ｐＨ応答性薬物徐放担体とその製造方法
【課題】ｐＨ依存性の、例えば、胃では分解されないでそのまま小腸に達することができ、
小腸では分解されて薬物が放出されて吸収される性質、もしくは分解される前にそのまま小腸に吸収される性質をもつ担体を提供すること。
【解決手段】Ｎ−アシル、好ましくは、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体である。かかるｐＨ応答性薬物徐放担体は、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に、放射線、例えば、γ線を照射し、この液滴をナノ粒子化することによって製造することができる。
小腸では分解されて薬物が放出されて吸収される性質、もしくは分解される前にそのまま小腸に吸収される性質をもつ担体を提供すること。
【解決手段】Ｎ−アシル、好ましくは、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体である。かかるｐＨ応答性薬物徐放担体は、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に、放射線、例えば、γ線を照射し、この液滴をナノ粒子化することによって製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性エラスチンを利用したｐＨ応答性薬物徐放担体とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は「薬剤を必要な時に、必要な場所で、必要な量だけ作用させる」ことを目的としており、薬物の効率的な活用や副作用の低減、患者のＱＯＬの向上のためにも非常に重要な役割を果たすことが期待されている。現在、経口、静脈注射、経皮、経肺といった様々な投与形態での技術開発が進んでいる。
【０００３】
例えば、経肺投与は、肺癌、肺感染症、アレルギー性肺疾患などに直接投与できるルートであり、薬物の有効性を高めるとともに全身への曝露を低減させることができる。Pfizer社のインスリン粉末吸入剤であるExuberaは、粒子サイズが約３μｍに最適化されたヒトインスリンがそれぞれマンニトール、グリシン、およびクエン酸ナトリウムとともに製剤としてパッケージされたもので、非多孔性のスプレードライ品である。これは、世界初の全身投与吸入剤として２００６年に発売されたが、わずか２年で販売中止になった。これは、コストの高さ、デバイスの適正使用の難しさ、製剤の分散性の確保といった経肺投与に対する問題点を浮き彫りにした。
【０００４】
経皮吸収は、適用面積が大きいことから期待されている投与形態である。これは、最初の血液循環で、肝臓をバイパスできるので、薬効成分が壊れずに静脈注射と同じように最も有効に利用でき、注射のような痛みは伴わない。代表的なものとして、ニトロダームＴＴＳがある。これは、冠状動脈を広げる働きのあるニトログリセリンを含んだパッチを胸や腕に貼り付けることで狭心症発作を予防できる。しかし、角質層による抵抗から薬の皮膚吸収に時間遅れが生じるために、注射のような即効性はないので、発作予防には有効だが、発作が起こってからはほとんど効果がない。また、経皮吸収製剤には透過促進剤などの皮膚吸収を促進するための添加剤が用いられているために皮膚の敏感な人はこれらの物質によって皮膚刺激を受けることがある。
【０００５】
以上のような投与経路は、いずれも患者のＱＯＬの向上や経済的なコストの観点でみるとまだまだ改良の余地が多いと考えられる。その中で、経口投与は、利便性の高さから現在最も汎用されている投与経路であり、安全でコストが嵩まないという利点を持つことから、患者のＱＯＬ向上のためには、他の投与経路と比較して一番望ましい投与経路であると考えられる。また、経口投与はインスリンの注射による投与などでしばしば問題となる、抹消における高インスリン血症も起こしにくいなどの利点を持つ。しかしながら、消化管内での放出制御や消化酵素からの保護、吸収改善などの問題点もある。このような問題点を解消して、胃では分解されないでそのまま小腸に達することができ、小腸で分解されて薬物が吸収される性質をもつ担体を作製する必要がある。
【０００６】
一方、本発明者らは、生体高分子であるエラスチンに着目し、その薬物担体としての応用を検討してきた。エラスチンは、動物の大動脈や項靭帯や皮膚などの主要な構成成分である。エラスチンは、不溶性だが酸やアルカリ処理によって可溶化される。その可溶化エラスチンは水溶液中においてコアセルベーションと呼ばれる現象を引き起こす。これは、エラスチン水溶液を体温付近まで加熱すると白濁し、そのまま放置すると透明な平衡溶液と淡黄色の高粘性なコアセルベートの２層に分離し、冷却すると元の均一溶液に戻るという可逆的な一連の現象のことをいう（特許文献１、２参照）。本発明者らは、このコアセルベーション時に形成されるコアセルベート液滴に着目し、これにγ線を照射することでより安定なナノ粒子を作製することに成功した。そして、本発明者らは、かかるナノ粒子の作製技術の応用開発にも努めてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−４５７２２号公報
【特許文献２】特開２００９−２１９４２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、水溶性エラスチンのコアセルベート液滴の技術を更に展開し、胃では分解されないでそのまま小腸に達することができ、小腸では分解されて薬物が放出されて吸収される性質、もしくは分解される前にそのまま小腸に吸収される性質をもつ担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に様々な条件でγ線照射を行うことで粒径の異なるナノ粒子を作製しγ線照射条件の違いによる影響を調べた。この方法によって得られる粒径の範囲は１０〜１０００nmであった。また、水溶性エラスチンをアシル化、例えば、アセチル化することで等電点を強酸側にシフトさせ、より強酸条件で自己集合するようなＮ−アセチル水溶性エラスチンを作製し、γ線照射によって安定なナノ粒子を得た。そして、そのナノ粒子を用いて、ｐＨ１．２及びｐＨ７．４の条件での粒径測定や色素徐放試験を行い、ｐＨ応答性薬物徐放担体への応用を検討し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、ｐＨ変化に応答して粒径が変化する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体、及び、pH変化に応答して薬物放出を調節する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体である。
【００１１】
そして、本発明の他の態様は、かかる担体の製造方法に係るものであり、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線、例えば、γ線を照射し、該液滴をナノ粒子化することを特徴とするｐＨ応答性薬物徐放担体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
