β２アドレナリン多型検出
【課題】多型の結果として所期効果をあげないであろう薬剤を処方する前にβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を検出する手段の提供。
【解決手段】β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を有する標的配列を増幅および検出するための組成物であって、標的配列を検出するための分子ビーコンプローブを含み、前記分子ビーコンプローブは特定な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含む組成物。
【解決手段】β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を有する標的配列を増幅および検出するための組成物であって、標的配列を検出するための分子ビーコンプローブを含み、前記分子ビーコンプローブは特定な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸多型に関し、特に核酸増幅法を用いる一ヌクレオチド多型の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの配列を調べるように計画された研究及びヒトゲノム配列を比較するように計画された研究から、ヒトゲノムの多型に関する情報が引き出された。ヒトゲノムにおける各種多型が既に公知である。各種ヒトゲノム多型には、１塩基置換、挿入または欠失；変数のタンデム反復配列；遺伝子の全部または大部分の欠失；遺伝子増幅；及び染色体再構成が含まれる。通常、１個のヌクレオチドが関わる多型は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と呼ばれている。
【０００３】
最近、β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６におけるＳＮＰは報告されており、βアゴニスト治療に対する応答の変化に関係している（Ｊ．Ｍ．Ｄｒａｚｅｎら，Ｔｈｏｒｚｘ，５１：１１６８（１９９６）；Ｓ．Ｂ．Ｌｉｇｇｅｔｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５６：Ｓ１５６−６２（１９９７）；Ｆ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３１８４−８（１９９７））。アドレナリン受容体は各種細胞の表面上のホルモン受容体である。ホルモンはアドレナリン受容体部位に結合すると一連の細胞事象のカスケードをトリガーし得る。よって、アドレナリン受容体及びそこに結合するホルモンは大部分分子レベルで細胞事象をコントロールする機構を形成する。多くの医薬化合物は、アドレナリン受容体部位に結合し、こうして細胞機能を臨床的に調節する分子を模倣している。例えば、β−アゴニストとして公知の薬物はβ２アドレナリン受容体部位に結合し、喘息に対する薬剤として広く使用されている。しかしながら、β２アドレナリン遺伝子のコドン１６にＳＮＰを有する患者は、受容体と薬剤またはホルモン間のアフィニテイーを低下させる受容体のコンフォメーション等が変化するために前記治療に応答しないことがある。
【０００４】
従って、多型の結果として所期効果をあげないであろう薬剤を処方する前にβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を検出する手段を提供することが有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開第９２／２０７０２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，１８５，４４４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０３４，５０６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１４２，０４７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４６４，７４６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４２４，４１４号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９４８，８８２号明細書
【特許文献８】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献９】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，３１０，６５２号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，３２２，７７０号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６９１，１４６号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，８７６，９３０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，７２３，５９１号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，３４８，８５３号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，１１９，８０１号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，９６２，２３３号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，９４２，２８３号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，８６６，３３６号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【特許文献２３】米国特許第６，１５０，０９７号明細書
【特許文献２４】米国特許出願第０８／５１４，７０４号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍ．Ｄｒａｚｅｎら，Ｔｈｏｒｚｘ，５１：１１６８（１９９６）
【非特許文献２】Ｓ．Ｂ．Ｌｉｇｇｅｔｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５６：Ｓ１５６−６２（１９９７）
【非特許文献３】Ｆ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３１８４−８（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８（１９９６）
【非特許文献５】Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１：３５３−３８８（１９９２）
【発明の概要】
【０００７】
本明細書には、自動化に適した方法で多型核酸配列を分析し得る方法を開示する。本発明は、試験サンプル中のβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６に多型を有する標的配列を増幅、検出するための試薬、方法及びキットを提供する。特に、本明細書中で配列番号１と称される標的配列を増幅するための増幅プライマーとして配列番号２及び配列番号３を使用することができる。前記プライマーは増幅産物を特異的且つ高感度で産生し、この増幅産物は配列番号４及び５、配列番号６、７、８及び９からなる分子ビーコンプローブを用いて容易に検出できることを知見した。配列番号４は野生型配列に特異的な内部ハイブリダイゼーションプローブであり、配列番号５は変異体（多型）配列に特異的な内部ハイブリダイゼーションプローブである。また、配列番号６及び７は野生型配列に対する分子ビーコンプローブに挿入され得るヌクレオチド配列であり、配列番号８及び９は変異体（多型）配列に対して選択的な分子ビーコンプローブに挿入されるヌクレオチド配列である。
【０００８】
本明細書中で配列番号１として示される標的配列は、核酸増幅試薬、標的配列を含む試験サンプル、及び配列番号２及び３のプライマーを含む反応混合物を形成することにより増幅され得る。増幅後、増幅された標的配列が検出され得る。例えば、配列番号４及び５のプローブ、または配列番号６、７、８または９の配列を含む分子ビーコンプローブを増幅された標的配列にハイブリダイズするために使用すると、プローブ／増幅産物ハイブリッドが形成され、このハイブリッドは各種公知方法から選択した適当な方法を用いて検出され得る。すなわち、プローブが配列番号４であるプローブ／増幅産物ハイブリッドが検出されれば、野生型配列の存在が分かる。一方、プローブが配列番号５であるプローブ／増幅産物ハイブリッドが検出されれば、多型配列の存在が分かる。同様に、増幅産物の存在下で配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブから標的結合状態を示すシグナルが検出されれば、野生型配列の存在が分かる。一方、増幅産物の存在下で配列番号８または配列番号９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブの１つから標的結合状態を示すシグナルが検出されれば、変異体（多型）配列の存在が分かる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、試験サンプル中の標的配列を増幅、検出するための試薬、方法及びキットを提供する。特に、配列番号２及び配列番号３がβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６に多型を含む可能性のある核酸配列を増幅するために増幅プライマーとして使用され得る。よって、標的配列の野生型及び多型バージョンの両方が配列番号２及び配列番号３を用いて増幅され得る。代表的な標的配列として、配列ＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧ ＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴ ＧＧＣＡＣＣＣＡＡＴ ＡＧＡＡＧＣＣＡＴＧ ＣＧＣＣＧＧＡＣＣＡ ＣＧＡＣＧＴＣＡＣＧ ＣＡＧＣＡＡＡＧＧＧ ＡＣＧＡＧＧＴＧＴＧ ＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣ ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧ ＴＣＡＴＧＴ（配列番号１）を提示する。配列番号２及び配列番号３のプライマーにより産生される増幅産物を検出または区別するために配列番号４または配列番号５を有するプローブ配列を使用することができる（例えば、試験サンプル中の野生型または多型配列の存在を示す）。また、配列番号２及び配列番号３のプライマーにより産生される増幅産物を検出及び／または区別するために配列番号６、７、８または９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブを使用することができる（例えば、試験サンプル中の野生型または多型配列の存在を示す）。
【００１０】
本発明において有用なヌクレオチド配列には、
【００１１】
【化１】
、及び上記した天然ヌクレオチドの１つ以上がヌクレオチドの合成アナログで置換されている人工アナログ配列が含まれる。３つの好ましい実施態様では、配列番号６、７、８及びは９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンはフルオレセイン及びｄａｂｃｙｌを連結させた上記ヌクレオチド配列から完全にもしくは本質的に構成される。配列番号６及び配列番号９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブはそれぞれ配列番号７及び配列番号８を含む分子ビーコンプローブよりも好ましい。
【００１２】
