ｐ５３癌抑制蛋白との結合に関与するＣ型肝炎ウイルス非構造蛋白ＮＳ３のアミノ酸残基の同定と、医薬開発への利用
【課題】 ＮＳ３アミノ末端領域においてｐ５３との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、その知見を利用した新規医薬のスクリーニング方法を提供すること、特に、Ｃ型肝炎治療薬あるいはＣ型肝癌発症予防薬といった医薬の開発に有用なスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴とする。このスクリーニング方法において、第１０６番目のロイシン等の、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む領域と結合する物質を探索することにより、効率の良いスクリーニングが可能になる。
【解決手段】 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴とする。このスクリーニング方法において、第１０６番目のロイシン等の、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む領域と結合する物質を探索することにより、効率の良いスクリーニングが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白（増殖関連多機能蛋白）ＮＳ３のアミノ末端領域においてｐ５３癌抑制蛋白との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、その知見を医薬開発に応用する技術に関し、特に、Ｃ型肝炎治療薬あるいはＣ型肝癌発症予防薬といった医薬開発に用いる技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科に属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と略記する場合がある）は、慢性肝疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者の１５〜２０％に肝硬変をおこす。そして、肝硬変患者では年率１〜４％の割合で原発性肝細胞癌が発生し、我が国では、Ｃ型肝炎ウイルス感染者の約３０％が確実に肝細胞癌になると推測されている。
【０００３】
ＨＣＶのゲノム（遺伝子）は１本鎖プラス鎖のＲＮＡで、約９６００塩基で構成されており、約３０００のアミノ酸をコードしている。この前駆体蛋白は宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルスがコードする２種類のプロテアーゼによって開裂を受け、コア、エンベロープ１（Ｅ１）、Ｅ２、ｐ７、非構造蛋白２（ＮＳ２）、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの１０種類のウイルス蛋白を生じる。
【０００４】
図１４は、ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ遺伝子、およびＨＣＶ蛋白を模式的に示したものである。同図に示すように、ＨＣＶ粒子は、ウイルス遺伝子ＲＮＡと３種類の構造蛋白（Ｃ（コアタンパク質）、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質）からなる。ＨＣＶ遺伝子は約９６００塩基のＲＮＡからなり、一つの大きなオープンリーディングフレームがある。そのオープンリーディングフレームは約３０００アミノ酸残基からなる前駆体蛋白をコードしている。この前駆体蛋白は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルス固有の２種類のプロテアーゼ（ＨＣＶ亜鉛プロテアーゼおよびＨＣＶセリンプロテアーゼ）によりプロセシングされ、少なくとも上記１０種類の成熟ウイルス蛋白を生じる。ＮＳ３を含め、ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂはウイルス粒子を構成しないが、ウイルス増殖には必須の非構造蛋白である。
【０００５】
ＨＣＶのゲノムは変異に富んでおり、それに基づいてＨＣＶは６種類のゲノタイプと６０種類以上のサブタイプに分類されている。サブタイプ１ｂ（ＨＣＶ−１ｂ）は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出される。一般的に、ＨＣＶ−１ｂは他のサブタイプに比べてインターフェロン感受性が低く、また、肝細胞癌をおこしやすいことが知られている。
【０００６】
一方、ゲノタイプやサブタイプに関連する差異以外に、同じサブタイプ内でもウイルス株によって様々な性質の違いがあることも観察されている。例えば、ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａのアミノ酸配列の違いによってインターフェロン感受性や血中ウイルス量の異なることが報告されている。また、本発明者は以前、ＮＳ３のアミノ末端領域の二次構造の多様性と肝細胞癌発症危険性がよく相関することを、多数の臨床検体を用いて明らかにした（下記の非特許文献１・２参照）。
【０００７】
ＮＳ３は、そのアミノ末端領域にセリンプロテアーゼを、また、カルボキシル末端にヌクレオシド３リン酸加水分解酵素（ＮＴＰａｓｅ）やヘリカーゼをコードしている。ＮＳ３は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５Ｂを中心としたウイルス遺伝子複製装置の一部を構成し、ヘリカーゼ機能によるＲＮＡの巻き戻しを介してウイルス遺伝子の複製に関与するとともに、セリンプロテアーゼ機能による前駆体蛋白のプロセシングを担う。すなわち、ＮＳ３は、ウイルス増殖に必須の多機能蛋白である。
【０００８】
ＮＳ３のアミノ末端領域はＮＳ４Ａと結合し、そのことを介してＮＳ３が安定化され、そのセリンプロテアーゼ活性が亢進される。そのようなウイルス増殖に不可欠な酵素活性以外に、ＮＳ３は肝細胞癌の発生に関わっていると考えられる。例えば、ＮＳ３のアミノ末端領域が種々の培養細胞（マウスやラットの線維芽細胞、ヒト肝細胞など）を悪性形質転換（癌化）させることが報告されている（下記の非特許文献３・４参照）。
【０００９】
また、本発明者もこれまでに、ＮＳ３がマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）にアクチノマイシンＤ誘導性アポトーシスに対する抵抗性を付与すること（下記の非特許文献５参照）、さらに、ＮＳ３のアミノ末端領域１８０残基がｐ５３癌抑制蛋白と相互作用すること、及びその相互作用はＮＳ３アミノ末端領域の配列によって異なることを観察している（下記の非特許文献６〜８参照）。
【００１０】
【非特許文献１】Ogata, S., Y. Ku, S. Yoon, S. Makino, M. Nagano-Fujii, and H. Hotta. 2002. Correlation between secondary structure of an amino-terminal portion of the nonstructural protein 3 (NS3) of hepatitis C virus and development of hepatocellular carcinoma. Microbiol. Immunol. 46:549-554.
【非特許文献２】Ogata, S., R. H. Florese, M. Nagano-Fujii, R. Hidajat, L. Deng, Y.,Ku, S. Yoon, T. Saito, S. Kawata, and H. Hotta. 2003. Identification of hepatitis C virus (HCV) subtype 1b strains that are highly, or only weakly, associated with hepatocellular carcinoma on the basis of the secondary structure of an amino-terminal portion of the HCV NS3 protein. J. Clin. Microbiol. 41:2835-2841.
【非特許文献３】Sakamuro, D., T. Furukawa, and T. Takegami. 1995. Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transforms NIH 3T3 cells. J. Virol. 69:3893-3896.
【非特許文献４】He, Q. Q., R. X. Cheng, Y. Sun, D. Y. Feng, Z. C. Chen, and H. Zeng. 2003. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 C-terminal deleted protein. World J. Gastroenterol. 9:474-478.
【非特許文献５】Fujita, T., S. Ishido, S. Muramatsu, M. Itoh, and H. Hotta. 1996. Suppression of actinomycin D-induced apoptosis by the NS3 protein of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:825-831.
【非特許文献６】Ishido, S., and H. Hotta. 1998. Complex formation of the nonstructural protein 3 of hepatitis C virus with the p53 tumor suppressor. FEBS Lett. 438:258-262.
【非特許文献７】Ishido, S., T. Fujita, and H. Hotta. 2000. Possible involvement of the NS3 protein of hepatitis C virus in hepatocarcinogenesis: Its interaction with the p53 tumor suppressor, p. 37-55. In N. A. Habib, (ed.), Hepatocellular Carcinoma: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ.
