静置し、培地を１ｍＬ加えた。この溶液を、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、４ｍＬの培地を加えた培養シャーレに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、トリプシンにて細胞を培養シャーレから剥がし、５００μｇ力価のＧ４１８を含む培地に懸濁した。数日間培養した後、実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１７］ＧＦＰ発現を指標としたＦＡＣＳによるｈＥＲＧ高発現細胞の分離濃縮
実施例１２または実施例１５で調製したｈＥＲＧ導入細胞の中からＧＦＰ発現を指標としＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、より高発現の細胞を分離濃縮した。１０ｃｍ ｄｉｓｈに調製した細胞をｔｒｙｐｓｉｎで剥がし、ＦＡＣＳＡｒｉａの使用法に従ってＧＦＰが高発現している細胞のみを分離した。分離後の細胞を解析したところＧＦＰ高発現の細胞が濃縮されていることが示された。得られた細胞は実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１８］ｈＥＲＧチャネル発現細胞のクローニング
細胞のクローニングは限外希釈法にて行った。９６ｗｅｌｌ培養プレートの１ｗｅｌｌあたり０．３個の細胞になるように細胞懸濁液を調整し、各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注した。約２週間後、顕微鏡観察下で、１つのｗｅｌｌに１つの細胞集団（コロニー）が観察されたｗｅｌｌの細胞を２４ｗｅｌｌ培養プレートに移し継続して培養した。また、その後Ｆ７５培養フラスコまで規模を拡張し、ウェスタンブロット法によるタンパク発現の確認と電気生理学的手法によるｈＥＲＧチャネルの機能的発現によりｈＥＲＧチャネル発現細胞株を選別した（実施例１９および２０）。
［実施例１９］ウェスタンブロット法によるｈＥＲＧチャネルの検出
本試験は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。６穴プレートにて培養したそれぞれの細胞を、氷冷ＰＢＳにて洗浄し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を添加したＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮｏｎｉｄｅｔＲ Ｐ−４０、０．５％ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｏｄｉｕｍ）を加え、セルスクレイパーで剥がした。剥がした細胞をエッペンドルフチューブに回収し、４℃にて１０，０００ｒｐｍ（遠心機：ＭＲＸ−１５２、ローター：ＴＭＡ−６、トミー精工）で３分間遠心した後、上清をサンプルとして回収した。サンプルのタンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
タンパク質の電気泳動、転写にはＮＯＶＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の装置を使用した。回収したサンプルに、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適量加え、９５℃にて３分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ ３−８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサンプルをアプライし、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１２０Ｖで約一時間電気泳動を行った。電気泳動を終えたゲルを、Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）とともにＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅｌｏｃｋＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にセットし、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０Ｖで約一時間、転写を行った。
一次抗体にはＡｎｔｉ−ＨＥＲＧ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）を、二次抗体にはＡｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）を用いた。一次抗体反応後と二次抗体反応後には、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにてＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅの洗浄を行った。結合抗体の検出には、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いた。
その結果、ｎｏｒｍａｌ ＣＨＯ−Ｋ１細胞にはｈＥＲＧタンパクに相当する分子量約１５０ｋＤのバンドは全く検出されなかった（図１５、レーン１）。また、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株Ｍ３細胞には、わずかにｈＥＲＧタンパクのバンドが検出された（図１５、レーン２）。それに対して、レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株には明らかに多量のｈＥＲＧタンパクが検出された（図１５、レーン３）。
［実施例２０］全自動ハイスループットパッチクランプシステムによるｈＥＲＧ電流の測定および電流分布比較
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞（実施例１３）および細胞株（実施例１４）を用いて行った。ｈＥＲＧチャネル発現細胞をＦ７５培養フラスコで培養した。培養した後、ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）溶液を用いてＦ７５培養フラスコから剥がし、適当な濃度（１．０〜１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）になるように細胞をＰＢＳ溶液に懸濁した。その細胞懸濁液をＩｏｎＷｏｒｋｓ ＨＴＴＭシステムの細胞用リザーバーに移した。ｈＥＲＧ電流測定の手順としては、測定用プレート（ＰａｔｃｈＰｌａｔｅＴＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）の各ウェルにＰＢＳを分注し、次に細胞浮遊液を分注し、ウェルの中央にある穴に細胞がシールを形成するまで放置した。シール形成後、アンフォテリシンＢを含む溶液（ＫＣｌ １４０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２５−７．３）を灌流し、穿孔パッチを形成させた。穿孔パッチ形成後、刺激電極を介した膜電位固定法により細胞に電位変化を与え、ｈＥＲＧ電流を誘発させ、ｈＥＲＧ電流を記録した。
ｈＥＲＧ電流は、電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて−５０ｍＶへ１秒間変化させ誘発させた。ｈＥＲＧ電流の大きさは、−５０ｍＶに電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いた。リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株から記録されたｈＥＲＧ電流の分布を図１６および表１に示す。
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１６）のｈＥＲＧ電流分布（表１、図１６のＡ）よりも、レトロウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞（実施例１３）の電流分布は大きく（表１、図１６のＢ）、また細胞株（実施例１４）の電流分布は明らかに大きかった（表１、図１６のＣ）。
表１において、Ａは、リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＢはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、ＣはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株のｈＥＲＧ電流分布を表わす。
さらに、化合物のｈＥＲＧ電流阻害活性を、より安定的に評価するためにカットオフ値を設定し、各ｈＥＲＧ発現細胞のｈＥＲＧ電流について解析した。カットオフ値としては、１）＋２０ｍＶに脱分極したときの電流値に対する末尾電流のピーク値の比が０．８未満、２）シール抵抗が３０ＭΩ末満の２項目を設定し、それらの条件を満たすデータについて解析した。
カットオフ値を設定し、解析した結果を図１７および表２に示す。
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１６）のｈＥＲＧ電流分布（表２、図１７のＡ）よりも、レトロウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞（実施例１３）の電流分布は大きく（表２、図１７のＢ）、また細胞株（実施例１４）の電流分布は明らかに大きかった（表２、図１７のＣ）。さらに、一年間継続培養した細胞の電流は安定していた（表２、図１７のＤ）。また、レンチウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１８）の電流分布もレトロウイルスを用いて樹立した細胞株と同様に明らかに大きく、このことは一年間継続培養してもｈＥＲＧチャネルが安定して発現していることを意味していた（表２、図１７のＥ）。
表２において、Ａは、リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＢはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、ＣはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＤはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株を一年間継続培養した細胞株、ＥはレンチウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株のｈＥＲＧ電流分布を表わす。
［実施例２１］全自動ハイスループットパッチクランプシステムによる被検化合物のｈＥＲＧチャネル阻害活性の評価
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。ｈＥＲＧ電流の測定は実施例２０と同様に行った。また、被検化合物または既知化合物のｈＥＲＧチャネルに対する阻害活性は、被検化合物添加前に記録された末尾電流のピーク値を１００％としたときの、各濃度の被検物質を添加した後の末尾電流のピーク値の割合から抑制率を算出した。被検化合物のそれぞれの濃度における抑制率よりｈＥＲＧ電流に対する阻害活性値（ＩＣ５０値）を算出した。
各薬剤の評価濃度は、アステミゾール、Ｅ−４０３１、リスペリドン、ベラパミルが０．０１６，０．０４８，０．０１４，０．０４１，０．１２３，０．３７，１．１１，３．３３μＭ、キニジンは０．０４８，０．０１４，０．０４１，０．１２３，０．３７，１．１１，３．３３，１０μＭとした。また、薬剤は約４分間作用させた。
その結果、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株では、殆どのデータポイントが欠落していたが、レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株では、全てのデータを取得でき、各薬剤のＩＣ５０値（０．０８３、０．０４４、０．５３６、０．７２０、０．３８５μＭ）も求めることが出来た（図１８）。
［実施例２２］ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いた膜電位変化の測定
レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。また、ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社）を用いた。ｈＥＲＧチャネル発現細胞を、測定二日前にＢｉｏｃｏａｔ Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｐｌａｔｅ（ＢＥＣＫＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）に蒔いた。細胞溶液は１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製し、１ウェル当たり２５μｌとした。ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ ＫｉｔのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを測定用緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２４ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、（最終ｐＨ約７．２５））に溶解し、１ウェル当たり２５μｌ加えた。ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡを添加してから約１時間後、ＦＤＳＳ６０００を用いて膜電位変化の測定を行った。測定プログラムは、被検物質添加前に１０回、添加後に５０回、６秒毎とした。測定は室温で行った。ｈＥＲＧ阻害活性は、被検物質添加後５分間で変化した蛍光強度から算出した。陽性対照として、Ｅ４０３１、Ｄｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅを用いた。
結果を図１９に示す。ＫＣｌ添加によって、膜電位が脱分極したことを意味する蛍光強度の変化が観察された。また、ｈＥＲＧ阻害剤であるＥ４０３１およびＤｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅによっても同様の膜電位変化が見られ、その変化は濃度依存的であった。
［実施例２３］古典的パッチクランプ法によるｈＥＲＧ電流の記録
古典的パッチクランプ法によるｈＥＲＧ電流の記録は、本発明のｈＥＲＧ発現細胞を用いて行った。また、ｈＥＲＧ電流の測定を論文［Ｚｈｏｕ，Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７４，２３０−２４１（１９９８）］を参考に以下のように行った。
ポリリジンをコーティングしたガラスプレート上に細胞を蒔き、２〜４日間培養した。実験時に細胞を蒔いたガラスプレートを電流測定用バスに移動した。ｈＥＲＧ電流は、ホールセルパッチクランプ法の膜電位固定法にて観察した。ｈＥＲＧ電流の記録用の溶液としては、細胞外灌流溶液（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ４ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４）および電極内溶液（ＫＣｌ １３０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ ５ｍＭ、ＥＧＴＡ ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ｐＨ７．２）を用いた。ｈＥＲＧ電流の測定には電流増幅装置（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、電流の記録および解析にはｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。ｈＥＲＧ電流は、電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ５秒間、そして−５０ｍＶへ４秒間変化させ、この電位変化を２０秒間隔で細胞に与え誘発した。また、ｈＥＲＧ電流の大きさには、−５０ｍＶに電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いた。
【産業上の利用可能性】
本発明により、薬剤研究開発でのｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高いｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより高感度で処理能力の高い評価を可能とした。