静脈注射による投与は患者に苦痛を与えることになるので、最近では経口、経皮、経肺といった様々な投与技術が開発されているが、経口投与は通常の薬の摂取と同様の感覚で投与でき、利便性が高いことから、最も望まれている投与方法である。本発明のｐＨ応答性薬物徐放担体は、生体高分子素材の生分解性、γ線照射装置を用いた簡便で滅菌されたナノ粒子作製方法等を活かした担体であり、経口投与できることから、患者のＱＯＬの向上や経済的なコストの面で医療分野に多大に貢献できる。また本発明のｐＨ応答性薬物徐放担体は経口投与以外にも、ｐＨ応答に対応した薬物徐放を必要とする静脈注射、経皮、経肺等の投与技術にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】濃度を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図２】昇温速度を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図３】照射量を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図４】異なるｐＨ条件下でのアセチル水溶性エラスチンの濁度曲線を示す図。
【図５】ｐＨ１．２及び７．４の条件で測定したナノ粒子からの色素徐放の結果を示す図。
【図６】ｐＨ１．２から７．４に変化させた場合のナノ粒子からの色素徐放の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明においては、生体由来の水溶性エラスチンを用いて、先ず、胃の酸性下と同じ条件下では自己集合により収縮して薬物を放出しないように、ついで小腸の弱アルカリ下と同じ条件下では自己集合がほどけることにより膨潤して薬物を放出するように設計し、水溶性エラスチンを化学修飾することによりＮ−アシル水溶性エラスチンを作製し、得られたＮ−アシル水溶性エラスチンによって形成されるコアセルベート液滴から、γ線等の放射線照射技術によってナノ粒子を作製するものである。得られたＮ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子は、胃内と同様な酸性下で薬物を放出せず、小腸内と同様な弱アルカリ中で薬物を放出する性質をもつ担体である。またこの担体は、経口投与したとき、胃の酸性下で膨潤することにより、ペプシン等による酵素分解を受けずに小腸に到達し、ついで小腸の弱アルカリ下では膨潤することにより、エラスターゼ等による酵素分解を受ける性質をもつ担体である。さらにこの担体は小腸で分解を受ける前に一部がナノ粒子のまま小腸に吸収される性質をもつ担体でもある。
【００１５】
本発明のＮ−アシル水溶性エラスチンは、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ−アシル化して得られる。水溶性エラスチンのＮ末端及びリジン、アルギニン等のアミノ酸残基側鎖のアミノ基等がアシル化される。Ｎ−アシル化には、Ｎ−ホルミル化、Ｎ−アセチル化、Ｎ−ベンゾイル化などがあるが、Ｎ−アセチル化が好ましい。また、ウレタン型やアルキル型を用いてもよい。
【００１６】
水溶性エラスチンを得る方法・手段は色々と提案されている。好ましいのは、本発明者が提案した下記の方法である（特開２００７−４５７２２号公報（特許文献１）参照）。
【００１７】
第１の方法は、動物性生体組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理を行って不溶性エラスチンを得、次いでこの不溶性エラスチンをシュウ酸等の可溶化液に浸漬・溶解させ、水溶性エラスチンを製造する。コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であって、このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬して行うのが好ましい。また、コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理に際しては、アルカリ性溶液による処理の前に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化バリウムの少なくともいずれか一つを含む塩溶液に、動物性生体組織を浸漬させる浸漬処理（前処理）を行うのも好ましい。
【００１８】
動物性生体組織としては、特に制限はないが、エラスチンの含量が多い点で、豚、馬、牛、羊などの哺乳動物から得られた項靱帯や大動脈血管を使用することが好ましい。またエラスチン含有が多い魚の動脈球を使用してもよい。動物性生体組織は、先ず、ホモジナイザーを用いてホモジナイズするのが良い。ホモジナイズはミキサー、ミートチョッパーなど動物性生体組織を細断できれば良く、好ましくは３ミリメートル角以下、さらに好ましくはペースト状に細断できる器具を用いると良い。細断した動物性生体組織の粒が小さいほど、コラーゲンやその他の不要なタンパク質の除去効率を上げることができるので好ましい。ホモジナイズした動物性生体組織は、例えば、熱水又は熱希薄アルカリ水溶液で煮沸するか、もしくは有機溶媒で処理することによって脱脂処理を行っても良い。
【００１９】
前記可溶化液としては、シュウ酸、蟻酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ベタイン、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、スルファミン酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸の少なくともいずれか一つを含む酸性溶液が用いられる。そして、この酸性溶液の酸の総量は、１Ｌあたり０．１〜０．５molとし、かつ、液温を９０〜１０５℃とするのが好ましい。
【００２０】
前記可溶化液は、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であっても良い。このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．５molとし、かつ、液温が９０〜１０５℃のアルカリ性溶液とするのが好ましい。
【００２１】
第２の方法は、動物性生体組織の不要部分の除去処理、動物性生体組織の脱脂処理、動物性生体組織の細断処理の少なくともいずれか一つを含む前処理工程と、前処理された動物性生体組織をアルカリ性溶液に浸漬して濾別するアルカリ溶解工程と、アルカリ溶解工程を所定回数繰り返し、濾別により水溶性エラスチンを含む濾液を得る濾液回収工程と、濾液から水溶性エラスチンを生成する水溶性エラスチン生成工程とを順次行って水溶性エラスチンを製造する方法である。前記アルカリ溶解工程で用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムのいずれか一つ又は混合物が好ましい。