【非特許文献８】Muramatsu, S., S. Ishido, T, Fujita, M. Itoh, and H. Hotta. 1997. Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis C virus and factors affecting the localization. J. Virol. 71:4954-4961.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、ＨＣＶ非構造蛋白ＮＳ３のアミノ末端領域はセリンプロテアーゼ活性を有し、ウイルス前駆体蛋白のプロセシング、ひいてはウイルス増殖に必須の役割を担っている。一方、ＮＳ３アミノ末端領域は癌抑制蛋白ｐ５３と結合することを本発明者はこれまでに明らかにした。さらに、本発明者は、ＮＳ３アミノ末端領域の二次構造の多様性と肝細胞癌発症危険性がよく相関することを臨床的に明らかにした。これらの結果はＨＣＶ発癌におけるＮＳ３の重要性を強く支持するものである。
【００１２】
しかしながら、ＮＳ３アミノ末端領域のうち、どのアミノ酸がｐ５３癌抑制蛋白との結合に重要であるかは不明であった。またこれまでに、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性を阻害するＮＳ３インヒビターとしていくつかの物質が提案されているが、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質については知られておらず、このような物質をＨＣＶによる発癌の予防、治療などに利用する提案もなされていなかった。
【００１３】
本発明は、上記の事情に着目してなされたものであって、その目的は、ＮＳ３アミノ末端領域においてｐ５３との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、その知見を利用した新規医薬のスクリーニング方法を提供すること、特に、Ｃ型肝炎治療薬あるいはＣ型肝癌発症予防薬といった医薬開発に利用可能なスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の課題に鑑み、ＮＳ３のアミノ末端領域のうち、どのアミノ酸がｐ５３癌抑制蛋白との相互作用に関与しているかについて検討した。その結果、ｐ５３との結合に影響を与える複数のアミノ酸残基を同定した。これらアミノ酸残基のうち第１０６番目のロイシンがｐ５３との結合に最も重要な役割を担っていると考えられる。また、これらアミノ酸残基を置換するとＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性も変化し、両者の間に相関が認められた。以上の知見から、これらアミノ酸残基と相互作用する物質を探索することによって、ＨＣＶによる発癌を抑制し、さらには、ＨＣＶの増殖をも抑制し得る薬剤の開発に利用できること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明のスクリーニング方法は、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴としている。
【００１６】
ここで結合阻害物質は、ＮＳ３とｐ５３との結合を完全に阻害するものでなくてもよく、ＮＳ３とｐ５３との結合を有意に低下させるものであればよい。具体的なスクリーニング方法としては、後述の各種バインディングアッセイやインシリコ・スクリーニング等を挙げることができる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法において、ＮＳ３アミノ末端領域内の、ｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基を同定し、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することは好ましい方法である。解析の結果、ＮＳ３アミノ末端領域における第１０６番目のロイシンは、ｐ５３との結合に重要な役割を担っており、さらに、ＮＳ３のプロテアーゼ活性にも影響を与える部位であることを見出している。したがって、第１０６番目のロイシンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することは好ましい方法である。
【００１８】
また後述のように、ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニン、第１５８番目のバリン、および第１３８番目のセリンも、ＮＳ３とｐ５３との結合に影響を与える部位であることを見出した。したがって、本発明のスクリーニング方法の一態様として、これらいずれかのアミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索する方法を採用してもよい。このとき、結合関与領域として３０〜８０個程度のアミノ酸残基からなるＮＳ３アミノ末端領域内のペプチドを発現させ、当該ペプチドとｐ５３との結合阻害物質を探索することは好ましい方法である。
【００１９】
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白では、野生型よりも強くｐ５３蛋白と結合することが実験により認められた。このようにｐ５３蛋白とより強く結合するＮＳ３変異蛋白を使用して、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索する方法は、より強い結合阻害剤が得られる可能性があるので、本発明のスクリーニング方法として好ましい方法の一つである。
【発明の効果】
【００２０】
ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質は、ｐ５３癌抑制蛋白の本来の作用を維持させることによって、ＨＣＶによる発癌（原発性肝細胞癌）の予防や治療に有用と考えられる。本発明のスクリーニング方法は、このような結合阻害物質を探索することによって、癌の予防や治療に有用な薬剤の開発に利用することができる。
【００２１】
特に、ＮＳ３アミノ末端領域におけるｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することによって、効率の良い結合阻害物質の探索が可能である。
【００２２】
また、ｐ５３との結合に影響を与える部位として同定された第１０６番目のロイシン等は、ＮＳ３のプロテアーゼ活性にも影響を与え、同部位に変異を導入するとＨＣＶの増殖に重要なＮＳ３のプロテアーゼ活性は抑制された。したがって、第１０６番目のロイシン等と相互作用する物質は、ＨＣＶの増殖を抑制し、Ｃ型肝炎の治療薬として利用できる可能性がある。さらにこのことは、本発明のスクリーニング方法により第１０６番目のロイシン等と相互作用する物質を探索することによって、ｐ５３結合阻害作用と同時にＨＣＶ増殖抑制作用を示し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能であることを意味する。本発明は、このようなＨＣＶに対する新たなタイプの治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の具体的態様等について更に詳しく説明する。なお、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００２４】
本発明者は、前述のように、ＮＳ３アミノ末端領域のうち、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要な役割を担っているかについて解析した。ここでＮＳ３アミノ末端領域とはＮＳ３のアミノ末端側の領域をいうが、特に解析対象としたＮＳ３アミノ末端領域は、下記１〜１９８番目のアミノ酸配列領域である。
【００２５】
APITAYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSTPPAVPQSFQ
【００２６】
配列表の配列番号１においても、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列を示す。この１〜１９８番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列のうち１０２７番目から１２２４番目までのアミノ酸配列に相当する。
【００２７】
免疫共沈法、二重染色法などを用いた解析の結果、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列中、ｐ５３との結合に影響を与える複数のアミノ酸残基を同定した。さらに、これらのアミノ酸残基がＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性に影響を及ぼすかどうかについても検討した。
【００２８】
詳細は後述するが、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列中、４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）、１５８位のバリン（Ｖａｌ）をアラニン（Ａｌａ）に変異させると、いずれの場合にもｐ５３との結合は著しく抑制された。したがって、これら３つの部位はｐ５３との結合に重要と考えられる。また、１８０アミノ酸に点変異を導入した解析の結果、上記３つの部位のうち、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）がｐ５３との結合に最も重要な役割を担っており、次いで４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がｐ５３との結合に重要であると認められた。
【００２９】
他方、１３８位のセリン（Ｓｅｒ）をプロリン（Ｐｒｏ）に変異させると、ｐ５３結合性は逆に増加した。即ち、１３８位のセリンはｐ５３との結合に影響を与え、１３８位のセリンを置換すると、ＮＳ３とｐ５３とはより結合しやすくなる。
【００３０】
さらに、ｐ５３との結合に影響を与える上記複数のアミノ酸残基について、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性への影響を調べた結果、１０６位のロイシン、４３位のフェニルアラニンをアラニンに変異させると、いずれもプロテアーゼ活性が著しく減少し、両変異を導入すると、さらにプロテアーゼ活性は減弱した。同様に、１３８位のセリンをプロリンに変異させた場合にも、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性は著しく減少した。
【００３１】
このように、１０６位のロイシンは、ｐ５３との結合性およびセリンプロテアーゼ活性の双方に重要であり、同部位をアラニンに置換すると、ｐ５３結合性およびセリンプロテアーゼ活性は著しく減少した。そこでＮＳ３の立体構造を検討したところ、１０６位のロイシンは、セリンプロテアーゼの活性中心を構成するアミノ酸の一つである１３９位のセリン（Ｓｅｒ）と空間的に非常に近い部位に位置することがわかった。
【００３２】
前述のように、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質は、ｐ５３癌抑制蛋白の本来の作用を維持させることによって、ＨＣＶによる発癌（原発性肝細胞癌）を防止する治療薬となりうる。そして、ｐ５３との結合に影響を与える上記１０６位のロイシン等のアミノ酸残基は、治療薬開発の重要なターゲットとなりうる。また、これらのアミノ酸残基はＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性にも影響を及ぼすため、ＨＣＶの増殖を抑制するＣ型肝炎治療薬のターゲットともなりうる。このことは、上記１０６位のロイシン等のアミノ酸残基に着目して当該アミノ酸残基と相互作用する物質を探索することによって、ｐ５３結合阻害作用と同時にＨＣＶ増殖抑制作用を示し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能であることを意味する。本発明は、このようなＨＣＶに対する新たなタイプの治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００３３】
スクリーニング方法としては、例えばターゲットとなる上記１０６位のロイシンを含む領域と相互作用する物質を探索する。このような物質は、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質として有望である。同様に、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、あるいは１３８位のセリンを含む領域と相互作用する物質を探索することによって、ＨＣＶによる肝炎もしくは肝癌の治療薬を効率良く取得できる可能性が高い。
【００３４】
上記スクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や蛋白質の局在・活性変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。in vitro及びin vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、cell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、ｐ５３遺伝子・蛋白は、ヒト由来のもののほか、マウス、ラットその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、ＮＳ３アミノ末端領域の高次構造の情報を利用してスクリーニングを行ってもよい。
【００３５】
ＮＳ３アミノ末端領域の高次構造については、例えば下記文献Ａ・Ｂに報告されている。
文献Ａ：Kim, J. L., K. A. Morgenstern, C. Lin, T. Fox, M. D. Dwyer, J. A. Landro, S. P. Chambers, W. Markland, C. A. Lepre, E. T. O'Malley, S. L. Harbeson, C. M. Rice, M. A. Murcko, P. R. Caron, and J. A. Thomson. 1996. Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell 87:343-355.
文献Ｂ：Love, R. A., H. E. Parge, J. A. Wickersham, Z. Hostomsky, N. Habuka, E. W. Moomaw, T. Adachi, and Z. Hostomska. 1996. The crystal structure of hepatitis C virus NS3 proteinase reveals a trypsin-like fold and a structural zinc binding site. Cell 87:331-342.