本明細書に記載されている分子ビーコンのプライマー、プローブ及びヌクレオチド配列はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、または非帯電核酸アナログや当業界で公知の他の核酸アナログのような核酸アナログから構成され得、前記非帯電核酸アナログには国際特許出願公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載されているペプチド核酸（ＰＮＡ）及び米国特許第５，１８５，４４４号明細書、同第５，０３４，５０６号明細書及び同第５，１４２，０４７号明細書に記載されているモルホリノアナログが含まれるが、これらに限定されない。前記文献はいずれも援用により本明細書に含まれるとする。例えば、当業者は、Ｔ（すなわち、チミジン）として表されるオリゴヌクレオチドが示されている場合にはＤＮＡよりむしろＲＮＡを使用する実施態様ではこのオリゴヌクレオチドはＵも表し、非天然ヌクレオチド残基を本発明の配列に含む核酸アナログを表す。前記配列は通常現在利用可能な各種方法を用いて合成され得る。例えば、ＤＮＡ配列は、慣用のヌクレオチドホスホラミダイト化学及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティーに所在）、ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントンに所在）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から市販されている機器を用いて合成され得る。また、所望により、前記配列は、いずれも援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書、同第５，４２４，４１４号明細書及び同第４，９４８，８８２号明細書に記載されているような当業界で公知の方法を用いて標識され得る。ある実施態様では、本発明のプローブ及び分子ビーコンプローブが天然ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）のみを含んでいることが好ましく、より好ましくは天然ＤＮＡヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）のみを含む。プライマーとして使用される配列が配列の３’末端にＤＮＡを有していることが好ましく、より好ましくは完全にＤＮＡから構成される。
【００１３】
「標的配列」は、増幅及び検出される核酸配列であるかまたは配列番号１に相補的なヌクレオチド配列からなる。標的配列はときどき一本鎖と称されるが、当業者は認識しているように本発明で使用される標的配列が二本鎖であってもよい。
【００１４】
本明細書中、用語「試験サンプル」は標的配列を含んでいると疑われるものを意味する。試験サンプルは、生物学的ソース（例えば、血液、気管支肺胞洗浄液、唾液、咽頭スワブ、眼房水、脳脊髄液、汗、痰、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水）、組織（例えば、心組織等）、発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物等に由来するものであり得る。試験サンプルは（ｉ）前記ソースから入手したまま直接、または（ｉｉ）サンプルの特性を修飾するための予備処理後使用され得る。よって、使用する前に、試験サンプルを例えば血液から血漿を調製したり、細胞を破壊したり、固体材料から液体を作成したり、粘性流体を希釈したり、液体を濾過したり、液体を蒸留したり、液体を濃縮したり、干渉成分を不活化したり、試薬を添加したり、核酸を精製したりして予備処理され得る。最も一般的にはサンプルは全血液である。
【００１５】
配列番号２及び３は、増幅プライマーとして標的配列を増幅するために当業界で公知の増幅手順に従って使用され得る。好ましくは、本発明の配列は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の原理に従って使用される。当業者が理解しているように、標的配列がＲＮＡの場合には標的配列を増幅させる際に逆転写段階を加えてもよい。逆転写活性を有する酵素がＲＮＡ鋳型からＤＮＡ配列を産生し得ることは公知である。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ）は当業界で公知であり、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３１０，６５２号明細書及び同第５，３２２，７７０号明細書に記載されている。
【００１６】
よって、本発明の増幅方法は、通常核酸増幅試薬、増幅プライマー（すなわち、配列番号２及び配列番号３）及び標的配列を含んでいると疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成する段階を含む。反応混合物を形成した後形成された反応混合物を増幅条件にかけると、試験標的のコピーが少なくとも１個生ずる。当業界で公知のように反応混合物を熱サイクルにかけるように反応混合物を数回増幅条件にかけることは理解されている。
【００１７】
上記したように、反応混合物は“核酸増幅試薬”を含み得る。この核酸増幅試薬には公知の試薬が含まれ、その例にはポリメラーゼ活性（及び所要により逆転写活性）を有する酵素；マグネシウムまたはマンガンのような酵素コファクター；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及びデオキシアデニントリホスフェート、デオキシグアニントリホスフェート、デオキシシトシントリホスフェートやデオキシチミニントリホスフェートのようなデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
「増幅条件」は、通常プライマー配列の標的配列へのハイブリダイズまたはアニーリング及びその後のプライマー配列の伸長を促進する条件として定義される。当業界で公知のように、アニーリングは十分予想されるように温度、イオン強度、配列の長さ、相補性及び配列のＧ：Ｃ含量を含めた諸因子に依存する。例えば、相補的核酸配列の環境の温度を低くするとアニーリングが促進される。所与の組の配列について、溶融温度（Ｔｍ）は幾つかの公知和方法により推定され得る。典型的には、診断用途では溶融温度に近い（すなわち、１０℃以内）ハイブリダイゼーション温度を用いる。小カチオンはホスホジエステル骨格との相互作用により二重鎖の形成を安定化させる傾向にあるので、イオン強度、すなわち“塩”濃度も溶融温度に影響を与える。典型的な塩濃度はカチオンの種類及び価に依存するが、このことは当業者が容易に理解し得る。また、Ｇ：Ｃ対は３個の水素結合を含むのに対してＡ：Ｔ対は水素結合を２個しか有していないこと及びより長い配列は配列を一緒に保持する水素結合をより多く有していることから、高いＧ：Ｃ含量及びより長い配列も二重鎖の形成を安定化することも公知である。よって、高いＧ：Ｃ含量及びより長い配列は溶融温度を上昇させることによりハイブリダイゼーション条件に影響を与える。
【００１９】
所与の診断用途のために配列を選択したら、Ｇ：Ｃ含量及び長さは分かるであろうし、ハイブリダイゼーション条件を正確に決定する際に考慮され得る。イオン強度は通常酵素活性に対して最適化されるので、残る変更可能なパラメーターは唯一温度である。通常、ハイブリダイゼーション温度はプライマー及びプローブのＴｍであるかその近くに選択される。特定のプライマー、プローブ、またはプライマー／プローブ組に対する適当なハイブリダイゼーション条件を得ることは当業者の設計事項である。
【００２０】
上記したように産生した増幅産物は標的配列の増幅中またはその後に検出され得る。配列番号２及び３で産生された増幅産物を配列番号４及び５を有するプローブ配列または配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブを用いて検出するために使用され得る検出プラットフォームには、当業界で公知の均一または不均一方法が含まれる。均一検出プラットフォームの例は、標的配列の存在下でシグナルを発するプローブに結合させた蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer)（ＴＲＥＴ）標識の使用を含み得る。前記標識にはフルオレセイン及びｄａｂｃｙｌが含まれるが、これらに限定されない。核酸配列を均一に検出するために使用され得る方法の例は、（援用により本明細書に含まれるとする）米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されている所謂ＴａｑＭａｎアッセイ及び（援用により本明細書に含まれるとする）米国特許第５，９２５，５１７号明細書に記載されている分子ビーコンプローブ及びアッセイである。更に、前記プラットフォームは増幅産物の産生をリアルタイムに検出するために使用され得る。使用する特定検出プラットフォームに従って使用するのに適するようにプローブを修飾し得ると理解されたい。
【００２１】
増幅反応の完了後増幅反応の産物を分子量マーカーを用いて検出するために、例えばゲル電気泳動が使用され得る。しかしながら、増幅産物は標識プローブ及び固体支持体を用いて不均一に検出され得る。増幅された標的配列の検出方法は、（ａ）標的配列に対して相補的な核酸配列に対して少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（例えば、配列番号４及び５）をハイブリダイズして、プローブ及びそのプローブに対して相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成する段階、及び（ｂ）前記ハイブリッドを試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出する段階を含み得る。
【００２２】
上記のように形成されたハイブリッドは、該ハイブリッドを分離、検出するために使用され得る微粒子及び標識を用いて検出され得る。好ましくは、検出は市販されているＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（商標）装置（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で使用されるプロトコルに従って実施される。
【００２３】
また、増幅した標的配列の検出方法は、（ａ）配列番号６、７、８または９の配列を有する核酸を含む分子ビーコンプローブを適当な条件下で標的配列または増幅産物と接触させる段階、及び（ｂ）標的または増幅産物の存在または量を測定するために分子ビーコンの発光スペクトルを観察する段階を含む。
【００２４】
他の実施態様において、配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブは増幅産物の存在または量を検出するためにも使用され得る。例えば、分子ビーコンプローブを増幅反応に添加することにより１つの反応で増幅産物の増幅及び検出を本質的に同時に実施することができる。別の実施態様では、増幅産物を単離した後配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブと接触させてもよい。
【００２５】
本明細書中、「標識」は検出され得る性質ないし特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等のように直接検出され得る。或いは、標識は例えば特異的結合メンバーのように間接的に検出され得る。直接検出可能な標識では、該標識を検出し得るように基質、トリガー試薬、光等のような追加成分が必要な場合がある。間接的に検出可能な標識を使用するときには、該標識は通常“コンジュゲート”と組合せて使用される。通常、コンジュゲートは直接的に検出可能な標識に結合またはカップリングさせた特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当業界で公知であり、その例には特異的結合メンバーの特異的結合性または標識の検出可能性を損なわない任意の化学的手段及び／または物理的手段が含まれ得る。本明細書中、「特異的結合メンバー」は、１つの分子が他方の分子に例えば化学的または物理的手段により特異的に結合する２種の分子という結合対のメンバーを意味する。抗原／抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対にはアビジンとビオチン；ハプテンとこのハプテンに対して特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素コファクターまたは基質と酵素；等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明で使用される分子ビーコンプローブは、少なくとも１つの標識を形成するために少なくとも２つの部分を含む。分子ビーコンは第１化学部分を含み、前記第１化学部分は第２化学部分にコンジュゲートした核酸または核酸アナログにコンジュゲートされている。例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＴｙａｇｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８（１９９６）、米国特許第５，１１９，８０１号明細書及び同第５，３１２，７２８号明細書を参照されたい。核酸または核酸アナログはそれ自体に結合してステム−ループ構造を形成し得、これにより第１化学部分は第２化学部分により近づく。密接しているときには、第１化学部分、第２化学部分またはこれらの化学部分の組合せは検出可能なシグナルを発生しないか、或いは標的または増幅産物に結合していないときの分子ビーコンの特徴である“非結合シグナル”を発する。第１化学部分及び第２化学部分がそれぞれ核酸配列の対向末端に位置していることが好ましいが、核酸内の内部位置に導入されていてもよい。
