ｉＰＳ細胞を生成するための方法
多能性幹細胞の誘導の方法および組成物が開示されている。例えば特定の態様においてレポーター遺伝子を使用する誘導多能性幹細胞を生成するための方法が記載されている。さらに本発明は、レポーター遺伝子を使用する新規再プログラムベクターを提供する。一局面において、本発明は、多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクターを提供し、このカセットは、（ａ）転写制御エレメント、ならびに（ｂ）前記転写制御エレメントに機能的に連結した第１および第２コード配列であって、前記第１コード配列が再プログラム因子をコードし、かつ前記第２コード配列が第２再プログラム因子またはレポーターをコードする、第１および第２コード配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年８月１２日に出願された米国特許出願第６１／０８８，０５４号（この全体の開示は、放棄することなくその全体が、参考として具体的に本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に幹細胞の分野に関する。より詳細には、体細胞の再プログラムに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
一般に幹細胞は、一連の成熟した機能細胞を生じうる未分化細胞である。例えば造血幹細胞は、最終分化した血液細胞の様々な型のいずれをも生じうる。胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚由来であり、多能性であり、したがっていかなる器官もしくは組織型または少なくとも潜在的には完全な胚に発生する能力を有する。
【０００４】
慣用でｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、特定の遺伝子を挿入することによって非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の１種である。誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と多くの点で、例えば特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存キメラ形成、ならびに能力および分化能において同一であると考えられているが、天然の多能性幹細胞とのそれらの完全な関連性はいまだ評価が続いている。
【０００５】
ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から（非特許文献１）、および２００７年にヒト細胞から（非特許文献２；非特許文献３）初めて産生された。これは、論争を呼ぶ胚の使用を行わずに、研究において重要でありかつ治療的使用の可能性を有する多能性幹細胞を研究者が得られるようにする可能性があることから幹細胞研究における重要な進歩として挙げられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（２００６）１２６（４）：６６３〜６７６
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（２００７）１２６（４）：６６３〜７６
【非特許文献３】Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７〜１９２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしこれらの誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の研究のこの段階では、ｉＰＳ細胞を生成する効率は低く、これが臨床研究におけるｉＰＳ細胞の応用性の障害となっている。したがって誘導多能性幹細胞の産生効率を増強するための方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改善された効率で誘導多能性幹細胞を提供することにおける当技術分野での主な欠陥を克服する。第１の実施形態において誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法が提供され、この方法は：（ａ）（ｉ）転写制御エレメント、（ｉｉ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子またはレポーターをコードする）、（ｉｉｉ）第１ヌクレオチド配列の３’に位置するＩＲＥＳ、および（ｉｖ）再プログラム因子またはレポーターをコードしており、ＩＲＥＳの翻訳調節下であるように前記ＩＲＥＳの３’に位置する第２ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、（１）第１核酸が再プログラム因子をコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は他の再プログラム因子またはレポーターをコードし、（２）第１核酸がレポーターをコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードする、発現カセットを各ベクターが含む１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ；（ｂ）再プログラムベクターを体細胞集団の細胞に導入するステップ；（ｃ）集団を増大させるために細胞を培養するステップ；（ｄ）前記増大させた集団の後代細胞を選択するステップ（前記後代は胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する）；ならびに（ｅ）選択された後代細胞を培養して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップを含む。
【０００９】
特定の態様において、第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードし、第２ヌクレオチド配列はレポーターをコードするまたはその逆であり、したがって以下に記載のとおりレポーター遺伝子の同時発現は、再プログラム細胞の選択を支援する。
【００１０】
複数の再プログラム因子を同じ転写制御エレメントの下で共発現するために、発現カセットは第２ＩＲＥＳと、第２ＩＲＥＳの翻訳調節下になるように第２ＩＲＥＳの３’に位置する第３ヌクレオチド配列とを含みうる。特定の実施形態において第１および第２ヌクレオチド配列は、異なる再プログラム因子をコードできる。任意の上の状況において、レポーターは、トランスフェクションおよびｉＰＳ細胞選択の効率を改善するために第１、第２または第３ヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００１１】
本発明の効力は、感染効率の指標として役立ち、同じ多シストロン性転写物上の再プログラム遺伝子からの発現レベルと一般に相関し、細胞が多能性を完全に誘導されると抑制される蛍光タンパク質などのレポーターの発現に部分的に依存する。例えば上の方法のステップｃ）は、体細胞の集団（ここで体細胞はレポーターを発現する）を選択するステップおよび集団を増大させるために選択された細胞を培養するステップをさらに含みうる。したがって特定の態様において、蛍光補助細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用するレポーター、例えば蛍光タンパク質の発現レベルに基づいて最も少なく感染している細胞を最も効率良く選択することは可能である。
【００１２】
例示的実施形態においてレポーターは、細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでありうる。例えば蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）もしくは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはこれらの変種でありうる。使用されるレポーターに依存して、ステップｃ）における選択は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイ、発光アッセイまたはトランスフェクトされた細胞を効率的に選択するためにレポーター発現を検出または選別する当業者に公知の任意の方法を含みうる。別法または補完的な手法は、後代細胞における外来性レポーター転写物の欠如を、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡアレイもしくはハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット）などの従来法を使用して検査することである。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、１つまたは複数の再プログラムベクターに含まれる任意のヌクレオチド配列によってコードされるｉＰＳ再プログラム因子は、Ｓｏｘファミリー由来の少なくとも１つの成分およびＯｃｔファミリー由来の少なくとも１つの成分を含みうる。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を特定する転写制御階層での中核であると考えられている。例えばＳｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８でありえ、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４でありうる。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃなどの追加的因子も、再プログラム効率を増大でき、再プログラム因子の具体的なセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび場合によりＬｉｎ−２８を含む、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆおよび場合によりｃ−Ｍｙｃを含むセットでありうる。
【００１４】
さらなる実施形態においてベクターは、ウイルスベクター、より具体的にはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶ、ＳＬ−３−３−ＭＬＶまたは他の近縁関係にあるウイルスなどのレトロウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであっても良い。特定の態様において転写制御エレメントは、ウイルス遺伝子の組込みを介在するための末端反復配列領域（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＴＲ）を含みうる。
【００１５】
特定の実施形態において多シストロン性転写物は、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することによって使用されうる。例示的ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病（ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルス（ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルス（ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルス（ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルス（ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳまたはこれらの変種でありうる。詳細にはＩＲＥＳエレメントは脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳでありうる。
【００１６】
さらなる実施形態において再プログラムベクターは、リポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リン酸カルシウム、ポリカチオンもしくはポリアニオンまたは細胞中に外来性遺伝性要素を導入するために適切な任意の方法によって導入されうる。
【００１７】
本発明のさらなる態様において体細胞は、哺乳動物、より具体的にはヒト由来でありうる。体細胞は、これだけに限らないが線維芽細胞、造血細胞または間葉細胞が挙げられる最終分化した細胞または組織幹細胞であって良い。例えば体細胞は線維芽細胞である。体細胞は組織細胞バンク由来または選択されたヒト被験体、具体的には生存しているヒト由来であって良い。これらの体細胞の後代由来のゲノムは、選択されたヒト個体などの特定の供給原のこれらの体細胞に由来すると考えられる。
【００１８】
特定の態様において後代細胞は、レポーター発現の本質的な消失、未分化形態、胚性幹細胞特異的なマーカーもしくは多能性もしくは多系統分化能もしくは当技術分野において公知の任意の特徴またはこれらの組合せについて選択されうる。この選択ステップは、細胞が多能性状態にあり、分化状態に戻らないことを確実にするためにトランスフェクション後の１回または複数回の時点で使用されうる。したがって選択ステップは、再プログラムベクターが細胞に導入された少なくとも約１０日後から少なくとも３０日後などの後代細胞が自律的な多能性状態に入った後の時点であることができる。
【００１９】
具体的には後代細胞は、その利便性から未分化形態について選択されうる。胚性幹細胞特異的マーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴからなる群から選択される１つまたは複数の特異的マーカーでありうる。
【００２０】
詳細な態様において後代細胞は、再プログラムされた細胞は細胞が多能性になると外来性に導入された物質を抑制できることから、導入されたレポーター遺伝子の発現が本質的にないことに基づいてｉＰＳ細胞について選択されうる。したがってレポーター発現、例えば蛍光の本質的な消失は、形態的な特徴に加えての細胞が再プログラムされたことの指標である。そのような特徴は、導入されたレポーター遺伝子に基づいて蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイによって選択されうる。レポーター遺伝子発現の「本質的な消失」は、ｉＰＳ細胞集団の１％、０．５％、０．１％、０．０５％または任意の中間の百分率値より少ない細胞が外来性レポーター発現を含むことを意味する。
【００２１】
さらなる態様において再プログラムベクターは、（ａ）転写制御エレメント、（ｂ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子またはレポーターをコードする）、ｃ）第１のヌクレオチド配列の３’に位置するＩＲＥＳ、および（ｄ）再プログラム因子またはレポーターをコードしており、ＩＲＥＳの翻訳調節下であるようにＩＲＥＳの３’に位置する第２ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、（ｉ）第１核酸が再プログラム因子をコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は他の再プログラム因子またはレポーターをコードし、（ｉｉ）第１核酸がレポーターをコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードする、発現カセットを含むとしても開示される。
【００２２】
特定の態様において、第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードし、第２ヌクレオチド配列はレポーターをコードするまたはその逆であり、別法として第１および第２ヌクレオチド配列は異なる再プログラム因子をコードする。同じ転写制御エレメント下で複数の再プログラム因子を同時発現するために、発現カセットは第２ＩＲＥＳおよび、第２ＩＲＥＳの翻訳調節下になるように第２ＩＲＥＳの３’に位置する第３ヌクレオチド配列を含みうる。任意の上の状況において、レポーターは、トランスフェクションおよびｉＰＳ細胞選択の効率を改善するために第１、第２または第３ヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００２３】
さらなる態様において、（ａ）転写制御エレメント、および（ｂ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１および第２コード配列（第１コード配列は再プログラム因子をコードし、第２コード配列は第２再プログラム配列またはレポーターをコードする）を含む多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクターも提供される。例えば転写制御エレメントは、末端反復配列領域、プロモーター、エンハンサー、転写調節エレメントなどを含みうる。多シストロン性発現カセットに含まれる場合、第２コード配列は、再プログラムプロセスを支援するために（１つまたは複数の）コード配列の発現または発現の本質的な消失についての選択の促進のためにレポーターをコードできる。別法として第２コード配列は、プロウイルスコピーおよび、単一の多シストロン性転写物由来の２つ以上の再プログラム因子を発現することによる挿入変異の可能性を低減させるために、２番目以降の再プログラム因子でありうる。同様に多シストロン性発現カセットは、転写制御エレメントに機能的に連結した１つまたは複数の追加的コード配列（例えば第３、第４または第５コード配列など）を含みうる、ここで１つまたは複数の追加的コード配列は再プログラム因子、レポーターまたは選択マーカーをコードする。例えば選択マーカーは、抗生物質耐性マーカーまたは表面選択マーカーでありうる。
【００２４】
上に記載の再プログラムベクターの例示的実施形態において、レポーターは細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでありうる。例えば蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）もしくは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはｅＧＦＰ、ｅＲＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、ｅＣＦＰ、ｅＹＦＰなどのそれらの変種でありうる。特定の態様において再プログラムベクターは、抗生物質耐性マーカーなどの選択マーカーをさらに含みうる。
【００２５】
再プログラムベクターのさらなる実施形態において、再プログラムベクターに含まれる任意のヌクレオチド配列によってコードされるｉＰＳ再プログラム因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃを含みうる。例えばＳｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８でありえ、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４でありうる。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃなどの追加的因子も、再プログラム効率を増大できる。さらなる実施形態においてベクターは、ウイルスベクター、より具体的にはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶ、ＳＬ−３−３−ＭＬＶまたは他の近縁関係にあるウイルスなどのレトロウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に基づくベクターであっても良い。特定の態様において転写制御エレメントは、外来性遺伝子の組込みおよび転写を介在するための末端反復配列領域（ＬＴＲ）を含みうる。
【００２６】
特定の実施形態において再プログラムベクターは、１つもしくは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはコード配列の非依存的翻訳を駆動するために十分な任意の配列を含みうる。例示的ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルスＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルスＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳまたはこれらの変種でありうる。具体的にはＩＲＥＳエレメントは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳまたは口蹄疫ウイルスＩＲＥＳでありうる。
【００２７】
さらなる実施形態において、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法が提供され、この方法は（ａ）上に記載の１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ、および（ｂ）再プログラムベクターを体細胞集団の細胞に導入して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップを含む。特定の態様において、ｉＰＳ細胞を産生するための１つまたは複数の再プログラムベクターは、ＳｏｘおよびＯｃｔを含む再プログラム因子をコードするコード配列を含みうる。
【００２８】
上記方法は、（ｃ）集団を増大させるために細胞を培養するステップ、および（ｄ）増大させた集団の後代細胞を選択するステップ（後代細胞は胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する）をさらに含みうる。追加的ステップが、上記方法にさらに含まれうる：（ｅ）選択された後代細胞を培養して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップ。
【００２９】
レポーターをコードしている（１つまたは複数の）コード配列を含む再プログラムベクターについて、ステップ（ｃ）は、体細胞の集団を選択するステップをさらに含むことができ、再プログラムベクターの導入後はレポーターの発現と再プログラム因子の発現との間には相関関係があることから、選択された体細胞はレポーターを発現する。ステップ（ｃ）における選択ステップは、特定の態様におけるレポーター発現の検出のための光学アッセイ、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイを含みうる。
【００３０】
特定の態様において１つまたは複数の再プログラムベクターは、リポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオン、ポリアニオンまたはヌクレオチドの細胞内侵入のための当技術分野において公知の任意の方法によって体細胞に導入される。
【００３１】
再プログラムのために体細胞は、ヒト体細胞などの哺乳動物の体細胞でありうる。体細胞の種類は、線維芽細胞、造血細胞、リンパ球（Ｔ細胞またはＢ細胞など）、間葉細胞、島細胞または組織幹細胞でありうる。
【００３２】
後代細胞が自立的多能性状態を確立するために予め定めた期間の後、ウイルスベクターに含まれる発現カセットの発現は、遮断される。したがって後代細胞は、レポーター発現の本質的な消失または、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカーもしくは多能性などの他の公知の胚性細胞様特性などの特徴について選択されうる。後代細胞は、レポーター発現の消失もしくは低下の選択のための光学アッセイ、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイまたはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０もしくはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴなどのＥＳ細胞特異的表面マーカーによって選択されうる。
【００３３】
本発明の方法および／または組成物の内容について論じられた実施形態は、本明細書に記載する任意の他の方法または組成物に関しても使用されうる。したがって１つの方法または組成物に関係する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用されうる。
【００３４】
核酸を参照して本明細書において使用される用語「コードする」または「コードしている」は、本発明が当業者によって容易に理解されうるようにするために使用されるが、これらの用語は、「含む」または「含んでいる」とそれぞれ互換的に使用されうる。
【００３５】
本明細書において使用される記述「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味できる。本明細書の（一項または複数項の）特許請求の範囲において使用されるとおり、用語「含んでいる」と併せて使用される場合は、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味できる。
【００３６】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択のみ、または選択肢が相互排他的であることを意味すると明確に示す場合を除いて、「および／または」を意味して使用されるが、開示は単なる選択肢および「および／または」を意味する定義を支持する。本明細書において使用される「他の」は、少なくとも２番目以降を意味できる。
【００３７】
本出願全体について用語「約」は値が、装置、値を決定するために使用される方法、または研究対象に存在する変動についての固有の誤差変動を含むことを示して使用される。
【００３８】
本発明の他の目的、特性および有利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかし、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示の方法によってのみ与えられることは、本発明の精神および範囲中の種々の変更および修正がこの詳細な記載から当業者に明らかになることから理解されるべきである。
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の１つまたは複数を本明細書において示す具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて参照することによってより良く理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ−Ｂは、ＩＲＥＳ依存性多シストロン性の系の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．本発明
体細胞性、または完全に分化したヒト細胞を多能性または「幹細胞」状態に戻すように駆動する能力は、胚由来幹細胞の使用への多くの重要な科学的および社会的な課題を克服し、再生医療の可能性の実現に役立つであろう。しかし現在の再プログラムプロセスは、非効率的であり、それによりその適用を妨げている。本発明は、改善された効率を有する誘導多能性幹細胞の生成において現在の再プログラム技術に伴ういくつかの主要な問題を克服する。一般に胚性幹細胞様形態だけに基づく選択を使用する従来法とは対照的に、これらの方法の特定の態様は、選択を精密化し、かつ細胞の再プログラム化効率を最適化するために再プログラム因子に加えてレポーターをコードする多シストロン性転写物を発現しているベクターを使用する。本発明のさらなる実施形態および有利点は以下に記載される。
【００４２】
ＩＩ．定義
「再プログラム」は、培養中またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも、再プログラムを行わない他は同じ条件下で有するのと比べて少なくとも１つの新たな細胞型の後代を形成するための測定可能な程度に増大した能力を、細胞に与えるプロセスである。より具体的には再プログラムは、体細胞に多能性ポテンシャルを与えるプロセスである。これは十分な増殖後に、再プログラム化前にはそのような後代が本質的に形成できない場合、測定可能な割合の後代が新たな細胞型の表現型特徴を有し、そうでなければ新たな細胞型の特徴を有する割合が再プログラム前を測定可能な程度超えていることを意味する。特定の条件下で新たな細胞型の特徴を有する後代の割合は、好ましさが増加する順で少なくとも約１％、５％、２５％またはそれを超える場合がある。
【００４３】
「ベクター」または「構築物」（時には遺伝子送達または遺伝子輸送の「ビヒクル」と称される）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を意味する。
【００４４】
「発現構築物」または「発現カセット」によって、転写を方向付けられる核酸分子が意味される。発現構築物は、少なくともプロモーターまたはプロモーターと機能的に等価な構造を含む。エンハンサーなどの追加的エレメントおよび／または転写終結シグナルも含まれうる。
【００４５】
用語「外来性」は、細胞もしくは生体中のタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチドと関連して使用される場合は、人工的もしくは天然の手段によって細胞もしくは生体に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチドを意味し、または細胞に関連する場合は、単離され、続いて人工的もしくは天然の手段によって他の細胞もしくは生体に導入された細胞を意味する。外来性核酸は、異なる生体もしくは細胞由来であって良く、または生体もしくは細胞中に天然に存在する核酸の１つもしくは複数の追加的複製物であって良い。外来性細胞は、異なる生体由来であって良く、または同じ生体由来であって良い。非限定的例の方法により外来性核酸は、天然の細胞とは異なる染色体上の位置にあるか、そうでなければまたは天然において見出されるのとは異なる核酸配列によって隣接されている。
【００４６】
本明細書において使用される用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリペプチド配列の全体もしくは一部に相同である（すなわち同一である、厳密には進化的に関連しない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、本明細書において使用される用語「相補的」は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に相同であることを意味する。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００４７】
具体的なタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」または「導入遺伝子」は、適切な制御配列の調節下に位置する場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写されかつ場合により遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかで存在できる。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は１本鎖（すなわちセンス鎖）または２本鎖でありうる。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子として、これだけに限らないが原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列が挙げられる。転写終結配列は、遺伝子配列の３’に通常位置する。
【００４８】
用語「調節エレメント」は、レシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、転写後プロセシングおよび翻訳を集合的に提供するプロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、スプライスジャンクションなどを集合的に意味する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳されうる限り、これらの調節エレメントの全てが常に存在する必要はない。
【００４９】
本明細書において使用される用語「ＬＴＲ」は、プロウイルス（例えばレトロウイルスの組み込まれた形態）の各末端で見出される末端反復配列を意味する。ＬＴＲは、転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組込みのために必要な配列を含む多数の制御シグナルを含有する。ウイルス性ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域とを分けており、Ｒ領域の転写された配列はウイルスＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に生じる。