【００３６】
これら既存のＮＳ３アミノ末端領域の立体構造に関する情報、または本発明以降に開示された立体構造情報をもとに、上記１０６位のロイシン近傍の構造とよく結合し得る構造の低分子化合物（またはペプチド、ＲＮＡ等）を探索・分子設計することによって、ＳＢＤＤ（Structure Based Drug Design）による治療薬のスクリーニングが可能である。
【００３７】
勿論、このようなインシリコ・スクリーニング法のほかに、既存の各種バインディングアッセイを使用して、ＮＳ３とｐ５３との結合阻害物質を探索してもよい。例えば、本発明者は、後述の実施例に示すように、様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３とをＨｅＬａ細胞において共発現させる系を確立しており、この系を用いてＮＳ３とｐ５３との結合阻害を測定することができる。ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、例えば下記の配列情報をもとに調製することができ、これを発現ベクターに組み込み宿主に発現させることにより、当該アミノ酸配列からなる蛋白質を得ることができる。
【００３８】
ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列
GCGCCCATCACGGCCTACTCCCAACAGACGCGGGGCCTACTTGGTTGCATCATCACTAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAGGTTCAGGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGTATCAACGGCGTGTGTTGGACTGTCTATCATGGTGCCGGCTCAAAGACCCTAGCTGGCCCAAAAGGCCCAATCACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAAGACCTCGTTGGCTGGCcGGCGCCCCCTGGGGCGCGTTCCATGACACCATGCACCTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGACATGCTGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGCGACAGCAGGGGGAGCCTCCTCTCCCCCcGGCCCATCTCCTACCTGAAGGGTTCCTCGGGTGGTCCGCTGCTTTGCCCCTCGGGCCATGTTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGGGGGGTTGCGAAGGCGGTAGACTTTGTGCCCGTTGAGTCTATGGAAACCACTATGCGGTCTCCGGTCTTCACGGATAACTCAACCCCCCCGGCCGTACCGCAGTCATTCCAA
【００３９】
配列表の配列番号２・３にも上記塩基配列を示す。上記塩基配列をもとに、より短い長さのＮＳ３アミノ末端領域を作製し、あるいは、さらにエピトープタグで標識したものを作製し、これを材料に、ｐ５３との結合を阻害する物質をスクリーニングする。例えば上記１０６位のロイシンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなる断片を作製し、当該断片をｐ５３との結合関与領域としてスクリーニングに使用することは好ましい。同様に、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、または１３８位のセリンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなる断片を作製し、当該断片をｐ５３との結合関与領域としてスクリーニングを行ってもよい。
【００４０】
上記の結合測定系においては、後述のように、結合阻害の有無を免疫沈降―免疫ブロット法により検出することができるが、他の方法を用いてもよい。例えば、阻害剤のマススクリーニングに向けて98 wellまたは384 wellのマイクロタイタープレート等にＮＳ３アミノ末端領域を固定し、それとｐ５３との結合阻害の有無を酵素、蛍光色素あるいは放射性同位元素で標識した抗体によって検出する系を確立することも可能である。
【００４１】
このような試験管内反応系（cell-free system）によるスクリーニングの一例について説明すると、まず、上記１０６位のロイシン、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、または１３８位のセリンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなるＮＳ３アミノ末端領域の断片（結合関与領域）を、ＨｅＬａ細胞や大腸菌などで発現させることによって調製する。ｐ５３も発現ベクターを用いて同様に調製できるが、ｐ５３は、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ等のタグでエピトープ標識したものを調製するとよい。
【００４２】
次に、上記断片（結合関与領域）をウエル底面に固着し、タグをつけたｐ５３と被検物質とを混ぜてウエルに入れる。もし被検物質がｐ５３と上記ＮＳ３断片との結合を阻害するものであれば、洗浄後、抗タグ抗体ではｐ５３は検出されない。一方、もし被検物質がｐ５３とＮＳ３断片との結合に関与しないものであれば、洗浄後、抗タグ抗体によりｐ５３が検出される。このように、ｐ５３の検出の有無により、ｐ５３と上記ＮＳ３断片との結合を阻害する物質を検索することができる。この方法では、９６ウエルプレートとロボット分注機を使えばかなりのハイスループット化も期待できる。
【００４３】
このような方法を用いて、合成ペプチドライブラリー、微生物代謝産物ライブラリーや天然化合物ライブラリー等をスクリーニングし、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質を探索するとよい。さらに、得られた結合阻害物質について、ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性をも阻害するか、常法により検討するとよい。例えば、当該プロテアーゼ活性により開裂を受け、生成されるタンパク質の有無を抗体により検出する方法によって、プロテアーゼ活性阻害の有無を調査することができる。このような本発明のスクリーニング方法によって、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害すると同時にＮＳ３セリンプロテアーゼ活性をも阻害し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能になる。
【００４４】
後述の実施例に示すように、ＮＳ３アミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白は、野生型よりも強くｐ５３蛋白と結合した。そこで本発明のスクリーニング方法において、ｐ５３蛋白とより強く結合する上記ＮＳ３変異蛋白を使用して、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索する方法は、より強い結合阻害剤が得られる可能性が高く、好ましい方法の一つである。また、上記ＮＳ３変異蛋白以外に、点変異を導入したその他種々のＮＳ３変異蛋白（後述の実施例参照）についても、比較実験での利用を含め、本発明のスクリーニング方法において有用である。
【００４５】
勿論、本発明のスクリーニング方法は、前記の方法に限定されるものではなく、これとは異なる種々の方法が適用可能である。例えば、前記の方法は、試験管内反応系（cell-free system）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。一例として、二重染色法（後述の実施例参照）により、細胞内でのＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との共局在の有無を調べることによって、被検物質による結合阻害の有無を調査してもよい。
【００４６】
さらに、酵母two-hybrid法を用いて、ＮＳ３とｐ５３との結合を検出することも可能であり、この系により酵母細胞を使って結合阻害剤をスクリーニングすることができる。酵母two-hybrid法については、例えば、文献「Gyuris, J., E. A. Golemis, H. Chertkov, and R. Brent. 1993. Cdi1, a human G1- and S-phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75:791-803.」記載の方法を挙げることができる。そのほか、（１）上記１０６位のロイシンを含むＮＳ３アミノ末端領域をカラムに固定してこれと結合する物質を探索する方法、（２）表面プラズモン共鳴を応用した生体分子結合活性測定装置（ＢＩＡＣＯＲＥ）でｐ５３とＮＳ３との結合を検出し、この系により結合阻害剤をスクリーニングする方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４８】
（１）様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現する発現プラスミドの作製
図１の最上段に模式的に示すように、ＨＣＶのＮＳ３領域は、６３１アミノ酸からなる。本実施例においては、ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基に着目し、この１９８残基のうち、いずれのアミノ酸残基がｐ５３との結合に重要であるかについて検討した。
【００４９】
そのためまず、ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基、及びそれより短い種々の長さのＮＳ３アミノ末端領域をコードするｃＤＮＡを調製した（図１参照）。図中の数字はアミノ酸残基の位置を示す。例えば、上から５番目のｃＤＮＡは、３１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードする。ＮＳ３アミノ末端領域の１〜１９８番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列において１０２７〜１２２４番目に相当する。図１の右側かっこ内の数字は、各ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列が、ＨＣＶの全アミノ酸配列において何番目から何番目までに相当するかを示したものである。
【００５０】
ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基をコードするｃＤＮＡの配列は、配列表の配列番号２・３に示すとおりである。
【００５１】
上記のように調製した各種ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドに組み込むことで、様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現する発現プラスミドを作製した。また、これらｃＤＮＡに点変異を導入した点突然変異体をコードするｃＤＮＡ、および種々の長さのＮＳ３アミノ末端領域とglutathione S- transferase（ＧＳＴ）との融合蛋白をコードするｃＤＮＡを調製し、これらｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドに組み込んだ。点突然変異体ｃＤＮＡの作製は、常法によりin vitro mutagenesis kitを用いて行った。図１の上から８番目以降は、ＧＳＴとの融合蛋白を発現させたものである。
【００５２】
ｐ５３の発現には、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに全長ｐ５３ ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを使用した。
【００５３】
（２）培養細胞におけるＮＳ３とｐ５３の結合の検討
ワクチニアウイルスＴ７ハイブリッド発現法を用いて、上記各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３をＨｅＬａ細胞に発現させ、細胞抽出液を得た。その細胞抽出液について、特異抗体を用いた免疫共沈法と、それに引き続くウエスタンブロット法により、両蛋白の結合の有無を調べた。
【００５４】
（３）ＮＳ３とｐ５３の細胞内共局在の検討
上記と同様に各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３をＨｅＬａ細胞に発現させ、特異抗体を用いた二重染色間接蛍光抗体法により、両蛋白の細胞内共局在について検討した。
【００５５】
（４）ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性の測定
ＮＳ３と、その基質であるＨＣＶのＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリ蛋白を同時にＨｅＬａ細胞に発現させ、その細胞抽出液について、抗ＮＳ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリ蛋白の開裂を指標にして、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性を測定した。
【００５６】
（５）ｐ５３との結合に関与するＮＳ３の最小領域とアミノ酸残基の同定
図２は、特異抗体を用いた免疫共沈法と、それに引き続くウエスタンブロット法により、上記各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との結合の有無を調べた結果である。レーン１〜３は、ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸を発現させた試料（以下、便宜上「ａａ１〜１９８」という。他も同様である。）、レーン４〜９はそれぞれ、ａａ１〜１８０、ａａ１〜１２０、ａａ１〜９０、ａａ３１〜１９８、ａａ６１〜１９８、ａａ９１〜１９８を発現させた試料である。図中上段には、免疫沈降に用いた特異抗体を示す。レーン１の試料にはウサギから得た抗ＩｇＧ抗体を使用し、それ以外にはウサギから得た抗ｐ５３抗体を使用した。レーン２以外の試料は宿主細胞にｐ５３を共発現させたものであり、レーン２はベクター（ｐｃＤＮＡ）のみ細胞に導入したものである。「Ｌｙ」「Ｉｐ」はそれぞれ、細胞抽出液、免疫沈降物に対するウエスタンブロットの結果を示す（以下の図も同様である）。「ｐ５３」の検出には抗ｐ５３抗体を使用した。また、本実験は、Ｍｙｃペプチド標識ＮＳ３を発現させて行ったため、「ＮＳ３」の検出には抗Ｍｙｃ抗体を使用した。