【００２２】
この操作は、前記の、組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質を除去して不溶性エラスチンを得て、次いで、この不溶性エラスチンを可溶化して水溶性エラスチンを得る第１の方法とは異なり、組織から不溶性エラスチンを得ることなく、直接水溶性エラスチンを得る方法である。即ち、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、脱脂、細断処理した動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去した処理組織を得、次いで、この処理組織を１Ｌあたり０．０５〜０．５mol（アルカリ液の濃度がより高濃度）で９０〜１０５℃のアルカリ性溶液中に６０〜２４０分間（時間がより長い）浸漬して溶解し、水溶性エラスチンを得る方法である。
【００２３】
前記のごとく第１又は第２の方法で得られた水溶性エラスチンは、次いで、それを、例えば、透析処理することによって低分子量のものを除去して、分子量約８０００以上の水溶性エラスチンとされる。特に好ましく用いられるのは、平均分子量が約２０万程度の高分子量水溶性エラスチンである。
【００２４】
本発明のＮ−アセチル水溶性エラスチンの製造においては、先ず、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ−アシル化、好ましくは、Ｎ−アセチル化してＮ−アセチル化水溶性エラスチンを得る。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、反応性の第１アミン又は第２アミンを有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミンとしては、末端アミノ基も含まれる。
【００２５】
本発明においては、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部が、好ましくは、無水酢酸等のアセチル化試薬によってＮ−アセチル化されるが、Ｎ−アセチル化の程度は、下記式で表される修飾率で９５％以上であるものが好ましい。
修飾率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長４００ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。Ｂは、Ｎ−アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長４００ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
【００２６】
本発明においては、水溶性エラスチンをアシル化、例えば、アセチル化することで等電点を強酸側にシフトさせ、より強酸条件で自己集合するようなＮ−アセチル水溶性エラスチンが得られる。そして、次に、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴を調整し、この液滴に電子線やγ線等の放射線を照射することによって、安定なナノ粒子を得る。得られたナノ粒子は、例えば、ｐＨ１．２及びｐＨ７．４の条件での粒径測定や色素徐放試験にもちいられる。
【００２７】
得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンは、濃度０.１〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲で広域緩衝溶液（ｐＨ１．０〜１１．０）の溶媒でそれぞれ調整し、昇温速度０.１〜４０℃／ｍｉｎで加熱することにより、コアセルベート液滴を形成することができる。そして、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの水溶液の濁度を５〜８０℃の温度範囲で測定することによって、コアセルベート液滴の生成を確認することができる。
【００２８】
前記のようにして得られたコアセルベート液滴に、放射線、例えば、Ｃｏ−６０γ線照射装置によってγ線を照射すればよい。照射条件としては、照射温度は２０〜８０℃、照射量が５〜６０ｋＧｙ程度が適当である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を詳述する。
【００３０】
[ブタ由来水溶性エラスチンの作製]
１）ブタ由来不溶性エラスチンの単離
以下の手順に従ってブタ大動脈脱脂組織からNaCl可溶及びNaOH可溶の不溶タンパク質を抽出した。
【００３１】
ブタ大動脈脱脂組織（生体組織）を用い、前処理として付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を、刃物などを用いて削ぎ落とすことで不要部分の除去処理を行い、次いで、生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで細断処理を行った。ホモジナイズした生体組織を、重量の約１０倍容量の１Ｍ塩化ナトリウムを加え、室温で１時間攪拌して脱脂を行った。この操作を５回繰り返し、その後蒸留水で洗浄し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により水切りした。
【００３２】
上記のようにして脱脂した生体組織の重量に対して約１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１００℃で１５分間攪拌し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去する工程を行った。そして、生体組織とアルカリ性溶液とを分離した。分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ／ｍＬ以下になるまで、この操作を５回繰返した。その後、酢酸を加えて中和し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分）により洗浄し、残渣を乾燥して不溶性エラスチンを得た。
【００３３】
２）ブタ由来水溶性エラスチンの調製
ブタ由来不溶性エラスチンの乾燥重量の１０倍容量の０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、１００℃で３０分撹拌した。反応後、溶液を速やかに氷冷し酢酸で中和した。その後、分子量6,000〜8,000以上を分画する透析膜を用いて１週間透析した。その後、凍結乾燥し高分子量ブタ由来水溶性エラスチンを得た。
【００３４】
[実施例１]
水溶性エラスチンのナノ粒子の作製
γ線照射はＣｏ−６０γ線照射施設を用いて行った。照射条件として、照射量は１０ｋＧｙと３０ｋＧｙ、水溶性エラスチン濃度は２、５、１０ｍｇ／ｍｌ、昇温速度は２．０、１０．０、２０．０℃／ｍｉｎ、照射温度は６０℃で行った。これらの条件は濁度測定の結果から決定した。γ線照射後のナノ粒子の粒径測定には、NICOMP380ZLSを用いて行った。各サンプルを３ｍｌセルに入れ、２分×３回測定した。測定温度は4℃、37℃、60℃である。