本発明により、同時に効率よくｈＥＲＧチャネルの高発現細胞を得られることを利用して、多様な細胞種に対してｈＥＲＧ遺伝子を高レベルで発現させることにより、各細胞種間で内在性のイオンチャンネルの影響を比較することで、薬剤研究開発における副作用予測を行う上で最も適切な細胞種を選択することを可能としている。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
配列番号１０：ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
本明細書において引用した刊行物は、全体を通して本明細書に組み込むものとする。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【技術分野】
本発明は安全性の面において薬剤研究開発時に大きな問題となっている心電図ＱＴ間隔延長による心臓への副作用のリスクを回避するための評価細胞とその細胞樹立法およびそれらによる薬物の評価に関するものである。
【背景技術】
安全性薬理試験は、新規医薬品のヒトに対する安全性を薬理学的観点から検討する非臨床試験である。被験物質のヒトに対する安全性の検討と副作用予測などを目的とした安全性薬理試験ガイドラインが日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）において制定されており、そのガイドラインによれば、安全性薬理試験の一環として、被験物質の催不整脈作用、特に心電図ＱＴ間隔延長作用の有無を検討することが求められている。薬物の投与によって引き起こされるＱＴ間隔延長に伴う、心室性頻脈、ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ、および致死的な不整脈から患者を保護するために、このような重篤な副作用を誘発する可能性を有するＱＴ間隔延長作用を検出することは、医薬品開発において非常に重要である。
これまでに、ＱＴ間隔延長作用を有する多くの医薬品は、心筋細胞遅延型整流カリウムチャネルを抑制することが知られており、ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）チャネルがそのチャネルの主たる構成タンパクとして機能していると考えられている。従って、ヒト用医薬品による心室再分極遅延（ＱＴ間隔延長）の潜在的可能性を評価するためのガイドライン（ＩＣＨ−Ｓ７Ｂ）案では、非臨床試験としてｈＥＲＧチャネルを導入した細胞を用いたイオンチャネルアッセイが推奨されている。
従来、ｈＥＲＧチャネルに対する化合物の作用を適切に評価する方法として、ｈＥＲＧチャネルを発現させた細胞またはｈＥＲＧチャネルを本来保持している心筋細胞に対して直接ガラス微小電極を用いてチャネル活性を記録するパッチクランプ法が用いられてきた（Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ ２６０，７７９−８０２，（１９７６））。しかし、このパッチクランプ法は、高い精度でｈＥＲＧチャネルに対する薬物の評価を適切に行えるものであるが、熟練した高度な技術を必要とするものであり、その処理能力は著しく低く（１−５化合物／日／人）、薬剤開発段階での数多くの薬剤候補化合物に対して処理能力が著しく不足しているという問題があった。
一方、ｈＥＲＧチャネルの評価の処理能力を高める方法として、放射性同位元素であるＲｂ３＋の放出を検出する方法（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．ｖｏｌ．２８，１７７−１９１，（２００２））、放射性同位元素であるトリチウム（３Ｈ）で標識したｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅの結合との競合により評価する方法（Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ｖｏｌ．４３０，１４７−１４８（２００１））、および膜電位感受性色素を利用した方法（Ｔａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ ｖｏｌ．６，３２５−３３１（２００１）、Ｂａｘｔｅｒ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．ｉｂｉｄ．ｖｏｌ．７，７９−８５（２００３））などが報告されている。しかし、これらの方法は、放射性物質を用いる点で操作が煩雑であり、また、間接的な検出方法であるために感度および精度が低くなることから、パッチクランプ法で得られるｈＥＲＧチャネル阻害活性の測定精度と大きく乖離していた。
近年、上記問題点を解決する手段としてｈＥＲＧチャネルによる影響を適切に評価しつつ処理能力の高い機器である全自動ハイスループットパッチクランプシステムが開発されており、その中のいくつかの機器（Ｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ＨＴＴＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓＴＭ ７０００Ａ；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）が発売されている。これらの装置は、ｈＥＲＧチャネルを発現した細胞を浮遊状として、重力による落下および陰圧によって、各ウェルの中央にある小径の穴へ細胞を吸引し、電流記録可能な状態にするものであるため、パッチクランプ法のように熟練した高度な技術を必要としない。また、化合物の処理能力も非常に高く、１日に３０００ポイント以上のデータを取得することができる。ただし、この装置を用いて評価するに当たっては、実験に用いるｈＥＲＧチャネル発現細胞が非常に重要になる。すなわち、古典的なパッチクランプ法による測定では、細胞１つ１つを選択して評価するため、ｈＥＲＧチャネルの発現量の高い細胞を選び出して測定することができるのに対し、全自動ハイスループットパッチクランプシステムによる測定では、存在する細胞をランダムに使用するために発現量の高い細胞を選ぶことができない。従って、全自動ハイスループットパッチクランプシステムにより多検体を正確に評価するためには、一定割合以上の細胞がｈＥＲＧチャネルを発現していること、かつ、その発現量も十分に多いことが求められる。そこで、この全自動ハイスループットパッチクランプシステムで使用できるｈＥＲＧチャネル発現細胞を作製するために、種々の試みがなされている。
これまでの報告では、ある細胞にリン酸カルシウム法やリポフェクション法を用いたトランスフェクションによりｈＥＲＧ遺伝子を細胞に導入し、限界希釈によるクローニングおよびｈＥＲＧ遺伝子導入量確認、あるいはｈＥＲＧチャネルによる電流測定等の著しく労働消費的な手順を経て安定発現細胞を得ていた（Ｔａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．ｖｏｌ．６ ３２５−３３１（２００１）、Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．１（２−３），１２７−１３５，２００３．）。しかしながら、限界希釈によるクローニングという大変な労力を割いても、これらの手法ではｈＥＲＧ遺伝子導入量が充分でないため、細胞あたりのｈＥＲＧ電流は微弱なものとなる。ｈＥＲＧ電流が小さい場合には、十分なＳ／Ｎ比を取ることができず、その分測定感度は低下することになる。また、クローニングによりいかにｈＥＲＧ電流の大きな細胞を取得しても、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いた場合、そのｈＥＲＧ電流の大きさを高感度に測定することが困難であることが多い。
また、ｈＥＲＧチャネルが分類されるイオンチャンネルの電流の測定では、細胞が内在的にもつイオンチャンネルの影響が細胞種毎に異なるために、細胞種を変えることで測定実用度が大きく影響を受けることが多く、そのために、別種の細胞で測定を行う際にも上記と同様の労働消費的な操作を繰り返す必要があった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、薬剤研究開発におけるｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高いｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより、高感度かつ高処理能力を有する被験物質評価法を確立するものである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ｈＥＲＧ遺伝子をレトロウイルスベクタープラスミドまたはレンチウイルスベクタープラスミドに挿入し、ウイルスベクターを調製後、必要に応じて超遠心による濃縮を行い、細胞にｈＥＲＧ遺伝子を導入することにより、ｈＥＲＧチャネルを高発現する細胞を得ることに成功した。また、この細胞は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムまたは色素を用いた測定法において有効な発現量を確保し得るものであることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のチャネルを発現することができる細胞を、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体の４０％以上含むｈＥＲＧチャネル発現細胞集団。
（２）ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである（１）記載の細胞集団。
（３）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（２）記載の細胞集団。
（４）ｈＥＲＧ電流の細胞全体の平均が０．３ｎＡ以上である（１）から（３）のいずれか１項に記載の細胞集団。
（５）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が１．０ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネルを発現することができる細胞。
（６）ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである（５）記載の細胞。
（７）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（６）記載の細胞。
（８）ウイルスベクターを用いてｈＥＲＧチャネルを発現させることを特徴とする、（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法。
（９）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである（８）記載の方法。
（１０）ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである（８）記載の方法。
（１１）ウイルスベクターを超遠心により濃縮する工程を含むことを特徴とする、（８）から（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
（１３）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１２）記載の方法。
（１４）（８）から（１１）のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
（１５）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴する（１４）記載の方法。
（１６）（１）から（４）のいずれか１項に記載の細胞集団または（５）から（７）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１７）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１６）記載の方法。
（１８）（８）から（１１）のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１９）全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする（１８）記載の方法。
本発明により、薬剤研究開発におけるｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高い、ｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより高感度で処理能力の高い評価を可能とした。
本発明により、同時に効率よくｈＥＲＧチャネルの高発現細胞を得られることを利用して、多様な細胞種に対してｈＥＲＧチャネルを高レベルで発現させることにより、各細胞種間で内在性のイオンチャンネルの影響を比較することで、薬剤研究開発における副作用予測を行う上で最も適切な細胞種を選択することを可能としている。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＸＩＰ）の構造を示す。
図２は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＸＩＨ）の構造を示す。
図３は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩＰ）の構造を示す。
図４は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨ）の構造を示す。
図５は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇ）の構造を示す。
図６は、レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮ）の構造を示す。
図７は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ａＩＮ）の構造を示す。
図８は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＨ）の構造を示す。
図９は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＰ）の構造を示す。
図１０は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ）の構造を示す。
図１１は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ））の構造を示す。
図１２は、レンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳ）の構造を示す。
図１３は、レンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２Ｇ）の構造を示す。
図１４は、ｈＥＲＧ遺伝子を導入したレンチウイルスベクタープラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ）の構造を示す。
図１５は、ウェスタンブロット法によるｈＥＲＧチャネルタンパクの検出結果を示す。（Ｌａｎｅ１：ｎｏｒｍａｌ ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｌａｎｅ２：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｌａｎｅ３：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株）
図１６は、ｈＥＲＧ電流の分布を表す。（Ａ：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｂ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、Ｃ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株）
図１７は、カットオフ値を設定して解析したｈＥＲＧ電流の分布を示す。（Ａ：リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｂ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、Ｃ：レトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、Ｄ：レンチウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞群）
図１８は、既知化合物のｈＥＲＧ阻害活性を表す。
図１９は、ＫＣｌおよびｈＥＲＧ阻害剤であるＥ４０３１およびＤｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅによる膜電位変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
