アジュバントとしてのコレラホロトキシンの突然変異形
【課題】 毒性の低減した突然変異コレラホロトキシンの提供
【解決手段】 単一または二重アミノ酸置換または挿入を有する突然変異コレラホロトキシンであって、野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する突然変異コレラホロトキシン。かような突然変異コレラホロトキシンは免疫原性組成物にアジュバントとして、病原性細菌、ウイルス、真菌または寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲンまたは自己分子から選択される抗原に対する脊椎動物の免疫応答を強化するために有用である。
【解決手段】 単一または二重アミノ酸置換または挿入を有する突然変異コレラホロトキシンであって、野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する突然変異コレラホロトキシン。かような突然変異コレラホロトキシンは免疫原性組成物にアジュバントとして、病原性細菌、ウイルス、真菌または寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲンまたは自己分子から選択される抗原に対する脊椎動物の免疫応答を強化するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性突然変異コレラホロトキシンおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体の免疫系は病原体を攻撃するために様々なメカニズムを活性化する（非特許文献１）。しかしこれらすべてのメカニズムが免疫感作後に活性化される必要はない。免疫感作により誘導される防御免疫は、病原体に対抗または排除するために適当な免疫応答を誘導する免疫原性組成物の能力に依存する。病原体に依存して、これには細胞性および／または体液性免疫応答が必要となるかもしれない。多くの抗原は投与された時にそれら自体では免疫原性が不十分であるか、または免疫原性ではない。抗原に対する強力な適応免疫応答にはほとんどいつも、抗原が免疫応答を強化する物質であるアジュバントと一緒に投与される必要がある（非特許文献２）。
【０００３】
効果的な免疫感作法の必要性は、胃腸管、肺、鼻咽腔または尿生殖器面で、またはそれらを通って身体に入る急性の感染を引き起こす感染性生物に対して特に急がれている。これらの領域は、ほとんどが分泌免疫グロブリンＩｇＡからなる免疫グロブリンを含む粘膜に浸されている（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。この免疫グロブリンは多数のＩｇＡ−生産形質細胞に由来し、粘膜の下にある基底膜領域に浸潤する（非特許文献６；非特許文献７参照）。分泌型免疫グロブリンＩｇＡは分泌成分の作用を通して基底面に特異的に輸送される（非特許文献８）。
【０００４】
非経口免疫感作処方は通常、分泌型ＩｇＡ応答を誘導するには非効果的である。分泌型免疫は最もしばしば、粘膜に付随したリンパ様組織の直接的免疫感作を通して達成される。それらが１つの粘膜部位で誘導した後、ＩｇＡ−生産形質細胞の前駆体が溢出し、そして多様な粘膜組織に染み渡り、ここで最終的に分化して高率のＩｇＡ合成が起こる（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。徹底的な研究により、この共通粘膜免疫系を誘導する粘膜免疫感作の可能性（ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）が証明された（非特許文献１２）。稀な例外はあるが、効果的な免疫感作を達成するためには大用量の抗原が必要なので、この取り組みは精製された抗原に関しては現実的ではなくなった。
【０００５】
この問題を克服するために調査された方法の中に、粘膜アジュバントの使用がある。従来技術には抗原の免疫応答を強化する多数のアジュバントが知られている（非特許文献１３）。これらのアジュバントは抗原と混合した時、抗原を粒子状とし、抗原が体内により長期間留まることを助け、これによりマクロファージの取り込み上昇を促進し、そして免疫応答を強化する。しかし多くのアジュバントにより誘導される都合の悪い反応、またはそれらが粘膜免疫の誘導において効果が無いことから、免疫原性組成物を送達するためにより良いアジュバントの開発が必要となった。不幸なことには、今日までのアジュバントの開発はほとんど経験により実行されている（非特許文献１４）。すなわち抗原性組成物の送達に効果的なアジュバントを開発するためには、合理的およびより直接的な取り組みが必要である。
【０００６】
グラム陰性細菌であり、胃腸管の疾患であるコレラの原因菌であるコレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）により分泌されるトキシンは、アジュバントとして極めて有力である。コレラトキシン（ＣＴ）は３８２アミノ酸配列（配列番号１）として報告され（非特許文献１５）、これは１８アミノ酸シグナルを有する（配列番号１のアミノ酸１〜１８）。コレラトキシンホロトキシ分子は、トキシンの酵素活性の原因であるＣＴ−Ａ（配列番号２または配列番号１のアミノ酸１９〜２５８）と名付けられた１つのペプチドサブユニット、
およびトキシンの腸表皮細胞ならびにそれらの表面上にガングリオシドＧＭ１を含む他の細胞への結合に関与する各々がＣＴ−Ｂと名付けられた５つの同一ペプチドサブユニット（各々が２１アミノ酸シグナル（配列番号１のアミノ酸２５９〜２７９）に続いてＣＴ−Ｂペプチドサブユニット（配列番号１のアミノ酸２８０〜３８２）を有する）からなるヘキサヘテロマー複合体である（非特許文献１６；非特許文献１７）。コレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）により生産されるＣＴは、成熟ＣＴ−Ａ（配列番号２）のアミノ酸１８７位および１９９位のシステイン間の１つのジスルフィド結合ループ内でタンパク質溶解的に開裂されるＣＴ−Ａサブユニットを有する。この開裂は酵素的に活性なＡ１ポリペプチド（非特許文献１８）および断片Ａ１をＣＴ−Ｂペンタマーに連結するより小さいポリペプチドＡ２（非特許文献１９）を生じる。酵素的に活性な断片ＣＴ−Ａ１はエンテロサイト（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）に入った時に毒性を生じ、調節Ｇ−タンパク質（Ｇｓα）をＡＤＰ−リボシル化する。これはアデニル酸シクラーゼの構成的活性化、ｃＡＭＰの細胞内濃度の上昇および流体および電解質の小腸管腔への分泌を導き（非特許文献２０）、これにより毒性が引き起こされる。インビトロでＣＴのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、真核細胞内で小胞輸送（ｖｅｓｉｃｌｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に関与することが知られている小ＧＴＰ−結合タンパク質であるＡＲＦと呼ばれるアクセサリータンパク質の存在により刺激される（非特許文献２１）。
【０００７】
ＣＴと非関連抗原との同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、その抗原に対して同時発生の循環および粘膜抗体応答の誘導をもたらすことが報告された（非特許文献２２）。ヒトにおいて野生型ＣＴにより引き起こされる下痢のような望ましくない症状の同時発生を最少とするために、実質的に低減した毒性を有するＣＴホロトキシン形をアジュバントとして使用することが好ましい。ＣＴの突然変異体はより有用なアジュバントを達成する手段として示唆された。実質的に毒性が低減した突然変異コレラトキシンホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓと命名）を合理的に設計する１つの方法は、コレラ（ＣＴ）および関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ−Ｉ、ＬＴ−ＩＩａおよびＬＴ−ＩＩｂ）のファミリーに完全に保存されているトキシン分子中のアミノ酸残基を同定し、そして改変することである。実質的に毒性が低減した突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを生成するための別の合理的な方法は、ジフテリアトキシン（ＤＴ）および百日咳トキシン（ＰＴ）のようなＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ酵素活性を有する関連トキシンの骨格を含むＣＴ骨格の構造的配列に基づき、ＮＡＤ−結合に重要であることが同定されたホロトキシン分子のアミノ酸残基を改変することである（非特許文献２３；非特許文献２４）。
【０００８】
最近、ＣＴのそのように合理的に設計した、遺伝的に解毒された（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ）突然変異体が開示され、ここで１つの非保存的アミノ酸置換（グルタミン酸からヒスチジン）が、成熟Ａサブユニットのアミノ酸２９位でアミノ酸を改変することにより導入された（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ）。生成した突然変異体コレラホロトキシンは実質的に酵素的毒性が低減しているが、優れたアジュバント性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）および免疫原特性を有することが示された（特許文献２、引用により本明細書に編入する）。
【０００９】
このように実質的に低減した毒性を有するが、野生型ＣＴホロトキシンと同じかまたは強化されたアジュバント特性を有するＣＴホロトキシンのさらなる突然変異体を同定し、かつ／または合理的に設計する必要性が存在する。
【００１０】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／２９６，５３１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１８４３４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ，ＣＡ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，編集、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，「健常および疾患における免疫系（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）、第２版、カレントバイオロジー社（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）、ロンドン、英国（１９９６）
【非特許文献２】Ａｕｄｂｅｒｔ，Ｆ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｉｓｅ，Ｌ．Ｄ．１９９３ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１４：２８１−２８４）
【非特許文献３】Ｈａｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，１９６１ Ｉｎｔｌ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，２４１−２６７
【非特許文献４】Ｔｏｍａｓｉ，Ｔ．Ｂ．，ａｎｄ Ｚｉｇｅｌｂａｕｍ，Ｓ．，１９６３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４２，１５５２−１５６０
【非特許文献５】Ｔｏｍａｓｉ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９６５ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ，１２１，１０１−１２４
【非特許文献６】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｐ．ａｎｄ．Ｂａｋｌｅｉｎ，Ｋ，Ｓｃａｎｄ．１９７６ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１ （追補３６），１〜４５
【非特許文献７】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｐ．１９８４「健常および疾患におけるヒト鼻粘膜および扁桃の免疫機能（Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎａｓａｌ Ｍｕｃｏｓａ ａｎｄ Ｔｏｎｓｉｌｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、第２８頁および以下、肺および上呼吸管の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｕｐｐｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ）、Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ，Ｊ．編集、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、ニューヨーク州
【非特許文献８】Ｓｏｌａｒｉ Ｒ，ａｎｄ Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ，Ｊ−Ｐ，１９８５ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，６，１７−２０
【非特許文献９】Ｃｒａｂｂｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９６９ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．，１３０，７２３−７４４
【非特許文献１０】Ｂａｚｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９７０ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５，１０４９−１０５１
【非特許文献１１】Ｃｒａｉｇ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，１９７１ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ，１３４，１８８−２００
【非特許文献１２】Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９７８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６１，７３１−７３７
【非特許文献１３】Ｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｏ．ａｎｄ Ｅａｌｄｉｎｇ，Ｗ．，１９８４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２，２７３６−２７４１
【非特許文献１４】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，上記引用の頁１２〜２５から１２〜３５
【非特許文献１５】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７
【非特許文献１６】Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．，１９７６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，１２４２〜１２４８
【非特許文献１７】Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．，１９７３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２，３５５８〜３５６６
【非特許文献１８】Ｋａｓｓｉｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１２１４８〜１２１５２）
【非特許文献１９】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９７９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，５８５５−５８６１）
【非特許文献２０】Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｅｒｅｎ，Ｒ，１９７８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，３０５０〜３０５４
【非特許文献２１】Ｗｅｌｓｈ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，「ＡＤＰ−リボシル化因子：コレラトキシンを活性化し、そして小胞輸送を調節するグアニン−ヌクレオチトキ−結合タンパク質のファミリー（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ；Ａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｇｕａｎｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｃｈｏｌｅｒａ Ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」、天然トキシンのハンドブック：疾患における細菌のトキシンおよび毒素因子（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ｐ２５７〜２８０、第８巻、Ｍｏｓｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，編集、マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、ニューヨーク州 １９９５
【非特許文献２２】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７）。
【非特許文献２３】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，「熱−不安定性エンテロトキシン（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）（Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）」、タンパク質トキシンおよびそれらの細胞生物学における使用の指針（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ ａｎｄ Ｒａｐｐｎｏｌｉ，Ｒ，編集、オックスフォード大学出版、オックスフォード、英国（１９９７）
【非特許文献２４】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、「グラム−陰性細菌のコレラトキシンおよび関連するエンテロトキシン（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、第２２５〜２５６、天然トキシンのハンドブック：疾患における細菌のトキシンおよび毒素因子（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、第８巻（Ｍｏｓｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，編集、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州 １９９５
【発明の開示】
【００１１】
１つの観点では、本発明は野生型コレラホロトキシン（ＣＴ）に比べて、有意に低減した毒性を有するが、免疫系の有力な刺激物として機能する能力を保持したコレラホロトキシンの新規な突然変異した、免疫原性形態（ＣＴ−ＣＲＭｓと命名された）を提供する。具体的には本発明は望ましくは部位特異的突然変異誘発法により生成し、そして野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性を有するが、アジュバント特性に損失がない５個の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）に関する。
【００１２】
１つの態様では、本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸残基が別のアミノ酸に置換され、この置換は毒性に実質的な低減をもたらす。本発明の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンまたはグリシンに置換されている。アミノ酸位の決定について、ＣＴ−Ａの配列は配列番号２に例示されている。しかしＣＴ−Ａの他の変異体および断片も使用することができる。
【００１３】
別の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸４９位に単一のアミノ酸残基の挿入があり、この挿入は毒性に実質的な低減をもたらす。この観点および本明細書全体を通して、「Ａサブユニットの単一（または多数）のアミノ酸残基（１つまたは複数）の挿入があり」と言う時はいつでも、野生型残基（１つまたは複数）のアミノ酸位（１つまたは複数）［挿入アミノ酸番号（１つまたは複数）］が下にずれることを意味する。本発明の好適な態様では、アミノ酸残基ヒスチジンかＡサブユニッの
アミノ酸４９位に挿入され、これにより元の４９、５０位等にあったアミノ酸残基は５０、５１等にずれる。
【００１４】
第３の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭは実質的に低減したＣ
Ｔ毒性を有し、そしてＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸３５位および３６位に２つのアミノ酸残基の挿入があり、この挿入は毒性に実質的な低減をもたらす。本発明の観点の好適な態様では、アミノ酸残基グリシンおよびプロリンがＡサブユニットの３５位および３６位に挿入され、これにより元の３５位および３６位のアミノ酸残基は３７および３８等にずれる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭは実質的に低減したＣＴ毒性を有し、そしてＣＴのサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸残基３０にアミノ酸置換、そしてＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位に２つのアミノ酸残基の挿入があり、この置換および挿入は実質的に低減した毒性をもたらす。本発明の観点の好適な態様では、アミノ酸トリプトファンにＡサブユニットのアミノ酸３０位のチロシンが置換され、そしてＡサブユニットのアミノ酸位３１および３２にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンがそれぞれ挿入され、これにより元の３１位および３２位のアミノ酸残基は３３位および３４位等にずれる。
【００１６】
別の観点では、本発明は突然変異させたＣＴが今、免疫応答を刺激するトキシンの能力を抑制（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）せずに実質的に低減した毒性を有するように、通常の技術を使用して野生型ＣＴのＡサブユニットをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法を使用することにより、上記の新規ＣＴ−ＣＲＭｓを生産する方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらに別の観点では、選択した抗原、抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するためにアジュバントとして上記のような突然変異ＣＴ−ＣＲＭ、および製薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる免疫原性組成物を提供する。好ましくはＣＴ−ＣＲＭは選択した抗原に対する脊椎動物宿主の全身性および／または粘膜抗原性免疫応答を生成、または強化するために有用である。選択された抗原は病原性ウイルス、細菌、真菌または寄生生物に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片である。選択される抗原はガン細胞または腫瘍細胞に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片でもよい。選択される抗原はアレルゲンに対するアレルギー応答を緩和するようにＩｇＥの生産を妨害するようなアレルゲンに由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片でもよい。選択される抗原は、脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とする疾患を防止し、または処置するために、アミロイド前駆体タンパク質に由来するもののような望ましくない様式、量または場所で宿主より生産されるもの（自己分子）を表す分子の部分に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片に由来するものでよい。
【００１８】
本発明の観点の１つの態様では、上記のような選択された抗原と本発明の突然変異した免疫原性のＣＴ−ＣＲＭタンパク質、および製薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる選択された免疫原性組成物が提供される。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は１以上の上記の新規な解毒した突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）の有効なアジュバント量を含むことにより、脊椎動物宿主に免疫応答を誘導するために、免疫原性組成物のアジュバントとしてこれらＣＴ−ＣＲＭの使用法、または上記の選択された抗原を含む抗原性組成物の能力を上げる方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる観点では、上記のように実質的に低減した毒性をもつ新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列が提供される。好ましくはＤＮＡ配列（１つまたは複数）は、低減した毒性を有する突然変異ＡサブユニットおよびサブユニットＢの両方をコードする。あるいはＤＮＡ配列は低減した毒性をもつ突然変異Ａサブユニットのみをコードしてもよく、ここで改変したまたは突然変異ＣＴ−Ａはさらなる結合ドメインに融合されるか、またはＬＴ−Ｂと同時発現され、そして同時集合成（ｃｏ−ａｓｓ
ｅｍｂｌｅ）する。
【００２１】
本発明のさらなる観点では、本明細書に記載する免疫原性の解毒された突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むプラスミドが提供され、そしてここでそのようなＤＮＡ配列は宿主細胞でＣＴ−ＣＲＭの発現を支配する調節配列に操作可能に連結されている。好ましくは、調節配列は、アラビノース誘導性プロモーターを含んでなる。この観点の１つの態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１５と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンがトリプトファンに置換されている。本発明の別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１１と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンがグリシンに置換されている。
【００２２】
本発明の観点のさらに別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９０７と命名されたプラスミドを提供し、ここでＡサブユニットのアミノ酸４９位にアミノ酸残基ヒスチジンが挿入されている。本観点のさらに別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９０９と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンが挿入されている。さらなる態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１０と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸３０位のアミノ酸残基チロシンがアミノ酸残基トリプトファンに置換され、そしてＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンが挿入されている。
【００２３】
本発明のさらなる観点では、本明細書に記載するプラスミドで形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションされた適当な宿主細胞系が提供される。免疫原性の、解毒された突然変異コレラホロトキシンは、上記の１つのプラスミドで適当な宿主を形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションし、そして実質的に低減した毒性をもつ該組換え免疫原性突然変異コレラホロトキシンタンパク質の宿主細胞による発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することにより生産される。
【００２４】
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下の本発明の詳細な説明を読めば当業者には容易に明白となるだろう。
【００２５】
＜発明の詳細な説明＞
低減した毒性を現すが、それらの優れたアジュバント特性は保持するコレラホロトキシンの突然変異形、および免疫原性組成物中のアジュバントとしてＣＴｓのこれら突然変異形の用途を本明細書に記載する。
【００２６】
Ａ．突然変異体の解毒されたコレラトキシンホロトキシン
本発明のコレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）の新規な突然変異体である解毒された免疫原性形態は、野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性が特徴である。しかしそのようなＣＴ−ＣＲＭｓは免疫系の有力な刺激物としてそれらの能力を保持している。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは、コレラトキシンの成熟ＣＴ−Ａサブユニット中に１または数個のアミノ酸置換および／または挿入を特徴とする。本発明の種々の突然変異ＣＴ−Ａサブユニッ
トは、アジュバント性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）において野生型ＣＴに似ている突然変異ＣＴホロトキシンを形成するために、ＣＴ−Ｂサブユニットに集成する能力も保持するが、野生型ＣＴに比べて実質的に低減した毒性を現した。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは野生型ＣＴ−Ｂサブユニットに会合する突然変異体または改変したＣＴ−Ａサブユニットを使用して機能的ホロトキシンを作成することができる。あるいは本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは改変または突然変異ＣＴ−Ｂサブユニットに会合する改変または突然変異ＣＴ−Ａ サブユニットを含んでなることができる。
【００２７】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓのアミノ酸置換または挿入の位置を記載するアミノ酸位置の数の決定については、成熟ＣＴ−Ａは配列番号２、すなわち野生型ＣＴ配列の配列番号１のアミノ酸１９〜２５８に例示される。コレラホロトキシンのＡサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、国際公開第９３／１３２０２号パンフレットに説明する。同様に、適当な成熟ＣＴ−Ｂ配列は配列番号１のアミノ酸２８０〜３８２で具体的に説明される。しかしコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＣＴ−ＡおよびＣＴ−Ｂの他の変異体、バイオタイプおよび断片も本明細書に記載するアミノ酸置換および挿入を含む配列として使用することができる。例えばＣ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｈｕａ Ｈｓｕｅｈ Ｔｓａ Ｃｈｉｈ，９（４）：３９５−３９９のＥＬＴＯＲバイオタイプ；ＮＣＢＩデータベース位置Ｎｏ．ＡＡＣ３４７２８、およびコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）トキシンの変異体の他の供給源を参照にされたい。
【００２８】
本発明の１つの態様では、本発明の幾つかのＣＴ−ＣＲＭｓを生じるアミノ酸置換または挿入は、１つのアミノ酸を同様な構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えること、すなわち保存的アミノ酸の置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換または挿入は、関与する残基の極性、電荷、溶解性疎水性、親水性および／または両親媒性における類似に基づき作ることができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；極性／中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本発明は、単一アミノ酸置換をもつ２つ、単一アミノ酸挿入をもつ１つ、および二重アミノ酸挿入をもつ１つ、および単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入をもつ１つのＣＴ−ＣＲＭｓにより例示される。これらのＣＴ−ＣＲＭｓは実施例１に詳細に説明するように生成し、表１に説明するようにＡサブユニット中に以下の突然変異を含む。
【００２９】
【表１】
【００３０】
このように１つの態様では、本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸残基が、実質的に低減した毒性を生じる別のアミノ酸に置換されている。本発明の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンに置換される。本発明の別の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、グリシンに置換される。生成したＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇはそれぞれ優れたアジュバント特性を示す。
【００３１】
本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸位に単一のアミノ酸挿入を含んでなり、この挿入が実質的に低減した毒性を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸ヒスチジンがＡサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基に隣接して挿入され、優れたアジュバント特性を示す突然変異ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨを生じる。
【００３２】
本発明の別の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基に隣接したアミノ酸３５位および３６位に二重アミノ酸挿入を含んでなり、この挿入は毒性の実質的低減を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸グリシンおよびプロリンがＡサブユニットのアミノ酸３４位のグリシンに隣接して挿入されて突然変異ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰを生じ、これは優れたアジュバント特性を示す。
【００３３】
本発明のさらに別の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３０位に単一のアミノ酸置換およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位に二重アミノ酸挿入を含んでなり、この置換および挿入は毒性の実質的な低減を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸３０位のアミノ酸残基チロシンがアミノ酸残基トリプトファンに置換され、そしてその後にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンが挿入されて突然変異ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨを生じ、これは優れたアジュバント特性を示す。
【００３４】
本発明のさらに別のＣＴ−ＣＲＭｓは、上に具体的に記載した少なくとも単一置換または単一もしくは二重突然変異、およびさらに少なくとも１つのさらなる突然変異を、上記に説明した１以上のアミノ酸残基２５、３０、３１、３２、３４、３５、３６、４８および４９以外の位置に含むことができる。国際公開第９３／１３２０２号明細書（これは引用により本明細書に編入する）は、コレラホロトキシンの毒性を低減するために役立つＣＴ−Ａサブユニット中の一連の突然変異を記載する。これらの突然変異にはアミノ酸７位
のアルギニン、９位のアスパラギン酸、１１位のアルギニン、２９位のグルタミン酸、４４位のヒスチジン、５３位のバリン、５４位のアルギニン、６１位のセリン、６３位のセリン、７０位のヒスチジン、９７位のバリン、１０４位のチロシン、１０６位のプロリン、１０７位のヒスチジン、１１０位のグルタミン酸、１１２位のグルタミン酸、１１４位のセリン、１２７位のトリプトファン、１４６位のアルギニンおよびア１９２位のアルギニンに置換を作成することを含む。引用により本明細書に記載する国際公開第９８／４２３７５号パンフレットは、コレラホロトキシンの毒性を低減するために役立つＡサブユニット中のアミノ酸１０９をセリンへ置換することを記載する。
【００３５】
本発明に有用な他の有用な突然変異体タンパク質には、上記のように提供される１以上の特別な突然変異を持つ完全長のホロトキシン、および上記の突然変異した残基を含む６量体のＣＴ−ＣＲＭポリペプチドまたはそれらの断片を含み、そしてこのタンパク質、ポリペプチドまたは断片はそれが由来する野生型ＣＴのアジュバント性を保持するが、低減した毒性を特徴とする。低減した酵素活性を持つこれらＣＴ−ＣＲＭｓの免疫学的に活性な断片は、本発明の方法および組成物にも有用となり得る。通常、断片は上記の突然変異誘発部位を含むＣＴ−ＣＲＭサブユニットタンパク質の少なくとも少なくとも約２５個の連続するアミノ酸を含む。より典型的にはＣＴ−ＣＲＭサブユニット断片はＡまたはＢサブユニットの少なくとも約７５個の連続するアミノ酸を含む。ＣＴ−ＣＲＭサブユニットの別の断片は、いずれかのサブユニットの少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む。ＣＴ−ＣＲＭ ＣＴ−Ａサブユニットのさらに別の態様は、約１５０個のアミノ酸または２４０個未満のアミノ酸を含むことができる。
【００３６】
本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭｓの断片が、脊椎動物宿主に選択した抗原に対する免疫応答を生じる、または強化するならば、以下に記載する方法および組成物に有用である。断片にはＣＴ−ＣＲＭサブユニットのカルボキシ−末端領域の短縮を含む。例えばＣＴ−Ａ突然変異体サブユニットのみを含むように短縮化されたＣＴ−ＣＲＭは望ましい断片である。同様に、約残基２４０または２５０で短縮化されたＣＴ−Ａサブユニットは望ましい断片である。本発明のさらに別の断片ＣＴ−ＣＲＭｓを選択することができる。さらなるＣＴ−ＣＲＭホロトキシンの断片は、ＣＴ−Ｂサブユニットまたは短縮化ＣＴ−Ｂサブユニットの５個未満の反復を含むことができる。前述の断片は上記のような１以上の特別な突然変異を含んでもよい。
【００３７】
他の適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質には、１以上のアミノ酸残基が置換された基を含むものを含むことができる。さらに別の適当なＣＴ−ＣＲＭホロトキシンタンパク質は、６量体ＣＴ−ＣＲＭタンパク質の１以上のサブユニットが、分子の半減期を延ばすための化合物のような化合物に融合している（例えばポリエチレングリコール）。
【００３８】
別の適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質は、さらなるアミノ酸がリーダーまたは分泌配列、またはＣＴ−ＣＲＭタンパク質の免疫原性を強化するために使用される配列のような１以上のポリペプチドサブユニットに融合されたものである。ＣＴ−ＣＲＭｓのさらに他の修飾には、ＣＴのＮ末端でのＣＴ−Ａシグナルまたはリーダー配列、すなわち配列番号１のアミノ酸１〜１８の上に挙げた削除、および／またはＣＴ−Ｂシグナルまたはリーダー配列、すなわち配列番号１のアミノ酸２５９〜２７９の削除、および／または免疫原性を生じない他の領域の削除を含む。同様に本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭｓの修飾には、シグナルまたはリーダー配列の他のシグナルまたはリーダー配列への置換を含む。例えば引用により本明細書に編入する米国特許第５，７８０，６０１号明細書を参照にされたい。
【００３９】
適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質のさらに別の例は、多数のホロトキシンタンパク質を一緒にまたは担体に結合する目的で、任意のアミノ酸（例えば−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−）または他のアミノ酸もしくは化学化合物スペーサーがポリペプチドサブユニットの末端に含まれ
る得るものである。例えば有用なＣＴ−ＣＲＭｓには、担体タンパク質に結合した１以上の上記ＣＴ−ＣＲＭｓまたはそれらのサブユニットを含む。あるいは有用なＣＴ−ＣＲＭは、場合により担体タンパク質に結合した多数のＣＴ−ＣＲＭｓを含む融合タンパク質中に存在することができる。
【００４０】
これらの態様に関して、担体タンパク質は選択したＣＴ−ＣＲＭの免疫原性を強化することができる望ましくはタンパク質または他の分子である。そのような担体はアジュバント効果も有するより大きな分子でよい。例えば通例のタンパク質担体には、限定するわけではないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ、これは細菌においてガラクトース代謝の第１段階を触媒する）、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１タンパク質を含む。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドのようなトキソイド（すなわち自然に存在するトキシンをコードする配列、十分な修飾によりその毒性活性を排除する）、それらの各トキシンおよびＣＲＭ１９７（ジフテリアトキシンの非−毒性形、米国特許第５，６１４，３８２号明細書）のようなこれらタンパク質の突然変異体も担体として使用することができる。他の担体には緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシンおよびレトロウイルス粒子（レトロウイルスおよびＶＰ６粒子を含む）を含む。あるいは担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用してもよい。例えばハプテンを細菌トキシンのＴ細胞エピトープに結合させることができる。米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照にされたい。同様に、種々の細菌熱ショックタンパク質、例えばマイコバクテリアｈｓｐ−７０を使用してもよい。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は別の有用な担体である。当業者はこの内容に使用するための適当な担体を容易に選択することができる。融合タンパク質はタンパク質様材料を結合するための標準技法により形成することができる。融合物は以下に記載する組換えＤＮＡ技術により調製された融合遺伝子構築物から発現させることができる。
【００４１】
本明細書に記載する他の適当なＣＴ−ＣＲＭｓは、酵素的毒性を復活せず、そしてアジュバント性を消失させない修飾により、あるいはそのような特性の組み合わせにより具体的に例示したＣＴ−ＣＲＭｓから異なることができる。好ましくは、アミノ酸置換は１つのアミノ酸を同様な構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性疎水性、親水性および／または両親媒性における類似に基づき作ることができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；極性／中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００４２】
例えば、ＣＴ−ＣＲＭタンパク質のサブユニットの１次配列を改変するが、通常は分子の機能を改変しない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。そのような変化の作成には、アミノ酸のハイドロパシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）指数を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を付与するハイドロパシックなアミノ酸指数の重要性は、一般に当該技術分野で認識されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−３２）。特定のアミノ酸を同様のハイドロパシック指数またはスコアを有し、そしてそれでも同様な生物学的活性を持つポリペプチドを生じる他のアミノ酸に置換することができることは知られている。各アミノ酸はその疎水性および荷電特性に基づきハイドロパシック指数が割り当てられた。それらの指数は；イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３
．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタメート（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００４３】
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシック特性が生成するポリペプチドの２次および３次構造を決定し、これが次にポリペプチドと酵素、基質、受容体、抗体、抗原等のような他の分子との相互作用を定めると考えられている。当該技術分野ではアミノ酸を、類似のハイドロパシック指数を有する別のアミノ酸に置換し、そして機能的に均等なポリペプチドを得ることができることが知られている。そのような変化において、ハイドロパシック指数が＋／−２内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１内は特に好ましく、そして＋／−０．５内はさらに一層好適である。
【００４４】
同様のアミノ酸の置換または挿入は親水性に基づき作成することもでき、特にこれにより作成される生物学的に機能的な均等なポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的態様での使用に意図する。引用により本明細書に編入する米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、隣接するアミノ酸の親水性により支配される、ポリペプチドの最大の部分的平均親水性がその免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性に相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた；アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換し、そして生物学的に均等な、そして特に免疫学的に均等なポリペプチドを得ることができると理解されている。そのような変化において、親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく；±１内は特に好ましく；そして±０．５内はさらに一層好適である。
【００４５】
上に概説したように、アミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、荷電、サイズ等に基づく。様々な前述の特性を考慮する例示的置換は当業者には周知であり、そして：アルギニンとリシン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【００４６】
さらに通常はＣＴ−ＣＲＭタンパク質の１次配列を改変しない修飾には、ポリペプチドのインビボまたインビトロでの化学的誘導化、例えばアセチル化、メチル化またはカルボキシル化を含む。また本発明のＣＴ−ＣＲＭｓとして含まれるのは、グリコシル化により修飾されたこれらタンパク質、例えば合成およびプロセッシング中またはさらなるプロセッシング段階でポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより；あるいは哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素のようなグリコシル化に影響を及ぼす酵素に対してポリペプチドを暴露することにより作られるものを含む。またＣＴ−ＣＲＭｓとして包含されるのは、リン酸化アミノ酸残基を有する上に確認される突然変異した配列、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンである。
【００４７】
また本発明のＣＴ−ＣＲＭｓとして含まれるのは、タンパク質溶解的分解に対する耐性
