アズキ由来抗アレルギー剤及びこれを含有する食品
【課題】アズキの未利用な有効成分に着目し、新規かつ既存の抗アレルギー薬よりも高い薬効を備えたアズキ由来抗アレルギー剤、及びこれを含有する食品を提供する。
【解決手段】アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤に１０％〜４０％エタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤であり、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する。また、当該アズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したこと特徴とする。
【解決手段】アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤に１０％〜４０％エタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤であり、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する。また、当該アズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したこと特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アズキ由来抗アレルギー剤及びこれを含有する食品に関し、特に、アズキの熱水抽出物に由来する抗アレルギー剤であり、当該抗アレルギー剤を添加した食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー疾患の代表的な症状は、スギやヒノキ等の花粉に起因するアレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等である。現状、これらの治療、症状改善においては、抗ヒスタミン薬等のメディエーター遊離抑制剤、抗トロンボキサン薬（ＴＸＡ２拮抗剤、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤）、ロイコトリエン拮抗剤（ＲＴｓ拮抗剤）、Ｔｈ２サイトカイン阻害剤等が処方されている。前記の医薬品は症状改善に一定の効果を上げるものの、全身の倦怠感を引き起こす等の副作用も存在する。
【０００３】
そこで、近年、天然物由来成分をアレルギー疾患の症状改善に役立てようとする試みが数多く報告されている。例えば、甜茶（Ｒｕｂｕｓ ｓｕａｖｉｓｓｉｍｓ Ｓ．Ｌｅｅ）の抽出物を成分とする抗アレルギー剤（特許文献１、２等）がある。他に、杉（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｄ．Ｄｏｎ）の葉の抽出物（特許文献３）、「べにふうき」や「べにふじ」等の緑茶葉から抽出したカテキン類の抗アレルギー剤（特許文献４等）がある。これらの天然物を日常生活において積極的に摂取して比較的副作用を抑えながら、アレルギー反応の抑制、軽減に役立てようとする試みである。
【０００４】
前述の経緯とは別に、発明者は、以前からアズキに着目して各種の研究を行ってきた。アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、主に煮沸（炊きあげ）による加熱により軟らかく加工され、赤飯等の料理の食材、あるいは、砂糖が加えられ「小倉あん」等の製菓用食材に加工される。アズキの加工に際し、アズキの煮汁が大量に生じる。アズキの煮汁には、ポリフェノール類、サポニン類、アントシアニン類、さらには糖分子と結合した配糖体等も含有されていることが知られている。しかし、現状、利用されることなくそのまま廃棄されることが多い。
【０００５】
アズキの煮汁に着目し、この中に含まれる生理活性成分についての有効活用として、以下の研究が報告されている。例えば、アズキの煮汁から得られる配糖体については、抗腫瘍活性が報告されている（特許文献５、非特許文献１、２等参照）。また、アズキの煮汁のアルコール抽出物の生理作用については、血糖降下活性、細胞接着阻害、高脂血症予防等の効果が報告されている（非特許文献３、４、５、６等参照）。
【０００６】
そして、アズキに含まれる成分に関して抗アレルギーの生理活性効果について鋭意研究を重ねた発明者は、アレルギー疾患にもアズキに含まれる成分が有用である知見を得るに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２７００９５８号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６３１号公報
【特許文献３】特開２００７−２５４３２２号公報
【特許文献４】特許第４２７２６９１号公報
【特許文献５】特開２００３−６３９６７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】伊藤智広他、日本食品科学工学誌 第４９巻，第５号，ｐ．３３９−３４４（２００２年５月）
【非特許文献２】伊藤智広他、日本栄養・食料学会誌 第５８巻，第５号，ｐ．２８１−２８７（２００５年）
【非特許文献３】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（１２），２４２１−２４２６（２００４）
【非特許文献４】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（３），４４８−４５４（２００５）
【非特許文献５】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，１３４−１４１（２００９）
