γ−ラクトンの立体選択的合成
【課題】（Ｒ）或いは（Ｓ）−γ−ラクトンの立体選択的調製法。
【解決手段】γ−ラクトンを微生物により生合成することであって、該生合成は、Ｃ５からＣ２０の脂肪酸から選択された基質の、Ｃ４における立体選択的なヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株、特に、アスペルギルス属或いはモルティエレラ属の株を使用して行われる。また、上記γ−ラクトンの生合成、並びにその香料への使用及び食品用香料への使用も開示される。
【解決手段】γ−ラクトンを微生物により生合成することであって、該生合成は、Ｃ５からＣ２０の脂肪酸から選択された基質の、Ｃ４における立体選択的なヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株、特に、アスペルギルス属或いはモルティエレラ属の株を使用して行われる。また、上記γ−ラクトンの生合成、並びにその香料への使用及び食品用香料への使用も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−ラクトン類、特に天然のγ−ラクトン類の立体選択的合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「天然」物は一般に、社会的に高い評価を受けており、その結果、芳香性或いは着臭性化合物を使用する業界は「天然の」芳香性成分及び芳香性物質の開発に注力している。自然界で同定された物質のみがこの「天然の」という表示を付することができ、それ故、これらの物質は現在のところ植物或いは微生物から製造されている。後者の利用はますます盛んになり、今や、生物工学的方法は天然の分子を手ごろな費用で合成することを可能にしている。これはγ−ラクトン類の場合にあてはまる。
【０００３】
γ−ラクトン類は多くの天然産物の芳香及び風味を構成する芳香性の分子である。例えば、γ−ヘプタラクトンはそのヘーゼルナッツ或いはカラメルの芳香と味を呈する物質として知られており、γ−ノナラクトンは脂肪、クリーム、或いはココナッツの芳香を有し、又γ−デカラクトン及びγ−ウンデカラクトンはモモ或いはアンズの芳香と味を有する。
【０００４】
γ−ラクトン類は、天然にはそれらの二つのエナンチオマー型である（Ｒ）体と（Ｓ）体とで存在するが、（Ｒ）体のエナンチオマーが優勢である。
【０００５】
γ−ラクトン類は合成により、或いは微生物による生合成によっても製造出来る。例えば、特許文献１はサッカロミセス セレビシエ、デバロミセス バンセニアイ、或いはカンディダ ボイディニアイ等の食品の製造において使用が許可されている微生物によるγ−ラクトン類の製造法を記述している。
【０００６】
特許文献２は、γ−オクタラクトン、特に、及びその（Ｒ）と（Ｓ）光学異性体がバターの香り及び風味の形成に使用出来ることを示唆し、光学活性のγ−オクタラクトン及び記載されている生物学的プロセスの副産物である種々の化合物の混合物を相当量添加することによって、消費され得る物質の芳香と風味を増大する方法を記載している。特許文献２に記載の方法は、カプリル酸を用いて、シンセファラストレイタム属或いはモルティエレラ属の株を使用する生合成によりγ−オクタラクトンの（Ｒ）及び（Ｓ）の二つの異性体を得ることが可能であることを示唆しているが、しかしながらこの方法は鏡像異性選択的ではない。
【０００７】
γ−ラクトン類は食品香料産業及び香水産業において大きな価値があり、実際、該産業の大部分の資金が、微妙に感覚刺激の異なる種々の製品の製造に投入されている。
【０００８】
揮発性分子のキラリティー（鏡像性）が臭覚に関する相違をもたらし得、又γ−ラクトン類の光学異性体がすべて同じ感覚刺激性の特性を持たないことが知られている。それ故に、γ−ラクトンの特定の光学異性体の製造が、特にこの製造が競争的なコストにおいて、少なくとも先行技術と同等に効率的な方法、或いは先行技術よりも更に効率的な方法に従って行われるならば、大いに有利である。
【０００９】
出願人の知る限りでは、γ−ラクトン類の天然のエナンチオマーを直接得るための立体選択的方法は現在存在しない。既知の方法では、エナンチオマーの混合物を製造し、所望のエナンチオマーの分離を通常、置換されたシクロデキストリンのキャピラリーカラムのクロマトグラフィーにより、或いは誘導体化後に行われる。
【特許文献１】欧州特許第３７１５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５１１２８０３号明細書
【特許文献３】米国特許第５４５７０３６号明細書
【特許文献４】欧州特許第５１９４８１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、本発明は効果的、経済的且つ立体選択的なγ−ラクトンの生物学的合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（Ｒ）−γ−ラクトン類及び（Ｓ）−γ−ラクトン類の両者の合成に関する。本合成において、（Ｒ）及び（Ｓ）はγ−ラクトンの４位の不斉炭素原子における配置を表す。
【００１２】
本発明の方法による合成に好適なγ−ラクトン類は、一般式（Ｉ）で表される本発明に係る炭素数５（Ｃ５）から炭素数２０（Ｃ２０）のγ−ラクトン類である。
【化１】
式中、ラクトン環は２位と３位の炭素の間に不飽和結合を有し、Ｒ１はＣ１−１６アルケニル基、Ｃ１−１６アルキニル基、或いはＣ１−１６アルキル基であって、５位以降の炭素原子の一つ以上が任意に置換されてよい。「置換されたアルケニル基又はアルキニル基又はアルキル基」という用語は、少なくとも１個の炭素原子が少なくとも一つの置換基で置換されたアルケニル基又はアルキニル基又はアルキル基を意味する。「置換基」という用語は、特に、水酸基、ケト基、チオール基、アルキル基、或いはアルケニル基を意味する。
【００１３】
それ故、本発明は、γ−ラクトンの立体選択的な調製法に関するものであり、γ−ラクトン、特に、前記一般式（Ｉ）のγ−ラクトンの微生物による生合成が行われ、前記ラクトン環が２位と３位の炭素の間に不飽和結合を有しうるが、好ましくは飽和結合であり、Ｒ１が任意に置換されてよいＣ１−１６アルケニル基、Ｃ１−１６アルキニル基又はＣ１−１６アルキル基であり、前記生合成が少なくとも一つの基質、好ましくは脂肪酸から、前記基質のＣ４位の立体選択的なヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株の微生物培養により実施されることを特徴とする。
【００１４】
本発明はγ−ラクトン類の生物学的調製、特に適切な微生物株の培養により、少なくとも一つの基質からの、γ−ラクトンの（Ｒ）或いは（Ｓ）光学異性体のいずれかの立体選択的生合成に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本調製法は以下の段階を含んでなる。
ａ） 適切な微生物株を選抜する段階、
ｂ） 前記微生物株を適切な培地で培養する段階であって、前記培養が任意に前記微生物株の前培養を伴う段階、
ｃ） γ−ラクトンに変換され得る基質を添加する段階、
ｄ） 前記基質をγ−ラクトンに生物学的に変換する段階、及び
ｅ） 産生されたγ−ラクトンを回収する段階。
【００１６】
本発明に係るγ−ラクトンの生合成に用いる、段階ａ）において適切な微生物株は、前記基質の特異的なヒドロキシル化を可能にする株である。本発明の好適な実施形態において、段階ａ）において本発明に係るγ−ラクトンの生合成に用いる適切な微生物株は、Ｃ４位において前記基質の特異的な立体選択的なヒドロキシル化を可能にする株である。このようにして、本発明に従い、炭素原子Ｃ４が（Ｒ）立体配置又は（Ｓ）立体配置にあるγ−ラクトン類が得られる。
【００１７】
前記生合成の結果として得られる生成物が食品産業において使用される場合には、食品用の微生物株が勿論好ましいことになる。立体選択的ヒドロキシル化を可能にするこれら微生物株としては、特にアスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール属、及びモルティエレラ属の微生物株が挙げられる。これらの株はすべて微生物クラス１に属し、その幾つかは食用株であるので、それらを使用してもラクトンの工業的生産、或いはその食品における使用に対して何ら特別の問題を起こすことはない。本発明の特定の実施形態において、使用される株はアスペルギルス属の株、好ましくはアスペルギルス オリゼーであり、以下の群の株：
アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６４、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １１４７、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ ６３３０３、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ ５７０．６５、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ ８１９．７２、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７、アスペルギルス オリゼー ＶＭＦ ８８０９３が挙げられる。
【００１８】
これらの株の中で、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１及びアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７が好ましい。
【００１９】
別の具体的な実施形態において、使用される微生物株は、モルティエレラ属の株であって、以下の群の種：
