本発明は、成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現の検出、定量化、ならびにモニタリングのための、リボ核酸、プローブ、および方法に関する。本発明はさらに、他の非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現をモニタリングする、ならびに、ＲＮＡエディティング、単一の転写産物の対立遺伝子変異体、転写産物における特定のエキソンの突然変異、欠損、または重複（例えば、癌などのヒト疾患に関連する変化）を検出および定量化するための方法に関する。本発明はさらに、デオキシ核酸の発現の検出、定量化、ならびにモニタリングのための方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヌクレオシド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの非コードＲＮＡを、単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉するための方法。
【請求項２】
次のステップ：
ａ）オリゴヌクレオチド捕捉プローブと、非コードリボ核酸配列を接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列が、非コードＲＮＡにおける配列と相補的である、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ中の残りのヌクレオチド配列（アンカーヌクレオチド配列）と相補的な鎖を合成するステップ、
ｃ）形成された二本鎖を固体支持体上に固定させ、標的サンプルを富化し、それに続いて固体支持体から標的配列を解放させるステップ、
ｄ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としての捕捉プローブにおけるアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写によって、非コードリボ核酸に対して相補的なＤＮＡ鎖を合成するステップ、
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
ｆ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化するステップ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
次のステップ：
ａ）標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブと接触させるステップ、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、捕捉プローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成するステップ、
ｃ）固体支持体上に形成された二本鎖を固定化し、標的サンプルを富化するステップ、
ｄ）逆転写酵素と、プライマーとしての捕捉プローブとを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成するステップ、
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えるステップ、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
ｆ）ＤＮＡポリメラーゼと一対のプライマーとを使用して、標的配列を鋳型にするＰＣＲ増幅を実施するステップ、および、
ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、このようにして得られた核酸を定量化するステップ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）標的ヌクレオチド配列を、それぞれ、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなる２つのオリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、前記認識ヌクレオチド配列は、標的配列と相補的であり、第１のタギングプローブの認識配列が、標的配列の第１の領域とハイブリダイズし、第２のタギングプローブの第２の認識配列は、標的配列の第１の領域に隣接する標的配列の第２の領域とハイブリダイズする、
ｂ）ハイブリダイズしたタギングプローブの２つの隣接する認識配列を共有結合的に連結によって繋げ、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列および２つのアンカーヌクレオチド配列を含む、近接するヌクレオチド配列を形成すること、および、
ｃ）アンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって、連結されたオリゴヌクレオチド分子を定量化すること、
によって、核酸サンプル内の標的ヌクレオチド配列を定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）標的リボ核酸配列を、オリゴヌクレオチドタギングプローブと接触させること、ここで、認識ヌクレオチド配列は、標的配列内の配列と相補的である、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、プライマーとしての標的リボ核酸配列とを使用して、タギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列と相補的な鎖を合成すること、
ｃ）逆転写酵素と、プライマー結合部位としてのタギングプローブ内のアンカーヌクレオチド配列とを使用する逆転写により標的リボ核酸と相補的なＤＮＡ鎖を合成すること、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとしての第２のタギングプローブとを使用する第２鎖の合成によって、ヘテロ二本鎖中のリボ核酸配列を置き換えること、ここで、前記第２のタギングプローブは、アンカーヌクレオチド配列および認識ヌクレオチド配列からなり、前記認識ヌクレオチド配列は、逆転写酵素で伸長された核酸配列中の配列と相補的である、
ｅ）オリゴヌクレオチドタギングプローブに付着されたアンカーヌクレオチド配列に相当するプライマーと、標的認識配列および検出部分を含む標識された検出プローブとを使用するリアルタイムＰＣＲによって、得られた核酸を定量化すること、
によって、核酸サンプル内の低分子非コードＲＮＡ配列を定量化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオシド類似体がＬＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの非コードＲＮＡの単離、精製、増幅、検出、同定、定量化、または捕捉のためのキットであって、反応体および１つまたは複数の改変されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項８】
改変されたオリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオシド類似体を含有する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ヌクレオシド類似体がＬＮＡである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
最高でも長さが１００ヌクレオチドである、短い長さのＲＮＡの定量測定のための方法であって、
ａ）前記の短い長さのＲＮＡを含むサンプルから、１）前記の短い長さのＲＮＡの配列、その相当するＤＮＡ配列、または前記の短い長さのＲＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖標的配列、および２）５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、
ｂ）逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの鎖を得ること、および
ｃ）鋳型として前記ｃＤＮＡと所望により鋳型ポリヌクレオチドを含む定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施すること
を含む方法。
【請求項１１】
ステップｃにおいてｑＰＣＲのために使用されるプライマーが、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、５’または３’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の近接する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、１つは、一本鎖標的配列内の第１のヌクレオチド配列に相当し、もう１つは、一本鎖標的配列内の第２のヌクレオチド配列と相補的である、
から選択され、ｑＰＣＲのために使用される前記プライマーが、それぞれ独立に、検出可能な標識を含みうる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）における反応が、一本鎖標的配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、あるいは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の近接する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、逆転写プライマーまたはＤＮＡ重合プライマーを利用する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記逆転写プライマーまたはヌクレオチド重合プライマーが、少なくとも１つの短い長さのＲＮＡに対して特異的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、同一のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、共有結合的に結合される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、非共有結合的に結合される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、検出可能な標識を含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、酵素反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非酵素的な反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、サンプルＲＮＡが得られる生物中に天然には存在しない、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非哺乳類のものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列の、短い長さのＲＮＡへの連結による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、あるいはステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列を、ターミナルトランスフェラーゼ反応において、好ましくはポリ−Ａトランスフェラーゼ反応において、短い長さのＲＮＡに連結することによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