【００２７】
逆に、分子ビーコンが標的または増幅産物と接触すると、分子ビーコンプローブは標的及び／または増幅産物に結合する。分子ビーコンが標的または増幅産物に結合すると、分子ビーコンは分子ビーコンの第１化学部分及び第２化学部分を分離するコンフォメーションとなる。この分離状態で、分子ビーコンは“結合シグナル”を発し、このシグナルは“非結合シグナル”と区別され得る。結合シグナルは第１化学部分、第２化学部分またはその両方部分より発生し得るか、または非結合シグナルの不在であり得る。
【００２８】
第１化学部分及び第２化学部分は検出可能な適当な原子または分子部分であり得る。分子ビーコンプローブの第１化学部分及び第２化学部分の好ましい実施態様は適当な発蛍光団を含む。第１化学部分及び第２化学部分が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介してまたは衝突消光を介して相互作用し得ることが好ましい。
【００２９】
ＦＲＥＴは分子エルネギー移動の形態であり、これによりエネルギーはドナー分子とアクセプター分子間を通過する。ＦＲＥＴはある化合物の特性により生ずる。特定波長の光に暴露することにより励起されると、化合物は異なる波長で光（すなわち、蛍光）を発する。前記化合物は発蛍光団と称される。ＦＲＥＴにおいて、エネルギーはドナー分子（発蛍光団）とアクセプター分子間の長い距離にわたって非放射的に移動する。ドナーは光子を吸収してエネルギーをアクセプターに対して非放射的に移動する（Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１：３５３−３８８（１９９２）において検討）。
【００３０】
いずれの発蛍光団分子（すなわち、ドナーまたはアクセプター）をモニターするかに依存して、蛍光はエネルギーの移動により消光または強化される。２つの発蛍光団の励起及び発光スペクトルの共鳴重複によりエネルギーが移動し得る。エネルギー移動は物理的因子、例えば２つの発蛍光団間の方位及び距離にも依存する。共鳴エネルギー移動は当業界で公知であり、当業者は蛍光消光または強化のための適合対、並びに有用な励起及び蛍光検出波長を選択することができる。前記した発蛍光団について記載している米国特許第５，６９１，１４６号明細書、同第５，８７６，９３０号明細書、同第５，７２３，５９１号明細書、同第５，３４８，８５３号明細書、同第５，１１９，８０１号明細書、同第５，３１２，７２８号明細書、同第５，９６２，２３３号明細書、同第５，９４２，２８３号明細書及び同第５，８６６，３３６号明細書は援用により本明細書に含まれるとする。
【００３１】
発蛍光団がドナーまたはアクセプターであるかはその励起及び発光スペクトル及び対をなす発蛍光団の励起及び発光スペクトルにより定義される。例えば、ＦＡＭは４８８ｎｍの波長の光により最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍの光を発し、発光最大値は５２５ｎｍである。ＦＡＭはＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ（すべて５１４ｎｍで励起最大値を有する）と使用するのに適したドナー発蛍光団である。
【００３２】
ＦＲＥＴで通常使用されている分子には、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が含まれる。
【００３３】
本発明では非−ＦＲＥＴベースの分子ビーコンプローブが好ましい。その例には衝突消光対が含まれるが、これに限定されない。衝突消光対は援用により本明細書に含まれるとする米国特許第６，１５０，０９７号明細書に記載されている。
【００３４】
他の適当な標識は当業界で公知であり、標識がＦＲＥＴで使用されるかどうかに関係なく当業者により容易に選択され得る。
【００３５】
「固体支持体」は不溶性であるかまたはその後の反応で不溶性となる物質を指す。よって、固体支持体はラテックス、プラスチック、被覆プラスチック、磁気または非磁気金属、ガラス、シリコーン等であり得る。固体支持体の配置も多く当業者に公知であり、ビーズ、削り屑、粒、粒子、プレートまたはチューブが意図されるが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの態様によれば、検出を容易とすべくプライマー及び／またはプローブに標識を含有させることによりハイブリッドを検出し得る。よって、ハイブリッドを例えばミクロ粒子に固定化し、ミクロ粒子上のハイブリッドの存在をコンジュゲートを用いて検出するために、プライマー及びプローブに結合させた第１及び第２特異的結合メンバーを使用し得る。
【００３７】
別の実施態様によれば、特異的結合メンバー及び直接検出可能な標識の組合せをハイブリッドを検出するために使用され得る。例えば、特異的結合メンバーを該特異的結合メンバーで標識したプライマーを用いてハイブリッドに導入し得る。直接検出可能な標識を、直接検出可能な標識で標識したプローブを用いてハイブリッドに導入し得る。よって、ハイブリッドは特異的結合メンバーを用いてミクロ粒子に固定化し、プローブ上の標識に基づいて直接検出され得る。他の検出構成が当業者の設計事項であると理解されたい。
【００３８】
好ましい実施態様によれば、援用により本明細書に含まれるとする１９９５年８月１４日に出願された米国特許出願第０８／５１４，７０４号明細書に記載されている“オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲ”（本明細書では別名“ＯＨ ＰＣＲ”）増幅反応を標的配列を検出するために使用する。簡単に説明すると、好ましい方法で使用される試薬は少なくとも１つの増幅プライマー及び少なくとも１つの内部ハイブリダイゼーションプローブ、及び増幅反応を実施するための増幅試薬を含む。プライマー配列は標的配列（またはその補体）のコピーをプライム伸長するために使用され、捕捉標識または検出標識で標識される。プローブ配列はプライマー配列により作成した配列とハイブリダイズさせるために使用され、通常プライマー配列を含まない配列とハイブリダイズさせる。プライマー配列と同様に、プライマーを捕捉標識で標識したときにはプローブを検出標識で標識するかまたはその逆とするようにプローブ配列も捕捉標識または検出標識で標識する。検出標識は上で定義した“標識”と同じ定義を有し、“捕捉標識”は通常他の増幅反応物から伸長産物及びその産物に関連するプローブを分離するために使用される。（上に定義したように）特異的結合メンバーはこの目的に十分適している。この方法に従って使用されるプローブがハイブリダイゼーション条件下で伸長しないように前記プローブの３’末端はブロックされていることが好ましい。プローブの伸長の防止方法は公知であり、当業者の選択事項である。通常、プローブの３’末端にホスフェート基を付加すればプローブの伸長は十分阻止される。
【００３９】
プローブが当初反応混合物の一部である上記した好ましい実施態様によれば、反応混合物を増幅条件下に置いたときに標的配列またはその補体の複数のコピーがプローブのＴｍ以上の温度で生ずるようにプローブ配列がプライマー配列よりも低い融点を有するようなプライマー、プローブ及び増幅条件を選択することが好ましい。前記コピーを合成した後には、そのコピーを変性させ、混合物を冷却するとプローブと標的配列またはその補体のコピーの間でハイブリッドが形成され得る。温度を変性温度からプローブが一本鎖コピーに結合する温度まで下げる速度は非常に迅速（例えば、８〜１５分間）であることが好ましく、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー伸長のために活性である温度範囲を通過することが特に好ましい。迅速な冷却は、プライマー／コピー配列ハイブリダイゼーション及び伸長よりもむしろコピー配列／プローブハイブリダイゼーションにとって好ましい。
【００４０】
以下、本発明を更に説明するために実施例を提示するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００４１】
下記実施例では、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の一ヌクレオチド多型の本発明のＤＮＡオリゴマープライマー及びプローブを用いる検出を立証する。前記ＤＮＡプライマー及びプローブは配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５として、更に配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含むＦＡＭ及びｄａｂｃｙｌ含有分子ビーコンプローブとして同定される。β−２アドレナリン受容体遺伝子からの代表的配列の一部を本明細書中配列番号１として示す。
【００４２】
下記実施例では、配列番号２及び配列番号３を野生型及び変異体β−２アドレナリン受容体遺伝子の一部に特異的な増幅プライマーとして使用する。配列番号４は、β−２アドレナリン受容体遺伝子増幅産物の野生型対立遺伝子を検出する内部ハイブリダイゼションプローブである。配列番号５は、β−２アドレナリン受容体増幅産物の変異体（ミュータント）対立遺伝子を検出する内部ハイブリダイゼションプローブである。また、配列番号６及び配列番号７は野生型対立遺伝子に特異的な分子ビーコンプローブとなり、配列番号８及び配列番号９はβ−２アドレナリン受容体遺伝子または遺伝子増幅産物の変異体に特異的な分子ビーコンプローブとなる。
【実施例１】
【００４３】
β−２アドレナリン受容体遺伝子プライマー及びプローブの作成
Ａ．β−２アドレナリン受容体プライマー
プライマーは、β−２アドレナリン受容体遺伝子の野生型及び変異体（ミュータント）対立遺伝子を両方含む標的配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲにより結合、増幅させるように設計した。これらのプライマーは配列番号２及び配列番号３であった。プライマー配列を一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。更に、配列番号３を、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４２４，４１４号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学により５’末端でカルバゾールを用いてハプテン処理した。
【００４４】
Ｂ．野生型及びミュータントβ−２アドレナリン受容体プローブ
プローブは、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の野生型または変異体（ミュータント）対立遺伝子の増幅標的配列と、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズするように設計した。野生型対立遺伝子に対するプローブは配列番号４であり、変異型（ミュータント）対立遺伝子に対するプローブは配列番号５であった。プローブ配列を一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。配列番号４を、５’末端でアダマンタンを用いてハプテン処理した後１０チミジンを付加し、３’末端をホスフェートでブロックした。配列番号５を、５’末端でダンシルを用いてハプテン処理した後１０チミジンを付加し、３’末端をホスフェートでブロックした。全ての合成は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学を用いた。