【００５７】
同図に示される結果から、ａａ１〜１２０にｐ５３結合領域が存在することが分かった（レーン５）。ａａ９１〜１９８にも弱い結合領域が存在した（レーン９）。また、ｐ５３結合領域はＮＳ４Ａ結合領域（ａａ１〜３０）以外の領域に存在すること、即ち、ＮＳ４Ａ結合領域を除く１６８残基（ａａ３１〜１９８）がｐ５３と結合することが分かった（レーン７）。
【００５８】
次いで、上記１６８残基を３つの断片（ａａ３１〜９０、ａａ６１〜１３０、ａａ１２１〜１９８）に分けて発現させたところ、いずれの断片もｐ５３と結合したため、それぞれについて、さらに欠失変異体を作製して検討した。
【００５９】
図３は、ａａ３１〜９０においてｐ５３との結合に重要な部位を検討した結果である。レーン２〜６はそれぞれ、ａａ３１〜９０、ａａ４１〜９０、ａａ４６〜９０、ａａ５１〜９０、ａａ６１〜９０をＧＳＴ融合蛋白として発現させた試料である。「ＧＳＴ−ＮＳ３」の検出には抗ＧＳＴ抗体を使用した。
【００６０】
同図に示される結果から、ａａ４１〜９０はｐ５３と結合するが（レーン３）、ａａ４６〜９０は結合しないことが分かった（レーン４）。このことは、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ４１〜４５に存在する可能性を示している。そこで、それぞれのアミノ酸をアラニン（Ａｌａ）に置換した変異体を作製し、ｐ５３との結合を調べた。
【００６１】
その結果、図４に示すように、４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアラニンに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することが分かった（レーン５：Ｆ４３Ａ）。
【００６２】
図５は、同様の方法により、ａａ６１〜１３０においてｐ５３との結合に重要な部位を検討した結果である。レーン１〜５はそれぞれ、ａａ６１〜１３０、ａａ６１〜１３０、ａａ６１〜１１０、ａａ６１〜１０５、ａａ６１〜１００をＧＳＴ融合蛋白として発現させた試料である。これらの試料中、レーン１の試料のみｐ５３を共発現させていない。
【００６３】
同図に示される結果から、ａａ６１〜１１０はｐ５３と結合するが（レーン３）、ａａ６１〜１０５は結合しないことが分かった（レーン４）。このことから、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ１０６〜１１０に存在する可能性が示された。そこで、 それぞれのアミノ酸を置換した変異体を作製して検討した結果、図６に示すように、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）をＡｌａに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することが分かった（レーン３：Ｌ１０６Ａ）。
【００６４】
さらに、同様の解析において、ａａ１２１〜１６０はｐ５３と結合するが（図７のレーン４）、ａａ１２１〜１５５は結合しない（同図レーン５）ことから、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ１５６〜１６０に存在する可能性が示された。
【００６５】
そこで、それぞれのアミノ酸をＡｌａに置換した変異体を作製し、ｐ５３との結合を調べたところ、図８に示すように、１５８位のバリン（Ｖａｌ）をＡｌａに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することがわかった（レーン３：Ｖ１５８Ａ）。
【００６６】
ｐ５３との結合に影響を与える上記３つの変異（Ｆ４３Ａ、Ｌ１０６Ａ、Ｖ１５８Ａ）のうち、結合に最も重要と考えられる部位はどれであるかを検討する為、これらの変異をそれぞれ単独に（または複数組み合わせて）、ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基からなる断片に導入してｐ５３との結合の有無を調べた。その結果、図９に示すように、ｐ５３との結合はＬ１０６Ａ変異の導入によって著しく抑制された（レーン４・５）。なお図中、レーン３・４はそれぞれ、ａａ１〜１８０にＦ４３Ａ変異、Ｌ１０６Ａ変異を導入した試料、レーン５は、ａａ１〜１８０にＦ４３Ａ変異、およびＬ１０６Ａ変異を導入した試料、レーン２は、変異を導入することなくａａ１〜１８０を発現させた試料である。
【００６７】
このようにａａ１〜１８０フラグメントにおいて、Ｌ１０６Ａ変異がｐ５３との結合に大きく影響した。他方、ａａ１〜１８０フラグメントにおいて、Ｆ４３Ａ変異とＶ１５８Ａ変異をそれぞれ単独に導入したことによる、ｐ５３との結合抑制はほとんど認められなかった。
【００６８】
ＮＳ３とｐ５３の細胞内共局在の解析においても同様の結果が得られ、Ｌ１０６Ａ変異によって、ＮＳ３の核移行とｐ５３との共局在はほとんど完全に消失した（図１０）。以上の結果より、ＮＳ３とｐ５３との結合には１０６位Ｌｅｕの関与が最も重要であり、次に４３位Ｐｈｅの関与が重要と考えられた。
【００６９】
さらに、多くのＨＣＶ臨床分離株のＮＳ３の比較解析から、１３８位のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換したＳ１３８Ｐ変異株のｐ５３結合性が増強することが分かった。そこで、このＳ１３８Ｐ変異を他の分離株に導入して検討したところ、他の多くの株でも、Ｓ１３８Ｐ変異によりｐ５３結合能が増加することが確認された（図１１）。
【００７０】
（６）ｐ５３結合性に影響を及ぼすＮＳ３のアミノ酸変異とＮＳ３セリンプロテアーゼ活性との相関
上記のｐ５３結合性に影響を及ぼすＮＳ３のアミノ酸変異により、ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性が影響されるか否かについて検討した。その結果、Ｆ４３ＡとＬ１０６Ａは同程度に著しく、ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害した（図１２）。また、両変異による阻害は相加的に認められた。
【００７１】
他方、Ｓ１３８Ｐ変異は単独で、ほぼ完全にＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を消失させた（図１３）。
【００７２】
さらにこれらの変異を、ＮＳ３アミノ末端領域の立体構造解析結果（前記文献Ａ・Ｂ参照）に照らして検討した。その結果、ｐ５３結合を阻害するＬ１０６Ａ変異は、ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性中心（Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−８１、Ｓｅｒ−１３９）の一つであるＳｅｒ−１３９と空間的に非常に近接していることが分かった。また、他の２つの変異（Ｆ４３Ａ、Ｖ１５８Ａ）も比較的近い位置に存在した。
【００７３】
ｐ５３結合を増強するＳ１３８Ｐ変異はＳｅｒ−１３９と隣り合わせており、当然、空間的にもほぼ同じ位置に存在する。以上の実験結果より、ＮＳ３のｐ５３結合責任領域は、１０６位のＬｅｕを中心に、立体構造的にはＮＳ３セリンプロテアーゼの活性中心近傍に位置すると考えられた。これらの結果は、ＨＣＶ発癌の抑制とＨＣＶ増殖の抑制を同時にもたらす薬剤の開発にとって有用な知見である。
【００７４】
（７）ＮＳ３断片とｐ５３との結合阻害物質のスクリーニング
上記１０６位のロイシンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなるＮＳ３断片、およびＭｙｃ標識したｐ５３を、ＨｅＬａ細胞で発現させることによって調製した。上記ＮＳ３断片をウエル底面に固着し、Ｍｙｃ標識ｐ５３と被検物質とを混ぜてウエルに入れた。被検物質の結合阻害性については、抗Ｍｙｃ抗体によるｐ５３の検出の有無によって判断した。
【００７５】
ｐ５３とＮＳ３断片との結合阻害物質については、さらにＮＳ３セリンプロテアーゼ活性をも阻害するか、当該プロテアーゼ活性による生成物の有無を抗体で検出するアッセイ法により検討した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することによって、Ｃ型肝炎またはＨＣＶによる肝癌の治療、発症防止に有効な薬剤の開発に利用することができる。
【００７７】
特に、ＮＳ３アミノ末端領域におけるｐ５３との結合に影響を与える１０６位のロイシン等のアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することによって、効率の良い結合阻害物質の探索が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】発現プラスミドによって様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現させたことを説明する図である。
【図２】ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図３】ＮＳ３アミノ末端領域（３１〜９０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図４】ＮＳ３アミノ末端領域４１〜４３番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図５】ＮＳ３アミノ末端領域（６１〜１３０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図６】ＮＳ３アミノ末端領域１０６〜１０９番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図７】ＮＳ３アミノ末端領域（１２１〜１７０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図８】ＮＳ３アミノ末端領域１５８〜１６０番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図９】ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基からなる断片に点変異を導入して、ｐ５３との結合の有無を調べた結果を示す図である。
【図１０】二重染色法により、細胞内のＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との共局在を調べた結果を示す図である。上段はＭｙｃタグをつけたＮＳ３アミノ末端領域１８０残基を発現させた結果、中段は当該１８０残基にＦ４３Ａの点変異を導入した結果、下段は当該１８０残基にＬ１０６Ａの点変異を導入した結果、である。右側３列は宿主細胞にｐ５３を共発現させた結果である。原図はカラーであり、抗Ｍｙｃ抗体からのシグナルは緑で示され、抗ｐ５３抗体からのシグナルは赤で示される。最も右側の列は、抗Ｍｙｃ抗体からのシグナル（緑）と抗ｐ５３抗体からのシグナル（赤）とを重ね合わせたものである。
【図１１】複数のＨＣＶ臨床分離株のＮＳ３について、１３８位のセリンをプロリンに置換したＳ１３８Ｐ変異蛋白をｐ５３と共発現させ、野生型（ｗｔ）を発現させた場合と比較してｐ５３との結合性が変化するかどうかを免疫沈降―免疫ブロット法により検討した結果を示す図である。図中、「３１」「Ｈ１７−２」はＨＣＶ臨床分離株（ウイルス株）の名称を示す。左半分の「Ｌｙｓａｔｅ」は免疫沈降していない細胞抽出物のサンプル、右半分の「ＩＰ ｗｉｔｈ α―ｐ５３」は抗ｐ５３抗体で免疫沈降したサンプルであり、主に右半分でＮＳ３とｐ５３との結合の強さを判定している。ウイルス株「３１」のＮＳ３では、１３８位の変異の有無に拘わらず、同程度の細胞内発現量がみられるが（左半分）、免疫沈降すると１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したもののほうが濃いバンドがみられる（右半分）。すなわち、１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異するとｐ５３との結合が増強する。ウイルス株「Ｈ１７−２」でも同様のことがいえる。細胞内発現量は野生型（変異なし）のほうがプロリン（Ｐｒｏ）に変異したものより多いが（左半分）、免疫沈降すると１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したもののほうが濃いバンドがみられる（右半分）。すなわち、１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したＮＳ３変異蛋白は、その細胞内発現量が少なくても効率良くｐ５３と結合することがわかる。
【図１２】ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性に及ぼすアミノ酸点突然変異の影響を調べた結果を示す図である。左から順に、コントロール（ｐｃＤＮＡベクターのみ導入したもの）、ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基を発現させたもの、当該１８０残基にＦ４３Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＬ１０６Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＦ４３ＡおよびＬ１０６Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＦ４３Ａ、Ｌ１０６ＡおよびＶ１５８Ａの点変異を導入したもの、の結果である。Ｆ４３Ａ変異とＬ１０６Ａ変異はそれぞれ単独でセリンプロテアーゼ活性を著しく減弱させた。また、これらの変異のセリンプロテアーゼ阻害効果は相加的であった。