【００５０】
「蛍光タンパク質」は、蛍光発色団を含むタンパク質の種類を意味し、発色団は少なくとも３個のアミノ酸から形成され、ｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン発色団を生じる環化反応によって特徴付けられる。発色団は、補欠分子族を含有せず、選択的エネルギーの光を発光でき、エネルギーは、適切な（１つまたは複数の）波長を含む外部光源からの先行する照射によって発色団に貯えられている。天然の蛍光タンパク質は、発色団が上に詳述のｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン環構造を含むとの条件で、任意の数のアミノ酸を含む発色団を有する任意の構造でありうる。典型的にはＳＦＰは、排他的ではなく、緑色蛍光タンパク質において見出され、Ｃｈａｌｆｉｅら、（１９９４年）に記載されているなどのβ−バレル構造を含む。
【００５１】
蛍光タンパク質は、タンパク質によって吸収される特定の波長の入射光への応答で長波長の光を生じる能力である「蛍光特性」を特徴的に示す。
【００５２】
用語「プロモーター」は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味して本明細書においてその通常の意味で使用され、ここで制御配列はＲＮＡポリメラーゼに結合でき、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。
【００５３】
「エンハンサー」により、プロモーターの近くに位置する場合、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターから生じる転写活性と比較して増大した転写活性を与えるヌクレオチド配列が意味される。
【００５４】
核酸分子に関連して「機能的に連結する」により、２つ以上の核酸分子（例えば転写される核酸分子、プロモーターおよびエンハンサーエレメント）が核酸分子の転写を可能にするように連結していることが意味される。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関連して「機能的に連結」は、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、融合の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する単一のポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドを生じるように連結していることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラである、すなわち異種性分子からなる。
【００５５】
用語「細胞」は、本明細書において当技術分野におけるその広義で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔てる膜構造によって囲まれており、自己複製能を有し、遺伝情報およびそれを発現するための機構を有する生存しているものを意味する。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば融合細胞、遺伝的に改変された細胞など）でありうる。
【００５６】
本明細書において使用される用語「幹細胞」は、自己複製でき、多能性である細胞を意味する。典型的には幹細胞は、障害組織を再生できる。本明細書における幹細胞は、これだけに限らないが胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも称される）でありうる。上に記載の能力を有しうる人工的に産生された任意の細胞（例えば本明細書において使用される融合細胞、再プログラム細胞など）は、幹細胞でありうる。
【００５７】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて確立され、１９８９年からノックアウトマウスの産生にも応用されている。１９９８年にヒトＥＳ細胞が確立され、現在再生医療に利用可能になっている。
【００５８】
ＥＳ細胞とは異なり組織幹細胞は、限定された分化能を有する。組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、高い核／細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。ほとんどの組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期および個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などの細胞が由来する部位に基づいて分類される。皮膚系における組織幹細胞は、表皮幹細胞、毛包幹細胞などを含む。消化器系における組織幹細胞は、膵臓（共通）幹細胞、肝臓幹細胞などを含む。骨髄系における組織幹細胞は、造血幹細胞、間葉幹細胞などを含む。神経系幹における組織幹細胞は、神経幹細胞、網膜幹細胞などを含む。
【００５９】
慣用でｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「誘導多能性幹細胞」は、非多能性細胞、典型的には成体体細胞または、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞などの最終分化した細胞から、再プログラム因子と称される特定の遺伝子を挿入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を意味する。
【００６０】
「多能性」は、１つもしくは複数の組織もしくは器官を構成する全ての細胞に、または好ましくは３種の胚葉：内胚葉（胃の内部の内膜、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれにも分化する可能性を有する幹細胞を意味する。本明細書において使用される「多能性幹細胞」は、３種の胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば全能性細胞の子孫または誘導多能性細胞に分化できる細胞を意味する。
【００６１】
「自己再生」は、未分化状態を維持しながら細胞分割の多数の周期を経る能力を意味する。
【００６２】
本明細書において使用される用語「体細胞」は、例えば卵子、精子などの生殖系細胞以外の、任意の細胞を意味し、そのＤＮＡを次世代に直接移行させない。典型的には体細胞は、限定された多能性を有するかまたは多能性を有さない。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在しうるまたは遺伝的に改変されうる。
【００６３】
ＩＩＩ．誘導多能性幹細胞についての一般的背景
本発明の特定の実施形態において、レポーターおよび再プログラム因子の両方をコードする多シストロン性転写物を発現している再プログラムベクターでの体細胞の再プログラム方法が開示される。例えばこれらの細胞は、形質転換された細胞を濃縮するために最初にレポーター遺伝子の発現について選択されることができ、その後、誘導多能性幹細胞に関するレポーター遺伝子の抑制についてそれらの後代が選択されうる。胚性幹細胞の特徴の理解は、これらの方法に加えて誘導多能性幹細胞を選択することに役立ちうる。幹細胞再プログラム研究から公知の再プログラム因子は、これらの新規方法に使用されうる。これらの誘導多能性幹細胞が、胚性幹細胞に替わって治療的および研究的な応用のために潜在的に使用されうることは、後者を使用する倫理的障害によりさらに検討される。
【００６４】
Ａ．幹細胞
幹細胞は、全てではないがほとんどの多細胞生物において見出される細胞である。それらは、有糸細胞分裂および特殊化した細胞型の多様な範囲への分化を通じてそれら自体を再生する能力によって特徴付けられる。哺乳動物の幹細胞の２つの広範な種類は：胚盤胞に見出される胚性幹細胞、および成体組織に見出される成体幹細胞である。発生中の胚において幹細胞は、特殊化する胚組織の全てに分化できる。成体において幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充している身体のための修復系として作用するが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の通常の代謝回転も維持する。
【００６５】
幹細胞が細胞培養を通じて増殖でき、かつ筋肉または神経などの種々の組織の細胞と合致する特徴を有する特殊化した細胞に転換されうることから、医学的治療におけるそれらの使用が、計画されている。具体的には、胚細胞系、治療的クローニングを通じて生成された自己胚性幹細胞および臍帯血または骨髄由来の高度に可塑的な成体幹細胞は、有望な候補としてもてはやされている。最近、成体細胞の誘導多能性幹細胞への再プログラムが胚性幹細胞に替わる大きな可能性を有している。
【００６６】
Ｂ．胚性幹細胞
胚性幹細胞系（ＥＳ細胞系）は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）の胚盤葉上層組織または初期桑実胚状態の胚由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、初期状態（ヒトではおよそ４〜５日後）の胚であり、細胞５０〜１５０個からなる。ＥＳ細胞は多能性であり、発生中に３つの主要な胚葉、外胚葉、内胚葉および中胚葉の全ての派生物を生じる。言い換えると、それらは、特定の細胞型用に十分かつ必要な刺激を与えられた場合に、成体の２００を超える細胞型のそれぞれに発生できる。それらは、胚体外膜または胎盤には寄与しない。
【００６７】
今日までのほとんどの研究は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用して実施されている。両者は、本質的な幹細胞特徴を有しているが、未分化状態を維持するためにそれらは非常に異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞は、ゼラチン層上で増殖でき、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在を必要とする。ヒトＥＳ細胞は、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の支持細胞層上で増殖でき、しばしば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在を必要とする。最適な培養条件または遺伝子操作がなければ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３年）、胚性幹細胞は直ちに分化する。
【００６８】
ヒト胚性幹細胞は、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質の存在によっても定義されうる。転写因子Ｏｃｔ−４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２は、分化を生じる遺伝子の抑制を確実にし、多能性を維持するコア制御ネットワークを形成する（Ｂｏｙｅｒら、２００５年）。ｈＥＳ細胞を同定するために最も慣用される細胞表面抗原として糖脂質ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４ならびにケラタン表面抗原Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が挙げられる。
【００６９】
２０年間の研究の後、胚性幹細胞を使用する認可された治療およびヒトでの治験はない。多能性細胞であるＥＳ細胞は、正確な分化のために特異的シグナルを必要とし、身体に直接注入されるとＥＳ細胞は多種多様な型の細胞に分化し、奇形腫を生じる。移植片拒絶を回避する一方で有用な細胞にＥＳ細胞を分化させることは、胚性幹細胞研究者がいまだ直面している障害のほんの一部に過ぎない。現在多数の国がＥＳ細胞研究または新規ＥＳ細胞系の産生のいずれかを一時的に禁止している。非限定的な増大と多能性とが組み合わされたそれらの能力により、胚性幹細胞は障害または疾患の後の再生医療および臓器移植のための理論的潜在的な供給原に留まっている。しかしこの問題を回避する１つの方法は、直接再プログラムによって体細胞に多能性状態を誘導することである。
【００７０】
Ｃ．再プログラム因子
ｉＰＳ細胞の生成には、誘導のために使用される遺伝子が非常に重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明において開示されるベクター系において使用されうる。特定の態様においてＳｏｘおよびＯｃｔ（好ましくはＯｃｔ３／４）をコードしている核酸は、再プログラムベクターに含まれる。例えば再プログラムベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇおよび場合によりＬｉｎ−２８をコードしている発現カセットまたはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４および場合によりｃ−ｍｙｃをコードしている発現カセットを含みうる。これらの再プログラム因子をコードしている核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じ再プログラムベクターまたは異なる再プログラムベクターに含まれうる。
【００７１】
Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３およびＳｏｘ１５）の特定のメンバーは、誘導プロセスに関与し、その欠如が誘導を不可能にする重要な転写制御因子として同定されている。しかしＫｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃ）、ＮａｎｏｇならびにＬＩＮ２８の特定のメンバーを含む追加的遺伝子が、誘導効率を増大させるために同定されている。
【００７２】
Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持において決定的な役割を演じる。卵割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞におけるＯｃｔ−３／４の欠如は、自発的な栄養芽細胞への分化を生じ、Ｏｃｔ−３／４の存在は、したがって胚性幹細胞の多能性および分化能を生じる。Ｏｃｔ−３／４の密接な類縁体、Ｏｃｔ１およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリー中の種々の他の遺伝子は、誘導を誘発することができず、それにより誘導プロセスへのＯｃｔ−３／４の排他性を実証している。
【００７３】
遺伝子のＳｏｘファミリーは、Ｏｃｔ−３／４と同様に多能性の維持に関連しているが、多能性幹細胞において独占的に発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に多能性および単能性幹細胞に伴っている。Ｓｏｘ２はＹａｍａｎａｋａら（２００７年）、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）およびＹｕら（２００７年）によって誘導のために使用された最初の遺伝子であったが、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子が誘導プロセスにおいて同様に作用することが見出されている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞をもたらし、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８も効率は低下しているがｉＰＳ細胞を生成する。
【００７４】
胚性幹細胞において、Ｏｃｔ−３／４などの少なくともＯｃｔメンバーおよびＳｏｘ２などの少なくともＳｏｘメンバーは、多能性を促進するために必要である。Ｙａｍａｎａｋａら（２００７年）は、Ｎａｎｏｇが誘導に不必要であることを報告したが、Ｙｕら（２００７年）は、因子の１つとしてＮａｎｏｇを用いてｉＰＳ細胞を生成できることおよびＮａｎｏｇが用量依存的に確実に再プログラム効率を増強することを報告した。
【００７５】
ＬＩＮ２８は、分化および増殖と関連して胚性幹細胞および胚性癌腫細胞において発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｙｕら（２００７年）は、それが不必要ではあるが、ｉＰＳ生成における因子であることを実証した。
【００７６】
遺伝子のＫｌｆファミリーのＫｌｆ４は、Ｙａｍａｎａｋａらによって最初に同定され、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）によってマウスｉＰＳ細胞の生成のための因子として確認され、Ｙａｍａｎａｋａら（２００７年）によってヒトｉＰＳ細胞の生成のための因子として実証された。しかしＴｈｏｍｐｓｏｎらは、Ｋｌｆ４がヒトｉＰＳ細胞の生成のために不必要であることおよび実際にヒトｉＰＳ細胞を生成することに失敗したことを報告した。Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を生成できる因子であることが見出され、関連遺伝子Ｋｌｆ１およびＫｌｆ５も効率は低下していたが同様にできた。
【００７７】
遺伝子のＭｙｃファミリーは、癌に関係する癌原遺伝子である。ＹａｍａｎａｋａらおよびＪａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）は、ｃ−ｍｙｃがマウスｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であることを実証し、ＹａｍａｎａｋａらはそれがヒトｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であったことを実証した。しかし、ＴｈｏｍｓｏｎらおよびＹａｍａｎａｋａら（２００７年）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生成に不必要であったことを報告した。ｉＰＳ細胞の誘導における遺伝子の「ｍｙｃ」ファミリーの使用は、ｃ−ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞を移植されたマウスの２５％が致死的奇形腫を発症したことから臨床治療としてのｉＰＳ細胞の可能性に関して問題である。Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃの代わりに同様の効率で誘導するために同定されている。
【００７８】
Ｄ．再プログラム因子を使用する多能性幹細胞の誘導
典型的にはｉＰＳ細胞は、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。典型的にはトランスフェクションは、現在のやり方ではレトロウイルスなどのウイルスベクターの組込みを通じて達成される。トランスフェクトされる遺伝子は、主要な転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を増強することが示唆される。臨界期後に、トランスフェクトされた細胞の少数が形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的には形態学的選定、倍加時間を通じてまたはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【００７９】
２００７年１１月に、２つの独立した研究者チームの研究により成体ヒト細胞からｉＰＳを作製することによってマイルストーンが達成された（Ｙｕら、２００７年；Ｙａｍａｎａｋａら、２００７年）。マウスモデルにおいて先に使用された同じ原理でＹａｍａｎａｋａは、同じ４つの中心的な遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを、ｃ−Ｍｙｃは癌遺伝子であるがレトロウイルス系で使用してヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することに成功した。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ｃ−Ｍｙｃの使用を避けてレンチウイルス系を使用し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧおよび異なる遺伝子ＬＩＮ２８を使用した。
【００８０】
しかし、誘導多能性幹細胞を生成するための現在のプロセスは、緩徐かつ非効率的であり、ほとんどの細胞が失敗する。このプロセスの効率を改善するために、特定の態様において本方法およびベクターは、再プログラム因子および（レポーターの存在に関して選択することによってトランスフェクション効率を最適化する）レポーターを含有する多シストロン性構築物を利用し、導入遺伝子抑制が多能性細胞においては非常に効果的であることから、後者はレポーター遺伝子の発現のないものを選択することによって多能性細胞の選択を改善する。
【００８１】
ＩＶ．誘導多能性幹細胞を生成するための多シストロン性の系
本発明の特定の態様において、このＩＲＥＳ依存性多シストロン性系に由来する適用性および効率的発現は、その有利点の根拠となり、ｉＰＳ細胞産生の効率を増強するための有用な手段としてそれを確立する。この系の多数の変更として、これだけに限らないが（例えば図１を参照されたい）、１）使用するレポーターの変更（例えばシアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）、２）レポーター遺伝子の他の再プログラム遺伝子への置換（合成される必要のあるウイルスが少なくなる）、または３）ＬＴＲがＯｃｔ４ ＩＲＥＳ Ｓｏｘ−２ ＩＲＥＳ ｅＧＦＰの発現を駆動するような２つのＩＲＥＳを有するカセットの作製が挙げられる。
【００８２】
Ａ．配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
多シストロン性転写物の産生を可能にするためにＩＲＥＳ配列は、本発明に含まれる。これは、本発明の発現系が単一の転写物単位から複数の再プログラム因子を産生すること、または融合タンパク質を作製することなく、もしくは追加的遺伝子の発現を調節するための追加的制御エレメントの必要性がなく多シストロン性転写物にレポーターを容易に組み込むことを可能にする。
【００８３】
ほとんどの真核生物およびウイルスのメッセージは、ｍＲＮＡの５’末端の７−メチルグアノシンキャップの認識に関与する機構によって翻訳を開始する。しかし少数の例においては、翻訳は、ｍＲＮＡのキャップ領域から翻訳される遺伝子の３’下流に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がリボソームによって認識されるキャップ非依存的機構を介して生じ、転写物からの第２のコード領域の翻訳を可能にする。したがってＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルの迂回を可能にし、内部部位で翻訳を開始する（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）。
【００８４】
これは、ＩＲＥＳ配列が単一の遺伝子座からの複数のタンパク質の同時発現を可能にすることから本発明において特に重要である。ＩＲＥＳエレメントは、異種性の翻訳領域に連結されうる。複数の翻訳領域は、一緒に転写されることができ、ＩＲＥＳによってそれぞれ分離されることができ、多シストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントの効力により、各翻訳領域は効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現されうる（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
特に好ましい実施形態は、同じ多シストロン性転写物中の所望の組換え産物およびレポーターの両方についてのコード配列を包含するものである。形質転換事象の成功は、所望の再プログラム因子および容易に検出可能なレポーターの両方の発現によって示され、トランスフェクションに成功した細胞の選択を促進する。
【００８６】
ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳ要は記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１年）も同様である。特定の例として、ポリオウイルスＩ型、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＶ）の、「タイラー（Ｔｈｅｌｉｅｒ’ｓ）マウス脳脊髄炎ウイルス」（ＴＭＥＶ）の、「口蹄疫ウイルス」（ＦＭＤＶ）の、「ウシエンテロウイルス」（ＢＥＶ）の、「コクサッキーＢウイルス」（ＣＢＶ）のもしくは「ヒトライノウイルス」（ＨＲＶ）の５’ＵＴＲ、または「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」（ＢＩＰ）５’ＵＴＲ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａｅ ５’ＵＴＲもしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ ５’ＵＴＲあるいは上に列挙した配列由来の遺伝子交雑物または断片由来のＩＲＥＳエレメントが挙げられる。ＩＲＥＳ配列はＫｉｍら（１９９２年）およびＭｃＢｒａｔｎｅｙら（１９９３年）に記載されている。
【００８７】
Ｂ．レポーター
本発明の特定の実施形態は、形質転換の成功を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えばレポーター遺伝子は、発現カセット内で、同時発現のための再プログラム遺伝子のコード領域に通常は付随する制御エレメントの調節下に位置付けられうる。レポーターは、再プログラムベクターを含有する細胞が、それらを薬物もしくは他の選択圧の下に置くことなくまたはそうでなければ細胞生存率を危険にさらすことなく単離されることを可能にする。追加的有利点は、抑制されたレポーター発現を有する誘導多能性幹細胞を濃縮することである。
【００８８】
そのようなレポーターの例として、細胞表面タンパク質（例えばＣＤ４、ＨＡエピトープ）、蛍光タンパク質、抗原決定基および酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。ベクターを含有する細胞は、例えば、細胞表面タンパク質に対する蛍光標識抗体またはベクターにコードされた酵素によって蛍光産物に転換されうる基質を使用するＦＡＣＳによって単離されうる。
【００８９】
具体的な実施形態においてレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質である。蛍光発光スペクトルのプロファイルが可視光スペクトルのほぼ全体にわたることを特徴とする蛍光タンパク質の広範囲の遺伝的変種が開発されている。（非限定的な例として表１を参照されたい）。最初のＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ緑色蛍光タンパク質での変異誘導の試みは、青色から黄色の範囲の新たな蛍光プローブをもたらし、生物学的研究でのｉｎ ｖｉｖｏレポーター分子で最も広く使用されているものの一部である。橙色および赤色スペクトル領域で発光する長波長蛍光タンパク質は、花虫網に属するマリンアネモネ（ｍａｒｉｎｅ ａｎｅｍｏｎｅ）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａおよび造礁サンゴから開発されている。さらに他の種がシアン、緑色、黄色、橙色および深紅の蛍光発光を有する同様のタンパク質を産生するために採取されている。開発研究の努力は、蛍光タンパク質の輝度および安定性を改善するために継続されており、それによりそれら全般の有用性を改善している。
【００９０】
【表１−１】
【００９１】
【表１−２】
Ｖ．ベクター構築および送達
特定の実施形態において再プログラムベクターは、ウイルスベクター、例えば細胞内でこれらの再プログラム因子を発現するためのレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターでありうる。これらの方法の新規特性は、上に記載の多シストロン性転写物の使用であり、形質転換された細胞および誘導多能性細胞の選択を促進する。これらのベクターの構築および送達方法の詳細は、下に記載されている。
【００９２】
Ａ．ベクター
当業者は、標準的組換え技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１年およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６年を参照されたい、どちらも参照により本明細書に組み込まれる）を通じてベクターを構築する態勢が十分に整っている。ベクターとして、これだけに限らないがプラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）ならびにレトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、複製能力を有するもの、複製欠損およびそのガットレス形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどの人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられる。
【００９３】
好ましい１つのアプローチにおいてベクターは、ウイルスベクターである、具体的には、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、体細胞の再プログラムに成功裏に使用されている。ウイルスベクターは、細胞を効率的に形質導入し、それら自体のＤＮＡを宿主細胞に導入できる。組換えウイルスベクターの生成において、典型的には非必須遺伝子が異種（または非天然）タンパク質の遺伝子またはコード配列で置換される。
【００９４】
ウイルスベクターは、核酸および場合によりタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する発現構築物の一種である。特定のウイルスが受容体−依存性エンドサイトーシスを介して細胞に感染する、または細胞に侵入する能力および宿主細胞ゲノム中に組み込み、かつウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力は、それらを外来性核酸の細胞（例えば哺乳動物細胞）への移行のための魅力的な候補にしている。本発明の多シストロン性転写物を送達するために使用されうるウイルスベクターの非限定的例は、下に記載される。
【００９５】
ａ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来性遺伝物質を移行し、広域スペクトルの種および細胞型に感染し、特定の細胞系にパッケージされるそれらの能力により遺伝子送達ベクターとしての将来性がある（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年）。
【００９６】
レトロウイルスベクターを構築するために、核酸は、複製欠損であるウイルスを産生するために特定のウイルス配列の位置のウイルスゲノムに挿入される。ウイルス粒子を産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３年）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドがレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に特定の細胞系に導入されると（例えばリン酸カルシウム沈殿法によって）、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物の（次いで培養培地に分泌される）ウイルス粒子へのパッケージングを可能にする（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年；Ｍａｎｎら、１９８３年）。組換えレトロウイルスを含有する培地は、次いで回収され、場合により濃縮され、遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、幅広い細胞型に感染可能できる。しかし組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。
【００９７】
ｂ．レンチウイルスベクター