モルティエレラ イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＤＳＭＺ １４１４、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １９４．２８、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２０８．３２、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２４．３５、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ５６０．６３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １６７．８０、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ４９３．８３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ３０９．９３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２５０．９５、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １０９０７５、モルティエレラ ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ） ＣＢＳ １１２．０８、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ２１９．４７、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ２４３．５８、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ４７８．６３、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ８５２．７３、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ３６６．９５、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ １０１２２６が挙げられる。
【００２０】
事実、本発明者らは驚くべきことに、且つ予想外にも、アスペルギルス属のある株の使用により（Ｒ）γ−ラクトンが選択的に製造され、又モルティエレラ属のある株をの使用により（Ｓ）γ−ラクトンが選択的に製造されることを見出した。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、ヤロウイア リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、それらがＣ４位におけるヒドロキシル化をもたらす能力がないため、本発明から除外される。Ｃ４におけるヒドロキシル化を特異的、且つ選択的に行う能力のないすべての微生物株が本発明から除外されることが有利である。
【００２２】
何らかの理論によって拘束されることなく、前記微生物株を培養する条件が、観察された立体選択性に、又前記生物学的変換の定量的側面に重要であり得ることは予測出来る。
【００２３】
本発明に記載の方法の、段階ｂ）における培養は、例えば、適切な培地における、細胞増殖による微生物株の培養液、好ましくは半濃縮培養液の調製を含む。この培養では、予め前記微生物株の増殖の第一段階にとって適切な第一の培地において前記株の前培養を行ってもよい。
【００２４】
本発明の立体選択的プロセスに使用される培養条件は、結果として、封入体で（特にペルオキシソームで）満たされた隆起を示す菌糸の形成をもたらす条件でなければならない。本発明の好適な実施形態において、調製された細胞培養液は、分生胞子を持たず、これらの封入体（特にペルオキシソーム）で満たされた膨化した構造を示す分節したフィラメントからなる「コンポート」型の菌糸を有する。前記培養条件は実際、特に菌糸での胞子形成の防止に適切でなければならない。その上、発明者らは特に、本願明細書に記載された培養条件の使用によって得られる菌糸の生理的状態（封入体、特にペルオキシソームで満たされた隆起及び膨張を有する分節した菌糸）が、反応収量に少なからぬ影響を及ぼし得、先行技術における収量よりも大きな収量を得ることを可能にすることを見出した。菌糸体の生理的状態はまた、前記反応の立体選択性にも影響を与えうる。
【００２５】
すなわち、本発明の好適な実施形態において、本発明の方法の段階ｂ）は、封入体、特にペルオキシソームで満たされた隆起及び膨張を有する分節した菌糸を得るために適切な培地で微生物株を培養する段階である。本発明において使用される培養培地はペプトンを含まない方が有利である。本発明において使用される培地は、麦芽抽出物（麦芽エキス）及び／又は酵母抽出物（酵母エキス）を含むことが好ましい。好適な実施形態によれば、段階ｃ）に使用される菌糸は濃縮される。段階ｃ）に使用される菌糸体の濃度は、好ましくは培地１Ｌ当たり５ｇから１５ｇ、好ましくは６ｇから１２ｇ、非常に好ましくは７ｇから１０ｇである。
【００２６】
モルティエレラ株による（Ｓ）−γ−ラクトンの生成が、立体選択性及び収量に関して、前記のような、封入体で満たされて隆起した菌糸の使用により著しく促進されることが特に注目されていて、実際に、このような菌糸の使用により、絶対値において先行技術における生成物の旋光性よりも大きな旋光性を有する反応生成物を得ることができ、さらに、本発明に記載の方法によって、特に、上述のような封入体で満たされて隆起した菌糸の使用によって、先行技術における収量よりも大きな収量を得ることができる。
【００２７】
本方法の段階ｃ）は、細胞培養に基質を添加することである。本発明において、γ−ラクトンの生物学的合成には適切な基質が用いられる。
【００２８】
本発明の目的に鑑み、用語「適切な基質」は、少なくとも５個の炭素原子、好ましくは５から２０個の炭素原子を含み、５番目以遠の炭素原子の位置で任意に分枝し又は置換されている飽和又は不飽和直鎖脂肪酸、及び該脂肪酸のエステルを意味し、メチルエステル又はエチルエステルが好ましい。
【００２９】
好適な基質としては、γ−バレロラクトンを生成する炭素数５の酸であるバレリン酸、γ−ヘキサラクトンを生成する炭素数６の酸であるカプロン酸、γ−ヘプタラクトンを生成する炭素数７の酸であるエナント酸、γ−オクタラクトンを生成する炭素数８の酸であるカプリル酸、γ−ノナラクトンを生成する炭素数９の酸であるペラルゴン酸、γ−デカラクトンを生成する炭素数１０の酸であるデカン酸、γ−ウンデカラクトンを生成する炭素数１１の酸であるウンデカン酸、γ−ウンデセノラクトンを生成する炭素数１１の酸であるウンデシレン酸、γ−ドデカラクトンを生成する炭素数１２の酸であるラウリン酸、γ−テトラデカラクトンを生成する炭素数１４の酸であるミリスチン酸、γ−ヘキサデカラクトンを生成する炭素数１６の酸であるパルミチン酸、γ−ヘキサデセノラクトンを生成する不飽和の炭素数１６の酸であるパルミトレイン酸、γ−オクタデカラクトンを生成する炭素数１８の酸であるステアリン酸、γ−オクタデセノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるオレイン酸、γ−オクタデカジエノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるリノール酸、γ−オクタデカトリエノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるリノレン酸、及びγ−エイコサノラクトンを生成する炭素数２０の酸であるエイコサン酸、ならびにそれらのエステル、好ましくはそれらのエチルエステル又はメチルエステルが挙げられる。
【００３０】
希少ではあるが、炭素数１３、炭素数１５、炭素数１７及び炭素数１９の脂肪酸、ならびにそれらのエチル或いはメチルエステルを酸化し、それぞれ炭素数１３、炭素数１５、炭素数１７及び炭素数１９のγ−ラクトンを製造することも出来る。
【００３１】
前記基質がいかなる適切な基質又は種々の適切な基質の混合物、特に所定の酸及びその一つ以上のエステルの混合物であり得ることは言うまでもない。
【００３２】
本発明の有利な実施形態において、前記基質はバッチ培養、或いは流加培養により菌糸に蓄積される。好適な実施形態によれば、前記基質を、例えば油、特に大豆、トウモロコシ、ヒマワリの油のような何らかの通常の食物油、ミグリオールのような合成短鎖脂肪酸のトリグリセリド、好ましくは水素添加された、或いはオレイン酸に富むヒマワリ油等の助剤と混合し、基質を前記菌糸に接触させる前に添加する。助剤の存在は特に、前記基質の腐食性或いは毒性効果を大いに減少させることを可能にする。本発明の一実施形態によれば、モルティエレラ イサベリナ株を使用する本発明に記載の合成は、鉱物油を含まない培地で行われる。前記基質は１時間当たり、培地１Ｌ当たり０．３ｇ〜２．５ｇの濃度で添加するのが有利である。前記基質と混合される油、好ましくは植物油の量は、培地１Ｌ当たり１００ｇ〜５００ｇ、好ましくは培地１Ｌ当たり１５０ｇ〜３００ｇであることが有利である。
【００３３】
また、糖源、好ましくはグルコース源を基質と同時に培地に添加し、細胞のエネルギー需要が確実に賄われるようにする。添加するグルコースの濃度は、１時間に培地１Ｌ当たり０．３から０．４ｇであることが有利である。
【００３４】
ｐＨは、必要に応じて、基質添加の間、及びそれに続く生物学的変換の間、いかなる適当な塩基の添加によっても調節することが出来る。ｐＨは４．５〜８．５、好ましくは５．５〜８、好ましくは６〜７．５であることが有利である。
【００３５】
前記生物による変換の間、温度は２７〜３０℃に維持することが好ましい。前記生物学的変換を行う時間は３０〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間であってもよい。
【００３６】
本発明の方法の段階ｄ）における前記基質のγ−ラクトンへの生物学的変換は、前記微生物株によって行われる前記基質のＣ４位におけるヒドロキシル化反応が先に行われ、その後にラクトン化が行われる段階である。基質に対するこのヒドロキシル化を可能にするためには、酸素源が必要である。この酸素源は酸素を含む気体が好ましく、空気或いは酸素が極めて好ましい。前記気体は反応培地中に比較的大量に溶解される。
【００３７】
好適な実施形態によれば、先行技術において公知のように、消泡剤、特にシリコーン油或いは脂肪酸でエステル化されたポリエチレングリコールのポリマーを使用し、生物学的変換において生じうる泡沫の形成を制御する。
【００３８】