本発明において、レトロウイルスベクタープラスミドまたはレンチウイルスベクタープラスミドを利用してｈＥＲＧ遺伝子を含むウイルスベクターを調製し、得られたウイルスベクターによって細胞にｈＥＲＧチャネルを高発現させることができる。本発明は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムまたは色素を用いた測定法において、本発明により得られるｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を用いることにより、ｈＥＲＧ電流を阻害する物質を同定することができる。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
本発明において、パッチクランプ法とは、細胞膜上に存在するイオンチャネルを通過するイオンの流れを高感度で検出する手法である（新パッチクランプ実験技術法、岡田泰伸編、吉岡書店）。また、本発明において古典的なパッチクランプ法とは、高度な技術を要する研究員が、顕微鏡観察下で、直径０．５〜３μｍのガラス微小電極を細胞に押し当てて、非常に高い抵抗状態を作り上げた後にそのパッチを破壊することで、細胞膜表面上に存在するイオンチャネルを流れる電流を記録するホールセルパッチクランプ法である。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法とは、細胞をＰＢＳ等に浮遊状態で測定装置にセットし、アンフォテリシンＢ等を用いて細胞膜表面に穿孔を形成させ、細胞表面に存在するイオンチャネルを通って流れるイオンの動きを電流として検出する穿孔ホールセルパッチクランプ法である。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムとは、浮遊状にした細胞を、重力による落下および陰圧によって、各ウェルの小径の穴へ吸引し、電流記録を可能とする装置をいう。全自動ハイスループットパッチクランプシステムとしては、例えば、Ｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ＨＴＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓＴＭ ７０００Ａ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）があげられる。
本発明において、ｈＥＲＧチャネルとは、心筋細胞における遅延整流型カリウムチャネルの構成タンパク質の一つであり、詳細については後述する。
本発明において、ｈＥＲＧ電流とは、細胞膜表面に存在するｈＥＲＧチャネルを流れるカリウムイオンの流れのことである。このチャネルは、心臓において、心筋細胞の電気的な興奮を鎮めるために重要な役割を担っている。また、このｈＥＲＧ電流を抑制する薬剤は、重篤な心室性不整脈を誘発する危険性があるという理由により、市場からの撤退を余儀無くされる。従って、新規薬剤の開発において、このｈＥＲＧチャネルに対する作用がない、もしくは極力弱い薬剤の開発が必須となっている。
本発明において、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流とは、ｈＥＲＧチャネルを発現した細胞の膜電位を変化させた時に観察されるイオン電流をいう。より具体的には、細胞の膜電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、引き続き−５０ｍＶに１秒間変化させた時に検出されるイオン電流であり、このｈＥＲＧ電流の大きさとしては、−５０ｍＶに変化させた時に観察される末尾電流のピーク値をｈＥＲＧ電流の大きさとする。
本発明において、ｈＥＲＧチャネル発現細胞とは、ｈＥＲＧチャネルを発現している細胞をいう。以下にｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団の作製方法を記載する。
＜ｈＥＲＧチャネル＞
本発明において細胞に発現させるｈＥＲＧチャネルは、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）を含むものである。
以下、本発明のポリペプチドについて詳細に説明する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において１個または複数個（例えば１個または数個）のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じたアミノ酸配列であって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において１個または複数個（例えば１個または数個）のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じたアミノ酸配列としては、例えば、（ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
また、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されるポリペプチドも、本発明の範囲に含まれる（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９−１３）。
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のｈＥＲＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ）、非荷電性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ）、中性アミノ酸（Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｇｌｙ）、分枝アミノ酸（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、ヒドロキシアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ，Ｍｅｔ）、芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、複素環式アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ）、イミノ酸（Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ）等に分類することができる。
従って、非極性アミノ酸同士、あるいは非荷電性アミノ酸同士で置換させることが好ましい。中でも、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒおよびＴｈｒの間、ＡｓｐおよびＧｌｕの間、ＡｓｎおよびＧｌｎの間、ＬｙｓおよびＡｒｇの間、ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数および部位は特に制限ない。
このような配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、ＧＰＩアンカー形成、架橋、γ−カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、タンパク質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ＡＤＰ−リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。
さらに、本発明のポリペプチドには他のペプチド配列により付加された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、サブスタンスＰ、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、プロテインＣ断片、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリン定常領域断片、α−チューブリン断片、β−ガラクトシダーゼ、Ｂ−タグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｈｃｎｏｌ．６：１２０４−１０）、ｌｃｋタグ、ｐ１８ ＨＩＶ断片、ＨＳＶ−タグ（ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、Ｔ７−タグ（Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質）、ＶＳＶ−ＧＰ断片（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質）等のタンパク質の識別を容易にする配列、組換え技術によりタンパク質を発現させる際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
本発明のポリペプチドとしては、以上のようなポリペプチドがあげられ、例えば、前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは前記の配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質のｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドなどが好ましい。ここで、「ｈＥＲＧ活性」とは、カリウムイオンチャネルとして機能する活性を意味する。実質的に同質の活性とは、その活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
＜ｈＥＲＧ遺伝子＞
本発明において、ｈＥＲＧ遺伝子とは、ｈＥＲＧチャネルをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドをいう。本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むものである。配列番号１で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、前記本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば何でもよい。例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。また、天然以外の塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。天然以外の塩基としては、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルギュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リポフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等が挙げられる。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列の遺伝子多型を含む。遺伝子多型は、データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を利用することにより、容易に知ることができる。遺伝子多型には、一塩基多型（ＳＮＰ）、および塩基配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型が含まれる。また、複数の塩基（例えば２個〜数十塩基）の欠失または挿入による多型も遺伝子多型に含まれる。さらに、２〜数十塩基の配列が繰り返されている多型も遺伝子多型に含まれる。このような多型として、ＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（繰り返しの単位が数塩基から数十塩基のもの）、およびマイクロサテライト多型（２〜４塩基単位程度のもの）がある。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。配列番号１で表される塩基配列のほか、非コード領域を除いた領域のみであってもよい。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する細胞のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：４３−７４）。
さらに、本発明のｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ｈＥＲＧ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドとしては、アイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、およびアレリック変異体があげられ、これらは、本発明のｈＥＲＧ遺伝子に含まれる。このようなｈＥＲＧ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーを用いてもよい。
より具体的に、ｃＤＮＡライブラリーの作製においては、まず、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の、細胞、臓器、組織等から直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットを使用することもできる。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２９１９−３２）により合成、および増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ（１９９４）Ｇｅｎｅ １３８：１７１−４；Ｓｕｚｕｋｉ（１９９７）Ｇｅｎｅ ２００：１４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込むことができる。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のｈＥＲＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムのうち、配列の同一性を決定するプログラムとして、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＸ、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．等を参照することができる。
本発明のｈＥＲＧ遺伝子に含まれるｈＥＲＧのアイソフォームやアレリック変異体等、ｈＥＲＧと類似した構造および機能を有する遺伝子は、配列番号１で表さる塩基配列を基にプライマーを設計し、ヒトのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）により得ることができる。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これら本発明のポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。また、変異の誘発は前記の通り市販のキットを用いることもできる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
＜ウイルスベクタープラスミド＞
本発明により、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を含むウイルスベクタープラスミド（以下、本発明のウイルスベクタープラスミドと称する場合がある）が提供される。ここで、ウイルスベクタープラスミドとは、ウイルス由来の塩基配列を利用して、任意の塩基配列を任意の細胞に組み込むことができるようにしたプラスミドをいう。本発明のウイルスベクタープラスミドは、本発明のｈＥＲＧ遺伝子を宿主細胞内に保持したり、該ｈＥＲＧ遺伝子にコードされるｈＥＲＧチャネルを発現させたりするのに有用である。
ウイルスベクタープラスミドを使用する場合に基となるウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＭｏＭＬＶ）などのオンコレトロウイルス由来のものや、ヒト後天性免疫不全症候群ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）などのレンチウイルス由来のものが挙げられる。
本発明において、レトロウイルスとは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オンコウイルス亜科（Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ）のオンコウイルス属（Ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）に属するウイルスをいい、レンチウイルスとは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、レンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）のレンチウイルス属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスをいう。
これまでにレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターにより効率良く細胞の染色体中に安定した遺伝子導入・発現が可能であることが示されている（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．ｖｏｌ．７ ３３−４０（２００１））。本発明のウイルスベクタープラスミドには、ｐＺＩＰｎｅｏ（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｃｅｌｌ．３７：１０５３−１０６２）、ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８３５８７−３５９６）、ｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社 ｃａｔａｌｏｇ １００４１Ｐ）、ＶｉｒａＰｏｒｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ ２１７５６３）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（Ｔａｋａｒａ ｃａｔａｌｏｇ ３６５０）等のレトロウイルスベクタープラスミド、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ Ｋ４９５５−１０）等のレンチウイルスベクタープラスミド等様々なウイルスベクタープラスミドを用いることができる。また、レトロウイルスおよびレンチウイルス以外由来のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、シンビスウイルス、センダイウイルス、トガウイルス、パラミクソウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス等を元に作製されたベクタープラスミドを利用することもできる。
レトロウイルスベクターの中では、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレトロウイルスベクターを使用することが望ましい。シュードタイプとは、一つのウイルスゲノムが別種のウイルスの外皮タンパク質に囲まれて発芽してくる現象である（Ｚａｖａｄａ，Ｊ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．１５ １８３−１９１（１９７２））。ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）は、ラブドウイルス科に属するネガティブ１本鎖ＲＮＡゲノムを持つウイルスであり、その外皮タンパク質（Ｇタンパク質）の細胞側のレセプターはホスファチジルセリンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．３２ ６３９−６４６（１９８３），Ｍａｓｔｒｏｍａｒｉｎｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８ ２３５９−２３６９（１９８７））、通常用いられる両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）のレトロウイルスベクターに比較してきわめて広い宿主域を有する（Ｅｍｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．６５ １２０２−１２０７（１９９１），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．２６０ １０９−１１５（１９９９））と共に超遠心操作により遺伝子導入能力を向上できることが報告されている（Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．９０ ８０３３−８０３７（１９９３））。従って、このＶＳＶ−Ｇ遺伝子産物を外皮に持つシュードタイプレトロウイルスを作製することにより、本来の外皮タンパク質を持つレトロウイルスに比較して効率よく各種細胞にｈＥＲＧ遺伝子を導入することが可能となる。
これらＶＳＶ−Ｇシュードタイプベクターの性質はレンチウイルスベクターにおいても同様であり、報告されているレンチウイルスベクターの多くがこのシュードタイプベクターである（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．ｖｏｌ．７ ３３−４０（２００１））。
ウイルスベクタープラスミドの好ましい態様においては、ウイルスベクタープラスミドを導入した宿主細胞内で本発明のｈＥＲＧ遺伝子が発現されるように制御配列下に結合する。ここで「制御配列」とは、プロモーターおよびターミネーターであり、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されたポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての構成成分を含むものである。
また、本発明のウイルスベクターは、選択可能なマーカーを含んでいてもよい。選択可能なマーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子（ネオマイシシ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）や蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ等）などが挙げられる。さらに、細胞内で発現されたポリペプチドを細胞膜上へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドをポリペプチドに付加するようにしてウイルスベクタープラスミドへ組み込むこともできる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
哺乳動物およびその他の動物細胞を宿主とする場合には、アデノウイルスｌａｔｅプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００）、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙプロモーター（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５−９）、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２１７−２３）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８）、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．３，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）ｐｐ．８３−１４１）、ＳＶ４０ ｌａｔｅプロモーター（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３８５−９４）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）−ＬＴＲプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６８４−７０４）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンサー、ｃＰＰＴ（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）配列およびグロビンイントロン等を使用することができる。
ウイルスベクタープラスミドへのｈＥＲＧ遺伝子の挿入は、リガーゼ反応により行うことができる。このとき、制限酵素サイトを利用することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）Ｓｅｃｔｉｏｎ ５．６１−５．６３）。
＜ウイルスベクターの調製＞
本発明において、ウイルスベクターとは、ウイルスベクタープラスミドを含有するウイルスをいう。ウイルスベクターを調製するために、ウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞には、２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）等用いることができる。ウイルスベクタープラスミドは、アデノウイルス法、エレクトポレーション（電気穿孔）法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１３３（１９９０））、カチオニックリポソーム法（カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等）、正電荷ポリマーによる導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｒｉａｌ ｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、パーティクルガンを用いる方法、リポソーム法、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）など））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、レセプター介在遺伝子導入法、レトロウイルス法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス−リポソーム法（別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社（１９９７）；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社（１９９７）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１４５８−６４（１９９４）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ１２１２−２０（１９９６）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０：１４４０−８（１９９３）；実験医学１２：１８２２−６（１９９４）；蛋白質核酸酵素４２：１８０６−１３（１９９７）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）：４７９−８２（１９９５））、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法等によりパッケージング細胞に導入することができる。
パッケージング細胞を適当な培地にて培養し、上記方法によりウイルスベクタープラスミドをトランスフェクションし、その後、一定時間培養し、培養液を回収することでウイルスベクターを得ることができる。また、トランスフェクション後、必要に応じて２から２４時間後、好ましくは６から１２時間後に培地を交換することができる。培地を交換した後、さらに１２時間から７２時間培養し、培養液を回収することでウイルスベクターを得ることができる。回収した培養液は、必要に応じて遠心操作、フィルター（０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）等）によるろ過を行うことができる。
＜ウイルスベクターの濃縮＞
本発明のウイルスベクターは、そのままでも用いることができるが、濃縮した方が、より好ましい。前記操作により得られたウイルスベクターを超遠心操作することで、濃縮ウイルスベクターを得ることができる。超遠心は、少なくとも３５，０００ｇ（ｇは重力加速度を表す）以上、好ましくは５５，０００ｇ以上を、少なくとも１００分以上、好ましくは１２０分以上行う。超遠心は、例えば、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）および超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、１９５００ｒｐｍ，１００分行うことによりできる。
＜ｈＥＲＧ遺伝子の導入＞
本発明において、ｈＥＲＧ遺伝子の細胞への導入は、本発明のウイルスベクターをそのまま用いることもできるが、濃縮したものを用いた方がより好ましい。
本発明のｈＥＲＧチャネル癸現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団における宿主細胞には、哺乳類由来の真核細胞を用いることができ、好ましくは、ＣＨＯ（中でもＤＨＦＲ遺伝子欠損ｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−２０（１９８０）およびＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０：１２７５（１９６８））が好適である）、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞等である。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団における宿主細胞には、心臓由来のセルライン、または単離した心筋細胞若しくは洞房結節細胞を用いることもできる。本発明のｈＥＲＧ発現細胞または細胞集団には、一定条件下、例えば、薬剤刺激、電気刺激、熱刺激、光刺激などにより、転写を調節し、発現を調節することができる細胞も含まれる。
宿主細胞を培養し、培養液にウイルスベクターを添加し、さらに培養することで遺伝子導入することができる。ウイルスベクターは、濃縮したものを用いるのが好ましい。添加するウイルスベクターには、必要に応じてｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）を加えることができる。ウイルスを加えた後、２４時間後に培地を交換することが好ましい。また、培地を交換した後、７２時間程度培養することで細胞あたりの発現量を最大とすることができる。
＜ｈＥＲＧチャネル発現細胞、ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団＞
以上の方法により、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞およびｈＥＲＧチャネル発現細胞集団が提供される。培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ、Ｆ１２等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリンまたはストレプトマイシンなどを添加することができ、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気および攪拌を行ったりすることができる。
本発明の方法により得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞の細胞集団（以下、「本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団」と称することがある）の中には、チャネル発現細胞（以下、本発現のｈＥＲＧチャネル発現細胞と称することがある）が多数存在しており、中でも、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネル発現細胞を多く含むものである。その含有率は、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体のうち、少なくとも４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞は、遺伝子の導入操作内容が同一の操作内容である限り、同一実験系で導入された細胞全体を母数としてもよく、異なる実験系（例えば異なる実験日に行われた場合等）で導入された細胞を全体にまとめて母数としてもよい。ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団のｈＥＲＧ電流の平均は０．３ｎＡ以上であり、好ましくは０．６ｎＡ以上であり、より好ましくは０．８ｎＡ以上であり、さらに好ましくは１．０ｎＡ以上である。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団の全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流は、後述のパッチクランプ法により測定することができる。なお、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法によって測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネル発現細胞の含有率は、無作為に選び出した複数の細胞それぞれについて、ｈＥＲＧ電流を測定することにより、ｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上の細胞の割合を算出することができる。
