がん関連マクロファージを標的とした固形がん治療剤
【課題】がん関連マクロファージを標的とする新規固形がん治療剤を提供する。
【解決手段】葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む固形がん治療剤。
【解決手段】葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む固形がん治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん関連マクロファージを標的とする固形がん治療剤に関する。より具体的には、本発明は、がん関連マクロファージの葉酸受容体β（以下、「FRβ」とも称する）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む固形がん治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの増殖や転移には、しばしば炎症反応が関与する。この炎症反応において中心的な役割を担うと考えられているのが、がん組織に局在するがん関連マクロファージである。がん関連マクロファージは、本来免疫担当細胞であり、がんを攻撃するためのインターロイキン(IL)、インターフェロン(IFN)などのサイトカインを産生するが、一方、がんの進行を促進する血管新生因子(VEGF)などのサイトカインも産生することが知られている。具体的には、がん関連マクロファージの数は、臨床的にある種のがんの悪性度と相関を示し（非特許文献１）、がん増殖や転移に必要な血管新生を促進させると同時に、がんに対する免疫反応を抑制させる働きをもつ（非特許文献２）。また、マクロファージから分化した破骨細胞は、がんの骨転移において骨破壊を起こすことが知られている。
【０００３】
これまで、がん関連マクロファージで高発現する種々の物質が報告されている。例えば非特許文献3によれば、がん関連マクロファージにおいてスカベンジャー受容体が高発現されることが報告されている。また、非特許文献4によれば、Legumainと呼ばれる細胞内プロテアーゼが、がん関連マクロファージで特異的かつ高発現していることが報告されている。しかし、スカベンジャー受容体は正常マクロファージでも発現するため、これを標的としたがん療法は副作用のリスクを伴う。Legumainは細胞表面に露出しない細胞内タンパク質であるため、抗体療法の標的としては適当ではない。このように、現在までに、抗体療法の有意な副作用のリスクがなく、かつ抗体療法に適したがん関連マクロファージの標的分子は見出されていない。
【０００４】
本発明者らは、先に、抗ヒト葉酸受容体β(FRβ)マウスモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的解析により、関節リウマチの滑膜組織中で活性化したマクロファージ表面にはFRβが高発現し、正常組織や末梢血での発現はみられないか非常に低いことを見出した。
【０００５】
さらに、本発明者らは、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体の抗原認識部位遺伝子と遺伝子改変型の緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）遺伝子とを融合させたリコンビナントタイプイムノトキシンを作製し、SCIDマウス-関節リウマチ滑膜移植モデルにおいて、該イムノトキシンによるFRβ発現マクロファージの選択除去が、関節リウマチの治療に有効であることや、関節リウマチに見られるマクロファージから破骨細胞への分化や血管新生を抑制することを報告してきた（特許文献1、非特許文献5、6、7）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO 2005/103250
【非特許文献１】de Visser KE, Eichten A, Coussens LM. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nat Rev Cancer. 2006 Jan; 6(1):24-37.
【非特許文献２】Dirkx AE, Oude Egbrink MG, Wagstaff J, Griffioen AW. Monocyte/macrophage infiltration in tumors: modulators of angiogenesis. J Leukoc Biol. 2006 Dec; 80(6): 1183-96.
【非特許文献３】Bak SP, Walters JJ, Takeya M, Conejo-Garcia JR, Berwin BL. Scavenger receptor-A targeted leukocyte depletion inhibits peritoneal ovarian tumor progression. Cancer Res. 2007 May 15; 67(10): 4783-9.
【非特許文献４】Luo Y, Zhou H, Kreuger J, Kaplan C, Lee SH, Dolman C, Markowitz D, Wu W, Liu C, Reisfeld J Clin Invest. 2006 Aug; 116(8): 2132-2141.
【非特許文献５】Nakashima-Matsushita N, Homma T, Yu S, Matsuda T, Sunahara N, Nakamura T, Tsukano M, Ratnam M, Matsuyama T. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1999 Aug; 42(8): 1609-16.
【非特許文献６】Nagayoshi R, Nagai T, Matsushita K, Sato K, Sunahara N, Matsuda T, Nakamura T, Komiya S, Onda M, Matsuyama T. Effectiveness of anti-folate receptor beta antibody conjugated with truncated Psuedomonas exotoxin in the targeting of rheumatoid arthritis synovial macropahges. Arthritis Rheum. 2005 Sep; 52(9): 2666-75.
【非特許文献７】Nagai T, Tanaka M, Tsuneyoshi Y, Matsushita K, Sunahara N, Matsuda T, Yoshida H, Komiya S, Onda M, Matsuyama T. In vitro and in vivo efficacy of a recombinant immunotoxin against folate receptor beta on the activation and proliferation of rheumatoid arthritis synovial cells. Arthritis Rheum. 2006 Oct; 54(10): 3126-34.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、がん関連マクロファージを標的とする新規固形がん治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今回、FRβはマクロファージ表面に発現するが、正常部位にはほとんど発現が見られないことから、がん関連マクロファージに対する候補標的分子であろうと予測し、ヒト悪性グリオーマ組織を一例として選択し、該組織におけるがん関連マクロファージのFRβ発現を免疫組織学的に検討したところ、全ての検体においてFRβが発現されていることを見出した（図１、２）。
【０００９】
また、本発明者らは、抗マウスFRβに対するラットモノクローナル抗体を作製し、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ移植モデルにおいて、がん周辺部のマクロファージにおけるFRβ発現を免疫組織学的に検討し、ヒト悪性グリオーマと同様に、がん周辺のマクロファージでFRβの発現を確認した（図３）。
【００１０】
本発明者らはさらに、抗マウスFRβ抗体と緑膿菌外毒素とを含むリコンビナントイムノトキシンを作製し、これをin vitroにてFRβ発現細胞株、チオグリコレートで誘導したマウス腹腔マクロファージ（炎症性マクロファージ）などに適用し、これらの細胞株や炎症性マクロファージの細胞死を引き起こすことを見出した。さらにまた、本発明者らは、今回、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ移植モデルにおいても、上記リコンビナントイムノトキシンの投与により、がん組織の増殖と周囲の血管新生が抑制されることを見出した。
本発明は、上記の新規知見を基礎とするものである。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
(1) 葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含み、かつ、FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死を引き起こし、これによって、該マクロファージが集積する固形がんの増殖を抑制することを可能にする、固形がん治療剤。
【００１２】
(2) 前記固形がんは、悪性グリオーマ又は乳がんである、上記(1)記載の固形がん治療剤。
【００１３】
(3) 前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、上記(1)又は(2)記載の固形がん治療剤。
【００１４】
(4) 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、上記(1)〜(3)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１５】
(5) 前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、上記(1)〜(4)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１６】
(6) 前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１７】
(7) 前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１８】
(8) 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、上記(1)〜(7)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１９】
(9) 前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖（L鎖）可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(8)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００２０】
(10) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
(11) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２２】
(12) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２３】
(13) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２４】
(14) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
(15) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
(16) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２７】
(17) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
(18) 前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)からなる群から選択されるものである、上記(1)〜(17)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００２９】
(19) 前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００３０】
(20) 前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の固形がん治療剤は、がんの増殖及び転移に関係するがん関連マクロファージの細胞死又は細胞傷害を選択的に誘導し、これによって、該がん関連マクロファージが集積する、悪性グリオーマ、乳がんなどの固形がんの増殖抑制又は縮退を引き起こすことを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の固形がん治療剤についてさらに説明する。
【００３３】
本発明の固形がん治療剤の特徴は、
(1) 葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含むこと、
(2) FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死が引き起こされること、
(3) 前記マクロファージが集積する固形がんの増殖が抑制されること、ならびに、
(4) 前記固形がんにおいて血管新生が抑制されること、
を包含する。
【００３４】
本明細書で使用される「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、哺乳動物のがん関連マクロファージの細胞表面に発現される受容体タンパク質を意味する。このマクロファージは、特定のがんの周囲に集積する性質を有している。
【００３５】
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物などが含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
【００３６】
本明細書で使用される「葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは、がん関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体（例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など）であってもよい。これらの抗体はまた、固形がん細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、がん関連マクロファージ及び固形がんの両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００３７】
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、がん関連マクロファージ及び、場合により、がん細胞を死滅させる又は障害する能力をもつ任意の物質を指す。
【００３８】
1. 複合体
本発明の治療剤の有効成分としての複合体は、上記のとおり、がん関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ（及び場合により、がん細胞）の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
【００３９】
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などが含まれる。
【００４０】
本発明の複合体が上記抗体と細胞毒素からなるとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー（例えばペプチド）を介して、結合することができる。一方、本発明の複合体が上記抗体と細胞毒性剤からなるとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
【００４１】
本発明によれば、がん細胞を異物として認識してそれを攻撃するはずのマクロファージに対して細胞死を誘発することによって、その結果として、固形がんの増殖が抑制されるという意外な医薬効果が提供される。
【００４２】
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、がん関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性をもつタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの１つであるFRα（例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70％のアミノ酸配列同一性がある（特表2008-500025））と結合しないことが望ましい。
【００４３】