前記生物学的変換、即ちＣ４における特異的且つ立体選択的なヒドロキシル化、それに続くラクトン化が実施された後、本方法の段階ｅ）において、抽出によるγ−ラクトンの回収がおこなわれ、そのγ−ラクトンの抽出は適切な手段によって行われる。前記γ−ラクトンの抽出は水蒸気蒸留によって行われ、必要に応じて、未反応の基質をその後除去するためのエステル化を続いて行うことが有利である。
【００３９】
別法として、γ−ラクトンの抽出は、培地を酸性にした後、溶媒抽出によって行われる。
【００４０】
本発明の一変法によれば、本方法の段階ｅ）を行わず、代わりに段階ｅ’）を行う。この段階では、抽出前に、得られたγ−ラクトンをｉｎ ｓｉｔｕにて還元することによって段階ｄ）の最終プロセスを継続する。段階ｅ’）では、段階ｄ）で得られたγ−ラクトンの立体構造に依存して、より飽和した（Ｒ）−又は（Ｓ）−γ−ラクトンが得られる。
【００４１】
第一の実施形態によれば、前記還元は飽和ラクトンが得られるまで実施出来る。第二の実施形態によれば、前記還元を中止して、段階ｄ）の生物学的変換から誘導されるγ−ラクトンの側鎖よりも側鎖の不飽和結合が少ないγ−ラクトンが得られる。その他の実施形態によれば、本発明に記載の方法を段階ｄ）の最後まで継続し、一方で発酵槽のｐＨ調節を中止し、パン酵母、ワイン酵母、或いはビール酵母などの生きた乾燥酵母、及び糖源、特にグルコース源を培養装置に添加する。ｐＨが５．５に達する場合、適当な塩基、例えば水酸化ナトリウムでｐＨ５．５に調節する。前記混合物を好ましくは１２〜２４時間培養を続け、次いでγ−ラクトンを抽出する。別の変法によれば、段階ｄ）から得られるγ−ラクトンを、還元性の微生物、或いは少なくとも還元状態に置かれる微生物、例えば、サッカロミセス セレビシエ、ピキア エチェルシアイ、ピチア パストリス、ハンセヌラ ポリモルファ、枯草菌又はラクトバシラス ブレビスの新鮮培養によって還元出来る。
【００４２】
段階ｅ’）の還元により、段階ｄ）から得られるγ−ラクトンよりもさらに飽和したγ−ラクトンが生成される。この特異的な実施形態に従って得られるより飽和されたこれらのγ−ラクトンは４位に不斉炭素原子を有し、前記還元反応が前記分子の立体異性を修飾しないため、原料となる飽和度の低いγ−ラクトンと同じ立体配置を有する。
【００４３】
本発明の方法に従って得られるγ−ラクトンは、着臭剤及び風味剤としての特性を有するため、それらはすべての香料及び食品の風味付けへの用途、特に香水、着臭物質、又は化粧品若しくは食品組成物の製造に、又は食品添加物としての用途に使用出来る。
【００４４】
本発明において、用語「香料」は、この用語の通常の意味における香料のみならず、製品の匂いが重要である他の分野における香料をも意味する。前記用語の通常の意味における香料組成物としては、例えば芳香性の基剤及び濃縮物、オーデコロン、オードトワレ、香水及び類似の製品；局所用組成物、特に化粧用組成物（例えば、顔及び体につけるクリーム、タルカムパウダー、ヘアオイル、シャンプー、ヘアローション、浴用塩及び浴用油、シャワー用及び浴用ジェル、化粧石鹸、制汗剤及び脱臭剤、髭剃りローションとクリーム、石鹸、クリーム、歯磨き、うがい薬、軟膏及び類似の製品）；ならびにメンテナンス製品（例えば軟化剤、界面活性剤、粉末洗剤、空気消臭剤、及び類似の製品）が挙げられる。
【００４５】
用語「着臭剤」は匂いを発する化合物を指すのに使用される。
【００４６】
用語「食品への風味添加」は、本発明の化合物を使用してあらゆるヒト用或いは動物用の液状又は固体の食品、特に飲料水、酪農製品、アイスクリームに風味を添加することを意味する。
【００４７】
γ−ラクトンの（Ｒ）若しくは（Ｓ）エナンチオマー、又は（Ｒ）及び（Ｓ）エナンチオマーの混合物を香料組成物に使用し、異国風の、フローラル又はフルーティーな香気を付与出来る。本用途において、前記（Ｓ）エナンチオマー又は（Ｒ）エナンチオマー、あるいは当業者により決定された種々の比率における二つのエナンチオマーの混合物が使用される。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法によって得られたγ−ラクトンは、本発明によれば、それらが存在する組成物の総重量に対して０．００２５重量％〜１０重量％で使用される。これらのγ−ラクトンは固体又は液体の組成物、特にゲル、クリーム、軟膏及び／或いはスプレー用の組成物の製造に役立ち得る。
【００４９】
本発明の方法によって得られたγ−ラクトンは、本発明によれば、それ自身が着臭剤である組成物、又は前記着臭剤が一定の臭気の遮断又は中和に使用される組成物に使用出来る。
【００５０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下に示す実施例の参照により明らかになると思われるが、これらの実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００５１】
段階ａ − 微生物株の選抜
すべての微生物保存株（コレクション）を先ずＭＧＹ寒天培地に植菌し、２７℃で７２時間培養し、これらの株を続いて１００ｍｌの１×の麦芽培地を含む１Ｌ容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、２７℃で２４時間培養した。基質であるウンデシレン酸を次いで培地に添加し（１０回添加、培地１Ｌ当たり５ｇ）、さらに４８時間から１２０時間、２７℃で培養を継続した。
【００５２】
培地中のγ−ウンデセノラクトンを嗅覚により感知し、濃度を分析した後、最適な株を選抜した。モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１とアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７株を選抜し、それらの株をその後培養槽における最適化試験に使用した。
【００５３】
段階ｂ 細胞培養の調製
モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１又はアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７株（元株は−８０℃で試験管中に凍結保存した株）をＭＧＹ寒天上に植菌し、２７℃で３０時間培養した。
【００５４】
前記の前培養液を、６Ｌ容の培養槽内の１×麦芽培地５Ｌに植菌した。
麦芽エキス １６５ｇ
酵母エキス ２５ｇ
適量の水 ５Ｌ
ｐＨ ６．５
【００５５】
モルティエレラ イサベリナ
２７℃、１分間に５００回転の回転数、培地１Ｌ当たり３．５Ｌ／１時間の空気供給、ｐＨ調整なし、３０時間、の条件で培養を行った。
【００５６】
アスペルギルス オリゼー
２０℃、５００ｒｐｍの回転数、０．０５ｖｖｍの空気供給、ｐＨ調整なしで３０時間培養を行い、次いで２５℃、５００ｒｐｍの回転数、０．０５ｖｖｍの空気供給、ｐＨ調整なしで２４時間培養を行った。両方の場合において、封入体（ペルオキシソームを含む）で満たされた多数の大きな膨張を含む菌糸を得た。
【００５７】
次いで、１２５Ｌの１．５×麦芽培地を３００Ｌ容の培養槽に調製した。
麦芽エキス ６．１８８ｋｇ
酵母エキス ０．９３８ｋｇ
適量の水 １２５Ｌ
【００５８】
前記培地を１２１℃で４０分間滅菌した。前記培養槽及びその部品を滅菌、加圧処理した。温度を２７℃に調節した。加圧し、１時間当たり培地１Ｌ当たり３．５Ｌ、即ち凡そ０．６ｍ３／ｈの通気速度を維持した。塩基（１０Ｎ ＮａＯＨ）、酸（８５％のリン酸（Ｈ３ＰＯ４））、消泡剤及び接種材として役立つ６Ｌ容の発酵糟を無菌状態で寄せ集めた。撹拌速度を３２５ｒｐｍに調節し、消泡剤の滴下を開始し、次いで接種材料（５Ｌ）をｐＨ調整なしで接種した。撹拌速度を３２５ｒｐｍに維持し、通気を２．２ｍ３／ｈ（０．３ｖｖｍ）に増加させた。菌の増殖を２４時間継続させ、乾燥重量ベースで培地１Ｌ当たり凡そ１０ｇの菌糸を得た。この菌糸は「コンポート」型の菌糸で、胞子を持たない多数の膨張と隆起を含むフィラメントから構成されているはずである。
【実施例２】
【００５９】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるラウリン酸の変換
菌糸の量と品質を確保した後、基質（ラウリン酸）をミグリオールに添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で５５時間にわたり添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７に調節した。回転速度を９００ｒｐｍに増加し、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速とした。前記変換を５５時間実施した。培地１Ｌ当たり１２ｇの収量で（Ｓ）−γ−ドデカラクトンを得た。比較のため、特許文献３（Ｈａｎ）の教示に従い、特許文献３に記載のモルティエレラ属の株を用いてγ−ドデカラクトンを調製した。
【００６０】
前記Ｈａｎの方法が使用される場合、収量は培地１Ｌ当たり４〜６．５ｇのオーダーであるが、それと比較し、本発明の方法では封入体で膨張した「コンポート」菌糸を用いた場合、収量は培地１Ｌ当たり１２〜１５ｇのオーダーであった。
【実施例３】
【００６１】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるカプリル酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、基質（カプリル酸）を０．７５ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。回転速度を６００ｒｐｍに増加させ、通気を３．５Ｌ／分の流速とした。前記変換を４８〜７４時間実施した。培地１Ｌ当たり１５〜２５ｇ、一般には培地１Ｌ当たり凡そ９ｇの収量で（Ｓ）−γ−オクタラクトンを得た。
【００６２】
比較のため、特許文献４（Ｆａｒｂｏｏｄ）の教示に従い、特許文献４に記載のモルティエレラ属の株を用いてγ−オクタラクトンを調製した。前記ファーブッドの方法に従って得られる生成物の旋光性は−２８°であって、このことは本生成物が（Ｒ）と（Ｓ）エナンチオマーの混合物であり、（Ｓ）エナンチオマーがごく僅かに優勢であることを意味している。本発明の方法に従って得られる生成物の旋光性は−４２°であって、このことは（Ｓ）−γ−ラクトンが選択的に生成されることを示すものである。
【００６３】