レンチウイルスは複合レトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて制御および構造的機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えばＮａｌｄｉｎｉら、１９９６年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７年；Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照されたい）。
【００９８】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染でき、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方での遺伝子導入および核酸配列の発現のために使用されうる。例えば非分裂細胞に感染できる組換えレンチウイルス（ここで適切な宿主細胞は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖならびにｒｅｖおよびｔａｔを保有している２つ以上のベクターによってトランスフェクトされる）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
【００９９】
Ｂ．制御エレメント
ベクターは、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらに調節する、または他に標的細胞へ有益な特性をもたらす他の成分または機能性も含みうる。そのような他の成分として、例えば細胞への結合および標的化に影響を与える成分（細胞型または組織特異的結合を調節する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞でのポリヌクレオチドの局在性に影響を与える成分（核局在化を介在する薬剤など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。
【０１００】
ベクターに含まれる真核生物の発現カセットは、好ましくは（５’から３’への方向で）タンパク質コード配列に機能的に連結した真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を含有する。
【０１０１】
ａ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度が調節されている核酸配列の領域である調節配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御タンパク質および分子が核酸配列の特定の転写を開始するために結合する場合がある遺伝エレメントを含有できる。語句、「機能的に位置した」、「機能的に連結した」、「調節下」および「転写調節下」は、プロモーターが、転写開始および／またはその配列の発現を調節するために核酸配列に関連して正確な機能的位置にあるおよび／または方向にあることを意味する。
【０１０２】
プロモーターは、ＲＮＡ合成についての開始部位を位置付けるために機能する配列を一般的に含む。これの最も公知である例は、ＴＡＴＡボックスであるが、例えば哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子に対するプロモーターなどＴＡＴＡボックスを欠いているいくつかのプロモーターでは、開始部位を覆っている分離したエレメントそれ自体が、開始場所を定めることに役立っている。追加的プロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。典型的にはこれらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターは開始部位の下流に機能的エレメントを同様に含有することが示されている。コード配列をプロモーター「の調節下」にするために、それは選択したプロモーターの「下流」（すなわちその３’）転写翻訳領域の転写開始部位の５’末端に位置している。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【０１０３】
プロモーターエレメント間の間隙は、しばしば変動性であり、したがってエレメントが相互に反転または移動する場合にプロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターにおいてプロモーターエレメント間の間隙は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ解離まで増大できる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調してまたは独立してのいずれでも機能できると考えられている。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を意味する「エンハンサー」と併せて使用されうる、または使用されえない。
【０１０４】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることから、天然で核酸配列に付随するものである場合がある。そのようなプロモーターは、「内在性」であると称されうる。同様にエンハンサーは、天然で核酸配列に付随するものである場合があり、配列の下流または上流のいずれかに位置する。別法としてある種の有利点は、コード核酸セグメントを組換えまたは異種性プロモーター（その天然環境では核酸配列に通常付随しないプロモーターを意味する）の調節下に位置付けることによって得られる。組換えまたは異種性エンハンサーもその天然環境では核酸配列と通常付随しないエンハンサーを意味する。そのようなプロモーターまたはエンハンサーとして、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち異なる転写制御領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有している）が挙げられる。例えば組換えＤＮＡ構築物中で最も慣用されるプロモーターとして、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、本明細書において開示する組成物と関連して、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して産生されうる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写および／または発現を方向付ける調節配列も同様に使用されうることが予期される。
【０１０５】
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官または生体においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に方向付けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは重要である。分子生物学の分野の当業者は、プロモーター、エンハンサーおよびタンパク質発現のための細胞型組合せの使用を全般に理解している（例えば参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な産生において有利であるなどのように、導入されたＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を方向付けるための適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、および／または有用でありうる。プロモーターは、異種性または内在性でありうる。
【０１０６】
追加的に、任意のプロモーター／エンハンサー組合せ（例えばＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のとおり）も、発現を駆動するために使用されうる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、可能性のある他の実施形態である。真核細胞は、適切な細菌性ポリメラーゼが送達複合体の一部としてまたは追加的遺伝子発現構築物としてのいずれかで提供される場合には、特定の細菌性プロモーターからの細胞質発現を支持できる。
【０１０７】
プロモーターの非限定的な例として、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなどの初期または後期ウイルスプロモーター；例えばベータアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９年、Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９年）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８年、Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８年）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９年、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４年）などの真核細胞プロモーター；ならびにサイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答配列プロモーター（ｔｒｅ）などの連鎖状の応答エレメントプロモーター、が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１に記載のヒト成長ホルモンミニマルプロモーター）またはマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能である、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ ４５００７）を使用することも可能である。具体的な例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターでありうる。
【０１０８】
ｂ．開始シグナル
特定の開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルは、提供される必要がある場合がある。当業者は、これを容易に決定でき、必要なシグナルを提供できる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と共に「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれであっても良い。発現効率は、適切な転写増強エレメントの包含によって増強されうる。
【０１０９】
ｃ．多重クローニング部位
ベクターは、多重制限酵素部位を含有する核酸領域であり、任意のそれはベクターを消化するために標準的組換え技術と共に使用されうる多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含みうる（例えば参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９年、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８年およびＣｏｃｅａ、１９９７年を参照されたい）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置にだけに作用する酵素での核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは、商業的に入手できる。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしばベクターは、外来性配列をベクターに連結できるようにするためにＭＣＳ内を切断する制限酵素を使用して直線化または断片化される。「連結」は、相互に近接できるまたはできない２つの核酸断片間でのホスホジエステル結合の形成プロセスを意味する。制限酵素および連結反応に関与する技術は組換え技術の当業者に周知である。
【０１１０】
ｄ．スプライシング部位
転写された真核生物性ＲＮＡ分子のほとんどは、１次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の正常なプロセシングを確実にするために供与体および／または受容体スプライシング部位を必要とする場合がある（例えば参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｎｄｌｅｒら、１９９７年を参照されたい）。
【０１１１】
ｅ．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、少なくとも１つの終結シグナルを含みうる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。したがって特定の実施形態においてＲＮＡ転写物の産生を止める終結シグナルが計画される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにｉｎ ｖｉｖｏにおいて必要な場合がある。
【０１１２】
真核生物系においてターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるための新たな転写物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列も含みうる。これは、転写物の３’末端に約２００個のＡ残基の伸長（ポリＡ）を添加するためのシグナルを特殊化した内在性ポリメラーゼに伝える。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であると考えられ、より効率的に翻訳される。したがって真核生物に関与する他の実施形態において、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことは好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することはより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するためおよびカセットから他の配列に読み過ごすことを最小化するために役立ちうる。
【０１１３】
本発明における使用のために計画されたターミネーターは、これだけに限らないが、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、または例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス性終結配列が挙げられ、本明細書に記載のまたは当業者に公知の任意の公知の転写のターミネーターを含む。特定の実施形態において終結シグナルは、配列の短縮などによる転写可能なまたは翻訳可能な配列の欠失でありうる。
【０１１４】
ｆ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物での発現において、転写物の正常なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルが典型的には含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に不可欠ある考えられず、任意のそのような配列が使用されうる。好ましい実施形態は、好都合であり、種々の標的細胞において十分に機能することが公知であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させうるか、または細胞質間輸送を促進できる。
【０１１５】
Ｃ．ベクター送達
本発明での再プログラムベクターの体細胞への導入は、本明細書に記載のとおりまたは当業者に公知であるとおり、細胞の形質転換のための核酸送達用の任意の適切な方法を使用できる。そのような方法として、これだけに限らないがｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションによる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９年、Ｎａｂｅｌら、１９８９年）、マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，２１５号）を含むインジェクションによる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）、電気穿孔法による（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号、Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、リン酸カルシウム沈殿法による（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）、ＤＥＡＥデキストランに続いてポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）、ダイレクトソニックローディングによる（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）、リポソーム介在性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年；Ｗｏｎｇら、１９８０年；Ｋａｎｅｄａら、１９８９年；Ｋａｔｏら、１９９１年）および受容体介在性トランスフェクションによる（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；ＷｕおよびＷｕ、１９８８年）、微粒子銃による（それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願 ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８、米国特許第５，６１０，０４２号、第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号）、炭化ケイ素繊維での撹拌による（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３０２，５２３号および５，４６４，７６５号）、アグロバクテリウム介在形質転換による（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６１６号および第５，５６３，０５５号）、プロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３年；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８４，６１１号および第４，９５２，５００号）、乾燥／阻害介在ＤＮＡ取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）などのＤＮＡの直接送達およびそのような方法の任意の組合せが挙げられる。これらなどの技術の応用を通じて、（１つもしくは複数の）細胞小器官、（１つもしくは複数の）細胞、（１つもしくは複数の）組織または（１つもしくは複数の）生体は安定的にまたは一過的に形質転換されうる。
【０１１６】
ａ．リポソーム介在トランスフェクション
本発明の特定の実施形態において核酸は、例えばリポソームなどの脂質複合体中に捕捉されうる。リポソームは、リン脂質二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自発的に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再構成を受け、水を捕捉し、溶質を脂質二重層の間に溶解する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。同様に計画されるのは、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはスーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化した核酸である。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質および使用される細胞に応じて変動する場合があり、例えば細胞１００〜１０００万個当たりベクターＤＮＡ約５〜約２０μｇが計画されうる。
【０１１７】
リポソーム介在核酸送達および外来性ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現は、良く成功している（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞および肝細胞種細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム介在送達および発現の実現可能性も実証されている（Ｗｏｎｇら、１９８０年）。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態においてリポソームは、血液凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成されうる。このことは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への進入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。他の実施形態においてリポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と共に複合体形成されうるまたは使用されうる（Ｋａｔｏら、１９９１年）。さらなる実施形態においてリポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と共に複合体形成されうるまたは使用されうる。他の実施形態において送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含みうる。
【０１１９】
ｂ．電気穿孔法
本発明の特定の実施形態において核酸は、電気穿孔法を介して細胞に導入される。電気穿孔法は、細胞およびＤＮＡの懸濁物の高電圧放電への暴露を含む。レシピエント細胞は、機械的損傷によって形質転換により感受性であるように作製されうる。使用されるベクターの量も使用される細胞の性質に応じて変動する場合があり、例えば細胞１００万〜１０００万個当たりベクターＤＮＡ約５〜約２０μｇで計画されうる。
【０１２０】
電気穿孔法を使用する真核生物細胞のトランスフェクションは、非常に良く成功している。この方法でマウスプレＢリンパ球は、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされており（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、ラット肝細胞は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年）。
【０１２１】
ｃ．リン酸カルシウム法
本発明の他の実施形態において核酸は、リン酸カルシウム沈殿法を使用して細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞は、この技術を使用してアデノウイルス５ ＤＮＡ（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年）でトランスフェクトされている。同様にこの方法でマウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞は、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年）、ラット肝細胞は種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）。
【０１２２】
ｄ．ＤＥＡＥ−デキストラン
他の実施形態において核酸は、ＤＥＡＥ−デキストランに続くポリエチレングリコールを使用して細胞に送達される。この方法でレポータープラスミドは、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）。
【０１２３】
ｅ．ソニケーションローディング
本発明の追加的実施形態は、ダイレクトソニックローディングによる核酸の導入を含む。ＬＴＫ−線維芽細胞は、ソニケーションローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされている（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）。
【０１２４】
ｆ．受容体介在トランスフェクション
さらに核酸は、受容体介在送達ビヒクルを介して標的細胞へ送達されうる。これらは、標的細胞において生じる受容体介在エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みの有利点を利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布を考慮して、この送達方法は別の範囲の特異性を本発明に加える。
【０１２５】
特定の受容体−介在遺伝子標的化ビヒクルは、細胞受容体−特異的リガンドおよび核酸結合剤を含む。他に核酸が送達される細胞受容体−特異的リガンドが機能的に付着しているものを含む。いくつかのリガンドは、受容体−介在性遺伝子輸送のために使用されており（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０年；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４年；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ ０２７３０８５）、技術の実現性を確立している。他の哺乳動物の細胞型との関連における特異的送達は記載されている（参照により本明細書に組み込まれるＷｕおよびＷｕ、１９９３年）。本発明の特定の態様において、リガンドは標的細胞集団で特異的に発現される受容体に応じて選択される。
【０１２６】
他の実施形態において、細胞特異的核酸標的化ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソームとの組合せで特異的結合リガンドを含みうる。送達される（１つまたは複数の）核酸は、リポソーム中に入れられ、特異的結合リガンドはリポソーム膜中に機能的に組み込まれる。したがってリポソームは、標的細胞の（１つまたは複数の）受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。そのような系は、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）がＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞への核酸の受容体−介在性送達において使用される系を使用して機能的であることが示されている。
【０１２７】
さらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、細胞特異的結合を方向付ける１つまたは複数の脂質または糖タンパク質を好ましくは含むリポソームそれ自体であっても良い。例えばラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）は、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。本発明の組織特異的形質転換構築物は、同様の手段で標的細胞へ特異的に送達されうることが予期される。
【０１２８】
ｇ．微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生体に核酸を導入するために使用されうる（米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第５，６１０，０４２号およびＰＣＴ出願 ＷＯ９４／０９６９９それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。この方法は、ＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して細胞を殺すことなく細胞膜を貫通し細胞に進入することを可能にする能力に依る（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。当技術分野において公知の多種多様な微粒子銃技術が存在し、その多くは本発明に適用できる。
【０１２９】
この微粒子銃において１つまたは複数の粒子は、少なくとも１つの核酸でコートされ、推進力によって細胞に送達されうる。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置は、次に駆動力をもたらす電流を起こすための高圧放電に依存している（Ｙａｎｇら、１９９０年）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金の粒子またはビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。例示的粒子として、タングステン、プラチナおよび好ましくは金をからなるものが挙げられる。場合により、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達のために必要ではないことが予期される。しかし、粒子はＤＮＡでコートされるよりむしろＤＮＡを含みうることが予期される。ＤＮＡコート粒子は、粒子銃を介するＤＮＡ送達のレベルを増大させうるが、それら自体としては必要ではない。
【０１３０】
照射のために、懸濁物中の細胞はフィルターまたは固形培養培地上に濃縮される。別法として未成熟胚または他の標的細胞は、固形培養培地上に準備される。照射される細胞は、マイクロプロジェクタイル阻止プレート下の適切な距離に置かれる。
【０１３１】
ＶＩ．ｉＰＳ細胞の選択
本発明の特定の態様において、再プログラムベクターが体細胞に導入された後、これらの細胞は増大のために培養される。細胞は、トランスフェクトされた細胞を濃縮するためにレポーターまたは選択マーカーなどのベクター要素の存在について選択されうる。再プログラムベクターは、これらの細胞において再プログラム要素を発現し、細胞分裂と共に複製および分配する。これらの発現される再プログラム因子は、体細胞ゲノムを自律的多能性状態を確立するために再プログラムし、ベクターの存在についての正の選択が除かれる間または後に、外来性遺伝性要素は、徐々に失われる。導入遺伝子発現のこの抑制は、レポーター遺伝子発現の遮断単独に関してまたは、（それらが多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予測されることから）他の胚性幹細胞特徴についての選択と組み合わせてでの誘導多能性幹細胞の選択を可能にする。
【０１３２】
Ａ．レポーター遺伝子発現についての選択
本発明の再プログラムベクターを導入された細胞は、レポーターおよび再プログラム因子を同時に発現でき、様々な時点でのレポーター遺伝子発現の存在または不在について選択されうる。例えば細胞は、レポーターの存在について選択されることができ、トランスフェクションはレポーターを使用することによって最適化されうる。誘導多能性幹細胞は、導入遺伝子が再プログラムの際に抑制されることからレポーターの消失について選別されうる。そのような選択または選別は、導入遺伝子発現の指標としてのレポーター遺伝子の発現によって生成される検出可能なシグナルに基づく。
【０１３３】
検出可能なシグナルは、本発明の方法において使用されるレポーター遺伝子の性質に応じて多数の方法のいずれか１つによって生成されうる。例えば、検出可能なシグナルは、蛍光シグナル例えばＧＦＰなどの発光でありうる。ＧＦＰは、基質または補助因子を必要とせずに蛍光シグナルを生じる蛍光ポリペプチドである。ＧＦＰ発現および検出技術は、当技術分野において周知であり、キットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。ＧＦＰ発現は、無処理細胞においてそれらを溶解する、またはさらなる試薬を添加する必要なくアッセイされうる。別法として検出可能なシグナルは、酵素活性または細胞表面マーカー（例えばＬＮＧＦＲ）の認識の結果として生成されるシグナルでありうる。
【０１３４】
フローサイトメトリー、例えば蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）は、レポーター遺伝子発現に基づく検出可能なシグナルについて選択するために慣用される。ＦＡＣＳは、細胞の不均一な混合物を、各細胞に特異的な光散乱および蛍光特徴に基づいて細胞１つずつ２つ以上の容器に選別するための方法を提供する。これは、個々の細胞由来の蛍光シグナルの迅速、客観的かつ定量的な記録および誘導多能性細胞の物理的分離を提供する。