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、５以上、好ましくは7以上、より好ましくは８以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約５〜約10アミノ酸からなり、かつ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
【００４４】
本発明の抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
【００４５】
本発明の抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス（IgA, IgG, IgE, IgD, IgMなど）及びサブクラス(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2など)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
【００４６】
本発明の抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、１つの重鎖と１つの軽鎖からなるダイマーなどを含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
【００４７】
本発明の抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などであってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体（scFv）、二重特異性抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb (single chain diabody),dsFv-dsFvなどが含まれる（浅野竜太郎,生化学77(12)1497-1500,2005参照）。
【００４８】
以下、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
【００４９】
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原（抗原）として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、５以上、好ましくは７以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列からなるマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
【００５０】
かかるFRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報（例えば配列番号１など）に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank（NCBI、米国）、EMBL(EBI、欧州)などから入手可能である。
【００５１】
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)などを参照することができる。
【００５２】
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明の抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明の抗体を製造してもよい。
【００５３】
本発明のポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド（細菌細胞壁関連ペプチドの一種）等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1〜7回の免疫を行い、最後の免疫日から１〜７日後に、ELISA等の酵素免疫測定法などによって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで１回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
【００５４】
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞（例えば脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞など）と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。かかるハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら（Nature(1975)256: 495-96）の方法に準じて行うことができる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体の例として、ヒトFR-β発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られたマウス-マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
【００５６】
また本発明のモノクローナル抗体の他の例として、マウスFR-β発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られたラット-ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
【００５７】
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス-マウスハイブリドーマクローン36細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に、マウス-マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。また他の例として、ラット-ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号７及び８に、ラット-ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。
【００５８】
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、L鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
【００５９】
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
【００６０】
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸の相補的配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
【００６１】
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個を指す。
【００６２】
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、L鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性％は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数/位置（例えば、一部重複する位置）の総数ｘ100）。
【００６３】
2つの配列間の同一性％の決定は、例えばカーリン（Karlin）及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990) J. Mol. Biol. 215: 403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI-BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ（Myers）及びミラー（Miller）(1988)、CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
【００６４】
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC（150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2）、0.1〜0.5％ SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3％SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1％SDSを含む溶液、および１×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６５】
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
【００６６】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記）、Ausubelら（上記）などに記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
【００６７】
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis）を用いて常法により導入することができる（Proc Natl Acad Sci USA., 1984 81:5662；Sambrook ら（上記））。
【００６８】
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
【００６９】
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。
【００７０】
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫したのち、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中などからその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物のなかには、内因性抗体遺伝子を欠失したかつヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシなどのヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる（例えば国際公開WO 96/9634096、WO 96/33735、WO98/24893など）。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞（例えばB細胞）とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００７１】
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００７２】
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。本発明のキメラ抗体は、例えばMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
【００７３】
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットmAb由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10％未満が望ましい。
【００７４】
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体（又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体）のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR１、２及び３)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
【００７５】
(1) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７６】
(2) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７７】
(3) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７８】
(4) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７９】
(5) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８０】
(6) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８１】
(7) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８２】
(8) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８３】
上記マウスドナー配列に適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体のH鎖又はL鎖の配列とのコンピュータ比較によって同定されうる。そのフレームワーク配列がマウスL鎖可変領域及びH鎖可変領域のフレームワーク領域と高い配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインは、マウスフレームワーク配列を用いてNCBI BLAST（米国）を利用するKabatデータベースに照会することによって同定することができる。このとき、マウスドナー配列と80％以上、好ましくは90％以上の配列の同一性を共有するアクセプター配列を選択することができる。ラットドナー配列についても同様に、それに適するヒトアクセプター抗体配列を同定することができる。
【００８４】
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
【００８５】
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
【００８６】
本発明の抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体（scFv）であってもよい。本発明の一本鎖抗体は、例えば本発明のモノクローナル抗体のH鎖可変領域（例えば配列番号３、５、７、９）及びL鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
【００８７】
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒は、がん関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）、リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)などを挙げることができる。本発明においては、特に、緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
【００８８】
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などから適宜選択可能であり、慣用的にがんの化学療法に使用されるものが望ましい。このような細胞毒性剤としては、がん関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現するがん細胞の場合には、がん細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
【００８９】
1.3 リコンビナントイムノトキシンなどの複合体
本発明の複合体の１つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された本発明の抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明に係るリコンビナントイムノトキシンとは、標的（すなわちFRβタンパク質）に結合する本発明の上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
【００９０】
本発明の抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）を利用し、該反応性基と反応しうる官能基をもつ細胞毒と該抗体とを接触させることによって、本発明のリコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、本発明の抗体のH鎖可変領域遺伝子（配列番号３、５、７、９）及びL鎖可変領域遺伝子（配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、本発明のリコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤などによってメルカプト基(-SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
【００９１】
本発明のリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス-マウスハイブリドーマクローン36細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス-マウスハイブリドーマクローン36と緑膿菌害毒外のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス-マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