前記Ｆａｒｂｏｏｄの方法が使用される場合、得られる収量は培地１Ｌ当たり７．５〜１０ｇのオーダーであるが、それと比較し、本発明の方法では封入体で膨張した「コンポート」菌糸体を用いた場合、収量は１Ｌ当たり１５〜２５ｇのオーダーであった。
【実施例４】
【００６４】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるカプロン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、基質（カプロン酸）を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。回転速度を６００ｒｐｍに増加させ、通気を３．５Ｌ／分の流速とした。前記変換を４８〜７４時間実施した。（Ｓ）−γ−ヘキサラクトンを培地１Ｌ当たり６ｇの収量で得た。
【実施例５】
【００６５】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるウンデシレン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデシレン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計で培地１Ｌ当たり４０ｇ添加した。このウンデシレン酸は水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加したため、この油は０．９ｇ／Ｌ／ｈの流速、次いで１．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加された。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した。回転速度を５０５ｒｐｍに増加させ、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を７２時間実施した。
【００６６】
立体配置が（Ｓ）型のγ−ウンデセノラクトンが培地１Ｌ当たり６．５ｇ生成された。
【実施例６】
【００６７】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるウンデカン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデカン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で３．５時間、次いで０．７５ｇ／Ｌ／ｈの流速で３．５時間、次いで１ｇ／Ｌ／ｈの流速で４８時間添加した。このウンデカン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で２４時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した。回転速度を５０５ｒｐｍに増加させ、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を４８時間実施した。
【００６８】
立体配置が（Ｓ）のγ−ウンデカラクトンが培地１Ｌ当たり１９ｇ生成された。
【実施例７】
【００６９】
段階ｃ及びｄ アスペルギルス属の株によるウンデシレン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデシレン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計培地１Ｌ当たり４０ｇ添加した。このウンデシレン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。通気を０．５ｖｖｍ、即ち６ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を８０時間実施した。立体配置が（Ｒ）のγ−ウンデセノラクトンが培地１Ｌ当たり０．５ｇ生成された。
【実施例８】
【００７０】
段階ｃ及びｄ アスペルギルス属の株によるカプロン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、カプロン酸を１．６４ｇ／Ｌ／ｈの流速で２４時間、次いで２ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計培地１Ｌ当たり１８３ｇ添加した。このカプロン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物として（１／２部の酸：１／２部の油）配合される。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。通気を０．５ｖｖｍ、即ち６ｍ３／ｈの流速で行った。７２時間〜９６時間後、立体配置が（Ｒ）のγ−ヘキサラクトンが培地１Ｌ当たり１５ｇ生成された。
【実施例９】
【００７１】
段階ｅ 抽出−精製
３Ｌの８５％リン酸を用い、ｐＨ１．５に酸性化した。１００℃以上で３０分間加熱を行い、前記ラクトンを本質的にその閉環型とし、開環したヒドロキシ酸型ではないようにした。前記ラクトンを定量して抽出溶媒（好ましくはシクロヘキサン）を添加し、その混合物を常温で１時間攪拌した。遠心分離を行って有機層を回収した。ラクトンを定量した。溶媒を濃縮し、油状の「粗製品」を得た。減圧蒸留を行った。「樹脂を除かれた」ラクトンと排油を得た。次に前記ラクトンを減圧下に分留することによって精製を行う。純度９９％以上の生成物が得られ、同生成物は、モルティエレラ属の株を使用した場合はγ−ウンデセノラクトン（９９％以上が（Ｓ）異性体）であり、又はアスペルギルス種の株を使用した場合はγ−ウンデセノラクトン（９９％以上が（Ｒ）異性体）であった。
【００７２】
（Ｒ）又は（Ｓ）型のγ−ウンデセノラクトン、又は（Ｒ）及び（Ｓ）型の混合物、並びに（Ｒ）又は（Ｓ）型のγ−ウンデカラクトン、又は（Ｒ）及び（Ｓ）型の混合物は、組成物の着香に使用でき、エキゾチックな、フローラルな、又はフルーティーな香気を付与することが出来、更に出願人はγ−ウンデセノラクトンに関し「トロピカロン（登録商標）」を商標登録した。その用途により、前記（Ｓ）エナンチオマー又は前記（Ｒ）エナンチオマー、あるいは両エナンチオマーの当業者によって決定された割合の混合物が使用されることとなる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−ラクトン類、特に天然のγ−ラクトン類の立体選択的合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「天然」物は一般に、社会的に高い評価を受けており、その結果、芳香性或いは着臭性化合物を使用する業界は「天然の」芳香性成分及び芳香性物質の開発に注力している。自然界で同定された物質のみがこの「天然の」という表示を付することができ、それ故、これらの物質は現在のところ植物或いは微生物から製造されている。後者の利用はますます盛んになり、今や、生物工学的方法は天然の分子を手ごろな費用で合成することを可能にしている。これはγ−ラクトン類の場合にあてはまる。
【０００３】
γ−ラクトン類は多くの天然産物の芳香及び風味を構成する芳香性の分子である。例えば、γ−ヘプタラクトンはそのヘーゼルナッツ或いはカラメルの芳香と味を呈する物質として知られており、γ−ノナラクトンは脂肪、クリーム、或いはココナッツの芳香を有し、又γ−デカラクトン及びγ−ウンデカラクトンはモモ或いはアンズの芳香と味を有する。
【０００４】
γ−ラクトン類は、天然にはそれらの二つのエナンチオマー型である（Ｒ）体と（Ｓ）体とで存在するが、（Ｒ）体のエナンチオマーが優勢である。
【０００５】
γ−ラクトン類は合成により、或いは微生物による生合成によっても製造出来る。例えば、特許文献１はサッカロミセス セレビシエ、デバロミセス バンセニアイ、或いはカンディダ ボイディニアイ等の食品の製造において使用が許可されている微生物によるγ−ラクトン類の製造法を記述している。
【０００６】
特許文献２は、γ−オクタラクトン、特に、及びその（Ｒ）と（Ｓ）光学異性体がバターの香り及び風味の形成に使用出来ることを示唆し、光学活性のγ−オクタラクトン及び記載されている生物学的プロセスの副産物である種々の化合物の混合物を相当量添加することによって、消費され得る物質の芳香と風味を増大する方法を記載している。特許文献２に記載の方法は、カプリル酸を用いて、シンセファラストレイタム属或いはモルティエレラ属の株を使用する生合成によりγ−オクタラクトンの（Ｒ）及び（Ｓ）の二つの異性体を得ることが可能であることを示唆しているが、しかしながらこの方法は鏡像異性選択的ではない。
【０００７】
γ−ラクトン類は食品香料産業及び香水産業において大きな価値があり、実際、該産業の大部分の資金が、微妙に感覚刺激の異なる種々の製品の製造に投入されている。
【０００８】
揮発性分子のキラリティー（鏡像性）が臭覚に関する相違をもたらし得、又γ−ラクトン類の光学異性体がすべて同じ感覚刺激性の特性を持たないことが知られている。それ故に、γ−ラクトンの特定の光学異性体の製造が、特にこの製造が競争的なコストにおいて、少なくとも先行技術と同等に効率的な方法、或いは先行技術よりも更に効率的な方法に従って行われるならば、大いに有利である。
【０００９】
出願人の知る限りでは、γ−ラクトン類の天然のエナンチオマーを直接得るための立体選択的方法は現在存在しない。既知の方法では、エナンチオマーの混合物を製造し、所望のエナンチオマーの分離を通常、置換されたシクロデキストリンのキャピラリーカラムのクロマトグラフィーにより、或いは誘導体化後に行われる。
【特許文献１】欧州特許第３７１５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５１１２８０３号明細書
【特許文献３】米国特許第５４５７０３６号明細書
【特許文献４】欧州特許第５１９４８１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、本発明は効果的、経済的且つ立体選択的なγ−ラクトンの生物学的合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（Ｒ）−γ−ラクトン類及び（Ｓ）−γ−ラクトン類の両者の合成に関する。本合成において、（Ｒ）及び（Ｓ）はγ−ラクトンの４位の不斉炭素原子における配置を表す。
【００１２】