【０１３５】
ルシフェラーゼも、アッセイの基礎として使用されうる。ルシフェラーゼ発現は、当技術分野において公知であり、ルシフェラーゼ発現および検出のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）から商業的に入手可能である。ルシフェラーゼの存在は、シンチレーション測定によって発光シグナルを測定するよりも、細胞溶解および細胞へのルシフェリン基質の添加によって有利に評価される。
【０１３６】
酵素に基づくアッセイは、検出が発光を介す必要がないこと以外は、ルシフェラーゼに基づくアッセイと同様のやり方で実施される。検出技術は、酵素に依存し、したがって光学的（β−ガラクトシダーゼの場合など）である場合がある。
【０１３７】
物理的および生化学的方法も本発明のレポーター遺伝子の発現を同定または定量するために使用されうる。これらの方法として、これだけに限らないが、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出および決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および検査するためのノーザンブロット、Ｓ−１ＲＮａｓｅプロテクション、プライマー伸長法または逆転写ＰＣＲ増幅法、３）酵素活性を検出するための酵素アッセイ（そのような遺伝子産物は遺伝子構築物によってコードされている）、４）タンパク質ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット技術、免疫沈降または酵素結合免疫測定法（遺伝子構築物産物はタンパク質である）、ならびに５）導入された遺伝子構築物の発現の結果として産生された化合物の生化学的測定が挙げられる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの追加的技術も特定の細胞におけるレポーター遺伝子の存在または発現を検出するために使用されうる。
【０１３８】
Ｂ．胚性幹細胞特徴についての選択
先行する研究から生成に成功したｉＰＳＣは、天然から単離された多能性幹細胞（マウスおよびヒトの胚性幹細胞、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣなど）に、以下に関して顕著に類似しており、したがってｉＰＳＣの天然から単離された多能性幹細胞との同一性、確実性および多能性を確認した。したがって、本発明において開示される方法から生成される誘導多能性幹細胞は、レポーター遺伝子発現の存在の有無に加えて１つまたは複数の以下の幹細胞特徴に基づいて選別されうる。
【０１３９】
ａ．細胞の生物学的特性
形態学：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣに類似している。各細胞は、円形、大型の核および乏しい細胞質を有する場合がある。ｉＰＳＣのコロニーもＥＳＣのそれに類似している場合がある。ヒトｉＰＳＣはｈＥＳＣと同様にはっきりした縁の、扁平な、密集したコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様にｈＥＳＣのものよりもあまり扁平でなく、より凝集したコロニーを形成する。
【０１４０】
増殖特性：幹細胞はそれらの定義の一部として自己再生でなければならないことから、ＥＳＣの倍加時間および有糸分裂活性は、礎石となるものである。ｉＰＳＣは、有糸分裂活性であり、活発に自己再生、増殖し、かつＥＳＣと同じ速度で分裂することができる。
【０１４１】
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現される細胞表面抗原性マーカーを発現できる。ヒトｉＰＳＣは、これだけに限らないがＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６ＥおよびＮａｎｏｇが挙げられるｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣと同様にＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４は発現しなかった。
【０１４２】
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴが挙げられる未分化ＥＳＣにおいて発現される遺伝子を発現できる。
【０１４３】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、細胞分裂約５０回でのヘイフリック限界によって制限されない細胞分裂を維持するために必要である。ｈＥＳＣは、自己再生および増殖を維持するために高いテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣも高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体において必要な成分、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。
【０１４４】
多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣから完全に分化した組織へと同様の様式で分化できる。
【０１４５】
神経分化：ｉＰＳＣは、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＡＰ２を発現している神経細胞に分化できる。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣがｈＥＳＣと同様にドーパミン神経に分化できることを示すことができる。幹細胞関連遺伝子は、分化後に下方制御される。
【０１４６】
心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に拍動を開始する心筋細胞に分化できる。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβおよびＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は、分化後に下方制御される。
【０１４７】
奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、９週間などの一定時間後に自然発症で奇形腫を形成できる。奇形腫は、３つの胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉由来の組織を含有する多系統の腫瘍であり、これは、典型的には１つだけの細胞型である他の腫瘍とは違っている。奇形腫形成は多能性についてのランドマーク検査である。
【０１４８】
胚様体：培養中のｈＥＳＣは、有糸分裂活性で分化しているｈＥＳＣのコアおよび３つ全ての胚様由来の完全に分化した周辺の細胞からなる「胚様体」と称される球状の胚様構造を自発的に形成する。ｉＰＳＣも、胚様体を形成し、周辺の分化した細胞を有しうる。
【０１４９】
胚盤胞注入：ｈＥＳＣは、胚に分化する胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）および胚結節に天然では属し、一方、胚盤胞の殻（栄養膜）は胚体外組織に分化する。中空の栄養膜は、生存している胚を形成できず、したがって胚結節中の胚性幹細胞は分化し、胚を形成する必要がある。雌レシピエントに移される胚盤胞を生成するためにマイクロピペットによって栄養膜に注入されたｉＰＳＣは、生存しているキメラマウスの子：それらの身体全体について１０％〜９０で組み込まれたｉＰＳＣ誘導体を有するマウスおよびキメラ化を生じうる。
【０１５０】
ｂ．エピジェニック再プログラム
プロモーター脱メチル化：メチル化は、メチル基のＤＮＡ塩基への、典型的にはメチル基のＣｐＧ部位の（隣接シトシン／グアニン配列）シトシン分子への転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性を抑止し、または発現を妨げる酵素を補充することによって発現を妨げる。したがって遺伝子のメチル化は、転写を阻止することによってそれを効果的に抑制する。Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ１およびＮａｎｏｇを含む内在性多能性関連遺伝子のプロモーターは、ｉＰＳＣにおいて脱メチル化される場合があり、それらのプロモーター活性およびｉＰＳＣ中の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示す。
【０１５１】
ヒストン脱メチル化：ヒストンは、ＤＮＡ配列に構造的に局在し、種々のクロマチン関連修飾を通じてそれらの活性に影響を与えうる凝縮タンパク質である。Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇに付随するＨ３ヒストンは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇの発現を活性化するために脱メチル化されうる。
【０１５２】
ＶＩＩ．ｉＰＳ細胞の培養
開示の方法を使用して体細胞が再プログラムベクターを導入された後、これらの細胞は多能性を維持するために十分な培地中で培養されうる。本発明において生成される誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、米国特許出願第２００７０２３８１７０号および米国特許出願第２００３０２１１６０３号に記載のとおり霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技術を使用できる。
【０１５３】
例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は８０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８または＃１１９６５−０９２）、加熱不活性化していない２０％ディファインドウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール中で維持されうる。別法としてＥＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８）、２０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製された無血清培地においても維持されうる。使用の直前にヒトｂＦＧＦが最終濃度約４ｎｇ／ｍＬで添加される（ＷＯ９９／２０７４１）。
【０１５４】
ＥＳ細胞などのｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８７年）に対する抗体を使用する免疫組織学的検査またはフローサイトメトリーによって同定されうる特徴的抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、細胞およそ０．５〜１０ １０ ６個を８〜１２週齢のオスＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注入することによって確認されうる。３つの胚様それぞれの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施についての好ましい様式を構成すると考えられうることは当業者によって理解されるべきである。しかし当業者は、本開示を考慮して、開示される具体的な実施形態に多数の変更が作製されることができ、なお依然として本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られることを理解すべきである。
【０１５６】
（実施例１）
レトロウイルスベクターの構築
再プログラム遺伝子および選択マーカーが導入された親レトロウイルスベクターは、Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３年）において既に言及されている。簡潔には、ミニマルベクターは５’および３’ＭＭＬＶ末端反復領域（ＬＴＲ）を含有し、５’ＬＴＲは再プログラムおよび選択のために必要な遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターを含有する（図１）。好都合にも、５’ＬＴＲのすぐ上流に位置してサイトメガロウイルスプロモーターも存在することからレトロウイルスプラスミドは一過的トランスフェクションのために使用されることができ、プラスミドがウイルス合成のための鋳型として使用される場合には非機能的なままになる。
【０１５７】
図１に示すとおり、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８は、蛍光タンパク質もコードしているＭＭＬＶに基づくレトロウイルス骨格にそれぞれ導入された。Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ４の両方は、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）についての発現をコードしているレトロウイルス骨格中に置かれ、一方ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８は単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）を発現可能である骨格中に置かれた。再プログラムのための遺伝子をコードしている転写物の翻訳は、基準のＡＴＧ開始コドンで開始し、下流蛍光タンパク質は、脳心筋炎ウイルス由来の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を介して翻訳される。
【０１５８】
（実施例２）
レトロウイルスベクターを使用するウイルスの生成
レトロウイルスベクターをウイルスを生成するために以下の方法において使用した。最初に、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇまたはＬｉｎ−２８をコードする４つのレトロウイルスベクターのそれぞれを別々のトランスフェクション物として調製した。各レトロウイルスベクター１０マイクログラムを水疱性口内炎ウイルス偽型糖タンパク質（１μｇ）、Ｇａｇポリメラーゼ（３ｕｇ）およびＮＦｋＢ（１ｕｇ）をコードするＤＮＡと別々に混合した。次いでＤＮＡを、５００ｕｌ ＯｐｔｉＭｅｍと混合した。別にポリエチレンイミン（１ｍｇ／ｍｌ）４０マイクロリットルをＯｐｔｉＭｅｍ ５００μｌと混合した。ＤＮＡ／ＯｐｔｉＭｅｍ混合物およびＰＥＩ／ＯｐｔｉＭｅｍ混合物は、次いで室温で５分間インキュベートするために置き、次いで合わせて、室温で少なくとも２０分間インキュベートされるべきであるおよそ１ｍｌの溶液を得た。
【０１５９】
本発明者らは、トランスフェクションの日に細胞がおよそ８０パーセントコンフルエントとなるような希釈でトランスフェクションの１日前に分割されたＳＶ４０ Ｔ抗原タンパク質を過発現している２９３細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションの当日に細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、かつＯｐｔｉＭｅｍまたはＤＭＥＭ（血清および抗生物質不含有）の４ｍｌを加える。２０分間のインキュベーション中に、ひとたび親油性複合体が形成されたら、次いでＤＮＡ複合体（１ｍｌ）を細胞に滴下で加えた。培地は、３７℃でのインキュベーションの４時間後にＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清もしくは仔ウシ血清および５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝塩類溶液で置換した。ウイルスは、トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクションしたプレートから培地５ｍｌを回収することによって収集した。ウイルス含有培地は、次いで細胞細片を除くために５分間、１０００ｒｐｍで遠沈し、培地を４５ｕｍシリンジフィルターを通して濾過する。
【０１６０】
（実施例３）
細胞の感染およびプレーティング
再プログラムの実行を可能にする感染および環境への移行に関与する手順は、２つの方法のうちの１つに従った。１つの方法は、感染ならびに感染したおよび感染していない細胞の再プログラム用の照射ＭＥＦ上へのプレーティングを含み、他の方法は、再プログラム化の効率を増強する目的でＭＥＦへの選別法による感染した細胞だけのプレーティングを含んだ。
【０１６１】
方法１：再プログラム遺伝子を発現しているウイルスで感染させた未選別ＩＭＲ−９０細胞再プログラム
ＩＭＲ−９０細胞は、感染のためのレシピエント宿主として使用され成功しているが、この手順は初代皮膚細胞および造血細胞などの代替えの細胞型の感染に適応可能である。感染の７２時間前にＩＭＲ−９０細胞およそ５００００個を６ウエルプレートの各ウエルに接種した。細胞の追加的プレートを各ウイルスについての感染効率の決定における使用のために調製した。例えば１つのウエルの細胞を複数のウイルスよりも単一のウイルスに対するレシピエントにした。感染は、トランスフェクションした２９３Ｔ細胞から新たに収集したウイルスを用いて１〜１０の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で実行した。ＭＯＩの範囲は、ウイルス産生のための感染から感染への固有の変動性に依る。
【０１６２】
感染は、６ウエルプレート内で、最初に培地を除去し、４つのウイルスそれぞれ当容量で最終濃度培地１ｍｌ当たり細胞およそ５×１０４〜１×１０５個（すなわち最終容量２ｍｌで各ウイルスについて５００μｌ）で置換することにより行った。細胞は、接着したままであり、４℃で２時間ロッキングプラットホーム上に置き、３７℃、５％ＣＯ２に置いた。別法として細胞を、感染効率へ顕著な影響なく直ちにインキュベーターに置くことができた。感染当日は、０時点と見なされ、その後の全ての日が感染後と見なされた。次いで感染細胞は、４８時間インキュベートされ、その時点で４つ全てのウイルスで感染させた６ウエルプレートの各ウエルからの細胞を０．２〜０．５ｍｌの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで収集した。細胞は、回収され、プールされ、かつ１０％ＦＢＳを含む最小基礎培地（Ｍ１０Ｆ）で容量１０〜１５ｍｌにした。次いでそれらを１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去し、細胞を抗生物質を含まないＭ１０Ｆ １０ｍｌに再懸濁し、照射マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層の上に蒔いた。
【０１６３】
ＭＥＦを、感染したＩＭＲ−９０細胞の添加の３日前に０．１％ゼラチンでコートした１０ｃｍプレートに１ｍｌ当たり細胞およそ７．５×１０４個の密度で蒔いた。ＭＥＦプレーティングの翌日、培地を除去し、ＦＧＦを含まないヒトＥＳ（ｈＥＳ）培地（８０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２０％Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール）で置換した。プレーティングの３日後、ＭＥＦを１×ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇ不含有）で１度洗浄し、１０ｍｌ Ｍ１０Ｆに再懸濁した感染ＩＭＲ−９０細胞をＭＥＦに蒔いた。終夜インキュベーションはＩＭＲ−９０細胞の接着を可能にし、培地をゼブラフィッシュＦＧＦ １００ｎｇ／ｍｌを含有する馴化培地（ＣＭ）１０ｍｌで置換した（感染後３日を表す）。ＣＭを、ｈＥＳ培地を高密度照射ＭＥＦ上で終夜インキュベートし、回収し、１００ｎｇ／ｍｌ ｚＦＧＦを補充することによって調製した。次いで感染ＩＭＲ−９０細胞は、使用した培地をｚＦＧＦを含む新鮮ＣＭ １０ｍｌで毎日置換することによって培養した。
【０１６４】
方法２：再プログラム遺伝子を発現しているウイルスで感染させた選別ＩＭＲ−９０細胞再プログラム
感染は、感染の前に２つの６ウエルプレート全体を１ウエル当たりＩＭＲ−９０細胞５×１０４個で接種したことを除いて方法１に示したとおり実施した。感染細胞のより大きなプールは、選別を促進し、選別後の生存率も増強する。選別のための調製においてＩＭＲ−９０細胞を含有する全てのウエルをトリプシンによって収集し、方法１に示すとおり感染の３日後にプールした。プールした細胞を凝集塊を除くために濾過し、選別まで氷上に保存した。
【０１６５】
２５ｐｓｉの圧力、チップサイズ測定値１０ミクロンでＦＡＣｓ ＤＩＶＡを、Ｍ２０Ｆ／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含む１５ｍｌコニカルチューブに選択された細胞を選別するために使用した。選別は、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２発現のレベルに関連する低から中程度のレベルのｅＧＦＰならびにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のレベルに関連する低から中程度のレベルのｍＲＦＰに基づいた。本発明者らは、この実験をＬｉｎ２８の非存在下でも実施し、その場合様々なレベルのＮａｎｏｇを発現している細胞を特異的に選別できた。再プログラムの効率は、Ｎａｎｏｇの量の増大と関連し、したがって、ｍＲＦＰ強度によって反映される中程度から高レベルのＮａｎｏｇを発現している細胞を選別した。
【０１６６】
ＦＡＣｓにより決定したｅＧＦＰまたはｍＲＦＰについて陽性の細胞の分画によりＩＭＲ−９０細胞の平均でおよそ８５％が各ウイルスに感染しており、細胞約３×１０４〜２×１０５個を回収した。細胞を氷上で保存し、それらを蒔くまで選別の間、冷却した。同日、選別した細胞をＭ１０Ｆの総容量１０ｍｌにし、次いで１〜６日前に１ｍｌ当たり細胞およそ７．５×１０４個の密度で蒔いた照射ＭＥＦの単層上に置いた。選別後の回復および接着のために細胞をＭ１０Ｆ（抗生物質なし）中のＭＥＦ上でさらに３日間培養した（ＭＥＦは方法１に記載のとおり調製した）。感染の６日後、１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦを補充した１０ｍｌ ＣＭをＭ１０Ｆの代わりに使用し、再プログラムされたコロニーが形成されるまで毎日補充した。
【０１６７】
（実施例４）
再プログラム細胞の選択
再プログラムされた細胞をまず形態学およびｅＧＦＰおよびｍＲＦＰ発現の消失によって同定した。コロニーは拡大した核および複数の核小体を有する、高度に密集した細胞を含有した。ここで本発明者らは、感染後２０〜４０日間の範囲の時間枠でコロニーを取った。コロニーは、手作業で取り、照射ＭＥＦ（１ｍｌ当たり細胞７．５×１０４個）を含有するウエル（４８、２４から６ウエル）に移した。移した翌日はそれらに補充しないままにし、次いでコロニーが分割および冷凍のために十分な数に増大するまで毎日のＣＭでの補充を再開した。ｉＰＳクローンを、細胞表面マーカー（すなわちＳＳＥＡ ３、ＳＳＥＡ ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ １およびＯｃｔ４）および染色体中の任意の異常を同定するための核型を使用してさらに特徴付けた。
【０１６８】
本明細書において開示および特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行されうる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態の観点から記載されているが、本明細書において記載の方法および方法のステップまたはステップの連続に変更が、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく適応できることは当業者に明らかである。より具体的には化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤を代用でき、同じまたは類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかである全てのそのような類似する置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
【０１６９】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書において説明するものを捕捉してそれらが例示的手順または他の詳細を提供する範囲において、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１７０】
【化１】
【０１７１】
【化２】
【０１７２】
【化３】
【０１７３】
【化４】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年８月１２日に出願された米国特許出願第６１／０８８，０５４号（この全体の開示は、放棄することなくその全体が、参考として具体的に本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に幹細胞の分野に関する。より詳細には、体細胞の再プログラムに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
一般に幹細胞は、一連の成熟した機能細胞を生じうる未分化細胞である。例えば造血幹細胞は、最終分化した血液細胞の様々な型のいずれをも生じうる。胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚由来であり、多能性であり、したがっていかなる器官もしくは組織型または少なくとも潜在的には完全な胚に発生する能力を有する。
【０００４】
慣用でｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、特定の遺伝子を挿入することによって非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の１種である。誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と多くの点で、例えば特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存キメラ形成、ならびに能力および分化能において同一であると考えられているが、天然の多能性幹細胞とのそれらの完全な関連性はいまだ評価が続いている。
【０００５】
ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から（非特許文献１）、および２００７年にヒト細胞から（非特許文献２；非特許文献３）初めて産生された。これは、論争を呼ぶ胚の使用を行わずに、研究において重要でありかつ治療的使用の可能性を有する多能性幹細胞を研究者が得られるようにする可能性があることから幹細胞研究における重要な進歩として挙げられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（２００６）１２６（４）：６６３〜６７６
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（２００７）１２６（４）：６６３〜７６
【非特許文献３】Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７〜１９２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしこれらの誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の研究のこの段階では、ｉＰＳ細胞を生成する効率は低く、これが臨床研究におけるｉＰＳ細胞の応用性の障害となっている。したがって誘導多能性幹細胞の産生効率を増強するための方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改善された効率で誘導多能性幹細胞を提供することにおける当技術分野での主な欠陥を克服する。第１の実施形態において誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法が提供され、この方法は：（ａ）（ｉ）転写制御エレメント、（ｉｉ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子またはレポーターをコードする）、（ｉｉｉ）第１ヌクレオチド配列の３’に位置するＩＲＥＳ、および（ｉｖ）再プログラム因子またはレポーターをコードしており、ＩＲＥＳの翻訳調節下であるように前記ＩＲＥＳの３’に位置する第２ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、（１）第１核酸が再プログラム因子をコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は他の再プログラム因子またはレポーターをコードし、（２）第１核酸がレポーターをコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードする、発現カセットを各ベクターが含む１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ；（ｂ）再プログラムベクターを体細胞集団の細胞に導入するステップ；（ｃ）集団を増大させるために細胞を培養するステップ；（ｄ）前記増大させた集団の後代細胞を選択するステップ（前記後代は胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する）；ならびに（ｅ）選択された後代細胞を培養して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップを含む。
【０００９】
特定の態様において、第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードし、第２ヌクレオチド配列はレポーターをコードするまたはその逆であり、したがって以下に記載のとおりレポーター遺伝子の同時発現は、再プログラム細胞の選択を支援する。
【００１０】
複数の再プログラム因子を同じ転写制御エレメントの下で共発現するために、発現カセットは第２ＩＲＥＳと、第２ＩＲＥＳの翻訳調節下になるように第２ＩＲＥＳの３’に位置する第３ヌクレオチド配列とを含みうる。特定の実施形態において第１および第２ヌクレオチド配列は、異なる再プログラム因子をコードできる。任意の上の状況において、レポーターは、トランスフェクションおよびｉＰＳ細胞選択の効率を改善するために第１、第２または第３ヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００１１】
本発明の効力は、感染効率の指標として役立ち、同じ多シストロン性転写物上の再プログラム遺伝子からの発現レベルと一般に相関し、細胞が多能性を完全に誘導されると抑制される蛍光タンパク質などのレポーターの発現に部分的に依存する。例えば上の方法のステップｃ）は、体細胞の集団（ここで体細胞はレポーターを発現する）を選択するステップおよび集団を増大させるために選択された細胞を培養するステップをさらに含みうる。したがって特定の態様において、蛍光補助細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用するレポーター、例えば蛍光タンパク質の発現レベルに基づいて最も少なく感染している細胞を最も効率良く選択することは可能である。
【００１２】
例示的実施形態においてレポーターは、細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでありうる。例えば蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）もしくは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはこれらの変種でありうる。使用されるレポーターに依存して、ステップｃ）における選択は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイ、発光アッセイまたはトランスフェクトされた細胞を効率的に選択するためにレポーター発現を検出または選別する当業者に公知の任意の方法を含みうる。別法または補完的な手法は、後代細胞における外来性レポーター転写物の欠如を、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡアレイもしくはハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット）などの従来法を使用して検査することである。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、１つまたは複数の再プログラムベクターに含まれる任意のヌクレオチド配列によってコードされるｉＰＳ再プログラム因子は、Ｓｏｘファミリー由来の少なくとも１つの成分およびＯｃｔファミリー由来の少なくとも１つの成分を含みうる。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を特定する転写制御階層での中核であると考えられている。例えばＳｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８でありえ、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４でありうる。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃなどの追加的因子も、再プログラム効率を増大でき、再プログラム因子の具体的なセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび場合によりＬｉｎ−２８を含む、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆおよび場合によりｃ−Ｍｙｃを含むセットでありうる。