【００３５】
異なる条件でγ線照射したナノ粒子の粒径（４℃で測定）を条件ごとにそれぞれ図１（ａ）水溶性エラスチン濃度の影響、図１（ｂ）昇温速度の影響、図１（ｃ）γ線照射量の影響、に示した。図１より、濃度と昇温速度の違いが粒径に大きく影響を与えることが確認できた。特に、濃度が１０ｍｇ／ｍｌのときの粒径は２ｍｇ／ｍｌのときの粒径と比較して５倍近い大きさになった。粒径の小さな粒子を作製するためには濃度が薄く、昇温速度が速い条件でγ線照射を行う必要があることが示唆される。
【００３６】
[実施例２]
Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の作製
【００３７】
１）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの作製
前記で得られたブタ由来水溶性エラスチンにTFEを加え溶解させ、次いでピリジン、無水酢酸の順に加え撹拌し４℃、２４時間反応させた。反応後、ニンヒドリンによる呈色反応を行い、アミノ基がほぼ定量的にアセチル化されたことを確認した。その後、減圧濃縮によって溶媒を除去した。そして、蒸留水に再溶解させ４℃で１週間透析後、凍結乾燥を行ってＮ−アセチル水溶性エラスチンを得た。Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの収率は８０．６％で、Ｎ−アセチル化修飾率は９６．８％であった。
【００３８】
２）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの濁度測定（コアセルベート液滴の調整）
前記で得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンは、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、広域緩衝溶液(ｐＨ２．０〜８．０)の溶媒でそれぞれ調整し、ペルチェ式温度コントローラー付き分光光度計(JASCO:V-560)を用いて窒素気流下で濁度測定を行った。波長４００ｎｍ、温度範囲５〜６５℃、温度上昇速度０．５℃／ｍｉｎであった。
【００３９】
作製したＮ−アセチル水溶性エラスチンの異なるｐＨ条件での濁度曲線を図２に示した。作製したＮ−アセチル水溶性エラスチンは、ｐＨ２〜４の強酸中では２０℃付近で濁度が開始し、生理的温度である３７℃付近でピークに達した。一方、ｐＨ５〜８では４０℃付近から濁度を開始することが確認された。
【００４０】
３）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのγ線照射
γ線照射はＣｏ−６０γ線照射施設を用いて行った。照射条件は照射量１０ｋＧｙ、Ｎ−アセチル水溶性エラスチン濃度２．０ｍｇ／ｍｌ、温度上昇速度２０℃／ｍｉｎ、照射温度は６０℃で行った。ナノ粒子の生成は、ＴＥＭ観察によって行った。即ち、得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子（AcENPs）の懸濁液（１．０ｍｇ／ｍｌ）５μｌをグリッドに乗せ、余分な試料を濾紙で吸い取り、ランプの前で数十秒放置して乾燥させ、TEMにより観察を行った。その結果、γ線照射(条件：濃度２ｍｇ／ｍｌ、
昇温速度２０℃／ｍｉｎ、照射量１０ｋＧｙ)により作製したcENPsのTEM画像から、AcENPsが球状のナノ粒子になっていることが確認できた。
【００４１】
[実施例３]
１）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の色素徐放試験
【００４２】
色素徐放試験は以下の２通りで行った。
（１）AcENPs
１ｍｇに対して０．５ｍＭ・Ponceau
BSを３００μｌ加え、４℃で２４時間、次いで３７℃で２４時間放置して色素を担持させた。遠心分離(１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、３７℃)で上清を回収し、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)またはPBS(ｐＨ７．４)を３００μｌ加えた。次いで、３７℃、３０分震盪させた後、遠心分離を行い、上清を回収し、再び、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)またはPBS(ｐＨ７．４)を３００μｌ加えた。徐放が終わるまで同様の操作を繰り返し、回収した上清は分光光度計を用いて吸光度測定(５０５ｎｍ)を行った。
【００４３】
（２）上記1)と同様にして色素を担持後、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)を３００μｌ加えた。それを３７℃、３０分震盪させた後、遠心分離を行い、上清を回収し、再び０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)を３００μｌ加えた。この操作をさらに３回繰り返して行った後、溶媒をPBS(ｐＨ７．４)に変え同様の操作を8回繰り返し行った。回収した上清は分光光度計を用いて吸光度測定(５０５ｎｍ)を行った。
【００４４】
胃のｐＨがｐＨ１〜２、小腸のｐＨが７〜８であることより、ｐＨ１．２及び７．４の条件を設定して測定した色素徐放の結果を図３に示した。ｐＨ１．２中では色素徐放が１０％にも満たなかったが、ｐＨ７．４中では８０％近く徐放される結果が確認された。
【００４５】
次に、実際の消化器官（胃ではｐＨ１〜２、小腸ではｐＨ７〜８中での徐放、すなわち胃を通って小腸に達する過程での徐放を想定してのｐＨ１．２から７．４に変化させた場合の色素徐放の結果を図４に示した。図３と同様に、ｐＨ１．２では色素がほとんど徐放されないが、ｐＨ７．４に変化すると急激な徐放が始まるのが確認された。
【００４６】
２）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の粒径測定
AcENPsを濃度が２ｍｇ／ｍｌ
になるようにｐＨ１．２の０．１Ｍ・ＨＣｌ溶液及びｐＨ７．４のPBS溶液にそれぞれ溶解し、NICOMP380ZLSを用いて粒径を測定した。異なるｐＨ環境（ｐＨ１．２、ｐＨ７．４）でのナノ粒子の粒径は、ｐＨが１．２で２７９．７±５７．０ｎｍで、ｐＨが７．４で５７９．６±９８．９ｎｍであり、ｐＨ７．４での粒径はｐＨ１．２での粒径と比較すると約２倍近く大きくなっていることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性エラスチンを利用したｐＨ応答性薬物徐放担体とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は「薬剤を必要な時に、必要な場所で、必要な量だけ作用させる」ことを目的としており、薬物の効率的な活用や副作用の低減、患者のＱＯＬの向上のためにも非常に重要な役割を果たすことが期待されている。現在、経口、静脈注射、経皮、経肺といった様々な投与形態での技術開発が進んでいる。