連結が、オーバーハングライゲーションおよび平滑末端ライゲーションから選択され、好ましくはオーバーハングライゲーションである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
小さいＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端に直接隣接する５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端が、オーバーハングライゲーションを可能にするように配置されるように、５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であり、短い長さのＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドの、短い長さのＲＮＡへのアニーリングを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のすべてのＲＮＡが、連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応にかけられる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応が、標的配列の３’末端のみで実施される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
標的配列の５’末端への連結が、連結反応の前に、標的配列の５’末端をリン酸化することによって実施される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
連結の前に、５’隣接ヌクレオチド配列が、その５’末端でブロックされ、３’隣接ヌクレオチド配列が、その３’末端でブロックされる、請求項２２〜２７のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、規定されたプロセッシング状態の、ステップ（ａ）における前記短い長さのＲＮＡと優先的または独占的に結合される、請求項１０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡの規定されたプロセッシング状態が、成熟した状態である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）が、ｃＤＮＡを得るための鋳型ポリヌクレオチドの逆転写を含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）が、隣接するヌクレオチド配列を付着するためのヌクレオチド重合のステップを含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
重合が、鋳型に依存しないポリメラーゼおよび鋳型に依存するポリメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼによって達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
重合が、標的配列の３’末端へのポリ−Ａ、ポリ−Ｇ、ポリ−Ｔ、またはポリ−Ｃテールの付加にある、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）が、以下のステップ
−その５’末端が短い長さのＲＮＡの３’末端と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの３’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された短い長さのＲＮＡ分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのＲＮＡを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ヌクレオチド重合が、鋳型ポリヌクレオチドを構成するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを得るためにＤＮＡ重合を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、（Ｉ）所望により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブにアニーリングしていない材料の除去の後、ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を逆転写させることを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
逆転写におけるプライマーが、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたは別の逆転写プライマーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ａ）が、
−その３’末端が短い長さのＲＮＡの５’と相補的でありその５’末端が５’隣接ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの５’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのＲＮＡを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）が、短い長さのＲＮＡが、伸長された捕捉プローブから除去され、捕捉プローブが、３’隣接ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに、その３’末端でアニーリング可能にされ、捕捉プローブが、ｃＤＮＡを得るために、鋳型としてヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ重合によって、５’→３’方向にさらに伸長されることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
捕捉オリゴヌクレオチドが、固体支持体上への固定化を可能にする部分を含有する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
非アニーリング材料の除去を可能にするために、捕捉プローブが、アニーリングの後に固定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ａ）におけるサンプルが、短い長さのＲＮＡについて富化される、請求項１０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｃ）が、改変されたヌクレオチドを含む検出プローブの使用を含む、請求項１０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
検出プローブが、短い長さのＲＮＡ内の配列に相当する、あるいはこの配列に相補的である、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
逆転写あるいはＤＮＡ重合に使用されるプライマーが、改変されたヌクレオチドを含む、請求項１０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｃ）におけるｑＰＣＲで使用される少なくとも１つのプライマーが、ステップ（ｂ）の逆転写またはヌクレオチド重合で使用されるプライマーによって構成される、請求項１０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
最高でも１００ヌクレオチドの長さである、短い長さのＲＮＡの定量測定に有用なキットであって、
−請求項１０から５０のいずれか一項に記載の方法において使用される、最小数の逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブ、ここで、逆転写プライマー、ヌクレオチド重合プライマー、ｑＰＣＲのためのプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドプローブは、請求項１１〜５０のいずれか一項で定義した通りである、ならびに
−逆転写プライマー、および／またはヌクレオチド重合プライマー、および／またはｑＰＣＲのためのプライマー、および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、および／またはヘルパーオリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する、短い長さのＲＮＡの定量測定のための指示書
を含むキット。

【図１−１】

【図１−２】

【図２−Ａ】

【図２−Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９−１】

【図９−２】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１１−３】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２−１】

【図２２−２】

【図２２−３】

【図２２−４】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７−１】

【図２７−２】

【図２８−１】

【図２８−２】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【公表番号】特表２００７−５３２１００（Ｐ２００７−５３２１００Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６６５９（Ｐ２００７−５０６６５９）
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００２３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９８０２９
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願人】（５０４４１２３２５）エクシコン・アクティーゼルスカブ (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｘｉｑｏｎ　Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】