【００１４】
さらなる実施形態においてベクターは、ウイルスベクター、より具体的にはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶ、ＳＬ−３−３−ＭＬＶまたは他の近縁関係にあるウイルスなどのレトロウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであっても良い。特定の態様において転写制御エレメントは、ウイルス遺伝子の組込みを介在するための末端反復配列領域（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＴＲ）を含みうる。
【００１５】
特定の実施形態において多シストロン性転写物は、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することによって使用されうる。例示的ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病（ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルス（ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルス（ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルス（ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルス（ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）ＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳまたはこれらの変種でありうる。詳細にはＩＲＥＳエレメントは脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳでありうる。
【００１６】
さらなる実施形態において再プログラムベクターは、リポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リン酸カルシウム、ポリカチオンもしくはポリアニオンまたは細胞中に外来性遺伝性要素を導入するために適切な任意の方法によって導入されうる。
【００１７】
本発明のさらなる態様において体細胞は、哺乳動物、より具体的にはヒト由来でありうる。体細胞は、これだけに限らないが線維芽細胞、造血細胞または間葉細胞が挙げられる最終分化した細胞または組織幹細胞であって良い。例えば体細胞は線維芽細胞である。体細胞は組織細胞バンク由来または選択されたヒト被験体、具体的には生存しているヒト由来であって良い。これらの体細胞の後代由来のゲノムは、選択されたヒト個体などの特定の供給原のこれらの体細胞に由来すると考えられる。
【００１８】
特定の態様において後代細胞は、レポーター発現の本質的な消失、未分化形態、胚性幹細胞特異的なマーカーもしくは多能性もしくは多系統分化能もしくは当技術分野において公知の任意の特徴またはこれらの組合せについて選択されうる。この選択ステップは、細胞が多能性状態にあり、分化状態に戻らないことを確実にするためにトランスフェクション後の１回または複数回の時点で使用されうる。したがって選択ステップは、再プログラムベクターが細胞に導入された少なくとも約１０日後から少なくとも３０日後などの後代細胞が自律的な多能性状態に入った後の時点であることができる。
【００１９】
具体的には後代細胞は、その利便性から未分化形態について選択されうる。胚性幹細胞特異的マーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴからなる群から選択される１つまたは複数の特異的マーカーでありうる。
【００２０】
詳細な態様において後代細胞は、再プログラムされた細胞は細胞が多能性になると外来性に導入された物質を抑制できることから、導入されたレポーター遺伝子の発現が本質的にないことに基づいてｉＰＳ細胞について選択されうる。したがってレポーター発現、例えば蛍光の本質的な消失は、形態的な特徴に加えての細胞が再プログラムされたことの指標である。そのような特徴は、導入されたレポーター遺伝子に基づいて蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイによって選択されうる。レポーター遺伝子発現の「本質的な消失」は、ｉＰＳ細胞集団の１％、０．５％、０．１％、０．０５％または任意の中間の百分率値より少ない細胞が外来性レポーター発現を含むことを意味する。
【００２１】
さらなる態様において再プログラムベクターは、（ａ）転写制御エレメント、（ｂ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子またはレポーターをコードする）、ｃ）第１のヌクレオチド配列の３’に位置するＩＲＥＳ、および（ｄ）再プログラム因子またはレポーターをコードしており、ＩＲＥＳの翻訳調節下であるようにＩＲＥＳの３’に位置する第２ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、（ｉ）第１核酸が再プログラム因子をコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は他の再プログラム因子またはレポーターをコードし、（ｉｉ）第１核酸がレポーターをコードする場合は、第２ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードする、発現カセットを含むとしても開示される。
【００２２】
特定の態様において、第１ヌクレオチド配列は再プログラム因子をコードし、第２ヌクレオチド配列はレポーターをコードするまたはその逆であり、別法として第１および第２ヌクレオチド配列は異なる再プログラム因子をコードする。同じ転写制御エレメント下で複数の再プログラム因子を同時発現するために、発現カセットは第２ＩＲＥＳおよび、第２ＩＲＥＳの翻訳調節下になるように第２ＩＲＥＳの３’に位置する第３ヌクレオチド配列を含みうる。任意の上の状況において、レポーターは、トランスフェクションおよびｉＰＳ細胞選択の効率を改善するために第１、第２または第３ヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００２３】
さらなる態様において、（ａ）転写制御エレメント、および（ｂ）転写制御エレメントに機能的に連結した第１および第２コード配列（第１コード配列は再プログラム因子をコードし、第２コード配列は第２再プログラム配列またはレポーターをコードする）を含む多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクターも提供される。例えば転写制御エレメントは、末端反復配列領域、プロモーター、エンハンサー、転写調節エレメントなどを含みうる。多シストロン性発現カセットに含まれる場合、第２コード配列は、再プログラムプロセスを支援するために（１つまたは複数の）コード配列の発現または発現の本質的な消失についての選択の促進のためにレポーターをコードできる。別法として第２コード配列は、プロウイルスコピーおよび、単一の多シストロン性転写物由来の２つ以上の再プログラム因子を発現することによる挿入変異の可能性を低減させるために、２番目以降の再プログラム因子でありうる。同様に多シストロン性発現カセットは、転写制御エレメントに機能的に連結した１つまたは複数の追加的コード配列（例えば第３、第４または第５コード配列など）を含みうる、ここで１つまたは複数の追加的コード配列は再プログラム因子、レポーターまたは選択マーカーをコードする。例えば選択マーカーは、抗生物質耐性マーカーまたは表面選択マーカーでありうる。
【００２４】
上に記載の再プログラムベクターの例示的実施形態において、レポーターは細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでありうる。例えば蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）もしくは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはｅＧＦＰ、ｅＲＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、ｅＣＦＰ、ｅＹＦＰなどのそれらの変種でありうる。特定の態様において再プログラムベクターは、抗生物質耐性マーカーなどの選択マーカーをさらに含みうる。
【００２５】
再プログラムベクターのさらなる実施形態において、再プログラムベクターに含まれる任意のヌクレオチド配列によってコードされるｉＰＳ再プログラム因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃを含みうる。例えばＳｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８でありえ、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４でありうる。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃなどの追加的因子も、再プログラム効率を増大できる。さらなる実施形態においてベクターは、ウイルスベクター、より具体的にはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶ、ＳＬ−３−３−ＭＬＶまたは他の近縁関係にあるウイルスなどのレトロウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に基づくベクターであっても良い。特定の態様において転写制御エレメントは、外来性遺伝子の組込みおよび転写を介在するための末端反復配列領域（ＬＴＲ）を含みうる。
【００２６】
特定の実施形態において再プログラムベクターは、１つもしくは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはコード配列の非依存的翻訳を駆動するために十分な任意の配列を含みうる。例示的ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルスＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルスＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳまたはこれらの変種でありうる。具体的にはＩＲＥＳエレメントは、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳまたは口蹄疫ウイルスＩＲＥＳでありうる。
【００２７】
さらなる実施形態において、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法が提供され、この方法は（ａ）上に記載の１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ、および（ｂ）再プログラムベクターを体細胞集団の細胞に導入して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップを含む。特定の態様において、ｉＰＳ細胞を産生するための１つまたは複数の再プログラムベクターは、ＳｏｘおよびＯｃｔを含む再プログラム因子をコードするコード配列を含みうる。
【００２８】
上記方法は、（ｃ）集団を増大させるために細胞を培養するステップ、および（ｄ）増大させた集団の後代細胞を選択するステップ（後代細胞は胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する）をさらに含みうる。追加的ステップが、上記方法にさらに含まれうる：（ｅ）選択された後代細胞を培養して、ｉＰＳ細胞集団を提供するステップ。
【００２９】
レポーターをコードしている（１つまたは複数の）コード配列を含む再プログラムベクターについて、ステップ（ｃ）は、体細胞の集団を選択するステップをさらに含むことができ、再プログラムベクターの導入後はレポーターの発現と再プログラム因子の発現との間には相関関係があることから、選択された体細胞はレポーターを発現する。ステップ（ｃ）における選択ステップは、特定の態様におけるレポーター発現の検出のための光学アッセイ、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイを含みうる。
【００３０】
特定の態様において１つまたは複数の再プログラムベクターは、リポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオン、ポリアニオンまたはヌクレオチドの細胞内侵入のための当技術分野において公知の任意の方法によって体細胞に導入される。
【００３１】
再プログラムのために体細胞は、ヒト体細胞などの哺乳動物の体細胞でありうる。体細胞の種類は、線維芽細胞、造血細胞、リンパ球（Ｔ細胞またはＢ細胞など）、間葉細胞、島細胞または組織幹細胞でありうる。
【００３２】
後代細胞が自立的多能性状態を確立するために予め定めた期間の後、ウイルスベクターに含まれる発現カセットの発現は、遮断される。したがって後代細胞は、レポーター発現の本質的な消失または、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカーもしくは多能性などの他の公知の胚性細胞様特性などの特徴について選択されうる。後代細胞は、レポーター発現の消失もしくは低下の選択のための光学アッセイ、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイまたはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０もしくはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴなどのＥＳ細胞特異的表面マーカーによって選択されうる。
【００３３】
本発明の方法および／または組成物の内容について論じられた実施形態は、本明細書に記載する任意の他の方法または組成物に関しても使用されうる。したがって１つの方法または組成物に関係する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用されうる。
【００３４】
核酸を参照して本明細書において使用される用語「コードする」または「コードしている」は、本発明が当業者によって容易に理解されうるようにするために使用されるが、これらの用語は、「含む」または「含んでいる」とそれぞれ互換的に使用されうる。
【００３５】
本明細書において使用される記述「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味できる。本明細書の（一項または複数項の）特許請求の範囲において使用されるとおり、用語「含んでいる」と併せて使用される場合は、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味できる。
【００３６】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択のみ、または選択肢が相互排他的であることを意味すると明確に示す場合を除いて、「および／または」を意味して使用されるが、開示は単なる選択肢および「および／または」を意味する定義を支持する。本明細書において使用される「他の」は、少なくとも２番目以降を意味できる。
【００３７】
本出願全体について用語「約」は値が、装置、値を決定するために使用される方法、または研究対象に存在する変動についての固有の誤差変動を含むことを示して使用される。
【００３８】
本発明の他の目的、特性および有利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかし、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示の方法によってのみ与えられることは、本発明の精神および範囲中の種々の変更および修正がこの詳細な記載から当業者に明らかになることから理解されるべきである。
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の１つまたは複数を本明細書において示す具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて参照することによってより良く理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ−Ｂは、ＩＲＥＳ依存性多シストロン性の系の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．本発明
体細胞性、または完全に分化したヒト細胞を多能性または「幹細胞」状態に戻すように駆動する能力は、胚由来幹細胞の使用への多くの重要な科学的および社会的な課題を克服し、再生医療の可能性の実現に役立つであろう。しかし現在の再プログラムプロセスは、非効率的であり、それによりその適用を妨げている。本発明は、改善された効率を有する誘導多能性幹細胞の生成において現在の再プログラム技術に伴ういくつかの主要な問題を克服する。一般に胚性幹細胞様形態だけに基づく選択を使用する従来法とは対照的に、これらの方法の特定の態様は、選択を精密化し、かつ細胞の再プログラム化効率を最適化するために再プログラム因子に加えてレポーターをコードする多シストロン性転写物を発現しているベクターを使用する。本発明のさらなる実施形態および有利点は以下に記載される。
【００４２】
ＩＩ．定義
「再プログラム」は、培養中またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも、再プログラムを行わない他は同じ条件下で有するのと比べて少なくとも１つの新たな細胞型の後代を形成するための測定可能な程度に増大した能力を、細胞に与えるプロセスである。より具体的には再プログラムは、体細胞に多能性ポテンシャルを与えるプロセスである。これは十分な増殖後に、再プログラム化前にはそのような後代が本質的に形成できない場合、測定可能な割合の後代が新たな細胞型の表現型特徴を有し、そうでなければ新たな細胞型の特徴を有する割合が再プログラム前を測定可能な程度超えていることを意味する。特定の条件下で新たな細胞型の特徴を有する後代の割合は、好ましさが増加する順で少なくとも約１％、５％、２５％またはそれを超える場合がある。
【００４３】
「ベクター」または「構築物」（時には遺伝子送達または遺伝子輸送の「ビヒクル」と称される）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を意味する。
【００４４】
「発現構築物」または「発現カセット」によって、転写を方向付けられる核酸分子が意味される。発現構築物は、少なくともプロモーターまたはプロモーターと機能的に等価な構造を含む。エンハンサーなどの追加的エレメントおよび／または転写終結シグナルも含まれうる。
【００４５】
用語「外来性」は、細胞もしくは生体中のタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチドと関連して使用される場合は、人工的もしくは天然の手段によって細胞もしくは生体に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチドを意味し、または細胞に関連する場合は、単離され、続いて人工的もしくは天然の手段によって他の細胞もしくは生体に導入された細胞を意味する。外来性核酸は、異なる生体もしくは細胞由来であって良く、または生体もしくは細胞中に天然に存在する核酸の１つもしくは複数の追加的複製物であって良い。外来性細胞は、異なる生体由来であって良く、または同じ生体由来であって良い。非限定的例の方法により外来性核酸は、天然の細胞とは異なる染色体上の位置にあるか、そうでなければまたは天然において見出されるのとは異なる核酸配列によって隣接されている。
【００４６】
本明細書において使用される用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリペプチド配列の全体もしくは一部に相同である（すなわち同一である、厳密には進化的に関連しない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、本明細書において使用される用語「相補的」は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に相同であることを意味する。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００４７】
具体的なタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」または「導入遺伝子」は、適切な制御配列の調節下に位置する場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写されかつ場合により遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかで存在できる。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は１本鎖（すなわちセンス鎖）または２本鎖でありうる。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子として、これだけに限らないが原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列が挙げられる。転写終結配列は、遺伝子配列の３’に通常位置する。
【００４８】
用語「調節エレメント」は、レシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、転写後プロセシングおよび翻訳を集合的に提供するプロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、スプライスジャンクションなどを集合的に意味する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳されうる限り、これらの調節エレメントの全てが常に存在する必要はない。
【００４９】
本明細書において使用される用語「ＬＴＲ」は、プロウイルス（例えばレトロウイルスの組み込まれた形態）の各末端で見出される末端反復配列を意味する。ＬＴＲは、転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組込みのために必要な配列を含む多数の制御シグナルを含有する。ウイルス性ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域とを分けており、Ｒ領域の転写された配列はウイルスＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に生じる。
【００５０】
「蛍光タンパク質」は、蛍光発色団を含むタンパク質の種類を意味し、発色団は少なくとも３個のアミノ酸から形成され、ｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン発色団を生じる環化反応によって特徴付けられる。発色団は、補欠分子族を含有せず、選択的エネルギーの光を発光でき、エネルギーは、適切な（１つまたは複数の）波長を含む外部光源からの先行する照射によって発色団に貯えられている。天然の蛍光タンパク質は、発色団が上に詳述のｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン環構造を含むとの条件で、任意の数のアミノ酸を含む発色団を有する任意の構造でありうる。典型的にはＳＦＰは、排他的ではなく、緑色蛍光タンパク質において見出され、Ｃｈａｌｆｉｅら、（１９９４年）に記載されているなどのβ−バレル構造を含む。
【００５１】
蛍光タンパク質は、タンパク質によって吸収される特定の波長の入射光への応答で長波長の光を生じる能力である「蛍光特性」を特徴的に示す。
【００５２】
用語「プロモーター」は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味して本明細書においてその通常の意味で使用され、ここで制御配列はＲＮＡポリメラーゼに結合でき、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。
【００５３】
「エンハンサー」により、プロモーターの近くに位置する場合、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターから生じる転写活性と比較して増大した転写活性を与えるヌクレオチド配列が意味される。
【００５４】
核酸分子に関連して「機能的に連結する」により、２つ以上の核酸分子（例えば転写される核酸分子、プロモーターおよびエンハンサーエレメント）が核酸分子の転写を可能にするように連結していることが意味される。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関連して「機能的に連結」は、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、融合の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する単一のポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドを生じるように連結していることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラである、すなわち異種性分子からなる。
【００５５】
用語「細胞」は、本明細書において当技術分野におけるその広義で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔てる膜構造によって囲まれており、自己複製能を有し、遺伝情報およびそれを発現するための機構を有する生存しているものを意味する。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば融合細胞、遺伝的に改変された細胞など）でありうる。
【００５６】
本明細書において使用される用語「幹細胞」は、自己複製でき、多能性である細胞を意味する。典型的には幹細胞は、障害組織を再生できる。本明細書における幹細胞は、これだけに限らないが胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも称される）でありうる。上に記載の能力を有しうる人工的に産生された任意の細胞（例えば本明細書において使用される融合細胞、再プログラム細胞など）は、幹細胞でありうる。
【００５７】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて確立され、１９８９年からノックアウトマウスの産生にも応用されている。１９９８年にヒトＥＳ細胞が確立され、現在再生医療に利用可能になっている。
【００５８】
ＥＳ細胞とは異なり組織幹細胞は、限定された分化能を有する。組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、高い核／細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。ほとんどの組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期および個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などの細胞が由来する部位に基づいて分類される。皮膚系における組織幹細胞は、表皮幹細胞、毛包幹細胞などを含む。消化器系における組織幹細胞は、膵臓（共通）幹細胞、肝臓幹細胞などを含む。骨髄系における組織幹細胞は、造血幹細胞、間葉幹細胞などを含む。神経系幹における組織幹細胞は、神経幹細胞、網膜幹細胞などを含む。
【００５９】
慣用でｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「誘導多能性幹細胞」は、非多能性細胞、典型的には成体体細胞または、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞などの最終分化した細胞から、再プログラム因子と称される特定の遺伝子を挿入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を意味する。
【００６０】
「多能性」は、１つもしくは複数の組織もしくは器官を構成する全ての細胞に、または好ましくは３種の胚葉：内胚葉（胃の内部の内膜、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれにも分化する可能性を有する幹細胞を意味する。本明細書において使用される「多能性幹細胞」は、３種の胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば全能性細胞の子孫または誘導多能性細胞に分化できる細胞を意味する。
【００６１】
「自己再生」は、未分化状態を維持しながら細胞分割の多数の周期を経る能力を意味する。
【００６２】
本明細書において使用される用語「体細胞」は、例えば卵子、精子などの生殖系細胞以外の、任意の細胞を意味し、そのＤＮＡを次世代に直接移行させない。典型的には体細胞は、限定された多能性を有するかまたは多能性を有さない。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在しうるまたは遺伝的に改変されうる。
【００６３】
ＩＩＩ．誘導多能性幹細胞についての一般的背景
本発明の特定の実施形態において、レポーターおよび再プログラム因子の両方をコードする多シストロン性転写物を発現している再プログラムベクターでの体細胞の再プログラム方法が開示される。例えばこれらの細胞は、形質転換された細胞を濃縮するために最初にレポーター遺伝子の発現について選択されることができ、その後、誘導多能性幹細胞に関するレポーター遺伝子の抑制についてそれらの後代が選択されうる。胚性幹細胞の特徴の理解は、これらの方法に加えて誘導多能性幹細胞を選択することに役立ちうる。幹細胞再プログラム研究から公知の再プログラム因子は、これらの新規方法に使用されうる。これらの誘導多能性幹細胞が、胚性幹細胞に替わって治療的および研究的な応用のために潜在的に使用されうることは、後者を使用する倫理的障害によりさらに検討される。
【００６４】
Ａ．幹細胞
幹細胞は、全てではないがほとんどの多細胞生物において見出される細胞である。それらは、有糸細胞分裂および特殊化した細胞型の多様な範囲への分化を通じてそれら自体を再生する能力によって特徴付けられる。哺乳動物の幹細胞の２つの広範な種類は：胚盤胞に見出される胚性幹細胞、および成体組織に見出される成体幹細胞である。発生中の胚において幹細胞は、特殊化する胚組織の全てに分化できる。成体において幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充している身体のための修復系として作用するが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の通常の代謝回転も維持する。
【００６５】
幹細胞が細胞培養を通じて増殖でき、かつ筋肉または神経などの種々の組織の細胞と合致する特徴を有する特殊化した細胞に転換されうることから、医学的治療におけるそれらの使用が、計画されている。具体的には、胚細胞系、治療的クローニングを通じて生成された自己胚性幹細胞および臍帯血または骨髄由来の高度に可塑的な成体幹細胞は、有望な候補としてもてはやされている。最近、成体細胞の誘導多能性幹細胞への再プログラムが胚性幹細胞に替わる大きな可能性を有している。