【非特許文献６】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，３１８−３２１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の点に鑑みなされたものであり、アズキの未利用な有効成分に着目し、新規かつ既存の抗アレルギー薬よりも高い薬効を備えたアズキ由来抗アレルギー剤、及びこれを含有する食品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、請求項１の発明は、アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１１】
請求項２の発明は、前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１２】
請求項３の発明は、前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する請求項１または２に記載のアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１３】
請求項４の発明は、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤含有食品に係る。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、アズキを熱湯で煮沸することで生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したため、これまで廃棄されていたアズキの未利用な有効成分に着目し、新規のアズキ由来抗アレルギー剤を得ることができた。
【００１５】
請求項２の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、請求項１の発明において、前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液であるため、既存の抗アレルギー薬よりも高い薬効を備えたアズキ由来抗アレルギー剤を得ることができた。
【００１６】
請求項３の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、請求項１または２の発明において、前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈するため、Ｉ型アレルギーの症状改善に貢献できる。
【００１７】
請求項４の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤含有食品によると、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したため、日常的な食事から抗アレルギー剤を摂取することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のアズキ由来抗アレルギー剤を得る概略工程図である。
【図２】細胞内シグナル伝達モデルの模式図である。
【図３】４種類のアズキ煮汁由来抽出物の脱顆粒反応抑制率のグラフである。
【図４】アズキ煮汁由来抽出物、甜茶抽出物、及びクロモグリク酸ナトリウムの脱顆粒反応抑制率のグラフである。
【図５】アズキ由来抽出物に関する細胞内カルシウムイオン濃度のグラフである。
【図６】クロモグリク酸ナトリウムに関する細胞内カルシウムイオン濃度のグラフである。
【図７】アズキ由来抽出物添加後の細胞内ＲＯＳ産生のグラフである。
【図８】ＤＰＩ添加後の細胞内ＲＯＳ産生のグラフである。
【図９】細胞膜画分及び細胞質画分のタンパク質のウエスタンブロットの比較写真である。
【図１０】抗酸化活性を示したグラフである。
【図１１】抗原刺激の有無とアズキ由来抽出物添加の各リン酸化タンパク質の第１検出泳動写真である。
【図１２】抗原刺激の有無とアズキ由来抽出物添加の各リン酸化タンパク質の第２検出泳動写真である。
【図１３】陰性対照、陽性対照、及びアズキの煮汁粉末を投与してＰＣＡ反応を行ったマウスの剥離皮膚の写真である。
【図１４】アズキ由来抽出物及び甜茶抽出物を投与してＰＣＡ反応を行ったマウスの剥離皮膚の写真である。
【図１５】図１３及び図１４のマウスにおける血管透過亢進抑制作用を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤について、図１の概略工程図を用い、これを得る過程を説明する。はじめに、アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、蒸煮釜等において９０℃〜９５℃の熱湯中で、２０分〜６０分間煮沸（炊きあげ）される。当該加熱後、アズキと湯（煮汁）は分離される。アズキについては砂糖等が添加され小倉あんに加工される。
【００２０】
アズキを煮沸した際に生じる煮汁は室温に冷まされ、煮汁は上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）と沈殿物（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に分けられる。煮汁の分離には、フィルター濾過の他、後述の実施例の条件による遠心分離も用いられる。
【００２１】
煮汁の上清中には、各種の熱水可溶性成分が含まれている。そこで、上清内の成分の濃縮と溶出分離のため、上清はいったん合成吸着剤に吸着される。合成吸着剤は適宜の樹脂製カラム、樹脂ビーズ等である。後記の実施例では、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂からなる細孔を備えた粒径０．２５ｍｍ以上のビーズを用いた。
【００２２】
上清中の各種成分を吸着している合成吸着剤に対してエタノールの水溶液が添加、送通される。そして、合成吸着剤に吸着されているアズキの抽出物は溶出される。このように、アズキの煮沸、上清分離、吸着、溶出の過程を経ることにより得られる成分が、本発明に規定するアズキ由来抗アレルギー剤である。エタノール水溶液中に存在する溶出分の有無は、所定の波長（２８０ｎｍ）の吸光度を確認することにより容易に把握することができる。