【０００３】
例えば、経肺投与は、肺癌、肺感染症、アレルギー性肺疾患などに直接投与できるルートであり、薬物の有効性を高めるとともに全身への曝露を低減させることができる。Pfizer社のインスリン粉末吸入剤であるExuberaは、粒子サイズが約３μｍに最適化されたヒトインスリンがそれぞれマンニトール、グリシン、およびクエン酸ナトリウムとともに製剤としてパッケージされたもので、非多孔性のスプレードライ品である。これは、世界初の全身投与吸入剤として２００６年に発売されたが、わずか２年で販売中止になった。これは、コストの高さ、デバイスの適正使用の難しさ、製剤の分散性の確保といった経肺投与に対する問題点を浮き彫りにした。
【０００４】
経皮吸収は、適用面積が大きいことから期待されている投与形態である。これは、最初の血液循環で、肝臓をバイパスできるので、薬効成分が壊れずに静脈注射と同じように最も有効に利用でき、注射のような痛みは伴わない。代表的なものとして、ニトロダームＴＴＳがある。これは、冠状動脈を広げる働きのあるニトログリセリンを含んだパッチを胸や腕に貼り付けることで狭心症発作を予防できる。しかし、角質層による抵抗から薬の皮膚吸収に時間遅れが生じるために、注射のような即効性はないので、発作予防には有効だが、発作が起こってからはほとんど効果がない。また、経皮吸収製剤には透過促進剤などの皮膚吸収を促進するための添加剤が用いられているために皮膚の敏感な人はこれらの物質によって皮膚刺激を受けることがある。
【０００５】
以上のような投与経路は、いずれも患者のＱＯＬの向上や経済的なコストの観点でみるとまだまだ改良の余地が多いと考えられる。その中で、経口投与は、利便性の高さから現在最も汎用されている投与経路であり、安全でコストが嵩まないという利点を持つことから、患者のＱＯＬ向上のためには、他の投与経路と比較して一番望ましい投与経路であると考えられる。また、経口投与はインスリンの注射による投与などでしばしば問題となる、抹消における高インスリン血症も起こしにくいなどの利点を持つ。しかしながら、消化管内での放出制御や消化酵素からの保護、吸収改善などの問題点もある。このような問題点を解消して、胃では分解されないでそのまま小腸に達することができ、小腸で分解されて薬物が吸収される性質をもつ担体を作製する必要がある。
【０００６】
一方、本発明者らは、生体高分子であるエラスチンに着目し、その薬物担体としての応用を検討してきた。エラスチンは、動物の大動脈や項靭帯や皮膚などの主要な構成成分である。エラスチンは、不溶性だが酸やアルカリ処理によって可溶化される。その可溶化エラスチンは水溶液中においてコアセルベーションと呼ばれる現象を引き起こす。これは、エラスチン水溶液を体温付近まで加熱すると白濁し、そのまま放置すると透明な平衡溶液と淡黄色の高粘性なコアセルベートの２層に分離し、冷却すると元の均一溶液に戻るという可逆的な一連の現象のことをいう（特許文献１、２参照）。本発明者らは、このコアセルベーション時に形成されるコアセルベート液滴に着目し、これにγ線を照射することでより安定なナノ粒子を作製することに成功した。そして、本発明者らは、かかるナノ粒子の作製技術の応用開発にも努めてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−４５７２２号公報
【特許文献２】特開２００９−２１９４２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、水溶性エラスチンのコアセルベート液滴の技術を更に展開し、胃では分解されないでそのまま小腸に達することができ、小腸では分解されて薬物が放出されて吸収される性質、もしくは分解される前にそのまま小腸に吸収される性質をもつ担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に様々な条件でγ線照射を行うことで粒径の異なるナノ粒子を作製しγ線照射条件の違いによる影響を調べた。この方法によって得られる粒径の範囲は１０〜１０００nmであった。また、水溶性エラスチンをアシル化、例えば、アセチル化することで等電点を強酸側にシフトさせ、より強酸条件で自己集合するようなＮ−アセチル水溶性エラスチンを作製し、γ線照射によって安定なナノ粒子を得た。そして、そのナノ粒子を用いて、ｐＨ１．２及びｐＨ７．４の条件での粒径測定や色素徐放試験を行い、ｐＨ応答性薬物徐放担体への応用を検討し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、ｐＨ変化に応答して粒径が変化する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体、及び、pH変化に応答して薬物放出を調節する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体である。
【００１１】
そして、本発明の他の態様は、かかる担体の製造方法に係るものであり、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線、例えば、γ線を照射し、該液滴をナノ粒子化することを特徴とするｐＨ応答性薬物徐放担体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
静脈注射による投与は患者に苦痛を与えることになるので、最近では経口、経皮、経肺といった様々な投与技術が開発されているが、経口投与は通常の薬の摂取と同様の感覚で投与でき、利便性が高いことから、最も望まれている投与方法である。本発明のｐＨ応答性薬物徐放担体は、生体高分子素材の生分解性、γ線照射装置を用いた簡便で滅菌されたナノ粒子作製方法等を活かした担体であり、経口投与できることから、患者のＱＯＬの向上や経済的なコストの面で医療分野に多大に貢献できる。また本発明のｐＨ応答性薬物徐放担体は経口投与以外にも、ｐＨ応答に対応した薬物徐放を必要とする静脈注射、経皮、経肺等の投与技術にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】濃度を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図２】昇温速度を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図３】照射量を変更した条件下でγ線照射して得られたナノ粒子の粒径を示す図。
【図４】異なるｐＨ条件下でのアセチル水溶性エラスチンの濁度曲線を示す図。
【図５】ｐＨ１．２及び７．４の条件で測定したナノ粒子からの色素徐放の結果を示す図。