【００４５】
Ｃ．野生型及びミュータントβ−２アドレナリン受容体分子ビーコンプローブ
分子ビーコンプローブは、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の野生型または変異体（ミュータント）対立遺伝子の増幅標的配列と、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズするように設計した。野生型対立遺伝子に対するプローブは配列番号６及び配列番号７のヌクレオチド配列から構成され、変異体対立遺伝子に対するプローブは配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列から構成した。プローブ配列を３’ｄａｂｃｙｌを結合させた調整ポアガラス（ＣＰＧ）の使い捨てプレ充填カラムを用いて一般的なオリゴヌクレオチド合成法により合成し、５’末端をＦＡＭで停止した。全ての合成は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学を用いた。
【実施例２】
【００４６】
β−２アドレナリン受容体多型の検出
Ａ．一般的手順
ＤＮＡを、全血からＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（２００μｌ以下のサンプルに対して）またはＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉキット（２００μｌ〜１０ｍｌのサンプル容量に対して）（両キットともカリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎから市販）を製造業者の指示に従って用いて抽出した。全てのサンプルの遺伝子型を配列決定により確認した。これにより、サンプルは本試験で調べるβ−２アドレナリン受容体遺伝子対立遺伝子でホモ接合性野生型、ホモ接合性ミュータントまたはヘテロ接合性として同定され得た。幾つかの場合では、精製ＤＮＡを２６０ｎＭでの光の吸光度により定量した。
【００４７】
上記サンプルからのＤＮＡを、実施例１で作成した配列番号２及び配列番号３プライマー及び配列番号４（野生型）及び配列番号５（ミュータント）プローブを用いてＰＣＲ増幅し、検出した。
【００４８】
ＰＣＲは、５０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）（ｐＨ８．１）、１５０ｍＭ 酢酸カリウム、０．１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸、０．０２％ ナトリウムアジド、０．００１％ ウシ血清アルブミン及び８％（ｗ／ｖ） グリセロールを含有する１×ＰＣＲ緩衝液中で実施した。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを５単位／反応の濃度で、それぞれ１５０μＭの最終濃度で存在させたｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）と共に使用した。配列番号２及び配列番号３プライマー及び配列番号４野生型プローブはそれぞれ１１０ｎＭの濃度で使用し、配列番号５ミュータントプローブは５０ｎＭの濃度で使用した。最終濃度３．２５ｍＭの塩化マンガンも反応混合物中に存在させた。反応物の総容量は０．２ｍｌで、サンプル容量は２０μｌとした。
【００４９】
反応混合物をＬＣｘ（登録商標）サーマルサイクラーを用いて増幅した。まず、反応混合物を最初９７℃において２分間インキュベートした後、９４℃×４０秒間、５５℃×４０秒間及び７２℃×４０秒間のＰＣＲ増幅サイクルを４５回実施した。反応混合物を熱サイクルにかけた後、混合物を９７℃において５分間維持し、温度を１２℃に急速に下げることによりプローブオリゴハイブリダイゼーションを達成した。反応プローブを分析し、検出するまでサンプルを１２℃において最低でも１０分間保持した。
【００５０】
反応産物をＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。反応産物を捕捉し、検出するために抗−カルバゾール被覆微粒子、抗−アダマンタン抗体／アルカリホスファーゼコンジュゲート及び抗−ダンシル抗体／β−ガラクトシダーゼコンジュゲート（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）の懸濁液をＬＣｘ（登録商標）と一緒に用いた。使用した酵素基質は４−メチル−ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）及び７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシクマリン−４−酢酸−（２−ヒドロキシエチル）アミド（ＡＵＧ）であり、基質の反応産物への変換速度を測定し、カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として報告した。
【００５１】
Ｂ．標的ＤＮＡ滴定
配列決定により明らかとなった３遺伝子型（ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性ミュータント）のそれぞれからのＤＮＡをサンプル中の異なる量のＤＮＡ（２５〜５００ｎｇ／反応）を用いて上記した手順により単離し、定量し、試験した。
【００５２】
この試験の結果を表１に示す。この結果から、野生型プローブはホモ接合性野生型及びヘテロ接合性β−２アドレナリン受容体遺伝子型の両方を検出したが、ホモ接合性ミュータントβ−２アドレナリン受容体遺伝子型をポジティブとして検出しなかったことが分かる。ミュータントプローブはホモ接合性ミュータント及びヘテロ接合性β−２アドレナリン受容体遺伝子型の両方を検出したが、ホモ接合性野生型β−２アドレナリン受容体遺伝子型をポジティブとして検出しなかったことが分かる。予想したように、いずれのプローブも１つの野生型及び１つの変異体（ミュータント）対立遺伝子を含んでいるので、ヘテロ接合性サンプルを検出した。更に、プローブが適当なホモ接合性サンプル中に存在する２対立遺伝子よりもかなり反応する１つの対立遺伝子しか有していないので、ヘテロ接合性サンプルのＬＣｘ反応速度はホモ接合性サンプルのＬＣｘ反応速度のほぼ半分であった。よって、全てのプローブが優れた特異性を示した。ポジティブサンプルはすべて少なくとも２５ｎｇ／反応のＤＮＡまで低濃度でも検出可能であった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
Ｃ．未知サンプルの遺伝子型測定
上記Ａに記載した手順を用いて、２０サンプルのβ−２アドレナリン受容体遺伝子型を測定した。この結果を配列決定により調べた結果と比較した。
【００５５】
表２から分かるように、サンプルは野生型プローブ（ホモ接合性野生型）のみ、ミュータントプローブ（ホモ接合性ミュータント）のみ、または両プローブ（ヘテロ接合性）と明らかに反応した。これらの結果は配列決定により立証された。すなわち、ＬＸｃフォーマットで上記プライマー及びプローブを用いて、この方法は実施が簡単でありながら、配列決定と同じくらい正確にβ−２アドレナリン受容体の遺伝子型が調べられる。
【００５６】
【表２】
【実施例３】
【００５７】
分子ビーコンプローブを用いるβ−２アドレナリン受容体多型の検出
全血から単離したＤＮＡ（１２５ｎｇ）から正プライマーとして配列番号２（３００ｎＭ）及び逆プライマーとして配列番号３（３００ｎＭ）を用いるＰＣＲ反応により標準及び未知単位複製配列を作成した。ポリメラーゼ連鎖反応は、５０ｕｌの総容量でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの０．２ｍｌマイクロＡＭＰ（商標）チューブ中で実施した。１×ＰＣＲ緩衝液は３ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ類（２００ｕＭの最終濃度）、０．０２５Ｕ／μｌ（５単位） ＡＴ Ｇｏｌｄ（商標）、６０ｎＭ ＲＯＸ及び２００ｎＭ 配列番号６または配列番号９の核酸成分を有する分子ビーコンプローブを含んでいた（配列番号６及び９を含む分子ビーコンは配列番号７及び８を含む分子ビーコンよりも高性能であることが判明した）。まず、反応混合物を９５℃において１０分間インキュベートした後熱サイクルに４５回かけた。熱サイクルは、９４℃で３０秒間の溶融、５５℃で５０秒間のアニーリング及びデーター測定及び７２℃で３０秒間の伸長とした。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｍｓの参照染料ＲＯＸを用い、７７００ ＡＢＩ配列検出システム（商標）を用いて蛍光を測定した。
【００５８】
各サンプルにポリメラーゼ連鎖反応を３回かけた。各反応の第１回は分子ビーコンプローブの代わりに水を用いて実施した。第２回はＦＡＭ−配列番号６−ｄａｂｃｙｌからなる分子ビーコンプローブを用いて実施した。第３回はＦＡＭ−配列番号９−ｄａｂｃｙｌからなる分子ビーコンプローブを用いて実施した。標準サンプル及び未知サンプルの同一性をＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認した。野生型配列に対してホモ接合性の各サンプルは配列番号６からなる分子ビーコンプローブの存在下で強い蛍光を示し、配列番号６からなる分子ビーコンプローブの代わりに水または配列番号９からなる分子ビーコンプローブを使用したときには本質的に蛍光を示さなかった。逆に、変異体配列に対してホモ接合性の各サンプルは配列番号９からなる分子ビーコンプローブの存在下で強い蛍光を示し、配列番号９からなる分子ビーコンプローブの代わりに水または配列番号６からなる分子ビーコンプローブを使用したときには本質的に蛍光を示さなかった。同様に、ヘテロ接合性サンプルでは、各分子ビーコンプローブを含む反応において中程度の蛍光が観察された。
【００５９】
いずれの場合も、約２８または３０サイクル後蛍光が検出され、約３５サイクルまでベースライン蛍光から容易に区別され得た。
【００６０】
特定実施態様を参照して本発明を詳細に説明してきたが、前記実施態様に対して各種変化及び修飾を本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得ることは当業者に自明である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸多型に関し、特に核酸増幅法を用いる一ヌクレオチド多型の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの配列を調べるように計画された研究及びヒトゲノム配列を比較するように計画された研究から、ヒトゲノムの多型に関する情報が引き出された。ヒトゲノムにおける各種多型が既に公知である。各種ヒトゲノム多型には、１塩基置換、挿入または欠失；変数のタンデム反復配列；遺伝子の全部または大部分の欠失；遺伝子増幅；及び染色体再構成が含まれる。通常、１個のヌクレオチドが関わる多型は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と呼ばれている。
【０００３】
最近、β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６におけるＳＮＰは報告されており、βアゴニスト治療に対する応答の変化に関係している（Ｊ．Ｍ．Ｄｒａｚｅｎら，Ｔｈｏｒｚｘ，５１：１１６８（１９９６）；Ｓ．Ｂ．Ｌｉｇｇｅｔｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５６：Ｓ１５６−６２（１９９７）；Ｆ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３１８４−８（１９９７））。アドレナリン受容体は各種細胞の表面上のホルモン受容体である。ホルモンはアドレナリン受容体部位に結合すると一連の細胞事象のカスケードをトリガーし得る。よって、アドレナリン受容体及びそこに結合するホルモンは大部分分子レベルで細胞事象をコントロールする機構を形成する。多くの医薬化合物は、アドレナリン受容体部位に結合し、こうして細胞機能を臨床的に調節する分子を模倣している。例えば、β−アゴニストとして公知の薬物はβ２アドレナリン受容体部位に結合し、喘息に対する薬剤として広く使用されている。しかしながら、β２アドレナリン遺伝子のコドン１６にＳＮＰを有する患者は、受容体と薬剤またはホルモン間のアフィニテイーを低下させる受容体のコンフォメーション等が変化するために前記治療に応答しないことがある。