【００９２】
本発明の複合体のもう１つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体蛋白質のNH2基、SH基、OH基、COOH基などを利用し、これと反応性の官能基をもつ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
【００９３】
2. 治療剤
こうして作製された本発明の複合体は、がん関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、がん関連マクロファージの細胞死を誘導することができる（下記実施例5及び図4参照）。
【００９４】
さらに、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体をリガンドとするリコンビナントイムノトキシンを作製し、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ皮下移植モデルにおいて該イムノトキシンによるがん関連マクロファージの選択的排除の効果を検討したところ、がん組織の増殖及びがん組織周囲の血管新生を抑制することが確認された（下記実施例6、7及び図5、6参照）。
【００９５】
このように、本発明のリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、悪性グリオーマを含む固形がんに対する治療効果を有するものである。また、本発明の複合体は、がん関連マクロファージにおいて特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
【００９６】
本発明の複合体は、これを有効成分として含む固形がん治療剤として製剤化される。すなわち、本発明の固形がん治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、固形がん治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路など様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明の複合体が1日当たり３０μg以上、好ましくは４０μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
【００９７】
本発明の固形がん治療剤は、本発明の複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体などの1種以上を含むことができる。また固形がんの治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。かかる薬剤として、これに限定されるものではないが安定化剤としてヒト血清アルブミン、細胞傷害能のある化学療法剤があげられる。代謝拮抗剤であるシトシンアラビノシド(cytosine alabinoside)、フルオロウラシル(fluorouracil、)メソトレキサート(methotrexate)、アミノプテリン(aminopterin)、アンスラサイクリン(anthracycline)、マイトマイシン(mitomicin)、デメコルシン(demecolcine)、エトポシド(etoposide)、ミスラマイシン(mithramicin)、アルキル化剤であるクロラムブチル(chlorambucil)、メルファラン(melpharan)、エンドキサン(endoxan)、DNA合成阻害剤であるダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、アドリアマイシン(adriamycin)、チューブリン阻害剤であるコルヒチン(colchicine)、タキサン(taxane)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)などを挙げることができる。
【００９８】
本発明の固形がん治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明の固形がん治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
【００９９】
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射などが考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明の固形がん治療剤を接触させてもよい。
【０１００】
本発明の固形がん治療剤による治療に有効な固形がんとして、例えば悪性グリオーマ、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、肺がんなどを挙げることができる。また、手術の適用が困難な転移がん組織の縮退にも効果的であると考えられる。
【０１０１】
本発明の固形がん治療剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、固形がんに罹患している患者、固形がんを治療している患者、固形がんの予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコなどを例として挙げることができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【０１０３】
実施例１．抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜またはBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、またはBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜：agaaagacatgggtctggaaatggatg（配列番号１５）；マウス肝臓：tctagaaagacatggcctggaaacag（配列番号１６）)およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜：gactgaactcagccaaggagccagagtt（配列番号１７）；マウス肝臓：cccaacatggatcaggaact（配列番号１８）)を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわちPCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1-TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
【０１０４】
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50 mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次にあらかじめEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER-BOS(Mizushima et al. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase (Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入ならびに、FRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
【０１０５】
pEF-BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300-19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、あらかじめ1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300-19マウス細胞およびラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜：agaaagacatgggtctggaaatggatg（配列番号１５）；マウス肝臓：tctagaaagacatggcctggaaacag（配列番号１６）)およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜：gactgaactcagccaaggagccagagtt（配列番号１７）；マウス肝臓：cccaacatggatcaggaact（配列番号１８）)をBioneer PCR premix (Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
【０１０６】
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300-19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス（抗ヒトFRβモノクローナル抗体用）あるいはWhister Kyotoラット（抗マウスFRβモノクローナル抗体用）の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
【０１０７】
モノクローナル抗体の作成はKolerの方法(Kohler & Milstein, Nature(1975)256:495-96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS-1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
【０１０８】
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴あたり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
【０１０９】
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウスおよびラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
【０１１０】
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)および軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36bおよび94bはIg-Prime Kitを用いてVHおよびVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VHおよびVLの遺伝子を増幅した。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
【０１１１】
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig-Prime KitおよびラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag（配列番号１９）)を用い、VHおよびVLの遺伝子をPCRに増幅させた。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。解析後のCL5とCL10の塩基配列を図２に示す。
【０１１２】
実施例2．ヒト悪性グリオーマにおけるFRβ陽性マクロファージの検出
ヒト悪性グリオーマ組織は、鹿児島大学病院脳神経外科学より供与を受けた。尚、個人情報取り扱い、ならびに倫理審査に関しては、当大学病院の規定に基づいておこなった。ヒト悪性グリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて10μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(94b)、ならびにマクロファージ全般のマーカーであるCD163に対するCD163マウスモノクローナル抗体を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびCD163陽性細胞の検出を行った。
【０１１３】
ヒト悪性グリオーマにおけるFRβ陽性細胞の局在を図1に示す。FRβならびにCD163抗体でラベル化された細胞は、AECによって赤色に染色される。これより、ヒト悪性グリオーマ組織に浸潤したCD163陽性のうち、FRβ陽性細胞も同部位で検出された。
【０１１４】
次に、直接的にFRβ発現細胞がCD163発現マクロファージであることを証明するために、蛍光二重染色を行った。すなわち、ローダミン蛍光色素(molecular probe)でラベルした94bとFITC蛍光色素(molecular probe)でラベルしたCD163抗体を作製し、上記と同様の手法でグリオーマ組織に滴下し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。蛍光二重染色の結果を図2に示す。グリオーマ組織中でFRβを発現している細胞は赤色を、CD163を発現している細胞は緑色で検出され、両者を発現している細胞は橙-黄色で検出される。以上の結果より、悪性グリオーマ中ではFRβを発現するマクロファージが局在することが明らかとなった。
【０１１５】
実施例3．C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの検出
1x106個に調整したラットグリオーマ細胞をBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植し、飼育を行った。経日的にグリオーマ組織の増殖が視認されることを確認後、飼育20日目にマウスを安楽死させてグリオーマ移植組織を摘出した。摘出したグリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて6μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗マウスFRβマウスモノクローナル抗体(CL5)ならびに抗マウスマクロファージマーカーモノクローナル抗体(F4/80, R&D)を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびF4/80陽性細胞の検出を行った。C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性細胞の局在を図3に示す。グリオーマの近傍に浸潤したF4/80陽性マクロファージでFRβ陽性が検出された。
【０１１６】
実施例4．リコンビナントイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（VH）にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン (塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センス：cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag（配列番号２０）、アンチセンス：cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg（配列番号２１）)、Quick change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用いて実施例1で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1-TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センス：gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgg gtcgc（配列番号２２）、アンチセンス：gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac（配列番号２３）)。
【０１１７】
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1-Blueに遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン (塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
【０１１８】
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVHおよびCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
【０１１９】
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc（配列番号２４）とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg（配列番号２５）を、CL10の５’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg（配列番号２６）とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc（配列番号２７）をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