【図１３】ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性に及ぼすＳ１３８Ｐ変異の影響を調べた結果を示す図である。図中、「０６３」「３１」「Ｈ１７−２」「ＭＫＣ１ａ」はＨＣＶ臨床分離株（ウイルス株）の名称を示す。Ｓ１３８Ｐ変異により、セリンプロテアーゼ活性はほぼ完全に消失した。
【図１４】ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ遺伝子、およびＨＣＶ蛋白を模式的に示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス非構造蛋白（増殖関連多機能蛋白）ＮＳ３のアミノ末端領域においてｐ５３癌抑制蛋白との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、その知見を医薬開発に応用する技術に関し、特に、Ｃ型肝炎治療薬あるいはＣ型肝癌発症予防薬といった医薬開発に用いる技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科に属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と略記する場合がある）は、慢性肝疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者の１５〜２０％に肝硬変をおこす。そして、肝硬変患者では年率１〜４％の割合で原発性肝細胞癌が発生し、我が国では、Ｃ型肝炎ウイルス感染者の約３０％が確実に肝細胞癌になると推測されている。
【０００３】
ＨＣＶのゲノム（遺伝子）は１本鎖プラス鎖のＲＮＡで、約９６００塩基で構成されており、約３０００のアミノ酸をコードしている。この前駆体蛋白は宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルスがコードする２種類のプロテアーゼによって開裂を受け、コア、エンベロープ１（Ｅ１）、Ｅ２、ｐ７、非構造蛋白２（ＮＳ２）、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの１０種類のウイルス蛋白を生じる。
【０００４】
図１４は、ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ遺伝子、およびＨＣＶ蛋白を模式的に示したものである。同図に示すように、ＨＣＶ粒子は、ウイルス遺伝子ＲＮＡと３種類の構造蛋白（Ｃ（コアタンパク質）、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質）からなる。ＨＣＶ遺伝子は約９６００塩基のＲＮＡからなり、一つの大きなオープンリーディングフレームがある。そのオープンリーディングフレームは約３０００アミノ酸残基からなる前駆体蛋白をコードしている。この前駆体蛋白は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルス固有の２種類のプロテアーゼ（ＨＣＶ亜鉛プロテアーゼおよびＨＣＶセリンプロテアーゼ）によりプロセシングされ、少なくとも上記１０種類の成熟ウイルス蛋白を生じる。ＮＳ３を含め、ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂはウイルス粒子を構成しないが、ウイルス増殖には必須の非構造蛋白である。
【０００５】
ＨＣＶのゲノムは変異に富んでおり、それに基づいてＨＣＶは６種類のゲノタイプと６０種類以上のサブタイプに分類されている。サブタイプ１ｂ（ＨＣＶ−１ｂ）は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出される。一般的に、ＨＣＶ−１ｂは他のサブタイプに比べてインターフェロン感受性が低く、また、肝細胞癌をおこしやすいことが知られている。
【０００６】
一方、ゲノタイプやサブタイプに関連する差異以外に、同じサブタイプ内でもウイルス株によって様々な性質の違いがあることも観察されている。例えば、ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａのアミノ酸配列の違いによってインターフェロン感受性や血中ウイルス量の異なることが報告されている。また、本発明者は以前、ＮＳ３のアミノ末端領域の二次構造の多様性と肝細胞癌発症危険性がよく相関することを、多数の臨床検体を用いて明らかにした（下記の非特許文献１・２参照）。
【０００７】
ＮＳ３は、そのアミノ末端領域にセリンプロテアーゼを、また、カルボキシル末端にヌクレオシド３リン酸加水分解酵素（ＮＴＰａｓｅ）やヘリカーゼをコードしている。ＮＳ３は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５Ｂを中心としたウイルス遺伝子複製装置の一部を構成し、ヘリカーゼ機能によるＲＮＡの巻き戻しを介してウイルス遺伝子の複製に関与するとともに、セリンプロテアーゼ機能による前駆体蛋白のプロセシングを担う。すなわち、ＮＳ３は、ウイルス増殖に必須の多機能蛋白である。
【０００８】
ＮＳ３のアミノ末端領域はＮＳ４Ａと結合し、そのことを介してＮＳ３が安定化され、そのセリンプロテアーゼ活性が亢進される。そのようなウイルス増殖に不可欠な酵素活性以外に、ＮＳ３は肝細胞癌の発生に関わっていると考えられる。例えば、ＮＳ３のアミノ末端領域が種々の培養細胞（マウスやラットの線維芽細胞、ヒト肝細胞など）を悪性形質転換（癌化）させることが報告されている（下記の非特許文献３・４参照）。
【０００９】
また、本発明者もこれまでに、ＮＳ３がマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）にアクチノマイシンＤ誘導性アポトーシスに対する抵抗性を付与すること（下記の非特許文献５参照）、さらに、ＮＳ３のアミノ末端領域１８０残基がｐ５３癌抑制蛋白と相互作用すること、及びその相互作用はＮＳ３アミノ末端領域の配列によって異なることを観察している（下記の非特許文献６〜８参照）。
【００１０】
【非特許文献１】Ogata, S., Y. Ku, S. Yoon, S. Makino, M. Nagano-Fujii, and H. Hotta. 2002. Correlation between secondary structure of an amino-terminal portion of the nonstructural protein 3 (NS3) of hepatitis C virus and development of hepatocellular carcinoma. Microbiol. Immunol. 46:549-554.
【非特許文献２】Ogata, S., R. H. Florese, M. Nagano-Fujii, R. Hidajat, L. Deng, Y.,Ku, S. Yoon, T. Saito, S. Kawata, and H. Hotta. 2003. Identification of hepatitis C virus (HCV) subtype 1b strains that are highly, or only weakly, associated with hepatocellular carcinoma on the basis of the secondary structure of an amino-terminal portion of the HCV NS3 protein. J. Clin. Microbiol. 41:2835-2841.
【非特許文献３】Sakamuro, D., T. Furukawa, and T. Takegami. 1995. Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transforms NIH 3T3 cells. J. Virol. 69:3893-3896.
【非特許文献４】He, Q. Q., R. X. Cheng, Y. Sun, D. Y. Feng, Z. C. Chen, and H. Zeng. 2003. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 C-terminal deleted protein. World J. Gastroenterol. 9:474-478.
【非特許文献５】Fujita, T., S. Ishido, S. Muramatsu, M. Itoh, and H. Hotta. 1996. Suppression of actinomycin D-induced apoptosis by the NS3 protein of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:825-831.
【非特許文献６】Ishido, S., and H. Hotta. 1998. Complex formation of the nonstructural protein 3 of hepatitis C virus with the p53 tumor suppressor. FEBS Lett. 438:258-262.
【非特許文献７】Ishido, S., T. Fujita, and H. Hotta. 2000. Possible involvement of the NS3 protein of hepatitis C virus in hepatocarcinogenesis: Its interaction with the p53 tumor suppressor, p. 37-55. In N. A. Habib, (ed.), Hepatocellular Carcinoma: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ.
【非特許文献８】Muramatsu, S., S. Ishido, T, Fujita, M. Itoh, and H. Hotta. 1997. Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis C virus and factors affecting the localization. J. Virol. 71:4954-4961.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、ＨＣＶ非構造蛋白ＮＳ３のアミノ末端領域はセリンプロテアーゼ活性を有し、ウイルス前駆体蛋白のプロセシング、ひいてはウイルス増殖に必須の役割を担っている。一方、ＮＳ３アミノ末端領域は癌抑制蛋白ｐ５３と結合することを本発明者はこれまでに明らかにした。さらに、本発明者は、ＮＳ３アミノ末端領域の二次構造の多様性と肝細胞癌発症危険性がよく相関することを臨床的に明らかにした。これらの結果はＨＣＶ発癌におけるＮＳ３の重要性を強く支持するものである。
【００１２】
しかしながら、ＮＳ３アミノ末端領域のうち、どのアミノ酸がｐ５３癌抑制蛋白との結合に重要であるかは不明であった。またこれまでに、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性を阻害するＮＳ３インヒビターとしていくつかの物質が提案されているが、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質については知られておらず、このような物質をＨＣＶによる発癌の予防、治療などに利用する提案もなされていなかった。
【００１３】
本発明は、上記の事情に着目してなされたものであって、その目的は、ＮＳ３アミノ末端領域においてｐ５３との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、その知見を利用した新規医薬のスクリーニング方法を提供すること、特に、Ｃ型肝炎治療薬あるいはＣ型肝癌発症予防薬といった医薬開発に利用可能なスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の課題に鑑み、ＮＳ３のアミノ末端領域のうち、どのアミノ酸がｐ５３癌抑制蛋白との相互作用に関与しているかについて検討した。その結果、ｐ５３との結合に影響を与える複数のアミノ酸残基を同定した。これらアミノ酸残基のうち第１０６番目のロイシンがｐ５３との結合に最も重要な役割を担っていると考えられる。また、これらアミノ酸残基を置換するとＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性も変化し、両者の間に相関が認められた。以上の知見から、これらアミノ酸残基と相互作用する物質を探索することによって、ＨＣＶによる発癌を抑制し、さらには、ＨＣＶの増殖をも抑制し得る薬剤の開発に利用できること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明のスクリーニング方法は、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴としている。
【００１６】
ここで結合阻害物質は、ＮＳ３とｐ５３との結合を完全に阻害するものでなくてもよく、ＮＳ３とｐ５３との結合を有意に低下させるものであればよい。具体的なスクリーニング方法としては、後述の各種バインディングアッセイやインシリコ・スクリーニング等を挙げることができる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法において、ＮＳ３アミノ末端領域内の、ｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基を同定し、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することは好ましい方法である。解析の結果、ＮＳ３アミノ末端領域における第１０６番目のロイシンは、ｐ５３との結合に重要な役割を担っており、さらに、ＮＳ３のプロテアーゼ活性にも影響を与える部位であることを見出している。したがって、第１０６番目のロイシンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することは好ましい方法である。
【００１８】
また後述のように、ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニン、第１５８番目のバリン、および第１３８番目のセリンも、ＮＳ３とｐ５３との結合に影響を与える部位であることを見出した。したがって、本発明のスクリーニング方法の一態様として、これらいずれかのアミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索する方法を採用してもよい。このとき、結合関与領域として３０〜８０個程度のアミノ酸残基からなるＮＳ３アミノ末端領域内のペプチドを発現させ、当該ペプチドとｐ５３との結合阻害物質を探索することは好ましい方法である。