【０００４】
従って、多型の結果として所期効果をあげないであろう薬剤を処方する前にβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を検出する手段を提供することが有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開第９２／２０７０２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，１８５，４４４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０３４，５０６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１４２，０４７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４６４，７４６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４２４，４１４号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９４８，８８２号明細書
【特許文献８】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献９】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，３１０，６５２号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，３２２，７７０号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６９１，１４６号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，８７６，９３０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，７２３，５９１号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，３４８，８５３号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，１１９，８０１号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，９６２，２３３号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，９４２，２８３号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，８６６，３３６号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【特許文献２３】米国特許第６，１５０，０９７号明細書
【特許文献２４】米国特許出願第０８／５１４，７０４号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍ．Ｄｒａｚｅｎら，Ｔｈｏｒｚｘ，５１：１１６８（１９９６）
【非特許文献２】Ｓ．Ｂ．Ｌｉｇｇｅｔｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５６：Ｓ１５６−６２（１９９７）
【非特許文献３】Ｆ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３１８４−８（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８（１９９６）
【非特許文献５】Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１：３５３−３８８（１９９２）
【発明の概要】
【０００７】
本明細書には、自動化に適した方法で多型核酸配列を分析し得る方法を開示する。本発明は、試験サンプル中のβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６に多型を有する標的配列を増幅、検出するための試薬、方法及びキットを提供する。特に、本明細書中で配列番号１と称される標的配列を増幅するための増幅プライマーとして配列番号２及び配列番号３を使用することができる。前記プライマーは増幅産物を特異的且つ高感度で産生し、この増幅産物は配列番号４及び５、配列番号６、７、８及び９からなる分子ビーコンプローブを用いて容易に検出できることを知見した。配列番号４は野生型配列に特異的な内部ハイブリダイゼーションプローブであり、配列番号５は変異体（多型）配列に特異的な内部ハイブリダイゼーションプローブである。また、配列番号６及び７は野生型配列に対する分子ビーコンプローブに挿入され得るヌクレオチド配列であり、配列番号８及び９は変異体（多型）配列に対して選択的な分子ビーコンプローブに挿入されるヌクレオチド配列である。
【０００８】
本明細書中で配列番号１として示される標的配列は、核酸増幅試薬、標的配列を含む試験サンプル、及び配列番号２及び３のプライマーを含む反応混合物を形成することにより増幅され得る。増幅後、増幅された標的配列が検出され得る。例えば、配列番号４及び５のプローブ、または配列番号６、７、８または９の配列を含む分子ビーコンプローブを増幅された標的配列にハイブリダイズするために使用すると、プローブ／増幅産物ハイブリッドが形成され、このハイブリッドは各種公知方法から選択した適当な方法を用いて検出され得る。すなわち、プローブが配列番号４であるプローブ／増幅産物ハイブリッドが検出されれば、野生型配列の存在が分かる。一方、プローブが配列番号５であるプローブ／増幅産物ハイブリッドが検出されれば、多型配列の存在が分かる。同様に、増幅産物の存在下で配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブから標的結合状態を示すシグナルが検出されれば、野生型配列の存在が分かる。一方、増幅産物の存在下で配列番号８または配列番号９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブの１つから標的結合状態を示すシグナルが検出されれば、変異体（多型）配列の存在が分かる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、試験サンプル中の標的配列を増幅、検出するための試薬、方法及びキットを提供する。特に、配列番号２及び配列番号３がβ２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６に多型を含む可能性のある核酸配列を増幅するために増幅プライマーとして使用され得る。よって、標的配列の野生型及び多型バージョンの両方が配列番号２及び配列番号３を用いて増幅され得る。代表的な標的配列として、配列ＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧ ＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴ ＧＧＣＡＣＣＣＡＡＴ ＡＧＡＡＧＣＣＡＴＧ ＣＧＣＣＧＧＡＣＣＡ ＣＧＡＣＧＴＣＡＣＧ ＣＡＧＣＡＡＡＧＧＧ ＡＣＧＡＧＧＴＧＴＧ ＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣ ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧ ＴＣＡＴＧＴ（配列番号１）を提示する。配列番号２及び配列番号３のプライマーにより産生される増幅産物を検出または区別するために配列番号４または配列番号５を有するプローブ配列を使用することができる（例えば、試験サンプル中の野生型または多型配列の存在を示す）。また、配列番号２及び配列番号３のプライマーにより産生される増幅産物を検出及び／または区別するために配列番号６、７、８または９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブを使用することができる（例えば、試験サンプル中の野生型または多型配列の存在を示す）。
【００１０】
本発明において有用なヌクレオチド配列には、
【００１１】
【化１】
、及び上記した天然ヌクレオチドの１つ以上がヌクレオチドの合成アナログで置換されている人工アナログ配列が含まれる。３つの好ましい実施態様では、配列番号６、７、８及びは９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンはフルオレセイン及びｄａｂｃｙｌを連結させた上記ヌクレオチド配列から完全にもしくは本質的に構成される。配列番号６及び配列番号９のヌクレオチド配列を含む分子ビーコンプローブはそれぞれ配列番号７及び配列番号８を含む分子ビーコンプローブよりも好ましい。
【００１２】
本明細書に記載されている分子ビーコンのプライマー、プローブ及びヌクレオチド配列はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、または非帯電核酸アナログや当業界で公知の他の核酸アナログのような核酸アナログから構成され得、前記非帯電核酸アナログには国際特許出願公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載されているペプチド核酸（ＰＮＡ）及び米国特許第５，１８５，４４４号明細書、同第５，０３４，５０６号明細書及び同第５，１４２，０４７号明細書に記載されているモルホリノアナログが含まれるが、これらに限定されない。前記文献はいずれも援用により本明細書に含まれるとする。例えば、当業者は、Ｔ（すなわち、チミジン）として表されるオリゴヌクレオチドが示されている場合にはＤＮＡよりむしろＲＮＡを使用する実施態様ではこのオリゴヌクレオチドはＵも表し、非天然ヌクレオチド残基を本発明の配列に含む核酸アナログを表す。前記配列は通常現在利用可能な各種方法を用いて合成され得る。例えば、ＤＮＡ配列は、慣用のヌクレオチドホスホラミダイト化学及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティーに所在）、ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントンに所在）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から市販されている機器を用いて合成され得る。また、所望により、前記配列は、いずれも援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書、同第５，４２４，４１４号明細書及び同第４，９４８，８８２号明細書に記載されているような当業界で公知の方法を用いて標識され得る。ある実施態様では、本発明のプローブ及び分子ビーコンプローブが天然ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）のみを含んでいることが好ましく、より好ましくは天然ＤＮＡヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）のみを含む。プライマーとして使用される配列が配列の３’末端にＤＮＡを有していることが好ましく、より好ましくは完全にＤＮＡから構成される。
【００１３】
「標的配列」は、増幅及び検出される核酸配列であるかまたは配列番号１に相補的なヌクレオチド配列からなる。標的配列はときどき一本鎖と称されるが、当業者は認識しているように本発明で使用される標的配列が二本鎖であってもよい。
【００１４】