本発明の方法による合成に好適なγ−ラクトン類は、一般式（Ｉ）で表される本発明に係る炭素数５（Ｃ５）から炭素数２０（Ｃ２０）のγ−ラクトン類である。
【化１】
式中、ラクトン環は２位と３位の炭素の間に不飽和結合を有し、Ｒ１はＣ１−１６アルケニル基、Ｃ１−１６アルキニル基、或いはＣ１−１６アルキル基であって、５位以降の炭素原子の一つ以上が任意に置換されてよい。「置換されたアルケニル基又はアルキニル基又はアルキル基」という用語は、少なくとも１個の炭素原子が少なくとも一つの置換基で置換されたアルケニル基又はアルキニル基又はアルキル基を意味する。「置換基」という用語は、特に、水酸基、ケト基、チオール基、アルキル基、或いはアルケニル基を意味する。
【００１３】
それ故、本発明は、γ−ラクトンの立体選択的な調製法に関するものであり、γ−ラクトン、特に、前記一般式（Ｉ）のγ−ラクトンの微生物による生合成が行われ、前記ラクトン環が２位と３位の炭素の間に不飽和結合を有しうるが、好ましくは飽和結合であり、Ｒ１が任意に置換されてよいＣ１−１６アルケニル基、Ｃ１−１６アルキニル基又はＣ１−１６アルキル基であり、前記生合成が少なくとも一つの基質、好ましくは脂肪酸から、前記基質のＣ４位の立体選択的なヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株の微生物培養により実施されることを特徴とする。
【００１４】
本発明はγ−ラクトン類の生物学的調製、特に適切な微生物株の培養により、少なくとも一つの基質からの、γ−ラクトンの（Ｒ）或いは（Ｓ）光学異性体のいずれかの立体選択的生合成に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本調製法は以下の段階を含んでなる。
ａ） 適切な微生物株を選抜する段階、
ｂ） 前記微生物株を適切な培地で培養する段階であって、前記培養が任意に前記微生物株の前培養を伴う段階、
ｃ） γ−ラクトンに変換され得る基質を添加する段階、
ｄ） 前記基質をγ−ラクトンに生物学的に変換する段階、及び
ｅ） 産生されたγ−ラクトンを回収する段階。
【００１６】
本発明に係るγ−ラクトンの生合成に用いる、段階ａ）において適切な微生物株は、前記基質の特異的なヒドロキシル化を可能にする株である。本発明の好適な実施形態において、段階ａ）において本発明に係るγ−ラクトンの生合成に用いる適切な微生物株は、Ｃ４位において前記基質の特異的な立体選択的なヒドロキシル化を可能にする株である。このようにして、本発明に従い、炭素原子Ｃ４が（Ｒ）立体配置又は（Ｓ）立体配置にあるγ−ラクトン類が得られる。
【００１７】
前記生合成の結果として得られる生成物が食品産業において使用される場合には、食品用の微生物株が勿論好ましいことになる。立体選択的ヒドロキシル化を可能にするこれら微生物株としては、特にアスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール属、及びモルティエレラ属の微生物株が挙げられる。これらの株はすべて微生物クラス１に属し、その幾つかは食用株であるので、それらを使用してもラクトンの工業的生産、或いはその食品における使用に対して何ら特別の問題を起こすことはない。本発明の特定の実施形態において、使用される株はアスペルギルス属の株、好ましくはアスペルギルス オリゼーであり、以下の群の株：
アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６４、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １１４７、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ ６３３０３、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ ５７０．６５、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ ８１９．７２、アスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７、アスペルギルス オリゼー ＶＭＦ ８８０９３が挙げられる。
【００１８】
これらの株の中で、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１及びアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７が好ましい。
【００１９】
別の具体的な実施形態において、使用される微生物株は、モルティエレラ属の株であって、以下の群の種：
モルティエレラ イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＤＳＭＺ １４１４、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １９４．２８、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２０８．３２、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２４．３５、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ５６０．６３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １６７．８０、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ４９３．８３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ３０９．９３、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２５０．９５、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １０９０７５、モルティエレラ ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ） ＣＢＳ １１２．０８、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ２１９．４７、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ２４３．５８、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ４７８．６３、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ８５２．７３、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ ３６６．９５、モルティエレラ ラマニアナ ＣＢＳ １０１２２６が挙げられる。
【００２０】
事実、本発明者らは驚くべきことに、且つ予想外にも、アスペルギルス属のある株の使用により（Ｒ）γ−ラクトンが選択的に製造され、又モルティエレラ属のある株をの使用により（Ｓ）γ−ラクトンが選択的に製造されることを見出した。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、ヤロウイア リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、それらがＣ４位におけるヒドロキシル化をもたらす能力がないため、本発明から除外される。Ｃ４におけるヒドロキシル化を特異的、且つ選択的に行う能力のないすべての微生物株が本発明から除外されることが有利である。
【００２２】
何らかの理論によって拘束されることなく、前記微生物株を培養する条件が、観察された立体選択性に、又前記生物学的変換の定量的側面に重要であり得ることは予測出来る。
【００２３】
本発明に記載の方法の、段階ｂ）における培養は、例えば、適切な培地における、細胞増殖による微生物株の培養液、好ましくは半濃縮培養液の調製を含む。この培養では、予め前記微生物株の増殖の第一段階にとって適切な第一の培地において前記株の前培養を行ってもよい。
【００２４】
本発明の立体選択的プロセスに使用される培養条件は、結果として、封入体で（特にペルオキシソームで）満たされた隆起を示す菌糸の形成をもたらす条件でなければならない。本発明の好適な実施形態において、調製された細胞培養液は、分生胞子を持たず、これらの封入体（特にペルオキシソーム）で満たされた膨化した構造を示す分節したフィラメントからなる「コンポート」型の菌糸を有する。前記培養条件は実際、特に菌糸での胞子形成の防止に適切でなければならない。その上、発明者らは特に、本願明細書に記載された培養条件の使用によって得られる菌糸の生理的状態（封入体、特にペルオキシソームで満たされた隆起及び膨張を有する分節した菌糸）が、反応収量に少なからぬ影響を及ぼし得、先行技術における収量よりも大きな収量を得ることを可能にすることを見出した。菌糸体の生理的状態はまた、前記反応の立体選択性にも影響を与えうる。
【００２５】
すなわち、本発明の好適な実施形態において、本発明の方法の段階ｂ）は、封入体、特にペルオキシソームで満たされた隆起及び膨張を有する分節した菌糸を得るために適切な培地で微生物株を培養する段階である。本発明において使用される培養培地はペプトンを含まない方が有利である。本発明において使用される培地は、麦芽抽出物（麦芽エキス）及び／又は酵母抽出物（酵母エキス）を含むことが好ましい。好適な実施形態によれば、段階ｃ）に使用される菌糸は濃縮される。段階ｃ）に使用される菌糸体の濃度は、好ましくは培地１Ｌ当たり５ｇから１５ｇ、好ましくは６ｇから１２ｇ、非常に好ましくは７ｇから１０ｇである。
【００２６】
モルティエレラ株による（Ｓ）−γ−ラクトンの生成が、立体選択性及び収量に関して、前記のような、封入体で満たされて隆起した菌糸の使用により著しく促進されることが特に注目されていて、実際に、このような菌糸の使用により、絶対値において先行技術における生成物の旋光性よりも大きな旋光性を有する反応生成物を得ることができ、さらに、本発明に記載の方法によって、特に、上述のような封入体で満たされて隆起した菌糸の使用によって、先行技術における収量よりも大きな収量を得ることができる。
【００２７】