を改善し、または溶解性を至適化するために、通例の分子生化学的技法を使用して修飾された上記配列である。そのようなＣＴ−ＣＲＭｓに含まれるのは、自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または自然に存在しない合成アミノ酸を含むものである。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓに存在することができる他の既知の修飾は、限定するわけではないがアシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセッシング、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニレーションのようなタンパク質へのトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸の付加、およびユビキチン化である。
【００４８】
ＣＴの構造および機能に影響を及ぼす表１の新規ＣＴ−ＣＲＭｓの表現型効果を評価した。ＣＴ−コード遺伝子の部位特異的突然変異誘発法により生成した単一アミノ酸置換、単一アミノ酸挿入、二重アミノ酸挿入または単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入のいずれかを持つ突然変異Ａサブユニットも、非変性ゲル電気泳動アッセイにより決定されるように、サブユニットＢの存在下でＣＴ−Ｂサブユニットと免疫反応性ホロトキシンに集成することができた（表２、実施例２を参照にされたい）。各突然変異ホロトキシンもＹ−１副腎腫瘍細胞アッセイで試験して、野生型ＣＴホロトキシンに比べてその残存毒性について測定した（表３および４、実施例３を参照にされたい）。これらホロトキシンはそれらのアジュバント性において野生型ＣＴに似ているが、表３に提示される結果は野生型コレラホロトキシンと比べた時、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが実質的に低減した毒性を有することを示した。単一および二重アミノ酸置換を持つＣＴ−ＣＲＭｓの残存毒性は、野生型ＣＴに比べて実質的に低減された。これらのデータは突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがホロトキシンであり、そして野生型ＣＴよりも実質的に毒性が低いことを証明している。具体的には突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはＹ−１マウス副腎細胞アッセイで野生型コレラホロトキシンよりも有意に低い毒性レベルを示した。
【００４９】
各突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイでも野生型ＣＴと比較した（実施例４を参照にされたい）。Ｙ−１副腎細胞アッセイで作成した毒性データと一般に一致するこの結果は、種々のＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性が野生型ＣＴと比べた時に実質的に低下していることを示した（表５および６）。
【００５０】
本明細書で使用する用語および句「低減した毒性を有するホロトキシン」または「実質的に低い毒性」等は、本明細書に記載する５個のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４３ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）のような本発明のＣＴ−ＣＲＭｓ突然変異体が、野生型ＣＴに比べて精製したトキシンタンパク質の単位あたり実質的に低い毒性を現すことを意味する。この「低減した毒性」は有意な副作用、特にＣＴに付随することが知られている、例えば下痢を引き起こすことなく免疫原性組成物中に各突然変異体をアジュバントとして使用することを可能とする。以下により詳細に記載するように、本発明の突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはＹ−１マウス副腎細胞アッセイで野生型ＣＴよりも有意に低レベルの毒性を、そして野生型ＣＴと比べた時に有意に低減したＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【００５１】
本発明の免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、生成した突然変異ＣＴタンパク質がアジュバントとして機能し、同時に導入される脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように低減した毒性と保持されたアジュバント性のバランスを現す。以下の実施例で示すよう
に、マウスモデルのアッセイ系における結果は、本明細書に開示する突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができた。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓのこれら特徴を支持する実験を以下にまとめ、そして実施例でより詳細に述べる。
【００５２】
免疫原性組成物中に含める候補として同定された細菌またはウイルス抗原を含む組成物用の粘膜アジュバントとして、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの効力を評価するために、２つの異なるモデル抗原系を調査した：（１）組換えＰ４外側膜タンパク質（型を分類できないインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細菌（ＮＴＨｉ）のタンパク質“ｅ”（ｒＰ４）としても知られている）（米国特許第５，６０１，８３１号明細書を参照にされたい）、および（２）モラクセーラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）細菌の自然なＵｓｐＡ２外膜タンパク質（国際公開第９８／２８３３３号パンフレット）。
【００５３】
重要なことは、データは突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが異なる抗原の鼻内投与後（ＩＮ）に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができることを示す。マウスモデル系での結果は、本明細書に開示されるすべての突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが、これらの異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができたことを示す。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた（表６〜１８を参照にされたい）。
【００５４】
本発明による免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、タンパク質がアジュバントとして機能し、同時に組成物で免疫感作した脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように、低減した毒性と保持されたアジュバント性のバランスを現す。
【００５５】
Ｂ．ＣＴ−ＣＲＭｓをコードする核酸分子
本発明の別の観点には、部位特異的突然変異、置換および／または挿入を有する上記のＣＴ−ＣＲＭｓおよび／またはそれらのサブユニット、あるいはさらに１以上のそれら突然変異、置換および／または挿入を有することができる断片をコードする、単離された、合成の、または組換え核酸分子および配列を含む。
【００５６】
ＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子は、好ましくは宿主細胞中でＣＴ−ＣＲＭの発現を支配する調節配列の制御下にあることができる。本明細書に記載するように、そのような核酸分子はインビトロでＣＴ−ＣＲＭタンパク質を発現するために、あるいはヒトでインビボでＣＴ−ＣＲＭタンパク質の発現を可能とするために使用することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「単離されたヌクレオチド分子または配列」は、自然な環境にある分子または配列に付随し得る他の生物学的成分の混入を含まない核酸セグメントまたは断片を称する。例えば本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列の１態様は、自然に存在する状態でそれを挟む配列から分離された配列、例えば自然に存在するゲノム中の断片に隣接する配列のような、断片に通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片である。さらに本発明のヌクレオチド配列および分子は、本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードするようにすでに改変されている。すなわち用語「単離された核酸分子または配列」は、細胞中の非突然変異核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質に自然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸配列または分子にも適用する。本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列は、組換え法、合成法、例えば突然変異誘発法、またはそのような方法の組み合わせのような他の常法により調製された配列および分子も包含する。本発明のヌクレオチド配列または分子は、本明細書に提示する具体的なヌクレオ
チド配列のみに限定するとは解釈されず、本明細書に提示するヌクレオチド配列と相同性を共有する（すなわち配列同一性を有する）任意の、かつすべてのヌクレオチド配列を含むと解釈されるべきである。
【００５８】
核酸またはそれらの断片に関して言う時、用語「実質的相同性」または「実質的類似性」とは適当なヌクレオチド挿入または欠失を含む核酸と別の核酸（またはその相補鎖）を最適に並列配置した時、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡのような周知の配列同一性アルゴリズムにより測定されるような、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％にヌクレオチド配列の同一性があることを称する。本明細書で使用する用語「相同的」は、２つのポリマー性分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子、あるいは２つのポリペプチド分子間の配列類似性を称する。２つの分子の両方のヌクレオチドまたはアミノ酸位が同じ単量体ヌクレオチドまたはアミノ酸で占有されている時、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンに占有されていれば、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は、対合するかまたは相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物配列において位置の半分（例えばサブユット長が１０のポリマーの５個の位置）が相同的ならば、２つの配列は５０％の相同性である。位置の９０％、例えば１０のうちの９が対合または相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＣＧ５’は５０％の相同性を共有する。本明細書で使用する用語「実質的に相同的」とは所望の核酸に対して約７０％の相同的、より好ましくは約８０％相同的、そして最も好ましくは約９０％相同的なＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００５９】
また本発明は、野生型ＣＴタンパク質に比べて低減した酵素的毒性を有し、そして野生型ＣＴのアジュバント性を保持する本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質またはサブユニットをコードする核酸に対して、少なくとも７０％、８０％または９０％相同的な核酸分子を含んでなる単離されたヌクレオチド分子を対象とする。さらに遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭの突然変異体または置換されたアミノ酸残基をコードする任意の３ヌクレオチドコドンも本発明の範囲内である。
【００６０】
本明細書で検討するように、ＣＴ−ＣＲＭｓ、突然変異ＣＴ−Ａサブユニットまたは突然変異ＣＴ−Ｂサブユニット、および／またはそれらをコードするＤＮＡ配列、あるいは本明細書に記載する核酸分子または組成物に有用な他の配列は、同定された配列に対するそれらの相同性または同一性の割合により定め、相同性の割合または同一性の割合を算出するために使用するアルゴリズムには以下を含む：Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：６７−７２；Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，分子配列の比較および整列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、（Ｍ．Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ，編集）。実践的なアプローチシリーズ：核酸およびタンパク質配列分析ＸＶＩＩＩ（Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＸＶＩＩＩ）、ＩＲＬ出版：オックスフォード、英国（１９８７）ｐｐ．４１７）、およびＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラム（Ｅ．Ｇ．Ｓｈｐａｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８：１７９−１９１）。これらは引用により本明細書に編入する。
【００６１】
本明細書で使用するように２つのＤＮＡが「操作可能に連結された」と記載することは、１本鎖または２本鎖ＤＮＡがそれぞれ２つのＤＮＡを含んでなり、そしてＤＮＡ配列の少なくとも１つがもう１つのＤＮＡに特徴つけられる生理学的効果を発揮できるように２つのＤＮＡがＤＮＡ中に並べられていることを意味する。
【００６２】
好ましくは本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質を生産すること、またはそれを細胞でインビボ生産するために投与することに使用するために、各ＣＴ−ＣＲＭタンパク質コード配列および必要な調節配列は、別のウイルスまたは非−ウイルス組換えベクターに存在する（核酸分子を細胞へ送達するための非−ウイルス法を含む）。あるいは本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質の二重コピーをコードする、または多数の異なるＣＴ−ＣＲＭｓをコードする２以上のこれら核酸配列をポリシストロン性転写、すなわち多くの遺伝子産物を発現するように設計された単一分子に含めてもよい。
【００６３】
本発明はさらに、免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むベクター、特にプラスミドに関する。望ましい態様には、例えばＣＴ−Ａのアミノ酸残基２５に単一アミノ酸置換、ＣＴ−Ａのアミノ酸残基４８と４９との間に単一アミノ酸挿入、ＣＴ−Ａのアミノ酸残基３４と３５との間に二重アミノ酸挿入、またはＣＴ−Ａのアミノ酸残基３０に単一アミノ酸置換およびアミノ酸３０と３１との間に二重アミノ酸挿入を有する免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを含む。本明細書に使用する用語「ベクター」は、ウイルスまたは非ウイルス、例えば細菌、外因性またはヘテロロガスな核酸配列をコードするように設計された種に由来するＤＮＡ分子を意味する。すなわちこの用語には通例の細菌プラスミドを含む。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウイルスまたはファージに由来するプラスミド配列を含むことができる。そのようなベクターは染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素およびウイルスに由来するベクターを含む。ベクターはプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素、コスミドおよびファジェミドから派生したような、それらの組み合わせに由来してもよい。この用語にはまた１つの細胞から他の細胞へ遺伝子を移す非−複製ウイルスも含む。この用語は例えばポリリシン化合物等のような核酸を細胞に移すことを促進する非−プラスミドおよび非−ウイルス化合物も含むと解釈すべきである。
【００６４】
本発明の核酸分子には非−ウイルスベクター、または本発明に従いＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする配列を宿主細胞に送達する方法を含む。種々の非−ウイルスベクターが当該技術分野では知られており、そしてそれらには限定するわけではないがプラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、「裸の」ＤＮＡおよびカチオン性脂質またはポリマーと縮合（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）したＤＮＡを含むことができる。
【００６５】
細菌ベクターの例には限定するわけではないが、とりわけカルメットとゲランの菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕ ｒｉｎ）（ＢＣＧ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）に由来する配列を含む。適当なプラスミドベクターには例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１，ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８およびｐＢＲ３２８を含む。
【００６６】
適当な誘導性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅ，６９：３０１−３１５）、アラビノース発現ベクター（例えば、ｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４１２１−４１３０）、およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐ
ＥＴＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現するウイルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎ１により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で存在するプロファージが持つＴ７ｇｎ１遺伝子から、宿主のＢＬ２１株（ＤＥ３）またはＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）により供給される。ｐＢＡＤ系はａｒａＣ遺伝子により調節される誘導性アラビノースプロモーターに依存する。このプロモーターはアラビノースの存在で誘導される。
【００６７】
１例としてｐＬＰ９９１１と命名されたプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからトリプトファン）を有する、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ）。別の例としてｐＬＰ９９１５と命名されたプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからグリシン）を有する、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）。ｐＬＰ９９０７と命名された第３のプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基トレオニンに隣接したアミノ酸４９位に単一アミノ酸ヒスチジンが挿入された、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ）。別の例のプラスミドはｐＬＰ９９０９と命名されている。このプラスミドはＡサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基グリシンに隣接したアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンの二重アミノ酸挿入が挿入された、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ）。本発明で例示する別のプラスミドはｐＬＰ９９１０と命名されている。これはＡサブユニットのアミノ酸３０位に単一アミノ酸置換（アミノ酸３０位でアミノ酸残基チロシンのアミノ酸残基トリプトファンへの置換）、およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基の二重アミノ酸挿入（アラニンおよびヒスチジン）がなされた、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）。
【００６８】
別の種類の有用なベクターは１本または２本鎖バクテリオファージベクターである。例えば適当なクローニングベクターには限定するわけではないがとりわけ、バクテリオファージλベクター系、λｇｔ１１、μｇｔμＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、λｇｔ−ＷＥＳ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、λｇｔ−１−λＢＣ、λｇｔ−１−λＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ９を含む。
【００６９】
別の態様では発現ベクターは酵母発現ベクターである。Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母中で発現させるためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃＩ（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１（５）：４３３−４３７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２ Ｃｅｌｌ，３０（３）：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｇｅｎｅ，６１（２）：１２３−１３３）、およびｐＹＥＳ２（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を含む。
【００７０】
あるいはバキュロウイルス発現ベクターを使用する。培養した昆虫細胞中（例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞）でタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２
４：４３４−４４３）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９，Ｖｉｒｏｌ．，１７０（１）：３１−３９）を含む。
【００７１】
さらに別の態様では、哺乳動物発現ベクターを哺乳動物細胞での発現に使用する。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７ Ｎａｔｕｒｅ，３２９：８４０−８４２）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．，６１（１）：１８７−９３）を含む。哺乳動物細胞で使用する時、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により提供される。
【００７２】
組換えベクターの１種類は、組換え１本または２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。種々のウイルスベクター系が当該技術分野では知られている。そのようなベクターの例には限定するわけではないが、目的とする選択した核酸組成物を運ぶか、または発現するように構築される組換えアデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−に基づくベクター、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクター、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルス、組換えポックスウイルスベクター、組換えワクシニアウイルスベクター、ＳＶ−４０ベクター、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等を含む。
【００７３】
使用できるレトロウイルスには、欧州特許第４１５ ７３１号明細書；国際公開第９０／０７９３６号；同第９４／０３６２２号；同第９３／２５６９８号；および同第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号および同第９３／１０２１８号パンフレット；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；および欧州特許第０ ３４５ ２４２号明細書に記載されているものを含む。適当な組換えレトロウイルスの例には、国際公開第９１／０２８０５号パンフレットに記載されているものを含む。
【００７４】
アルファウイルスに基づくベクターもＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸分子として使用することができる。そのようなベクターは、例えばシンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネゼエラのウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）を含む広い種々のアルファウイルスから構築することができる。そのようなベクター系の代表例には、米国特許第５，０９１，３０９号；同第５，２１７，８７９号および同第５，１８５，４４０号明細書；ならびに国際公開第９２／１０５７８号；同第９４／２１７９２号；同第９５／２７０６９号；同第９５／２７０４４号および同第９５／０７９９４号パンフレットに記載されているものを含む。
【００７５】
アデノウイルスベクターの例には、Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６；６１６−６２７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２；４３１−４３４；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ＰＮＡＳ ９１：２１５−２１９；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１１４９８−１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６；Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．，１９９３ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９；Ｃａｉｌａｕｄ
ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７−１２９１；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２−３７８；およびＬｅｖｒｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｅｎｅ １０１：１９５−２０２に記載されているものを含む。例示のアデノウイルスベクターには、国際公開第９４／１２６４９号；同第９３／０３７６９号；同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号；および同第９５／００６５５号パンフレットに記載されているものを含む。他のアデノウイルスベクターには、米国特許第６，０８３，７１６号明細書に記載されているもののようなチンパンジーアデノウイルスに由来するものを含む。
【００７６】
別のウイルスベクターは、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなパルボウイルスに基づく。代表的な例には、国際公開第９３／０９２３９号パンフレット、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１０６１３−１０６１７に記載されているＡＡＶベクターを含む。他の特に望ましいＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１に基づくものを含む；２０００年５月１８日に公開された国際公開第００／２８０６１号パンフレットを参照にされたい。他の望ましいＡＡＶベクターにはプソイドタイプ（ｐｓｕｄｏｔｙｐｅｄ）された、すなわちＡＡＶ ＩＴＲｓにヘテロロガスなＡＡＶ血清型のカプシドにパッケージされたＡＡＶ５’ＩＴＲｓ、導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲｓからなるミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を含むものを含む。そのようなプソイドタイプされたＡＡＶベクターを生産する方法は、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに詳細に記載されている。
【００７７】
本発明の核酸分子が「裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ」である態様では、これをとりわけシクロデキストリン−含有ポリマーおよび保護的な相互作用性非縮合（ｎｏｎｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）ポリマーのような従来のポリマーまたは従来のものではないポリマーと組み合わることができる。「裸のＤＮＡ」およびカチオン性脂質またはポリマーと縮合したＤＮＡは、典型的には化学法を使用して細胞に送達される。細胞送達のために当該技術分野では多数の化学法が知られており、そしてＤＮＡと複合させるために脂質、ポリマーまたはタンパク質を使用すること、場合によりＤＮＡを粒子に縮合すること、そして細胞に送達することを含む。他の非ウイルス化学法には、ＤＮＡを縮合するためにカチオンを使用することを含み、これは次にリポソーム中に入れられ、そして本発明に従い使用される。Ｃ．Ｈｅｎｒｙ，２００１ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ，７９（４８）：３５−４１を参照にされたい。
【００７８】
本発明のＣＴ−ＣＲＭをコードする核酸分子は、「裸のＤＮＡ」として（米国特許第５，５８０，８５９号明細書）またはブピバカインおよび他の局所麻酔薬のような免疫感作を容易にする薬剤と組成物に配合されるか（米国特許第６，１２７，１７０号明細書）のいずれかで直接細胞に導入される。
【００７９】
上記のウイルスおよび非ウイルスベクターのすべての成分は、当該技術分野で既知の材料から容易に選択することができ、そして製薬産業から入手することができる。ベクター成分および調節配列の選択は、本発明を限定するとは考えられない。本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする各核酸配列は、好ましくは哺乳動物または脊椎動物細胞中で各核酸配列の産物の複製および生成を支配する調節配列の制御下にある。用語「プロモーター／調節配列」とは、調節配列に操作可能に連結した核酸の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。好ましくはプロモーター／調節配列は細胞中でＣＴ−ＣＲＭタンパク質の発現を駆動するように、コード配列の５’末端に配置されている。場合によりプロモーター／調
節配列は組織特異的様式で機能することができる。例えばプロモーター／調節配列は、特定の組織型の細胞中でのみ発現を駆動することができる。場合によりこの配列は中心のプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列はエンハンサー配列および組織特異的様式の発現に必要な他の調節要素に含まれることもできる。
【００８０】
適当なプロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよびその他の中から容易に選択することができる。活性が非特異的であり、そして本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸分子に使用される構成的プロモーターの例には、限定するわけではないがレトロウイルスラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター（インビトロゲン）を含む。
【００８１】
外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターには、限定するわけではないがアラビノースプロモーター、亜鉛−誘導性ヤギメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン−抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン−誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９、またはＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，２：５１２−５１８も参照にされたい）、ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：２３９−２４３およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１）およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）を含む。ＣＴ−ＣＲＭの発現系で使用するために特に好適なプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターである。
【００８２】
この内容で有用となり得る他の種類の誘導性プロモーターは、特異的な生理学的状態、例えば温度または急性期または複製している細胞のみにより調節されるものである。有用な組織−特異的プロモーターには骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターより高い活性を持つ合成筋肉プロモーターを含む（。Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５を参照にされたい）。組織特異的であるプロモーターの例として、とりわけ肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６；骨シアロプロテイン、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン（ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒ
ｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５；ニューロフィラメント軽−鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５：ニューロン特異的ｎｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）が知られている。例えばこの内容に有用な既知のプロモーターに関するさらなる一覧は、国際公開第００／５５３３５号パンフレットを参照にされたい。
【００８３】
本発明の核酸配列、分子またはベクターに含むためのさらなる調節配列には、限定するわけではないが、エンハンサー配列、ポリアデニレーション配列、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列、翻訳されるべきポリペプチドのそれぞれ始めおよび終わりの転写開始および終結に関する部位、転写された領域の翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、ＩＲＥＳ要素、ゴールドバーグ−ホグネスの“ＴＡＴＡ”要素、制限酵素開裂部位、選択可能なマーカー等を含む。エンハンサー配列には、例えばＳＶ４０ＤＮＡの７２ｂｐのタンデム反復またはレトロウイルス長末端反復またはＬＴＲｓ等を含み、そして転写効率を上げるために使用する。プロモーターおよび他の共通ベクター要素の選択は通常であり、そして多くのそのような配列が利用可能であり、それらを用いて本発明に有用なヌクレオチド分子およびベクターを設計する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング．ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、（１９８９）およびそれに引用されている文献、例えば第３，１８〜３．２６頁および１６．１７〜１６．２７頁、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク（１９８９）を参照にされたい。当業者はそのような既知の調節配列の中から容易に選択して本発明の分子を調製することができる。そのような調節配列の選択は、本発明を限定するものではない。
【００８４】
Ｃ．本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質およびヌクレオチド分子の作成法
抗原性組成物のアジュバントとして突然変異ＣＴ−ＣＲＭの証明された用途の観点から適当量の突然変異ＣＴ−ＣＲＭの生産が望ましい。本明細書に開示する本発明のヌクレオチド配列およびＣＴ−ＣＲＭ、ならびにヌクレオチド分子およびＣＴ−ＣＲＭタンパク質を含む組成物の調製または合成は、利用可能な材料を使用して当業者の能力内に十分にある。合成法は本発明を限定するものではない。以下の実施例で本発明のＣＴ−ＣＲＭｓをコードする配列の現在好適な合成の態様を詳細に説明する。
【００８５】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓおよびヌクレオチド分子および配列は、中でも化学的合成法、組換え遺伝子操作法、部位特異的突然変異誘発法、およびそのような方法の組み合わせにより生成することができる。例えば本発明のヌクレオチド配列／ＣＴ−ＣＲＭｓは既知の化学的合成技術、例えば中でもＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３ Ｊ．Ａｍｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４；Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ピアス化学社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード、イリノイ州（１９８４）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５；Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｕｒｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４：２７０；およびＳｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４５３９に記載されているように固相化学合成により従来通り調製することができる。また例えばタンパク質−構造および分子的特徴（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．フリーマン アンド カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨー
ク、１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．，「翻訳後タンパク質修飾：展望と将来性（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、タンパク質の翻訳後の共有的修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）の１〜１２頁、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｎｓｏｎ編集、アカデミック出版、ニューヨーク、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８−６２も参照にされたい。
【００８６】
あるいは本発明の組成物は、本明細書に提供される情報を利用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．同上）、ＣＴ−ＣＲＭタンパク質を場合により他の免疫原および任意のキャリアータンパク質とコードするヌクレオチド分子を宿主微生物内等でクローニングし、そして発現させることによるような、通例の分子生物学技術、部位特異的突然変異誘発法、遺伝子操作またはポリメラーゼ連鎖反応を使用して構築することができる。ＣＴ−ＣＲＭｓおよび任意の免疫原のコード配列は合成的に調製することができる（Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５
Ｇｅｎｅ，１６４：４９）。
【００８７】
一般に、組換えＤＮＡ技術には上記のようなＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードするＤＮＡ配列を合成または単離により得、そしてＤＮＡ配列をそれが好ましくはアラビノース誘導性プロモーターの存在下で発現される適切なベクター／宿主細胞発現系に導入することが関与する。ＤＮＡを発現ベクターに挿入するために記載された任意の方法を使用して、プロモーターおよび他の調節制御要素を選択した組換えベクター内の特別な部位に連結することができる。次いで適当な宿主細胞をそのようなベクターまたはプラスミドを用いて通常の技術により形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションさせる。
【００８８】
種々の宿主細胞−ベクター（プラスミド）系を使用して免疫原性突然変異コレラホロトキシンを発現することができる。好ましく含まれるベクター系であるアラビノース誘導性プロモーターは、使用する宿主細胞に適合性がある。ベクターが宿主細胞に（使用する宿主細胞−ベクター系に依存して形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより）挿入された時にＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡが宿主細胞により発現されるように、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列が発現系に挿入され、そしてプロモーター（好ましくはアラビノース誘導性プロモーター）および他の制御要素がベクター内の特別な部位に連結される。
【００８９】
ベクターは上記のようなウイルスベクターまたは非ウイルスベクターから選択することができるが、使用する宿主細胞と適合していなければならない。組換えＤＮＡベクターは、（使用するベクター／宿主細胞系に依存して）形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより適切な宿主細胞（細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞等）に導入することができる。宿主−ベクター系には限定するわけではないが、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；ウイルスで感染させた哺乳動物細胞系（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）；およびウイルスで感染させた昆虫細胞（例えばバキュロウイルス）を含む。
【００９０】
合成核酸分子を使用して本発明のＣＴ−ＣＲＭおよび他の組成物をクローニングし、そして発現させるための系には、組換え技術において周知である種々の微生物および細胞の使用を含む。宿主細胞は哺乳動物、昆虫細胞、酵母細胞を含め原核（例えば細菌）細胞および真核細胞を含む生物学上の生物から選択することができる。好ましくは本発明の種々の方法および組成物で使用する細胞は細菌細胞である。適当な細菌細胞には例えば、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種々の株である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）のような酵母細胞、およびＳｆ９およびＳｆ２１細胞のような昆虫細胞も生産目的のために有用な宿主細胞である。限定するわけではないがチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ニワトリ胚繊維芽細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＥＲ Ｃ６、ＮＳＯ、ＶＥＲＯまたはＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞ならびに他の通例および通常ではない生物および植物も適当な宿主細胞である。
【００９１】
他の適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産および精製の方法は、既知の技術を参照して当業者が行うことができる。例えば中でもＧｅｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５を参照にされたい。
【００９２】
典型的には宿主細胞は発現に十分な期間、培養条件下で維持される。培養条件は当該技術分野では周知であり、そしてイオン組成および濃度、温度、ｐＨ等を含む。典型的にはトランスフェクションした細胞は培養基で培養条件下にて維持する。種々の細胞型について適当な培地が当該技術分野で知られている。好適な態様では、温度は約２０℃から約５０℃、より好ましくは約３０℃から約４０℃、そしてさらにより好ましくは約３７℃である。
【００９３】
ｐＨは好ましくは６．０の値から約８．０の値、より好ましくは約６．８の値から約７．８の値であり、そして最も好ましくは約７．４である。容量オスモル濃度は好ましくはリットルあたり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）から約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、より好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌから約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コードされたタンパク質のトランスフェクションおよび発現に必要な他の生物学的条件は、当該技術分野では周知である。
【００９４】
組換えＣＴ−ＣＲＭタンパク質は宿主細胞またはそれらの膜から、または細胞が培養された培地のいずれかから回収または集められる。回収は組換えＣＴ−ＣＲＭタンパク質を単離し、そして精製することを含んでなる。ポリペプチドに関する単離および精製法は当該技術分野では周知であり、そして沈殿、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動等のような手法を含む。
【００９５】
通例の組換え手段により生産された時、本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは細胞またはそれらの培地から、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティーおよびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心、分別溶解性を含む通例の方法により、あるいは精製またはタンパク質に関する他の任意の標準的技術により単離、そして精製されることができる。原核細胞からヘテロロガスなタンパク質の精製に関して幾つかの方法が存在する。米国特許第４，５１８，５２６号；同第４，５９９，１９７号；および同第４，７３４，３６２号明細書を参照にされたい。しかし生産された精製調製物は、ヒトに対して有害となり得る宿主のトキシンを実質的に含むべきではない。特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌の宿主細胞中で発現した時、精製されたペプチドまたはタンパク質にはエンドトキシン混入が実質的に排除されるべきである。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上を参照にされたい。
【００９６】
本発明の方法および組成物で使用するＣＴ−ＣＲＭｓは、本明細書に挙げる具体的に例示する方法の産物に限定されない。実際にはタンパク質は直前に引用した教科書中の方法により、あるいは本明細書を通して引用した教科書の方法により調製することができる。そのように使用するためにタンパク質組成物を単離し、そして組換え的または合成的に生産することは当業者の技術範囲内である。
【００９７】
単一アミノ酸置換をもつ２つ、単一アミノ酸挿入を持つ１つ、および二重アミノ酸置換を持つ２つの表１に掲げた５個の例示的ＣＴ−ＣＲＭｓは、上記の方法の幾つかを使用して実施例１に詳細に記載したように生成した。具体的には１組の突然変異ＣＴクローン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で、既知のＣＴホロトキシン分子をコードするプラスミドについて標準的な部位特異的突然変異誘発プロトコールにより生成した。精製されたＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈホロトキシンが生じる収量は、１リットルの培養基あたり約５０μｇであったことが事前に示されていた（国際公開第００／１８４３４号パンフレットを参照にされたい）。元のプラスミドに対する修飾を介してＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈの収量を上げる最初の試みは効果がほとんど無いか、または無いことが示された。プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈおよび誘導体とコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＤｓｂＡおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ＲｐｏＨの同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を通して、収量に穏やかな上昇が達成された。同時発現および精製の修飾によりＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈの収量は約２ｍｇ／リットルに増加した。