また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団は、後述のクローニングにより得られる細胞、細胞株も含まれる。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団は、クローニングで得られた細胞株に、さらにｈＥＲＧ遺伝子を導入して得られる細胞、細胞集団も含まれる。
＜ｈＥＲＧチャネル発現細胞のクローニング＞
本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、そのまま用いることも可能であるが、培養中に性質が偏ることを避け、安定した薬物評価を可能とするためにクローニングを行うことができる。細胞クローニングは、定法（例えば、限外希釈法、フローサイトメトリーによるセルソーティング等）により行うことができる。クローニング後の細胞株から、発現量の測定、パッチクランプ法によるｈＥＲＧチャネルの機能的解析により最適なｈＥＲＧチャネル発現細胞株を選別することができる。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞における発現量は、抗ｈＥＲＧチャネル抗体を用いた免疫組織学的な解析方法により測定できる。抗体は、定法により作製してもよく、市販のもの（例えば、Ａｌｏｍｅｎｅ Ｌａｂｓ）を用いてもよい。免疫組織学的な解析方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色等があげられる。
このクローニングにより、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上の細胞がより容易に提供される。
＜ｈＥＲＧ電流の測定方法＞
本発明は、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流を測定する方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を用いて、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムにより、ｈＥＲＧ電流を測定する方法を提供する。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、前述の本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を作製する方法などにより得ることができる。本発明のｈＥＲＧ電流の測定方法において使用されるｈＥＲＧチャネル発現細胞のｈＥＲＧチャネル発現量は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上であることが望ましく、当該細胞あるいは当該細胞集団も本発明の範囲に含まれる。なお、発現量が多いほどパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が高くなる。
本発明のｈＥＲＧ電流の測定方法を実施するためには、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーは、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよい。好ましくはｐＨ７．４のｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。
次に、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、種々の保持電位および脱分極パルスを細胞に与えることにより誘発することができる。これらの条件については、当業者であれば容易に設定することができる（Ｚｈｏｕ，Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７４，２３０−２４１（１９９８））。例えば、保持電位を、−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて、脱分極パルスを−５０ｍＶへ１秒間与えることにより誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、−５０ｍＶへ電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
＜本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を用いたｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法＞
ｈＥＲＧ電流の阻害活性を有する化合物は、ＱＴ延長作用を伴う催不整脈作用を有することが知られており、心室頻拍や突然死といった重篤な副作用を誘発することがある。そのため、安全性の高い医薬品開発には、その開発の対象となる被検物質がｈＥＲＧ電流に影響を与えないことを確認することが必須である。よって、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を用いたｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法は、ｈＥＲＧ電流に影響を与えない被検化合物を選択することを容易とするものであり、従って、本発明の阻害活性測定方法は、種々の疾病の治療・予防剤などの医薬の開発に有用である。
すなわち、本発明は、
（Ａ）ｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させることを特徴とするｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法を提供する。本発明のｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法においては、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させる前と接触させた後における、例えば、当該細胞のｈＥＲＧ電流を測定して比較することができる。たとえば、ｈＥＲＧ電流の阻害活性は、被検化合物を接触させる前のｈＥＲＧ電流の大きさに対する当該化合物を接触させた後のｈＥＲＧ電流の大きさの比を指標に用いることができる。
（Ｂ）ｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団を用いることを特徴とするｈＥＲＧ電流を変化させもしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させた場合と接触させない場合との比較を行うことを特徴とするｈＥＲＧ電流を変化させもしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団に、被検化合物を接触させた場合と接触させない場合における、例えば、当該細胞のｈＥＲＧ電流を測定して比較することができる。例えば、被検化合物を接触させない場合よりも接触させた場合のｈＥＲＧチャネル電流が小さいとき、当該被検化合物をｈＥＲＧチャネル電流を阻害する化合物とすることができる。
ｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団は、本発明のｈＥＲＧ発現細胞、本発明のｈＥＲＧ発現細胞集団を用いることができ、あるいは前述の本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を作製する方法などにより得ることができる。本発明のｈＥＲＧ電流の阻害活性の測定方法において、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団のｈＥＲＧチャネル発現量は、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が、少なくとも０．４ｎＡ以上、好ましくは０．６ｎＡ以上、さらに好ましくは０．８ｎＡ以上、より好ましくは１．０ｎＡ以上、特に好ましくは１．２ｎＡ以上である。なお、発現量が多いほどパッチクランプ法により測定されるチャネル電流が高くなり、高感度な測定系の構築が可能になる。
本発明の（Ａ）または（Ｂ）の前記の方法を実施するためには、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞または細胞集団を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーには、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよい。好ましくは、ｐＨ７．４ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。
まず、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、種々の保持電位および脱分極パルスを細胞に与えることにより誘発することができる。これらの条件については、当業者であれば容易に設定することができる。例えば、保持電位を、−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて、脱分極パルスを−５０ｍＶへ１秒間与えることにより誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
次に、ｈＥＲＧチャネル発現細胞に被検化合物を共存させる。このとき、コントロールとして、被検化合物を含まないものやｈＥＲＧ電流を阻害することが知られている化合物を加えた細胞も用意することができる。ｈＥＲＧ電流を阻害する化合物としては、アステミゾール（Ｔａｌｉａｌａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５４：１１３−２１）、Ｅ−４０３１（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．（１９９８）７４：２３０−４１）、リスペリドン（Ｋｏｎｇｓａｍｕｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）４５０：３７−４１））、ベラパミル（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：９８９−９８）、キニジン（Ｊｉｅｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２００１）２９９：２９０−６．）があげられる。反応は、例えば、１５℃から３７℃、好ましくは２０℃から３０℃で、１０秒から６０分、好ましくは３分から１０分行う。
そして、パッチクランプ法、好ましくは全自動ハイスループットパッチクランプシステ厶を用いて、ｈＥＲＧ電流を記録することができる。ｈＥＲＧ電流は、被検化合物共存前と同条件により誘発することができる。ｈＥＲＧ電流の大きさには、電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いることができる。
例えば、被検化合物を接触させる前のｈＥＲＧ電流の大きさを１００％、０ｎＡを０％とすることで、被検化合物を接触させた後のｈＥＲＧ電流の大きさから抑制率を算出し、被検化合物のｈＥＲＧ電流に対する阻害活性を測定できる。さらに、被検化合物の用量を変化させることで、被検化合物固有の阻害活性値を算出することも可能である。また、ｈＥＲＧ電流を５０％阻害する濃度が、少なくとも０．３μＭ以上、好ましくは１．０μＭ以上、より好ましくは３．０μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上、最も好ましくは３０μＭ以上である場合には、ｈＥＲＧ電流に影響を与えない、あるいは阻害活性を有さないと判断することができる。
被検化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
＜本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞によるＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いた膜電位変化の測定方法＞
本発明は、ｈＥＲＧチャネル発現細胞によるＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた膜電位変化の測定方法を提供する。
具体的には、以下のように操作を行うことで、測定することができる。本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞を、前述の適当な方法で一定期間培養し、測定に適したバッファーに懸濁する。バッファーには、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈＥＲＧ電流に影響を与えないバッファーであれば何でもよく、好ましくは、ｐＨ７．４ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅである。細胞懸濁液は、０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌから１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製することが好ましい。次に、懸濁した細胞をプレート（例えば、Ｂｉｏｃｏａｔ Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｐｌａｔｅ（ＢＥＣＫＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）等を利用する）に蒔き、さらに培養する。細胞は、５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔くことができる。また、２日間程度培養することが好ましい。次に、ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＣｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを測定用緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２４ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、（最終ｐＨ約７．２５））に溶解し、１ウェル当たり２５μｌ加える。Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを添加してから約１時間後、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社）を用いて膜電位変化の測定を行うことができる。測定プログラムは、当業者にとって適当な条件を設定でき、例えば、被検化合物添加前に１０回、添加後に５０回、６秒毎とすることができる。測定は室温で行うことができる。ｈＥＲＧ阻害活性は、被検化合物添加により変化した蛍光強度から算出することができる。陽性対照として、Ｅ４０３１、Ｄｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅ等を用いることができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＶａｌまたはＶ：バリン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号１〕ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０で表される塩基配列を示す。
〔配列番号２〕ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０で表されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号３〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号４〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号５〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号６〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプラィマー塩基配列を示す。