【００１９】
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白では、野生型よりも強くｐ５３蛋白と結合することが実験により認められた。このようにｐ５３蛋白とより強く結合するＮＳ３変異蛋白を使用して、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索する方法は、より強い結合阻害剤が得られる可能性があるので、本発明のスクリーニング方法として好ましい方法の一つである。
【発明の効果】
【００２０】
ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質は、ｐ５３癌抑制蛋白の本来の作用を維持させることによって、ＨＣＶによる発癌（原発性肝細胞癌）の予防や治療に有用と考えられる。本発明のスクリーニング方法は、このような結合阻害物質を探索することによって、癌の予防や治療に有用な薬剤の開発に利用することができる。
【００２１】
特に、ＮＳ３アミノ末端領域におけるｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することによって、効率の良い結合阻害物質の探索が可能である。
【００２２】
また、ｐ５３との結合に影響を与える部位として同定された第１０６番目のロイシン等は、ＮＳ３のプロテアーゼ活性にも影響を与え、同部位に変異を導入するとＨＣＶの増殖に重要なＮＳ３のプロテアーゼ活性は抑制された。したがって、第１０６番目のロイシン等と相互作用する物質は、ＨＣＶの増殖を抑制し、Ｃ型肝炎の治療薬として利用できる可能性がある。さらにこのことは、本発明のスクリーニング方法により第１０６番目のロイシン等と相互作用する物質を探索することによって、ｐ５３結合阻害作用と同時にＨＣＶ増殖抑制作用を示し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能であることを意味する。本発明は、このようなＨＣＶに対する新たなタイプの治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の具体的態様等について更に詳しく説明する。なお、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００２４】
本発明者は、前述のように、ＮＳ３アミノ末端領域のうち、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要な役割を担っているかについて解析した。ここでＮＳ３アミノ末端領域とはＮＳ３のアミノ末端側の領域をいうが、特に解析対象としたＮＳ３アミノ末端領域は、下記１〜１９８番目のアミノ酸配列領域である。
【００２５】
APITAYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSTPPAVPQSFQ
【００２６】
配列表の配列番号１においても、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列を示す。この１〜１９８番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列のうち１０２７番目から１２２４番目までのアミノ酸配列に相当する。
【００２７】
免疫共沈法、二重染色法などを用いた解析の結果、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列中、ｐ５３との結合に影響を与える複数のアミノ酸残基を同定した。さらに、これらのアミノ酸残基がＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性に影響を及ぼすかどうかについても検討した。
【００２８】
詳細は後述するが、上記１〜１９８番目のアミノ酸配列中、４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）、１５８位のバリン（Ｖａｌ）をアラニン（Ａｌａ）に変異させると、いずれの場合にもｐ５３との結合は著しく抑制された。したがって、これら３つの部位はｐ５３との結合に重要と考えられる。また、１８０アミノ酸に点変異を導入した解析の結果、上記３つの部位のうち、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）がｐ５３との結合に最も重要な役割を担っており、次いで４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がｐ５３との結合に重要であると認められた。
【００２９】
他方、１３８位のセリン（Ｓｅｒ）をプロリン（Ｐｒｏ）に変異させると、ｐ５３結合性は逆に増加した。即ち、１３８位のセリンはｐ５３との結合に影響を与え、１３８位のセリンを置換すると、ＮＳ３とｐ５３とはより結合しやすくなる。
【００３０】
さらに、ｐ５３との結合に影響を与える上記複数のアミノ酸残基について、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性への影響を調べた結果、１０６位のロイシン、４３位のフェニルアラニンをアラニンに変異させると、いずれもプロテアーゼ活性が著しく減少し、両変異を導入すると、さらにプロテアーゼ活性は減弱した。同様に、１３８位のセリンをプロリンに変異させた場合にも、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性は著しく減少した。
【００３１】
このように、１０６位のロイシンは、ｐ５３との結合性およびセリンプロテアーゼ活性の双方に重要であり、同部位をアラニンに置換すると、ｐ５３結合性およびセリンプロテアーゼ活性は著しく減少した。そこでＮＳ３の立体構造を検討したところ、１０６位のロイシンは、セリンプロテアーゼの活性中心を構成するアミノ酸の一つである１３９位のセリン（Ｓｅｒ）と空間的に非常に近い部位に位置することがわかった。
【００３２】
前述のように、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質は、ｐ５３癌抑制蛋白の本来の作用を維持させることによって、ＨＣＶによる発癌（原発性肝細胞癌）を防止する治療薬となりうる。そして、ｐ５３との結合に影響を与える上記１０６位のロイシン等のアミノ酸残基は、治療薬開発の重要なターゲットとなりうる。また、これらのアミノ酸残基はＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性にも影響を及ぼすため、ＨＣＶの増殖を抑制するＣ型肝炎治療薬のターゲットともなりうる。このことは、上記１０６位のロイシン等のアミノ酸残基に着目して当該アミノ酸残基と相互作用する物質を探索することによって、ｐ５３結合阻害作用と同時にＨＣＶ増殖抑制作用を示し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能であることを意味する。本発明は、このようなＨＣＶに対する新たなタイプの治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００３３】
スクリーニング方法としては、例えばターゲットとなる上記１０６位のロイシンを含む領域と相互作用する物質を探索する。このような物質は、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質として有望である。同様に、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、あるいは１３８位のセリンを含む領域と相互作用する物質を探索することによって、ＨＣＶによる肝炎もしくは肝癌の治療薬を効率良く取得できる可能性が高い。
【００３４】
上記スクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や蛋白質の局在・活性変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。in vitro及びin vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、cell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、ｐ５３遺伝子・蛋白は、ヒト由来のもののほか、マウス、ラットその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、ＮＳ３アミノ末端領域の高次構造の情報を利用してスクリーニングを行ってもよい。
【００３５】
ＮＳ３アミノ末端領域の高次構造については、例えば下記文献Ａ・Ｂに報告されている。
文献Ａ：Kim, J. L., K. A. Morgenstern, C. Lin, T. Fox, M. D. Dwyer, J. A. Landro, S. P. Chambers, W. Markland, C. A. Lepre, E. T. O'Malley, S. L. Harbeson, C. M. Rice, M. A. Murcko, P. R. Caron, and J. A. Thomson. 1996. Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell 87:343-355.
文献Ｂ：Love, R. A., H. E. Parge, J. A. Wickersham, Z. Hostomsky, N. Habuka, E. W. Moomaw, T. Adachi, and Z. Hostomska. 1996. The crystal structure of hepatitis C virus NS3 proteinase reveals a trypsin-like fold and a structural zinc binding site. Cell 87:331-342.
【００３６】
これら既存のＮＳ３アミノ末端領域の立体構造に関する情報、または本発明以降に開示された立体構造情報をもとに、上記１０６位のロイシン近傍の構造とよく結合し得る構造の低分子化合物（またはペプチド、ＲＮＡ等）を探索・分子設計することによって、ＳＢＤＤ（Structure Based Drug Design）による治療薬のスクリーニングが可能である。
【００３７】
勿論、このようなインシリコ・スクリーニング法のほかに、既存の各種バインディングアッセイを使用して、ＮＳ３とｐ５３との結合阻害物質を探索してもよい。例えば、本発明者は、後述の実施例に示すように、様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３とをＨｅＬａ細胞において共発現させる系を確立しており、この系を用いてＮＳ３とｐ５３との結合阻害を測定することができる。ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、例えば下記の配列情報をもとに調製することができ、これを発現ベクターに組み込み宿主に発現させることにより、当該アミノ酸配列からなる蛋白質を得ることができる。
【００３８】
ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列
GCGCCCATCACGGCCTACTCCCAACAGACGCGGGGCCTACTTGGTTGCATCATCACTAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAGGTCGAGGGGGAGGTTCAGGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGTATCAACGGCGTGTGTTGGACTGTCTATCATGGTGCCGGCTCAAAGACCCTAGCTGGCCCAAAAGGCCCAATCACCCAAATGTACACCAATGTAGACCAAGACCTCGTTGGCTGGCcGGCGCCCCCTGGGGCGCGTTCCATGACACCATGCACCTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGACATGCTGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGCGACAGCAGGGGGAGCCTCCTCTCCCCCcGGCCCATCTCCTACCTGAAGGGTTCCTCGGGTGGTCCGCTGCTTTGCCCCTCGGGCCATGTTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGGGGGGTTGCGAAGGCGGTAGACTTTGTGCCCGTTGAGTCTATGGAAACCACTATGCGGTCTCCGGTCTTCACGGATAACTCAACCCCCCCGGCCGTACCGCAGTCATTCCAA
【００３９】
配列表の配列番号２・３にも上記塩基配列を示す。上記塩基配列をもとに、より短い長さのＮＳ３アミノ末端領域を作製し、あるいは、さらにエピトープタグで標識したものを作製し、これを材料に、ｐ５３との結合を阻害する物質をスクリーニングする。例えば上記１０６位のロイシンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなる断片を作製し、当該断片をｐ５３との結合関与領域としてスクリーニングに使用することは好ましい。同様に、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、または１３８位のセリンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなる断片を作製し、当該断片をｐ５３との結合関与領域としてスクリーニングを行ってもよい。
【００４０】
上記の結合測定系においては、後述のように、結合阻害の有無を免疫沈降―免疫ブロット法により検出することができるが、他の方法を用いてもよい。例えば、阻害剤のマススクリーニングに向けて98 wellまたは384 wellのマイクロタイタープレート等にＮＳ３アミノ末端領域を固定し、それとｐ５３との結合阻害の有無を酵素、蛍光色素あるいは放射性同位元素で標識した抗体によって検出する系を確立することも可能である。