【０１２０】
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1-TOPO-94bVHおよびpCR2.1-TOPO-CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79-VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
【０１２１】
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センス：taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc（配列番号２８）（このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である）アンチセンス：gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt（配列番号２９）（このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある）。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc（配列番号３０）およびgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt（配列番号３１）)。
【０１２２】
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1-TOPO-94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79-VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
【０１２３】
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79-94bVHPE、pRK79-CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79-VL94b、pRK79-VLCL10を50 ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15-18時間の培養で行った。
【０１２４】
選択終了後の大腸菌は1000 mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600 nmで1.0-1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl-beta-D-thio-galactopyranoside)を終濃度1 mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、20 mM EDTAを含む)を用いて200 mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2 mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、2.5%のTritonX-100、0.5 M NaCl、20 mM EDTAを含む)で 200 mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2 mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、2.5%のTritonX-100、0.5 M NaCl、20 mM EDTAを含む)で 200 mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を５回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6 Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10 mg/mLとなるように調節した。
【０１２５】
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b-VHPEと94b-VL、CL10-VHPEとCL10-VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
【０１２６】
まず、0.5 mLのVHPE、0.25 mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10 mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75 mLの0.1 Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5 M アルギニン、0.9 mM 酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5 mLまで濃縮し、さらに50 mLのトリス緩衝液(pH 7.4、0.1 M 尿素、1 mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
【０１２７】
次に、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi-Trap Q（GE）に、30 mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH 7.4、0.3 M NaCl、1 mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ (POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10 mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0 Mから1.0 MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25 mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS-PAGEにて確認後、-80℃で保存した。
【０１２８】
[SDS-PAGEによる純度検定]
SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130 mM グリシン、25 mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100 mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30 mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液（ナカライテスク）でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
【０１２９】
実施例5．リコンビナントイムノトキシンのFRβ発現細胞のアポトーシス誘導効果（細胞傷害）の検証
実施例1と同様の手法にてマウスFRβを恒常発現させるB300-19細胞を作製し、リコンビナントタイプイムノトキシンのアポトーシス誘導効果（細胞傷害）を検証した。リコンビナントタイプイムノトキシンのアポトーシス誘導効果（細胞傷害）はプロピジウムイオジウム(Propidium iodium)とDNAの結合をフローサイトメータ―にて測定した。
【０１３０】
まず2x105個に調整したマウスFRβ発現B300-19にリコンビナントイムノトキシンの濃度を変えた条件で種々の時間で培養した。培養終了後、細胞を生理的食塩水で洗浄し、細胞ペレットに40μg/mLの濃度に調整したプロピジウムイオジウム(Propidium iodium)溶液を0.5 mL加えて室温で一晩培養後、蛍光強度をフローサイトメータ―にて測定した。
図5はマウスFRβ発現B300-19と種々の濃度におけるリコンビナントイムノトキシン(X軸に示す)を添加した際の培養時間における細胞死の割合(Y軸に示す)を示したものである。結果は4回の独立した実験の平均値で、エラーバーは標準偏差を示す。
【０１３１】
実施例6．リコンビナントイムノトキシンのがん増殖抑制効果の検証
1 x 106個に調整したラットグリオーマ細胞をBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植し、飼育を行った。移植２日後から14日後までにかけて、リコンビナントタイプイムノトキシンを2μgあるいは0.5μgのリコンビナントタイプイムノトキシンを生理的食塩水で10μLに希釈調整し、マウスの左側移植部位に投与した。右側は生理的食塩水および2μgのVH-PEを10μLに調節して投与した。
【０１３２】
移植グリオーマ組織の最大および最小直径を経日的にキャリパーを用いて計測した。移植グリオーマ組織の体積は、（最大直径x最小直径x最小直径x3.14）/6にて算出した。飼育20日目にマウスを安楽死させてグリオーマ移植組織を摘出した。リコンビナントタイプイムノトキシンによるラットC6グリオーマの増殖抑制効果を図5に示す。横軸(X軸)はラットC６グリオーマ移植後の日数を示し、縦軸(Y軸)は腫瘍体積を示す。図５より、2および0.5μgのリコンビナントタイプイムノトキシン投与はラットC６グリオーマの増殖を顕著に抑制することが確認できた。
【０１３３】
摘出したグリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて6μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗マウスFRβマウスモノクローナル抗体(CL5)ならびに抗マウスマクロファージマーカーモノクローナル抗体(F4/80, R&D)を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびF4/80陽性細胞の検出を行った。さらに、各投与群におけるFRβ陽性細胞ならびにF4/80で染色されるマクロファージの数を比較した。図5にリコンビナントタイプイムノトキシン投与によるラットC6グリオーマ組織内のFRβ陽性細胞とF4/80陽性マクロファージ数の減少を示す。
【０１３４】
2μｇのリコンビナントタイプイムノトキシン投与群では対象群(VH-PE投与)に比べ、顕著にFRβ陽性細胞並びにF４/８０陽性マクロファージが減少した。
【０１３５】
実施例7．リコンビナントイムノトキシンの血管新生抑制効果の検証
実施例６と同様に、血管新生マーカーであるCD31の免疫染色を行った。用いた抗体は抗マウスCD31ラットモノクローナル抗体(B&D)を200倍に希釈して検出を行った。
【０１３６】
CD31で染色された細胞数の測定ならびに、新生血管の面積および周囲長をWesseling Pらが報告した悪性グリオーマの血管新生定量方法に従って行った(Wesseling P et al. Quantiative immunohistological analysis of the microvasculature in untreated human glioblastoma mutiforme. J Neurosurg 1994; 81:902-09)。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図1は、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体を用いた、がん関連マクロファージのヒト悪性グリオーマにおける局在を示す免疫組織染色結果である。FRβおよびCD163抗体で認識される細胞は赤色に発色する。CD163はマクロファージ全般に発現するタンパク質で、主にマクロファージマーカーとして使われる。
【図２】図2は、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体を用いた、がん関連マクロファージのヒト悪性グリオーマにおける局在を示す免疫蛍光二重染色結果である。青色色素は細胞の核を染色するDAPI染色である。黄-橙色に染色されているものはマクロファージでかつ、FRβを発現している細胞である。
【図３】図3は、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体を用いた、C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの局在を示す免疫組織染色結果である。FRβおよびF4/80抗体で認識される細胞は赤色に発色する。
【図４】図4は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンのアポトーシス誘導効果を示す。FRβ発現B300-19細胞に対するイムノトキシンのアポトーシス誘導能をPropidium Iodiumの染色性によるフローサイトメータ―にて測定した。縦軸はアポトーシス誘導率を示し、横軸はイムノトキシン濃度を示す。黒丸はリコンビナントタイプイムノトキシンを示し、白丸は対象として用いたVH-PEを示す。
【図５】図5は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンのがん増殖抑制効果を示す。C6ラットグリオーマ(1 x 106)を0.1 mLの50%マトリゲルに縣濁し、ヌードマウスに移植し、移植後2日-14日（2隔日）にかけてイムノトキシン(IT)を腫瘍に直接投与した。対照群１：生理食塩水, 対照群２：VH-PE, Low: 0.4 μgイムノトキシン, High:2 μgイムノトキシン 横軸は移植後の日数を、縦軸は腫瘍の体積を示す。
【図６】図6は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンの血管新生抑制効果を示す。CD31は血管新生のマーカータンパク質、F4/80はマクロファージのマーカータンパク質である。各抗体によって認識された細胞は赤色を呈する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん関連マクロファージを標的とする固形がん治療剤に関する。より具体的には、本発明は、がん関連マクロファージの葉酸受容体β（以下、「FRβ」とも称する）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む固形がん治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの増殖や転移には、しばしば炎症反応が関与する。この炎症反応において中心的な役割を担うと考えられているのが、がん組織に局在するがん関連マクロファージである。がん関連マクロファージは、本来免疫担当細胞であり、がんを攻撃するためのインターロイキン(IL)、インターフェロン(IFN)などのサイトカインを産生するが、一方、がんの進行を促進する血管新生因子(VEGF)などのサイトカインも産生することが知られている。具体的には、がん関連マクロファージの数は、臨床的にある種のがんの悪性度と相関を示し（非特許文献１）、がん増殖や転移に必要な血管新生を促進させると同時に、がんに対する免疫反応を抑制させる働きをもつ（非特許文献２）。また、マクロファージから分化した破骨細胞は、がんの骨転移において骨破壊を起こすことが知られている。
【０００３】
これまで、がん関連マクロファージで高発現する種々の物質が報告されている。例えば非特許文献3によれば、がん関連マクロファージにおいてスカベンジャー受容体が高発現されることが報告されている。また、非特許文献4によれば、Legumainと呼ばれる細胞内プロテアーゼが、がん関連マクロファージで特異的かつ高発現していることが報告されている。しかし、スカベンジャー受容体は正常マクロファージでも発現するため、これを標的としたがん療法は副作用のリスクを伴う。Legumainは細胞表面に露出しない細胞内タンパク質であるため、抗体療法の標的としては適当ではない。このように、現在までに、抗体療法の有意な副作用のリスクがなく、かつ抗体療法に適したがん関連マクロファージの標的分子は見出されていない。
【０００４】
本発明者らは、先に、抗ヒト葉酸受容体β(FRβ)マウスモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的解析により、関節リウマチの滑膜組織中で活性化したマクロファージ表面にはFRβが高発現し、正常組織や末梢血での発現はみられないか非常に低いことを見出した。
【０００５】
さらに、本発明者らは、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体の抗原認識部位遺伝子と遺伝子改変型の緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）遺伝子とを融合させたリコンビナントタイプイムノトキシンを作製し、SCIDマウス-関節リウマチ滑膜移植モデルにおいて、該イムノトキシンによるFRβ発現マクロファージの選択除去が、関節リウマチの治療に有効であることや、関節リウマチに見られるマクロファージから破骨細胞への分化や血管新生を抑制することを報告してきた（特許文献1、非特許文献5、6、7）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO 2005/103250
【非特許文献１】de Visser KE, Eichten A, Coussens LM. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nat Rev Cancer. 2006 Jan; 6(1):24-37.