〔配列番号７〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号８〕ｈＥＲＧ遺伝子をクローニングするためのプライマー塩基配列を示す。
〔配列番号９〕ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１０〕ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１１〕ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１２〕ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔを挿入するための塩基配列を示す。
〔配列番号１３〕ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏの塩基配列を示す。
【実施例】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［実施例１］ｈＥＲＧ遺伝子の調製
ｈＥＲＧ遺伝子の単離は、配列番号１で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。ここでは４０７０ ｂｐｓが示されており、ｈＥＲＧチャネルをコードする領域（ストップコドンを除く）は、１８４−３６６０（３４７７ ｂｐｓ，１１５９アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号３から８までに示すｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを作製した（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。
ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６５１６−１）を鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ）によりｃＤＮＡを作製した。次に、このｃＤＮＡ鋳型とし、配列番号３および４、配列番号５および６並びに配列番号７および８からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡをプライマーとして、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、（９５℃３０秒−６１℃３０秒−６８℃１分）を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。プライマーの塩基配列は以下の通りである。
その結果、それぞれ約１．２，１．２，１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
これらのＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔａｌｏｇ６９９６７−３）に挿入し、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により配列を確認した。その結果、配列番号３および４からなるプライマーの組み合わせによって得られた１１７９ｂｐｓの配列は、配列番号１における１７３ｂｐから１３５１ｂｐと同一であった。一方、配列番号５および６ならなるプライマーの組み合わせによって得られた１１６８ｂｐｓの配列中には２つの変異（Ａ１８７５Ｇ，Ｔ２１４９Ｃ）が見られたが、これらの変異は、該当部位の塩基配列から翻訳されるアミノ酸（Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）には影響を与えないことが明らかである。また、配列番号７および８からなるプライマーの組み合わせによって得られた１６４２ｂｐｓの配列中には２つの変異（Ｃ２４２０Ｔ，Ａ３３６７Ｇ）が見られたが、今回得られた複数のクローンで同一の変異を有していたことから、今回使用している試料中（ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６５１６−１））のｈＥＲＧ遺伝子として正しいと判断した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断した。また、配列番号３および４からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、配列番号５および６からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へ、リガーゼ反応（ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．６０２２）により挿入してｐＢＳ−１＆１４＆１５＆１８を作製した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。また、配列番号７および８からなるプライマーの組み合わせによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へ、リガーゼ反応により挿入してｐＢＳ−６＆４を作製した。
さらに、ｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。また、ｐＢＳ−１＆１４＆１５＆１８をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで、ｐＢＳ−６＆４をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。次に、ここで得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＲＥＰ７中へリガーゼ反応により挿入して、ｈＥＲＧ遺伝子を含むｐＲＥＰ７ＨＥＲＧを得た。
［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８ ３５８７−３５９６）（配列番号１３）から、制限酵素ＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）により平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６０３ｌ−１）から制限酵素ＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＰを得た（図１）。
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｌａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８ ３５８７−３５９６）（配列番号１３）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６０６１−１）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た（図２）。
ｐＢａｂｅＸＩＰから制限酵素ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃１００４１Ｐ）から制限酵素ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＰを得た（図３）。
ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃１００４１Ｐ）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た（図４）。
ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨから制限酵素ＢｇｌＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ ＃６０２９−１）から制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを切り出したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇを得た（図５）。
ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨからＢｇｌＩＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ＃６９３８−１）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｎｅｏ（ｒ）を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮを得た（図６）。
［実施例３］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸａＩＮを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ａＩＮを得た（図７）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＨを得た（図８）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＰをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）ＩＰを得た（図９）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩ２ＧをＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇを得た（図１０）。
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨをＢｇｌＩＩで切断し、ＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化した。ここへ実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）を得た（図１１）。
［実施例４］レンチウイルスベクタープラスミドの調製
マルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）挿入のために配列番号：９および１０からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡを作製した（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。ｏｌｉｇｏ ＤＮＡの塩基配列を以下に示す。
配列番号９及び１０のｏｌｉｇｏ ＤＮＡを、９８℃、５分間の熱変性後に緩やかに室温に戻すことでアニーリングさせた。
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ Ｋ４９５５−１０）からＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断することによりｌａｃＺ−Ｖ５ ｅｐｉｔｏｐｅ−ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＥＭ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（ｒ）を除き、ここへ上記ｏｌｉｇｏ ＤＮＡを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳを得た（図１２）。
ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ（ｃＰＰＴ）を導入し遺伝子導入能力を上昇させるために報告されている方法を参考にして、配列番号：１１および１２に示すｏｌｉｇｏ ＤＮＡプライマーを作製した（Ｚｅｎｎｏｕ，Ｖ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１０１ １７３−１８５（２０００））（日本バイオサービス（埼玉県朝霞市）に依頼）。
配列番号：１１および１２からなるｏｌｉｇｏ ＤＮＡをプライマーとして、ｐＬＰ１（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｇａｔｅｗａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋ４９６０−００）プラスミドを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、（９５℃３０秒−６１℃３０秒−６８℃１分）を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。その結果、約０．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔａｌｏｇ ６９９６７−３）に挿入し、ｃＰＰＴ−ｐＴ７Ｂｌｕｅを得た。このＤＮＡ断片の塩基配列は、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により配列が報告されているｃＰＰＴ（Ｚｅｎｎｏｕ，Ｖ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１０１ １７３−１８５（２０００））と同一であることを確認した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ここへｃＰＰＴを含むＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｃＰＰＴ−ｐＴ７Ｂｌｕｅ並びにＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳを挿入しｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｐＢＳを得た。
ｐＬｅｎｔｉ６／ＭＣＳをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断してＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを除き、ここへｃＰＰＴ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｐＢＳを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＭＣＳを得た。ｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＭＣＳをＫｐｎＩで切断し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化した。ここへｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｃａｔａｌｏｇ ６０２９−１）からＨｉｎｃＩＩによりＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ断片を切り出したものを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２Ｇを得た（図１３）。
［実施例５］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクタープラスミドの調製
実施例４で得たｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−ＸＩ２ＧをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。ここへ実施例３で得たｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２ＧからＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより末端を平滑化したものを挿入しｐＬｅｎｔｉ６／ｃＰＰＴ−（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇを得た（図１４）。
［実施例６］ベクタープラスミドの調製
実施例１で得たｐＲＥＰ７ＨＥＲＧからＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｈＥＲＧ遺伝子を切り出し、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開環したｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入しｐＺｅｏｈＥＲＧを得た。