【図６】ｐＨ１．２から７．４に変化させた場合のナノ粒子からの色素徐放の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明においては、生体由来の水溶性エラスチンを用いて、先ず、胃の酸性下と同じ条件下では自己集合により収縮して薬物を放出しないように、ついで小腸の弱アルカリ下と同じ条件下では自己集合がほどけることにより膨潤して薬物を放出するように設計し、水溶性エラスチンを化学修飾することによりＮ−アシル水溶性エラスチンを作製し、得られたＮ−アシル水溶性エラスチンによって形成されるコアセルベート液滴から、γ線等の放射線照射技術によってナノ粒子を作製するものである。得られたＮ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子は、胃内と同様な酸性下で薬物を放出せず、小腸内と同様な弱アルカリ中で薬物を放出する性質をもつ担体である。またこの担体は、経口投与したとき、胃の酸性下で膨潤することにより、ペプシン等による酵素分解を受けずに小腸に到達し、ついで小腸の弱アルカリ下では膨潤することにより、エラスターゼ等による酵素分解を受ける性質をもつ担体である。さらにこの担体は小腸で分解を受ける前に一部がナノ粒子のまま小腸に吸収される性質をもつ担体でもある。
【００１５】
本発明のＮ−アシル水溶性エラスチンは、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ−アシル化して得られる。水溶性エラスチンのＮ末端及びリジン、アルギニン等のアミノ酸残基側鎖のアミノ基等がアシル化される。Ｎ−アシル化には、Ｎ−ホルミル化、Ｎ−アセチル化、Ｎ−ベンゾイル化などがあるが、Ｎ−アセチル化が好ましい。また、ウレタン型やアルキル型を用いてもよい。
【００１６】
水溶性エラスチンを得る方法・手段は色々と提案されている。好ましいのは、本発明者が提案した下記の方法である（特開２００７−４５７２２号公報（特許文献１）参照）。
【００１７】
第１の方法は、動物性生体組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理を行って不溶性エラスチンを得、次いでこの不溶性エラスチンをシュウ酸等の可溶化液に浸漬・溶解させ、水溶性エラスチンを製造する。コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であって、このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬して行うのが好ましい。また、コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理に際しては、アルカリ性溶液による処理の前に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化バリウムの少なくともいずれか一つを含む塩溶液に、動物性生体組織を浸漬させる浸漬処理（前処理）を行うのも好ましい。
【００１８】
動物性生体組織としては、特に制限はないが、エラスチンの含量が多い点で、豚、馬、牛、羊などの哺乳動物から得られた項靱帯や大動脈血管を使用することが好ましい。またエラスチン含有が多い魚の動脈球を使用してもよい。動物性生体組織は、先ず、ホモジナイザーを用いてホモジナイズするのが良い。ホモジナイズはミキサー、ミートチョッパーなど動物性生体組織を細断できれば良く、好ましくは３ミリメートル角以下、さらに好ましくはペースト状に細断できる器具を用いると良い。細断した動物性生体組織の粒が小さいほど、コラーゲンやその他の不要なタンパク質の除去効率を上げることができるので好ましい。ホモジナイズした動物性生体組織は、例えば、熱水又は熱希薄アルカリ水溶液で煮沸するか、もしくは有機溶媒で処理することによって脱脂処理を行っても良い。
【００１９】
前記可溶化液としては、シュウ酸、蟻酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ベタイン、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、スルファミン酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸の少なくともいずれか一つを含む酸性溶液が用いられる。そして、この酸性溶液の酸の総量は、１Ｌあたり０．１〜０．５molとし、かつ、液温を９０〜１０５℃とするのが好ましい。
【００２０】
前記可溶化液は、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であっても良い。このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．５molとし、かつ、液温が９０〜１０５℃のアルカリ性溶液とするのが好ましい。
【００２１】
第２の方法は、動物性生体組織の不要部分の除去処理、動物性生体組織の脱脂処理、動物性生体組織の細断処理の少なくともいずれか一つを含む前処理工程と、前処理された動物性生体組織をアルカリ性溶液に浸漬して濾別するアルカリ溶解工程と、アルカリ溶解工程を所定回数繰り返し、濾別により水溶性エラスチンを含む濾液を得る濾液回収工程と、濾液から水溶性エラスチンを生成する水溶性エラスチン生成工程とを順次行って水溶性エラスチンを製造する方法である。前記アルカリ溶解工程で用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムのいずれか一つ又は混合物が好ましい。
【００２２】
この操作は、前記の、組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質を除去して不溶性エラスチンを得て、次いで、この不溶性エラスチンを可溶化して水溶性エラスチンを得る第１の方法とは異なり、組織から不溶性エラスチンを得ることなく、直接水溶性エラスチンを得る方法である。即ち、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、脱脂、細断処理した動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去した処理組織を得、次いで、この処理組織を１Ｌあたり０．０５〜０．５mol（アルカリ液の濃度がより高濃度）で９０〜１０５℃のアルカリ性溶液中に６０〜２４０分間（時間がより長い）浸漬して溶解し、水溶性エラスチンを得る方法である。
【００２３】
前記のごとく第１又は第２の方法で得られた水溶性エラスチンは、次いで、それを、例えば、透析処理することによって低分子量のものを除去して、分子量約８０００以上の水溶性エラスチンとされる。特に好ましく用いられるのは、平均分子量が約２０万程度の高分子量水溶性エラスチンである。
【００２４】
本発明のＮ−アセチル水溶性エラスチンの製造においては、先ず、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ−アシル化、好ましくは、Ｎ−アセチル化してＮ−アセチル化水溶性エラスチンを得る。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、反応性の第１アミン又は第２アミンを有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミンとしては、末端アミノ基も含まれる。