【非特許文献２】Dirkx AE, Oude Egbrink MG, Wagstaff J, Griffioen AW. Monocyte/macrophage infiltration in tumors: modulators of angiogenesis. J Leukoc Biol. 2006 Dec; 80(6): 1183-96.
【非特許文献３】Bak SP, Walters JJ, Takeya M, Conejo-Garcia JR, Berwin BL. Scavenger receptor-A targeted leukocyte depletion inhibits peritoneal ovarian tumor progression. Cancer Res. 2007 May 15; 67(10): 4783-9.
【非特許文献４】Luo Y, Zhou H, Kreuger J, Kaplan C, Lee SH, Dolman C, Markowitz D, Wu W, Liu C, Reisfeld J Clin Invest. 2006 Aug; 116(8): 2132-2141.
【非特許文献５】Nakashima-Matsushita N, Homma T, Yu S, Matsuda T, Sunahara N, Nakamura T, Tsukano M, Ratnam M, Matsuyama T. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1999 Aug; 42(8): 1609-16.
【非特許文献６】Nagayoshi R, Nagai T, Matsushita K, Sato K, Sunahara N, Matsuda T, Nakamura T, Komiya S, Onda M, Matsuyama T. Effectiveness of anti-folate receptor beta antibody conjugated with truncated Psuedomonas exotoxin in the targeting of rheumatoid arthritis synovial macropahges. Arthritis Rheum. 2005 Sep; 52(9): 2666-75.
【非特許文献７】Nagai T, Tanaka M, Tsuneyoshi Y, Matsushita K, Sunahara N, Matsuda T, Yoshida H, Komiya S, Onda M, Matsuyama T. In vitro and in vivo efficacy of a recombinant immunotoxin against folate receptor beta on the activation and proliferation of rheumatoid arthritis synovial cells. Arthritis Rheum. 2006 Oct; 54(10): 3126-34.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、がん関連マクロファージを標的とする新規固形がん治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今回、FRβはマクロファージ表面に発現するが、正常部位にはほとんど発現が見られないことから、がん関連マクロファージに対する候補標的分子であろうと予測し、ヒト悪性グリオーマ組織を一例として選択し、該組織におけるがん関連マクロファージのFRβ発現を免疫組織学的に検討したところ、全ての検体においてFRβが発現されていることを見出した（図１、２）。
【０００９】
また、本発明者らは、抗マウスFRβに対するラットモノクローナル抗体を作製し、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ移植モデルにおいて、がん周辺部のマクロファージにおけるFRβ発現を免疫組織学的に検討し、ヒト悪性グリオーマと同様に、がん周辺のマクロファージでFRβの発現を確認した（図３）。
【００１０】
本発明者らはさらに、抗マウスFRβ抗体と緑膿菌外毒素とを含むリコンビナントイムノトキシンを作製し、これをin vitroにてFRβ発現細胞株、チオグリコレートで誘導したマウス腹腔マクロファージ（炎症性マクロファージ）などに適用し、これらの細胞株や炎症性マクロファージの細胞死を引き起こすことを見出した。さらにまた、本発明者らは、今回、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ移植モデルにおいても、上記リコンビナントイムノトキシンの投与により、がん組織の増殖と周囲の血管新生が抑制されることを見出した。
本発明は、上記の新規知見を基礎とするものである。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
(1) 葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含み、かつ、FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死を引き起こし、これによって、該マクロファージが集積する固形がんの増殖を抑制することを可能にする、固形がん治療剤。
【００１２】
(2) 前記固形がんは、悪性グリオーマ又は乳がんである、上記(1)記載の固形がん治療剤。
【００１３】
(3) 前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、上記(1)又は(2)記載の固形がん治療剤。
【００１４】
(4) 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、上記(1)〜(3)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１５】
(5) 前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、上記(1)〜(4)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１６】
(6) 前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１７】
(7) 前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１８】
(8) 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、上記(1)〜(7)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００１９】
(9) 前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖（L鎖）可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(8)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００２０】
(10) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
(11) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２２】
(12) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２３】
(13) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２４】
(14) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
(15) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
(16) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２７】
(17) 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
(18) 前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)からなる群から選択されるものである、上記(1)〜(17)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００２９】
(19) 前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【００３０】
(20) 前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の固形がん治療剤。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の固形がん治療剤は、がんの増殖及び転移に関係するがん関連マクロファージの細胞死又は細胞傷害を選択的に誘導し、これによって、該がん関連マクロファージが集積する、悪性グリオーマ、乳がんなどの固形がんの増殖抑制又は縮退を引き起こすことを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の固形がん治療剤についてさらに説明する。
【００３３】
本発明の固形がん治療剤の特徴は、
(1) 葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含むこと、
(2) FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死が引き起こされること、
(3) 前記マクロファージが集積する固形がんの増殖が抑制されること、ならびに、
(4) 前記固形がんにおいて血管新生が抑制されること、
を包含する。
【００３４】
本明細書で使用される「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、哺乳動物のがん関連マクロファージの細胞表面に発現される受容体タンパク質を意味する。このマクロファージは、特定のがんの周囲に集積する性質を有している。
【００３５】
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物などが含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
【００３６】
本明細書で使用される「葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは、がん関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体（例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など）であってもよい。これらの抗体はまた、固形がん細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、がん関連マクロファージ及び固形がんの両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００３７】
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、がん関連マクロファージ及び、場合により、がん細胞を死滅させる又は障害する能力をもつ任意の物質を指す。
【００３８】
1. 複合体
本発明の治療剤の有効成分としての複合体は、上記のとおり、がん関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ（及び場合により、がん細胞）の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
【００３９】
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などが含まれる。
【００４０】
本発明の複合体が上記抗体と細胞毒素からなるとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー（例えばペプチド）を介して、結合することができる。一方、本発明の複合体が上記抗体と細胞毒性剤からなるとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
【００４１】
本発明によれば、がん細胞を異物として認識してそれを攻撃するはずのマクロファージに対して細胞死を誘発することによって、その結果として、固形がんの増殖が抑制されるという意外な医薬効果が提供される。
【００４２】
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、がん関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性をもつタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの１つであるFRα（例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70％のアミノ酸配列同一性がある（特表2008-500025））と結合しないことが望ましい。
【００４３】
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、５以上、好ましくは7以上、より好ましくは８以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約５〜約10アミノ酸からなり、かつ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
【００４４】
本発明の抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
【００４５】
本発明の抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス（IgA, IgG, IgE, IgD, IgMなど）及びサブクラス(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2など)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
【００４６】
本発明の抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、１つの重鎖と１つの軽鎖からなるダイマーなどを含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
【００４７】
本発明の抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などであってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体（scFv）、二重特異性抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb (single chain diabody),dsFv-dsFvなどが含まれる（浅野竜太郎,生化学77(12)1497-1500,2005参照）。
【００４８】
以下、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
【００４９】
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原（抗原）として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、５以上、好ましくは７以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列からなるマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
【００５０】
かかるFRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報（例えば配列番号１など）に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank（NCBI、米国）、EMBL(EBI、欧州)などから入手可能である。
【００５１】
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)などを参照することができる。
【００５２】
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明の抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明の抗体を製造してもよい。
【００５３】
本発明のポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド（細菌細胞壁関連ペプチドの一種）等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1〜7回の免疫を行い、最後の免疫日から１〜７日後に、ELISA等の酵素免疫測定法などによって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで１回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
【００５４】