ｐＺｅｏｈＥＲＧをｄａｍ−大腸菌株ＳＣＳ１１０に導入し、大量培養に続いてプラスミドを調製した後、当該プラスミドから得られたＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｈＥＲＧ遺伝子（ＣｌａＩ／ｆｉｌｌ−ｉｎ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を、ｐｃＤＮＡ３．１ ＮｅｏからＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを除いたＤＮＡ断片（ＮｕｒＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで開環した物）に導入しｐＳＶ ｈＥＲＧ−Ｎｅｏを作製した。発現ベクターを導入した大腸菌の大量培養は定法にて行い、ベクターの精製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。
［実施例７］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０６の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ 東京 ｃａｔａｌｏｇ４０２０−０１０）にＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ Ｄ５７９６）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＥＢＮＡ培養液とする）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ＃２１７５６６）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ｃａｔａｌｏｇ＃２１７５６７）、および実施例３で得たｐＢａｂｅＣＬ（ｈＥＲＧ）Ｉ２Ｇ、それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．ｃａｔａｌｏｇ ＭＩＲ２３００）を用いてトランスフェクションした。その６−１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして以後の実験に供した。
［実施例８］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターの調製
４×１０６の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇ Ｒ６２０−０７）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ 東京 ｃａｔａｌｏｇ４０２０−０１０）にＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ Ｄ５７９６）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＥＢＮＡ培養液とする）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＬＰ１，ｐＬＰ２，ｐＬＰ／ＶＳＶＧ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔａｌｏｇＫ４９７０−１０）、および実施例５で得たヒトｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクタープラスミド、それぞれ２．５μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．ｃａｔａｌｏｇ ＭＩＲ２３００）を用いてトランスフェクションした。その６−１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＬＨＶ０２５ＬＳ）でろ過したものを非濃縮レンチウイルスベクターとして以後の実験に供した。
［実施例９］レトロウイルスベクターの濃縮
実施例７で調製したウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ５０Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ３４４０５８）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って１９，５００ｒｐｍ１００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。一時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。必要に応じて、濃縮ウイルスベクター溶液を集め再度超遠心操作を行って再濃縮ウイルスベクター溶液を調製した。
［実施例１０］レンチウイルスベクターの濃縮
実施例８で調製したウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。超遠心用チューブ５０Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．ｃａｔａｌｏｇ３４４０５８）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って１９，５００ｒｐｍ １００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。一時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。必要に応じて、濃縮ウイルスベクター溶液を集め再度超遠心操作を行って再濃縮ウイルスベクター溶液を調製した。
［実施例１１］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
実施例７で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３８）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例７で調製したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１２］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
実施例８で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例８で調製したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１７、および実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１３］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−２
実施例９で遠心濃縮したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１４］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−３
実施例１８に示す細胞クローニングを行い、適切なｈＥＲＧ電流が記録できた細胞株に対して、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
実施例１３で得られたｈＥＲＧ発現細胞株（３×１０３）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例９で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを最終濃度８μｇ／ｍｌとなるように、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１５］ｈＥＲＧ遺伝子導入用レンチウイルスベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製−２
実施例１０で調製したウイルスベクターによる細胞へのｈＥＲＧ遺伝子導入を以下のように行った。
３×１０３のＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ．ｃａｔａｌｏｇ３５−３０７５）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．ｃａｔａｌｏｇ１１３２０−０３３）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）（以下、ＣＨＯ培養液とする）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例１０で遠心濃縮したウイルスベクター１００μｌを、培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８ 別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）とともにＣＨＯ細胞に加えた。その翌日、ウイルスベクターを含む培養液をＣＨＯ培養液２００μｌと交換し、さらに、３日間培養した。ここで得られたｈＥＲＧ遺伝子導入細胞は、細胞集団としておおよその性質を知るために以下の実験に供すると共に、必要に応じて実施例１７および実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１６］リポフェクション法を用いたｈＥＲＧ遺伝子導入用ベクターによるｈＥＲＧ発現細胞の調製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研ジーンバンク・細胞開発銀行）へのｈＥＲＧ遺伝子導入用ベクターの導入をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従って以下のように行った。
直径６ｃｍ培養シャーレに２日間培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＴＥ溶液に溶解した約１μｇのｈＥＲＧ発現ベクター（ＳＶ−ｈＥＲＧ−ｎｅｏ）と８μＬのＥｎｈａｎｃｅｒを最終容量１５０μＬになるように混和し、約１秒間攪拌した後、室温で２−５分間静置した。次に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μＬ加え約１０秒間攪拌した後、室温で５−１０分間静置し、培地を１ｍＬ加えた。この溶液を、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、４ｍＬの培地を加えた培養シャーレに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、トリプシンにて細胞を培養シャーレから剥がし、５００μｇ力価のＧ４１８を含む培地に懸濁した。数日間培養した後、実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１７］ＧＦＰ発現を指標としたＦＡＣＳによるｈＥＲＧ高発現細胞の分離濃縮
実施例１２または実施例１５で調製したｈＥＲＧ導入細胞の中からＧＦＰ発現を指標としＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、より高発現の細胞を分離濃縮した。１０ｃｍ ｄｉｓｈに調製した細胞をｔｒｙｐｓｉｎで剥がし、ＦＡＣＳＡｒｉａの使用法に従ってＧＦＰが高発現している細胞のみを分離した。分離後の細胞を解析したところＧＦＰ高発現の細胞が濃縮されていることが示された。得られた細胞は実施例１８に示す細胞クローニングを行って以下の実験に供した。
［実施例１８］ｈＥＲＧチャネル発現細胞のクローニング
細胞のクローニングは限外希釈法にて行った。９６ｗｅｌｌ培養プレートの１ｗｅｌｌあたり０．３個の細胞になるように細胞懸濁液を調整し、各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注した。約２週間後、顕微鏡観察下で、１つのｗｅｌｌに１つの細胞集団（コロニー）が観察されたｗｅｌｌの細胞を２４ｗｅｌｌ培養プレートに移し継続して培養した。また、その後Ｆ７５培養フラスコまで規模を拡張し、ウェスタンブロット法によるタンパク発現の確認と電気生理学的手法によるｈＥＲＧチャネルの機能的発現によりｈＥＲＧチャネル発現細胞株を選別した（実施例１９および２０）。
［実施例１９］ウェスタンブロット法によるｈＥＲＧチャネルの検出
本試験は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。６穴プレートにて培養したそれぞれの細胞を、氷冷ＰＢＳにて洗浄し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を添加したＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮｏｎｉｄｅｔＲ Ｐ−４０、０．５％ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｏｄｉｕｍ）を加え、セルスクレイパーで剥がした。剥がした細胞をエッペンドルフチューブに回収し、４℃にて１０，０００ｒｐｍ（遠心機：ＭＲＸ−１５２、ローター：ＴＭＡ−６、トミー精工）で３分間遠心した後、上清をサンプルとして回収した。サンプルのタンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
タンパク質の電気泳動、転写にはＮＯＶＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の装置を使用した。回収したサンプルに、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適量加え、９５℃にて３分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ ３−８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサンプルをアプライし、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１２０Ｖで約一時間電気泳動を行った。電気泳動を終えたゲルを、Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）とともにＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅｌｏｃｋＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にセットし、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０Ｖで約一時間、転写を行った。
一次抗体にはＡｎｔｉ−ＨＥＲＧ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）を、二次抗体にはＡｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）を用いた。一次抗体反応後と二次抗体反応後には、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにてＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅの洗浄を行った。結合抗体の検出には、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いた。
その結果、ｎｏｒｍａｌ ＣＨＯ−Ｋ１細胞にはｈＥＲＧタンパクに相当する分子量約１５０ｋＤのバンドは全く検出されなかった（図１５、レーン１）。また、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株Ｍ３細胞には、わずかにｈＥＲＧタンパクのバンドが検出された（図１５、レーン２）。それに対して、レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株には明らかに多量のｈＥＲＧタンパクが検出された（図１５、レーン３）。
［実施例２０］全自動ハイスループットパッチクランプシステムによるｈＥＲＧ電流の測定および電流分布比較
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞（実施例１３）および細胞株（実施例１４）を用いて行った。ｈＥＲＧチャネル発現細胞をＦ７５培養フラスコで培養した。培養した後、ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）溶液を用いてＦ７５培養フラスコから剥がし、適当な濃度（１．０〜１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）になるように細胞をＰＢＳ溶液に懸濁した。その細胞懸濁液をＩｏｎＷｏｒｋｓ ＨＴＴＭシステムの細胞用リザーバーに移した。ｈＥＲＧ電流測定の手順としては、測定用プレート（ＰａｔｃｈＰｌａｔｅＴＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）の各ウェルにＰＢＳを分注し、次に細胞浮遊液を分注し、ウェルの中央にある穴に細胞がシールを形成するまで放置した。シール形成後、アンフォテリシンＢを含む溶液（ＫＣｌ １４０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２５−７．３）を灌流し、穿孔パッチを形成させた。穿孔パッチ形成後、刺激電極を介した膜電位固定法により細胞に電位変化を与え、ｈＥＲＧ電流を誘発させ、ｈＥＲＧ電流を記録した。