【００９８】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓの発現を上昇させるために、プラスミド中のラクトース誘導性プロモーターをアラビノース誘導性プロモーター（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に置き換え、これをＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結した。クローニング中、プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）２１２５株に由来するＣＴサブユニットＢをコードするｃｔｘＢ遺伝子に連結されたコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）５６９Ｂ株に由来するＣＴサブユニットＡをコードするｃｔｘＡ遺伝子を含むことが決定された。これらの遺伝子の交差整列により、２つのｃｔｘＢ遺伝子間の７塩基置換およびｃｔｘＡ遺伝子間の１塩基変化が示された。これらの塩基置換の幾つかが成熟サブユニットにアミノ酸の変化を導いた。中でも特に注目されるのは、Ａ−２部分内にアミノ酸変化を、またはＡサブユニットのホロトキシン集成ドメインを導くｃｔｘ遺伝子間の置換である。これら遺伝子間の異質性がトキシンの発現またはホロトキシンの集成に負の影響を及ぼすかどうかは知られていなかった。しかし進化的な観点から、両トキシンのサブユニット遺伝子が同じ起源に由来することは好ましいと考えられた。そのまま両ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子を、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）５６９Ｂ株に由来するアラビノース誘導系の構築物に使用した。プラスミドｐＬＰ９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０の構造は実施例１に示す。免疫原性突然変異コレラホロトキシンは、宿主細胞を上記のプラスミドで形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションし、そして宿主細胞を該組換え免疫原性解毒タンパク質が宿主細胞により発現できる条件下で培養することにより生産される。ｐＬＰ９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０からＣＴ−ＣＲＭｓの収量は、それぞれ１リットルのカルチャーあたり７．６、５．６、７．９、２７．４および１．９ｍｇの精製物質である。
【００９９】
生成したＣＴ−ＣＲＭタンパク質または核酸分子は、以下の実施例に記載するように任意の数の選択された抗原と一緒に免疫原性組成物に配合され、そしてインビボアッセイによりアジュバント効力についてスクリーニングする。
【０１００】
Ｄ．免疫原性組成物
本発明の効果的な免疫原性組成物は、本発明の突然変異コレラホロトキシンを含んでなるものである。好ましくは突然変異コレラホロトキシンＣＴ−ＣＲＭは、野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する。「低減した毒性」により、各突然変異体は有意な副作用、特に野生型ＣＴに付随ことが知られている副作用、例えば下痢を引き起こすことなく免疫原性組成物中にアジュバントとして使用できる。より好ましくは本発明の免疫原性組成物中のＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからトリプトファンまたはアルギニンからグリシン）を有する（ＣＴ−ＣＲ
ＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）。別の好適な態様では、ＣＴ−ＣＲＭはＡサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基トレオニンに隣接するアミノ酸４９位にヒスチジンの単一アミノ酸挿入を有する（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ）。第３の好適な態様は、Ａサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基グリシンに隣接したアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンの二重アミノ酸挿入を有するＣＴ−ＣＲＭである（ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ）。第４の例であるＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３０位に単一アミノ酸置換（チロシンからトリプトファンへ）、およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンの二重アミノ酸挿入を有する（ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）。１つの態様では、ＣＴ−ＣＲＭは上記の１以上のさらなる修飾を有してもよい。別の態様では、組成物は選択された抗原および適当な有効なアジュバント量のＣＴ−ＣＲＭを含んでなり、ここで該ホロトキシンは該抗原に対する脊椎動物の免疫応答を有意に強化する。本発明の組成物は、上記のような選択された抗原を含んでなる組成物の投与に対して、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞性免疫応答を改善することにより免疫応答をモジュレートする。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「有効なアジュバント量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）」とは、脊椎動物宿主に上昇した免疫応答を誘導するために効果的である本発明の１つのＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の用量を意味する。より具体的な定義では、用語「有効なアジュバント量」とは本明細書に記載する５種のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の１つ（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）の、脊椎動物宿主に上昇した免疫応答を誘導するために効果的である用量を意味する。具体的には本明細書に開示するＣＴ−ＣＲＭｓは、異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を増す。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた。本発明の免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、生じた突然変異ＣＴタンパク質がアジュバントとして機能し、同時にそれが導入された脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように、低減した毒性および保持されたアジュバント性のバランスを現す。特に「有効なアジュバント投薬用量または量」は、宿主の年齢、体重および医学的状態ならびに投与法に依存する。適当な用量は当業者により容易に決定される。
【０１０２】
アジュバントとして本発明の突然変異コレラホロトキシンを含む免疫原性組成物は、広い種々の抗原の中から選択される少なくとも１つの抗原も含む。抗原（１つまたは複数）は、全細胞もしくはウイルス、または１以上のサッカライド、タンパク質サブユニット、ポリペプチド、ペプチドもしくは断片、ポリ−もしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分を含んでなることができる。所望により抗原性組成物は同じかまたは異なる病原性微生物に由来する１より多くの抗原を含んでもよい。
【０１０３】
このように１つの態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性細菌に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む望ましい細菌性の免疫原性組成物には限定するわけではないが、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（型を決定できる、またはできない両方）、ヘモフィルス ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｍｕｓ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ）、トラコーマ クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア シッタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アロイオコッカス オチジティス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ ｏｔｉｄｉｔｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ）−マイコバクテリウム イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）コンプレックス、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｌｉｓ）、プロテウス ベルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プレウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅａｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ ガリスセプチム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｕｍ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０４】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性ウイルスに由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む望ましいウイルス免疫原性組成物には、限定するわけではないがＲＳウイルス、パラインフルエルザウイルス１〜３型、ヒト メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト パピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンバーウイルス、牛疫ウイルス、鳥気管支ウイルス（正式には七面鳥鼻気管支ウイルス）、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管支ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、鳥感染性ファブリキウス病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック（Ｍａｒｅｋ’ｓ）病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスにより引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０５】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性真菌に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む真菌病原体に対して望ましいス免疫原性組成物には、限定するわけではないがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０６】
さらに別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性寄生生物
に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む寄生生物に対して望ましい免疫原性組成物には、限定するわけではないがリューシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ ゴンジー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｃｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０７】
アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む、非−感染性疾患に対する望ましい免疫原性組成物も本発明の範囲内である。そのような免疫原性組成物には、脊椎動物抗原に対するものを含み、特に限定するわけではないがアレルギー、自己免疫疾患、アルツハイマー病およびガンのような疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置に関する抗原に対する組成物を含む。
【０１０８】
例えば本発明の免疫原性組成物は、ガン細胞または腫瘍細胞に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含むことができる。本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含む、脊椎動物において治療用または予防用の抗−ガン効果を誘導する望ましい免疫原性組成物は、限定するわけではないが前立腺特異的抗原、癌−胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、ホルモンおよびホルモン同族体等を含めガン抗原または腫瘍に関連する抗原を利用するものを含む。
【０１０９】
本発明の他の免疫原性組成物は、脊椎動物宿主のアレルゲンに対する応答をモジュレートするために望ましい、そのような組成物は本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）およびアレルゲンまたはそれらの断片に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含む。そのようなアレルゲンの例は、米国特許第５，８３０，８７７号明細書および国際公開第９９／５１２５９号パンフレットに記載され、これは引用により本明細書に編入し、そして花粉、昆虫の毒、動物の鱗屑、菌類の胞子および薬剤（ペニシリンのような）を含む。免疫原性組成物はアレルゲンに対するアレルギー応答をモジュレートするように、アレルギー反応の原因として知られているＩｇＥ抗体の生産を妨害する。
【０１１０】
さらに別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として抗原の分子部分に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含み、これらは脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とするような疾患を防止または処置するように、アミロイド前駆体タンパク質に由来するもののような望ましくない様式、量または場所で宿主により生産されるもの（または自己分子）を表す。本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含む、脊椎動物宿主中で自己分子に対する応答をモジュレートするために望ましい組成物は、自己分子またはそれらの断片を含むものを含む。そのような自己分子の例には、糖尿病に関与するβ−鎖インスリン、胃食道反射疾患に関与するＧ１７分子および多発性硬化症、狼瘡および慢性関節リウマチのような疾患において自己免疫応答をダウンレギュレーションする作用物質を含む。
【０１１１】
本発明のさらに他の免疫原性組成物は、脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とする疾患を防止または処置するために望ましい。そのような組成物は本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）ならびにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の部分を含む。この疾患はアルツハイマー病、アミロイドーシスまたはアミロイド発生（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）疾患のように様々に言われている。β−アミロイド前駆体タンパク質（Ａβペプチドとも呼ばれる）は、ＡＰＰの４２アミノ酸断片であり、これはβおよびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰのプロセッシングにより生成し、そして以下の配列を有する
：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＡｌａＩｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ（配列番号３）。患者の中にはアミロイド沈着が凝集したＡβペプチドの形態を取るものもある。驚くべきことには今、単離されたＡβペプチドの投与が脊椎動物のアミロイド沈着のＡβペプチド成分に対して免疫応答を誘導することが見いだされた（国際公開第９９／２７９４４号パンフレット）。すなわち本発明の態様は、本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体に加えてＡβペプチド、ならびにＡβペプチドの断片およびＡβペプチドに対する抗体またはそれらの断片を含む。１つのそのようなＡβペプチドの断片は、以下の配列を有する２８アミノ酸ペプチドである（米国特許第４，６６６，８２９号明細書：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ（配列番号４）。
【０１１２】
そのような免疫原性組成物は、滅菌水または滅菌等張性塩溶液のような免疫学的に許容され得る希釈剤または製薬学的に許容され得る担体をさらに含んでなる。抗原性組成物はそのような希釈剤または担体と通例の様式で混合される。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」とは、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合性がある任意かつすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗菌・カビ剤、等張性かつ吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は当業者には明白であり、そしてほとんど投与経路に依存するだろう。
【０１１３】
免疫原性組成物は限定するわけではないが懸濁液、溶液、油性または水性賦形剤中の乳液、ペーストおよび移植可能な徐放性または生分解性製剤を含んでもよい。そのような製剤は、限定するわけではないが沈殿防止剤、安定化剤または分散剤を含む１以上のさらなる材料をさらに含んでなる。非経口投与用の製剤の１態様では、再構成する組成物を非経口的に投与する前に、有効成分を適当な賦形剤（例えば滅菌されたパイロジェンを含まない水）で再構成するように、乾燥（すなわち粉末または粒状）形態で提供する。有用な他の非経口的に投与可能な製剤には、有効成分を微晶質状で、リポソーム調製物で、または生分解ポリマー系として含んでなるものを含む。徐放性または移植用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、溶解しにくいポリマーまたは溶解しにくい塩のような製薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含んでもよい。
【０１１４】
本発明のタンパク質免疫原性組成物中に存在できるさらに加える成分は、ＣＴ−ＣＲＭｓに加えてアジュバント、保存剤、化学的安定化剤または他の抗原性タンパク質である。典型的には安定化剤、アジュバントおよび保存剤は至適化されて、標的とするヒトまたは動物における効力に最高の配合を決定する。適当な例示的保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。使用できる適当な安定化材料には、例えばカザミノ酸、シュクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物および乾燥ミルクを含む。
【０１１５】
本発明の抗原性組成物は、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓに加えてさらなるアジュバントを含んでなることができる。免疫応答を強化するために使用する通例の非−ＣＴ−ＣＲＭアジュバントには、限定するわけではないが引用により本明細書に編入する米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；コリキサ（Ｃｏｒｉｘａ）、ハミルトン、モンタナ州）を含む。またアジ
ュバントとしての使用に適するのは、コリキサ（ハミルトン、モンタナ州）から入手可能であり、そして引用により本明細書に編入する米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記載されている合成脂質Ａ同族体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体または同族体である。そのようなＡＧＰの１つは５２９（正式にはＲＣ５２９として知られている）として知られている２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは水性状態または安定な乳液として配合される。
【０１１６】
さらに他の非−ＣＴ−ＣＲＭアジュバントには鉱物油および水乳液、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｉｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミル ジペプチド、殺されたボルデテーラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、引用により本明細書に編入する米国特許第５，０５７，５４０号明細書に記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、フラミンガンム、マサチューセッツ州）のようなサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成される粒子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（引用により本明細書に編入する米国特許第６，２０７，６４６号明細書）、百日咳トキシン（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む；例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９３／１３３０２号および同第９２／１９２６５号パンフレットを参照にされたい。
【０１１７】
種々のサイトカインおよびリンホカインも本発明の免疫原性組成物に含めるのに適当である。１つのそのようなサイトカインは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、これは引用により本明細書に編入する米国特許第５，０７８，９９６号明細書に記載されているヌクレオチド配列を有する。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含むプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、そして２０１１０−２２０９ バージニア州、マナッサス、１０８０１ ブルヴァール大学のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号３９９００で寄託した。サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は引用により本明細書に編入する米国特許第５，７２３，１２７号明細書に記載さている別のアジュバントである（ジェネティック インスティテュート社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州から入手可能である）。免疫モジュレーティング活性を有することが示された他のサイトカインまたはリンホカインには限定するわけではないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子αおよびβを含み、そしてアジュバントとしての使用に適する。
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物のさらに他の適当な任意の成分には限定するわけではないが：表面活性物質（例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド）、メトシキヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシ、ツフツシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル、例えばリン酸アルミニウム等、および免疫刺激複合体を含む。ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原は、免疫原性組成物に使用するためにリポソームに包含されるか、または多糖、リポ多糖および／または他のポリマーに結合してもよい。
【０１１９】
本発明のＣＴ−ＲＣＭ突然変異体（１つまたは複数）または所望するＣＴ−ＲＣＭをコードするＤＮＡ配列および分子を含む本発明の免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド組成物（ＤＮＡ免疫原性組成物としても知られている）としても有用であり、あるいは選択した抗原をコードするポリヌクレオチドと投与される。例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型の完全長の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと一緒にコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の製剤を皮内経路で投与されたＤＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＨＳＶ ｇＤ２のみをコードするプラスミドＤＮＡを皮内経路で受容したマウスよりも高い平均細胞性応答を生じた。さらにプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物をＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと一緒に受容したマウスに関する平均血清抗体力価は、アジュバント無しでプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物を受容したマウスに見られる力価とほぼ同じであった。同様に、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈをアジュバントとして加えたプラスミドＤＮＡ
ＨＳＶ ｇＤ２組成物も、アジュバントを加えない組成物を皮内または筋肉内経路で送達した後に見られるレベルに匹敵するレベルで膣洗浄サンプルにｇＤ２−特異的抗体応答を生じた。ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨまたはＣＴをアジュバントとして加え、そして皮内経路で送達したプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物で免疫感作したマウスも、アジュバント無しでプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ−ｇＤ２組成物を受容したマウスよりも実質的に高レベルのガンマインターフェロンおよびＩＬ−５を生成した。このようにＣＴ−ＣＲＭｓはＨＳＶに対するプラスミドＤＮＡ組成物を投与した時、増殖的およびガンマインターフェロン応答を強化する。
【０１２０】
上記のような担体に加えて、ポリヌクレオチド分子からなる免疫原性組成物は望ましくは、場合により局所麻酔薬、ペプチド、カチオン性脂質を含む脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリシンのようなポリカチオン、デンドリマーのような分枝した、３次元ポリカチオン、炭水化物、カチオン性両親媒性化合物、界面活性剤、ベンジルアンモニウム表面活性剤または細胞にポリヌクレオチドの輸送を促進する化合物のような任意のポリヌクレオチド促進剤または「共剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）」を含む。そのような促進剤にはブピビカイン（引用により本明細書に編入する米国特許第５，５９３，９７２号明細書を参照にされたい）を含む。本発明に有用なそのような促進剤または共剤の他の排他的ではない例は、各々が引用により本明細書に編入される米国特許第５，７０３，０５５号；同第５，７３９，１１１号；同第５，８３７，５３３号明細書；１９９６年４月４日に公開された国際公開第９６／１００３８号パンフレット；および１９９４年８月８日に公開された国際公開第９４／１６７３７号パンフレットに記載されている。
【０１２１】
より好ましくは、局所麻酔薬は核酸分子と１以上の複合体を形成する量で存在する。局所麻酔薬は本発明の核酸分子またはプラスミドと混合される時、ＤＮＡを包む小さい種々の複合体または粒子を形成し、そして均一である。すなわち本発明の免疫原性組成物の１態様では、複合体は局所麻酔薬と本発明の少なくとも１つのプラスミドを混合することより形成される。この混合物から生じる任意の単一複合体は、異なるプラスミドの様々な組み合わせを含むことができる。あるいは本発明の組成物の別の態様では、すべてのプラスミドが単一のボーラス投与で投与される場合、局所麻酔薬は個々のプラスミドと別個に混合され、そして別個の混合物を単一の組成物に合わせて、単一の免疫原性組成物中に所望の比率でプラスミドが存在する事を確実にすることができる。あるいは局所麻酔薬および各プラスミドを別個に混合し、そして別個に投与して所望の比率を得ることができる。ここで今後、用語「複合体」または「１以上の複合体」または「複合体（複数）」は、免疫原性組成物のこの態様を定めるために使用し、この用語は１以上の複合体とＣＴ−ＣＲＭをコードするプラスミドおよび抗原をコードするプラスミドの混合物、または別個に形成された複合体の混合物を含む各複合体を包含し、ここで各複合体は唯一の種類のプラスミド、または複合体の１つまたは混合物を含み、ここで各複合体はポリシスストロン性ＤＮＡを含む。好ましくは、複合体は直径が約５０〜約１５０ｎｍである。使用する促進剤が
局所麻酔薬、好ましくはプピバカインである時、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づき約０．１重量％から約１．０重量％の量が好ましい。例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９９／２１５９１号パンフレットも参照にされたい、そしてこれは好ましくは、約０．００１〜０．０３重量％の間の量で投与される、共剤としてベンジルアンモニウム表面活性剤の包含を教示する。本発明に従い、局所麻酔薬の量は該核酸分子に対する比率で０．０１〜２．５重量／容量％の局所麻酔薬対１〜１０μｇ／ｍｌの核酸で存在する。別のそのような範囲は、０．０５〜１．２５重量／容量％の局所麻酔薬対１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｌ／ｍｌの核酸である。
【０１２２】
使用する時、そのようなポリヌクレオチド免疫原性組成物はＣＴ−ＣＲＭおよび抗原を一過性の基準にてインビボで発現し；遺伝材料は宿主の染色体に挿入または組み込まれない。この使用は、目標が目的の遺伝材料を染色体に挿入または組み込むことである遺伝子療法とは区別される。免疫感作により投与されたポリヌクレオチドが宿主の表現型を形質転換しないことを確認するためのアッセイを使用する（米国特許第６，１６８，９１８号明細書）。
【０１２３】
免疫原性組成物は組成物の選択した投与様式に適する他の添加剤を含んでもよい。本発明の組成物は凍結乾燥したポリヌクレオチドを含んでもよく、これは粉末、液体または懸濁液の剤形を開発するために他の製薬学的に許容される賦形剤と使用することができる。例えばレミングトン：製剤学の科学および実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２巻、第１９版、（１９９５）、例えば第９５章エーロゾル；および国際公開第９９／４５９６６号パンフレットを参照にされたい（これらの教示は引用により本明細書に編入する）。これら組成物の投与経路は所望により組み合わせられ、または適合され得る。
【０１２４】
これらの核酸分子を含む免疫原性組成物は、任意の通例の投与経路を介して投与するために適する添加剤を含むことができる。幾つかの好適な態様では、本発明の免疫原性組成物は例えば液体、粉末、エーロゾル、錠剤、カプセル、腸のコート錠剤またはカプセルまたは座薬の形態でヒト個体に投与するために調製される。
【０１２５】
本発明の免疫原性組成物は（タンパク質を含むか、または核酸分子を含むいずれの組成物でも）、上記のように、通例の生理学的に許容され得る担体、アジュバントまたは上記の種類の製薬学的調製物に有用な他の材料の選択により限定されることはない。上記の成分から、適当なｐＨ、等張性、安定性および他の通常の特性を有するこれらの製薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技術範囲内である。
【０１２６】
Ｅ．本発明の組成物の使用法
ＣＴ−ＣＲＭ単独またはＣＴ−ＣＲＭの組み合わせおよび選択した抗原を含んでなる本発明の免疫原性組成物は、種々の経路によりヒトまたは非−ヒト脊椎動物に投与して抗原、好ましくは上記に確認される疾患を引き起こす抗原に対する免疫応答を強化する。本発明の組成物は、上記の選択した抗原、および有効なアジュバント量の突然変異ＣＴ−ＣＲＭを含んでなる組成物の投与後に、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞性免疫を改善することにより免疫応答をモジュレートし、ここで突然変異ＣＴ−ＣＲＭは野生型ＣＴに比べて実質的に低減した毒性を有し、そしてここで低減した毒性は単一アミノ酸置換、単一アミノ酸挿入、二重アミノ酸挿入または単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入の結果である。
【０１２７】
１つの態様では、ＣＴ−ＣＲＭ（タンパク質として、または核酸分子によりコードされるものとして）を含む免疫原性組成物は、選択した抗原（タンパク質または核酸のいずれかとして）を含んでなる組成物の投与前に投与される。別の態様では、免疫原性組成物は
抗原およびＣＴ−ＣＲＭの両方を含む組成物で、あるいは抗原を含有する組成物とは別の組成物として投与されるいずれの場合であっても、免疫原性組成物は抗原と同時に投与される。さらなる態様では、ＣＴ−ＣＲＭを含む組成物は抗原を含む組成物の後に投与される。抗原および突然変異ＣＴ−ＣＲＭが同時に投与されることが必要ではないが好ましい。
【０１２８】
ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物は、上記のようにタンパク質またはタンパク質をコードする核酸分子として投与することができる。ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物は、タンパク質として投与される選択した抗原と組み合わせてタンパク質として投与することができる。あるいは上記のように、タンパク質としてＣＴ−ＣＲＭ免疫原性組成物は上記のような抗原をコードする核酸分子と投与することができる。さらに別の代案には、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の両方をこれらのタンパク質をコードする核酸配列として投与することを含む。
【０１２９】
ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物を投与するために、任意の適当な投与経路を採用することができる。この経路はＣＴ−ＣＲＭおよび抗原が別の組成物または異なる形態で、例えばタンパク質または核酸で投与されるならば、選択した抗原を含む組成物を投与するために選択した経路と同じでも異なってもよい。適当な投与経路は限定するわけではないが、鼻内、経口、膣、直腸、非経口、皮内、経皮（例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照にされたい）、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含む。適当な経路は使用する免疫原性組成物の性質、および患者の年齢、体重、性別および一般的な健康状態の評価、および免疫原性組成物中に存在する抗原、および担当医師による類似因子に依存して選択される。
【０１３０】
一般に本発明の免疫原性組成物（１つまたは複数）のＣＴ−ＣＲＭおよび／または抗原成分に関する適切な「有効量」または投薬用量の選択も、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原のタンパク質または核酸状態、使用する免疫原性組成物（１つまたは複数）中の抗原の同一性、ならびに患者の身体的状態、最も特別には免疫感作する個体の一般的な健康状態、年齢および体重にも基づくだろう。免疫原性組成物の投与法および経路ならびにその中のさらなる成分の存在も、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の投薬用量および量に影響し得る。有効用量のそのような選択および上方または下方調整は、当業者の技術範囲内である。免疫応答、好ましくは防御応答を誘導する、または有意に悪い副作用無しで患者に外因的効果を生成するために必要なＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の量は、これらの因子に依存して変動する。適当な用量は当業者に容易に決定される。
【０１３１】
例として１つの態様では、タンパク質成分、例えば上記のＣＴ−ＣＲＭ変異体タンパク質および／または抗原を含む組成物について、各用量は約１μｇから約２０ｍｇの間のタンパク質／ｍＬ（滅菌溶液）を含んでなることができる。他の投薬用量範囲も、当業者により企図され得る。最初の用量は任意でよく、続いて所望により追加免疫を繰り返すことができる。
【０１３２】
別の例では、ＤＮＡおよびベクター組成物中のヌクレオチド分子の量は当業者により選択され、そして調整され得る。１つの態様では、各用量は１ｍＬの滅菌溶液あたり約５０μｇから約１ｍｇの間のＣＴ−ＣＲＭをコードするまたは抗原をコードする核酸、例えばＤＮＡプラスミドを含んでなる。
【０１３３】
組成物に関する用量および投薬処方の回数も当業者により容易に決定され得る。防御はＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物の単回投与により付与されるかもしれないし、または防御を維持するために後の追加免疫に加えて選択した抗原を含むか、含まずに数回の投与が必要かもしれない。場合によっては突然変異ＣＴ−ＣＲＭのアジュバント特性により必
要とされる抗原を含む投与の数を減らすことができ、あるいは投薬処方のタイムコースを減らすことができる。免疫のレベルを監視して必要ならば追加免疫の必要性を決定することができる。
【０１３４】
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を説明する。実施例は具体的説明の目的のみであり、本発明を限定するとは解釈されない。
【０１３５】
本明細書に引用するすべての技術文献は、引用により本明細書に編入する。
【実施例１】
【０１３６】
ＣＴ突然変異体の発現
Ａ．細菌株、プラスミドおよび成長条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アーリントンハイツ、イリノイ州）、ＴＸ１（ＦＴｃ、ＸＬ１ブルーに由来するｌａｃ１ｑを持つＴＧ１のナリジキシン酸耐性誘導体）（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）、ＴＥ１（ＴＧ１ ｅｎｄＡ、ＦＴｃ、ｌａｃ１ｑ）およびＣＪ２３６（ＦＴｃ、ｌａｃ１ｑ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ヘラクレス、カリフォルニア州）を組換えプラスミドをクローニングし、そして変異体タンパク質を発現させるための宿主として使用した。プラスミドを含む株は必要に応じて抗生物質（アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ；カナマイシン ２５μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン １０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で維持した。
【０１３７】
Ｂ．ｃｔｘＡ遺伝子の突然変異誘発
１本鎖のウラシル含有鋳型（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，１９９２ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：４９１５−２４）を使用した部位特異的突然変異誘発は、ｐＳＫＩＩ中の自然なＣＴオペロンのクローンであるプラスミドｐＭＧＪ６７（ストラタジーン）に作成されたオリゴヌクレオチド−誘導突然変異体を選択するために使用した。簡単に説明すると、各オリゴヌクレオチドをリン酸化し、そしてｄｕｔ ｕｎｇＣＪ２３６（ＦＴｃ、ｐＭＧＪ６７）からレスキューした（ｒｅｓｕｃｕｅｄ）１本鎖ＤＮＡ鋳型について第２鎖合成を支配するために使用した。連結およびｕｎｇ＋株ＴＸ１の形質転換後、１本鎖ＤＮＡをＡｐＲ形質転換体からレスキューし、そしてジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２）。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発法（ストラタジーン）を使用して、幾つかの突然変異をｐＡＲＣＴ２に直接導入した。ｐＡＲＣＴ２は、ＬＴＩＩｂＢ遺伝子に由来するシグナル配列を含むｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子を含むオペロンを発現するｐＡＲ３（国際公開第９８／２０７３４号パンフレット）に由来するアラビノース−誘導性クローンであり、そして各遺伝子はｐＴ７−１の誘導体であるベクタープラスミドｐＴ７−７からＴ７遺伝子１０に由来する開始配列を翻訳するために独立して使用する。
【０１３８】
Ｃ．１および２コドン挿入突然変異体
単一コドン挿入は、ｐＭＧＪ６４（ｐＭＧＪ６７の誘導体）を部分消化し、続いて３−塩基粘着末端のフィル−インおよび自己連結によりＤｄｅＩ制限部位に作成した。２コドンＴＡＢ−リンカー挿入突然変異体は、６塩基対ＡｐａＩリンカー（ＧＧＧＣＣＣ）をＴＡＢマニュアル（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に記載されているようにｐＭＧＪ６４のＲｓａＩ部分消化の末端に付加することにより作成した。形質転換体を単一ＤｄｅＩまたはＲｓａＩ部位のいずれかの損失（および新たなＡｐａＩ部位の存在）について調査し、そしてＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１３９】
Ｄ．アラビノース促進化ＣＴ−ＣＲＭ発現ベクターの構築
ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ（国際公開第００／１８４３４号パンフレット）での事前の実験では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での最大生産が合成のｃｔｘＡ遺伝子の上流の合成シャイン−ダルガルノ配列を置換し、そしてアラビノースプロモーター系の制御下にオペロンを配置することにより達成されたことが示された。Ａサブユニットに部位特異的突然変異を含むＣＴオペロンは、すでに記載されたように作成した（同上）。ＣＴ−ＣＲＭｓは、元はβ−ガラトクシダーゼプロモーターの制御下にあり、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現レべルは低かった。ＰＣＲを使用してＣＴ−ＡサブユニットのＡＴＧの５’領域を修飾し、そして５’末端のＮｈｅＩ部位に挿入した。対応する３’プライマーをＣＴ−Ｂ遺伝子の３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に加えた。使用したプライマーは
【０１４０】
【化１】
【０１４１】
であった。
【０１４２】
ＰＣＲを各突然変異体ＣＴ−ＣＲＭオペロンについて行い、そしてＰＣＲ産物を製造元の指示に従いｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（インビトロゲン）に連結し、そしてＴｏｐ１０Ｆ’細胞に形質転換した。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ寒天上にまいた。白色コロニーからのプラスミドを、ＥｃｏＲＩでの消化により挿入物について調査した。正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを製造元の指示に従いＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＣＴオペロンを含むＤＮＡ段片を低融点アガロースから単離した。プラスミドｐＢＡＤ１８−Ｃｍ（インビトロゲン）をＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして直線状ＤＮＡを低融点アガロースから単離した。消化したｐＢＡＤ１８およびＣＴオペロンは１２℃で連結し、そしてＴｏｐ１０Ｆ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。クロラムフェニコール−耐性コロニーに由来するプラスミドを制限分析により挿入物について調査し、そして代表的コロニーを配列決定して部位特異的突然変異の存在を確認した。プラスミドはＣＴ−ＣＲＭｓを発現させるためにＤＨ５α中で形質転換した。
【０１４３】
Ｅ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＣＴ−ＣＲＭｓの発現
プラスミドｐＬＰ９９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞、ＣＴ−ＣＲＭｓをそれぞれ発現する細胞を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）およびグリセロール（０．５％）を含むリン酸緩衝化Ｈｙ−Ｓｏｙ培地で、３７℃にて通気しながら成長させた。カルチャーが約４．５−５．５のＯＤ６００に達した時、それらは最終濃度０．５％までＬ−アラビノースを加えることにより誘導した。カルチャーは誘導後、３７℃で通気しながら３時間インキューベーションし、そして次いで細胞を遠心により集めた。細胞ペレットを−２０℃に保存した。
【０１４４】
Ｆ．ＣＴ−ＣＲＭｓの調製および精製
細胞ペレットを室温で解凍し、そして１０ｍＭ ＮａＰＯ４および１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に元の９％のカルチャー容量で再懸濁した。細胞懸濁液はミクロ流動化装置を使用して機械的に破壊し、そして１０分間、８，５００ｘｇで遠心した。細胞溶解物はさらに１６０，０００ｘｇで１時間遠心することにより清澄化した。清澄化した細胞溶解物は、１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したカルボキシメチル（ＣＭ）−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（１０リットルのカルチャーあたり３００ｍｌのＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））（アマーシャム−ファルマシア）に、２ｍｌ／分の流速で乗せた。カラムを＞１０容量の１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）を用いて５ｍｌ／分
の流速で洗浄した。ＣＴ−ＣＲＭｓＥ２９Ｈホロトキシンは４カラム容量の１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ８．３）で溶出した。精製したＣＴ−ＣＲＭｓはＰＢＳ中での透析によりバッファー交換し、そして４℃で保存した。完全なホロトキシンおよび各サブユニットの存在は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥでそれぞれ決定した。未変性ＰＡＧＥは完全なコレラホロトキシンの分子量と予想される精製された８６ｋＤａ分子（データは示さず）の存在を示した（Ｔｅｂｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｖａｃｃｉｎｅ，１８（２４）：２７２３−２７３４）。加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは完全なホロトキシンを構成するＣＴ−Ａ（２７ｋＤａ）およびＣＴ−Ｂ（１２ｋＤａ）サブユニットに並んだ２つのバンドを示した（データは示さず）。
【実施例２】
【０１４５】
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