【００６６】
Ｂ．胚性幹細胞
胚性幹細胞系（ＥＳ細胞系）は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）の胚盤葉上層組織または初期桑実胚状態の胚由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、初期状態（ヒトではおよそ４〜５日後）の胚であり、細胞５０〜１５０個からなる。ＥＳ細胞は多能性であり、発生中に３つの主要な胚葉、外胚葉、内胚葉および中胚葉の全ての派生物を生じる。言い換えると、それらは、特定の細胞型用に十分かつ必要な刺激を与えられた場合に、成体の２００を超える細胞型のそれぞれに発生できる。それらは、胚体外膜または胎盤には寄与しない。
【００６７】
今日までのほとんどの研究は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用して実施されている。両者は、本質的な幹細胞特徴を有しているが、未分化状態を維持するためにそれらは非常に異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞は、ゼラチン層上で増殖でき、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在を必要とする。ヒトＥＳ細胞は、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の支持細胞層上で増殖でき、しばしば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在を必要とする。最適な培養条件または遺伝子操作がなければ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３年）、胚性幹細胞は直ちに分化する。
【００６８】
ヒト胚性幹細胞は、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質の存在によっても定義されうる。転写因子Ｏｃｔ−４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２は、分化を生じる遺伝子の抑制を確実にし、多能性を維持するコア制御ネットワークを形成する（Ｂｏｙｅｒら、２００５年）。ｈＥＳ細胞を同定するために最も慣用される細胞表面抗原として糖脂質ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４ならびにケラタン表面抗原Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が挙げられる。
【００６９】
２０年間の研究の後、胚性幹細胞を使用する認可された治療およびヒトでの治験はない。多能性細胞であるＥＳ細胞は、正確な分化のために特異的シグナルを必要とし、身体に直接注入されるとＥＳ細胞は多種多様な型の細胞に分化し、奇形腫を生じる。移植片拒絶を回避する一方で有用な細胞にＥＳ細胞を分化させることは、胚性幹細胞研究者がいまだ直面している障害のほんの一部に過ぎない。現在多数の国がＥＳ細胞研究または新規ＥＳ細胞系の産生のいずれかを一時的に禁止している。非限定的な増大と多能性とが組み合わされたそれらの能力により、胚性幹細胞は障害または疾患の後の再生医療および臓器移植のための理論的潜在的な供給原に留まっている。しかしこの問題を回避する１つの方法は、直接再プログラムによって体細胞に多能性状態を誘導することである。
【００７０】
Ｃ．再プログラム因子
ｉＰＳ細胞の生成には、誘導のために使用される遺伝子が非常に重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明において開示されるベクター系において使用されうる。特定の態様においてＳｏｘおよびＯｃｔ（好ましくはＯｃｔ３／４）をコードしている核酸は、再プログラムベクターに含まれる。例えば再プログラムベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇおよび場合によりＬｉｎ−２８をコードしている発現カセットまたはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４および場合によりｃ−ｍｙｃをコードしている発現カセットを含みうる。これらの再プログラム因子をコードしている核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じ再プログラムベクターまたは異なる再プログラムベクターに含まれうる。
【００７１】
Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３およびＳｏｘ１５）の特定のメンバーは、誘導プロセスに関与し、その欠如が誘導を不可能にする重要な転写制御因子として同定されている。しかしＫｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃ）、ＮａｎｏｇならびにＬＩＮ２８の特定のメンバーを含む追加的遺伝子が、誘導効率を増大させるために同定されている。
【００７２】
Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持において決定的な役割を演じる。卵割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞におけるＯｃｔ−３／４の欠如は、自発的な栄養芽細胞への分化を生じ、Ｏｃｔ−３／４の存在は、したがって胚性幹細胞の多能性および分化能を生じる。Ｏｃｔ−３／４の密接な類縁体、Ｏｃｔ１およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリー中の種々の他の遺伝子は、誘導を誘発することができず、それにより誘導プロセスへのＯｃｔ−３／４の排他性を実証している。
【００７３】
遺伝子のＳｏｘファミリーは、Ｏｃｔ−３／４と同様に多能性の維持に関連しているが、多能性幹細胞において独占的に発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に多能性および単能性幹細胞に伴っている。Ｓｏｘ２はＹａｍａｎａｋａら（２００７年）、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）およびＹｕら（２００７年）によって誘導のために使用された最初の遺伝子であったが、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子が誘導プロセスにおいて同様に作用することが見出されている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞をもたらし、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８も効率は低下しているがｉＰＳ細胞を生成する。
【００７４】
胚性幹細胞において、Ｏｃｔ−３／４などの少なくともＯｃｔメンバーおよびＳｏｘ２などの少なくともＳｏｘメンバーは、多能性を促進するために必要である。Ｙａｍａｎａｋａら（２００７年）は、Ｎａｎｏｇが誘導に不必要であることを報告したが、Ｙｕら（２００７年）は、因子の１つとしてＮａｎｏｇを用いてｉＰＳ細胞を生成できることおよびＮａｎｏｇが用量依存的に確実に再プログラム効率を増強することを報告した。
【００７５】
ＬＩＮ２８は、分化および増殖と関連して胚性幹細胞および胚性癌腫細胞において発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｙｕら（２００７年）は、それが不必要ではあるが、ｉＰＳ生成における因子であることを実証した。
【００７６】
遺伝子のＫｌｆファミリーのＫｌｆ４は、Ｙａｍａｎａｋａらによって最初に同定され、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）によってマウスｉＰＳ細胞の生成のための因子として確認され、Ｙａｍａｎａｋａら（２００７年）によってヒトｉＰＳ細胞の生成のための因子として実証された。しかしＴｈｏｍｐｓｏｎらは、Ｋｌｆ４がヒトｉＰＳ細胞の生成のために不必要であることおよび実際にヒトｉＰＳ細胞を生成することに失敗したことを報告した。Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を生成できる因子であることが見出され、関連遺伝子Ｋｌｆ１およびＫｌｆ５も効率は低下していたが同様にできた。
【００７７】
遺伝子のＭｙｃファミリーは、癌に関係する癌原遺伝子である。ＹａｍａｎａｋａらおよびＪａｅｎｉｓｃｈら（１９８８年）は、ｃ−ｍｙｃがマウスｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であることを実証し、ＹａｍａｎａｋａらはそれがヒトｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であったことを実証した。しかし、ＴｈｏｍｓｏｎらおよびＹａｍａｎａｋａら（２００７年）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生成に不必要であったことを報告した。ｉＰＳ細胞の誘導における遺伝子の「ｍｙｃ」ファミリーの使用は、ｃ−ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞を移植されたマウスの２５％が致死的奇形腫を発症したことから臨床治療としてのｉＰＳ細胞の可能性に関して問題である。Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃの代わりに同様の効率で誘導するために同定されている。
【００７８】
Ｄ．再プログラム因子を使用する多能性幹細胞の誘導
典型的にはｉＰＳ細胞は、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。典型的にはトランスフェクションは、現在のやり方ではレトロウイルスなどのウイルスベクターの組込みを通じて達成される。トランスフェクトされる遺伝子は、主要な転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を増強することが示唆される。臨界期後に、トランスフェクトされた細胞の少数が形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的には形態学的選定、倍加時間を通じてまたはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【００７９】
２００７年１１月に、２つの独立した研究者チームの研究により成体ヒト細胞からｉＰＳを作製することによってマイルストーンが達成された（Ｙｕら、２００７年；Ｙａｍａｎａｋａら、２００７年）。マウスモデルにおいて先に使用された同じ原理でＹａｍａｎａｋａは、同じ４つの中心的な遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを、ｃ−Ｍｙｃは癌遺伝子であるがレトロウイルス系で使用してヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することに成功した。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ｃ−Ｍｙｃの使用を避けてレンチウイルス系を使用し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧおよび異なる遺伝子ＬＩＮ２８を使用した。
【００８０】
しかし、誘導多能性幹細胞を生成するための現在のプロセスは、緩徐かつ非効率的であり、ほとんどの細胞が失敗する。このプロセスの効率を改善するために、特定の態様において本方法およびベクターは、再プログラム因子および（レポーターの存在に関して選択することによってトランスフェクション効率を最適化する）レポーターを含有する多シストロン性構築物を利用し、導入遺伝子抑制が多能性細胞においては非常に効果的であることから、後者はレポーター遺伝子の発現のないものを選択することによって多能性細胞の選択を改善する。
【００８１】
ＩＶ．誘導多能性幹細胞を生成するための多シストロン性の系
本発明の特定の態様において、このＩＲＥＳ依存性多シストロン性系に由来する適用性および効率的発現は、その有利点の根拠となり、ｉＰＳ細胞産生の効率を増強するための有用な手段としてそれを確立する。この系の多数の変更として、これだけに限らないが（例えば図１を参照されたい）、１）使用するレポーターの変更（例えばシアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）、２）レポーター遺伝子の他の再プログラム遺伝子への置換（合成される必要のあるウイルスが少なくなる）、または３）ＬＴＲがＯｃｔ４ ＩＲＥＳ Ｓｏｘ−２ ＩＲＥＳ ｅＧＦＰの発現を駆動するような２つのＩＲＥＳを有するカセットの作製が挙げられる。
【００８２】
Ａ．配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
多シストロン性転写物の産生を可能にするためにＩＲＥＳ配列は、本発明に含まれる。これは、本発明の発現系が単一の転写物単位から複数の再プログラム因子を産生すること、または融合タンパク質を作製することなく、もしくは追加的遺伝子の発現を調節するための追加的制御エレメントの必要性がなく多シストロン性転写物にレポーターを容易に組み込むことを可能にする。
【００８３】
ほとんどの真核生物およびウイルスのメッセージは、ｍＲＮＡの５’末端の７−メチルグアノシンキャップの認識に関与する機構によって翻訳を開始する。しかし少数の例においては、翻訳は、ｍＲＮＡのキャップ領域から翻訳される遺伝子の３’下流に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がリボソームによって認識されるキャップ非依存的機構を介して生じ、転写物からの第２のコード領域の翻訳を可能にする。したがってＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルの迂回を可能にし、内部部位で翻訳を開始する（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）。
【００８４】
これは、ＩＲＥＳ配列が単一の遺伝子座からの複数のタンパク質の同時発現を可能にすることから本発明において特に重要である。ＩＲＥＳエレメントは、異種性の翻訳領域に連結されうる。複数の翻訳領域は、一緒に転写されることができ、ＩＲＥＳによってそれぞれ分離されることができ、多シストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントの効力により、各翻訳領域は効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現されうる（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
特に好ましい実施形態は、同じ多シストロン性転写物中の所望の組換え産物およびレポーターの両方についてのコード配列を包含するものである。形質転換事象の成功は、所望の再プログラム因子および容易に検出可能なレポーターの両方の発現によって示され、トランスフェクションに成功した細胞の選択を促進する。
【００８６】
ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳ要は記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１年）も同様である。特定の例として、ポリオウイルスＩ型、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＶ）の、「タイラー（Ｔｈｅｌｉｅｒ’ｓ）マウス脳脊髄炎ウイルス」（ＴＭＥＶ）の、「口蹄疫ウイルス」（ＦＭＤＶ）の、「ウシエンテロウイルス」（ＢＥＶ）の、「コクサッキーＢウイルス」（ＣＢＶ）のもしくは「ヒトライノウイルス」（ＨＲＶ）の５’ＵＴＲ、または「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」（ＢＩＰ）５’ＵＴＲ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａｅ ５’ＵＴＲもしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ ５’ＵＴＲあるいは上に列挙した配列由来の遺伝子交雑物または断片由来のＩＲＥＳエレメントが挙げられる。ＩＲＥＳ配列はＫｉｍら（１９９２年）およびＭｃＢｒａｔｎｅｙら（１９９３年）に記載されている。
【００８７】
Ｂ．レポーター
本発明の特定の実施形態は、形質転換の成功を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えばレポーター遺伝子は、発現カセット内で、同時発現のための再プログラム遺伝子のコード領域に通常は付随する制御エレメントの調節下に位置付けられうる。レポーターは、再プログラムベクターを含有する細胞が、それらを薬物もしくは他の選択圧の下に置くことなくまたはそうでなければ細胞生存率を危険にさらすことなく単離されることを可能にする。追加的有利点は、抑制されたレポーター発現を有する誘導多能性幹細胞を濃縮することである。
【００８８】
そのようなレポーターの例として、細胞表面タンパク質（例えばＣＤ４、ＨＡエピトープ）、蛍光タンパク質、抗原決定基および酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。ベクターを含有する細胞は、例えば、細胞表面タンパク質に対する蛍光標識抗体またはベクターにコードされた酵素によって蛍光産物に転換されうる基質を使用するＦＡＣＳによって単離されうる。
【００８９】
具体的な実施形態においてレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質である。蛍光発光スペクトルのプロファイルが可視光スペクトルのほぼ全体にわたることを特徴とする蛍光タンパク質の広範囲の遺伝的変種が開発されている。（非限定的な例として表１を参照されたい）。最初のＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ緑色蛍光タンパク質での変異誘導の試みは、青色から黄色の範囲の新たな蛍光プローブをもたらし、生物学的研究でのｉｎ ｖｉｖｏレポーター分子で最も広く使用されているものの一部である。橙色および赤色スペクトル領域で発光する長波長蛍光タンパク質は、花虫網に属するマリンアネモネ（ｍａｒｉｎｅ ａｎｅｍｏｎｅ）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａおよび造礁サンゴから開発されている。さらに他の種がシアン、緑色、黄色、橙色および深紅の蛍光発光を有する同様のタンパク質を産生するために採取されている。開発研究の努力は、蛍光タンパク質の輝度および安定性を改善するために継続されており、それによりそれら全般の有用性を改善している。
【００９０】
【表１−１】
【００９１】
【表１−２】
Ｖ．ベクター構築および送達
特定の実施形態において再プログラムベクターは、ウイルスベクター、例えば細胞内でこれらの再プログラム因子を発現するためのレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターでありうる。これらの方法の新規特性は、上に記載の多シストロン性転写物の使用であり、形質転換された細胞および誘導多能性細胞の選択を促進する。これらのベクターの構築および送達方法の詳細は、下に記載されている。
【００９２】
Ａ．ベクター
当業者は、標準的組換え技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１年およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６年を参照されたい、どちらも参照により本明細書に組み込まれる）を通じてベクターを構築する態勢が十分に整っている。ベクターとして、これだけに限らないがプラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）ならびにレトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、複製能力を有するもの、複製欠損およびそのガットレス形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどの人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられる。
【００９３】
好ましい１つのアプローチにおいてベクターは、ウイルスベクターである、具体的には、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、体細胞の再プログラムに成功裏に使用されている。ウイルスベクターは、細胞を効率的に形質導入し、それら自体のＤＮＡを宿主細胞に導入できる。組換えウイルスベクターの生成において、典型的には非必須遺伝子が異種（または非天然）タンパク質の遺伝子またはコード配列で置換される。
【００９４】
ウイルスベクターは、核酸および場合によりタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する発現構築物の一種である。特定のウイルスが受容体−依存性エンドサイトーシスを介して細胞に感染する、または細胞に侵入する能力および宿主細胞ゲノム中に組み込み、かつウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力は、それらを外来性核酸の細胞（例えば哺乳動物細胞）への移行のための魅力的な候補にしている。本発明の多シストロン性転写物を送達するために使用されうるウイルスベクターの非限定的例は、下に記載される。
【００９５】
ａ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来性遺伝物質を移行し、広域スペクトルの種および細胞型に感染し、特定の細胞系にパッケージされるそれらの能力により遺伝子送達ベクターとしての将来性がある（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年）。
【００９６】
レトロウイルスベクターを構築するために、核酸は、複製欠損であるウイルスを産生するために特定のウイルス配列の位置のウイルスゲノムに挿入される。ウイルス粒子を産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３年）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドがレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に特定の細胞系に導入されると（例えばリン酸カルシウム沈殿法によって）、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物の（次いで培養培地に分泌される）ウイルス粒子へのパッケージングを可能にする（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年；Ｍａｎｎら、１９８３年）。組換えレトロウイルスを含有する培地は、次いで回収され、場合により濃縮され、遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、幅広い細胞型に感染可能できる。しかし組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。
【００９７】
ｂ．レンチウイルスベクター
レンチウイルスは複合レトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて制御および構造的機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えばＮａｌｄｉｎｉら、１９９６年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７年；Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照されたい）。
【００９８】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染でき、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方での遺伝子導入および核酸配列の発現のために使用されうる。例えば非分裂細胞に感染できる組換えレンチウイルス（ここで適切な宿主細胞は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖならびにｒｅｖおよびｔａｔを保有している２つ以上のベクターによってトランスフェクトされる）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
【００９９】
Ｂ．制御エレメント
ベクターは、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらに調節する、または他に標的細胞へ有益な特性をもたらす他の成分または機能性も含みうる。そのような他の成分として、例えば細胞への結合および標的化に影響を与える成分（細胞型または組織特異的結合を調節する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞でのポリヌクレオチドの局在性に影響を与える成分（核局在化を介在する薬剤など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。
【０１００】
ベクターに含まれる真核生物の発現カセットは、好ましくは（５’から３’への方向で）タンパク質コード配列に機能的に連結した真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を含有する。
【０１０１】
ａ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度が調節されている核酸配列の領域である調節配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御タンパク質および分子が核酸配列の特定の転写を開始するために結合する場合がある遺伝エレメントを含有できる。語句、「機能的に位置した」、「機能的に連結した」、「調節下」および「転写調節下」は、プロモーターが、転写開始および／またはその配列の発現を調節するために核酸配列に関連して正確な機能的位置にあるおよび／または方向にあることを意味する。
【０１０２】
プロモーターは、ＲＮＡ合成についての開始部位を位置付けるために機能する配列を一般的に含む。これの最も公知である例は、ＴＡＴＡボックスであるが、例えば哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子に対するプロモーターなどＴＡＴＡボックスを欠いているいくつかのプロモーターでは、開始部位を覆っている分離したエレメントそれ自体が、開始場所を定めることに役立っている。追加的プロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。典型的にはこれらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターは開始部位の下流に機能的エレメントを同様に含有することが示されている。コード配列をプロモーター「の調節下」にするために、それは選択したプロモーターの「下流」（すなわちその３’）転写翻訳領域の転写開始部位の５’末端に位置している。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【０１０３】
プロモーターエレメント間の間隙は、しばしば変動性であり、したがってエレメントが相互に反転または移動する場合にプロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターにおいてプロモーターエレメント間の間隙は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ解離まで増大できる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調してまたは独立してのいずれでも機能できると考えられている。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を意味する「エンハンサー」と併せて使用されうる、または使用されえない。
【０１０４】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることから、天然で核酸配列に付随するものである場合がある。そのようなプロモーターは、「内在性」であると称されうる。同様にエンハンサーは、天然で核酸配列に付随するものである場合があり、配列の下流または上流のいずれかに位置する。別法としてある種の有利点は、コード核酸セグメントを組換えまたは異種性プロモーター（その天然環境では核酸配列に通常付随しないプロモーターを意味する）の調節下に位置付けることによって得られる。組換えまたは異種性エンハンサーもその天然環境では核酸配列と通常付随しないエンハンサーを意味する。そのようなプロモーターまたはエンハンサーとして、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち異なる転写制御領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有している）が挙げられる。例えば組換えＤＮＡ構築物中で最も慣用されるプロモーターとして、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、本明細書において開示する組成物と関連して、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して産生されうる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写および／または発現を方向付ける調節配列も同様に使用されうることが予期される。
【０１０５】
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官または生体においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に方向付けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは重要である。分子生物学の分野の当業者は、プロモーター、エンハンサーおよびタンパク質発現のための細胞型組合せの使用を全般に理解している（例えば参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な産生において有利であるなどのように、導入されたＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を方向付けるための適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、および／または有用でありうる。プロモーターは、異種性または内在性でありうる。
【０１０６】
追加的に、任意のプロモーター／エンハンサー組合せ（例えばＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のとおり）も、発現を駆動するために使用されうる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、可能性のある他の実施形態である。真核細胞は、適切な細菌性ポリメラーゼが送達複合体の一部としてまたは追加的遺伝子発現構築物としてのいずれかで提供される場合には、特定の細菌性プロモーターからの細胞質発現を支持できる。
【０１０７】