【００２３】
エタノール水溶液は、全量水の状態から徐々にエタノール濃度が連続的に高められる濃度勾配（グラジエント）の溶液（ｖ／ｖ％）として調製され、前記の抽出物の溶出に供される。実施例において、エタノール水溶液の濃度（ｖ／ｖ％）は、当初の０％から、１０％ないし４０％濃度の溶液、４０％ないし６０％濃度の溶液、６０％ないし８０％濃度の溶液の４種類としている。濃度勾配を形成する精度上、概ね前記の濃度域毎に分けられる。なお、合成吸着剤を乾燥させると分離能が変動してしまうため、濃度の切り替えの際に必要量の水が送通される。
【００２４】
各エタノール水溶液濃度の溶出の画分（フラクション）から水分等を蒸発、乾燥することにより、エタノール水溶液の濃度毎に振り分けた抽出物を得ることができる。この抽出物がアズキ由来抗アレルギー剤である。前記の４種類のエタノール水溶液の濃度域にあっては、一様に抗アレルギー性を発現する。その中においても、１０％ないし４０％の濃度域のエタノール水溶液の抗アレルギー性の発現が顕著である。抽出物はアズキの煮汁由来の成分であるため、配糖体、色素成分、各種カテキン類等のポリフェノール成分が含まれていると想定される。従って、本発明のアズキ由来抗アレルギー剤とは、前記の配糖体等の成分をはじめ、複数の成分を含む混合物であると考えられる。
【００２５】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤とは、アレルギー症状の治療、緩和に有用と考えられる薬効成分である。加えて、日常生活の質（ＱＯＬ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の改善に効果を発揮するとされる薬効成分である。薬剤として用いる場合、経口投与の剤型は錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の適宜である。また、注射薬、点滴薬、スプレー薬、点鼻薬、点眼薬等とすることもできる。列記の薬剤においては、アズキ由来抗アレルギー剤を単独としても他の薬剤を加え併用しても良い。
【００２６】
ここで、アレルギーと症状について、その種類に応じて簡単に説明する。一般的にアレルギーは以下のＩ型からＩＶ型に分類される。
【００２７】
［Ｉ型アレルギー（即時型）］
ＩＬ−４等のシグナルによりＢ細胞から分泌されるＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）は、マスト細胞や好塩基球細胞の表面の受容体ＦｃεＲＩに結合する。ＩｇＥに各種のアレルゲン（抗原）が結合すると、マスト細胞や好塩基球細胞からヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン等のケミカルメディエーターが分泌される。前記の各種ケミカルメディエーターにより、血管拡張によるむくみや鼻炎、気管支収縮による喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の症状を引き起こす。食物アレルギー、アナフィラキシーショックの症状もＩ型アレルギーに含まれる。
【００２８】
［ＩＩ型アレルギー（細胞傷害型）］
自己の細胞が抗原として認識されることにより、この細胞に対するＩｇＧ、ＩｇＭ等の抗体が産生される。自己の細胞同士で抗原抗体反応の攻撃が起きてしまう反応である。症状として、自己免疫性溶液性貧血、橋本病、バセドウ病等がある。
【００２９】
［ＩＩＩ型アレルギー（アルサス型）］
可溶性抗原とＩｇＧとの反応により免疫複合体が形成される。この免疫複合体による組織傷害に起因した反応である。症状として、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等がある。
【００３０】
［ＩＶ型アレルギー（遅延型）］
Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞の活性化によりＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５等のサイトカインが産性され、マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞により異物が処理される際の反応がある。症状として、アトピー性皮膚炎、ツベルクリン反応等がある。特に、Ｉ型アレルギーが進行した後のアトピー性皮膚炎の場合、炎症を悪化させやすい。
【００３１】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤は、上記のアレルギー反応の抑制に効果を発揮すると考えられる。とりわけ、後記の実施例に開示する細胞内の作用機序から理解できるように、Ｉ型アレルギー反応を抑制する効果が高いと推察される。Ｉ型アレルギーは緊急性を要する重篤な症状を発症する他、喘息、鼻水、くしゃみ等の日常生活における不快感の原因となる症状も多い。そこで、日常的に抗アレルギー剤を摂取することにより、常時マスト細胞や好塩基球細胞等に感作して症状を緩和することができれば、生活の質の向上、生活習慣に起因する疾病の改善に大きく貢献する。
【００３２】
本発明の抗アレルギー剤は、天然物であり、古くから食用されているアズキに由来する抽出物である。そのことから、本発明のアズキ由来抗アレルギー剤は食品と馴染み良い。よって、新たにアズキ由来抗アレルギー剤を添加したアズキ由来抗アレルギー剤含有食品を作ることができる。
【００３３】
アズキ由来抗アレルギー剤（アズキ煮汁抽出物）を添加可能な食品は、具体的に、水ようかん、ようかん、小倉あん、どら焼き、アズキのムース、アイスクリーム、飴（キャンデー）、キャラメル、カスタードプディング、コーヒーゼリー、グミ、ババロア、マシュマロ、カステラ、ホットケーキ、クッキー、フルーツジュース、炭酸飲料等がある。さらにはサプリメントとなる錠剤等も挙げられる。