突然変異ＣＴ−ＣＲＭＳ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨは、未変性ｐａｇｅ電気泳動により分析して完全なホロトキシンとして精製後に存在するＣＴ−ＣＲＭｓの割合を決定した。精製したＣＴ−ＣＲＭｓ、各１５μｌ（種々のタンパク質濃度）を６％の重合化未変性ポリアクリルアミドゲに流した。３種の濃度（３００、６００および１２００ｎｇ）のＣＴ−Ｂを標準として使用した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。次にゲルはデンシトメーターを使用してスキャンし、そしてホロトキシンの割合をＣＴ−ＣＲＭｓおよびＣＴ−Ｂ標準のデンシトメーターの読み取りから算出した。データは９５％のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、９１．２０％のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、９１．００％のＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、９８．８％のＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよび９０．９３％のＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨが完全なホロトキシンとして存在することを示した（表２）。
【０１４６】
【表２】
【実施例３】
【０１４７】
ＣＴ−ＣＲＭＳの残存毒性に関するＹ−１副腎細胞アッセイ
コレラトキシン／熱不安定性エンテロトキシンファミリーにおけるエンテロトキシンの毒性を測定するために、インビトロで使用されているマウスＹ−１副腎腫瘍細胞アッセイで、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを野生型ＣＴと毒性について比較した。このアッセイはトキシンが細胞表面受容体へ結合し、そして続いてトキシンのＡ１サブユニットが細胞の細胞質に入ることに依存している。
【０１４８】
コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）から単離された自然なコレラトキシンを、Ａ１−Ａ２連結部にタンパク質溶解的にニックを入れ、ジスルフィド結合のみで一緒に保持されているＡ１およびＡ２サブユニットを生じる。これによりＡ１およびＡ２サブユニットを不
安定にし、そして互いに容易に解離できるようにする。ニックを入れたＣＴのＡ１サブユニットは、細胞表面受容体への結合でＡ２サブユニットから解離し、そして細胞に入り、ここでそれは調節Ｇ−タンパク質（Ｇｓα）をＡＤＰ−リボシル化し、上記のようにその毒性効果を導く。対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産されたエンテロトキシン（ＣＴまたはＬＴのいずれか）はニックを入れず、したがって未だ連結しているＡ１−Ａ２ペプチドを有する。結果として、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）で生産されたＣＴは、Ｙ−１副腎細胞アッセイで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなヘテロロガスな細菌で生産されたＣＴよりも有意に毒性である。
【０１４９】
第１のＹ−１副腎細胞アッセイでは、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）に由来するニックを入れた野生型ＣＴと毒性について比較した。このアッセイでは、Ｙ−１副腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７９）を９６−ウェルの平らなプレートにウェルあたり１０４細胞の濃度でまいた。その後、精製（クーマシーブルー染色により決定された〜９０％純度）したＣＴ−ＣＲＭｓの３倍の連続希釈物を腫瘍細胞に加え、そして３７℃（５％ＣＯ２）で１８時間、インキューベーションした。次いで細胞を光学顕微鏡により毒性の存在（細胞のラウンディング：ｒｏｕｎｄｉｎｇ）について調査した。終点力価は５０％より多い細胞ラウンディングを与えるために必要なトキシンの最少濃度と定めた。残存毒性の割合は、ＣＴ−ＣＲＭｓにより誘導される力価で除算し、１００を掛けたコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）に由来する野生型のニックを入れたＣＴの終点力価（１００％毒性）を使用して算出した。表３に示すデータは、Ｙ−１副腎細胞アッセイを使用して試験した５個の精製された突然変異体ホロトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＳＨの残存毒性が、実質的に低減したことを示す。
【０１５０】
【表３】
【０１５１】
第２の別の実験では、上昇したレベルの突然変異ＣＴ−ＣＲＭを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺粗抽出物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したニックを入れていない野生型ＣＴホロトキシンに対してＹ−１副腎細胞アッセイで比較した。Ｙ−１副腎細胞はマルチ−ウェル皿中の１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中で、粗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解物の存在下でインキューベーションした。細胞毒性は前述のように監視した。この実験では、１毒性単位を一晩のインキューベーション後に７５〜１００％の細胞にラウンディングを生じるトキシンまたは上清の量と定めた。この実験結果を以下の表４に示す。
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
この実験結果は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＧおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨの毒性が実質的に低減され、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨの毒性が野生型ＣＴの毒性の約３０％であることを示した。理論に拘束されることなく、第２実験で生じた変異体は（表４）、第２実験で使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺粗抽出物が、ニックが入っていない突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを含んだという事実に起因するかもしれない。別の原因は毒性が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により生産される野生型の、ニックが入っていないＣＴの毒性の割合として算出されたからかもしれない、ここで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するニックが入っていない野生型ＣＴは、同じＹ１細胞アッセイで６２５０ｐｇ／ｍｌの５０％細胞ラウンディング用量を有した（データは示さず）。対照的に第１実験では、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの残存毒性はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅａｅ）により生産される野生型のニックが入ったＣＴの毒性の割合として算出され、ここでニックが入ったホロトキシンは、同じＹ１細胞アッセイで１２５ｐｇ／ｍｌの５０％細胞ラウンディング用量を有した。結果として、第２実験で報告された残存毒性は第１実験で得られたものより５０倍高かった。
【実施例４】
【０１５４】
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼアッセイ
ＮＡＤ＋：アグマチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、放射性標識したＮＡＤ＋からの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドの放出として測定した。簡単に説明すると、ＣＴおよびＣＴ−ＣＲＭｓはトリプシン活性化し、そして３０℃で３０分間、ＴＥＡＮバッファー（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ／アジ化ナトリウム／塩化ナトリウム）（ｐＨ８．０）中で５０ｍＭ グリシン／２０ｍＭ ジチオスレイトールとインキューベーションした。その後、反応に以下の材料を加えた：０．１μｇのダイズトリプシンインヒビター、５０ｍＭ リン酸カリウム、１０ｍＭ アグマチン、２０ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００μＭ ＧＴＰ、３ｍＭ ジミリストイルホスファチジル−コリン、０．２％コレート、０．０３ｍｇの卵白アルブミン、１００μＭ［アデニン−Ｕ−１４Ｃ］ＮＡＤ（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＮＥＮ（商標）、ボストン、マサチューセッツ州）、そして水で３００μｌの最終容量とした。３０℃で９０分間インキューベーションした後、１００μｌのサンプルをＡＧ１−Ｘ２（バイオ−ラッド）のカラム（０．６４ｘ５ｃｍ）に乗せ、これを１．０ｍｌの蒸留した／脱イオン化Ｈ２Ｏで５回、洗浄した。［１４Ｃ］ＡＤＰ−リボシルアグマチンを含有する溶出物をラジオアッセイのために回収した。溶出物中の１４Ｃの平均回収は、カラムに乗せたものに対する割合として表す。結果を表５に与える。
【０１５５】
【表５】
【０１５６】
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、基質としてジエチルアミノ（ベンジリジン−アミノ）グアニジン（ＤＥＡＢＡＧ）を使用して独立して測定した（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ，ＲＫ２００１ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３（１３）：４０２４−３２）。このアッセイでは、精製した細胞溶解物から突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの２５μｌアリコート（３０℃で３０分間、１／５０重量／重量％のトリプシンと活性化した）を、２００μｌの２ｍＭ ＤＥＡＢＡＧと０．１Ｍ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、１０μＭ ＮＡＤ、４ｍＭ ＤＴＴ中で２時間インキューベーションした。反応は、４００ｍｇのＤＯＷＥＸ ＡＧ５０−Ｘ８樹脂を含む８００μｌのスラリーバッファーを結合未反応基質に加えることにより止めた。上清のＡＤＰ−リボシル化ＤＥＡＢＡＧはＤＥＡＢＡＧでカリブレーションしたＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ蛍光計で蛍光の発光により定量した。突然変異ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨを除き、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、野生型よりも実質的に減少した（表６）。ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨで見られた高レベルのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、この実験で突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性が異なるアッセイプロトコールで異なる基質を使用して測定されたという事実に因るのかもしれない。
【０１５７】
【表６】
【実施例５】
【０１５８】
型を分類できないインフルエンザ菌（ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥ）（ＮＴＨＩ）の組換えＰ４外側膜タンパク質（ＲＰ４）単独で、またはＣＴ−ＣＲＭＳと一緒に免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）に、０、３および５週で塩水中の組換えＰ４タンパク質（ｒＰ４、５μｇ／用量）、あるいは野生型ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗま
たはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを一緒に配合して免疫感作あたり１．０μｇの用量で免疫感作した。１０μｌの総容量を鼻内投与した（鼻孔あたり５μｌ）。マウスは血清抗体応答をアッセイするために０、２、３、４、５または６日に採血した。最後（６週）の免疫感作から１週間後、マウスは粘膜抗体応答を分析するために屠殺した。
【０１５９】
群間の有意差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多比較試験（ｒＰ４タンパク質について）により、またはスチューデントｔ−検定（ＵｓｐＡ２について）により、ＪＭＰ（商標）統計探査ソフトウェア（ＳＡＳ研究所社、カリー、ノースカロライナ州）を使用して測定した。
【０１６０】
０、３、５および６週の血清抗体の分析は、本明細書に開示する任意の突然変異体を１μｇ／用量の濃度で配合したＮＴＨｉｒＰ４タンパク質の免疫感作がｒＰ４タンパク質に対する免疫応答を有意に誘導したことを示した。ｒＰ４タンパク質に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、配合にＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含めることにより約１５〜３５倍に上昇した。新規な突然変異トキシン（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）間には、たとえそれらがすべてｒＰ４タンパク質単独よりも有意に高いＩｇＧ力価を誘導しても、ステューデントｔ−検定により全抗−ｒＰ４ ＩｇＧ力価の有意差は観察されなかった（表６）。ＩｇＡ抗体の個々の血清分析は、配合ｒＰ４／ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇのみが、塩水中のｒＰ４タンパク質を受容した対照群よりもｒＰ４タンパク質に対するＩｇＡ抗体の有意により高い力価を誘導したことを示した（表７）。各新規ＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の使用は、ｒＰ４タンパク質に対する血清ＩｇＧサブクラス抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）も強化した（表９）。
【０１６１】
抗−ｒＰ４タンパク質抗体応答も、プールした粘膜洗浄サンプル（ＳＡＬ：唾液腺洗浄サンプル、ＢＡＬ：気管肺胞洗浄サンプル、ＶＷ：膣洗浄サンプル）で分析した（表８）。予想どおり、ｒＰ４／塩水を免疫感作したマウスからのＢＡＬおよびＮＷ中に抗体の誘導は無かった。しかしＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇの有力な粘膜アジュバント能力は明らかに証明可能であった。これらプールサンプルについて統計的分析を行うことができなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを受容したマウスは、試験した各唾液、ＢＡＬおよびＶＷサンプル中に上昇したｒＰ４特異的ＩｇＡ抗体を示した。
【０１６２】
さらに抗−ＣＴ抗体応答も測定した。表７〜１１に示すように、すべてのＣＴ突然変異体が全身性および粘膜性のＣＴ−特異的抗体応答を最後の免疫感作から１週間後に強化した。しかし上記実験におけるマウスは実験の完了後にマウス肝炎ウイルスに感染していると決定されたことに注目すべきである。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
ａ．メスＢＡＬＢ／ｃマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６５】
【表８】
【０１６６】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．粘膜サンプルは６週、１日に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
ａ．メスＢＡＬＢ／ｃマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
ｅ．＊塩水対照と比べた有意差を示す；∧は他のＩＮ群と比べた有意差を示す。
【０１７１】
【表１１】
【０１７２】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
ｅ．＊塩水対照と比べた有意差を示す；∧は他のＩＮ群と比べた有意差を示す。
【実施例６】
【０１７３】
Ｍ．カタラーリス（ＣＡＴＡＲＲＨＡＬＩＳ）のＵＳＰＡ２外膜タンパク質で免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
この実験では、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがＭ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の自然なＵｓｐＡ２外膜タンパク質に対する全身性および粘膜性免疫応答を増す能力を調査した。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）に、０、３および５週で免疫感作した。１０μｌの塩水中の精製されたＵｓｐＡ２（５μｇ／用量）単独、または０．１μｇ用量の野生型ＣＴまたは突然変異ＣＴ−ＣＲＭ（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）を含む１０μｌの配合物を、０、２および４週にＢａｌｂ／ｃマウスにＩＮ（５μｌ／鼻孔）で投与した。０、２、４および６週の血清抗体の分析は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き任意の前記ＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を配合したＵｓｐ２での免疫感作が、０．１μｇ／用量の濃度でＵｓｐＡ２に対する抗体応答を強化したことを示した。ＵｓｐＡ２に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、ＣＴ−由来の突然変異体を含めることにより約３〜１０倍に上昇した。ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴは、スチューデントｔ−検定によりＵｓｐＡ２／ＰＢＳよりも有意に高いＩｇＧ力価を誘導した。しかし新規な各突然変異体トキシン（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）間の全抗−ＵｓｐＡ２ＩｇＧ力価に有意差は観察されなかった。ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、各ＣＴ突然変異体の使用はＵｓｐＡ２に対する血清ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧｂ抗体を強化した（表１２）。
【０１７４】
抗−ＵｓｐＡ２抗体応答は、プールした粘膜洗浄サンプルでも分析した（表１３）。予想どおり、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳを免疫感作したマウスからの粘膜洗浄物中に抗体の誘導は観察されなかった。しかし各突然変異ＣＴの有力な粘膜アジュバント能は明らかに証明された。これらプールサンプルについて統計的分析を行なわなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰを受容したマウスには、集めた各気管肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、鼻洗浄液（ＮＷ）および膣洗浄液（ＶＷ）サンプル中にＵｓｐＡ２に対するＩｇＧまたはＩｇＡ力価の上昇が示された（表１３）。対照的にＵｓｐＡ２タンパク質に対する局所免疫応答のアジュバンティングにおいて、いずれの新規突然変異トキシンもＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴよりも良くないようであった。血清および粘膜洗浄液中のタンパク質−特異的ＩｇＧおよびＩｇＡレべルも２８日に調査した。すべての突然変異ＣＴが強化された血清ＩｇＧ抗体応答を誘導した（データは示さず）。気管、鼻および膣洗浄液中のＩｇＧおよびＩｇＡレべルも測定した。これらの洗浄液中にＩｇＡは検出されず、そしてＩｇＧは２〜３の洗浄液で検出されただけであった（表１３）。この実験でマウスは、実験が完了した後にマウス肝炎ウイルスに感染していると決定された。
【０１７５】
【表１２】
【０１７６】
＊ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２、４週に鼻内に免疫感作した。
血清および粘膜洗浄液を６週に集めた。抗原用量は５μｇであり、そしてアジュバント用量は動物あたり０．１μｇであった。ＩｇＧサブクラスはプールした血清についてＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７７】
【表１３】
【０１７８】
＊ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２、４週に鼻内に免疫感作した。
血清および粘膜洗浄液を６週に集めた。抗原用量は５μｇであり、そしてアジュバント用量は動物あたり０．１μｇであった。ＩｇＧおよびＩｇＡ力価はプールした血清についてＥＬＩＳＡにより測定した。
【実施例７】
【０１７９】
突然変異トキシンコレラホロトキシンのアジュバント性
毒性、機能性および免疫原性の特徴が異なる突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの総合的なパネルを作成するために、上記のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を粘膜アジュバントとして分析し、そして各突然変異体の毒性および酵素活性プロフィールを決定した。表１４から１８にまとめるように、すべての突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性および酵素活性を有する。これらの遺伝的に解毒された突然変異ＣＴｓを、Ｍ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の自然なＵｓｐＡ２タンパク質に対する免疫応答を補助する（ａｄｊｕｖａｎｔ）能力について評価した。
【０１８０】
実験は以下のように行った：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）は０、２および４週に、５μｇの精製した自然なＵｓｐＡ２タンパク質（ＰＢＳ中）で、または免疫感作あたり０．１または１．０μｇの用量で野生型ＣＴまたはＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨまたはＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨまたはＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを共配合して（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）免疫感作した。１０μｌの全容量を鼻内に投与した（５μｌ／鼻孔）。マウスは血清抗体応答をアッセイするために０、２、４または６週に採血した。最後の免疫感作（６週）から２週間後、マウスは粘膜抗体応答を分析するために屠殺された。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価はＯＤ４０５で０．１の終点で測定した。群間の有意差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多比較試験により、ＪＭＰ（商標）統計探査ソフトウェア（ＳＡＳ研究所社、カリー、ノースカロライナ州）を使用して測定した。
【０１８１】
ＣＴ−ＣＲＭｓのアジュバント性は以下のようにまとめることができる。２、４および６週の血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き任意のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を１μｇ／用量で配合したＵｓｐＡ２タンパク質の免疫感作が、ＵｓｐＡ２タンパク質に対する抗体応答を有意に強化したことを示した（表１５）。ＵｓｐＡ２タンパク質に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、ＣＴ−誘導突然変異体（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除く）を包含することにより約１１〜６８倍に上昇した（表１６）。ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ（１μｇ用量で）およびＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ（０．１μｇおよび１μｇの両方で）は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ分析によりＵｓｐＡ２／ＰＢＳよりも有意に高いＩｇＧおよびＩｇＡ力価を誘導した。しかしＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、各新規突然変異トキシン間で全抗−ＵｓｐＡ２ ＩｇＧ力価に有意差は観察されなかった（表１６）。ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、１μｇ用量での各ＣＴ突然変異トキシンの使用もＵｓｐＡ２に対する血清ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体を強化した（表１７）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂ力価の比率は約１．０であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２型のバランスがとれた免疫応答を示した。
【０１８２】
抗−ＵｓｐＡ２タンパク質抗体応答は、プールした粘膜洗浄サンプルでも分析した（表１８）。予想どおり、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳを免疫感作したマウスからの粘膜洗浄液中に抗体の誘導は観察されなかった。しかし各突然変異ＣＴ−ＣＲＭ（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除く）の有力な粘膜アジュバント能は明らかに証明された。粘膜サンプル中のほとんどで検出されるＵｓｐＡ２特異的粘膜ＩｇＡ抗体が存在した。これらプールサンプルについて統計的分析を行なわなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗを受容したマウスには、集めた各気管肺胞洗浄液、鼻洗浄液および膣洗浄液サンプル中にＵｓｐＡ２タンパク質に対して上昇したＩｇＧまたはＩｇＡ抗体が、野生型ＣＴまたはＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと同様に示された。
【０１８３】
これらＣＴ−ＣＲＭｓは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きＭ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）のＵｓｐＡ２タンパク質に関する有力な粘膜アジュバントである。血清抗体データは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きすべてのＣＴ−ＣＲＭｓが１μｇ用量でＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨとのようにＵｓｐＡ２タンパク質に対する免疫応答を等しく補助することができることを示した（表１６）。０．１μｇ用量で、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰは同じ用量のＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈよりも有力であると思われた（表１６）。粘膜洗浄データは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きすべてのこれらＣＴ−ＣＲＭｓが有力な粘膜アジュバント特性を保持することを示唆しているようである（表１８）。さらに表１４に示すよう、それらすべてが野生型ＣＴよりも有意に低い残存特性および酵素活性を有する。したがってこれらの突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはさらに効果的な粘膜アジュバントである。
【０１８４】
【表１４】
【０１８５】
【表１５】
【０１８６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５群）に、０、２＆４週に１０μｌ容量でＩＮ免疫感作した。血清を６週に集めた。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価はＯＤ４０５が０．１の終点で決定した。Ｔｕｋｅ ｙ−Ｋｒａｍｅｒ分析は以下を示した：１μｇ用量の各アジュバントは０．１μｇ用量の同じアジュバントから統計的に有意である（ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰのＩｇＧおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＧのＩｇＡを除く）。アスタリスク（＊）で報告した表１６の結果は、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳ群から統計的に有意である。脚注（ａ）で示した結果は、すべての０．１μｇ用量（ＣＴを除く）および１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇよりも統計的に有意に高い。脚注（ｂ）で示した結果は、１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨを除き、すべての１μｇ用量よりも統計的に有意に低い。脚注（ｃ）で示した結果は、０．１μｇ用量（ＣＴを除く）および１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇよりも統計的に有意に高い。脚注（ｄ）で示した結果は、すべての１μｇ用量および０．１μｇ用量のＣＴおよびＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰよりも統計的に有意に低い。
【０１８７】
【表１６】
【０１８８】
表１７に報告する結果は、以下の実験に基づいた。５匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、０、２および４週に１μｇＣＴ（シグマ）またはＣＴ突然変異体で補助したｎＵｓｐＡ２を含有する１０μＬを鼻内に免疫感作した。終点抗体力価は６週で集めた血清から決定した。データを０．１のＯＤ４０５を生じる逆希釈の幾何平均（±１）として表１７に与える。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒによる統計分析ではアスタリスク（＊）で印を付けた結果がｎＵｓｐＡ２／ＰＢＳ群よりも有意に高いことを示した。
【０１８９】
【表１７】
【０１９０】
表１８のデータについて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２および４週に１０μｌ容量をＩＮ免疫感作した。粘膜洗浄サンプルを６週目に集めた。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価は、ＤＯ４０５が０．１の終点で決定した。
【０１９１】
【表１８】
【実施例８】
【０１９２】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）の精製した自然な融合（Ｆ）タンパク質で免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
本発明の突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがＲＳウイルス（ＲＳＶ）タンパク質に対する粘膜免疫応答を増す能力を、精製された自然な融合（Ｆ）タンパク質を使用して調査した。
【０１９３】
自然なＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢、５／群）に、０および３週にＲＳＶの２４８／４０４株に由来する自然な精製された融合（Ｆ）タンパク質を免疫感作した（ＩＮ、１０μｌ）。タンパク質（３μｇ／用量）を、１．０または０．１μｇの示したＣＴ−ＣＲＭを用いて混合物に調製した。対照マウスはＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ単独と、野生型ＣＴと、またはＰＢＳと混合したＦタンパク質で免疫感作した。ＥＬＩＳＡにより終点の抗−Ｆタンパク質全およびサブクラスＩｇＧおよびＩｇＡ力価を決定するために、血清（幾何平均力価±１標準偏差）および気管肺胞洗浄液（ＢＡＷ）、鼻洗浄液（ＮＷ）および膣洗浄液（ＶＷ）を２回目の免疫感作から２週間後に集めた。粘膜洗浄液サンプルは終点力価を決定するためにプールした。
【０１９４】
２回の実験からの結果を表１９および２０に与える。
【０１９５】
【表１９】
【０１９６】
【表２０】
【０１９７】
本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を１．０μｇ用量で粘膜アジュバントとして使用した時、突然変異ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＴＨまたは野生型ＣＴの使用に類似する結果が得られた（表１９）。ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＴＨまたは野生型ＣＴと混合したＦタンパク質で免疫感作した後に誘導された抗−Ｆタンパク質ＩｇＧまたはＩｇＡ力価から注目すべき差異は観察されなかった。しかし０．１μｇ用量で、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇは、血清抗−Ｆタンパク質ＩｇＡ力価を増すことがあまりできないようだった。本発明の突然変異体を配合したＦタンパク質で免疫感作したマウスの粘膜洗浄液は、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴを混合したＦタンパク質により誘導される力価に匹敵するようだった（表２０）。
【０１９８】
このように本発明のすべてのＣＴ−ＣＲＭ突然変異体はＦタンパク質に関するアジュバント活性を有した。
【０１９９】
本明細書で引用したすべての刊行物および技術文献は、引用により本明細書に編入する。本発明を特定の好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考える。そのような修飾は特許請求の範囲内にあるものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性突然変異コレラホロトキシンおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体の免疫系は病原体を攻撃するために様々なメカニズムを活性化する（非特許文献１）。しかしこれらすべてのメカニズムが免疫感作後に活性化される必要はない。免疫感作により誘導される防御免疫は、病原体に対抗または排除するために適当な免疫応答を誘導する免疫原性組成物の能力に依存する。病原体に依存して、これには細胞性および／または体液性免疫応答が必要となるかもしれない。多くの抗原は投与された時にそれら自体では免疫原性が不十分であるか、または免疫原性ではない。抗原に対する強力な適応免疫応答にはほとんどいつも、抗原が免疫応答を強化する物質であるアジュバントと一緒に投与される必要がある（非特許文献２）。
【０００３】
効果的な免疫感作法の必要性は、胃腸管、肺、鼻咽腔または尿生殖器面で、またはそれらを通って身体に入る急性の感染を引き起こす感染性生物に対して特に急がれている。これらの領域は、ほとんどが分泌免疫グロブリンＩｇＡからなる免疫グロブリンを含む粘膜に浸されている（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。この免疫グロブリンは多数のＩｇＡ−生産形質細胞に由来し、粘膜の下にある基底膜領域に浸潤する（非特許文献６；非特許文献７参照）。分泌型免疫グロブリンＩｇＡは分泌成分の作用を通して基底面に特異的に輸送される（非特許文献８）。
【０００４】
非経口免疫感作処方は通常、分泌型ＩｇＡ応答を誘導するには非効果的である。分泌型免疫は最もしばしば、粘膜に付随したリンパ様組織の直接的免疫感作を通して達成される。それらが１つの粘膜部位で誘導した後、ＩｇＡ−生産形質細胞の前駆体が溢出し、そして多様な粘膜組織に染み渡り、ここで最終的に分化して高率のＩｇＡ合成が起こる（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。徹底的な研究により、この共通粘膜免疫系を誘導する粘膜免疫感作の可能性（ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）が証明された（非特許文献１２）。稀な例外はあるが、効果的な免疫感作を達成するためには大用量の抗原が必要なので、この取り組みは精製された抗原に関しては現実的ではなくなった。
【０００５】
この問題を克服するために調査された方法の中に、粘膜アジュバントの使用がある。従来技術には抗原の免疫応答を強化する多数のアジュバントが知られている（非特許文献１３）。これらのアジュバントは抗原と混合した時、抗原を粒子状とし、抗原が体内により長期間留まることを助け、これによりマクロファージの取り込み上昇を促進し、そして免疫応答を強化する。しかし多くのアジュバントにより誘導される都合の悪い反応、またはそれらが粘膜免疫の誘導において効果が無いことから、免疫原性組成物を送達するためにより良いアジュバントの開発が必要となった。不幸なことには、今日までのアジュバントの開発はほとんど経験により実行されている（非特許文献１４）。すなわち抗原性組成物の送達に効果的なアジュバントを開発するためには、合理的およびより直接的な取り組みが必要である。
【０００６】
グラム陰性細菌であり、胃腸管の疾患であるコレラの原因菌であるコレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）により分泌されるトキシンは、アジュバントとして極めて有力である。コレラトキシン（ＣＴ）は３８２アミノ酸配列（配列番号１）として報告され（非特許文献１５）、これは１８アミノ酸シグナルを有する（配列番号１のアミノ酸１〜１８）。コレラトキシンホロトキシ分子は、トキシンの酵素活性の原因であるＣＴ−Ａ（配列番号２または配列番号１のアミノ酸１９〜２５８）と名付けられた１つのペプチドサブユニット、
およびトキシンの腸表皮細胞ならびにそれらの表面上にガングリオシドＧＭ１を含む他の細胞への結合に関与する各々がＣＴ−Ｂと名付けられた５つの同一ペプチドサブユニット（各々が２１アミノ酸シグナル（配列番号１のアミノ酸２５９〜２７９）に続いてＣＴ−Ｂペプチドサブユニット（配列番号１のアミノ酸２８０〜３８２）を有する）からなるヘキサヘテロマー複合体である（非特許文献１６；非特許文献１７）。コレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）により生産されるＣＴは、成熟ＣＴ−Ａ（配列番号２）のアミノ酸１８７位および１９９位のシステイン間の１つのジスルフィド結合ループ内でタンパク質溶解的に開裂されるＣＴ−Ａサブユニットを有する。この開裂は酵素的に活性なＡ１ポリペプチド（非特許文献１８）および断片Ａ１をＣＴ−Ｂペンタマーに連結するより小さいポリペプチドＡ２（非特許文献１９）を生じる。酵素的に活性な断片ＣＴ−Ａ１はエンテロサイト（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）に入った時に毒性を生じ、調節Ｇ−タンパク質（Ｇｓα）をＡＤＰ−リボシル化する。これはアデニル酸シクラーゼの構成的活性化、ｃＡＭＰの細胞内濃度の上昇および流体および電解質の小腸管腔への分泌を導き（非特許文献２０）、これにより毒性が引き起こされる。インビトロでＣＴのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、真核細胞内で小胞輸送（ｖｅｓｉｃｌｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に関与することが知られている小ＧＴＰ−結合タンパク質であるＡＲＦと呼ばれるアクセサリータンパク質の存在により刺激される（非特許文献２１）。
【０００７】
ＣＴと非関連抗原との同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、その抗原に対して同時発生の循環および粘膜抗体応答の誘導をもたらすことが報告された（非特許文献２２）。ヒトにおいて野生型ＣＴにより引き起こされる下痢のような望ましくない症状の同時発生を最少とするために、実質的に低減した毒性を有するＣＴホロトキシン形をアジュバントとして使用することが好ましい。ＣＴの突然変異体はより有用なアジュバントを達成する手段として示唆された。実質的に毒性が低減した突然変異コレラトキシンホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓと命名）を合理的に設計する１つの方法は、コレラ（ＣＴ）および関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ−Ｉ、ＬＴ−ＩＩａおよびＬＴ−ＩＩｂ）のファミリーに完全に保存されているトキシン分子中のアミノ酸残基を同定し、そして改変することである。実質的に毒性が低減した突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを生成するための別の合理的な方法は、ジフテリアトキシン（ＤＴ）および百日咳トキシン（ＰＴ）のようなＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ酵素活性を有する関連トキシンの骨格を含むＣＴ骨格の構造的配列に基づき、ＮＡＤ−結合に重要であることが同定されたホロトキシン分子のアミノ酸残基を改変することである（非特許文献２３；非特許文献２４）。
【０００８】
最近、ＣＴのそのように合理的に設計した、遺伝的に解毒された（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ）突然変異体が開示され、ここで１つの非保存的アミノ酸置換（グルタミン酸からヒスチジン）が、成熟Ａサブユニットのアミノ酸２９位でアミノ酸を改変することにより導入された（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ）。生成した突然変異体コレラホロトキシンは実質的に酵素的毒性が低減しているが、優れたアジュバント性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）および免疫原特性を有することが示された（特許文献２、引用により本明細書に編入する）。
【０００９】
このように実質的に低減した毒性を有するが、野生型ＣＴホロトキシンと同じかまたは強化されたアジュバント特性を有するＣＴホロトキシンのさらなる突然変異体を同定し、かつ／または合理的に設計する必要性が存在する。
【００１０】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／２９６，５３１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１８４３４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ，ＣＡ．ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，編集、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，「健常および疾患における免疫系（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）、第２版、カレントバイオロジー社（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）、ロンドン、英国（１９９６）
【非特許文献２】Ａｕｄｂｅｒｔ，Ｆ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｉｓｅ，Ｌ．Ｄ．１９９３ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１４：２８１−２８４）
【非特許文献３】Ｈａｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，１９６１ Ｉｎｔｌ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，２４１−２６７
【非特許文献４】Ｔｏｍａｓｉ，Ｔ．Ｂ．，ａｎｄ Ｚｉｇｅｌｂａｕｍ，Ｓ．，１９６３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４２，１５５２−１５６０
【非特許文献５】Ｔｏｍａｓｉ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９６５ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ，１２１，１０１−１２４
【非特許文献６】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｐ．ａｎｄ．Ｂａｋｌｅｉｎ，Ｋ，Ｓｃａｎｄ．１９７６ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１ （追補３６），１〜４５
【非特許文献７】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｐ．１９８４「健常および疾患におけるヒト鼻粘膜および扁桃の免疫機能（Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎａｓａｌ Ｍｕｃｏｓａ ａｎｄ Ｔｏｎｓｉｌｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、第２８頁および以下、肺および上呼吸管の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｕｐｐｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ）、Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ，Ｊ．編集、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、ニューヨーク州
【非特許文献８】Ｓｏｌａｒｉ Ｒ，ａｎｄ Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ，Ｊ−Ｐ，１９８５ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，６，１７−２０
【非特許文献９】Ｃｒａｂｂｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９６９ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．，１３０，７２３−７４４
【非特許文献１０】Ｂａｚｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９７０ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５，１０４９−１０５１
【非特許文献１１】Ｃｒａｉｇ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，１９７１ Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ，１３４，１８８−２００
【非特許文献１２】Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９７８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６１，７３１−７３７
【非特許文献１３】Ｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｏ．ａｎｄ Ｅａｌｄｉｎｇ，Ｗ．，１９８４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２，２７３６−２７４１
【非特許文献１４】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，上記引用の頁１２〜２５から１２〜３５
【非特許文献１５】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７
【非特許文献１６】Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．，１９７６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，１２４２〜１２４８
【非特許文献１７】Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．，１９７３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２，３５５８〜３５６６
【非特許文献１８】Ｋａｓｓｉｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１２１４８〜１２１５２）
【非特許文献１９】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９７９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，５８５５−５８６１）