【００２５】
本発明においては、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部が、好ましくは、無水酢酸等のアセチル化試薬によってＮ−アセチル化されるが、Ｎ−アセチル化の程度は、下記式で表される修飾率で９５％以上であるものが好ましい。
修飾率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長４００ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。Ｂは、Ｎ−アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長４００ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
【００２６】
本発明においては、水溶性エラスチンをアシル化、例えば、アセチル化することで等電点を強酸側にシフトさせ、より強酸条件で自己集合するようなＮ−アセチル水溶性エラスチンが得られる。そして、次に、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴を調整し、この液滴に電子線やγ線等の放射線を照射することによって、安定なナノ粒子を得る。得られたナノ粒子は、例えば、ｐＨ１．２及びｐＨ７．４の条件での粒径測定や色素徐放試験にもちいられる。
【００２７】
得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンは、濃度０.１〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲で広域緩衝溶液（ｐＨ１．０〜１１．０）の溶媒でそれぞれ調整し、昇温速度０.１〜４０℃／ｍｉｎで加熱することにより、コアセルベート液滴を形成することができる。そして、Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの水溶液の濁度を５〜８０℃の温度範囲で測定することによって、コアセルベート液滴の生成を確認することができる。
【００２８】
前記のようにして得られたコアセルベート液滴に、放射線、例えば、Ｃｏ−６０γ線照射装置によってγ線を照射すればよい。照射条件としては、照射温度は２０〜８０℃、照射量が５〜６０ｋＧｙ程度が適当である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を詳述する。
【００３０】
[ブタ由来水溶性エラスチンの作製]
１）ブタ由来不溶性エラスチンの単離
以下の手順に従ってブタ大動脈脱脂組織からNaCl可溶及びNaOH可溶の不溶タンパク質を抽出した。
【００３１】
ブタ大動脈脱脂組織（生体組織）を用い、前処理として付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を、刃物などを用いて削ぎ落とすことで不要部分の除去処理を行い、次いで、生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで細断処理を行った。ホモジナイズした生体組織を、重量の約１０倍容量の１Ｍ塩化ナトリウムを加え、室温で１時間攪拌して脱脂を行った。この操作を５回繰り返し、その後蒸留水で洗浄し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により水切りした。
【００３２】
上記のようにして脱脂した生体組織の重量に対して約１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１００℃で１５分間攪拌し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去する工程を行った。そして、生体組織とアルカリ性溶液とを分離した。分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ／ｍＬ以下になるまで、この操作を５回繰返した。その後、酢酸を加えて中和し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分）により洗浄し、残渣を乾燥して不溶性エラスチンを得た。
【００３３】
２）ブタ由来水溶性エラスチンの調製
ブタ由来不溶性エラスチンの乾燥重量の１０倍容量の０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、１００℃で３０分撹拌した。反応後、溶液を速やかに氷冷し酢酸で中和した。その後、分子量6,000〜8,000以上を分画する透析膜を用いて１週間透析した。その後、凍結乾燥し高分子量ブタ由来水溶性エラスチンを得た。
【００３４】
[実施例１]
水溶性エラスチンのナノ粒子の作製
γ線照射はＣｏ−６０γ線照射施設を用いて行った。照射条件として、照射量は１０ｋＧｙと３０ｋＧｙ、水溶性エラスチン濃度は２、５、１０ｍｇ／ｍｌ、昇温速度は２．０、１０．０、２０．０℃／ｍｉｎ、照射温度は６０℃で行った。これらの条件は濁度測定の結果から決定した。γ線照射後のナノ粒子の粒径測定には、NICOMP380ZLSを用いて行った。各サンプルを３ｍｌセルに入れ、２分×３回測定した。測定温度は4℃、37℃、60℃である。
【００３５】
異なる条件でγ線照射したナノ粒子の粒径（４℃で測定）を条件ごとにそれぞれ図１（ａ）水溶性エラスチン濃度の影響、図１（ｂ）昇温速度の影響、図１（ｃ）γ線照射量の影響、に示した。図１より、濃度と昇温速度の違いが粒径に大きく影響を与えることが確認できた。特に、濃度が１０ｍｇ／ｍｌのときの粒径は２ｍｇ／ｍｌのときの粒径と比較して５倍近い大きさになった。粒径の小さな粒子を作製するためには濃度が薄く、昇温速度が速い条件でγ線照射を行う必要があることが示唆される。
【００３６】
[実施例２]
Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の作製
【００３７】
１）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの作製
前記で得られたブタ由来水溶性エラスチンにTFEを加え溶解させ、次いでピリジン、無水酢酸の順に加え撹拌し４℃、２４時間反応させた。反応後、ニンヒドリンによる呈色反応を行い、アミノ基がほぼ定量的にアセチル化されたことを確認した。その後、減圧濃縮によって溶媒を除去した。そして、蒸留水に再溶解させ４℃で１週間透析後、凍結乾燥を行ってＮ−アセチル水溶性エラスチンを得た。Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの収率は８０．６％で、Ｎ−アセチル化修飾率は９６．８％であった。
【００３８】