プロモーターの非限定的な例として、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなどの初期または後期ウイルスプロモーター；例えばベータアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９年、Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９年）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８年、Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８年）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９年、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４年）などの真核細胞プロモーター；ならびにサイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答配列プロモーター（ｔｒｅ）などの連鎖状の応答エレメントプロモーター、が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１に記載のヒト成長ホルモンミニマルプロモーター）またはマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能である、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ ４５００７）を使用することも可能である。具体的な例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターでありうる。
【０１０８】
ｂ．開始シグナル
特定の開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルは、提供される必要がある場合がある。当業者は、これを容易に決定でき、必要なシグナルを提供できる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と共に「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれであっても良い。発現効率は、適切な転写増強エレメントの包含によって増強されうる。
【０１０９】
ｃ．多重クローニング部位
ベクターは、多重制限酵素部位を含有する核酸領域であり、任意のそれはベクターを消化するために標準的組換え技術と共に使用されうる多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含みうる（例えば参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９年、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８年およびＣｏｃｅａ、１９９７年を参照されたい）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置にだけに作用する酵素での核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは、商業的に入手できる。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしばベクターは、外来性配列をベクターに連結できるようにするためにＭＣＳ内を切断する制限酵素を使用して直線化または断片化される。「連結」は、相互に近接できるまたはできない２つの核酸断片間でのホスホジエステル結合の形成プロセスを意味する。制限酵素および連結反応に関与する技術は組換え技術の当業者に周知である。
【０１１０】
ｄ．スプライシング部位
転写された真核生物性ＲＮＡ分子のほとんどは、１次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の正常なプロセシングを確実にするために供与体および／または受容体スプライシング部位を必要とする場合がある（例えば参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｎｄｌｅｒら、１９９７年を参照されたい）。
【０１１１】
ｅ．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、少なくとも１つの終結シグナルを含みうる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。したがって特定の実施形態においてＲＮＡ転写物の産生を止める終結シグナルが計画される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにｉｎ ｖｉｖｏにおいて必要な場合がある。
【０１１２】
真核生物系においてターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるための新たな転写物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列も含みうる。これは、転写物の３’末端に約２００個のＡ残基の伸長（ポリＡ）を添加するためのシグナルを特殊化した内在性ポリメラーゼに伝える。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であると考えられ、より効率的に翻訳される。したがって真核生物に関与する他の実施形態において、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことは好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することはより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するためおよびカセットから他の配列に読み過ごすことを最小化するために役立ちうる。
【０１１３】
本発明における使用のために計画されたターミネーターは、これだけに限らないが、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、または例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス性終結配列が挙げられ、本明細書に記載のまたは当業者に公知の任意の公知の転写のターミネーターを含む。特定の実施形態において終結シグナルは、配列の短縮などによる転写可能なまたは翻訳可能な配列の欠失でありうる。
【０１１４】
ｆ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物での発現において、転写物の正常なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルが典型的には含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に不可欠ある考えられず、任意のそのような配列が使用されうる。好ましい実施形態は、好都合であり、種々の標的細胞において十分に機能することが公知であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させうるか、または細胞質間輸送を促進できる。
【０１１５】
Ｃ．ベクター送達
本発明での再プログラムベクターの体細胞への導入は、本明細書に記載のとおりまたは当業者に公知であるとおり、細胞の形質転換のための核酸送達用の任意の適切な方法を使用できる。そのような方法として、これだけに限らないがｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションによる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９年、Ｎａｂｅｌら、１９８９年）、マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，２１５号）を含むインジェクションによる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）、電気穿孔法による（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号、Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、リン酸カルシウム沈殿法による（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）、ＤＥＡＥデキストランに続いてポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）、ダイレクトソニックローディングによる（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）、リポソーム介在性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年；Ｗｏｎｇら、１９８０年；Ｋａｎｅｄａら、１９８９年；Ｋａｔｏら、１９９１年）および受容体介在性トランスフェクションによる（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；ＷｕおよびＷｕ、１９８８年）、微粒子銃による（それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願 ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８、米国特許第５，６１０，０４２号、第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号）、炭化ケイ素繊維での撹拌による（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３０２，５２３号および５，４６４，７６５号）、アグロバクテリウム介在形質転換による（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６１６号および第５，５６３，０５５号）、プロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３年；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８４，６１１号および第４，９５２，５００号）、乾燥／阻害介在ＤＮＡ取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）などのＤＮＡの直接送達およびそのような方法の任意の組合せが挙げられる。これらなどの技術の応用を通じて、（１つもしくは複数の）細胞小器官、（１つもしくは複数の）細胞、（１つもしくは複数の）組織または（１つもしくは複数の）生体は安定的にまたは一過的に形質転換されうる。
【０１１６】
ａ．リポソーム介在トランスフェクション
本発明の特定の実施形態において核酸は、例えばリポソームなどの脂質複合体中に捕捉されうる。リポソームは、リン脂質二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自発的に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再構成を受け、水を捕捉し、溶質を脂質二重層の間に溶解する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。同様に計画されるのは、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはスーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化した核酸である。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質および使用される細胞に応じて変動する場合があり、例えば細胞１００〜１０００万個当たりベクターＤＮＡ約５〜約２０μｇが計画されうる。
【０１１７】
リポソーム介在核酸送達および外来性ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現は、良く成功している（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞および肝細胞種細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム介在送達および発現の実現可能性も実証されている（Ｗｏｎｇら、１９８０年）。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態においてリポソームは、血液凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成されうる。このことは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への進入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。他の実施形態においてリポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と共に複合体形成されうるまたは使用されうる（Ｋａｔｏら、１９９１年）。さらなる実施形態においてリポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と共に複合体形成されうるまたは使用されうる。他の実施形態において送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含みうる。
【０１１９】
ｂ．電気穿孔法
本発明の特定の実施形態において核酸は、電気穿孔法を介して細胞に導入される。電気穿孔法は、細胞およびＤＮＡの懸濁物の高電圧放電への暴露を含む。レシピエント細胞は、機械的損傷によって形質転換により感受性であるように作製されうる。使用されるベクターの量も使用される細胞の性質に応じて変動する場合があり、例えば細胞１００万〜１０００万個当たりベクターＤＮＡ約５〜約２０μｇで計画されうる。
【０１２０】
電気穿孔法を使用する真核生物細胞のトランスフェクションは、非常に良く成功している。この方法でマウスプレＢリンパ球は、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされており（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、ラット肝細胞は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年）。
【０１２１】
ｃ．リン酸カルシウム法
本発明の他の実施形態において核酸は、リン酸カルシウム沈殿法を使用して細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞は、この技術を使用してアデノウイルス５ ＤＮＡ（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年）でトランスフェクトされている。同様にこの方法でマウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞は、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年）、ラット肝細胞は種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）。
【０１２２】
ｄ．ＤＥＡＥ−デキストラン
他の実施形態において核酸は、ＤＥＡＥ−デキストランに続くポリエチレングリコールを使用して細胞に送達される。この方法でレポータープラスミドは、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）。
【０１２３】
ｅ．ソニケーションローディング
本発明の追加的実施形態は、ダイレクトソニックローディングによる核酸の導入を含む。ＬＴＫ−線維芽細胞は、ソニケーションローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされている（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）。
【０１２４】
ｆ．受容体介在トランスフェクション
さらに核酸は、受容体介在送達ビヒクルを介して標的細胞へ送達されうる。これらは、標的細胞において生じる受容体介在エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みの有利点を利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布を考慮して、この送達方法は別の範囲の特異性を本発明に加える。
【０１２５】
特定の受容体−介在遺伝子標的化ビヒクルは、細胞受容体−特異的リガンドおよび核酸結合剤を含む。他に核酸が送達される細胞受容体−特異的リガンドが機能的に付着しているものを含む。いくつかのリガンドは、受容体−介在性遺伝子輸送のために使用されており（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０年；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４年；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ ０２７３０８５）、技術の実現性を確立している。他の哺乳動物の細胞型との関連における特異的送達は記載されている（参照により本明細書に組み込まれるＷｕおよびＷｕ、１９９３年）。本発明の特定の態様において、リガンドは標的細胞集団で特異的に発現される受容体に応じて選択される。
【０１２６】
他の実施形態において、細胞特異的核酸標的化ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソームとの組合せで特異的結合リガンドを含みうる。送達される（１つまたは複数の）核酸は、リポソーム中に入れられ、特異的結合リガンドはリポソーム膜中に機能的に組み込まれる。したがってリポソームは、標的細胞の（１つまたは複数の）受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。そのような系は、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）がＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞への核酸の受容体−介在性送達において使用される系を使用して機能的であることが示されている。
【０１２７】
さらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、細胞特異的結合を方向付ける１つまたは複数の脂質または糖タンパク質を好ましくは含むリポソームそれ自体であっても良い。例えばラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）は、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。本発明の組織特異的形質転換構築物は、同様の手段で標的細胞へ特異的に送達されうることが予期される。
【０１２８】
ｇ．微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生体に核酸を導入するために使用されうる（米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第５，６１０，０４２号およびＰＣＴ出願 ＷＯ９４／０９６９９それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。この方法は、ＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して細胞を殺すことなく細胞膜を貫通し細胞に進入することを可能にする能力に依る（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。当技術分野において公知の多種多様な微粒子銃技術が存在し、その多くは本発明に適用できる。
【０１２９】
この微粒子銃において１つまたは複数の粒子は、少なくとも１つの核酸でコートされ、推進力によって細胞に送達されうる。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置は、次に駆動力をもたらす電流を起こすための高圧放電に依存している（Ｙａｎｇら、１９９０年）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金の粒子またはビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。例示的粒子として、タングステン、プラチナおよび好ましくは金をからなるものが挙げられる。場合により、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達のために必要ではないことが予期される。しかし、粒子はＤＮＡでコートされるよりむしろＤＮＡを含みうることが予期される。ＤＮＡコート粒子は、粒子銃を介するＤＮＡ送達のレベルを増大させうるが、それら自体としては必要ではない。
【０１３０】
照射のために、懸濁物中の細胞はフィルターまたは固形培養培地上に濃縮される。別法として未成熟胚または他の標的細胞は、固形培養培地上に準備される。照射される細胞は、マイクロプロジェクタイル阻止プレート下の適切な距離に置かれる。
【０１３１】
ＶＩ．ｉＰＳ細胞の選択
本発明の特定の態様において、再プログラムベクターが体細胞に導入された後、これらの細胞は増大のために培養される。細胞は、トランスフェクトされた細胞を濃縮するためにレポーターまたは選択マーカーなどのベクター要素の存在について選択されうる。再プログラムベクターは、これらの細胞において再プログラム要素を発現し、細胞分裂と共に複製および分配する。これらの発現される再プログラム因子は、体細胞ゲノムを自律的多能性状態を確立するために再プログラムし、ベクターの存在についての正の選択が除かれる間または後に、外来性遺伝性要素は、徐々に失われる。導入遺伝子発現のこの抑制は、レポーター遺伝子発現の遮断単独に関してまたは、（それらが多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予測されることから）他の胚性幹細胞特徴についての選択と組み合わせてでの誘導多能性幹細胞の選択を可能にする。
【０１３２】
Ａ．レポーター遺伝子発現についての選択
本発明の再プログラムベクターを導入された細胞は、レポーターおよび再プログラム因子を同時に発現でき、様々な時点でのレポーター遺伝子発現の存在または不在について選択されうる。例えば細胞は、レポーターの存在について選択されることができ、トランスフェクションはレポーターを使用することによって最適化されうる。誘導多能性幹細胞は、導入遺伝子が再プログラムの際に抑制されることからレポーターの消失について選別されうる。そのような選択または選別は、導入遺伝子発現の指標としてのレポーター遺伝子の発現によって生成される検出可能なシグナルに基づく。
【０１３３】
検出可能なシグナルは、本発明の方法において使用されるレポーター遺伝子の性質に応じて多数の方法のいずれか１つによって生成されうる。例えば、検出可能なシグナルは、蛍光シグナル例えばＧＦＰなどの発光でありうる。ＧＦＰは、基質または補助因子を必要とせずに蛍光シグナルを生じる蛍光ポリペプチドである。ＧＦＰ発現および検出技術は、当技術分野において周知であり、キットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。ＧＦＰ発現は、無処理細胞においてそれらを溶解する、またはさらなる試薬を添加する必要なくアッセイされうる。別法として検出可能なシグナルは、酵素活性または細胞表面マーカー（例えばＬＮＧＦＲ）の認識の結果として生成されるシグナルでありうる。
【０１３４】
フローサイトメトリー、例えば蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）は、レポーター遺伝子発現に基づく検出可能なシグナルについて選択するために慣用される。ＦＡＣＳは、細胞の不均一な混合物を、各細胞に特異的な光散乱および蛍光特徴に基づいて細胞１つずつ２つ以上の容器に選別するための方法を提供する。これは、個々の細胞由来の蛍光シグナルの迅速、客観的かつ定量的な記録および誘導多能性細胞の物理的分離を提供する。
【０１３５】
ルシフェラーゼも、アッセイの基礎として使用されうる。ルシフェラーゼ発現は、当技術分野において公知であり、ルシフェラーゼ発現および検出のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）から商業的に入手可能である。ルシフェラーゼの存在は、シンチレーション測定によって発光シグナルを測定するよりも、細胞溶解および細胞へのルシフェリン基質の添加によって有利に評価される。
【０１３６】
酵素に基づくアッセイは、検出が発光を介す必要がないこと以外は、ルシフェラーゼに基づくアッセイと同様のやり方で実施される。検出技術は、酵素に依存し、したがって光学的（β−ガラクトシダーゼの場合など）である場合がある。
【０１３７】
物理的および生化学的方法も本発明のレポーター遺伝子の発現を同定または定量するために使用されうる。これらの方法として、これだけに限らないが、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出および決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および検査するためのノーザンブロット、Ｓ−１ＲＮａｓｅプロテクション、プライマー伸長法または逆転写ＰＣＲ増幅法、３）酵素活性を検出するための酵素アッセイ（そのような遺伝子産物は遺伝子構築物によってコードされている）、４）タンパク質ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット技術、免疫沈降または酵素結合免疫測定法（遺伝子構築物産物はタンパク質である）、ならびに５）導入された遺伝子構築物の発現の結果として産生された化合物の生化学的測定が挙げられる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの追加的技術も特定の細胞におけるレポーター遺伝子の存在または発現を検出するために使用されうる。
【０１３８】
Ｂ．胚性幹細胞特徴についての選択
先行する研究から生成に成功したｉＰＳＣは、天然から単離された多能性幹細胞（マウスおよびヒトの胚性幹細胞、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣなど）に、以下に関して顕著に類似しており、したがってｉＰＳＣの天然から単離された多能性幹細胞との同一性、確実性および多能性を確認した。したがって、本発明において開示される方法から生成される誘導多能性幹細胞は、レポーター遺伝子発現の存在の有無に加えて１つまたは複数の以下の幹細胞特徴に基づいて選別されうる。
【０１３９】
ａ．細胞の生物学的特性
形態学：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣに類似している。各細胞は、円形、大型の核および乏しい細胞質を有する場合がある。ｉＰＳＣのコロニーもＥＳＣのそれに類似している場合がある。ヒトｉＰＳＣはｈＥＳＣと同様にはっきりした縁の、扁平な、密集したコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様にｈＥＳＣのものよりもあまり扁平でなく、より凝集したコロニーを形成する。
【０１４０】
増殖特性：幹細胞はそれらの定義の一部として自己再生でなければならないことから、ＥＳＣの倍加時間および有糸分裂活性は、礎石となるものである。ｉＰＳＣは、有糸分裂活性であり、活発に自己再生、増殖し、かつＥＳＣと同じ速度で分裂することができる。
【０１４１】
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現される細胞表面抗原性マーカーを発現できる。ヒトｉＰＳＣは、これだけに限らないがＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６ＥおよびＮａｎｏｇが挙げられるｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣと同様にＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４は発現しなかった。
【０１４２】
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴが挙げられる未分化ＥＳＣにおいて発現される遺伝子を発現できる。
【０１４３】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、細胞分裂約５０回でのヘイフリック限界によって制限されない細胞分裂を維持するために必要である。ｈＥＳＣは、自己再生および増殖を維持するために高いテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣも高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体において必要な成分、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。
【０１４４】
多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣから完全に分化した組織へと同様の様式で分化できる。
【０１４５】
神経分化：ｉＰＳＣは、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＡＰ２を発現している神経細胞に分化できる。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣがｈＥＳＣと同様にドーパミン神経に分化できることを示すことができる。幹細胞関連遺伝子は、分化後に下方制御される。
【０１４６】
心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に拍動を開始する心筋細胞に分化できる。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβおよびＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は、分化後に下方制御される。
【０１４７】
奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、９週間などの一定時間後に自然発症で奇形腫を形成できる。奇形腫は、３つの胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉由来の組織を含有する多系統の腫瘍であり、これは、典型的には１つだけの細胞型である他の腫瘍とは違っている。奇形腫形成は多能性についてのランドマーク検査である。
【０１４８】
胚様体：培養中のｈＥＳＣは、有糸分裂活性で分化しているｈＥＳＣのコアおよび３つ全ての胚様由来の完全に分化した周辺の細胞からなる「胚様体」と称される球状の胚様構造を自発的に形成する。ｉＰＳＣも、胚様体を形成し、周辺の分化した細胞を有しうる。
【０１４９】
胚盤胞注入：ｈＥＳＣは、胚に分化する胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）および胚結節に天然では属し、一方、胚盤胞の殻（栄養膜）は胚体外組織に分化する。中空の栄養膜は、生存している胚を形成できず、したがって胚結節中の胚性幹細胞は分化し、胚を形成する必要がある。雌レシピエントに移される胚盤胞を生成するためにマイクロピペットによって栄養膜に注入されたｉＰＳＣは、生存しているキメラマウスの子：それらの身体全体について１０％〜９０で組み込まれたｉＰＳＣ誘導体を有するマウスおよびキメラ化を生じうる。
【０１５０】
ｂ．エピジェニック再プログラム
プロモーター脱メチル化：メチル化は、メチル基のＤＮＡ塩基への、典型的にはメチル基のＣｐＧ部位の（隣接シトシン／グアニン配列）シトシン分子への転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性を抑止し、または発現を妨げる酵素を補充することによって発現を妨げる。したがって遺伝子のメチル化は、転写を阻止することによってそれを効果的に抑制する。Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ１およびＮａｎｏｇを含む内在性多能性関連遺伝子のプロモーターは、ｉＰＳＣにおいて脱メチル化される場合があり、それらのプロモーター活性およびｉＰＳＣ中の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示す。
【０１５１】
ヒストン脱メチル化：ヒストンは、ＤＮＡ配列に構造的に局在し、種々のクロマチン関連修飾を通じてそれらの活性に影響を与えうる凝縮タンパク質である。Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇに付随するＨ３ヒストンは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇの発現を活性化するために脱メチル化されうる。
【０１５２】
ＶＩＩ．ｉＰＳ細胞の培養