【非特許文献２０】Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｅｒｅｎ，Ｒ，１９７８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，３０５０〜３０５４
【非特許文献２１】Ｗｅｌｓｈ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，「ＡＤＰ−リボシル化因子：コレラトキシンを活性化し、そして小胞輸送を調節するグアニン−ヌクレオチトキ−結合タンパク質のファミリー（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ；Ａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｇｕａｎｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｃｈｏｌｅｒａ Ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」、天然トキシンのハンドブック：疾患における細菌のトキシンおよび毒素因子（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ｐ２５７〜２８０、第８巻、Ｍｏｓｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，編集、マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、ニューヨーク州 １９９５
【非特許文献２２】Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７）。
【非特許文献２３】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，「熱−不安定性エンテロトキシン（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）（Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）」、タンパク質トキシンおよびそれらの細胞生物学における使用の指針（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ ａｎｄ Ｒａｐｐｎｏｌｉ，Ｒ，編集、オックスフォード大学出版、オックスフォード、英国（１９９７）
【非特許文献２４】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、「グラム−陰性細菌のコレラトキシンおよび関連するエンテロトキシン（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、第２２５〜２５６、天然トキシンのハンドブック：疾患における細菌のトキシンおよび毒素因子（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、第８巻（Ｍｏｓｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，編集、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州 １９９５
【発明の開示】
【００１１】
１つの観点では、本発明は野生型コレラホロトキシン（ＣＴ）に比べて、有意に低減した毒性を有するが、免疫系の有力な刺激物として機能する能力を保持したコレラホロトキシンの新規な突然変異した、免疫原性形態（ＣＴ−ＣＲＭｓと命名された）を提供する。具体的には本発明は望ましくは部位特異的突然変異誘発法により生成し、そして野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性を有するが、アジュバント特性に損失がない５個の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）に関する。
【００１２】
１つの態様では、本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸残基が別のアミノ酸に置換され、この置換は毒性に実質的な低減をもたらす。本発明の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンまたはグリシンに置換されている。アミノ酸位の決定について、ＣＴ−Ａの配列は配列番号２に例示されている。しかしＣＴ−Ａの他の変異体および断片も使用することができる。
【００１３】
別の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸４９位に単一のアミノ酸残基の挿入があり、この挿入は毒性に実質的な低減をもたらす。この観点および本明細書全体を通して、「Ａサブユニットの単一（または多数）のアミノ酸残基（１つまたは複数）の挿入があり」と言う時はいつでも、野生型残基（１つまたは複数）のアミノ酸位（１つまたは複数）［挿入アミノ酸番号（１つまたは複数）］が下にずれることを意味する。本発明の好適な態様では、アミノ酸残基ヒスチジンかＡサブユニッの
アミノ酸４９位に挿入され、これにより元の４９、５０位等にあったアミノ酸残基は５０、５１等にずれる。
【００１４】
第３の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭは実質的に低減したＣ
Ｔ毒性を有し、そしてＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸３５位および３６位に２つのアミノ酸残基の挿入があり、この挿入は毒性に実質的な低減をもたらす。本発明の観点の好適な態様では、アミノ酸残基グリシンおよびプロリンがＡサブユニットの３５位および３６位に挿入され、これにより元の３５位および３６位のアミノ酸残基は３７および３８等にずれる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明の新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭは実質的に低減したＣＴ毒性を有し、そしてＣＴのサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸残基３０にアミノ酸置換、そしてＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位に２つのアミノ酸残基の挿入があり、この置換および挿入は実質的に低減した毒性をもたらす。本発明の観点の好適な態様では、アミノ酸トリプトファンにＡサブユニットのアミノ酸３０位のチロシンが置換され、そしてＡサブユニットのアミノ酸位３１および３２にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンがそれぞれ挿入され、これにより元の３１位および３２位のアミノ酸残基は３３位および３４位等にずれる。
【００１６】
別の観点では、本発明は突然変異させたＣＴが今、免疫応答を刺激するトキシンの能力を抑制（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）せずに実質的に低減した毒性を有するように、通常の技術を使用して野生型ＣＴのＡサブユニットをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法を使用することにより、上記の新規ＣＴ−ＣＲＭｓを生産する方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらに別の観点では、選択した抗原、抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するためにアジュバントとして上記のような突然変異ＣＴ−ＣＲＭ、および製薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる免疫原性組成物を提供する。好ましくはＣＴ−ＣＲＭは選択した抗原に対する脊椎動物宿主の全身性および／または粘膜抗原性免疫応答を生成、または強化するために有用である。選択された抗原は病原性ウイルス、細菌、真菌または寄生生物に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片である。選択される抗原はガン細胞または腫瘍細胞に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片でもよい。選択される抗原はアレルゲンに対するアレルギー応答を緩和するようにＩｇＥの生産を妨害するようなアレルゲンに由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片でもよい。選択される抗原は、脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とする疾患を防止し、または処置するために、アミロイド前駆体タンパク質に由来するもののような望ましくない様式、量または場所で宿主より生産されるもの（自己分子）を表す分子の部分に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片に由来するものでよい。
【００１８】
本発明の観点の１つの態様では、上記のような選択された抗原と本発明の突然変異した免疫原性のＣＴ−ＣＲＭタンパク質、および製薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる選択された免疫原性組成物が提供される。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は１以上の上記の新規な解毒した突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）の有効なアジュバント量を含むことにより、脊椎動物宿主に免疫応答を誘導するために、免疫原性組成物のアジュバントとしてこれらＣＴ−ＣＲＭの使用法、または上記の選択された抗原を含む抗原性組成物の能力を上げる方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる観点では、上記のように実質的に低減した毒性をもつ新規な免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列が提供される。好ましくはＤＮＡ配列（１つまたは複数）は、低減した毒性を有する突然変異ＡサブユニットおよびサブユニットＢの両方をコードする。あるいはＤＮＡ配列は低減した毒性をもつ突然変異Ａサブユニットのみをコードしてもよく、ここで改変したまたは突然変異ＣＴ−Ａはさらなる結合ドメインに融合されるか、またはＬＴ−Ｂと同時発現され、そして同時集合成（ｃｏ−ａｓｓ
ｅｍｂｌｅ）する。
【００２１】
本発明のさらなる観点では、本明細書に記載する免疫原性の解毒された突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むプラスミドが提供され、そしてここでそのようなＤＮＡ配列は宿主細胞でＣＴ−ＣＲＭの発現を支配する調節配列に操作可能に連結されている。好ましくは、調節配列は、アラビノース誘導性プロモーターを含んでなる。この観点の１つの態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１５と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンがトリプトファンに置換されている。本発明の別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１１と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンがグリシンに置換されている。
【００２２】
本発明の観点のさらに別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９０７と命名されたプラスミドを提供し、ここでＡサブユニットのアミノ酸４９位にアミノ酸残基ヒスチジンが挿入されている。本観点のさらに別の態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９０９と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンが挿入されている。さらなる態様では、本発明は実質的に低減した毒性をもつ免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むｐＬＰ９１０と命名されたプラスミドに関し、ここでＡサブユニットのアミノ酸３０位のアミノ酸残基チロシンがアミノ酸残基トリプトファンに置換され、そしてＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンが挿入されている。
【００２３】
本発明のさらなる観点では、本明細書に記載するプラスミドで形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションされた適当な宿主細胞系が提供される。免疫原性の、解毒された突然変異コレラホロトキシンは、上記の１つのプラスミドで適当な宿主を形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションし、そして実質的に低減した毒性をもつ該組換え免疫原性突然変異コレラホロトキシンタンパク質の宿主細胞による発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することにより生産される。
【００２４】
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下の本発明の詳細な説明を読めば当業者には容易に明白となるだろう。
【００２５】
＜発明の詳細な説明＞
低減した毒性を現すが、それらの優れたアジュバント特性は保持するコレラホロトキシンの突然変異形、および免疫原性組成物中のアジュバントとしてＣＴｓのこれら突然変異形の用途を本明細書に記載する。
【００２６】
Ａ．突然変異体の解毒されたコレラトキシンホロトキシン
本発明のコレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）の新規な突然変異体である解毒された免疫原性形態は、野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性が特徴である。しかしそのようなＣＴ−ＣＲＭｓは免疫系の有力な刺激物としてそれらの能力を保持している。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは、コレラトキシンの成熟ＣＴ−Ａサブユニット中に１または数個のアミノ酸置換および／または挿入を特徴とする。本発明の種々の突然変異ＣＴ−Ａサブユニッ
トは、アジュバント性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）において野生型ＣＴに似ている突然変異ＣＴホロトキシンを形成するために、ＣＴ−Ｂサブユニットに集成する能力も保持するが、野生型ＣＴに比べて実質的に低減した毒性を現した。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは野生型ＣＴ−Ｂサブユニットに会合する突然変異体または改変したＣＴ−Ａサブユニットを使用して機能的ホロトキシンを作成することができる。あるいは本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは改変または突然変異ＣＴ−Ｂサブユニットに会合する改変または突然変異ＣＴ−Ａ サブユニットを含んでなることができる。
【００２７】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓのアミノ酸置換または挿入の位置を記載するアミノ酸位置の数の決定については、成熟ＣＴ−Ａは配列番号２、すなわち野生型ＣＴ配列の配列番号１のアミノ酸１９〜２５８に例示される。コレラホロトキシンのＡサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、国際公開第９３／１３２０２号パンフレットに説明する。同様に、適当な成熟ＣＴ−Ｂ配列は配列番号１のアミノ酸２８０〜３８２で具体的に説明される。しかしコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＣＴ−ＡおよびＣＴ−Ｂの他の変異体、バイオタイプおよび断片も本明細書に記載するアミノ酸置換および挿入を含む配列として使用することができる。例えばＣ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｈｕａ Ｈｓｕｅｈ Ｔｓａ Ｃｈｉｈ，９（４）：３９５−３９９のＥＬＴＯＲバイオタイプ；ＮＣＢＩデータベース位置Ｎｏ．ＡＡＣ３４７２８、およびコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）トキシンの変異体の他の供給源を参照にされたい。
【００２８】
本発明の１つの態様では、本発明の幾つかのＣＴ−ＣＲＭｓを生じるアミノ酸置換または挿入は、１つのアミノ酸を同様な構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えること、すなわち保存的アミノ酸の置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換または挿入は、関与する残基の極性、電荷、溶解性疎水性、親水性および／または両親媒性における類似に基づき作ることができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；極性／中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本発明は、単一アミノ酸置換をもつ２つ、単一アミノ酸挿入をもつ１つ、および二重アミノ酸挿入をもつ１つ、および単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入をもつ１つのＣＴ−ＣＲＭｓにより例示される。これらのＣＴ−ＣＲＭｓは実施例１に詳細に説明するように生成し、表１に説明するようにＡサブユニット中に以下の突然変異を含む。
【００２９】
【表１】
【００３０】
このように１つの態様では、本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭはＣＴサブユニットＡのアミノ酸配列またはそれらの断片を含んでなり、ここでＡサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸残基が、実質的に低減した毒性を生じる別のアミノ酸に置換されている。本発明の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンに置換される。本発明の別の好適な態様では、Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、グリシンに置換される。生成したＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇはそれぞれ優れたアジュバント特性を示す。
【００３１】
本発明の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸位に単一のアミノ酸挿入を含んでなり、この挿入が実質的に低減した毒性を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸ヒスチジンがＡサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基に隣接して挿入され、優れたアジュバント特性を示す突然変異ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨを生じる。
【００３２】
本発明の別の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基に隣接したアミノ酸３５位および３６位に二重アミノ酸挿入を含んでなり、この挿入は毒性の実質的低減を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸グリシンおよびプロリンがＡサブユニットのアミノ酸３４位のグリシンに隣接して挿入されて突然変異ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰを生じ、これは優れたアジュバント特性を示す。
【００３３】
本発明のさらに別の新規ＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３０位に単一のアミノ酸置換およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位に二重アミノ酸挿入を含んでなり、この置換および挿入は毒性の実質的な低減を生じる。本発明の好適な態様では、アミノ酸３０位のアミノ酸残基チロシンがアミノ酸残基トリプトファンに置換され、そしてその後にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンが挿入されて突然変異ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨを生じ、これは優れたアジュバント特性を示す。
【００３４】
本発明のさらに別のＣＴ−ＣＲＭｓは、上に具体的に記載した少なくとも単一置換または単一もしくは二重突然変異、およびさらに少なくとも１つのさらなる突然変異を、上記に説明した１以上のアミノ酸残基２５、３０、３１、３２、３４、３５、３６、４８および４９以外の位置に含むことができる。国際公開第９３／１３２０２号明細書（これは引用により本明細書に編入する）は、コレラホロトキシンの毒性を低減するために役立つＣＴ−Ａサブユニット中の一連の突然変異を記載する。これらの突然変異にはアミノ酸７位
のアルギニン、９位のアスパラギン酸、１１位のアルギニン、２９位のグルタミン酸、４４位のヒスチジン、５３位のバリン、５４位のアルギニン、６１位のセリン、６３位のセリン、７０位のヒスチジン、９７位のバリン、１０４位のチロシン、１０６位のプロリン、１０７位のヒスチジン、１１０位のグルタミン酸、１１２位のグルタミン酸、１１４位のセリン、１２７位のトリプトファン、１４６位のアルギニンおよびア１９２位のアルギニンに置換を作成することを含む。引用により本明細書に記載する国際公開第９８／４２３７５号パンフレットは、コレラホロトキシンの毒性を低減するために役立つＡサブユニット中のアミノ酸１０９をセリンへ置換することを記載する。
【００３５】
本発明に有用な他の有用な突然変異体タンパク質には、上記のように提供される１以上の特別な突然変異を持つ完全長のホロトキシン、および上記の突然変異した残基を含む６量体のＣＴ−ＣＲＭポリペプチドまたはそれらの断片を含み、そしてこのタンパク質、ポリペプチドまたは断片はそれが由来する野生型ＣＴのアジュバント性を保持するが、低減した毒性を特徴とする。低減した酵素活性を持つこれらＣＴ−ＣＲＭｓの免疫学的に活性な断片は、本発明の方法および組成物にも有用となり得る。通常、断片は上記の突然変異誘発部位を含むＣＴ−ＣＲＭサブユニットタンパク質の少なくとも少なくとも約２５個の連続するアミノ酸を含む。より典型的にはＣＴ−ＣＲＭサブユニット断片はＡまたはＢサブユニットの少なくとも約７５個の連続するアミノ酸を含む。ＣＴ−ＣＲＭサブユニットの別の断片は、いずれかのサブユニットの少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む。ＣＴ−ＣＲＭ ＣＴ−Ａサブユニットのさらに別の態様は、約１５０個のアミノ酸または２４０個未満のアミノ酸を含むことができる。
【００３６】
本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭｓの断片が、脊椎動物宿主に選択した抗原に対する免疫応答を生じる、または強化するならば、以下に記載する方法および組成物に有用である。断片にはＣＴ−ＣＲＭサブユニットのカルボキシ−末端領域の短縮を含む。例えばＣＴ−Ａ突然変異体サブユニットのみを含むように短縮化されたＣＴ−ＣＲＭは望ましい断片である。同様に、約残基２４０または２５０で短縮化されたＣＴ−Ａサブユニットは望ましい断片である。本発明のさらに別の断片ＣＴ−ＣＲＭｓを選択することができる。さらなるＣＴ−ＣＲＭホロトキシンの断片は、ＣＴ−Ｂサブユニットまたは短縮化ＣＴ−Ｂサブユニットの５個未満の反復を含むことができる。前述の断片は上記のような１以上の特別な突然変異を含んでもよい。
【００３７】
他の適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質には、１以上のアミノ酸残基が置換された基を含むものを含むことができる。さらに別の適当なＣＴ−ＣＲＭホロトキシンタンパク質は、６量体ＣＴ−ＣＲＭタンパク質の１以上のサブユニットが、分子の半減期を延ばすための化合物のような化合物に融合している（例えばポリエチレングリコール）。
【００３８】
別の適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質は、さらなるアミノ酸がリーダーまたは分泌配列、またはＣＴ−ＣＲＭタンパク質の免疫原性を強化するために使用される配列のような１以上のポリペプチドサブユニットに融合されたものである。ＣＴ−ＣＲＭｓのさらに他の修飾には、ＣＴのＮ末端でのＣＴ−Ａシグナルまたはリーダー配列、すなわち配列番号１のアミノ酸１〜１８の上に挙げた削除、および／またはＣＴ−Ｂシグナルまたはリーダー配列、すなわち配列番号１のアミノ酸２５９〜２７９の削除、および／または免疫原性を生じない他の領域の削除を含む。同様に本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭｓの修飾には、シグナルまたはリーダー配列の他のシグナルまたはリーダー配列への置換を含む。例えば引用により本明細書に編入する米国特許第５，７８０，６０１号明細書を参照にされたい。
【００３９】
適当なＣＴ−ＣＲＭタンパク質のさらに別の例は、多数のホロトキシンタンパク質を一緒にまたは担体に結合する目的で、任意のアミノ酸（例えば−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−）または他のアミノ酸もしくは化学化合物スペーサーがポリペプチドサブユニットの末端に含まれ
る得るものである。例えば有用なＣＴ−ＣＲＭｓには、担体タンパク質に結合した１以上の上記ＣＴ−ＣＲＭｓまたはそれらのサブユニットを含む。あるいは有用なＣＴ−ＣＲＭは、場合により担体タンパク質に結合した多数のＣＴ−ＣＲＭｓを含む融合タンパク質中に存在することができる。
【００４０】
これらの態様に関して、担体タンパク質は選択したＣＴ−ＣＲＭの免疫原性を強化することができる望ましくはタンパク質または他の分子である。そのような担体はアジュバント効果も有するより大きな分子でよい。例えば通例のタンパク質担体には、限定するわけではないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ、これは細菌においてガラクトース代謝の第１段階を触媒する）、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１タンパク質を含む。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドのようなトキソイド（すなわち自然に存在するトキシンをコードする配列、十分な修飾によりその毒性活性を排除する）、それらの各トキシンおよびＣＲＭ１９７（ジフテリアトキシンの非−毒性形、米国特許第５，６１４，３８２号明細書）のようなこれらタンパク質の突然変異体も担体として使用することができる。他の担体には緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシンおよびレトロウイルス粒子（レトロウイルスおよびＶＰ６粒子を含む）を含む。あるいは担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用してもよい。例えばハプテンを細菌トキシンのＴ細胞エピトープに結合させることができる。米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照にされたい。同様に、種々の細菌熱ショックタンパク質、例えばマイコバクテリアｈｓｐ−７０を使用してもよい。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は別の有用な担体である。当業者はこの内容に使用するための適当な担体を容易に選択することができる。融合タンパク質はタンパク質様材料を結合するための標準技法により形成することができる。融合物は以下に記載する組換えＤＮＡ技術により調製された融合遺伝子構築物から発現させることができる。
【００４１】
本明細書に記載する他の適当なＣＴ−ＣＲＭｓは、酵素的毒性を復活せず、そしてアジュバント性を消失させない修飾により、あるいはそのような特性の組み合わせにより具体的に例示したＣＴ−ＣＲＭｓから異なることができる。好ましくは、アミノ酸置換は１つのアミノ酸を同様な構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性疎水性、親水性および／または両親媒性における類似に基づき作ることができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；極性／中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００４２】
例えば、ＣＴ−ＣＲＭタンパク質のサブユニットの１次配列を改変するが、通常は分子の機能を改変しない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。そのような変化の作成には、アミノ酸のハイドロパシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）指数を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を付与するハイドロパシックなアミノ酸指数の重要性は、一般に当該技術分野で認識されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−３２）。特定のアミノ酸を同様のハイドロパシック指数またはスコアを有し、そしてそれでも同様な生物学的活性を持つポリペプチドを生じる他のアミノ酸に置換することができることは知られている。各アミノ酸はその疎水性および荷電特性に基づきハイドロパシック指数が割り当てられた。それらの指数は；イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３
．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタメート（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００４３】
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシック特性が生成するポリペプチドの２次および３次構造を決定し、これが次にポリペプチドと酵素、基質、受容体、抗体、抗原等のような他の分子との相互作用を定めると考えられている。当該技術分野ではアミノ酸を、類似のハイドロパシック指数を有する別のアミノ酸に置換し、そして機能的に均等なポリペプチドを得ることができることが知られている。そのような変化において、ハイドロパシック指数が＋／−２内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１内は特に好ましく、そして＋／−０．５内はさらに一層好適である。
【００４４】
同様のアミノ酸の置換または挿入は親水性に基づき作成することもでき、特にこれにより作成される生物学的に機能的な均等なポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的態様での使用に意図する。引用により本明細書に編入する米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、隣接するアミノ酸の親水性により支配される、ポリペプチドの最大の部分的平均親水性がその免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性に相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた；アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換し、そして生物学的に均等な、そして特に免疫学的に均等なポリペプチドを得ることができると理解されている。そのような変化において、親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく；±１内は特に好ましく；そして±０．５内はさらに一層好適である。
【００４５】
上に概説したように、アミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、荷電、サイズ等に基づく。様々な前述の特性を考慮する例示的置換は当業者には周知であり、そして：アルギニンとリシン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【００４６】
さらに通常はＣＴ−ＣＲＭタンパク質の１次配列を改変しない修飾には、ポリペプチドのインビボまたインビトロでの化学的誘導化、例えばアセチル化、メチル化またはカルボキシル化を含む。また本発明のＣＴ−ＣＲＭｓとして含まれるのは、グリコシル化により修飾されたこれらタンパク質、例えば合成およびプロセッシング中またはさらなるプロセッシング段階でポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより；あるいは哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素のようなグリコシル化に影響を及ぼす酵素に対してポリペプチドを暴露することにより作られるものを含む。またＣＴ−ＣＲＭｓとして包含されるのは、リン酸化アミノ酸残基を有する上に確認される突然変異した配列、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンである。
【００４７】
また本発明のＣＴ−ＣＲＭｓとして含まれるのは、タンパク質溶解的分解に対する耐性
を改善し、または溶解性を至適化するために、通例の分子生化学的技法を使用して修飾された上記配列である。そのようなＣＴ−ＣＲＭｓに含まれるのは、自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または自然に存在しない合成アミノ酸を含むものである。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓに存在することができる他の既知の修飾は、限定するわけではないがアシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセッシング、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニレーションのようなタンパク質へのトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸の付加、およびユビキチン化である。
【００４８】
ＣＴの構造および機能に影響を及ぼす表１の新規ＣＴ−ＣＲＭｓの表現型効果を評価した。ＣＴ−コード遺伝子の部位特異的突然変異誘発法により生成した単一アミノ酸置換、単一アミノ酸挿入、二重アミノ酸挿入または単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入のいずれかを持つ突然変異Ａサブユニットも、非変性ゲル電気泳動アッセイにより決定されるように、サブユニットＢの存在下でＣＴ−Ｂサブユニットと免疫反応性ホロトキシンに集成することができた（表２、実施例２を参照にされたい）。各突然変異ホロトキシンもＹ−１副腎腫瘍細胞アッセイで試験して、野生型ＣＴホロトキシンに比べてその残存毒性について測定した（表３および４、実施例３を参照にされたい）。これらホロトキシンはそれらのアジュバント性において野生型ＣＴに似ているが、表３に提示される結果は野生型コレラホロトキシンと比べた時、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが実質的に低減した毒性を有することを示した。単一および二重アミノ酸置換を持つＣＴ−ＣＲＭｓの残存毒性は、野生型ＣＴに比べて実質的に低減された。これらのデータは突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがホロトキシンであり、そして野生型ＣＴよりも実質的に毒性が低いことを証明している。具体的には突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはＹ−１マウス副腎細胞アッセイで野生型コレラホロトキシンよりも有意に低い毒性レベルを示した。
【００４９】
各突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイでも野生型ＣＴと比較した（実施例４を参照にされたい）。Ｙ−１副腎細胞アッセイで作成した毒性データと一般に一致するこの結果は、種々のＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性が野生型ＣＴと比べた時に実質的に低下していることを示した（表５および６）。
【００５０】
本明細書で使用する用語および句「低減した毒性を有するホロトキシン」または「実質的に低い毒性」等は、本明細書に記載する５個のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４３ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）のような本発明のＣＴ−ＣＲＭｓ突然変異体が、野生型ＣＴに比べて精製したトキシンタンパク質の単位あたり実質的に低い毒性を現すことを意味する。この「低減した毒性」は有意な副作用、特にＣＴに付随することが知られている、例えば下痢を引き起こすことなく免疫原性組成物中に各突然変異体をアジュバントとして使用することを可能とする。以下により詳細に記載するように、本発明の突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはＹ−１マウス副腎細胞アッセイで野生型ＣＴよりも有意に低レベルの毒性を、そして野生型ＣＴと比べた時に有意に低減したＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【００５１】
本発明の免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、生成した突然変異ＣＴタンパク質がアジュバントとして機能し、同時に導入される脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように低減した毒性と保持されたアジュバント性のバランスを現す。以下の実施例で示すよう
に、マウスモデルのアッセイ系における結果は、本明細書に開示する突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができた。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた。本発明のＣＴ−ＣＲＭｓのこれら特徴を支持する実験を以下にまとめ、そして実施例でより詳細に述べる。
【００５２】
免疫原性組成物中に含める候補として同定された細菌またはウイルス抗原を含む組成物用の粘膜アジュバントとして、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの効力を評価するために、２つの異なるモデル抗原系を調査した：（１）組換えＰ４外側膜タンパク質（型を分類できないインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細菌（ＮＴＨｉ）のタンパク質“ｅ”（ｒＰ４）としても知られている）（米国特許第５，６０１，８３１号明細書を参照にされたい）、および（２）モラクセーラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）細菌の自然なＵｓｐＡ２外膜タンパク質（国際公開第９８／２８３３３号パンフレット）。
【００５３】
重要なことは、データは突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが異なる抗原の鼻内投与後（ＩＮ）に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができることを示す。マウスモデル系での結果は、本明細書に開示されるすべての突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが、これらの異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を有意に増すことができたことを示す。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた（表６〜１８を参照にされたい）。
【００５４】
本発明による免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、タンパク質がアジュバントとして機能し、同時に組成物で免疫感作した脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように、低減した毒性と保持されたアジュバント性のバランスを現す。
【００５５】
Ｂ．ＣＴ−ＣＲＭｓをコードする核酸分子
本発明の別の観点には、部位特異的突然変異、置換および／または挿入を有する上記のＣＴ−ＣＲＭｓおよび／またはそれらのサブユニット、あるいはさらに１以上のそれら突然変異、置換および／または挿入を有することができる断片をコードする、単離された、合成の、または組換え核酸分子および配列を含む。
【００５６】
ＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子は、好ましくは宿主細胞中でＣＴ−ＣＲＭの発現を支配する調節配列の制御下にあることができる。本明細書に記載するように、そのような核酸分子はインビトロでＣＴ−ＣＲＭタンパク質を発現するために、あるいはヒトでインビボでＣＴ−ＣＲＭタンパク質の発現を可能とするために使用することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「単離されたヌクレオチド分子または配列」は、自然な環境にある分子または配列に付随し得る他の生物学的成分の混入を含まない核酸セグメントまたは断片を称する。例えば本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列の１態様は、自然に存在する状態でそれを挟む配列から分離された配列、例えば自然に存在するゲノム中の断片に隣接する配列のような、断片に通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片である。さらに本発明のヌクレオチド配列および分子は、本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードするようにすでに改変されている。すなわち用語「単離された核酸分子または配列」は、細胞中の非突然変異核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質に自然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸配列または分子にも適用する。本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列は、組換え法、合成法、例えば突然変異誘発法、またはそのような方法の組み合わせのような他の常法により調製された配列および分子も包含する。本発明のヌクレオチド配列または分子は、本明細書に提示する具体的なヌクレオ
チド配列のみに限定するとは解釈されず、本明細書に提示するヌクレオチド配列と相同性を共有する（すなわち配列同一性を有する）任意の、かつすべてのヌクレオチド配列を含むと解釈されるべきである。
【００５８】
核酸またはそれらの断片に関して言う時、用語「実質的相同性」または「実質的類似性」とは適当なヌクレオチド挿入または欠失を含む核酸と別の核酸（またはその相補鎖）を最適に並列配置した時、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡのような周知の配列同一性アルゴリズムにより測定されるような、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％にヌクレオチド配列の同一性があることを称する。本明細書で使用する用語「相同的」は、２つのポリマー性分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子、あるいは２つのポリペプチド分子間の配列類似性を称する。２つの分子の両方のヌクレオチドまたはアミノ酸位が同じ単量体ヌクレオチドまたはアミノ酸で占有されている時、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンに占有されていれば、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は、対合するかまたは相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物配列において位置の半分（例えばサブユット長が１０のポリマーの５個の位置）が相同的ならば、２つの配列は５０％の相同性である。位置の９０％、例えば１０のうちの９が対合または相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＣＧ５’は５０％の相同性を共有する。本明細書で使用する用語「実質的に相同的」とは所望の核酸に対して約７０％の相同的、より好ましくは約８０％相同的、そして最も好ましくは約９０％相同的なＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００５９】
また本発明は、野生型ＣＴタンパク質に比べて低減した酵素的毒性を有し、そして野生型ＣＴのアジュバント性を保持する本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質またはサブユニットをコードする核酸に対して、少なくとも７０％、８０％または９０％相同的な核酸分子を含んでなる単離されたヌクレオチド分子を対象とする。さらに遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載するＣＴ−ＣＲＭの突然変異体または置換されたアミノ酸残基をコードする任意の３ヌクレオチドコドンも本発明の範囲内である。
【００６０】
本明細書で検討するように、ＣＴ−ＣＲＭｓ、突然変異ＣＴ−Ａサブユニットまたは突然変異ＣＴ−Ｂサブユニット、および／またはそれらをコードするＤＮＡ配列、あるいは本明細書に記載する核酸分子または組成物に有用な他の配列は、同定された配列に対するそれらの相同性または同一性の割合により定め、相同性の割合または同一性の割合を算出するために使用するアルゴリズムには以下を含む：Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：６７−７２；Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，分子配列の比較および整列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、（Ｍ．Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ，編集）。実践的なアプローチシリーズ：核酸およびタンパク質配列分析ＸＶＩＩＩ（Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＸＶＩＩＩ）、ＩＲＬ出版：オックスフォード、英国（１９８７）ｐｐ．４１７）、およびＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラム（Ｅ．Ｇ．Ｓｈｐａｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８：１７９−１９１）。これらは引用により本明細書に編入する。
【００６１】
本明細書で使用するように２つのＤＮＡが「操作可能に連結された」と記載することは、１本鎖または２本鎖ＤＮＡがそれぞれ２つのＤＮＡを含んでなり、そしてＤＮＡ配列の少なくとも１つがもう１つのＤＮＡに特徴つけられる生理学的効果を発揮できるように２つのＤＮＡがＤＮＡ中に並べられていることを意味する。
【００６２】
好ましくは本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質を生産すること、またはそれを細胞でインビボ生産するために投与することに使用するために、各ＣＴ−ＣＲＭタンパク質コード配列および必要な調節配列は、別のウイルスまたは非−ウイルス組換えベクターに存在する（核酸分子を細胞へ送達するための非−ウイルス法を含む）。あるいは本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質の二重コピーをコードする、または多数の異なるＣＴ−ＣＲＭｓをコードする２以上のこれら核酸配列をポリシストロン性転写、すなわち多くの遺伝子産物を発現するように設計された単一分子に含めてもよい。
【００６３】
本発明はさらに、免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含むベクター、特にプラスミドに関する。望ましい態様には、例えばＣＴ−Ａのアミノ酸残基２５に単一アミノ酸置換、ＣＴ−Ａのアミノ酸残基４８と４９との間に単一アミノ酸挿入、ＣＴ−Ａのアミノ酸残基３４と３５との間に二重アミノ酸挿入、またはＣＴ−Ａのアミノ酸残基３０に単一アミノ酸置換およびアミノ酸３０と３１との間に二重アミノ酸挿入を有する免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを含む。本明細書に使用する用語「ベクター」は、ウイルスまたは非ウイルス、例えば細菌、外因性またはヘテロロガスな核酸配列をコードするように設計された種に由来するＤＮＡ分子を意味する。すなわちこの用語には通例の細菌プラスミドを含む。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウイルスまたはファージに由来するプラスミド配列を含むことができる。そのようなベクターは染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素およびウイルスに由来するベクターを含む。ベクターはプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素、コスミドおよびファジェミドから派生したような、それらの組み合わせに由来してもよい。この用語にはまた１つの細胞から他の細胞へ遺伝子を移す非−複製ウイルスも含む。この用語は例えばポリリシン化合物等のような核酸を細胞に移すことを促進する非−プラスミドおよび非−ウイルス化合物も含むと解釈すべきである。