本方法の段階ｃ）は、細胞培養に基質を添加することである。本発明において、γ−ラクトンの生物学的合成には適切な基質が用いられる。
【００２８】
本発明の目的に鑑み、用語「適切な基質」は、少なくとも５個の炭素原子、好ましくは５から２０個の炭素原子を含み、５番目以遠の炭素原子の位置で任意に分枝し又は置換されている飽和又は不飽和直鎖脂肪酸、及び該脂肪酸のエステルを意味し、メチルエステル又はエチルエステルが好ましい。
【００２９】
好適な基質としては、γ−バレロラクトンを生成する炭素数５の酸であるバレリン酸、γ−ヘキサラクトンを生成する炭素数６の酸であるカプロン酸、γ−ヘプタラクトンを生成する炭素数７の酸であるエナント酸、γ−オクタラクトンを生成する炭素数８の酸であるカプリル酸、γ−ノナラクトンを生成する炭素数９の酸であるペラルゴン酸、γ−デカラクトンを生成する炭素数１０の酸であるデカン酸、γ−ウンデカラクトンを生成する炭素数１１の酸であるウンデカン酸、γ−ウンデセノラクトンを生成する炭素数１１の酸であるウンデシレン酸、γ−ドデカラクトンを生成する炭素数１２の酸であるラウリン酸、γ−テトラデカラクトンを生成する炭素数１４の酸であるミリスチン酸、γ−ヘキサデカラクトンを生成する炭素数１６の酸であるパルミチン酸、γ−ヘキサデセノラクトンを生成する不飽和の炭素数１６の酸であるパルミトレイン酸、γ−オクタデカラクトンを生成する炭素数１８の酸であるステアリン酸、γ−オクタデセノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるオレイン酸、γ−オクタデカジエノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるリノール酸、γ−オクタデカトリエノラクトンを生成する炭素数１８の酸であるリノレン酸、及びγ−エイコサノラクトンを生成する炭素数２０の酸であるエイコサン酸、ならびにそれらのエステル、好ましくはそれらのエチルエステル又はメチルエステルが挙げられる。
【００３０】
希少ではあるが、炭素数１３、炭素数１５、炭素数１７及び炭素数１９の脂肪酸、ならびにそれらのエチル或いはメチルエステルを酸化し、それぞれ炭素数１３、炭素数１５、炭素数１７及び炭素数１９のγ−ラクトンを製造することも出来る。
【００３１】
前記基質がいかなる適切な基質又は種々の適切な基質の混合物、特に所定の酸及びその一つ以上のエステルの混合物であり得ることは言うまでもない。
【００３２】
本発明の有利な実施形態において、前記基質はバッチ培養、或いは流加培養により菌糸に蓄積される。好適な実施形態によれば、前記基質を、例えば油、特に大豆、トウモロコシ、ヒマワリの油のような何らかの通常の食物油、ミグリオールのような合成短鎖脂肪酸のトリグリセリド、好ましくは水素添加された、或いはオレイン酸に富むヒマワリ油等の助剤と混合し、基質を前記菌糸に接触させる前に添加する。助剤の存在は特に、前記基質の腐食性或いは毒性効果を大いに減少させることを可能にする。本発明の一実施形態によれば、モルティエレラ イサベリナ株を使用する本発明に記載の合成は、鉱物油を含まない培地で行われる。前記基質は１時間当たり、培地１Ｌ当たり０．３ｇ〜２．５ｇの濃度で添加するのが有利である。前記基質と混合される油、好ましくは植物油の量は、培地１Ｌ当たり１００ｇ〜５００ｇ、好ましくは培地１Ｌ当たり１５０ｇ〜３００ｇであることが有利である。
【００３３】
また、糖源、好ましくはグルコース源を基質と同時に培地に添加し、細胞のエネルギー需要が確実に賄われるようにする。添加するグルコースの濃度は、１時間に培地１Ｌ当たり０．３から０．４ｇであることが有利である。
【００３４】
ｐＨは、必要に応じて、基質添加の間、及びそれに続く生物学的変換の間、いかなる適当な塩基の添加によっても調節することが出来る。ｐＨは４．５〜８．５、好ましくは５．５〜８、好ましくは６〜７．５であることが有利である。
【００３５】
前記生物による変換の間、温度は２７〜３０℃に維持することが好ましい。前記生物学的変換を行う時間は３０〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間であってもよい。
【００３６】
本発明の方法の段階ｄ）における前記基質のγ−ラクトンへの生物学的変換は、前記微生物株によって行われる前記基質のＣ４位におけるヒドロキシル化反応が先に行われ、その後にラクトン化が行われる段階である。基質に対するこのヒドロキシル化を可能にするためには、酸素源が必要である。この酸素源は酸素を含む気体が好ましく、空気或いは酸素が極めて好ましい。前記気体は反応培地中に比較的大量に溶解される。
【００３７】
好適な実施形態によれば、先行技術において公知のように、消泡剤、特にシリコーン油或いは脂肪酸でエステル化されたポリエチレングリコールのポリマーを使用し、生物学的変換において生じうる泡沫の形成を制御する。
【００３８】
前記生物学的変換、即ちＣ４における特異的且つ立体選択的なヒドロキシル化、それに続くラクトン化が実施された後、本方法の段階ｅ）において、抽出によるγ−ラクトンの回収がおこなわれ、そのγ−ラクトンの抽出は適切な手段によって行われる。前記γ−ラクトンの抽出は水蒸気蒸留によって行われ、必要に応じて、未反応の基質をその後除去するためのエステル化を続いて行うことが有利である。
【００３９】
別法として、γ−ラクトンの抽出は、培地を酸性にした後、溶媒抽出によって行われる。
【００４０】
本発明の一変法によれば、本方法の段階ｅ）を行わず、代わりに段階ｅ’）を行う。この段階では、抽出前に、得られたγ−ラクトンをｉｎ ｓｉｔｕにて還元することによって段階ｄ）の最終プロセスを継続する。段階ｅ’）では、段階ｄ）で得られたγ−ラクトンの立体構造に依存して、より飽和した（Ｒ）−又は（Ｓ）−γ−ラクトンが得られる。
【００４１】
第一の実施形態によれば、前記還元は飽和ラクトンが得られるまで実施出来る。第二の実施形態によれば、前記還元を中止して、段階ｄ）の生物学的変換から誘導されるγ−ラクトンの側鎖よりも側鎖の不飽和結合が少ないγ−ラクトンが得られる。その他の実施形態によれば、本発明に記載の方法を段階ｄ）の最後まで継続し、一方で発酵槽のｐＨ調節を中止し、パン酵母、ワイン酵母、或いはビール酵母などの生きた乾燥酵母、及び糖源、特にグルコース源を培養装置に添加する。ｐＨが５．５に達する場合、適当な塩基、例えば水酸化ナトリウムでｐＨ５．５に調節する。前記混合物を好ましくは１２〜２４時間培養を続け、次いでγ−ラクトンを抽出する。別の変法によれば、段階ｄ）から得られるγ−ラクトンを、還元性の微生物、或いは少なくとも還元状態に置かれる微生物、例えば、サッカロミセス セレビシエ、ピキア エチェルシアイ、ピチア パストリス、ハンセヌラ ポリモルファ、枯草菌又はラクトバシラス ブレビスの新鮮培養によって還元出来る。
【００４２】
段階ｅ’）の還元により、段階ｄ）から得られるγ−ラクトンよりもさらに飽和したγ−ラクトンが生成される。この特異的な実施形態に従って得られるより飽和されたこれらのγ−ラクトンは４位に不斉炭素原子を有し、前記還元反応が前記分子の立体異性を修飾しないため、原料となる飽和度の低いγ−ラクトンと同じ立体配置を有する。
【００４３】
本発明の方法に従って得られるγ−ラクトンは、着臭剤及び風味剤としての特性を有するため、それらはすべての香料及び食品の風味付けへの用途、特に香水、着臭物質、又は化粧品若しくは食品組成物の製造に、又は食品添加物としての用途に使用出来る。
【００４４】
本発明において、用語「香料」は、この用語の通常の意味における香料のみならず、製品の匂いが重要である他の分野における香料をも意味する。前記用語の通常の意味における香料組成物としては、例えば芳香性の基剤及び濃縮物、オーデコロン、オードトワレ、香水及び類似の製品；局所用組成物、特に化粧用組成物（例えば、顔及び体につけるクリーム、タルカムパウダー、ヘアオイル、シャンプー、ヘアローション、浴用塩及び浴用油、シャワー用及び浴用ジェル、化粧石鹸、制汗剤及び脱臭剤、髭剃りローションとクリーム、石鹸、クリーム、歯磨き、うがい薬、軟膏及び類似の製品）；ならびにメンテナンス製品（例えば軟化剤、界面活性剤、粉末洗剤、空気消臭剤、及び類似の製品）が挙げられる。
【００４５】
用語「着臭剤」は匂いを発する化合物を指すのに使用される。
【００４６】
用語「食品への風味添加」は、本発明の化合物を使用してあらゆるヒト用或いは動物用の液状又は固体の食品、特に飲料水、酪農製品、アイスクリームに風味を添加することを意味する。
【００４７】
γ−ラクトンの（Ｒ）若しくは（Ｓ）エナンチオマー、又は（Ｒ）及び（Ｓ）エナンチオマーの混合物を香料組成物に使用し、異国風の、フローラル又はフルーティーな香気を付与出来る。本用途において、前記（Ｓ）エナンチオマー又は（Ｒ）エナンチオマー、あるいは当業者により決定された種々の比率における二つのエナンチオマーの混合物が使用される。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法によって得られたγ−ラクトンは、本発明によれば、それらが存在する組成物の総重量に対して０．００２５重量％〜１０重量％で使用される。これらのγ−ラクトンは固体又は液体の組成物、特にゲル、クリーム、軟膏及び／或いはスプレー用の組成物の製造に役立ち得る。
【００４９】
本発明の方法によって得られたγ−ラクトンは、本発明によれば、それ自身が着臭剤である組成物、又は前記着臭剤が一定の臭気の遮断又は中和に使用される組成物に使用出来る。
【００５０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下に示す実施例の参照により明らかになると思われるが、これらの実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００５１】
段階ａ − 微生物株の選抜
すべての微生物保存株（コレクション）を先ずＭＧＹ寒天培地に植菌し、２７℃で７２時間培養し、これらの株を続いて１００ｍｌの１×の麦芽培地を含む１Ｌ容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、２７℃で２４時間培養した。基質であるウンデシレン酸を次いで培地に添加し（１０回添加、培地１Ｌ当たり５ｇ）、さらに４８時間から１２０時間、２７℃で培養を継続した。
【００５２】