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞（例えば脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞など）と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。かかるハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら（Nature(1975)256: 495-96）の方法に準じて行うことができる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体の例として、ヒトFR-β発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られたマウス-マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
【００５６】
また本発明のモノクローナル抗体の他の例として、マウスFR-β発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られたラット-ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
【００５７】
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス-マウスハイブリドーマクローン36細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に、マウス-マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。また他の例として、ラット-ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号７及び８に、ラット-ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。
【００５８】
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、L鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
【００５９】
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
【００６０】
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体；及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸の相補的配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
【００６１】
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個を指す。
【００６２】
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号３、５、７、９）、L鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性％は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数/位置（例えば、一部重複する位置）の総数ｘ100）。
【００６３】
2つの配列間の同一性％の決定は、例えばカーリン（Karlin）及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990) J. Mol. Biol. 215: 403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI-BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ（Myers）及びミラー（Miller）(1988)、CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
【００６４】
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC（150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2）、0.1〜0.5％ SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3％SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1％SDSを含む溶液、および１×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６５】
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
【００６６】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記）、Ausubelら（上記）などに記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
【００６７】
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis）を用いて常法により導入することができる（Proc Natl Acad Sci USA., 1984 81:5662；Sambrook ら（上記））。
【００６８】
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
【００６９】
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。
【００７０】
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫したのち、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中などからその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物のなかには、内因性抗体遺伝子を欠失したかつヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシなどのヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる（例えば国際公開WO 96/9634096、WO 96/33735、WO98/24893など）。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞（例えばB細胞）とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００７１】
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００７２】
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。本発明のキメラ抗体は、例えばMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
【００７３】
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットmAb由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10％未満が望ましい。
【００７４】
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体（又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体）のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR１、２及び３)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
【００７５】
(1) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７６】
(2) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７７】
(3) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７８】
(4) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７９】
(5) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも90％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８０】
(6) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８１】
(7) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８２】
(8) 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体：
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８３】
上記マウスドナー配列に適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体のH鎖又はL鎖の配列とのコンピュータ比較によって同定されうる。そのフレームワーク配列がマウスL鎖可変領域及びH鎖可変領域のフレームワーク領域と高い配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインは、マウスフレームワーク配列を用いてNCBI BLAST（米国）を利用するKabatデータベースに照会することによって同定することができる。このとき、マウスドナー配列と80％以上、好ましくは90％以上の配列の同一性を共有するアクセプター配列を選択することができる。ラットドナー配列についても同様に、それに適するヒトアクセプター抗体配列を同定することができる。
【００８４】
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
【００８５】
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
【００８６】
本発明の抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体（scFv）であってもよい。本発明の一本鎖抗体は、例えば本発明のモノクローナル抗体のH鎖可変領域（例えば配列番号３、５、７、９）及びL鎖可変領域遺伝子（例えば配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
【００８７】
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒は、がん関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）、リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)などを挙げることができる。本発明においては、特に、緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
【００８８】
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などから適宜選択可能であり、慣用的にがんの化学療法に使用されるものが望ましい。このような細胞毒性剤としては、がん関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現するがん細胞の場合には、がん細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
【００８９】
1.3 リコンビナントイムノトキシンなどの複合体
本発明の複合体の１つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された本発明の抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明に係るリコンビナントイムノトキシンとは、標的（すなわちFRβタンパク質）に結合する本発明の上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
【００９０】
本発明の抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）を利用し、該反応性基と反応しうる官能基をもつ細胞毒と該抗体とを接触させることによって、本発明のリコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、本発明の抗体のH鎖可変領域遺伝子（配列番号３、５、７、９）及びL鎖可変領域遺伝子（配列番号４、６、８、１０）の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、本発明のリコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤などによってメルカプト基(-SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
【００９１】
本発明のリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス-マウスハイブリドーマクローン36細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス-マウスハイブリドーマクローン36と緑膿菌害毒外のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス-マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
【００９２】
本発明の複合体のもう１つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体蛋白質のNH2基、SH基、OH基、COOH基などを利用し、これと反応性の官能基をもつ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
【００９３】
2. 治療剤
こうして作製された本発明の複合体は、がん関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、がん関連マクロファージの細胞死を誘導することができる（下記実施例5及び図4参照）。
【００９４】
さらに、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体をリガンドとするリコンビナントイムノトキシンを作製し、ヌードマウス-ラットC6グリオーマ皮下移植モデルにおいて該イムノトキシンによるがん関連マクロファージの選択的排除の効果を検討したところ、がん組織の増殖及びがん組織周囲の血管新生を抑制することが確認された（下記実施例6、7及び図5、6参照）。
【００９５】
このように、本発明のリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、悪性グリオーマを含む固形がんに対する治療効果を有するものである。また、本発明の複合体は、がん関連マクロファージにおいて特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
【００９６】
本発明の複合体は、これを有効成分として含む固形がん治療剤として製剤化される。すなわち、本発明の固形がん治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、固形がん治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路など様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明の複合体が1日当たり３０μg以上、好ましくは４０μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
【００９７】
本発明の固形がん治療剤は、本発明の複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体などの1種以上を含むことができる。また固形がんの治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。かかる薬剤として、これに限定されるものではないが安定化剤としてヒト血清アルブミン、細胞傷害能のある化学療法剤があげられる。代謝拮抗剤であるシトシンアラビノシド(cytosine alabinoside)、フルオロウラシル(fluorouracil、)メソトレキサート(methotrexate)、アミノプテリン(aminopterin)、アンスラサイクリン(anthracycline)、マイトマイシン(mitomicin)、デメコルシン(demecolcine)、エトポシド(etoposide)、ミスラマイシン(mithramicin)、アルキル化剤であるクロラムブチル(chlorambucil)、メルファラン(melpharan)、エンドキサン(endoxan)、DNA合成阻害剤であるダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、アドリアマイシン(adriamycin)、チューブリン阻害剤であるコルヒチン(colchicine)、タキサン(taxane)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)などを挙げることができる。
【００９８】
本発明の固形がん治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明の固形がん治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