【００６４】
本発明の核酸分子には非−ウイルスベクター、または本発明に従いＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする配列を宿主細胞に送達する方法を含む。種々の非−ウイルスベクターが当該技術分野では知られており、そしてそれらには限定するわけではないがプラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、「裸の」ＤＮＡおよびカチオン性脂質またはポリマーと縮合（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）したＤＮＡを含むことができる。
【００６５】
細菌ベクターの例には限定するわけではないが、とりわけカルメットとゲランの菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕ ｒｉｎ）（ＢＣＧ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）に由来する配列を含む。適当なプラスミドベクターには例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１，ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８およびｐＢＲ３２８を含む。
【００６６】
適当な誘導性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅ，６９：３０１−３１５）、アラビノース発現ベクター（例えば、ｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４１２１−４１３０）、およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐ
ＥＴＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現するウイルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎ１により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で存在するプロファージが持つＴ７ｇｎ１遺伝子から、宿主のＢＬ２１株（ＤＥ３）またはＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）により供給される。ｐＢＡＤ系はａｒａＣ遺伝子により調節される誘導性アラビノースプロモーターに依存する。このプロモーターはアラビノースの存在で誘導される。
【００６７】
１例としてｐＬＰ９９１１と命名されたプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからトリプトファン）を有する、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ）。別の例としてｐＬＰ９９１５と命名されたプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからグリシン）を有する、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）。ｐＬＰ９９０７と命名された第３のプラスミドは、Ａサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基トレオニンに隣接したアミノ酸４９位に単一アミノ酸ヒスチジンが挿入された、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ）。別の例のプラスミドはｐＬＰ９９０９と命名されている。このプラスミドはＡサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基グリシンに隣接したアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンの二重アミノ酸挿入が挿入された、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ）。本発明で例示する別のプラスミドはｐＬＰ９９１０と命名されている。これはＡサブユニットのアミノ酸３０位に単一アミノ酸置換（アミノ酸３０位でアミノ酸残基チロシンのアミノ酸残基トリプトファンへの置換）、およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基の二重アミノ酸挿入（アラニンおよびヒスチジン）がなされた、実質的に毒性が低減した免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離され、そして精製されたＤＮＡ配列を含む（ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）。
【００６８】
別の種類の有用なベクターは１本または２本鎖バクテリオファージベクターである。例えば適当なクローニングベクターには限定するわけではないがとりわけ、バクテリオファージλベクター系、λｇｔ１１、μｇｔμＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、λｇｔ−ＷＥＳ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、λｇｔ−１−λＢＣ、λｇｔ−１−λＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ９を含む。
【００６９】
別の態様では発現ベクターは酵母発現ベクターである。Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母中で発現させるためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃＩ（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１（５）：４３３−４３７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２ Ｃｅｌｌ，３０（３）：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｇｅｎｅ，６１（２）：１２３−１３３）、およびｐＹＥＳ２（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を含む。
【００７０】
あるいはバキュロウイルス発現ベクターを使用する。培養した昆虫細胞中（例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞）でタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２
４：４３４−４４３）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９，Ｖｉｒｏｌ．，１７０（１）：３１−３９）を含む。
【００７１】
さらに別の態様では、哺乳動物発現ベクターを哺乳動物細胞での発現に使用する。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７ Ｎａｔｕｒｅ，３２９：８４０−８４２）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．，６１（１）：１８７−９３）を含む。哺乳動物細胞で使用する時、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により提供される。
【００７２】
組換えベクターの１種類は、組換え１本または２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。種々のウイルスベクター系が当該技術分野では知られている。そのようなベクターの例には限定するわけではないが、目的とする選択した核酸組成物を運ぶか、または発現するように構築される組換えアデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−に基づくベクター、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクター、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルス、組換えポックスウイルスベクター、組換えワクシニアウイルスベクター、ＳＶ−４０ベクター、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等を含む。
【００７３】
使用できるレトロウイルスには、欧州特許第４１５ ７３１号明細書；国際公開第９０／０７９３６号；同第９４／０３６２２号；同第９３／２５６９８号；および同第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号および同第９３／１０２１８号パンフレット；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；および欧州特許第０ ３４５ ２４２号明細書に記載されているものを含む。適当な組換えレトロウイルスの例には、国際公開第９１／０２８０５号パンフレットに記載されているものを含む。
【００７４】
アルファウイルスに基づくベクターもＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸分子として使用することができる。そのようなベクターは、例えばシンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネゼエラのウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）を含む広い種々のアルファウイルスから構築することができる。そのようなベクター系の代表例には、米国特許第５，０９１，３０９号；同第５，２１７，８７９号および同第５，１８５，４４０号明細書；ならびに国際公開第９２／１０５７８号；同第９４／２１７９２号；同第９５／２７０６９号；同第９５／２７０４４号および同第９５／０７９９４号パンフレットに記載されているものを含む。
【００７５】
アデノウイルスベクターの例には、Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６；６１６−６２７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２；４３１−４３４；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ＰＮＡＳ ９１：２１５−２１９；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１１４９８−１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６；Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．，１９９３ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９；Ｃａｉｌａｕｄ
ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７−１２９１；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２−３７８；およびＬｅｖｒｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｅｎｅ １０１：１９５−２０２に記載されているものを含む。例示のアデノウイルスベクターには、国際公開第９４／１２６４９号；同第９３／０３７６９号；同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号；および同第９５／００６５５号パンフレットに記載されているものを含む。他のアデノウイルスベクターには、米国特許第６，０８３，７１６号明細書に記載されているもののようなチンパンジーアデノウイルスに由来するものを含む。
【００７６】
別のウイルスベクターは、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなパルボウイルスに基づく。代表的な例には、国際公開第９３／０９２３９号パンフレット、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１０６１３−１０６１７に記載されているＡＡＶベクターを含む。他の特に望ましいＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１に基づくものを含む；２０００年５月１８日に公開された国際公開第００／２８０６１号パンフレットを参照にされたい。他の望ましいＡＡＶベクターにはプソイドタイプ（ｐｓｕｄｏｔｙｐｅｄ）された、すなわちＡＡＶ ＩＴＲｓにヘテロロガスなＡＡＶ血清型のカプシドにパッケージされたＡＡＶ５’ＩＴＲｓ、導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲｓからなるミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を含むものを含む。そのようなプソイドタイプされたＡＡＶベクターを生産する方法は、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに詳細に記載されている。
【００７７】
本発明の核酸分子が「裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ」である態様では、これをとりわけシクロデキストリン−含有ポリマーおよび保護的な相互作用性非縮合（ｎｏｎｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）ポリマーのような従来のポリマーまたは従来のものではないポリマーと組み合わることができる。「裸のＤＮＡ」およびカチオン性脂質またはポリマーと縮合したＤＮＡは、典型的には化学法を使用して細胞に送達される。細胞送達のために当該技術分野では多数の化学法が知られており、そしてＤＮＡと複合させるために脂質、ポリマーまたはタンパク質を使用すること、場合によりＤＮＡを粒子に縮合すること、そして細胞に送達することを含む。他の非ウイルス化学法には、ＤＮＡを縮合するためにカチオンを使用することを含み、これは次にリポソーム中に入れられ、そして本発明に従い使用される。Ｃ．Ｈｅｎｒｙ，２００１ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ，７９（４８）：３５−４１を参照にされたい。
【００７８】
本発明のＣＴ−ＣＲＭをコードする核酸分子は、「裸のＤＮＡ」として（米国特許第５，５８０，８５９号明細書）またはブピバカインおよび他の局所麻酔薬のような免疫感作を容易にする薬剤と組成物に配合されるか（米国特許第６，１２７，１７０号明細書）のいずれかで直接細胞に導入される。
【００７９】
上記のウイルスおよび非ウイルスベクターのすべての成分は、当該技術分野で既知の材料から容易に選択することができ、そして製薬産業から入手することができる。ベクター成分および調節配列の選択は、本発明を限定するとは考えられない。本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする各核酸配列は、好ましくは哺乳動物または脊椎動物細胞中で各核酸配列の産物の複製および生成を支配する調節配列の制御下にある。用語「プロモーター／調節配列」とは、調節配列に操作可能に連結した核酸の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。好ましくはプロモーター／調節配列は細胞中でＣＴ−ＣＲＭタンパク質の発現を駆動するように、コード配列の５’末端に配置されている。場合によりプロモーター／調
節配列は組織特異的様式で機能することができる。例えばプロモーター／調節配列は、特定の組織型の細胞中でのみ発現を駆動することができる。場合によりこの配列は中心のプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列はエンハンサー配列および組織特異的様式の発現に必要な他の調節要素に含まれることもできる。
【００８０】
適当なプロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよびその他の中から容易に選択することができる。活性が非特異的であり、そして本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードする核酸分子に使用される構成的プロモーターの例には、限定するわけではないがレトロウイルスラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター（インビトロゲン）を含む。
【００８１】
外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターには、限定するわけではないがアラビノースプロモーター、亜鉛−誘導性ヤギメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン−抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン−誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９、またはＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，２：５１２−５１８も参照にされたい）、ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：２３９−２４３およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１）およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９７ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）を含む。ＣＴ−ＣＲＭの発現系で使用するために特に好適なプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターである。
【００８２】
この内容で有用となり得る他の種類の誘導性プロモーターは、特異的な生理学的状態、例えば温度または急性期または複製している細胞のみにより調節されるものである。有用な組織−特異的プロモーターには骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターより高い活性を持つ合成筋肉プロモーターを含む（。Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５を参照にされたい）。組織特異的であるプロモーターの例として、とりわけ肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６；骨シアロプロテイン、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン（ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒ
ｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５；ニューロフィラメント軽−鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５：ニューロン特異的ｎｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）が知られている。例えばこの内容に有用な既知のプロモーターに関するさらなる一覧は、国際公開第００／５５３３５号パンフレットを参照にされたい。
【００８３】
本発明の核酸配列、分子またはベクターに含むためのさらなる調節配列には、限定するわけではないが、エンハンサー配列、ポリアデニレーション配列、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列、翻訳されるべきポリペプチドのそれぞれ始めおよび終わりの転写開始および終結に関する部位、転写された領域の翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、ＩＲＥＳ要素、ゴールドバーグ−ホグネスの“ＴＡＴＡ”要素、制限酵素開裂部位、選択可能なマーカー等を含む。エンハンサー配列には、例えばＳＶ４０ＤＮＡの７２ｂｐのタンデム反復またはレトロウイルス長末端反復またはＬＴＲｓ等を含み、そして転写効率を上げるために使用する。プロモーターおよび他の共通ベクター要素の選択は通常であり、そして多くのそのような配列が利用可能であり、それらを用いて本発明に有用なヌクレオチド分子およびベクターを設計する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング．ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、（１９８９）およびそれに引用されている文献、例えば第３，１８〜３．２６頁および１６．１７〜１６．２７頁、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク（１９８９）を参照にされたい。当業者はそのような既知の調節配列の中から容易に選択して本発明の分子を調製することができる。そのような調節配列の選択は、本発明を限定するものではない。
【００８４】
Ｃ．本発明のＣＴ−ＣＲＭタンパク質およびヌクレオチド分子の作成法
抗原性組成物のアジュバントとして突然変異ＣＴ−ＣＲＭの証明された用途の観点から適当量の突然変異ＣＴ−ＣＲＭの生産が望ましい。本明細書に開示する本発明のヌクレオチド配列およびＣＴ−ＣＲＭ、ならびにヌクレオチド分子およびＣＴ−ＣＲＭタンパク質を含む組成物の調製または合成は、利用可能な材料を使用して当業者の能力内に十分にある。合成法は本発明を限定するものではない。以下の実施例で本発明のＣＴ−ＣＲＭｓをコードする配列の現在好適な合成の態様を詳細に説明する。
【００８５】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓおよびヌクレオチド分子および配列は、中でも化学的合成法、組換え遺伝子操作法、部位特異的突然変異誘発法、およびそのような方法の組み合わせにより生成することができる。例えば本発明のヌクレオチド配列／ＣＴ−ＣＲＭｓは既知の化学的合成技術、例えば中でもＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３ Ｊ．Ａｍｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４；Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ピアス化学社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード、イリノイ州（１９８４）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５；Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｕｒｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４：２７０；およびＳｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４５３９に記載されているように固相化学合成により従来通り調製することができる。また例えばタンパク質−構造および分子的特徴（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．フリーマン アンド カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨー
ク、１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．，「翻訳後タンパク質修飾：展望と将来性（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、タンパク質の翻訳後の共有的修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）の１〜１２頁、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｎｓｏｎ編集、アカデミック出版、ニューヨーク、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８−６２も参照にされたい。
【００８６】
あるいは本発明の組成物は、本明細書に提供される情報を利用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．同上）、ＣＴ−ＣＲＭタンパク質を場合により他の免疫原および任意のキャリアータンパク質とコードするヌクレオチド分子を宿主微生物内等でクローニングし、そして発現させることによるような、通例の分子生物学技術、部位特異的突然変異誘発法、遺伝子操作またはポリメラーゼ連鎖反応を使用して構築することができる。ＣＴ−ＣＲＭｓおよび任意の免疫原のコード配列は合成的に調製することができる（Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５
Ｇｅｎｅ，１６４：４９）。
【００８７】
一般に、組換えＤＮＡ技術には上記のようなＣＴ−ＣＲＭタンパク質をコードするＤＮＡ配列を合成または単離により得、そしてＤＮＡ配列をそれが好ましくはアラビノース誘導性プロモーターの存在下で発現される適切なベクター／宿主細胞発現系に導入することが関与する。ＤＮＡを発現ベクターに挿入するために記載された任意の方法を使用して、プロモーターおよび他の調節制御要素を選択した組換えベクター内の特別な部位に連結することができる。次いで適当な宿主細胞をそのようなベクターまたはプラスミドを用いて通常の技術により形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションさせる。
【００８８】
種々の宿主細胞−ベクター（プラスミド）系を使用して免疫原性突然変異コレラホロトキシンを発現することができる。好ましく含まれるベクター系であるアラビノース誘導性プロモーターは、使用する宿主細胞に適合性がある。ベクターが宿主細胞に（使用する宿主細胞−ベクター系に依存して形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより）挿入された時にＣＴ−ＣＲＭをコードするＤＮＡが宿主細胞により発現されるように、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列が発現系に挿入され、そしてプロモーター（好ましくはアラビノース誘導性プロモーター）および他の制御要素がベクター内の特別な部位に連結される。
【００８９】
ベクターは上記のようなウイルスベクターまたは非ウイルスベクターから選択することができるが、使用する宿主細胞と適合していなければならない。組換えＤＮＡベクターは、（使用するベクター／宿主細胞系に依存して）形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより適切な宿主細胞（細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞等）に導入することができる。宿主−ベクター系には限定するわけではないが、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；ウイルスで感染させた哺乳動物細胞系（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）；およびウイルスで感染させた昆虫細胞（例えばバキュロウイルス）を含む。
【００９０】
合成核酸分子を使用して本発明のＣＴ−ＣＲＭおよび他の組成物をクローニングし、そして発現させるための系には、組換え技術において周知である種々の微生物および細胞の使用を含む。宿主細胞は哺乳動物、昆虫細胞、酵母細胞を含め原核（例えば細菌）細胞および真核細胞を含む生物学上の生物から選択することができる。好ましくは本発明の種々の方法および組成物で使用する細胞は細菌細胞である。適当な細菌細胞には例えば、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種々の株である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）のような酵母細胞、およびＳｆ９およびＳｆ２１細胞のような昆虫細胞も生産目的のために有用な宿主細胞である。限定するわけではないがチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ニワトリ胚繊維芽細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＥＲ Ｃ６、ＮＳＯ、ＶＥＲＯまたはＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞ならびに他の通例および通常ではない生物および植物も適当な宿主細胞である。
【００９１】
他の適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産および精製の方法は、既知の技術を参照して当業者が行うことができる。例えば中でもＧｅｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５を参照にされたい。
【００９２】
典型的には宿主細胞は発現に十分な期間、培養条件下で維持される。培養条件は当該技術分野では周知であり、そしてイオン組成および濃度、温度、ｐＨ等を含む。典型的にはトランスフェクションした細胞は培養基で培養条件下にて維持する。種々の細胞型について適当な培地が当該技術分野で知られている。好適な態様では、温度は約２０℃から約５０℃、より好ましくは約３０℃から約４０℃、そしてさらにより好ましくは約３７℃である。
【００９３】
ｐＨは好ましくは６．０の値から約８．０の値、より好ましくは約６．８の値から約７．８の値であり、そして最も好ましくは約７．４である。容量オスモル濃度は好ましくはリットルあたり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）から約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、より好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌから約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コードされたタンパク質のトランスフェクションおよび発現に必要な他の生物学的条件は、当該技術分野では周知である。
【００９４】
組換えＣＴ−ＣＲＭタンパク質は宿主細胞またはそれらの膜から、または細胞が培養された培地のいずれかから回収または集められる。回収は組換えＣＴ−ＣＲＭタンパク質を単離し、そして精製することを含んでなる。ポリペプチドに関する単離および精製法は当該技術分野では周知であり、そして沈殿、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動等のような手法を含む。
【００９５】
通例の組換え手段により生産された時、本発明のＣＴ−ＣＲＭｓは細胞またはそれらの培地から、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティーおよびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心、分別溶解性を含む通例の方法により、あるいは精製またはタンパク質に関する他の任意の標準的技術により単離、そして精製されることができる。原核細胞からヘテロロガスなタンパク質の精製に関して幾つかの方法が存在する。米国特許第４，５１８，５２６号；同第４，５９９，１９７号；および同第４，７３４，３６２号明細書を参照にされたい。しかし生産された精製調製物は、ヒトに対して有害となり得る宿主のトキシンを実質的に含むべきではない。特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌の宿主細胞中で発現した時、精製されたペプチドまたはタンパク質にはエンドトキシン混入が実質的に排除されるべきである。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上を参照にされたい。
【００９６】
本発明の方法および組成物で使用するＣＴ−ＣＲＭｓは、本明細書に挙げる具体的に例示する方法の産物に限定されない。実際にはタンパク質は直前に引用した教科書中の方法により、あるいは本明細書を通して引用した教科書の方法により調製することができる。そのように使用するためにタンパク質組成物を単離し、そして組換え的または合成的に生産することは当業者の技術範囲内である。
【００９７】
単一アミノ酸置換をもつ２つ、単一アミノ酸挿入を持つ１つ、および二重アミノ酸置換を持つ２つの表１に掲げた５個の例示的ＣＴ−ＣＲＭｓは、上記の方法の幾つかを使用して実施例１に詳細に記載したように生成した。具体的には１組の突然変異ＣＴクローン（ＣＴ−ＣＲＭｓ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で、既知のＣＴホロトキシン分子をコードするプラスミドについて標準的な部位特異的突然変異誘発プロトコールにより生成した。精製されたＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈホロトキシンが生じる収量は、１リットルの培養基あたり約５０μｇであったことが事前に示されていた（国際公開第００／１８４３４号パンフレットを参照にされたい）。元のプラスミドに対する修飾を介してＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈの収量を上げる最初の試みは効果がほとんど無いか、または無いことが示された。プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈおよび誘導体とコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＤｓｂＡおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ＲｐｏＨの同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を通して、収量に穏やかな上昇が達成された。同時発現および精製の修飾によりＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈの収量は約２ｍｇ／リットルに増加した。
【００９８】
本発明のＣＴ−ＣＲＭｓの発現を上昇させるために、プラスミド中のラクトース誘導性プロモーターをアラビノース誘導性プロモーター（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に置き換え、これをＣＴ−ＣＲＭｓをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結した。クローニング中、プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）２１２５株に由来するＣＴサブユニットＢをコードするｃｔｘＢ遺伝子に連結されたコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）５６９Ｂ株に由来するＣＴサブユニットＡをコードするｃｔｘＡ遺伝子を含むことが決定された。これらの遺伝子の交差整列により、２つのｃｔｘＢ遺伝子間の７塩基置換およびｃｔｘＡ遺伝子間の１塩基変化が示された。これらの塩基置換の幾つかが成熟サブユニットにアミノ酸の変化を導いた。中でも特に注目されるのは、Ａ−２部分内にアミノ酸変化を、またはＡサブユニットのホロトキシン集成ドメインを導くｃｔｘ遺伝子間の置換である。これら遺伝子間の異質性がトキシンの発現またはホロトキシンの集成に負の影響を及ぼすかどうかは知られていなかった。しかし進化的な観点から、両トキシンのサブユニット遺伝子が同じ起源に由来することは好ましいと考えられた。そのまま両ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子を、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）５６９Ｂ株に由来するアラビノース誘導系の構築物に使用した。プラスミドｐＬＰ９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０の構造は実施例１に示す。免疫原性突然変異コレラホロトキシンは、宿主細胞を上記のプラスミドで形質転換、感染、形質導入またはトランスフェクションし、そして宿主細胞を該組換え免疫原性解毒タンパク質が宿主細胞により発現できる条件下で培養することにより生産される。ｐＬＰ９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０からＣＴ−ＣＲＭｓの収量は、それぞれ１リットルのカルチャーあたり７．６、５．６、７．９、２７．４および１．９ｍｇの精製物質である。
【００９９】
生成したＣＴ−ＣＲＭタンパク質または核酸分子は、以下の実施例に記載するように任意の数の選択された抗原と一緒に免疫原性組成物に配合され、そしてインビボアッセイによりアジュバント効力についてスクリーニングする。
【０１００】
Ｄ．免疫原性組成物
本発明の効果的な免疫原性組成物は、本発明の突然変異コレラホロトキシンを含んでなるものである。好ましくは突然変異コレラホロトキシンＣＴ−ＣＲＭは、野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する。「低減した毒性」により、各突然変異体は有意な副作用、特に野生型ＣＴに付随ことが知られている副作用、例えば下痢を引き起こすことなく免疫原性組成物中にアジュバントとして使用できる。より好ましくは本発明の免疫原性組成物中のＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸２５位に単一アミノ酸置換（アルギニンからトリプトファンまたはアルギニンからグリシン）を有する（ＣＴ−ＣＲ
ＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）。別の好適な態様では、ＣＴ−ＣＲＭはＡサブユニットのアミノ酸４８位のアミノ酸残基トレオニンに隣接するアミノ酸４９位にヒスチジンの単一アミノ酸挿入を有する（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ）。第３の好適な態様は、Ａサブユニットのアミノ酸３４位のアミノ酸残基グリシンに隣接したアミノ酸３５位および３６位にアミノ酸残基グリシンおよびプロリンの二重アミノ酸挿入を有するＣＴ−ＣＲＭである（ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ）。第４の例であるＣＴ−ＣＲＭは、Ａサブユニットのアミノ酸３０位に単一アミノ酸置換（チロシンからトリプトファンへ）、およびアミノ酸３０位のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸３１位および３２位にアミノ酸残基アラニンおよびヒスチジンの二重アミノ酸挿入を有する（ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）。１つの態様では、ＣＴ−ＣＲＭは上記の１以上のさらなる修飾を有してもよい。別の態様では、組成物は選択された抗原および適当な有効なアジュバント量のＣＴ−ＣＲＭを含んでなり、ここで該ホロトキシンは該抗原に対する脊椎動物の免疫応答を有意に強化する。本発明の組成物は、上記のような選択された抗原を含んでなる組成物の投与に対して、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞性免疫応答を改善することにより免疫応答をモジュレートする。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「有効なアジュバント量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）」とは、脊椎動物宿主に上昇した免疫応答を誘導するために効果的である本発明の１つのＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の用量を意味する。より具体的な定義では、用語「有効なアジュバント量」とは本明細書に記載する５種のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の１つ（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）の、脊椎動物宿主に上昇した免疫応答を誘導するために効果的である用量を意味する。具体的には本明細書に開示するＣＴ−ＣＲＭｓは、異なる抗原の鼻内投与後に粘膜および全身性免疫応答を増す。さらに事前に存在する抗−ＣＴ免疫応答の存在下でも、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは効率的な粘膜アジュバントとして役立つことができた。本発明の免疫原性突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓは、生じた突然変異ＣＴタンパク質がアジュバントとして機能し、同時にそれが導入された脊椎動物宿主により安全に免疫寛容となるように、低減した毒性および保持されたアジュバント性のバランスを現す。特に「有効なアジュバント投薬用量または量」は、宿主の年齢、体重および医学的状態ならびに投与法に依存する。適当な用量は当業者により容易に決定される。
【０１０２】
アジュバントとして本発明の突然変異コレラホロトキシンを含む免疫原性組成物は、広い種々の抗原の中から選択される少なくとも１つの抗原も含む。抗原（１つまたは複数）は、全細胞もしくはウイルス、または１以上のサッカライド、タンパク質サブユニット、ポリペプチド、ペプチドもしくは断片、ポリ−もしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分を含んでなることができる。所望により抗原性組成物は同じかまたは異なる病原性微生物に由来する１より多くの抗原を含んでもよい。
【０１０３】
このように１つの態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性細菌に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む望ましい細菌性の免疫原性組成物には限定するわけではないが、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（型を決定できる、またはできない両方）、ヘモフィルス ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｍｕｓ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ）、トラコーマ クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア シッタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アロイオコッカス オチジティス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ ｏｔｉｄｉｔｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ）−マイコバクテリウム イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）コンプレックス、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｌｉｓ）、プロテウス ベルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プレウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅａｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ ガリスセプチム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｕｍ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０４】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性ウイルスに由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む望ましいウイルス免疫原性組成物には、限定するわけではないがＲＳウイルス、パラインフルエルザウイルス１〜３型、ヒト メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト パピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンバーウイルス、牛疫ウイルス、鳥気管支ウイルス（正式には七面鳥鼻気管支ウイルス）、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管支ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、鳥感染性ファブリキウス病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック（Ｍａｒｅｋ’ｓ）病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスにより引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０５】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性真菌に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む真菌病原体に対して望ましいス免疫原性組成物には、限定するわけではないがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０６】
さらに別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として病原性寄生生物
に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含んでなる。アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む寄生生物に対して望ましい免疫原性組成物には、限定するわけではないがリューシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ ゴンジー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｃｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）により引き起こされる疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置を対象とするものを含む。
【０１０７】
アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）を含む、非−感染性疾患に対する望ましい免疫原性組成物も本発明の範囲内である。そのような免疫原性組成物には、脊椎動物抗原に対するものを含み、特に限定するわけではないがアレルギー、自己免疫疾患、アルツハイマー病およびガンのような疾患（１つまたは複数）の防止および／または処置に関する抗原に対する組成物を含む。
【０１０８】
例えば本発明の免疫原性組成物は、ガン細胞または腫瘍細胞に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含むことができる。本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含む、脊椎動物において治療用または予防用の抗−ガン効果を誘導する望ましい免疫原性組成物は、限定するわけではないが前立腺特異的抗原、癌−胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、ホルモンおよびホルモン同族体等を含めガン抗原または腫瘍に関連する抗原を利用するものを含む。
【０１０９】
本発明の他の免疫原性組成物は、脊椎動物宿主のアレルゲンに対する応答をモジュレートするために望ましい、そのような組成物は本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）およびアレルゲンまたはそれらの断片に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含む。そのようなアレルゲンの例は、米国特許第５，８３０，８７７号明細書および国際公開第９９／５１２５９号パンフレットに記載され、これは引用により本明細書に編入し、そして花粉、昆虫の毒、動物の鱗屑、菌類の胞子および薬剤（ペニシリンのような）を含む。免疫原性組成物はアレルゲンに対するアレルギー応答をモジュレートするように、アレルギー反応の原因として知られているＩｇＥ抗体の生産を妨害する。
【０１１０】
さらに別の態様では、本発明の免疫原性組成物は選択される抗原として抗原の分子部分に由来するポリペプチド、ペプチドまたは断片を含み、これらは脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とするような疾患を防止または処置するように、アミロイド前駆体タンパク質に由来するもののような望ましくない様式、量または場所で宿主により生産されるもの（または自己分子）を表す。本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含む、脊椎動物宿主中で自己分子に対する応答をモジュレートするために望ましい組成物は、自己分子またはそれらの断片を含むものを含む。そのような自己分子の例には、糖尿病に関与するβ−鎖インスリン、胃食道反射疾患に関与するＧ１７分子および多発性硬化症、狼瘡および慢性関節リウマチのような疾患において自己免疫応答をダウンレギュレーションする作用物質を含む。