【００４１】
このような試験管内反応系（cell-free system）によるスクリーニングの一例について説明すると、まず、上記１０６位のロイシン、４３位のフェニルアラニン、１５８位のバリン、または１３８位のセリンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなるＮＳ３アミノ末端領域の断片（結合関与領域）を、ＨｅＬａ細胞や大腸菌などで発現させることによって調製する。ｐ５３も発現ベクターを用いて同様に調製できるが、ｐ５３は、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ等のタグでエピトープ標識したものを調製するとよい。
【００４２】
次に、上記断片（結合関与領域）をウエル底面に固着し、タグをつけたｐ５３と被検物質とを混ぜてウエルに入れる。もし被検物質がｐ５３と上記ＮＳ３断片との結合を阻害するものであれば、洗浄後、抗タグ抗体ではｐ５３は検出されない。一方、もし被検物質がｐ５３とＮＳ３断片との結合に関与しないものであれば、洗浄後、抗タグ抗体によりｐ５３が検出される。このように、ｐ５３の検出の有無により、ｐ５３と上記ＮＳ３断片との結合を阻害する物質を検索することができる。この方法では、９６ウエルプレートとロボット分注機を使えばかなりのハイスループット化も期待できる。
【００４３】
このような方法を用いて、合成ペプチドライブラリー、微生物代謝産物ライブラリーや天然化合物ライブラリー等をスクリーニングし、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質を探索するとよい。さらに、得られた結合阻害物質について、ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性をも阻害するか、常法により検討するとよい。例えば、当該プロテアーゼ活性により開裂を受け、生成されるタンパク質の有無を抗体により検出する方法によって、プロテアーゼ活性阻害の有無を調査することができる。このような本発明のスクリーニング方法によって、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害すると同時にＮＳ３セリンプロテアーゼ活性をも阻害し、発癌防止およびＣ型肝炎治療の双方に効果が期待されるＨＣＶ治療薬の開発が可能になる。
【００４４】
後述の実施例に示すように、ＮＳ３アミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白は、野生型よりも強くｐ５３蛋白と結合した。そこで本発明のスクリーニング方法において、ｐ５３蛋白とより強く結合する上記ＮＳ３変異蛋白を使用して、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索する方法は、より強い結合阻害剤が得られる可能性が高く、好ましい方法の一つである。また、上記ＮＳ３変異蛋白以外に、点変異を導入したその他種々のＮＳ３変異蛋白（後述の実施例参照）についても、比較実験での利用を含め、本発明のスクリーニング方法において有用である。
【００４５】
勿論、本発明のスクリーニング方法は、前記の方法に限定されるものではなく、これとは異なる種々の方法が適用可能である。例えば、前記の方法は、試験管内反応系（cell-free system）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。一例として、二重染色法（後述の実施例参照）により、細胞内でのＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との共局在の有無を調べることによって、被検物質による結合阻害の有無を調査してもよい。
【００４６】
さらに、酵母two-hybrid法を用いて、ＮＳ３とｐ５３との結合を検出することも可能であり、この系により酵母細胞を使って結合阻害剤をスクリーニングすることができる。酵母two-hybrid法については、例えば、文献「Gyuris, J., E. A. Golemis, H. Chertkov, and R. Brent. 1993. Cdi1, a human G1- and S-phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75:791-803.」記載の方法を挙げることができる。そのほか、（１）上記１０６位のロイシンを含むＮＳ３アミノ末端領域をカラムに固定してこれと結合する物質を探索する方法、（２）表面プラズモン共鳴を応用した生体分子結合活性測定装置（ＢＩＡＣＯＲＥ）でｐ５３とＮＳ３との結合を検出し、この系により結合阻害剤をスクリーニングする方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４８】
（１）様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現する発現プラスミドの作製
図１の最上段に模式的に示すように、ＨＣＶのＮＳ３領域は、６３１アミノ酸からなる。本実施例においては、ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基に着目し、この１９８残基のうち、いずれのアミノ酸残基がｐ５３との結合に重要であるかについて検討した。
【００４９】
そのためまず、ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基、及びそれより短い種々の長さのＮＳ３アミノ末端領域をコードするｃＤＮＡを調製した（図１参照）。図中の数字はアミノ酸残基の位置を示す。例えば、上から５番目のｃＤＮＡは、３１〜１９８番目のアミノ酸配列をコードする。ＮＳ３アミノ末端領域の１〜１９８番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列において１０２７〜１２２４番目に相当する。図１の右側かっこ内の数字は、各ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列が、ＨＣＶの全アミノ酸配列において何番目から何番目までに相当するかを示したものである。
【００５０】
ＮＳ３アミノ末端領域の１９８残基をコードするｃＤＮＡの配列は、配列表の配列番号２・３に示すとおりである。
【００５１】
上記のように調製した各種ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドに組み込むことで、様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現する発現プラスミドを作製した。また、これらｃＤＮＡに点変異を導入した点突然変異体をコードするｃＤＮＡ、および種々の長さのＮＳ３アミノ末端領域とglutathione S- transferase（ＧＳＴ）との融合蛋白をコードするｃＤＮＡを調製し、これらｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドに組み込んだ。点突然変異体ｃＤＮＡの作製は、常法によりin vitro mutagenesis kitを用いて行った。図１の上から８番目以降は、ＧＳＴとの融合蛋白を発現させたものである。
【００５２】
ｐ５３の発現には、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに全長ｐ５３ ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを使用した。
【００５３】
（２）培養細胞におけるＮＳ３とｐ５３の結合の検討
ワクチニアウイルスＴ７ハイブリッド発現法を用いて、上記各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３をＨｅＬａ細胞に発現させ、細胞抽出液を得た。その細胞抽出液について、特異抗体を用いた免疫共沈法と、それに引き続くウエスタンブロット法により、両蛋白の結合の有無を調べた。
【００５４】
（３）ＮＳ３とｐ５３の細胞内共局在の検討
上記と同様に各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３をＨｅＬａ細胞に発現させ、特異抗体を用いた二重染色間接蛍光抗体法により、両蛋白の細胞内共局在について検討した。
【００５５】
（４）ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性の測定
ＮＳ３と、その基質であるＨＣＶのＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリ蛋白を同時にＨｅＬａ細胞に発現させ、その細胞抽出液について、抗ＮＳ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリ蛋白の開裂を指標にして、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性を測定した。
【００５６】
（５）ｐ５３との結合に関与するＮＳ３の最小領域とアミノ酸残基の同定
図２は、特異抗体を用いた免疫共沈法と、それに引き続くウエスタンブロット法により、上記各種ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との結合の有無を調べた結果である。レーン１〜３は、ＮＳ３アミノ末端領域１〜１９８番目のアミノ酸を発現させた試料（以下、便宜上「ａａ１〜１９８」という。他も同様である。）、レーン４〜９はそれぞれ、ａａ１〜１８０、ａａ１〜１２０、ａａ１〜９０、ａａ３１〜１９８、ａａ６１〜１９８、ａａ９１〜１９８を発現させた試料である。図中上段には、免疫沈降に用いた特異抗体を示す。レーン１の試料にはウサギから得た抗ＩｇＧ抗体を使用し、それ以外にはウサギから得た抗ｐ５３抗体を使用した。レーン２以外の試料は宿主細胞にｐ５３を共発現させたものであり、レーン２はベクター（ｐｃＤＮＡ）のみ細胞に導入したものである。「Ｌｙ」「Ｉｐ」はそれぞれ、細胞抽出液、免疫沈降物に対するウエスタンブロットの結果を示す（以下の図も同様である）。「ｐ５３」の検出には抗ｐ５３抗体を使用した。また、本実験は、Ｍｙｃペプチド標識ＮＳ３を発現させて行ったため、「ＮＳ３」の検出には抗Ｍｙｃ抗体を使用した。
【００５７】
同図に示される結果から、ａａ１〜１２０にｐ５３結合領域が存在することが分かった（レーン５）。ａａ９１〜１９８にも弱い結合領域が存在した（レーン９）。また、ｐ５３結合領域はＮＳ４Ａ結合領域（ａａ１〜３０）以外の領域に存在すること、即ち、ＮＳ４Ａ結合領域を除く１６８残基（ａａ３１〜１９８）がｐ５３と結合することが分かった（レーン７）。
【００５８】
次いで、上記１６８残基を３つの断片（ａａ３１〜９０、ａａ６１〜１３０、ａａ１２１〜１９８）に分けて発現させたところ、いずれの断片もｐ５３と結合したため、それぞれについて、さらに欠失変異体を作製して検討した。
【００５９】
図３は、ａａ３１〜９０においてｐ５３との結合に重要な部位を検討した結果である。レーン２〜６はそれぞれ、ａａ３１〜９０、ａａ４１〜９０、ａａ４６〜９０、ａａ５１〜９０、ａａ６１〜９０をＧＳＴ融合蛋白として発現させた試料である。「ＧＳＴ−ＮＳ３」の検出には抗ＧＳＴ抗体を使用した。
【００６０】
同図に示される結果から、ａａ４１〜９０はｐ５３と結合するが（レーン３）、ａａ４６〜９０は結合しないことが分かった（レーン４）。このことは、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ４１〜４５に存在する可能性を示している。そこで、それぞれのアミノ酸をアラニン（Ａｌａ）に置換した変異体を作製し、ｐ５３との結合を調べた。
【００６１】
その結果、図４に示すように、４３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアラニンに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することが分かった（レーン５：Ｆ４３Ａ）。
【００６２】
図５は、同様の方法により、ａａ６１〜１３０においてｐ５３との結合に重要な部位を検討した結果である。レーン１〜５はそれぞれ、ａａ６１〜１３０、ａａ６１〜１３０、ａａ６１〜１１０、ａａ６１〜１０５、ａａ６１〜１００をＧＳＴ融合蛋白として発現させた試料である。これらの試料中、レーン１の試料のみｐ５３を共発現させていない。
【００６３】
同図に示される結果から、ａａ６１〜１１０はｐ５３と結合するが（レーン３）、ａａ６１〜１０５は結合しないことが分かった（レーン４）。このことから、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ１０６〜１１０に存在する可能性が示された。そこで、 それぞれのアミノ酸を置換した変異体を作製して検討した結果、図６に示すように、１０６位のロイシン（Ｌｅｕ）をＡｌａに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することが分かった（レーン３：Ｌ１０６Ａ）。
【００６４】
さらに、同様の解析において、ａａ１２１〜１６０はｐ５３と結合するが（図７のレーン４）、ａａ１２１〜１５５は結合しない（同図レーン５）ことから、ｐ５３との結合に重要なアミノ酸はａａ１５６〜１６０に存在する可能性が示された。
【００６５】
そこで、それぞれのアミノ酸をＡｌａに置換した変異体を作製し、ｐ５３との結合を調べたところ、図８に示すように、１５８位のバリン（Ｖａｌ）をＡｌａに変異させると、ｐ５３との結合が著しく減弱することがわかった（レーン３：Ｖ１５８Ａ）。
【００６６】
ｐ５３との結合に影響を与える上記３つの変異（Ｆ４３Ａ、Ｌ１０６Ａ、Ｖ１５８Ａ）のうち、結合に最も重要と考えられる部位はどれであるかを検討する為、これらの変異をそれぞれ単独に（または複数組み合わせて）、ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基からなる断片に導入してｐ５３との結合の有無を調べた。その結果、図９に示すように、ｐ５３との結合はＬ１０６Ａ変異の導入によって著しく抑制された（レーン４・５）。なお図中、レーン３・４はそれぞれ、ａａ１〜１８０にＦ４３Ａ変異、Ｌ１０６Ａ変異を導入した試料、レーン５は、ａａ１〜１８０にＦ４３Ａ変異、およびＬ１０６Ａ変異を導入した試料、レーン２は、変異を導入することなくａａ１〜１８０を発現させた試料である。