【００９９】
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射などが考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明の固形がん治療剤を接触させてもよい。
【０１００】
本発明の固形がん治療剤による治療に有効な固形がんとして、例えば悪性グリオーマ、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、肺がんなどを挙げることができる。また、手術の適用が困難な転移がん組織の縮退にも効果的であると考えられる。
【０１０１】
本発明の固形がん治療剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、固形がんに罹患している患者、固形がんを治療している患者、固形がんの予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコなどを例として挙げることができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【０１０３】
実施例１．抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜またはBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、またはBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜：agaaagacatgggtctggaaatggatg（配列番号１５）；マウス肝臓：tctagaaagacatggcctggaaacag（配列番号１６）)およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜：gactgaactcagccaaggagccagagtt（配列番号１７）；マウス肝臓：cccaacatggatcaggaact（配列番号１８）)を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわちPCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1-TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
【０１０４】
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50 mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次にあらかじめEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER-BOS(Mizushima et al. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase (Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入ならびに、FRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
【０１０５】
pEF-BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300-19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、あらかじめ1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300-19マウス細胞およびラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜：agaaagacatgggtctggaaatggatg（配列番号１５）；マウス肝臓：tctagaaagacatggcctggaaacag（配列番号１６）)およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜：gactgaactcagccaaggagccagagtt（配列番号１７）；マウス肝臓：cccaacatggatcaggaact（配列番号１８）)をBioneer PCR premix (Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
【０１０６】
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300-19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス（抗ヒトFRβモノクローナル抗体用）あるいはWhister Kyotoラット（抗マウスFRβモノクローナル抗体用）の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
【０１０７】
モノクローナル抗体の作成はKolerの方法(Kohler & Milstein, Nature(1975)256:495-96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS-1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
【０１０８】
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴あたり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
【０１０９】
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウスおよびラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
【０１１０】
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)および軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36bおよび94bはIg-Prime Kitを用いてVHおよびVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VHおよびVLの遺伝子を増幅した。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
【０１１１】
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig-Prime KitおよびラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag（配列番号１９）)を用い、VHおよびVLの遺伝子をPCRに増幅させた。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。解析後のCL5とCL10の塩基配列を図２に示す。
【０１１２】
実施例2．ヒト悪性グリオーマにおけるFRβ陽性マクロファージの検出
ヒト悪性グリオーマ組織は、鹿児島大学病院脳神経外科学より供与を受けた。尚、個人情報取り扱い、ならびに倫理審査に関しては、当大学病院の規定に基づいておこなった。ヒト悪性グリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて10μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(94b)、ならびにマクロファージ全般のマーカーであるCD163に対するCD163マウスモノクローナル抗体を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびCD163陽性細胞の検出を行った。
【０１１３】
ヒト悪性グリオーマにおけるFRβ陽性細胞の局在を図1に示す。FRβならびにCD163抗体でラベル化された細胞は、AECによって赤色に染色される。これより、ヒト悪性グリオーマ組織に浸潤したCD163陽性のうち、FRβ陽性細胞も同部位で検出された。
【０１１４】
次に、直接的にFRβ発現細胞がCD163発現マクロファージであることを証明するために、蛍光二重染色を行った。すなわち、ローダミン蛍光色素(molecular probe)でラベルした94bとFITC蛍光色素(molecular probe)でラベルしたCD163抗体を作製し、上記と同様の手法でグリオーマ組織に滴下し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。蛍光二重染色の結果を図2に示す。グリオーマ組織中でFRβを発現している細胞は赤色を、CD163を発現している細胞は緑色で検出され、両者を発現している細胞は橙-黄色で検出される。以上の結果より、悪性グリオーマ中ではFRβを発現するマクロファージが局在することが明らかとなった。
【０１１５】
実施例3．C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの検出
1x106個に調整したラットグリオーマ細胞をBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植し、飼育を行った。経日的にグリオーマ組織の増殖が視認されることを確認後、飼育20日目にマウスを安楽死させてグリオーマ移植組織を摘出した。摘出したグリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて6μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗マウスFRβマウスモノクローナル抗体(CL5)ならびに抗マウスマクロファージマーカーモノクローナル抗体(F4/80, R&D)を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびF4/80陽性細胞の検出を行った。C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性細胞の局在を図3に示す。グリオーマの近傍に浸潤したF4/80陽性マクロファージでFRβ陽性が検出された。
【０１１６】
実施例4．リコンビナントイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（VH）にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン (塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センス：cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag（配列番号２０）、アンチセンス：cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg（配列番号２１）)、Quick change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用いて実施例1で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1-TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センス：gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgg gtcgc（配列番号２２）、アンチセンス：gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac（配列番号２３）)。
【０１１７】
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1-Blueに遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン (塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
【０１１８】
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVHおよびCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
【０１１９】
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc（配列番号２４）とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg（配列番号２５）を、CL10の５’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg（配列番号２６）とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc（配列番号２７）をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
【０１２０】
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1-TOPO-94bVHおよびpCR2.1-TOPO-CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79-VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
【０１２１】
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センス：taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc（配列番号２８）（このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である）アンチセンス：gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt（配列番号２９）（このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある）。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc（配列番号３０）およびgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt（配列番号３１）)。
【０１２２】
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1-TOPO-94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1 mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79-VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列を Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
【０１２３】
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79-94bVHPE、pRK79-CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79-VL94b、pRK79-VLCL10を50 ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15-18時間の培養で行った。
【０１２４】
選択終了後の大腸菌は1000 mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600 nmで1.0-1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl-beta-D-thio-galactopyranoside)を終濃度1 mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、20 mM EDTAを含む)を用いて200 mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2 mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、2.5%のTritonX-100、0.5 M NaCl、20 mM EDTAを含む)で 200 mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2 mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50 mMトリス緩衝液(pH 7.4、2.5%のTritonX-100、0.5 M NaCl、20 mM EDTAを含む)で 200 mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000 x gで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を５回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6 Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10 mg/mLとなるように調節した。
【０１２５】
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b-VHPEと94b-VL、CL10-VHPEとCL10-VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
【０１２６】