【０１１１】
本発明のさらに他の免疫原性組成物は、脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とする疾患を防止または処置するために望ましい。そのような組成物は本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体（１つまたは複数）ならびにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の部分を含む。この疾患はアルツハイマー病、アミロイドーシスまたはアミロイド発生（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）疾患のように様々に言われている。β−アミロイド前駆体タンパク質（Ａβペプチドとも呼ばれる）は、ＡＰＰの４２アミノ酸断片であり、これはβおよびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰのプロセッシングにより生成し、そして以下の配列を有する
：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＡｌａＩｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ（配列番号３）。患者の中にはアミロイド沈着が凝集したＡβペプチドの形態を取るものもある。驚くべきことには今、単離されたＡβペプチドの投与が脊椎動物のアミロイド沈着のＡβペプチド成分に対して免疫応答を誘導することが見いだされた（国際公開第９９／２７９４４号パンフレット）。すなわち本発明の態様は、本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体に加えてＡβペプチド、ならびにＡβペプチドの断片およびＡβペプチドに対する抗体またはそれらの断片を含む。１つのそのようなＡβペプチドの断片は、以下の配列を有する２８アミノ酸ペプチドである（米国特許第４，６６６，８２９号明細書：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ（配列番号４）。
【０１１２】
そのような免疫原性組成物は、滅菌水または滅菌等張性塩溶液のような免疫学的に許容され得る希釈剤または製薬学的に許容され得る担体をさらに含んでなる。抗原性組成物はそのような希釈剤または担体と通例の様式で混合される。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」とは、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合性がある任意かつすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗菌・カビ剤、等張性かつ吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は当業者には明白であり、そしてほとんど投与経路に依存するだろう。
【０１１３】
免疫原性組成物は限定するわけではないが懸濁液、溶液、油性または水性賦形剤中の乳液、ペーストおよび移植可能な徐放性または生分解性製剤を含んでもよい。そのような製剤は、限定するわけではないが沈殿防止剤、安定化剤または分散剤を含む１以上のさらなる材料をさらに含んでなる。非経口投与用の製剤の１態様では、再構成する組成物を非経口的に投与する前に、有効成分を適当な賦形剤（例えば滅菌されたパイロジェンを含まない水）で再構成するように、乾燥（すなわち粉末または粒状）形態で提供する。有用な他の非経口的に投与可能な製剤には、有効成分を微晶質状で、リポソーム調製物で、または生分解ポリマー系として含んでなるものを含む。徐放性または移植用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、溶解しにくいポリマーまたは溶解しにくい塩のような製薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含んでもよい。
【０１１４】
本発明のタンパク質免疫原性組成物中に存在できるさらに加える成分は、ＣＴ−ＣＲＭｓに加えてアジュバント、保存剤、化学的安定化剤または他の抗原性タンパク質である。典型的には安定化剤、アジュバントおよび保存剤は至適化されて、標的とするヒトまたは動物における効力に最高の配合を決定する。適当な例示的保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。使用できる適当な安定化材料には、例えばカザミノ酸、シュクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物および乾燥ミルクを含む。
【０１１５】
本発明の抗原性組成物は、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓに加えてさらなるアジュバントを含んでなることができる。免疫応答を強化するために使用する通例の非−ＣＴ−ＣＲＭアジュバントには、限定するわけではないが引用により本明細書に編入する米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；コリキサ（Ｃｏｒｉｘａ）、ハミルトン、モンタナ州）を含む。またアジ
ュバントとしての使用に適するのは、コリキサ（ハミルトン、モンタナ州）から入手可能であり、そして引用により本明細書に編入する米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記載されている合成脂質Ａ同族体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体または同族体である。そのようなＡＧＰの１つは５２９（正式にはＲＣ５２９として知られている）として知られている２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは水性状態または安定な乳液として配合される。
【０１１６】
さらに他の非−ＣＴ−ＣＲＭアジュバントには鉱物油および水乳液、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｉｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミル ジペプチド、殺されたボルデテーラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、引用により本明細書に編入する米国特許第５，０５７，５４０号明細書に記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、フラミンガンム、マサチューセッツ州）のようなサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成される粒子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（引用により本明細書に編入する米国特許第６，２０７，６４６号明細書）、百日咳トキシン（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む；例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９３／１３３０２号および同第９２／１９２６５号パンフレットを参照にされたい。
【０１１７】
種々のサイトカインおよびリンホカインも本発明の免疫原性組成物に含めるのに適当である。１つのそのようなサイトカインは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、これは引用により本明細書に編入する米国特許第５，０７８，９９６号明細書に記載されているヌクレオチド配列を有する。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含むプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、そして２０１１０−２２０９ バージニア州、マナッサス、１０８０１ ブルヴァール大学のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号３９９００で寄託した。サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は引用により本明細書に編入する米国特許第５，７２３，１２７号明細書に記載さている別のアジュバントである（ジェネティック インスティテュート社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州から入手可能である）。免疫モジュレーティング活性を有することが示された他のサイトカインまたはリンホカインには限定するわけではないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子αおよびβを含み、そしてアジュバントとしての使用に適する。
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物のさらに他の適当な任意の成分には限定するわけではないが：表面活性物質（例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド）、メトシキヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシ、ツフツシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル、例えばリン酸アルミニウム等、および免疫刺激複合体を含む。ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原は、免疫原性組成物に使用するためにリポソームに包含されるか、または多糖、リポ多糖および／または他のポリマーに結合してもよい。
【０１１９】
本発明のＣＴ−ＲＣＭ突然変異体（１つまたは複数）または所望するＣＴ−ＲＣＭをコードするＤＮＡ配列および分子を含む本発明の免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド組成物（ＤＮＡ免疫原性組成物としても知られている）としても有用であり、あるいは選択した抗原をコードするポリヌクレオチドと投与される。例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型の完全長の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと一緒にコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の製剤を皮内経路で投与されたＤＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＨＳＶ ｇＤ２のみをコードするプラスミドＤＮＡを皮内経路で受容したマウスよりも高い平均細胞性応答を生じた。さらにプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物をＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと一緒に受容したマウスに関する平均血清抗体力価は、アジュバント無しでプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物を受容したマウスに見られる力価とほぼ同じであった。同様に、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈをアジュバントとして加えたプラスミドＤＮＡ
ＨＳＶ ｇＤ２組成物も、アジュバントを加えない組成物を皮内または筋肉内経路で送達した後に見られるレベルに匹敵するレベルで膣洗浄サンプルにｇＤ２−特異的抗体応答を生じた。ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨまたはＣＴをアジュバントとして加え、そして皮内経路で送達したプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ ｇＤ２組成物で免疫感作したマウスも、アジュバント無しでプラスミドＤＮＡ ＨＳＶ−ｇＤ２組成物を受容したマウスよりも実質的に高レベルのガンマインターフェロンおよびＩＬ−５を生成した。このようにＣＴ−ＣＲＭｓはＨＳＶに対するプラスミドＤＮＡ組成物を投与した時、増殖的およびガンマインターフェロン応答を強化する。
【０１２０】
上記のような担体に加えて、ポリヌクレオチド分子からなる免疫原性組成物は望ましくは、場合により局所麻酔薬、ペプチド、カチオン性脂質を含む脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリシンのようなポリカチオン、デンドリマーのような分枝した、３次元ポリカチオン、炭水化物、カチオン性両親媒性化合物、界面活性剤、ベンジルアンモニウム表面活性剤または細胞にポリヌクレオチドの輸送を促進する化合物のような任意のポリヌクレオチド促進剤または「共剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）」を含む。そのような促進剤にはブピビカイン（引用により本明細書に編入する米国特許第５，５９３，９７２号明細書を参照にされたい）を含む。本発明に有用なそのような促進剤または共剤の他の排他的ではない例は、各々が引用により本明細書に編入される米国特許第５，７０３，０５５号；同第５，７３９，１１１号；同第５，８３７，５３３号明細書；１９９６年４月４日に公開された国際公開第９６／１００３８号パンフレット；および１９９４年８月８日に公開された国際公開第９４／１６７３７号パンフレットに記載されている。
【０１２１】
より好ましくは、局所麻酔薬は核酸分子と１以上の複合体を形成する量で存在する。局所麻酔薬は本発明の核酸分子またはプラスミドと混合される時、ＤＮＡを包む小さい種々の複合体または粒子を形成し、そして均一である。すなわち本発明の免疫原性組成物の１態様では、複合体は局所麻酔薬と本発明の少なくとも１つのプラスミドを混合することより形成される。この混合物から生じる任意の単一複合体は、異なるプラスミドの様々な組み合わせを含むことができる。あるいは本発明の組成物の別の態様では、すべてのプラスミドが単一のボーラス投与で投与される場合、局所麻酔薬は個々のプラスミドと別個に混合され、そして別個の混合物を単一の組成物に合わせて、単一の免疫原性組成物中に所望の比率でプラスミドが存在する事を確実にすることができる。あるいは局所麻酔薬および各プラスミドを別個に混合し、そして別個に投与して所望の比率を得ることができる。ここで今後、用語「複合体」または「１以上の複合体」または「複合体（複数）」は、免疫原性組成物のこの態様を定めるために使用し、この用語は１以上の複合体とＣＴ−ＣＲＭをコードするプラスミドおよび抗原をコードするプラスミドの混合物、または別個に形成された複合体の混合物を含む各複合体を包含し、ここで各複合体は唯一の種類のプラスミド、または複合体の１つまたは混合物を含み、ここで各複合体はポリシスストロン性ＤＮＡを含む。好ましくは、複合体は直径が約５０〜約１５０ｎｍである。使用する促進剤が
局所麻酔薬、好ましくはプピバカインである時、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づき約０．１重量％から約１．０重量％の量が好ましい。例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９９／２１５９１号パンフレットも参照にされたい、そしてこれは好ましくは、約０．００１〜０．０３重量％の間の量で投与される、共剤としてベンジルアンモニウム表面活性剤の包含を教示する。本発明に従い、局所麻酔薬の量は該核酸分子に対する比率で０．０１〜２．５重量／容量％の局所麻酔薬対１〜１０μｇ／ｍｌの核酸で存在する。別のそのような範囲は、０．０５〜１．２５重量／容量％の局所麻酔薬対１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｌ／ｍｌの核酸である。
【０１２２】
使用する時、そのようなポリヌクレオチド免疫原性組成物はＣＴ−ＣＲＭおよび抗原を一過性の基準にてインビボで発現し；遺伝材料は宿主の染色体に挿入または組み込まれない。この使用は、目標が目的の遺伝材料を染色体に挿入または組み込むことである遺伝子療法とは区別される。免疫感作により投与されたポリヌクレオチドが宿主の表現型を形質転換しないことを確認するためのアッセイを使用する（米国特許第６，１６８，９１８号明細書）。
【０１２３】
免疫原性組成物は組成物の選択した投与様式に適する他の添加剤を含んでもよい。本発明の組成物は凍結乾燥したポリヌクレオチドを含んでもよく、これは粉末、液体または懸濁液の剤形を開発するために他の製薬学的に許容される賦形剤と使用することができる。例えばレミングトン：製剤学の科学および実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２巻、第１９版、（１９９５）、例えば第９５章エーロゾル；および国際公開第９９／４５９６６号パンフレットを参照にされたい（これらの教示は引用により本明細書に編入する）。これら組成物の投与経路は所望により組み合わせられ、または適合され得る。
【０１２４】
これらの核酸分子を含む免疫原性組成物は、任意の通例の投与経路を介して投与するために適する添加剤を含むことができる。幾つかの好適な態様では、本発明の免疫原性組成物は例えば液体、粉末、エーロゾル、錠剤、カプセル、腸のコート錠剤またはカプセルまたは座薬の形態でヒト個体に投与するために調製される。
【０１２５】
本発明の免疫原性組成物は（タンパク質を含むか、または核酸分子を含むいずれの組成物でも）、上記のように、通例の生理学的に許容され得る担体、アジュバントまたは上記の種類の製薬学的調製物に有用な他の材料の選択により限定されることはない。上記の成分から、適当なｐＨ、等張性、安定性および他の通常の特性を有するこれらの製薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技術範囲内である。
【０１２６】
Ｅ．本発明の組成物の使用法
ＣＴ−ＣＲＭ単独またはＣＴ−ＣＲＭの組み合わせおよび選択した抗原を含んでなる本発明の免疫原性組成物は、種々の経路によりヒトまたは非−ヒト脊椎動物に投与して抗原、好ましくは上記に確認される疾患を引き起こす抗原に対する免疫応答を強化する。本発明の組成物は、上記の選択した抗原、および有効なアジュバント量の突然変異ＣＴ−ＣＲＭを含んでなる組成物の投与後に、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞性免疫を改善することにより免疫応答をモジュレートし、ここで突然変異ＣＴ−ＣＲＭは野生型ＣＴに比べて実質的に低減した毒性を有し、そしてここで低減した毒性は単一アミノ酸置換、単一アミノ酸挿入、二重アミノ酸挿入または単一アミノ酸置換および二重アミノ酸挿入の結果である。
【０１２７】
１つの態様では、ＣＴ−ＣＲＭ（タンパク質として、または核酸分子によりコードされるものとして）を含む免疫原性組成物は、選択した抗原（タンパク質または核酸のいずれかとして）を含んでなる組成物の投与前に投与される。別の態様では、免疫原性組成物は
抗原およびＣＴ−ＣＲＭの両方を含む組成物で、あるいは抗原を含有する組成物とは別の組成物として投与されるいずれの場合であっても、免疫原性組成物は抗原と同時に投与される。さらなる態様では、ＣＴ−ＣＲＭを含む組成物は抗原を含む組成物の後に投与される。抗原および突然変異ＣＴ−ＣＲＭが同時に投与されることが必要ではないが好ましい。
【０１２８】
ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物は、上記のようにタンパク質またはタンパク質をコードする核酸分子として投与することができる。ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物は、タンパク質として投与される選択した抗原と組み合わせてタンパク質として投与することができる。あるいは上記のように、タンパク質としてＣＴ−ＣＲＭ免疫原性組成物は上記のような抗原をコードする核酸分子と投与することができる。さらに別の代案には、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の両方をこれらのタンパク質をコードする核酸配列として投与することを含む。
【０１２９】
ＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物を投与するために、任意の適当な投与経路を採用することができる。この経路はＣＴ−ＣＲＭおよび抗原が別の組成物または異なる形態で、例えばタンパク質または核酸で投与されるならば、選択した抗原を含む組成物を投与するために選択した経路と同じでも異なってもよい。適当な投与経路は限定するわけではないが、鼻内、経口、膣、直腸、非経口、皮内、経皮（例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照にされたい）、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含む。適当な経路は使用する免疫原性組成物の性質、および患者の年齢、体重、性別および一般的な健康状態の評価、および免疫原性組成物中に存在する抗原、および担当医師による類似因子に依存して選択される。
【０１３０】
一般に本発明の免疫原性組成物（１つまたは複数）のＣＴ−ＣＲＭおよび／または抗原成分に関する適切な「有効量」または投薬用量の選択も、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原のタンパク質または核酸状態、使用する免疫原性組成物（１つまたは複数）中の抗原の同一性、ならびに患者の身体的状態、最も特別には免疫感作する個体の一般的な健康状態、年齢および体重にも基づくだろう。免疫原性組成物の投与法および経路ならびにその中のさらなる成分の存在も、ＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の投薬用量および量に影響し得る。有効用量のそのような選択および上方または下方調整は、当業者の技術範囲内である。免疫応答、好ましくは防御応答を誘導する、または有意に悪い副作用無しで患者に外因的効果を生成するために必要なＣＴ−ＣＲＭおよび抗原の量は、これらの因子に依存して変動する。適当な用量は当業者に容易に決定される。
【０１３１】
例として１つの態様では、タンパク質成分、例えば上記のＣＴ−ＣＲＭ変異体タンパク質および／または抗原を含む組成物について、各用量は約１μｇから約２０ｍｇの間のタンパク質／ｍＬ（滅菌溶液）を含んでなることができる。他の投薬用量範囲も、当業者により企図され得る。最初の用量は任意でよく、続いて所望により追加免疫を繰り返すことができる。
【０１３２】
別の例では、ＤＮＡおよびベクター組成物中のヌクレオチド分子の量は当業者により選択され、そして調整され得る。１つの態様では、各用量は１ｍＬの滅菌溶液あたり約５０μｇから約１ｍｇの間のＣＴ−ＣＲＭをコードするまたは抗原をコードする核酸、例えばＤＮＡプラスミドを含んでなる。
【０１３３】
組成物に関する用量および投薬処方の回数も当業者により容易に決定され得る。防御はＣＴ−ＣＲＭを含む免疫原性組成物の単回投与により付与されるかもしれないし、または防御を維持するために後の追加免疫に加えて選択した抗原を含むか、含まずに数回の投与が必要かもしれない。場合によっては突然変異ＣＴ−ＣＲＭのアジュバント特性により必
要とされる抗原を含む投与の数を減らすことができ、あるいは投薬処方のタイムコースを減らすことができる。免疫のレベルを監視して必要ならば追加免疫の必要性を決定することができる。
【０１３４】
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を説明する。実施例は具体的説明の目的のみであり、本発明を限定するとは解釈されない。
【０１３５】
本明細書に引用するすべての技術文献は、引用により本明細書に編入する。
【実施例１】
【０１３６】
ＣＴ突然変異体の発現
Ａ．細菌株、プラスミドおよび成長条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アーリントンハイツ、イリノイ州）、ＴＸ１（ＦＴｃ、ＸＬ１ブルーに由来するｌａｃ１ｑを持つＴＧ１のナリジキシン酸耐性誘導体）（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）、ＴＥ１（ＴＧ１ ｅｎｄＡ、ＦＴｃ、ｌａｃ１ｑ）およびＣＪ２３６（ＦＴｃ、ｌａｃ１ｑ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ヘラクレス、カリフォルニア州）を組換えプラスミドをクローニングし、そして変異体タンパク質を発現させるための宿主として使用した。プラスミドを含む株は必要に応じて抗生物質（アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ；カナマイシン ２５μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン １０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で維持した。
【０１３７】
Ｂ．ｃｔｘＡ遺伝子の突然変異誘発
１本鎖のウラシル含有鋳型（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，１９９２ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：４９１５−２４）を使用した部位特異的突然変異誘発は、ｐＳＫＩＩ中の自然なＣＴオペロンのクローンであるプラスミドｐＭＧＪ６７（ストラタジーン）に作成されたオリゴヌクレオチド−誘導突然変異体を選択するために使用した。簡単に説明すると、各オリゴヌクレオチドをリン酸化し、そしてｄｕｔ ｕｎｇＣＪ２３６（ＦＴｃ、ｐＭＧＪ６７）からレスキューした（ｒｅｓｕｃｕｅｄ）１本鎖ＤＮＡ鋳型について第２鎖合成を支配するために使用した。連結およびｕｎｇ＋株ＴＸ１の形質転換後、１本鎖ＤＮＡをＡｐＲ形質転換体からレスキューし、そしてジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２）。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発法（ストラタジーン）を使用して、幾つかの突然変異をｐＡＲＣＴ２に直接導入した。ｐＡＲＣＴ２は、ＬＴＩＩｂＢ遺伝子に由来するシグナル配列を含むｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子を含むオペロンを発現するｐＡＲ３（国際公開第９８／２０７３４号パンフレット）に由来するアラビノース−誘導性クローンであり、そして各遺伝子はｐＴ７−１の誘導体であるベクタープラスミドｐＴ７−７からＴ７遺伝子１０に由来する開始配列を翻訳するために独立して使用する。
【０１３８】
Ｃ．１および２コドン挿入突然変異体
単一コドン挿入は、ｐＭＧＪ６４（ｐＭＧＪ６７の誘導体）を部分消化し、続いて３−塩基粘着末端のフィル−インおよび自己連結によりＤｄｅＩ制限部位に作成した。２コドンＴＡＢ−リンカー挿入突然変異体は、６塩基対ＡｐａＩリンカー（ＧＧＧＣＣＣ）をＴＡＢマニュアル（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に記載されているようにｐＭＧＪ６４のＲｓａＩ部分消化の末端に付加することにより作成した。形質転換体を単一ＤｄｅＩまたはＲｓａＩ部位のいずれかの損失（および新たなＡｐａＩ部位の存在）について調査し、そしてＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１３９】
Ｄ．アラビノース促進化ＣＴ−ＣＲＭ発現ベクターの構築
ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ（国際公開第００／１８４３４号パンフレット）での事前の実験では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での最大生産が合成のｃｔｘＡ遺伝子の上流の合成シャイン−ダルガルノ配列を置換し、そしてアラビノースプロモーター系の制御下にオペロンを配置することにより達成されたことが示された。Ａサブユニットに部位特異的突然変異を含むＣＴオペロンは、すでに記載されたように作成した（同上）。ＣＴ−ＣＲＭｓは、元はβ−ガラトクシダーゼプロモーターの制御下にあり、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現レべルは低かった。ＰＣＲを使用してＣＴ−ＡサブユニットのＡＴＧの５’領域を修飾し、そして５’末端のＮｈｅＩ部位に挿入した。対応する３’プライマーをＣＴ−Ｂ遺伝子の３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に加えた。使用したプライマーは
【０１４０】
【化１】
【０１４１】
であった。
【０１４２】
ＰＣＲを各突然変異体ＣＴ−ＣＲＭオペロンについて行い、そしてＰＣＲ産物を製造元の指示に従いｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（インビトロゲン）に連結し、そしてＴｏｐ１０Ｆ’細胞に形質転換した。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ寒天上にまいた。白色コロニーからのプラスミドを、ＥｃｏＲＩでの消化により挿入物について調査した。正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを製造元の指示に従いＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＣＴオペロンを含むＤＮＡ段片を低融点アガロースから単離した。プラスミドｐＢＡＤ１８−Ｃｍ（インビトロゲン）をＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして直線状ＤＮＡを低融点アガロースから単離した。消化したｐＢＡＤ１８およびＣＴオペロンは１２℃で連結し、そしてＴｏｐ１０Ｆ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。クロラムフェニコール−耐性コロニーに由来するプラスミドを制限分析により挿入物について調査し、そして代表的コロニーを配列決定して部位特異的突然変異の存在を確認した。プラスミドはＣＴ−ＣＲＭｓを発現させるためにＤＨ５α中で形質転換した。
【０１４３】
Ｅ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＣＴ−ＣＲＭｓの発現
プラスミドｐＬＰ９９１１、ｐＬＰ９１５、ｐＬＰ９０７、ｐＬＰ９０９およびｐＬＰ９１０を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞、ＣＴ−ＣＲＭｓをそれぞれ発現する細胞を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）およびグリセロール（０．５％）を含むリン酸緩衝化Ｈｙ−Ｓｏｙ培地で、３７℃にて通気しながら成長させた。カルチャーが約４．５−５．５のＯＤ６００に達した時、それらは最終濃度０．５％までＬ−アラビノースを加えることにより誘導した。カルチャーは誘導後、３７℃で通気しながら３時間インキューベーションし、そして次いで細胞を遠心により集めた。細胞ペレットを−２０℃に保存した。
【０１４４】
Ｆ．ＣＴ−ＣＲＭｓの調製および精製
細胞ペレットを室温で解凍し、そして１０ｍＭ ＮａＰＯ４および１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に元の９％のカルチャー容量で再懸濁した。細胞懸濁液はミクロ流動化装置を使用して機械的に破壊し、そして１０分間、８，５００ｘｇで遠心した。細胞溶解物はさらに１６０，０００ｘｇで１時間遠心することにより清澄化した。清澄化した細胞溶解物は、１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したカルボキシメチル（ＣＭ）−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（１０リットルのカルチャーあたり３００ｍｌのＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））（アマーシャム−ファルマシア）に、２ｍｌ／分の流速で乗せた。カラムを＞１０容量の１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）を用いて５ｍｌ／分
の流速で洗浄した。ＣＴ−ＣＲＭｓＥ２９Ｈホロトキシンは４カラム容量の１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ８．３）で溶出した。精製したＣＴ−ＣＲＭｓはＰＢＳ中での透析によりバッファー交換し、そして４℃で保存した。完全なホロトキシンおよび各サブユニットの存在は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥでそれぞれ決定した。未変性ＰＡＧＥは完全なコレラホロトキシンの分子量と予想される精製された８６ｋＤａ分子（データは示さず）の存在を示した（Ｔｅｂｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｖａｃｃｉｎｅ，１８（２４）：２７２３−２７３４）。加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは完全なホロトキシンを構成するＣＴ−Ａ（２７ｋＤａ）およびＣＴ−Ｂ（１２ｋＤａ）サブユニットに並んだ２つのバンドを示した（データは示さず）。
【実施例２】
【０１４５】
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
突然変異ＣＴ−ＣＲＭＳ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨは、未変性ｐａｇｅ電気泳動により分析して完全なホロトキシンとして精製後に存在するＣＴ−ＣＲＭｓの割合を決定した。精製したＣＴ−ＣＲＭｓ、各１５μｌ（種々のタンパク質濃度）を６％の重合化未変性ポリアクリルアミドゲに流した。３種の濃度（３００、６００および１２００ｎｇ）のＣＴ−Ｂを標準として使用した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。次にゲルはデンシトメーターを使用してスキャンし、そしてホロトキシンの割合をＣＴ−ＣＲＭｓおよびＣＴ−Ｂ標準のデンシトメーターの読み取りから算出した。データは９５％のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、９１．２０％のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、９１．００％のＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、９８．８％のＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよび９０．９３％のＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨが完全なホロトキシンとして存在することを示した（表２）。
【０１４６】
【表２】
【実施例３】
【０１４７】
ＣＴ−ＣＲＭＳの残存毒性に関するＹ−１副腎細胞アッセイ
コレラトキシン／熱不安定性エンテロトキシンファミリーにおけるエンテロトキシンの毒性を測定するために、インビトロで使用されているマウスＹ−１副腎腫瘍細胞アッセイで、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを野生型ＣＴと毒性について比較した。このアッセイはトキシンが細胞表面受容体へ結合し、そして続いてトキシンのＡ１サブユニットが細胞の細胞質に入ることに依存している。
【０１４８】
コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）から単離された自然なコレラトキシンを、Ａ１−Ａ２連結部にタンパク質溶解的にニックを入れ、ジスルフィド結合のみで一緒に保持されているＡ１およびＡ２サブユニットを生じる。これによりＡ１およびＡ２サブユニットを不
安定にし、そして互いに容易に解離できるようにする。ニックを入れたＣＴのＡ１サブユニットは、細胞表面受容体への結合でＡ２サブユニットから解離し、そして細胞に入り、ここでそれは調節Ｇ−タンパク質（Ｇｓα）をＡＤＰ−リボシル化し、上記のようにその毒性効果を導く。対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産されたエンテロトキシン（ＣＴまたはＬＴのいずれか）はニックを入れず、したがって未だ連結しているＡ１−Ａ２ペプチドを有する。結果として、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）で生産されたＣＴは、Ｙ−１副腎細胞アッセイで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなヘテロロガスな細菌で生産されたＣＴよりも有意に毒性である。
【０１４９】
第１のＹ−１副腎細胞アッセイでは、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓをコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）に由来するニックを入れた野生型ＣＴと毒性について比較した。このアッセイでは、Ｙ−１副腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７９）を９６−ウェルの平らなプレートにウェルあたり１０４細胞の濃度でまいた。その後、精製（クーマシーブルー染色により決定された〜９０％純度）したＣＴ−ＣＲＭｓの３倍の連続希釈物を腫瘍細胞に加え、そして３７℃（５％ＣＯ２）で１８時間、インキューベーションした。次いで細胞を光学顕微鏡により毒性の存在（細胞のラウンディング：ｒｏｕｎｄｉｎｇ）について調査した。終点力価は５０％より多い細胞ラウンディングを与えるために必要なトキシンの最少濃度と定めた。残存毒性の割合は、ＣＴ−ＣＲＭｓにより誘導される力価で除算し、１００を掛けたコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）に由来する野生型のニックを入れたＣＴの終点力価（１００％毒性）を使用して算出した。表３に示すデータは、Ｙ−１副腎細胞アッセイを使用して試験した５個の精製された突然変異体ホロトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＳＨの残存毒性が、実質的に低減したことを示す。
【０１５０】
【表３】
【０１５１】
第２の別の実験では、上昇したレベルの突然変異ＣＴ−ＣＲＭを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺粗抽出物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したニックを入れていない野生型ＣＴホロトキシンに対してＹ−１副腎細胞アッセイで比較した。Ｙ−１副腎細胞はマルチ−ウェル皿中の１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中で、粗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解物の存在下でインキューベーションした。細胞毒性は前述のように監視した。この実験では、１毒性単位を一晩のインキューベーション後に７５〜１００％の細胞にラウンディングを生じるトキシンまたは上清の量と定めた。この実験結果を以下の表４に示す。
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
この実験結果は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＧおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨの毒性が実質的に低減され、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨの毒性が野生型ＣＴの毒性の約３０％であることを示した。理論に拘束されることなく、第２実験で生じた変異体は（表４）、第２実験で使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺粗抽出物が、ニックが入っていない突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓを含んだという事実に起因するかもしれない。別の原因は毒性が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により生産される野生型の、ニックが入っていないＣＴの毒性の割合として算出されたからかもしれない、ここで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するニックが入っていない野生型ＣＴは、同じＹ１細胞アッセイで６２５０ｐｇ／ｍｌの５０％細胞ラウンディング用量を有した（データは示さず）。対照的に第１実験では、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの残存毒性はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅａｅ）により生産される野生型のニックが入ったＣＴの毒性の割合として算出され、ここでニックが入ったホロトキシンは、同じＹ１細胞アッセイで１２５ｐｇ／ｍｌの５０％細胞ラウンディング用量を有した。結果として、第２実験で報告された残存毒性は第１実験で得られたものより５０倍高かった。
【実施例４】
【０１５４】
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼアッセイ
ＮＡＤ＋：アグマチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、放射性標識したＮＡＤ＋からの［カルボニル−１４Ｃ］ニコチンアミドの放出として測定した。簡単に説明すると、ＣＴおよびＣＴ−ＣＲＭｓはトリプシン活性化し、そして３０℃で３０分間、ＴＥＡＮバッファー（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ／アジ化ナトリウム／塩化ナトリウム）（ｐＨ８．０）中で５０ｍＭ グリシン／２０ｍＭ ジチオスレイトールとインキューベーションした。その後、反応に以下の材料を加えた：０．１μｇのダイズトリプシンインヒビター、５０ｍＭ リン酸カリウム、１０ｍＭ アグマチン、２０ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００μＭ ＧＴＰ、３ｍＭ ジミリストイルホスファチジル−コリン、０．２％コレート、０．０３ｍｇの卵白アルブミン、１００μＭ［アデニン−Ｕ−１４Ｃ］ＮＡＤ（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＮＥＮ（商標）、ボストン、マサチューセッツ州）、そして水で３００μｌの最終容量とした。３０℃で９０分間インキューベーションした後、１００μｌのサンプルをＡＧ１−Ｘ２（バイオ−ラッド）のカラム（０．６４ｘ５ｃｍ）に乗せ、これを１．０ｍｌの蒸留した／脱イオン化Ｈ２Ｏで５回、洗浄した。［１４Ｃ］ＡＤＰ−リボシルアグマチンを含有する溶出物をラジオアッセイのために回収した。溶出物中の１４Ｃの平均回収は、カラムに乗せたものに対する割合として表す。結果を表５に与える。
【０１５５】
【表５】
【０１５６】
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、基質としてジエチルアミノ（ベンジリジン−アミノ）グアニジン（ＤＥＡＢＡＧ）を使用して独立して測定した（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ，ＲＫ２００１ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３（１３）：４０２４−３２）。このアッセイでは、精製した細胞溶解物から突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの２５μｌアリコート（３０℃で３０分間、１／５０重量／重量％のトリプシンと活性化した）を、２００μｌの２ｍＭ ＤＥＡＢＡＧと０．１Ｍ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、１０μＭ ＮＡＤ、４ｍＭ ＤＴＴ中で２時間インキューベーションした。反応は、４００ｍｇのＤＯＷＥＸ ＡＧ５０−Ｘ８樹脂を含む８００μｌのスラリーバッファーを結合未反応基質に加えることにより止めた。上清のＡＤＰ−リボシル化ＤＥＡＢＡＧはＤＥＡＢＡＧでカリブレーションしたＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ蛍光計で蛍光の発光により定量した。突然変異ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨを除き、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、野生型よりも実質的に減少した（表６）。ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰおよびＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨで見られた高レベルのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、この実験で突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性が異なるアッセイプロトコールで異なる基質を使用して測定されたという事実に因るのかもしれない。
【０１５７】
【表６】
【実施例５】
【０１５８】
型を分類できないインフルエンザ菌（ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥ）（ＮＴＨＩ）の組換えＰ４外側膜タンパク質（ＲＰ４）単独で、またはＣＴ−ＣＲＭＳと一緒に免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）に、０、３および５週で塩水中の組換えＰ４タンパク質（ｒＰ４、５μｇ／用量）、あるいは野生型ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗま
たはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを一緒に配合して免疫感作あたり１．０μｇの用量で免疫感作した。１０μｌの総容量を鼻内投与した（鼻孔あたり５μｌ）。マウスは血清抗体応答をアッセイするために０、２、３、４、５または６日に採血した。最後（６週）の免疫感作から１週間後、マウスは粘膜抗体応答を分析するために屠殺した。
【０１５９】
群間の有意差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多比較試験（ｒＰ４タンパク質について）により、またはスチューデントｔ−検定（ＵｓｐＡ２について）により、ＪＭＰ（商標）統計探査ソフトウェア（ＳＡＳ研究所社、カリー、ノースカロライナ州）を使用して測定した。
【０１６０】
０、３、５および６週の血清抗体の分析は、本明細書に開示する任意の突然変異体を１μｇ／用量の濃度で配合したＮＴＨｉｒＰ４タンパク質の免疫感作がｒＰ４タンパク質に対する免疫応答を有意に誘導したことを示した。ｒＰ４タンパク質に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、配合にＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を含めることにより約１５〜３５倍に上昇した。新規な突然変異トキシン（ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）間には、たとえそれらがすべてｒＰ４タンパク質単独よりも有意に高いＩｇＧ力価を誘導しても、ステューデントｔ−検定により全抗−ｒＰ４ ＩｇＧ力価の有意差は観察されなかった（表６）。ＩｇＡ抗体の個々の血清分析は、配合ｒＰ４／ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇのみが、塩水中のｒＰ４タンパク質を受容した対照群よりもｒＰ４タンパク質に対するＩｇＡ抗体の有意により高い力価を誘導したことを示した（表７）。各新規ＣＴ−ＣＲＭ突然変異体の使用は、ｒＰ４タンパク質に対する血清ＩｇＧサブクラス抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）も強化した（表９）。
【０１６１】
抗−ｒＰ４タンパク質抗体応答も、プールした粘膜洗浄サンプル（ＳＡＬ：唾液腺洗浄サンプル、ＢＡＬ：気管肺胞洗浄サンプル、ＶＷ：膣洗浄サンプル）で分析した（表８）。予想どおり、ｒＰ４／塩水を免疫感作したマウスからのＢＡＬおよびＮＷ中に抗体の誘導は無かった。しかしＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇの有力な粘膜アジュバント能力は明らかに証明可能であった。これらプールサンプルについて統計的分析を行うことができなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを受容したマウスは、試験した各唾液、ＢＡＬおよびＶＷサンプル中に上昇したｒＰ４特異的ＩｇＡ抗体を示した。
【０１６２】
さらに抗−ＣＴ抗体応答も測定した。表７〜１１に示すように、すべてのＣＴ突然変異体が全身性および粘膜性のＣＴ−特異的抗体応答を最後の免疫感作から１週間後に強化した。しかし上記実験におけるマウスは実験の完了後にマウス肝炎ウイルスに感染していると決定されたことに注目すべきである。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
ａ．メスＢＡＬＢ／ｃマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６５】
【表８】
【０１６６】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．粘膜サンプルは６週、１日に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