本明細書中、用語「試験サンプル」は標的配列を含んでいると疑われるものを意味する。試験サンプルは、生物学的ソース（例えば、血液、気管支肺胞洗浄液、唾液、咽頭スワブ、眼房水、脳脊髄液、汗、痰、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水）、組織（例えば、心組織等）、発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物等に由来するものであり得る。試験サンプルは（ｉ）前記ソースから入手したまま直接、または（ｉｉ）サンプルの特性を修飾するための予備処理後使用され得る。よって、使用する前に、試験サンプルを例えば血液から血漿を調製したり、細胞を破壊したり、固体材料から液体を作成したり、粘性流体を希釈したり、液体を濾過したり、液体を蒸留したり、液体を濃縮したり、干渉成分を不活化したり、試薬を添加したり、核酸を精製したりして予備処理され得る。最も一般的にはサンプルは全血液である。
【００１５】
配列番号２及び３は、増幅プライマーとして標的配列を増幅するために当業界で公知の増幅手順に従って使用され得る。好ましくは、本発明の配列は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の原理に従って使用される。当業者が理解しているように、標的配列がＲＮＡの場合には標的配列を増幅させる際に逆転写段階を加えてもよい。逆転写活性を有する酵素がＲＮＡ鋳型からＤＮＡ配列を産生し得ることは公知である。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ）は当業界で公知であり、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３１０，６５２号明細書及び同第５，３２２，７７０号明細書に記載されている。
【００１６】
よって、本発明の増幅方法は、通常核酸増幅試薬、増幅プライマー（すなわち、配列番号２及び配列番号３）及び標的配列を含んでいると疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成する段階を含む。反応混合物を形成した後形成された反応混合物を増幅条件にかけると、試験標的のコピーが少なくとも１個生ずる。当業界で公知のように反応混合物を熱サイクルにかけるように反応混合物を数回増幅条件にかけることは理解されている。
【００１７】
上記したように、反応混合物は“核酸増幅試薬”を含み得る。この核酸増幅試薬には公知の試薬が含まれ、その例にはポリメラーゼ活性（及び所要により逆転写活性）を有する酵素；マグネシウムまたはマンガンのような酵素コファクター；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及びデオキシアデニントリホスフェート、デオキシグアニントリホスフェート、デオキシシトシントリホスフェートやデオキシチミニントリホスフェートのようなデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
「増幅条件」は、通常プライマー配列の標的配列へのハイブリダイズまたはアニーリング及びその後のプライマー配列の伸長を促進する条件として定義される。当業界で公知のように、アニーリングは十分予想されるように温度、イオン強度、配列の長さ、相補性及び配列のＧ：Ｃ含量を含めた諸因子に依存する。例えば、相補的核酸配列の環境の温度を低くするとアニーリングが促進される。所与の組の配列について、溶融温度（Ｔｍ）は幾つかの公知和方法により推定され得る。典型的には、診断用途では溶融温度に近い（すなわち、１０℃以内）ハイブリダイゼーション温度を用いる。小カチオンはホスホジエステル骨格との相互作用により二重鎖の形成を安定化させる傾向にあるので、イオン強度、すなわち“塩”濃度も溶融温度に影響を与える。典型的な塩濃度はカチオンの種類及び価に依存するが、このことは当業者が容易に理解し得る。また、Ｇ：Ｃ対は３個の水素結合を含むのに対してＡ：Ｔ対は水素結合を２個しか有していないこと及びより長い配列は配列を一緒に保持する水素結合をより多く有していることから、高いＧ：Ｃ含量及びより長い配列も二重鎖の形成を安定化することも公知である。よって、高いＧ：Ｃ含量及びより長い配列は溶融温度を上昇させることによりハイブリダイゼーション条件に影響を与える。
【００１９】
所与の診断用途のために配列を選択したら、Ｇ：Ｃ含量及び長さは分かるであろうし、ハイブリダイゼーション条件を正確に決定する際に考慮され得る。イオン強度は通常酵素活性に対して最適化されるので、残る変更可能なパラメーターは唯一温度である。通常、ハイブリダイゼーション温度はプライマー及びプローブのＴｍであるかその近くに選択される。特定のプライマー、プローブ、またはプライマー／プローブ組に対する適当なハイブリダイゼーション条件を得ることは当業者の設計事項である。
【００２０】
上記したように産生した増幅産物は標的配列の増幅中またはその後に検出され得る。配列番号２及び３で産生された増幅産物を配列番号４及び５を有するプローブ配列または配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブを用いて検出するために使用され得る検出プラットフォームには、当業界で公知の均一または不均一方法が含まれる。均一検出プラットフォームの例は、標的配列の存在下でシグナルを発するプローブに結合させた蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer)（ＴＲＥＴ）標識の使用を含み得る。前記標識にはフルオレセイン及びｄａｂｃｙｌが含まれるが、これらに限定されない。核酸配列を均一に検出するために使用され得る方法の例は、（援用により本明細書に含まれるとする）米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されている所謂ＴａｑＭａｎアッセイ及び（援用により本明細書に含まれるとする）米国特許第５，９２５，５１７号明細書に記載されている分子ビーコンプローブ及びアッセイである。更に、前記プラットフォームは増幅産物の産生をリアルタイムに検出するために使用され得る。使用する特定検出プラットフォームに従って使用するのに適するようにプローブを修飾し得ると理解されたい。
【００２１】
増幅反応の完了後増幅反応の産物を分子量マーカーを用いて検出するために、例えばゲル電気泳動が使用され得る。しかしながら、増幅産物は標識プローブ及び固体支持体を用いて不均一に検出され得る。増幅された標的配列の検出方法は、（ａ）標的配列に対して相補的な核酸配列に対して少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（例えば、配列番号４及び５）をハイブリダイズして、プローブ及びそのプローブに対して相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成する段階、及び（ｂ）前記ハイブリッドを試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出する段階を含み得る。
【００２２】
上記のように形成されたハイブリッドは、該ハイブリッドを分離、検出するために使用され得る微粒子及び標識を用いて検出され得る。好ましくは、検出は市販されているＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（商標）装置（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で使用されるプロトコルに従って実施される。
【００２３】
また、増幅した標的配列の検出方法は、（ａ）配列番号６、７、８または９の配列を有する核酸を含む分子ビーコンプローブを適当な条件下で標的配列または増幅産物と接触させる段階、及び（ｂ）標的または増幅産物の存在または量を測定するために分子ビーコンの発光スペクトルを観察する段階を含む。
【００２４】
他の実施態様において、配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブは増幅産物の存在または量を検出するためにも使用され得る。例えば、分子ビーコンプローブを増幅反応に添加することにより１つの反応で増幅産物の増幅及び検出を本質的に同時に実施することができる。別の実施態様では、増幅産物を単離した後配列番号６、７、８及び／または９を含む分子ビーコンプローブと接触させてもよい。
【００２５】
本明細書中、「標識」は検出され得る性質ないし特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等のように直接検出され得る。或いは、標識は例えば特異的結合メンバーのように間接的に検出され得る。直接検出可能な標識では、該標識を検出し得るように基質、トリガー試薬、光等のような追加成分が必要な場合がある。間接的に検出可能な標識を使用するときには、該標識は通常“コンジュゲート”と組合せて使用される。通常、コンジュゲートは直接的に検出可能な標識に結合またはカップリングさせた特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当業界で公知であり、その例には特異的結合メンバーの特異的結合性または標識の検出可能性を損なわない任意の化学的手段及び／または物理的手段が含まれ得る。本明細書中、「特異的結合メンバー」は、１つの分子が他方の分子に例えば化学的または物理的手段により特異的に結合する２種の分子という結合対のメンバーを意味する。抗原／抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対にはアビジンとビオチン；ハプテンとこのハプテンに対して特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素コファクターまたは基質と酵素；等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明で使用される分子ビーコンプローブは、少なくとも１つの標識を形成するために少なくとも２つの部分を含む。分子ビーコンは第１化学部分を含み、前記第１化学部分は第２化学部分にコンジュゲートした核酸または核酸アナログにコンジュゲートされている。例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＴｙａｇｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８（１９９６）、米国特許第５，１１９，８０１号明細書及び同第５，３１２，７２８号明細書を参照されたい。核酸または核酸アナログはそれ自体に結合してステム−ループ構造を形成し得、これにより第１化学部分は第２化学部分により近づく。密接しているときには、第１化学部分、第２化学部分またはこれらの化学部分の組合せは検出可能なシグナルを発生しないか、或いは標的または増幅産物に結合していないときの分子ビーコンの特徴である“非結合シグナル”を発する。第１化学部分及び第２化学部分がそれぞれ核酸配列の対向末端に位置していることが好ましいが、核酸内の内部位置に導入されていてもよい。
【００２７】
逆に、分子ビーコンが標的または増幅産物と接触すると、分子ビーコンプローブは標的及び／または増幅産物に結合する。分子ビーコンが標的または増幅産物に結合すると、分子ビーコンは分子ビーコンの第１化学部分及び第２化学部分を分離するコンフォメーションとなる。この分離状態で、分子ビーコンは“結合シグナル”を発し、このシグナルは“非結合シグナル”と区別され得る。結合シグナルは第１化学部分、第２化学部分またはその両方部分より発生し得るか、または非結合シグナルの不在であり得る。
【００２８】
第１化学部分及び第２化学部分は検出可能な適当な原子または分子部分であり得る。分子ビーコンプローブの第１化学部分及び第２化学部分の好ましい実施態様は適当な発蛍光団を含む。第１化学部分及び第２化学部分が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介してまたは衝突消光を介して相互作用し得ることが好ましい。
【００２９】
ＦＲＥＴは分子エルネギー移動の形態であり、これによりエネルギーはドナー分子とアクセプター分子間を通過する。ＦＲＥＴはある化合物の特性により生ずる。特定波長の光に暴露することにより励起されると、化合物は異なる波長で光（すなわち、蛍光）を発する。前記化合物は発蛍光団と称される。ＦＲＥＴにおいて、エネルギーはドナー分子（発蛍光団）とアクセプター分子間の長い距離にわたって非放射的に移動する。ドナーは光子を吸収してエネルギーをアクセプターに対して非放射的に移動する（Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１：３５３−３８８（１９９２）において検討）。