培地中のγ−ウンデセノラクトンを嗅覚により感知し、濃度を分析した後、最適な株を選抜した。モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１とアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７株を選抜し、それらの株をその後培養槽における最適化試験に使用した。
【００５３】
段階ｂ 細胞培養の調製
モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ １００５５９、モルティエレラ イサベリナ ＣＢＳ ２２１．２９、アスペルギルス オリゼー ＤＳＭＺ １８６１又はアスペルギルス オリゼー ＣＢＳ １１０．２７株（元株は−８０℃で試験管中に凍結保存した株）をＭＧＹ寒天上に植菌し、２７℃で３０時間培養した。
【００５４】
前記の前培養液を、６Ｌ容の培養槽内の１×麦芽培地５Ｌに植菌した。
麦芽エキス １６５ｇ
酵母エキス ２５ｇ
適量の水 ５Ｌ
ｐＨ ６．５
【００５５】
モルティエレラ イサベリナ
２７℃、１分間に５００回転の回転数、培地１Ｌ当たり３．５Ｌ／１時間の空気供給、ｐＨ調整なし、３０時間、の条件で培養を行った。
【００５６】
アスペルギルス オリゼー
２０℃、５００ｒｐｍの回転数、０．０５ｖｖｍの空気供給、ｐＨ調整なしで３０時間培養を行い、次いで２５℃、５００ｒｐｍの回転数、０．０５ｖｖｍの空気供給、ｐＨ調整なしで２４時間培養を行った。両方の場合において、封入体（ペルオキシソームを含む）で満たされた多数の大きな膨張を含む菌糸を得た。
【００５７】
次いで、１２５Ｌの１．５×麦芽培地を３００Ｌ容の培養槽に調製した。
麦芽エキス ６．１８８ｋｇ
酵母エキス ０．９３８ｋｇ
適量の水 １２５Ｌ
【００５８】
前記培地を１２１℃で４０分間滅菌した。前記培養槽及びその部品を滅菌、加圧処理した。温度を２７℃に調節した。加圧し、１時間当たり培地１Ｌ当たり３．５Ｌ、即ち凡そ０．６ｍ３／ｈの通気速度を維持した。塩基（１０Ｎ ＮａＯＨ）、酸（８５％のリン酸（Ｈ３ＰＯ４））、消泡剤及び接種材として役立つ６Ｌ容の発酵糟を無菌状態で寄せ集めた。撹拌速度を３２５ｒｐｍに調節し、消泡剤の滴下を開始し、次いで接種材料（５Ｌ）をｐＨ調整なしで接種した。撹拌速度を３２５ｒｐｍに維持し、通気を２．２ｍ３／ｈ（０．３ｖｖｍ）に増加させた。菌の増殖を２４時間継続させ、乾燥重量ベースで培地１Ｌ当たり凡そ１０ｇの菌糸を得た。この菌糸は「コンポート」型の菌糸で、胞子を持たない多数の膨張と隆起を含むフィラメントから構成されているはずである。
【実施例２】
【００５９】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるラウリン酸の変換
菌糸の量と品質を確保した後、基質（ラウリン酸）をミグリオールに添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で５５時間にわたり添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７に調節した。回転速度を９００ｒｐｍに増加し、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速とした。前記変換を５５時間実施した。培地１Ｌ当たり１２ｇの収量で（Ｓ）−γ−ドデカラクトンを得た。比較のため、特許文献３（Ｈａｎ）の教示に従い、特許文献３に記載のモルティエレラ属の株を用いてγ−ドデカラクトンを調製した。
【００６０】
前記Ｈａｎの方法が使用される場合、収量は培地１Ｌ当たり４〜６．５ｇのオーダーであるが、それと比較し、本発明の方法では封入体で膨張した「コンポート」菌糸を用いた場合、収量は培地１Ｌ当たり１２〜１５ｇのオーダーであった。
【実施例３】
【００６１】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるカプリル酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、基質（カプリル酸）を０．７５ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。回転速度を６００ｒｐｍに増加させ、通気を３．５Ｌ／分の流速とした。前記変換を４８〜７４時間実施した。培地１Ｌ当たり１５〜２５ｇ、一般には培地１Ｌ当たり凡そ９ｇの収量で（Ｓ）−γ−オクタラクトンを得た。
【００６２】
比較のため、特許文献４（Ｆａｒｂｏｏｄ）の教示に従い、特許文献４に記載のモルティエレラ属の株を用いてγ−オクタラクトンを調製した。前記ファーブッドの方法に従って得られる生成物の旋光性は−２８°であって、このことは本生成物が（Ｒ）と（Ｓ）エナンチオマーの混合物であり、（Ｓ）エナンチオマーがごく僅かに優勢であることを意味している。本発明の方法に従って得られる生成物の旋光性は−４２°であって、このことは（Ｓ）−γ−ラクトンが選択的に生成されることを示すものである。
【００６３】
前記Ｆａｒｂｏｏｄの方法が使用される場合、得られる収量は培地１Ｌ当たり７．５〜１０ｇのオーダーであるが、それと比較し、本発明の方法では封入体で膨張した「コンポート」菌糸体を用いた場合、収量は１Ｌ当たり１５〜２５ｇのオーダーであった。
【実施例４】
【００６４】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるカプロン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、基質（カプロン酸）を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。回転速度を６００ｒｐｍに増加させ、通気を３．５Ｌ／分の流速とした。前記変換を４８〜７４時間実施した。（Ｓ）−γ−ヘキサラクトンを培地１Ｌ当たり６ｇの収量で得た。
【実施例５】
【００６５】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるウンデシレン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデシレン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計で培地１Ｌ当たり４０ｇ添加した。このウンデシレン酸は水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加したため、この油は０．９ｇ／Ｌ／ｈの流速、次いで１．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加された。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した。回転速度を５０５ｒｐｍに増加させ、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を７２時間実施した。
【００６６】
立体配置が（Ｓ）型のγ−ウンデセノラクトンが培地１Ｌ当たり６．５ｇ生成された。
【実施例６】
【００６７】
段階ｃ及びｄ モルティエレラ属の株によるウンデカン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデカン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で３．５時間、次いで０．７５ｇ／Ｌ／ｈの流速で３．５時間、次いで１ｇ／Ｌ／ｈの流速で４８時間添加した。このウンデカン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で２４時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した。回転速度を５０５ｒｐｍに増加させ、通気を１ｖｖｍ、即ち１２ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を４８時間実施した。
【００６８】
立体配置が（Ｓ）のγ−ウンデカラクトンが培地１Ｌ当たり１９ｇ生成された。
【実施例７】
【００６９】
段階ｃ及びｄ アスペルギルス属の株によるウンデシレン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、ウンデシレン酸を０．３ｇ／Ｌ／ｈの流速で６時間、次いで０．５３ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計培地１Ｌ当たり４０ｇ添加した。このウンデシレン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物（１／４部の酸：３／４部の油）として添加した。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。通気を０．５ｖｖｍ、即ち６ｍ３／ｈの流速で行った。前記変換を８０時間実施した。立体配置が（Ｒ）のγ−ウンデセノラクトンが培地１Ｌ当たり０．５ｇ生成された。
【実施例８】
【００７０】
段階ｃ及びｄ アスペルギルス属の株によるカプロン酸の変換
菌糸体の量と品質を確保した後、カプロン酸を１．６４ｇ／Ｌ／ｈの流速で２４時間、次いで２ｇ／Ｌ／ｈの流速で７２時間、即ち合計培地１Ｌ当たり１８３ｇ添加した。このカプロン酸は、水素付加したヒマワリ油との混合物として（１／２部の酸：１／２部の油）配合される。平行してグルコースを連続的に０．３６ｇ／Ｌ／ｈの流速で添加した。培養工程全体を通じて、５ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節した。通気を０．５ｖｖｍ、即ち６ｍ３／ｈの流速で行った。７２時間〜９６時間後、立体配置が（Ｒ）のγ−ヘキサラクトンが培地１Ｌ当たり１５ｇ生成された。
【実施例９】
【００７１】
段階ｅ 抽出−精製
３Ｌの８５％リン酸を用い、ｐＨ１．５に酸性化した。１００℃以上で３０分間加熱を行い、前記ラクトンを本質的にその閉環型とし、開環したヒドロキシ酸型ではないようにした。前記ラクトンを定量して抽出溶媒（好ましくはシクロヘキサン）を添加し、その混合物を常温で１時間攪拌した。遠心分離を行って有機層を回収した。ラクトンを定量した。溶媒を濃縮し、油状の「粗製品」を得た。減圧蒸留を行った。「樹脂を除かれた」ラクトンと排油を得た。次に前記ラクトンを減圧下に分留することによって精製を行う。純度９９％以上の生成物が得られ、同生成物は、モルティエレラ属の株を使用した場合はγ−ウンデセノラクトン（９９％以上が（Ｓ）異性体）であり、又はアスペルギルス種の株を使用した場合はγ−ウンデセノラクトン（９９％以上が（Ｒ）異性体）であった。