ａ．メスＢＡＬＢ／ｃマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
ｅ．＊塩水対照と比べた有意差を示す；∧は他のＩＮ群と比べた有意差を示す。
【０１７１】
【表１１】
【０１７２】
ａ．メスＢＡＬＢ／ＣマウスにＮＴＨｉ ｒＰ４（５μｇ）を０、３および５週に免疫感作した。ＩＮ ｖａｘ＝１０μｌ
ｂ．ＮＴＨｉ ｒＰ４免疫原は塩水または１μｇの各コレラトキシン、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇと配合した。
ｃ．ウェルあたり０．２μｇのＮＴＨＩ ｒＰ４を用いてＥＬＩＳＡを行い、そして０．１のＯＤ４０５で終点力価を決定した。
ｄ．血清サンプルは０、３、５および６週に集めた；プールしたサンプルは５のｎを表す。
ｅ．＊塩水対照と比べた有意差を示す；∧は他のＩＮ群と比べた有意差を示す。
【実施例６】
【０１７３】
Ｍ．カタラーリス（ＣＡＴＡＲＲＨＡＬＩＳ）のＵＳＰＡ２外膜タンパク質で免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
この実験では、突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがＭ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の自然なＵｓｐＡ２外膜タンパク質に対する全身性および粘膜性免疫応答を増す能力を調査した。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）に、０、３および５週で免疫感作した。１０μｌの塩水中の精製されたＵｓｐＡ２（５μｇ／用量）単独、または０．１μｇ用量の野生型ＣＴまたは突然変異ＣＴ−ＣＲＭ（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ）を含む１０μｌの配合物を、０、２および４週にＢａｌｂ／ｃマウスにＩＮ（５μｌ／鼻孔）で投与した。０、２、４および６週の血清抗体の分析は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き任意の前記ＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を配合したＵｓｐ２での免疫感作が、０．１μｇ／用量の濃度でＵｓｐＡ２に対する抗体応答を強化したことを示した。ＵｓｐＡ２に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、ＣＴ−由来の突然変異体を含めることにより約３〜１０倍に上昇した。ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴは、スチューデントｔ−検定によりＵｓｐＡ２／ＰＢＳよりも有意に高いＩｇＧ力価を誘導した。しかし新規な各突然変異体トキシン（ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇ）間の全抗−ＵｓｐＡ２ＩｇＧ力価に有意差は観察されなかった。ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、各ＣＴ突然変異体の使用はＵｓｐＡ２に対する血清ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧｂ抗体を強化した（表１２）。
【０１７４】
抗−ＵｓｐＡ２抗体応答は、プールした粘膜洗浄サンプルでも分析した（表１３）。予想どおり、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳを免疫感作したマウスからの粘膜洗浄物中に抗体の誘導は観察されなかった。しかし各突然変異ＣＴの有力な粘膜アジュバント能は明らかに証明された。これらプールサンプルについて統計的分析を行なわなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰを受容したマウスには、集めた各気管肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、鼻洗浄液（ＮＷ）および膣洗浄液（ＶＷ）サンプル中にＵｓｐＡ２に対するＩｇＧまたはＩｇＡ力価の上昇が示された（表１３）。対照的にＵｓｐＡ２タンパク質に対する局所免疫応答のアジュバンティングにおいて、いずれの新規突然変異トキシンもＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴよりも良くないようであった。血清および粘膜洗浄液中のタンパク質−特異的ＩｇＧおよびＩｇＡレべルも２８日に調査した。すべての突然変異ＣＴが強化された血清ＩｇＧ抗体応答を誘導した（データは示さず）。気管、鼻および膣洗浄液中のＩｇＧおよびＩｇＡレべルも測定した。これらの洗浄液中にＩｇＡは検出されず、そしてＩｇＧは２〜３の洗浄液で検出されただけであった（表１３）。この実験でマウスは、実験が完了した後にマウス肝炎ウイルスに感染していると決定された。
【０１７５】
【表１２】
【０１７６】
＊ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２、４週に鼻内に免疫感作した。
血清および粘膜洗浄液を６週に集めた。抗原用量は５μｇであり、そしてアジュバント用量は動物あたり０．１μｇであった。ＩｇＧサブクラスはプールした血清についてＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７７】
【表１３】
【０１７８】
＊ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２、４週に鼻内に免疫感作した。
血清および粘膜洗浄液を６週に集めた。抗原用量は５μｇであり、そしてアジュバント用量は動物あたり０．１μｇであった。ＩｇＧおよびＩｇＡ力価はプールした血清についてＥＬＩＳＡにより測定した。
【実施例７】
【０１７９】
突然変異トキシンコレラホロトキシンのアジュバント性
毒性、機能性および免疫原性の特徴が異なる突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓの総合的なパネルを作成するために、上記のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を粘膜アジュバントとして分析し、そして各突然変異体の毒性および酵素活性プロフィールを決定した。表１４から１８にまとめるように、すべての突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓが野生型ＣＴに比べて有意に低減した毒性および酵素活性を有する。これらの遺伝的に解毒された突然変異ＣＴｓを、Ｍ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の自然なＵｓｐＡ２タンパク質に対する免疫応答を補助する（ａｄｊｕｖａｎｔ）能力について評価した。
【０１８０】
実験は以下のように行った：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、５マウス／群）は０、２および４週に、５μｇの精製した自然なＵｓｐＡ２タンパク質（ＰＢＳ中）で、または免疫感作あたり０．１または１．０μｇの用量で野生型ＣＴまたはＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨまたはＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨまたはＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＷまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを共配合して（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）免疫感作した。１０μｌの全容量を鼻内に投与した（５μｌ／鼻孔）。マウスは血清抗体応答をアッセイするために０、２、４または６週に採血した。最後の免疫感作（６週）から２週間後、マウスは粘膜抗体応答を分析するために屠殺された。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価はＯＤ４０５で０．１の終点で測定した。群間の有意差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多比較試験により、ＪＭＰ（商標）統計探査ソフトウェア（ＳＡＳ研究所社、カリー、ノースカロライナ州）を使用して測定した。
【０１８１】
ＣＴ−ＣＲＭｓのアジュバント性は以下のようにまとめることができる。２、４および６週の血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体は、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き任意のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を１μｇ／用量で配合したＵｓｐＡ２タンパク質の免疫感作が、ＵｓｐＡ２タンパク質に対する抗体応答を有意に強化したことを示した（表１５）。ＵｓｐＡ２タンパク質に対する全ＩｇＧ免疫応答の規模は、ＣＴ−誘導突然変異体（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除く）を包含することにより約１１〜６８倍に上昇した（表１６）。ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨ、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗ（１μｇ用量で）およびＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰ（０．１μｇおよび１μｇの両方で）は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ分析によりＵｓｐＡ２／ＰＢＳよりも有意に高いＩｇＧおよびＩｇＡ力価を誘導した。しかしＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、各新規突然変異トキシン間で全抗−ＵｓｐＡ２ ＩｇＧ力価に有意差は観察されなかった（表１６）。ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除き、１μｇ用量での各ＣＴ突然変異トキシンの使用もＵｓｐＡ２に対する血清ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体を強化した（表１７）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂ力価の比率は約１．０であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２型のバランスがとれた免疫応答を示した。
【０１８２】
抗−ＵｓｐＡ２タンパク質抗体応答は、プールした粘膜洗浄サンプルでも分析した（表１８）。予想どおり、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳを免疫感作したマウスからの粘膜洗浄液中に抗体の誘導は観察されなかった。しかし各突然変異ＣＴ−ＣＲＭ（ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除く）の有力な粘膜アジュバント能は明らかに証明された。粘膜サンプル中のほとんどで検出されるＵｓｐＡ２特異的粘膜ＩｇＡ抗体が存在した。これらプールサンプルについて統計的分析を行なわなかったが、幾つかの傾向が現れた。例えばＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰまたはＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｗを受容したマウスには、集めた各気管肺胞洗浄液、鼻洗浄液および膣洗浄液サンプル中にＵｓｐＡ２タンパク質に対して上昇したＩｇＧまたはＩｇＡ抗体が、野生型ＣＴまたはＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈと同様に示された。
【０１８３】
これらＣＴ−ＣＲＭｓは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きＭ．カタラーリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）のＵｓｐＡ２タンパク質に関する有力な粘膜アジュバントである。血清抗体データは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きすべてのＣＴ−ＣＲＭｓが１μｇ用量でＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＨとのようにＵｓｐＡ２タンパク質に対する免疫応答を等しく補助することができることを示した（表１６）。０．１μｇ用量で、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰは同じ用量のＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈよりも有力であると思われた（表１６）。粘膜洗浄データは、ＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇを除きすべてのこれらＣＴ−ＣＲＭｓが有力な粘膜アジュバント特性を保持することを示唆しているようである（表１８）。さらに表１４に示すよう、それらすべてが野生型ＣＴよりも有意に低い残存特性および酵素活性を有する。したがってこれらの突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓはさらに効果的な粘膜アジュバントである。
【０１８４】
【表１４】
【０１８５】
【表１５】
【０１８６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５群）に、０、２＆４週に１０μｌ容量でＩＮ免疫感作した。血清を６週に集めた。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価はＯＤ４０５が０．１の終点で決定した。Ｔｕｋｅ ｙ−Ｋｒａｍｅｒ分析は以下を示した：１μｇ用量の各アジュバントは０．１μｇ用量の同じアジュバントから統計的に有意である（ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰのＩｇＧおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５ＧのＩｇＡを除く）。アスタリスク（＊）で報告した表１６の結果は、ＵｓｐＡ２／ＰＢＳ群から統計的に有意である。脚注（ａ）で示した結果は、すべての０．１μｇ用量（ＣＴを除く）および１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇよりも統計的に有意に高い。脚注（ｂ）で示した結果は、１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨを除き、すべての１μｇ用量よりも統計的に有意に低い。脚注（ｃ）で示した結果は、０．１μｇ用量（ＣＴを除く）および１μｇ用量のＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇよりも統計的に有意に高い。脚注（ｄ）で示した結果は、すべての１μｇ用量および０．１μｇ用量のＣＴおよびＣＴ−ＣＲＭＧ３４ＧＧＰよりも統計的に有意に低い。
【０１８７】
【表１６】
【０１８８】
表１７に報告する結果は、以下の実験に基づいた。５匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、０、２および４週に１μｇＣＴ（シグマ）またはＣＴ突然変異体で補助したｎＵｓｐＡ２を含有する１０μＬを鼻内に免疫感作した。終点抗体力価は６週で集めた血清から決定した。データを０．１のＯＤ４０５を生じる逆希釈の幾何平均（±１）として表１７に与える。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒによる統計分析ではアスタリスク（＊）で印を付けた結果がｎＵｓｐＡ２／ＰＢＳ群よりも有意に高いことを示した。
【０１８９】
【表１７】
【０１９０】
表１８のデータについて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）は０、２および４週に１０μｌ容量をＩＮ免疫感作した。粘膜洗浄サンプルを６週目に集めた。ＵｓｐＡ２ ＥＬＩＳＡ力価は、ＤＯ４０５が０．１の終点で決定した。
【０１９１】
【表１８】
【実施例８】
【０１９２】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）の精製した自然な融合（Ｆ）タンパク質で免疫感作したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答
本発明の突然変異ＣＴ−ＣＲＭｓがＲＳウイルス（ＲＳＶ）タンパク質に対する粘膜免疫応答を増す能力を、精製された自然な融合（Ｆ）タンパク質を使用して調査した。
【０１９３】
自然なＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢、５／群）に、０および３週にＲＳＶの２４８／４０４株に由来する自然な精製された融合（Ｆ）タンパク質を免疫感作した（ＩＮ、１０μｌ）。タンパク質（３μｇ／用量）を、１．０または０．１μｇの示したＣＴ−ＣＲＭを用いて混合物に調製した。対照マウスはＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈ単独と、野生型ＣＴと、またはＰＢＳと混合したＦタンパク質で免疫感作した。ＥＬＩＳＡにより終点の抗−Ｆタンパク質全およびサブクラスＩｇＧおよびＩｇＡ力価を決定するために、血清（幾何平均力価±１標準偏差）および気管肺胞洗浄液（ＢＡＷ）、鼻洗浄液（ＮＷ）および膣洗浄液（ＶＷ）を２回目の免疫感作から２週間後に集めた。粘膜洗浄液サンプルは終点力価を決定するためにプールした。
【０１９４】
２回の実験からの結果を表１９および２０に与える。
【０１９５】
【表１９】
【０１９６】
【表２０】
【０１９７】
本発明のＣＴ−ＣＲＭ突然変異体を１．０μｇ用量で粘膜アジュバントとして使用した時、突然変異ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＴＨまたは野生型ＣＴの使用に類似する結果が得られた（表１９）。ＣＴ−ＣＲＭＥ２９ＴＨまたは野生型ＣＴと混合したＦタンパク質で免疫感作した後に誘導された抗−Ｆタンパク質ＩｇＧまたはＩｇＡ力価から注目すべき差異は観察されなかった。しかし０．１μｇ用量で、ＣＴ−ＣＲＭＴ４８ＴＨ、ＣＴ−ＣＲＭＹ３０ＷＡＨおよびＣＴ−ＣＲＭＲ２５Ｇは、血清抗−Ｆタンパク質ＩｇＡ力価を増すことがあまりできないようだった。本発明の突然変異体を配合したＦタンパク質で免疫感作したマウスの粘膜洗浄液は、ＣＴ−ＣＲＭＥ２９Ｈまたは野生型ＣＴを混合したＦタンパク質により誘導される力価に匹敵するようだった（表２０）。
【０１９８】
このように本発明のすべてのＣＴ−ＣＲＭ突然変異体はＦタンパク質に関するアジュバント活性を有した。
【０１９９】
本明細書で引用したすべての刊行物および技術文献は、引用により本明細書に編入する。本発明を特定の好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考える。そのような修飾は特許請求の範囲内にあるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸２５位に少なくとも単一アミノ酸置換を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項２】
Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンまたはグリシンに置換されている、請求項１に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項３】
Ａサブユニットのアミノ酸２５位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニットに少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項１に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項４】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位のアルギニンからなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位の二重アミノ酸挿入、
（ｄ）アミノ酸３０位の単一アミノ酸置換、および
（ｅ）Ａサブユニットのアミノ酸３１位および３２位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項３に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項５】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸３５および３６位に少なくとも１つの二重アミノ酸挿入を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項６】
アミノ酸グリシンおよびプロリンが、野生型アミノ酸３４位と３５位の間でＡサブユニットのアミノ酸３５及び３６に挿入されている、請求項５に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項７】
Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニット中に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項５に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項８】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミ
ノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位のアルギニンからなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸２５位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｄ）アミノ酸３０位の単一アミノ酸置換、および
（ｅ）Ａサブユニットのアミノ酸３１位および３２位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項７に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項９】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸３０位に少なくとも単一アミノ酸置換およびアミノ酸３１位および３２位に１つの二重アミノ酸挿入を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１０】
Ａサブユニットのアミノ酸３０位のアミノ酸チロシンがトリプトファンに置換され、そしてアミノ酸アラニンおよびヒツジンが野生型アミノ酸３０位と３１位の間でＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位に挿入されている、請求項９に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１１】
Ａサブユニットのアミノ酸３０位，３１位および３２位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニット中に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項９に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１２】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位からなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸２５位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｄ）Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項１１に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１３】
突然変異ホロトキシンが脊椎動物宿主において抗原に対する免疫応答を強化する、請求項１ないし１２のいずれかに記載の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）を含んでなる免疫原性組成物。
【請求項１４】
さらにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質に由来する断片を含んでなる選択される抗原を含んでなる請求項１３に記載の組成物であって、選択される抗原が病原性細菌、ウイルス、真菌または寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲンおよび自己−分子からなる群の員に由来する上記組成物。
【請求項１５】
選択される抗原が、型に分類できる、および型に分類できないインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｍｕｓ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔ
ａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマ クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア シッタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アロイオコッカス オチジティス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ ｏｔｉｄｉｔｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）コンプレックス、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｌｉｓ）、プロテウス ベルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プレウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅａｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ ガリスセプチム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｕｍ）からなる細菌種に由来する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
抗原がインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ４外膜タンパク質、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ６外膜タンパク質、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）接着および浸透タンパク質（Ｈａｐs）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ウレアーゼタンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢ組換えクラス１ピリン（ｒｐｉｌｉｎ）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢクラス１外膜タンパク質（ＰｏｒＡ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の抗原性組成物。
【請求項１７】
選択される抗原が、ＲＳウイルス、パラインフルエルザウイルス１、２、３型、ヒト メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト パピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンバーウイルス、牛疫ウイルス、鳥気管支ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管支ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、鳥感染性ファブリキウス病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび脳炎ウイルスからなるウイルス種から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
選択される抗原が、ＲＳウイルス融合タンパク質、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
選択される抗原が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）からなる病原性真菌の群から選択される真菌に由来する請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
選択される抗原が、リューシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ ゴンジー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｃｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）からなる病原性寄生生物の群から選択される寄生生物に由来する請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
選択される抗原が、前立腺特異的抗原、癌−胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、ホルモンおよびホルモン類似体からなる群から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
選択される抗原が、アミロイド前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質の４２アミノ酸断片であるＡβペプチド、またはＡβペプチドの断片からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
さらに希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
突然変異コレラホロトキシンに加えて第２のアジュバントをさらに含んでなる請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
有効成分として請求項１ないし１２いずれかに記載の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）を含んでなる抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するための製薬学的製剤。
【請求項２６】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸分子。
【請求項２７】
宿主細胞中で上記突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列をさらに含んでなり、この配列は該ホロトキシンをコードする配列に操作可能に連結されている、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする配列が宿主細胞中で該突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列に操作可能に連結されている、請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸配列を含んでなる核酸分子で形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２９】
コレラホロトキシンが野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する免疫原
性突然変異コレラホロトキシンの生産方法であって、請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸配列を含んでなる核酸分子で形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養することを含んでなり、免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする配列が、宿主細胞中による該免疫原性突然変異コレラホロトキシンの発現を可能とする条件下で該宿主細胞中での該突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列に操作可能に連結されている上記方法。
【請求項３０】
抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するための薬剤の調製における、病原性細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲン、自己−分子または脊椎動物抗原から選択される該抗原と組み合わせた請求項１ないし１２のいずれかに記載の突然変異コレラホロトキシンの有効アジュバント量での使用。
【請求項１】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸２５位に少なくとも単一アミノ酸置換を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項２】
Ａサブユニットのアミノ酸２５位のアミノ酸アルギニンが、トリプトファンまたはグリシンに置換されている、請求項１に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項３】
Ａサブユニットのアミノ酸２５位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニットに少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項１に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項４】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位のアルギニンからなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位の二重アミノ酸挿入、
（ｄ）アミノ酸３０位の単一アミノ酸置換、および
（ｅ）Ａサブユニットのアミノ酸３１位および３２位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項３に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項５】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸３５および３６位に少なくとも１つの二重アミノ酸挿入を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項６】
アミノ酸グリシンおよびプロリンが、野生型アミノ酸３４位と３５位の間でＡサブユニットのアミノ酸３５及び３６に挿入されている、請求項５に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項７】
Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニット中に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項５に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項８】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミ
ノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位のアルギニンからなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸２５位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｄ）アミノ酸３０位の単一アミノ酸置換、および
（ｅ）Ａサブユニットのアミノ酸３１位および３２位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項７に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項９】
野生型コレラトキシン（ＣＴ）のサブユニットＡのアミノ酸配列を含んでなる免疫原性突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）であって、該サブユニットＡがＡサブユニットのアミノ酸３０位に少なくとも単一アミノ酸置換およびアミノ酸３１位および３２位に１つの二重アミノ酸挿入を含んでなり、そして突然変異ＣＴ−ＣＲＭが野生型ＣＴに比べて低減した毒性を有する、上記ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１０】
Ａサブユニットのアミノ酸３０位のアミノ酸チロシンがトリプトファンに置換され、そしてアミノ酸アラニンおよびヒツジンが野生型アミノ酸３０位と３１位の間でＡサブユニットのアミノ酸３１位および３２位に挿入されている、請求項９に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１１】
Ａサブユニットのアミノ酸３０位，３１位および３２位以外の１つのアミノ酸位で、コレラホロトキシンのＡサブユニット中に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含んでなる、請求項９に記載ＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１２】
上記のさらなる突然変異が：
（ａ）アミノ酸７位のアルギニン、アミノ酸９位のアスパラギン酸、アミノ酸１１位のアルギニン、アミノ酸２９位のグルタミン酸、アミノ酸４４位のヒスチジン、アミノ酸５３位のバリン、アミノ酸５４位のアルギニン、アミノ酸６１位のセリン、アミノ酸６３位のセリン、アミノ酸７０位のヒスチジン、アミノ酸９７位のバリン、アミノ酸１０４位のチロシン、アミノ酸１０６位のプロリン、アミノ酸１０７位のヒスチジン、アミノ酸１０９位のセリン、アミノ酸１１０位のグルタミン酸、アミノ酸１１２位のグルタミン酸、アミノ酸１１４位のセリン、アミノ酸１２７位のトリプトファン、アミノ酸１４６位のアルギニンおよびアミノ酸１９２位からなる群から選択されるサブユニットＡアミノ酸についての置換；
（ｂ）Ａサブユニットのアミノ酸２５位の単一アミノ酸挿入、
（ｃ）Ａサブユニットのアミノ酸４９位の単一アミノ酸挿入、
（ｄ）Ａサブユニットのアミノ酸３５位および３６位の二重挿入、
からなる群から選択される、請求項１１に記載のＣＴ−ＣＲＭ。
【請求項１３】
突然変異ホロトキシンが脊椎動物宿主において抗原に対する免疫応答を強化する、請求項１ないし１２のいずれかに記載の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）を含んでなる免疫原性組成物。
【請求項１４】
さらにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質に由来する断片を含んでなる選択される抗原を含んでなる請求項１３に記載の組成物であって、選択される抗原が病原性細菌、ウイルス、真菌または寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲンおよび自己−分子からなる群の員に由来する上記組成物。
【請求項１５】
選択される抗原が、型に分類できる、および型に分類できないインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｍｕｓ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔ
ａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス アガラクティー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマ クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア シッタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アロイオコッカス オチジティス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ ｏｔｉｄｉｔｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）コンプレックス、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｌｉｓ）、プロテウス ベルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プレウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅａｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ ガリスセプチム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｕｍ）からなる細菌種に由来する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
抗原がインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ４外膜タンパク質、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ６外膜タンパク質、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）接着および浸透タンパク質（Ｈａｐs）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ウレアーゼタンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢ組換えクラス１ピリン（ｒｐｉｌｉｎ）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢクラス１外膜タンパク質（ＰｏｒＡ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の抗原性組成物。
【請求項１７】
選択される抗原が、ＲＳウイルス、パラインフルエルザウイルス１、２、３型、ヒト メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト パピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンバーウイルス、牛疫ウイルス、鳥気管支ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管支ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、鳥感染性ファブリキウス病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび脳炎ウイルスからなるウイルス種から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
選択される抗原が、ＲＳウイルス融合タンパク質、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
選択される抗原が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）からなる病原性真菌の群から選択される真菌に由来する請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
選択される抗原が、リューシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ ゴンジー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｃｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）からなる病原性寄生生物の群から選択される寄生生物に由来する請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
選択される抗原が、前立腺特異的抗原、癌−胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、ホルモンおよびホルモン類似体からなる群から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
選択される抗原が、アミロイド前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質の４２アミノ酸断片であるＡβペプチド、またはＡβペプチドの断片からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
さらに希釈剤、賦形剤または担体を含んでなる請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
突然変異コレラホロトキシンに加えて第２のアジュバントをさらに含んでなる請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
有効成分として請求項１ないし１２いずれかに記載の突然変異コレラホロトキシン（ＣＴ−ＣＲＭ）を含んでなる抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するための製薬学的製剤。
【請求項２６】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸分子。
【請求項２７】
宿主細胞中で上記突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列をさらに含んでなり、この配列は該ホロトキシンをコードする配列に操作可能に連結されている、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする配列が宿主細胞中で該突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列に操作可能に連結されている、請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸配列を含んでなる核酸分子で形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２９】
コレラホロトキシンが野生型コレラホロトキシンに比べて低減した毒性を有する免疫原
性突然変異コレラホロトキシンの生産方法であって、請求項１ないし１２のいずれかに記載の免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする単離され、そして精製された核酸配列を含んでなる核酸分子で形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養することを含んでなり、免疫原性突然変異コレラホロトキシンをコードする配列が、宿主細胞中による該免疫原性突然変異コレラホロトキシンの発現を可能とする条件下で該宿主細胞中での該突然変異ホロトキシンの発現を可能とする調節配列に操作可能に連結されている上記方法。
【請求項３０】
抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を強化するための薬剤の調製における、病原性細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、ガン細胞、腫瘍細胞、アレルゲン、自己−分子または脊椎動物抗原から選択される該抗原と組み合わせた請求項１ないし１２のいずれかに記載の突然変異コレラホロトキシンの有効アジュバント量での使用。
【公開番号】特開２００９−１１２３０１（Ｐ２００９−１１２３０１Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５６３６６（Ｐ２００８−２５６３６６）
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【分割の表示】特願２００３−５０１４１１（Ｐ２００３−５０１４１１）の分割
【原出願日】平成１４年６月５日（２００２．６．５）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０３４４７５７５）ガバメント・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプレゼンテイド・バイ・ザ・ユニフオームド・サービシズ・ユニバーシテイ・オブ・ザ・ヘルス・サイエンシズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【分割の表示】特願２００３−５０１４１１（Ｐ２００３−５０１４１１）の分割
【原出願日】平成１４年６月５日（２００２．６．５）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０３４４７５７５）ガバメント・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプレゼンテイド・バイ・ザ・ユニフオームド・サービシズ・ユニバーシテイ・オブ・ザ・ヘルス・サイエンシズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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