２）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンの濁度測定（コアセルベート液滴の調整）
前記で得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンは、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、広域緩衝溶液(ｐＨ２．０〜８．０)の溶媒でそれぞれ調整し、ペルチェ式温度コントローラー付き分光光度計(JASCO:V-560)を用いて窒素気流下で濁度測定を行った。波長４００ｎｍ、温度範囲５〜６５℃、温度上昇速度０．５℃／ｍｉｎであった。
【００３９】
作製したＮ−アセチル水溶性エラスチンの異なるｐＨ条件での濁度曲線を図２に示した。作製したＮ−アセチル水溶性エラスチンは、ｐＨ２〜４の強酸中では２０℃付近で濁度が開始し、生理的温度である３７℃付近でピークに達した。一方、ｐＨ５〜８では４０℃付近から濁度を開始することが確認された。
【００４０】
３）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのγ線照射
γ線照射はＣｏ−６０γ線照射施設を用いて行った。照射条件は照射量１０ｋＧｙ、Ｎ−アセチル水溶性エラスチン濃度２．０ｍｇ／ｍｌ、温度上昇速度２０℃／ｍｉｎ、照射温度は６０℃で行った。ナノ粒子の生成は、ＴＥＭ観察によって行った。即ち、得られたＮ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子（AcENPs）の懸濁液（１．０ｍｇ／ｍｌ）５μｌをグリッドに乗せ、余分な試料を濾紙で吸い取り、ランプの前で数十秒放置して乾燥させ、TEMにより観察を行った。その結果、γ線照射(条件：濃度２ｍｇ／ｍｌ、
昇温速度２０℃／ｍｉｎ、照射量１０ｋＧｙ)により作製したcENPsのTEM画像から、AcENPsが球状のナノ粒子になっていることが確認できた。
【００４１】
[実施例３]
１）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の色素徐放試験
【００４２】
色素徐放試験は以下の２通りで行った。
（１）AcENPs
１ｍｇに対して０．５ｍＭ・Ponceau
BSを３００μｌ加え、４℃で２４時間、次いで３７℃で２４時間放置して色素を担持させた。遠心分離(１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、３７℃)で上清を回収し、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)またはPBS(ｐＨ７．４)を３００μｌ加えた。次いで、３７℃、３０分震盪させた後、遠心分離を行い、上清を回収し、再び、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)またはPBS(ｐＨ７．４)を３００μｌ加えた。徐放が終わるまで同様の操作を繰り返し、回収した上清は分光光度計を用いて吸光度測定(５０５ｎｍ)を行った。
【００４３】
（２）上記1)と同様にして色素を担持後、０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)を３００μｌ加えた。それを３７℃、３０分震盪させた後、遠心分離を行い、上清を回収し、再び０．１Ｍ・ＨＣｌ(ｐＨ１．２)を３００μｌ加えた。この操作をさらに３回繰り返して行った後、溶媒をPBS(ｐＨ７．４)に変え同様の操作を8回繰り返し行った。回収した上清は分光光度計を用いて吸光度測定(５０５ｎｍ)を行った。
【００４４】
胃のｐＨがｐＨ１〜２、小腸のｐＨが７〜８であることより、ｐＨ１．２及び７．４の条件を設定して測定した色素徐放の結果を図３に示した。ｐＨ１．２中では色素徐放が１０％にも満たなかったが、ｐＨ７．４中では８０％近く徐放される結果が確認された。
【００４５】
次に、実際の消化器官（胃ではｐＨ１〜２、小腸ではｐＨ７〜８中での徐放、すなわち胃を通って小腸に達する過程での徐放を想定してのｐＨ１．２から７．４に変化させた場合の色素徐放の結果を図４に示した。図３と同様に、ｐＨ１．２では色素がほとんど徐放されないが、ｐＨ７．４に変化すると急激な徐放が始まるのが確認された。
【００４６】
２）Ｎ−アセチル水溶性エラスチンのナノ粒子の粒径測定
AcENPsを濃度が２ｍｇ／ｍｌ
になるようにｐＨ１．２の０．１Ｍ・ＨＣｌ溶液及びｐＨ７．４のPBS溶液にそれぞれ溶解し、NICOMP380ZLSを用いて粒径を測定した。異なるｐＨ環境（ｐＨ１．２、ｐＨ７．４）でのナノ粒子の粒径は、ｐＨが１．２で２７９．７±５７．０ｎｍで、ｐＨが７．４で５７９．６±９８．９ｎｍであり、ｐＨ７．４での粒径はｐＨ１．２での粒径と比較すると約２倍近く大きくなっていることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ変化に応答して粒径が変化する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体。
【請求項２】
pH変化に応答して薬物放出を調節する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体。
【請求項３】
Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線を照射し、該液滴をナノ粒子化することを特徴とするｐＨ応答性薬物徐放担体の製造方法。
【請求項４】
高分子量水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線を照射し、ナノオーダーの粒径をもつ粒子を得ることを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項１】
ｐＨ変化に応答して粒径が変化する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体。
【請求項２】
pH変化に応答して薬物放出を調節する、Ｎ−アシル水溶性エラスチンのナノ粒子からなるｐＨ応答性薬物徐放担体。
【請求項３】
Ｎ−アシル水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線を照射し、該液滴をナノ粒子化することを特徴とするｐＨ応答性薬物徐放担体の製造方法。
【請求項４】
高分子量水溶性エラスチンのコアセルベート液滴に放射線を照射し、ナノオーダーの粒径をもつ粒子を得ることを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１８４３６４（Ｐ２０１１−１８４３６４Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６５３（Ｐ２０１０−５１６５３）
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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