【００３０】
いずれの発蛍光団分子（すなわち、ドナーまたはアクセプター）をモニターするかに依存して、蛍光はエネルギーの移動により消光または強化される。２つの発蛍光団の励起及び発光スペクトルの共鳴重複によりエネルギーが移動し得る。エネルギー移動は物理的因子、例えば２つの発蛍光団間の方位及び距離にも依存する。共鳴エネルギー移動は当業界で公知であり、当業者は蛍光消光または強化のための適合対、並びに有用な励起及び蛍光検出波長を選択することができる。前記した発蛍光団について記載している米国特許第５，６９１，１４６号明細書、同第５，８７６，９３０号明細書、同第５，７２３，５９１号明細書、同第５，３４８，８５３号明細書、同第５，１１９，８０１号明細書、同第５，３１２，７２８号明細書、同第５，９６２，２３３号明細書、同第５，９４２，２８３号明細書及び同第５，８６６，３３６号明細書は援用により本明細書に含まれるとする。
【００３１】
発蛍光団がドナーまたはアクセプターであるかはその励起及び発光スペクトル及び対をなす発蛍光団の励起及び発光スペクトルにより定義される。例えば、ＦＡＭは４８８ｎｍの波長の光により最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍの光を発し、発光最大値は５２５ｎｍである。ＦＡＭはＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ（すべて５１４ｎｍで励起最大値を有する）と使用するのに適したドナー発蛍光団である。
【００３２】
ＦＲＥＴで通常使用されている分子には、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が含まれる。
【００３３】
本発明では非−ＦＲＥＴベースの分子ビーコンプローブが好ましい。その例には衝突消光対が含まれるが、これに限定されない。衝突消光対は援用により本明細書に含まれるとする米国特許第６，１５０，０９７号明細書に記載されている。
【００３４】
他の適当な標識は当業界で公知であり、標識がＦＲＥＴで使用されるかどうかに関係なく当業者により容易に選択され得る。
【００３５】
「固体支持体」は不溶性であるかまたはその後の反応で不溶性となる物質を指す。よって、固体支持体はラテックス、プラスチック、被覆プラスチック、磁気または非磁気金属、ガラス、シリコーン等であり得る。固体支持体の配置も多く当業者に公知であり、ビーズ、削り屑、粒、粒子、プレートまたはチューブが意図されるが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの態様によれば、検出を容易とすべくプライマー及び／またはプローブに標識を含有させることによりハイブリッドを検出し得る。よって、ハイブリッドを例えばミクロ粒子に固定化し、ミクロ粒子上のハイブリッドの存在をコンジュゲートを用いて検出するために、プライマー及びプローブに結合させた第１及び第２特異的結合メンバーを使用し得る。
【００３７】
別の実施態様によれば、特異的結合メンバー及び直接検出可能な標識の組合せをハイブリッドを検出するために使用され得る。例えば、特異的結合メンバーを該特異的結合メンバーで標識したプライマーを用いてハイブリッドに導入し得る。直接検出可能な標識を、直接検出可能な標識で標識したプローブを用いてハイブリッドに導入し得る。よって、ハイブリッドは特異的結合メンバーを用いてミクロ粒子に固定化し、プローブ上の標識に基づいて直接検出され得る。他の検出構成が当業者の設計事項であると理解されたい。
【００３８】
好ましい実施態様によれば、援用により本明細書に含まれるとする１９９５年８月１４日に出願された米国特許出願第０８／５１４，７０４号明細書に記載されている“オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲ”（本明細書では別名“ＯＨ ＰＣＲ”）増幅反応を標的配列を検出するために使用する。簡単に説明すると、好ましい方法で使用される試薬は少なくとも１つの増幅プライマー及び少なくとも１つの内部ハイブリダイゼーションプローブ、及び増幅反応を実施するための増幅試薬を含む。プライマー配列は標的配列（またはその補体）のコピーをプライム伸長するために使用され、捕捉標識または検出標識で標識される。プローブ配列はプライマー配列により作成した配列とハイブリダイズさせるために使用され、通常プライマー配列を含まない配列とハイブリダイズさせる。プライマー配列と同様に、プライマーを捕捉標識で標識したときにはプローブを検出標識で標識するかまたはその逆とするようにプローブ配列も捕捉標識または検出標識で標識する。検出標識は上で定義した“標識”と同じ定義を有し、“捕捉標識”は通常他の増幅反応物から伸長産物及びその産物に関連するプローブを分離するために使用される。（上に定義したように）特異的結合メンバーはこの目的に十分適している。この方法に従って使用されるプローブがハイブリダイゼーション条件下で伸長しないように前記プローブの３’末端はブロックされていることが好ましい。プローブの伸長の防止方法は公知であり、当業者の選択事項である。通常、プローブの３’末端にホスフェート基を付加すればプローブの伸長は十分阻止される。
【００３９】
プローブが当初反応混合物の一部である上記した好ましい実施態様によれば、反応混合物を増幅条件下に置いたときに標的配列またはその補体の複数のコピーがプローブのＴｍ以上の温度で生ずるようにプローブ配列がプライマー配列よりも低い融点を有するようなプライマー、プローブ及び増幅条件を選択することが好ましい。前記コピーを合成した後には、そのコピーを変性させ、混合物を冷却するとプローブと標的配列またはその補体のコピーの間でハイブリッドが形成され得る。温度を変性温度からプローブが一本鎖コピーに結合する温度まで下げる速度は非常に迅速（例えば、８〜１５分間）であることが好ましく、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー伸長のために活性である温度範囲を通過することが特に好ましい。迅速な冷却は、プライマー／コピー配列ハイブリダイゼーション及び伸長よりもむしろコピー配列／プローブハイブリダイゼーションにとって好ましい。
【００４０】
以下、本発明を更に説明するために実施例を提示するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００４１】
下記実施例では、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の一ヌクレオチド多型の本発明のＤＮＡオリゴマープライマー及びプローブを用いる検出を立証する。前記ＤＮＡプライマー及びプローブは配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５として、更に配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含むＦＡＭ及びｄａｂｃｙｌ含有分子ビーコンプローブとして同定される。β−２アドレナリン受容体遺伝子からの代表的配列の一部を本明細書中配列番号１として示す。
【００４２】
下記実施例では、配列番号２及び配列番号３を野生型及び変異体β−２アドレナリン受容体遺伝子の一部に特異的な増幅プライマーとして使用する。配列番号４は、β−２アドレナリン受容体遺伝子増幅産物の野生型対立遺伝子を検出する内部ハイブリダイゼションプローブである。配列番号５は、β−２アドレナリン受容体増幅産物の変異体（ミュータント）対立遺伝子を検出する内部ハイブリダイゼションプローブである。また、配列番号６及び配列番号７は野生型対立遺伝子に特異的な分子ビーコンプローブとなり、配列番号８及び配列番号９はβ−２アドレナリン受容体遺伝子または遺伝子増幅産物の変異体に特異的な分子ビーコンプローブとなる。
【実施例１】
【００４３】
β−２アドレナリン受容体遺伝子プライマー及びプローブの作成
Ａ．β−２アドレナリン受容体プライマー
プライマーは、β−２アドレナリン受容体遺伝子の野生型及び変異体（ミュータント）対立遺伝子を両方含む標的配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲにより結合、増幅させるように設計した。これらのプライマーは配列番号２及び配列番号３であった。プライマー配列を一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。更に、配列番号３を、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４２４，４１４号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学により５’末端でカルバゾールを用いてハプテン処理した。
【００４４】
Ｂ．野生型及びミュータントβ−２アドレナリン受容体プローブ
プローブは、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の野生型または変異体（ミュータント）対立遺伝子の増幅標的配列と、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズするように設計した。野生型対立遺伝子に対するプローブは配列番号４であり、変異型（ミュータント）対立遺伝子に対するプローブは配列番号５であった。プローブ配列を一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。配列番号４を、５’末端でアダマンタンを用いてハプテン処理した後１０チミジンを付加し、３’末端をホスフェートでブロックした。配列番号５を、５’末端でダンシルを用いてハプテン処理した後１０チミジンを付加し、３’末端をホスフェートでブロックした。全ての合成は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学を用いた。
【００４５】
Ｃ．野生型及びミュータントβ−２アドレナリン受容体分子ビーコンプローブ
分子ビーコンプローブは、β−２アドレナリン受容体遺伝子中の野生型または変異体（ミュータント）対立遺伝子の増幅標的配列と、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズするように設計した。野生型対立遺伝子に対するプローブは配列番号６及び配列番号７のヌクレオチド配列から構成され、変異体対立遺伝子に対するプローブは配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列から構成した。プローブ配列を３’ｄａｂｃｙｌを結合させた調整ポアガラス（ＣＰＧ）の使い捨てプレ充填カラムを用いて一般的なオリゴヌクレオチド合成法により合成し、５’末端をＦＡＭで停止した。全ての合成は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書に記載されている一般的なシアノエチルホスホラミダイトカップリング化学を用いた。
【実施例２】
【００４６】
β−２アドレナリン受容体多型の検出
Ａ．一般的手順
ＤＮＡを、全血からＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（２００μｌ以下のサンプルに対して）またはＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉキット（２００μｌ〜１０ｍｌのサンプル容量に対して）（両キットともカリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎから市販）を製造業者の指示に従って用いて抽出した。全てのサンプルの遺伝子型を配列決定により確認した。これにより、サンプルは本試験で調べるβ−２アドレナリン受容体遺伝子対立遺伝子でホモ接合性野生型、ホモ接合性ミュータントまたはヘテロ接合性として同定され得た。幾つかの場合では、精製ＤＮＡを２６０ｎＭでの光の吸光度により定量した。
【００４７】
上記サンプルからのＤＮＡを、実施例１で作成した配列番号２及び配列番号３プライマー及び配列番号４（野生型）及び配列番号５（ミュータント）プローブを用いてＰＣＲ増幅し、検出した。
【００４８】