ｈＥＲＧ電流は、電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ１秒間、続いて−５０ｍＶへ１秒間変化させ誘発させた。ｈＥＲＧ電流の大きさは、−５０ｍＶに電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いた。リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株から記録されたｈＥＲＧ電流の分布を図１６および表１に示す。
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１６）のｈＥＲＧ電流分布（表１、図１６のＡ）よりも、レトロウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞（実施例１３）の電流分布は大きく（表１、図１６のＢ）、また細胞株（実施例１４）の電流分布は明らかに大きかった（表１、図１６のＣ）。
表１において、Ａは、リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＢはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、ＣはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株のｈＥＲＧ電流分布を表わす。
さらに、化合物のｈＥＲＧ電流阻害活性を、より安定的に評価するためにカットオフ値を設定し、各ｈＥＲＧ発現細胞のｈＥＲＧ電流について解析した。カットオフ値としては、１）＋２０ｍＶに脱分極したときの電流値に対する末尾電流のピーク値の比が０．８未満、２）シール抵抗が３０ＭΩ末満の２項目を設定し、それらの条件を満たすデータについて解析した。
カットオフ値を設定し、解析した結果を図１７および表２に示す。
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１６）のｈＥＲＧ電流分布（表２、図１７のＡ）よりも、レトロウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞（実施例１３）の電流分布は大きく（表２、図１７のＢ）、また細胞株（実施例１４）の電流分布は明らかに大きかった（表２、図１７のＣ）。さらに、一年間継続培養した細胞の電流は安定していた（表２、図１７のＤ）。また、レンチウイルスを用いてｈＥＲＧ遺伝子を導入し樹立した細胞株（実施例１８）の電流分布もレトロウイルスを用いて樹立した細胞株と同様に明らかに大きく、このことは一年間継続培養してもｈＥＲＧチャネルが安定して発現していることを意味していた（表２、図１７のＥ）。
表２において、Ａは、リポフェクション法によりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＢはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞、ＣはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株、ＤはレトロウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株を一年間継続培養した細胞株、ＥはレンチウイルスによりｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株のｈＥＲＧ電流分布を表わす。
［実施例２１］全自動ハイスループットパッチクランプシステムによる被検化合物のｈＥＲＧチャネル阻害活性の評価
リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１６）およびレトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。ｈＥＲＧ電流の測定は実施例２０と同様に行った。また、被検化合物または既知化合物のｈＥＲＧチャネルに対する阻害活性は、被検化合物添加前に記録された末尾電流のピーク値を１００％としたときの、各濃度の被検物質を添加した後の末尾電流のピーク値の割合から抑制率を算出した。被検化合物のそれぞれの濃度における抑制率よりｈＥＲＧ電流に対する阻害活性値（ＩＣ５０値）を算出した。
各薬剤の評価濃度は、アステミゾール、Ｅ−４０３１、リスペリドン、ベラパミルが０．０１６，０．０４８，０．０１４，０．０４１，０．１２３，０．３７，１．１１，３．３３μＭ、キニジンは０．０４８，０．０１４，０．０４１，０．１２３，０．３７，１．１１，３．３３，１０μＭとした。また、薬剤は約４分間作用させた。
その結果、リポフェクション法でｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株では、殆どのデータポイントが欠落していたが、レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株では、全てのデータを取得でき、各薬剤のＩＣ５０値（０．０８３、０．０４４、０．５３６、０．７２０、０．３８５μＭ）も求めることが出来た（図１８）。
［実施例２２］ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いた膜電位変化の測定
レトロウイルスでｈＥＲＧ遺伝子を導入した細胞株（実施例１４）を用いて行った。また、ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社）を用いた。ｈＥＲＧチャネル発現細胞を、測定二日前にＢｉｏｃｏａｔ Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ Ｐｌａｔｅ（ＢＥＣＫＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）に蒔いた。細胞溶液は１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製し、１ウェル当たり２５μｌとした。ＦＬＩＰＲ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓａｙ ＫｉｔのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａを測定用緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２４ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、（最終ｐＨ約７．２５））に溶解し、１ウェル当たり２５μｌ加えた。ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡを添加してから約１時間後、ＦＤＳＳ６０００を用いて膜電位変化の測定を行った。測定プログラムは、被検物質添加前に１０回、添加後に５０回、６秒毎とした。測定は室温で行った。ｈＥＲＧ阻害活性は、被検物質添加後５分間で変化した蛍光強度から算出した。陽性対照として、Ｅ４０３１、Ｄｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅを用いた。
結果を図１９に示す。ＫＣｌ添加によって、膜電位が脱分極したことを意味する蛍光強度の変化が観察された。また、ｈＥＲＧ阻害剤であるＥ４０３１およびＤｏｆｅｔｉｌｌｉｄｅによっても同様の膜電位変化が見られ、その変化は濃度依存的であった。
［実施例２３］古典的パッチクランプ法によるｈＥＲＧ電流の記録
古典的パッチクランプ法によるｈＥＲＧ電流の記録は、本発明のｈＥＲＧ発現細胞を用いて行った。また、ｈＥＲＧ電流の測定を論文［Ｚｈｏｕ，Ｚ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７４，２３０−２４１（１９９８）］を参考に以下のように行った。
ポリリジンをコーティングしたガラスプレート上に細胞を蒔き、２〜４日間培養した。実験時に細胞を蒔いたガラスプレートを電流測定用バスに移動した。ｈＥＲＧ電流は、ホールセルパッチクランプ法の膜電位固定法にて観察した。ｈＥＲＧ電流の記録用の溶液としては、細胞外灌流溶液（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ４ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４）および電極内溶液（ＫＣｌ １３０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ ５ｍＭ、ＥＧＴＡ ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ｐＨ７．２）を用いた。ｈＥＲＧ電流の測定には電流増幅装置（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、電流の記録および解析にはｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。ｈＥＲＧ電流は、電位を−８０ｍＶから＋２０ｍＶへ５秒間、そして−５０ｍＶへ４秒間変化させ、この電位変化を２０秒間隔で細胞に与え誘発した。また、ｈＥＲＧ電流の大きさには、−５０ｍＶに電位を戻した際に観察される末尾電流のピーク値を用いた。
【産業上の利用可能性】
本発明により、薬剤研究開発でのｈＥＲＧチャネル阻害に基づく副作用を予測するための発現レベルの著しく高いｈＥＲＧチャネル発現細胞の樹立法を確立し、それにより高感度で処理能力の高い評価を可能とした。
本発明により、同時に効率よくｈＥＲＧチャネルの高発現細胞を得られることを利用して、多様な細胞種に対してｈＥＲＧ遺伝子を高レベルで発現させることにより、各細胞種間で内在性のイオンチャンネルの影響を比較することで、薬剤研究開発における副作用予測を行う上で最も適切な細胞種を選択することを可能としている。また、本発明のｈＥＲＧチャネル発現細胞またはｈＥＲＧチャネル発現細胞集団は、長期間安定的にｈＥＲＧチャネルを発現することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
配列番号１０：ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
本明細書において引用した刊行物は、全体を通して本明細書に組み込むものとする。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のチャネルを発現することができる細胞を、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体の４０％以上含む、ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団。
【請求項２】
ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである請求項１記載の細胞集団。
【請求項３】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項２記載の細胞集団。
【請求項４】
ｈＥＲＧ電流の細胞全体の平均が０．３ｎＡ以上である請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項５】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が１．０ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネルを発現することができる細胞。
【請求項６】
ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである請求項５記載の細胞。
【請求項７】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項６記載の細胞。
【請求項８】
ウイルスベクターを用いてｈＥＲＧチャネルを発現させることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法。
【請求項９】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスベクターを超遠心により濃縮する工程を含むことを特徴とする、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
【請求項１３】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
【請求項１５】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１７】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１９】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項１】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が０．６ｎＡ以上のチャネルを発現することができる細胞を、ｈＥＲＧ遺伝子が導入された細胞全体の４０％以上含む、ｈＥＲＧチャネル発現細胞集団。
【請求項２】
ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである請求項１記載の細胞集団。
【請求項３】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項２記載の細胞集団。
【請求項４】
ｈＥＲＧ電流の細胞全体の平均が０．３ｎＡ以上である請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項５】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いたパッチクランプ法により測定されるｈＥＲＧ電流が１．０ｎＡ以上のｈＥＲＧチャネルを発現することができる細胞。
【請求項６】
ｈＥＲＧ遺伝子の導入がウイルスベクターによるものである請求項５記載の細胞。
【請求項７】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項６記載の細胞。
【請求項８】
ウイルスベクターを用いてｈＥＲＧチャネルを発現させることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法。
【請求項９】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスベクターを超遠心により濃縮する工程を含むことを特徴とする、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
【請求項１３】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流の阻害活性を測定する方法。
【請求項１５】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞集団または請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１７】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法により作製された細胞集団または細胞を用いることを特徴とする、ｈＥＲＧ電流を変化させ、もしくは変化させない化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１９】
全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１８】
【図１９】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７５００
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【発行日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５５０７（Ｐ２００５−５１５５０７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７４４１
【国際出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【発行日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７４４１
【国際出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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