【００６７】
このようにａａ１〜１８０フラグメントにおいて、Ｌ１０６Ａ変異がｐ５３との結合に大きく影響した。他方、ａａ１〜１８０フラグメントにおいて、Ｆ４３Ａ変異とＶ１５８Ａ変異をそれぞれ単独に導入したことによる、ｐ５３との結合抑制はほとんど認められなかった。
【００６８】
ＮＳ３とｐ５３の細胞内共局在の解析においても同様の結果が得られ、Ｌ１０６Ａ変異によって、ＮＳ３の核移行とｐ５３との共局在はほとんど完全に消失した（図１０）。以上の結果より、ＮＳ３とｐ５３との結合には１０６位Ｌｅｕの関与が最も重要であり、次に４３位Ｐｈｅの関与が重要と考えられた。
【００６９】
さらに、多くのＨＣＶ臨床分離株のＮＳ３の比較解析から、１３８位のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換したＳ１３８Ｐ変異株のｐ５３結合性が増強することが分かった。そこで、このＳ１３８Ｐ変異を他の分離株に導入して検討したところ、他の多くの株でも、Ｓ１３８Ｐ変異によりｐ５３結合能が増加することが確認された（図１１）。
【００７０】
（６）ｐ５３結合性に影響を及ぼすＮＳ３のアミノ酸変異とＮＳ３セリンプロテアーゼ活性との相関
上記のｐ５３結合性に影響を及ぼすＮＳ３のアミノ酸変異により、ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性が影響されるか否かについて検討した。その結果、Ｆ４３ＡとＬ１０６Ａは同程度に著しく、ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害した（図１２）。また、両変異による阻害は相加的に認められた。
【００７１】
他方、Ｓ１３８Ｐ変異は単独で、ほぼ完全にＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を消失させた（図１３）。
【００７２】
さらにこれらの変異を、ＮＳ３アミノ末端領域の立体構造解析結果（前記文献Ａ・Ｂ参照）に照らして検討した。その結果、ｐ５３結合を阻害するＬ１０６Ａ変異は、ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性中心（Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−８１、Ｓｅｒ−１３９）の一つであるＳｅｒ−１３９と空間的に非常に近接していることが分かった。また、他の２つの変異（Ｆ４３Ａ、Ｖ１５８Ａ）も比較的近い位置に存在した。
【００７３】
ｐ５３結合を増強するＳ１３８Ｐ変異はＳｅｒ−１３９と隣り合わせており、当然、空間的にもほぼ同じ位置に存在する。以上の実験結果より、ＮＳ３のｐ５３結合責任領域は、１０６位のＬｅｕを中心に、立体構造的にはＮＳ３セリンプロテアーゼの活性中心近傍に位置すると考えられた。これらの結果は、ＨＣＶ発癌の抑制とＨＣＶ増殖の抑制を同時にもたらす薬剤の開発にとって有用な知見である。
【００７４】
（７）ＮＳ３断片とｐ５３との結合阻害物質のスクリーニング
上記１０６位のロイシンを含む３０〜８０個程度のアミノ酸からなるＮＳ３断片、およびＭｙｃ標識したｐ５３を、ＨｅＬａ細胞で発現させることによって調製した。上記ＮＳ３断片をウエル底面に固着し、Ｍｙｃ標識ｐ５３と被検物質とを混ぜてウエルに入れた。被検物質の結合阻害性については、抗Ｍｙｃ抗体によるｐ５３の検出の有無によって判断した。
【００７５】
ｐ５３とＮＳ３断片との結合阻害物質については、さらにＮＳ３セリンプロテアーゼ活性をも阻害するか、当該プロテアーゼ活性による生成物の有無を抗体で検出するアッセイ法により検討した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、ＮＳ３とｐ５３との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することによって、Ｃ型肝炎またはＨＣＶによる肝癌の治療、発症防止に有効な薬剤の開発に利用することができる。
【００７７】
特に、ＮＳ３アミノ末端領域におけるｐ５３との結合に影響を与える１０６位のロイシン等のアミノ酸残基に着目して、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することによって、効率の良い結合阻害物質の探索が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】発現プラスミドによって様々な長さのＮＳ３アミノ末端領域を発現させたことを説明する図である。
【図２】ＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図３】ＮＳ３アミノ末端領域（３１〜９０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図４】ＮＳ３アミノ末端領域４１〜４３番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図５】ＮＳ３アミノ末端領域（６１〜１３０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図６】ＮＳ３アミノ末端領域１０６〜１０９番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図７】ＮＳ３アミノ末端領域（１２１〜１７０番目内）とｐ５３との結合の有無をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図８】ＮＳ３アミノ末端領域１５８〜１６０番目のアミノ酸に点変異を導入して、いずれのアミノ酸がｐ５３との結合に重要かを検討した結果を示す図である。
【図９】ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基からなる断片に点変異を導入して、ｐ５３との結合の有無を調べた結果を示す図である。
【図１０】二重染色法により、細胞内のＮＳ３アミノ末端領域とｐ５３との共局在を調べた結果を示す図である。上段はＭｙｃタグをつけたＮＳ３アミノ末端領域１８０残基を発現させた結果、中段は当該１８０残基にＦ４３Ａの点変異を導入した結果、下段は当該１８０残基にＬ１０６Ａの点変異を導入した結果、である。右側３列は宿主細胞にｐ５３を共発現させた結果である。原図はカラーであり、抗Ｍｙｃ抗体からのシグナルは緑で示され、抗ｐ５３抗体からのシグナルは赤で示される。最も右側の列は、抗Ｍｙｃ抗体からのシグナル（緑）と抗ｐ５３抗体からのシグナル（赤）とを重ね合わせたものである。
【図１１】複数のＨＣＶ臨床分離株のＮＳ３について、１３８位のセリンをプロリンに置換したＳ１３８Ｐ変異蛋白をｐ５３と共発現させ、野生型（ｗｔ）を発現させた場合と比較してｐ５３との結合性が変化するかどうかを免疫沈降―免疫ブロット法により検討した結果を示す図である。図中、「３１」「Ｈ１７−２」はＨＣＶ臨床分離株（ウイルス株）の名称を示す。左半分の「Ｌｙｓａｔｅ」は免疫沈降していない細胞抽出物のサンプル、右半分の「ＩＰ ｗｉｔｈ α―ｐ５３」は抗ｐ５３抗体で免疫沈降したサンプルであり、主に右半分でＮＳ３とｐ５３との結合の強さを判定している。ウイルス株「３１」のＮＳ３では、１３８位の変異の有無に拘わらず、同程度の細胞内発現量がみられるが（左半分）、免疫沈降すると１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したもののほうが濃いバンドがみられる（右半分）。すなわち、１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異するとｐ５３との結合が増強する。ウイルス株「Ｈ１７−２」でも同様のことがいえる。細胞内発現量は野生型（変異なし）のほうがプロリン（Ｐｒｏ）に変異したものより多いが（左半分）、免疫沈降すると１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したもののほうが濃いバンドがみられる（右半分）。すなわち、１３８位がプロリン（Ｐｒｏ）に変異したＮＳ３変異蛋白は、その細胞内発現量が少なくても効率良くｐ５３と結合することがわかる。
【図１２】ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性に及ぼすアミノ酸点突然変異の影響を調べた結果を示す図である。左から順に、コントロール（ｐｃＤＮＡベクターのみ導入したもの）、ＮＳ３アミノ末端領域１８０残基を発現させたもの、当該１８０残基にＦ４３Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＬ１０６Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＦ４３ＡおよびＬ１０６Ａの点変異を導入したもの、当該１８０残基にＦ４３Ａ、Ｌ１０６ＡおよびＶ１５８Ａの点変異を導入したもの、の結果である。Ｆ４３Ａ変異とＬ１０６Ａ変異はそれぞれ単独でセリンプロテアーゼ活性を著しく減弱させた。また、これらの変異のセリンプロテアーゼ阻害効果は相加的であった。
【図１３】ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性に及ぼすＳ１３８Ｐ変異の影響を調べた結果を示す図である。図中、「０６３」「３１」「Ｈ１７−２」「ＭＫＣ１ａ」はＨＣＶ臨床分離株（ウイルス株）の名称を示す。Ｓ１３８Ｐ変異により、セリンプロテアーゼ活性はほぼ完全に消失した。
【図１４】ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ遺伝子、およびＨＣＶ蛋白を模式的に示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、
Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域においてｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基を同定し、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニン、第１０６番目のロイシン、第１３８番目のセリン又は第１５８番目のバリンを含む結合関与領域と結合する物質、又は、当該領域とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項４】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１０６番目のロイシンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項５】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項６】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１５８番目のバリンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法であって、
当該結合関与領域が３０から８０のアミノ酸残基であることを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白を作製し、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎もしくは肝癌の治療または発症予防に使用される医薬のスクリーニング方法であって、
Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白ＮＳ３とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索し、あるいはさらに当該結合阻害物質の中からＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域においてｐ５３との結合に影響を与えるアミノ酸残基を同定し、当該アミノ酸残基を含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニン、第１０６番目のロイシン、第１３８番目のセリン又は第１５８番目のバリンを含む結合関与領域と結合する物質、又は、当該領域とｐ５３癌抑制蛋白との結合を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項４】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１０６番目のロイシンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項５】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第４３番目のフェニルアラニンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項６】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１５８番目のバリンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンを含む結合関与領域と結合する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法であって、
当該結合関与領域が３０から８０のアミノ酸残基であることを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１記載のスクリーニング方法であって、
ＮＳ３のアミノ末端領域における第１３８番目のセリンをプロリンに置換したＮＳ３変異蛋白を作製し、当該変異蛋白とｐ５３蛋白との結合を阻害する物質を探索することを特徴とする、スクリーニング方法。
【図１】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−７５０３８（Ｐ２００６−７５０３８Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６０７３６（Ｐ２００４−２６０７３６）
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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