まず、0.5 mLのVHPE、0.25 mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10 mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75 mLの0.1 Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5 M アルギニン、0.9 mM 酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5 mLまで濃縮し、さらに50 mLのトリス緩衝液(pH 7.4、0.1 M 尿素、1 mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
【０１２７】
次に、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi-Trap Q（GE）に、30 mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH 7.4、0.3 M NaCl、1 mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ (POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10 mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH 7.4、1 mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0 Mから1.0 MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25 mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS-PAGEにて確認後、-80℃で保存した。
【０１２８】
[SDS-PAGEによる純度検定]
SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130 mM グリシン、25 mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100 mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30 mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液（ナカライテスク）でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
【０１２９】
実施例5．リコンビナントイムノトキシンのFRβ発現細胞のアポトーシス誘導効果（細胞傷害）の検証
実施例1と同様の手法にてマウスFRβを恒常発現させるB300-19細胞を作製し、リコンビナントタイプイムノトキシンのアポトーシス誘導効果（細胞傷害）を検証した。リコンビナントタイプイムノトキシンのアポトーシス誘導効果（細胞傷害）はプロピジウムイオジウム(Propidium iodium)とDNAの結合をフローサイトメータ―にて測定した。
【０１３０】
まず2x105個に調整したマウスFRβ発現B300-19にリコンビナントイムノトキシンの濃度を変えた条件で種々の時間で培養した。培養終了後、細胞を生理的食塩水で洗浄し、細胞ペレットに40μg/mLの濃度に調整したプロピジウムイオジウム(Propidium iodium)溶液を0.5 mL加えて室温で一晩培養後、蛍光強度をフローサイトメータ―にて測定した。
図5はマウスFRβ発現B300-19と種々の濃度におけるリコンビナントイムノトキシン(X軸に示す)を添加した際の培養時間における細胞死の割合(Y軸に示す)を示したものである。結果は4回の独立した実験の平均値で、エラーバーは標準偏差を示す。
【０１３１】
実施例6．リコンビナントイムノトキシンのがん増殖抑制効果の検証
1 x 106個に調整したラットグリオーマ細胞をBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植し、飼育を行った。移植２日後から14日後までにかけて、リコンビナントタイプイムノトキシンを2μgあるいは0.5μgのリコンビナントタイプイムノトキシンを生理的食塩水で10μLに希釈調整し、マウスの左側移植部位に投与した。右側は生理的食塩水および2μgのVH-PEを10μLに調節して投与した。
【０１３２】
移植グリオーマ組織の最大および最小直径を経日的にキャリパーを用いて計測した。移植グリオーマ組織の体積は、（最大直径x最小直径x最小直径x3.14）/6にて算出した。飼育20日目にマウスを安楽死させてグリオーマ移植組織を摘出した。リコンビナントタイプイムノトキシンによるラットC6グリオーマの増殖抑制効果を図5に示す。横軸(X軸)はラットC６グリオーマ移植後の日数を示し、縦軸(Y軸)は腫瘍体積を示す。図５より、2および0.5μgのリコンビナントタイプイムノトキシン投与はラットC６グリオーマの増殖を顕著に抑制することが確認できた。
【０１３３】
摘出したグリオーマ組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結組織ブロックにした。凍結ブロックをクライオスタットにて6μmに薄切し、連続凍結組織標本を作製した。作製後、室温で十分に乾燥させた後、アセトンにて固定した。固定後、組織をリン酸緩衝液(PBS: pH7.3, 0.15 M NaCl)にて洗浄した後、3%カゼインを含むPBSを組織上に滴下し、室温で30分間培養した。培養後、200倍に希釈した抗マウスFRβマウスモノクローナル抗体(CL5)ならびに抗マウスマクロファージマーカーモノクローナル抗体(F4/80, R&D)を滴下し、室温で60分間培養した。培養終了後、0.15 %過酸化水素を含むPBSにて内因性のペルオキシダーゼを消化し、さらにPBSで洗浄を行った。洗浄後、ヒストファインMAX-PO(ニチレイ)にて二次抗体を滴下し、室温で30分間反応させた。反応終了後、PBSで洗浄し、アミノエチルカルバゾール(AEC)染色キット（ニチレイ）にて、FRβおよびF4/80陽性細胞の検出を行った。さらに、各投与群におけるFRβ陽性細胞ならびにF4/80で染色されるマクロファージの数を比較した。図5にリコンビナントタイプイムノトキシン投与によるラットC6グリオーマ組織内のFRβ陽性細胞とF4/80陽性マクロファージ数の減少を示す。
【０１３４】
2μｇのリコンビナントタイプイムノトキシン投与群では対象群(VH-PE投与)に比べ、顕著にFRβ陽性細胞並びにF４/８０陽性マクロファージが減少した。
【０１３５】
実施例7．リコンビナントイムノトキシンの血管新生抑制効果の検証
実施例６と同様に、血管新生マーカーであるCD31の免疫染色を行った。用いた抗体は抗マウスCD31ラットモノクローナル抗体(B&D)を200倍に希釈して検出を行った。
【０１３６】
CD31で染色された細胞数の測定ならびに、新生血管の面積および周囲長をWesseling Pらが報告した悪性グリオーマの血管新生定量方法に従って行った(Wesseling P et al. Quantiative immunohistological analysis of the microvasculature in untreated human glioblastoma mutiforme. J Neurosurg 1994; 81:902-09)。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図1は、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体を用いた、がん関連マクロファージのヒト悪性グリオーマにおける局在を示す免疫組織染色結果である。FRβおよびCD163抗体で認識される細胞は赤色に発色する。CD163はマクロファージ全般に発現するタンパク質で、主にマクロファージマーカーとして使われる。
【図２】図2は、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体を用いた、がん関連マクロファージのヒト悪性グリオーマにおける局在を示す免疫蛍光二重染色結果である。青色色素は細胞の核を染色するDAPI染色である。黄-橙色に染色されているものはマクロファージでかつ、FRβを発現している細胞である。
【図３】図3は、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体を用いた、C6ラットグリオーマ移植モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの局在を示す免疫組織染色結果である。FRβおよびF4/80抗体で認識される細胞は赤色に発色する。
【図４】図4は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンのアポトーシス誘導効果を示す。FRβ発現B300-19細胞に対するイムノトキシンのアポトーシス誘導能をPropidium Iodiumの染色性によるフローサイトメータ―にて測定した。縦軸はアポトーシス誘導率を示し、横軸はイムノトキシン濃度を示す。黒丸はリコンビナントタイプイムノトキシンを示し、白丸は対象として用いたVH-PEを示す。
【図５】図5は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンのがん増殖抑制効果を示す。C6ラットグリオーマ(1 x 106)を0.1 mLの50%マトリゲルに縣濁し、ヌードマウスに移植し、移植後2日-14日（2隔日）にかけてイムノトキシン(IT)を腫瘍に直接投与した。対照群１：生理食塩水, 対照群２：VH-PE, Low: 0.4 μgイムノトキシン, High:2 μgイムノトキシン 横軸は移植後の日数を、縦軸は腫瘍の体積を示す。
【図６】図6は、実施例4で作製したリコンビナントイムノトキシンの血管新生抑制効果を示す。CD31は血管新生のマーカータンパク質、F4/80はマクロファージのマーカータンパク質である。各抗体によって認識された細胞は赤色を呈する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含み、かつ、FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死を引き起こし、これによって、該マクロファージが集積する固形がんの増殖を抑制することを可能にする、固形がん治療剤。
【請求項２】
前記固形がんは、悪性グリオーマ又は乳がんである、請求項１記載の固形がん治療剤。
【請求項３】
前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項１又は２記載の固形がん治療剤。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項５】
前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、請求項１〜４のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項８】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項９】
前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖（L鎖）可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項１０】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)からなる群から選択されるものである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項１９】
前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項２０】
前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項１】
葉酸受容体β（FRβ）に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含み、かつ、FRβ発現性のがん関連マクロファージの細胞死を引き起こし、これによって、該マクロファージが集積する固形がんの増殖を抑制することを可能にする、固形がん治療剤。
【請求項２】
前記固形がんは、悪性グリオーマ又は乳がんである、請求項１記載の固形がん治療剤。
【請求項３】
前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項１又は２記載の固形がん治療剤。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項５】
前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、請求項１〜４のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項１〜５のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項８】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項９】
前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖（L鎖）可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項１０】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号３に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号３に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号４に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号４に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号５に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号５に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号６に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号６に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号７に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号７に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号７に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号８に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号８に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号８に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号９に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号９に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号９に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
(a) 配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(b) 配列番号１０に示す塩基配列において１個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c) 配列番号１０に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号１０に示す塩基配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin）リシンＡ鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンＡ鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)からなる群から選択されるものである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の固形がん治療剤。
【請求項１９】
前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【請求項２０】
前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の固形がん治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−７７０２６（Ｐ２０１０−７７０２６Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３０８８２（Ｐ２００８−１３０８８２）
【出願日】平成２０年５月１９日（２００８．５．１９）
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１９日（２００８．５．１９）
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
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