【００７２】
（Ｒ）又は（Ｓ）型のγ−ウンデセノラクトン、又は（Ｒ）及び（Ｓ）型の混合物、並びに（Ｒ）又は（Ｓ）型のγ−ウンデカラクトン、又は（Ｒ）及び（Ｓ）型の混合物は、組成物の着香に使用でき、エキゾチックな、フローラルな、又はフルーティーな香気を付与することが出来、更に出願人はγ−ウンデセノラクトンに関し「トロピカロン（登録商標）」を商標登録した。その用途により、前記（Ｓ）エナンチオマー又は前記（Ｒ）エナンチオマー、あるいは両エナンチオマーの当業者によって決定された割合の混合物が使用されることとなる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−ラクトンの立体選択的調製方法であって、γ−ラクトン、特に一般式（Ｉ）のγ−ラクトンの微生物による生合成が行われることを特徴とし、
【化１】
式中、ラクトン環が２位と３位の炭素原子の間に不飽和結合を有してよいが、好ましくは飽和結合であって、Ｒ１が任意に置換されてよい（Ｃ１−Ｃ１６）アルケニル基、任意に置換されてよい（Ｃ１−Ｃ１６）アルキニル基又は任意に置換されてよい（Ｃ１−１６）アルキル基であり、前記生合成が、少なくとも一つの基質、好ましくは脂肪酸から、前記基質のＣ４における特異的ヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株の微生物培養により行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
ａ） 前記基質のＣ４におけるヒドロキシル化を可能にする微生物株から選ばれた適切な株を選抜する段階、
ｂ） 前記の株を適切な培地で培養する段階であって、前記培養に先立って、任意に、前記株を前培養する段階を伴う段階、
ｃ） γ−ラクトン、特に請求項１記載の式（Ｉ）のγ−ラクトンに変換され得る基質を添加する段階、
ｄ） 前記基質をγ−ラクトン、特に式（Ｉ）のγ−ラクトンに生物学的に変換する段階、及び
ｅ） 生成された前記γ−ラクトンを回収する段階
を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の立体選択的調製方法。
【請求項３】
段階ａ）における前記微生物株がアスペルギルス属の株から選抜され、好ましくはアスペルギルス オリゼー株であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｒ）−γ−ラクトンの立体選択的調製方法。
【請求項４】
段階ａ）における前記微生物株がモルティエレラ属の株から選抜され、好ましくはモルティエレラ イサベリナア株であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｓ）−γ−ラクトンの立体選択的調製法。
【請求項５】
前記基質が、少なくとも５個の炭素原子、好ましくは５から２０個の炭素原子を含む任意に置換された飽和又は不飽和直鎖脂肪酸、及びその脂肪酸のエステル、好ましくはメチルエステル又はエチルエステルから選択されることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びエイコサン酸及びそれらのエステル、好ましくはそれらのエチルエステル若しくはメチルエステル、又はそれらの混合物からなるグループから選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
段階ｃ）において、前記基質が、好ましくは、油、特に水素添加されたか若しくはオレイン酸に富むヒマワリ油、ミグリオール若しくはグルコース、又はこれらの成分の混合物から選択される少なくとも一つの製造助剤との混合物として添加されることを特徴とする、請求項２から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ｅ）がγ−ラクトンの水蒸気蒸留による抽出であって、必要に応じて、未反応の基質のエステル化及び除去が続いて行われることを特徴とする、請求項２から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階ｅ）が、段階ｄ）の終わりに得られた前記ラクトンの溶媒抽出であることを特徴とする、請求項２から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｅ）が、段階ｄ）の終わりに得られた前記γ−ラクトンのｉｎ ｓｉｔｕにおける還元からなる段階ｅ’）で置換されることを特徴とする、請求項２から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記（Ｒ）−γ−ラクトンの立体特異的生合成のためのアスペルギルス オリゼーの培養物の使用。
【請求項１２】
前記（Ｓ）−γ−ラクトンの立体特異的生合成のためのモルティエレラ イサベリナの培養物の使用。
【請求項１】
γ−ラクトンの立体選択的調製方法であって、γ−ラクトン、特に一般式（Ｉ）のγ−ラクトンの微生物による生合成が行われることを特徴とし、
【化１】
式中、ラクトン環が２位と３位の炭素原子の間に不飽和結合を有してよいが、好ましくは飽和結合であって、Ｒ１が任意に置換されてよい（Ｃ１−Ｃ１６）アルケニル基、任意に置換されてよい（Ｃ１−Ｃ１６）アルキニル基又は任意に置換されてよい（Ｃ１−１６）アルキル基であり、前記生合成が、少なくとも一つの基質、好ましくは脂肪酸から、前記基質のＣ４における特異的ヒドロキシル化を可能にする微生物株から選抜された株の微生物培養により行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
ａ） 前記基質のＣ４におけるヒドロキシル化を可能にする微生物株から選ばれた適切な株を選抜する段階、
ｂ） 前記の株を適切な培地で培養する段階であって、前記培養に先立って、任意に、前記株を前培養する段階を伴う段階、
ｃ） γ−ラクトン、特に請求項１記載の式（Ｉ）のγ−ラクトンに変換され得る基質を添加する段階、
ｄ） 前記基質をγ−ラクトン、特に式（Ｉ）のγ−ラクトンに生物学的に変換する段階、及び
ｅ） 生成された前記γ−ラクトンを回収する段階
を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の立体選択的調製方法。
【請求項３】
段階ａ）における前記微生物株がアスペルギルス属の株から選抜され、好ましくはアスペルギルス オリゼー株であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｒ）−γ−ラクトンの立体選択的調製方法。
【請求項４】
段階ａ）における前記微生物株がモルティエレラ属の株から選抜され、好ましくはモルティエレラ イサベリナア株であることを特徴とする、請求項２に記載の（Ｓ）−γ−ラクトンの立体選択的調製法。
【請求項５】
前記基質が、少なくとも５個の炭素原子、好ましくは５から２０個の炭素原子を含む任意に置換された飽和又は不飽和直鎖脂肪酸、及びその脂肪酸のエステル、好ましくはメチルエステル又はエチルエステルから選択されることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びエイコサン酸及びそれらのエステル、好ましくはそれらのエチルエステル若しくはメチルエステル、又はそれらの混合物からなるグループから選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
段階ｃ）において、前記基質が、好ましくは、油、特に水素添加されたか若しくはオレイン酸に富むヒマワリ油、ミグリオール若しくはグルコース、又はこれらの成分の混合物から選択される少なくとも一つの製造助剤との混合物として添加されることを特徴とする、請求項２から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ｅ）がγ−ラクトンの水蒸気蒸留による抽出であって、必要に応じて、未反応の基質のエステル化及び除去が続いて行われることを特徴とする、請求項２から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階ｅ）が、段階ｄ）の終わりに得られた前記ラクトンの溶媒抽出であることを特徴とする、請求項２から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｅ）が、段階ｄ）の終わりに得られた前記γ−ラクトンのｉｎ ｓｉｔｕにおける還元からなる段階ｅ’）で置換されることを特徴とする、請求項２から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記（Ｒ）−γ−ラクトンの立体特異的生合成のためのアスペルギルス オリゼーの培養物の使用。
【請求項１２】
前記（Ｓ）−γ−ラクトンの立体特異的生合成のためのモルティエレラ イサベリナの培養物の使用。
【公表番号】特表２００８−５１８５９５（Ｐ２００８−５１８５９５Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８４７４（Ｐ２００７−５３８４７４）
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２７３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８５５１
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０７０３８６７４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２７３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８５５１
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０７０３８６７４）
【Ｆターム（参考）】
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