ＰＣＲは、５０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）（ｐＨ８．１）、１５０ｍＭ 酢酸カリウム、０．１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸、０．０２％ ナトリウムアジド、０．００１％ ウシ血清アルブミン及び８％（ｗ／ｖ） グリセロールを含有する１×ＰＣＲ緩衝液中で実施した。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを５単位／反応の濃度で、それぞれ１５０μＭの最終濃度で存在させたｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）と共に使用した。配列番号２及び配列番号３プライマー及び配列番号４野生型プローブはそれぞれ１１０ｎＭの濃度で使用し、配列番号５ミュータントプローブは５０ｎＭの濃度で使用した。最終濃度３．２５ｍＭの塩化マンガンも反応混合物中に存在させた。反応物の総容量は０．２ｍｌで、サンプル容量は２０μｌとした。
【００４９】
反応混合物をＬＣｘ（登録商標）サーマルサイクラーを用いて増幅した。まず、反応混合物を最初９７℃において２分間インキュベートした後、９４℃×４０秒間、５５℃×４０秒間及び７２℃×４０秒間のＰＣＲ増幅サイクルを４５回実施した。反応混合物を熱サイクルにかけた後、混合物を９７℃において５分間維持し、温度を１２℃に急速に下げることによりプローブオリゴハイブリダイゼーションを達成した。反応プローブを分析し、検出するまでサンプルを１２℃において最低でも１０分間保持した。
【００５０】
反応産物をＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。反応産物を捕捉し、検出するために抗−カルバゾール被覆微粒子、抗−アダマンタン抗体／アルカリホスファーゼコンジュゲート及び抗−ダンシル抗体／β−ガラクトシダーゼコンジュゲート（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）の懸濁液をＬＣｘ（登録商標）と一緒に用いた。使用した酵素基質は４−メチル−ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）及び７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシクマリン−４−酢酸−（２−ヒドロキシエチル）アミド（ＡＵＧ）であり、基質の反応産物への変換速度を測定し、カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として報告した。
【００５１】
Ｂ．標的ＤＮＡ滴定
配列決定により明らかとなった３遺伝子型（ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性ミュータント）のそれぞれからのＤＮＡをサンプル中の異なる量のＤＮＡ（２５〜５００ｎｇ／反応）を用いて上記した手順により単離し、定量し、試験した。
【００５２】
この試験の結果を表１に示す。この結果から、野生型プローブはホモ接合性野生型及びヘテロ接合性β−２アドレナリン受容体遺伝子型の両方を検出したが、ホモ接合性ミュータントβ−２アドレナリン受容体遺伝子型をポジティブとして検出しなかったことが分かる。ミュータントプローブはホモ接合性ミュータント及びヘテロ接合性β−２アドレナリン受容体遺伝子型の両方を検出したが、ホモ接合性野生型β−２アドレナリン受容体遺伝子型をポジティブとして検出しなかったことが分かる。予想したように、いずれのプローブも１つの野生型及び１つの変異体（ミュータント）対立遺伝子を含んでいるので、ヘテロ接合性サンプルを検出した。更に、プローブが適当なホモ接合性サンプル中に存在する２対立遺伝子よりもかなり反応する１つの対立遺伝子しか有していないので、ヘテロ接合性サンプルのＬＣｘ反応速度はホモ接合性サンプルのＬＣｘ反応速度のほぼ半分であった。よって、全てのプローブが優れた特異性を示した。ポジティブサンプルはすべて少なくとも２５ｎｇ／反応のＤＮＡまで低濃度でも検出可能であった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
Ｃ．未知サンプルの遺伝子型測定
上記Ａに記載した手順を用いて、２０サンプルのβ−２アドレナリン受容体遺伝子型を測定した。この結果を配列決定により調べた結果と比較した。
【００５５】
表２から分かるように、サンプルは野生型プローブ（ホモ接合性野生型）のみ、ミュータントプローブ（ホモ接合性ミュータント）のみ、または両プローブ（ヘテロ接合性）と明らかに反応した。これらの結果は配列決定により立証された。すなわち、ＬＸｃフォーマットで上記プライマー及びプローブを用いて、この方法は実施が簡単でありながら、配列決定と同じくらい正確にβ−２アドレナリン受容体の遺伝子型が調べられる。
【００５６】
【表２】
【実施例３】
【００５７】
分子ビーコンプローブを用いるβ−２アドレナリン受容体多型の検出
全血から単離したＤＮＡ（１２５ｎｇ）から正プライマーとして配列番号２（３００ｎＭ）及び逆プライマーとして配列番号３（３００ｎＭ）を用いるＰＣＲ反応により標準及び未知単位複製配列を作成した。ポリメラーゼ連鎖反応は、５０ｕｌの総容量でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの０．２ｍｌマイクロＡＭＰ（商標）チューブ中で実施した。１×ＰＣＲ緩衝液は３ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ類（２００ｕＭの最終濃度）、０．０２５Ｕ／μｌ（５単位） ＡＴ Ｇｏｌｄ（商標）、６０ｎＭ ＲＯＸ及び２００ｎＭ 配列番号６または配列番号９の核酸成分を有する分子ビーコンプローブを含んでいた（配列番号６及び９を含む分子ビーコンは配列番号７及び８を含む分子ビーコンよりも高性能であることが判明した）。まず、反応混合物を９５℃において１０分間インキュベートした後熱サイクルに４５回かけた。熱サイクルは、９４℃で３０秒間の溶融、５５℃で５０秒間のアニーリング及びデーター測定及び７２℃で３０秒間の伸長とした。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｍｓの参照染料ＲＯＸを用い、７７００ ＡＢＩ配列検出システム（商標）を用いて蛍光を測定した。
【００５８】
各サンプルにポリメラーゼ連鎖反応を３回かけた。各反応の第１回は分子ビーコンプローブの代わりに水を用いて実施した。第２回はＦＡＭ−配列番号６−ｄａｂｃｙｌからなる分子ビーコンプローブを用いて実施した。第３回はＦＡＭ−配列番号９−ｄａｂｃｙｌからなる分子ビーコンプローブを用いて実施した。標準サンプル及び未知サンプルの同一性をＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認した。野生型配列に対してホモ接合性の各サンプルは配列番号６からなる分子ビーコンプローブの存在下で強い蛍光を示し、配列番号６からなる分子ビーコンプローブの代わりに水または配列番号９からなる分子ビーコンプローブを使用したときには本質的に蛍光を示さなかった。逆に、変異体配列に対してホモ接合性の各サンプルは配列番号９からなる分子ビーコンプローブの存在下で強い蛍光を示し、配列番号９からなる分子ビーコンプローブの代わりに水または配列番号６からなる分子ビーコンプローブを使用したときには本質的に蛍光を示さなかった。同様に、ヘテロ接合性サンプルでは、各分子ビーコンプローブを含む反応において中程度の蛍光が観察された。
【００５９】
いずれの場合も、約２８または３０サイクル後蛍光が検出され、約３５サイクルまでベースライン蛍光から容易に区別され得た。
【００６０】
特定実施態様を参照して本発明を詳細に説明してきたが、前記実施態様に対して各種変化及び修飾を本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得ることは当業者に自明である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を有する標的配列を増幅および検出するための組成物であって、標的配列を検出するための分子ビーコンプローブを含み、前記分子ビーコンプローブは配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含むことを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
更に、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）核酸増幅試薬、配列番号２のヌクレオチド配列を有する核酸、配列番号３のヌクレオチド配列及び標的配列を含んでいると疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成する段階、
（ｂ）前記混合物を増幅条件にかけて増幅産物を生成する段階、
（ｃ）前記増幅産物を配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含む分子ビーコンプローブと接触させて、前記分子ビーコンプローブにより標的配列の存在を示すシグナルを発生させる段階、及び
（ｄ）前記ビーコンプローブにより発生したシグナルを試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出する段階
を含むことを特徴とする試験サンプル中の標的配列の検出方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号２及び配列番号３、（ｂ）増幅試薬、及び（ｃ）配列番号６及び配列番号８からなる群から選択される分子ビーコンプローブを含むことを特徴とするβ２アドレナリン受容体標的配列を増幅および検出するためのキット。
【請求項１】
β２アドレナリン受容体遺伝子のコドン１６における多型を有する標的配列を増幅および検出するための組成物であって、標的配列を検出するための分子ビーコンプローブを含み、前記分子ビーコンプローブは配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含むことを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
更に、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）核酸増幅試薬、配列番号２のヌクレオチド配列を有する核酸、配列番号３のヌクレオチド配列及び標的配列を含んでいると疑われる試験サンプルを含む反応混合物を形成する段階、
（ｂ）前記混合物を増幅条件にかけて増幅産物を生成する段階、
（ｃ）前記増幅産物を配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸及び標識部分を含む分子ビーコンプローブと接触させて、前記分子ビーコンプローブにより標的配列の存在を示すシグナルを発生させる段階、及び
（ｄ）前記ビーコンプローブにより発生したシグナルを試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出する段階
を含むことを特徴とする試験サンプル中の標的配列の検出方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号２及び配列番号３、（ｂ）増幅試薬、及び（ｃ）配列番号６及び配列番号８からなる群から選択される分子ビーコンプローブを含むことを特徴とするβ２アドレナリン受容体標的配列を増幅および検出するためのキット。
【公開番号】特開２００９−２６１４０６（Ｐ２００９−２６１４０６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５４６１４（Ｐ２００９−１５４６１４）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【分割の表示】特願２００３−５３４６１１（Ｐ２００３−５３４６１１）の分割
【原出願日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【分割の表示】特願２００３−５３４６１１（Ｐ２００３−５３４６１１）の分割
【原出願日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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