開示の方法を使用して体細胞が再プログラムベクターを導入された後、これらの細胞は多能性を維持するために十分な培地中で培養されうる。本発明において生成される誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、米国特許出願第２００７０２３８１７０号および米国特許出願第２００３０２１１６０３号に記載のとおり霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技術を使用できる。
【０１５３】
例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は８０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８または＃１１９６５−０９２）、加熱不活性化していない２０％ディファインドウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール中で維持されうる。別法としてＥＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８）、２０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製された無血清培地においても維持されうる。使用の直前にヒトｂＦＧＦが最終濃度約４ｎｇ／ｍＬで添加される（ＷＯ９９／２０７４１）。
【０１５４】
ＥＳ細胞などのｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８７年）に対する抗体を使用する免疫組織学的検査またはフローサイトメトリーによって同定されうる特徴的抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、細胞およそ０．５〜１０ １０ ６個を８〜１２週齢のオスＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注入することによって確認されうる。３つの胚様それぞれの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施についての好ましい様式を構成すると考えられうることは当業者によって理解されるべきである。しかし当業者は、本開示を考慮して、開示される具体的な実施形態に多数の変更が作製されることができ、なお依然として本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られることを理解すべきである。
【０１５６】
（実施例１）
レトロウイルスベクターの構築
再プログラム遺伝子および選択マーカーが導入された親レトロウイルスベクターは、Ｋｅｎｎｅｄｙら（２００３年）において既に言及されている。簡潔には、ミニマルベクターは５’および３’ＭＭＬＶ末端反復領域（ＬＴＲ）を含有し、５’ＬＴＲは再プログラムおよび選択のために必要な遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターを含有する（図１）。好都合にも、５’ＬＴＲのすぐ上流に位置してサイトメガロウイルスプロモーターも存在することからレトロウイルスプラスミドは一過的トランスフェクションのために使用されることができ、プラスミドがウイルス合成のための鋳型として使用される場合には非機能的なままになる。
【０１５７】
図１に示すとおり、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８は、蛍光タンパク質もコードしているＭＭＬＶに基づくレトロウイルス骨格にそれぞれ導入された。Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ４の両方は、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）についての発現をコードしているレトロウイルス骨格中に置かれ、一方ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８は単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）を発現可能である骨格中に置かれた。再プログラムのための遺伝子をコードしている転写物の翻訳は、基準のＡＴＧ開始コドンで開始し、下流蛍光タンパク質は、脳心筋炎ウイルス由来の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を介して翻訳される。
【０１５８】
（実施例２）
レトロウイルスベクターを使用するウイルスの生成
レトロウイルスベクターをウイルスを生成するために以下の方法において使用した。最初に、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇまたはＬｉｎ−２８をコードする４つのレトロウイルスベクターのそれぞれを別々のトランスフェクション物として調製した。各レトロウイルスベクター１０マイクログラムを水疱性口内炎ウイルス偽型糖タンパク質（１μｇ）、Ｇａｇポリメラーゼ（３ｕｇ）およびＮＦｋＢ（１ｕｇ）をコードするＤＮＡと別々に混合した。次いでＤＮＡを、５００ｕｌ ＯｐｔｉＭｅｍと混合した。別にポリエチレンイミン（１ｍｇ／ｍｌ）４０マイクロリットルをＯｐｔｉＭｅｍ ５００μｌと混合した。ＤＮＡ／ＯｐｔｉＭｅｍ混合物およびＰＥＩ／ＯｐｔｉＭｅｍ混合物は、次いで室温で５分間インキュベートするために置き、次いで合わせて、室温で少なくとも２０分間インキュベートされるべきであるおよそ１ｍｌの溶液を得た。
【０１５９】
本発明者らは、トランスフェクションの日に細胞がおよそ８０パーセントコンフルエントとなるような希釈でトランスフェクションの１日前に分割されたＳＶ４０ Ｔ抗原タンパク質を過発現している２９３細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションの当日に細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、かつＯｐｔｉＭｅｍまたはＤＭＥＭ（血清および抗生物質不含有）の４ｍｌを加える。２０分間のインキュベーション中に、ひとたび親油性複合体が形成されたら、次いでＤＮＡ複合体（１ｍｌ）を細胞に滴下で加えた。培地は、３７℃でのインキュベーションの４時間後にＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清もしくは仔ウシ血清および５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝塩類溶液で置換した。ウイルスは、トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクションしたプレートから培地５ｍｌを回収することによって収集した。ウイルス含有培地は、次いで細胞細片を除くために５分間、１０００ｒｐｍで遠沈し、培地を４５ｕｍシリンジフィルターを通して濾過する。
【０１６０】
（実施例３）
細胞の感染およびプレーティング
再プログラムの実行を可能にする感染および環境への移行に関与する手順は、２つの方法のうちの１つに従った。１つの方法は、感染ならびに感染したおよび感染していない細胞の再プログラム用の照射ＭＥＦ上へのプレーティングを含み、他の方法は、再プログラム化の効率を増強する目的でＭＥＦへの選別法による感染した細胞だけのプレーティングを含んだ。
【０１６１】
方法１：再プログラム遺伝子を発現しているウイルスで感染させた未選別ＩＭＲ−９０細胞再プログラム
ＩＭＲ−９０細胞は、感染のためのレシピエント宿主として使用され成功しているが、この手順は初代皮膚細胞および造血細胞などの代替えの細胞型の感染に適応可能である。感染の７２時間前にＩＭＲ−９０細胞およそ５００００個を６ウエルプレートの各ウエルに接種した。細胞の追加的プレートを各ウイルスについての感染効率の決定における使用のために調製した。例えば１つのウエルの細胞を複数のウイルスよりも単一のウイルスに対するレシピエントにした。感染は、トランスフェクションした２９３Ｔ細胞から新たに収集したウイルスを用いて１〜１０の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で実行した。ＭＯＩの範囲は、ウイルス産生のための感染から感染への固有の変動性に依る。
【０１６２】
感染は、６ウエルプレート内で、最初に培地を除去し、４つのウイルスそれぞれ当容量で最終濃度培地１ｍｌ当たり細胞およそ５×１０４〜１×１０５個（すなわち最終容量２ｍｌで各ウイルスについて５００μｌ）で置換することにより行った。細胞は、接着したままであり、４℃で２時間ロッキングプラットホーム上に置き、３７℃、５％ＣＯ２に置いた。別法として細胞を、感染効率へ顕著な影響なく直ちにインキュベーターに置くことができた。感染当日は、０時点と見なされ、その後の全ての日が感染後と見なされた。次いで感染細胞は、４８時間インキュベートされ、その時点で４つ全てのウイルスで感染させた６ウエルプレートの各ウエルからの細胞を０．２〜０．５ｍｌの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで収集した。細胞は、回収され、プールされ、かつ１０％ＦＢＳを含む最小基礎培地（Ｍ１０Ｆ）で容量１０〜１５ｍｌにした。次いでそれらを１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去し、細胞を抗生物質を含まないＭ１０Ｆ １０ｍｌに再懸濁し、照射マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層の上に蒔いた。
【０１６３】
ＭＥＦを、感染したＩＭＲ−９０細胞の添加の３日前に０．１％ゼラチンでコートした１０ｃｍプレートに１ｍｌ当たり細胞およそ７．５×１０４個の密度で蒔いた。ＭＥＦプレーティングの翌日、培地を除去し、ＦＧＦを含まないヒトＥＳ（ｈＥＳ）培地（８０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２０％Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール）で置換した。プレーティングの３日後、ＭＥＦを１×ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇ不含有）で１度洗浄し、１０ｍｌ Ｍ１０Ｆに再懸濁した感染ＩＭＲ−９０細胞をＭＥＦに蒔いた。終夜インキュベーションはＩＭＲ−９０細胞の接着を可能にし、培地をゼブラフィッシュＦＧＦ １００ｎｇ／ｍｌを含有する馴化培地（ＣＭ）１０ｍｌで置換した（感染後３日を表す）。ＣＭを、ｈＥＳ培地を高密度照射ＭＥＦ上で終夜インキュベートし、回収し、１００ｎｇ／ｍｌ ｚＦＧＦを補充することによって調製した。次いで感染ＩＭＲ−９０細胞は、使用した培地をｚＦＧＦを含む新鮮ＣＭ １０ｍｌで毎日置換することによって培養した。
【０１６４】
方法２：再プログラム遺伝子を発現しているウイルスで感染させた選別ＩＭＲ−９０細胞再プログラム
感染は、感染の前に２つの６ウエルプレート全体を１ウエル当たりＩＭＲ−９０細胞５×１０４個で接種したことを除いて方法１に示したとおり実施した。感染細胞のより大きなプールは、選別を促進し、選別後の生存率も増強する。選別のための調製においてＩＭＲ−９０細胞を含有する全てのウエルをトリプシンによって収集し、方法１に示すとおり感染の３日後にプールした。プールした細胞を凝集塊を除くために濾過し、選別まで氷上に保存した。
【０１６５】
２５ｐｓｉの圧力、チップサイズ測定値１０ミクロンでＦＡＣｓ ＤＩＶＡを、Ｍ２０Ｆ／５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含む１５ｍｌコニカルチューブに選択された細胞を選別するために使用した。選別は、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２発現のレベルに関連する低から中程度のレベルのｅＧＦＰならびにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のレベルに関連する低から中程度のレベルのｍＲＦＰに基づいた。本発明者らは、この実験をＬｉｎ２８の非存在下でも実施し、その場合様々なレベルのＮａｎｏｇを発現している細胞を特異的に選別できた。再プログラムの効率は、Ｎａｎｏｇの量の増大と関連し、したがって、ｍＲＦＰ強度によって反映される中程度から高レベルのＮａｎｏｇを発現している細胞を選別した。
【０１６６】
ＦＡＣｓにより決定したｅＧＦＰまたはｍＲＦＰについて陽性の細胞の分画によりＩＭＲ−９０細胞の平均でおよそ８５％が各ウイルスに感染しており、細胞約３×１０４〜２×１０５個を回収した。細胞を氷上で保存し、それらを蒔くまで選別の間、冷却した。同日、選別した細胞をＭ１０Ｆの総容量１０ｍｌにし、次いで１〜６日前に１ｍｌ当たり細胞およそ７．５×１０４個の密度で蒔いた照射ＭＥＦの単層上に置いた。選別後の回復および接着のために細胞をＭ１０Ｆ（抗生物質なし）中のＭＥＦ上でさらに３日間培養した（ＭＥＦは方法１に記載のとおり調製した）。感染の６日後、１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦを補充した１０ｍｌ ＣＭをＭ１０Ｆの代わりに使用し、再プログラムされたコロニーが形成されるまで毎日補充した。
【０１６７】
（実施例４）
再プログラム細胞の選択
再プログラムされた細胞をまず形態学およびｅＧＦＰおよびｍＲＦＰ発現の消失によって同定した。コロニーは拡大した核および複数の核小体を有する、高度に密集した細胞を含有した。ここで本発明者らは、感染後２０〜４０日間の範囲の時間枠でコロニーを取った。コロニーは、手作業で取り、照射ＭＥＦ（１ｍｌ当たり細胞７．５×１０４個）を含有するウエル（４８、２４から６ウエル）に移した。移した翌日はそれらに補充しないままにし、次いでコロニーが分割および冷凍のために十分な数に増大するまで毎日のＣＭでの補充を再開した。ｉＰＳクローンを、細胞表面マーカー（すなわちＳＳＥＡ ３、ＳＳＥＡ ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ １およびＯｃｔ４）および染色体中の任意の異常を同定するための核型を使用してさらに特徴付けた。
【０１６８】
本明細書において開示および特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行されうる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態の観点から記載されているが、本明細書において記載の方法および方法のステップまたはステップの連続に変更が、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく適応できることは当業者に明らかである。より具体的には化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤を代用でき、同じまたは類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかである全てのそのような類似する置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
【０１６９】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書において説明するものを捕捉してそれらが例示的手順または他の詳細を提供する範囲において、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１７０】
【化１】
【０１７１】
【化２】
【０１７２】
【化３】
【０１７３】
【化４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）転写制御エレメント、ならびに
（ｂ）前記転写制御エレメントに機能的に連結した第１および第２コード配列であって、前記第１コード配列が再プログラム因子をコードし、かつ前記第２コード配列が第２再プログラム因子またはレポーターをコードする、第１および第２コード配列
を含む多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクター。
【請求項２】
前記転写制御エレメントが末端反復配列領域（ＬＴＲ）を含む、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項３】
前記第２コード配列がレポーターをコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項４】
前記第２コード配列が第２再プログラム因子をコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項５】
前記発現カセットが前記転写制御エレメントに機能的に連結した第３コード配列をさらに含み、前記第３コード配列が再プログラム因子、レポーターまたは選択マーカーをコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項６】
前記第３コード配列が選択マーカーをコードする、請求項５に記載の再プログラムベクター。
【請求項７】
前記選択マーカーが抗生物質耐性マーカーである、請求項６に記載の再プログラムベクター。
【請求項８】
前記レポーターが細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項８に記載の再プログラムベクター。
【請求項１０】
コードされる前記再プログラム因子がＳｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１１】
ＳｏｘがＳｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８である、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１２】
ＯｃｔがＯｃｔ−４である、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１３】
前記再プログラム因子がＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃである、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１５】
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１４に記載の再プログラムベクター。
【請求項１６】
前記レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶまたはＳＬ−３−３−ＭＬＶである、請求項１５に記載の再プログラムベクター。
【請求項１７】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１４に記載の再プログラムベクター。
【請求項１８】
前記発現カセットが１つまたは複数のＩＲＥＳをさらに含む、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１９】
前記ＩＲＥＳが、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルスＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルスＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳおよびヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳからなる群から選択される、請求項１８に記載の再プログラムベクター。
【請求項２０】
前記ＩＲＥＳが脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳである、請求項１９に記載の再プログラムベクター。
【請求項２１】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１から２０に記載の１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ、および
（ｂ）体細胞の集団の細胞に前記再プログラムベクターを導入してｉＰＳ細胞集団を提供するステップ
を含む、方法。
【請求項２２】
（ｃ）前記集団を増大させるために前記細胞を培養するステップ、および
（ｄ）増大させた前記集団の後代細胞を選択するステップであって、前記後代細胞が胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する、ステップ
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｃ）が前記体細胞の集団を選択するステップをさらに含み、選択された前記体細胞が前記レポーターを発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｃ）における前記選択が蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ｅ）選択された前記後代細胞を培養して、前記ｉＰＳ細胞集団を提供するステップ
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の再プログラムベクターがＳｏｘおよびＯｃｔを含む再プログラム因子をコードするコード配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の再プログラムベクターがリポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオンまたはポリアニオンによって前記細胞に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記体細胞が哺乳動物体細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記体細胞がヒト体細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記体細胞が線維芽細胞、造血細胞または間葉細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記特徴が前記レポーターの本質的な消失、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカーまたは多能性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記特徴が前記レポーターの発現の本質的な消失である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記特徴が蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイによって選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記特徴が未分化形態である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記特徴が、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴからなる群から選択される１つまたは複数の胚性幹細胞特異的マーカーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）転写制御エレメント、ならびに
（ｂ）前記転写制御エレメントに機能的に連結した第１および第２コード配列であって、前記第１コード配列が再プログラム因子をコードし、かつ前記第２コード配列が第２再プログラム因子またはレポーターをコードする、第１および第２コード配列
を含む多シストロン性発現カセットを含む再プログラムベクター。
【請求項２】
前記転写制御エレメントが末端反復配列領域（ＬＴＲ）を含む、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項３】
前記第２コード配列がレポーターをコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項４】
前記第２コード配列が第２再プログラム因子をコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項５】
前記発現カセットが前記転写制御エレメントに機能的に連結した第３コード配列をさらに含み、前記第３コード配列が再プログラム因子、レポーターまたは選択マーカーをコードする、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項６】
前記第３コード配列が選択マーカーをコードする、請求項５に記載の再プログラムベクター。
【請求項７】
前記選択マーカーが抗生物質耐性マーカーである、請求項６に記載の再プログラムベクター。
【請求項８】
前記レポーターが細胞表面マーカー、蛍光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項８に記載の再プログラムベクター。
【請求項１０】
コードされる前記再プログラム因子がＳｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１１】
ＳｏｘがＳｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５またはＳｏｘ−１８である、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１２】
ＯｃｔがＯｃｔ−４である、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１３】
前記再プログラム因子がＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃである、請求項１０に記載の再プログラムベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１５】
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１４に記載の再プログラムベクター。
【請求項１６】
前記レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、Ａｋｖ−ＭＬＶまたはＳＬ−３−３−ＭＬＶである、請求項１５に記載の再プログラムベクター。
【請求項１７】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１４に記載の再プログラムベクター。
【請求項１８】
前記発現カセットが１つまたは複数のＩＲＥＳをさらに含む、請求項１に記載の再プログラムベクター。
【請求項１９】
前記ＩＲＥＳが、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポティウイルスＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルスＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦカッパＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテッショウウイルス−１ ｔａｌｆａｎ ＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティック輪斑ウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳおよびヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳからなる群から選択される、請求項１８に記載の再プログラムベクター。
【請求項２０】
前記ＩＲＥＳが脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳである、請求項１９に記載の再プログラムベクター。
【請求項２１】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１から２０に記載の１つまたは複数の再プログラムベクターを得るステップ、および
（ｂ）体細胞の集団の細胞に前記再プログラムベクターを導入してｉＰＳ細胞集団を提供するステップ
を含む、方法。
【請求項２２】
（ｃ）前記集団を増大させるために前記細胞を培養するステップ、および
（ｄ）増大させた前記集団の後代細胞を選択するステップであって、前記後代細胞が胚性幹細胞の１つまたは複数の特徴を有する、ステップ
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｃ）が前記体細胞の集団を選択するステップをさらに含み、選択された前記体細胞が前記レポーターを発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｃ）における前記選択が蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ｅ）選択された前記後代細胞を培養して、前記ｉＰＳ細胞集団を提供するステップ
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の再プログラムベクターがＳｏｘおよびＯｃｔを含む再プログラム因子をコードするコード配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の再プログラムベクターがリポソームトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃、リン酸カルシウム、ポリカチオンまたはポリアニオンによって前記細胞に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記体細胞が哺乳動物体細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記体細胞がヒト体細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記体細胞が線維芽細胞、造血細胞または間葉細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記特徴が前記レポーターの本質的な消失、未分化形態、胚性幹細胞特異的マーカーまたは多能性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記特徴が前記レポーターの発現の本質的な消失である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記特徴が蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＣＡＴアッセイまたは発光アッセイによって選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記特徴が未分化形態である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記特徴が、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴからなる群から選択される１つまたは複数の胚性幹細胞特異的マーカーである、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５００００５（Ｐ２０１２−５００００５Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３０９４（Ｐ２０１１−５２３０９４）
【出願日】平成２１年８月１１日（２００９．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３４０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９５６９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１０００３８３０）セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１１日（２００９．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３４０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９５６９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１０００３８３０）セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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