【００３４】
列記のアズキ由来抗アレルギー剤含有食品を製造するに際し、アズキ由来抗アレルギー剤の含有量は、当該食品自体の味覚及び添加後の味の変化、他の添加成分、１回当たりの喫食量、喫食頻度、季節性、販売形態、さらに年齢、性別、職種を加味した需要者層等を総合的に考慮して規定される。食品に添加するアズキ由来抗アレルギー剤の量は自由であり、例えば０．０１重量％ないし１００重量％（つまり、全量アズキ由来抗アレルギー剤とする食品）、１重量％ないし８０重量％としても良い。
【実施例】
【００３５】
発明者らは、次述の手法、手順に従い、アズキよりアズキ由来抗アレルギー剤を抽出した。そして、抗アレルギー剤の細胞内における作用機序の確認、並びに生体における発現を確認した。
【００３６】
［アズキ煮汁由来の抽出物の調製］
原料となるアズキに北海道十勝産の小豆を用いた。開放型の蒸煮釜にアズキを投入し、水から加熱して４５分間煮沸した。煮上がって軟らかくなったアズキとその煮汁と分けた。煮汁を室温付近（約２０℃）になるまで冷ました後、１６５００×ｇ（９０００ｒｐｍ）、１０分間の遠心分離をした。遠心分離より得た上清１ｋｇに芳香族系合成吸着剤（三菱化学株式会社製 逆相吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０」）３００ｇを加えて４℃で１２時間攪拌した。合成吸着剤とそれ以外の液に分けた後、合成吸着剤を蒸留水により洗浄し、さらに４０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）により数回溶出を行った。
【００３７】
前記の洗浄、溶出した合成吸着剤をカラム（内径５ｍｍ×全長３００ｍｍ）に充填した。当該合成吸着剤充填カラムを複数本用意した。合成吸着剤充填カラムに対し、はじめは蒸留水のみを送通し、次第にエタノールの割合を高めながら溶液を調製して送通した。本実施例では、当初の蒸留水のみの溶出から、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液とする４種類の濃度による溶出を行った。溶出に供したエタノールは濃度勾配（グラジエント）を伴う。このため、濃度を切り替えるに際し濃度に幅が不可避的に生じる。そこで、上記のとおり濃度域を持った溶出条件とした。
【００３８】
蒸留水のみの溶出、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液から得た画分（フラクション）のそれぞれについて、ロータリーエバポレーター（柴田科学株式会社製）を用い、画分中の水分等を蒸発、乾固した。こうして、溶出条件の異なる４種類のアズキ煮汁由来の抽出物を得た。以降の明細書、図面において、蒸留水のみの溶出から得た抽出物を「ＷＥｘ」、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．４０」、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．６０」、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．８０」として表記する。
【００３９】
［細胞内機序の検証］
４種類の異なるアズキ煮汁由来の抽出物を調製した発明者は、細胞内における抗アレルギー性能の発現の有無、細胞内の作用部位を明らかにすることにより、アズキ煮汁由来の抽出物の薬効性を確認した。以下、検証実験を順に述べる。
【００４０】
〈１．脱顆粒反応抑制作用〉
溶出条件の異なる４種類のアズキ煮汁由来の抽出物について、脱顆粒反応抑制作用を抗アレルギー性能の指標として測定した。併せて、既存の抗アレルギー作用を発揮する薬剤等との比較も試みた。脱顆粒反応抑制作用は、図２に開示の好塩基球細胞等の細胞内シグナル伝達モデルの模式図における脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）に伴い、ケミカルメディエーター（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ）となるβ−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の分泌抑制効果を指標として用いた。
【００４１】
ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ添加のＭＥＭ培地に懸濁した。同培地にマウスモノクローナル抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体）を２００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間、前記のラット細胞を抗体で感作した。培養終了後、培地を吸引除去してシラガニアン緩衝液により２回洗浄し、同緩衝液１６０μＬに置換した。
【００４２】
添加用の薬液の調製に際し、はじめに、４種類のアズキ煮汁由来の抽出物であるＷＥｘ、ＥｔＥｘ．４０、ＥｔＥｘ．６０、及びＥｔＥｘ．８０と、比較として甜茶抽出物（以降、Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．と称する。）をそれぞれジメチルスルホキシド（以降、ＤＭＳＯと称する。）に溶解した。各抽出物を溶解したＤＭＳＯの最終濃度を０．１％以下とするまでシラガニアン緩衝液で希釈した。陽性対照としてＤＭＳＯのみをシラガニアン緩衝液で希釈した。また、抗アレルギー薬として用いる薬剤として、医薬品名「インタール」、分子名「クロモグリク酸ナトリウム：ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ」（以降、Ｄｓｃｇと称する。）を用い、このＤｓｃｇもＤＭＳＯに溶解し、抽出物の場合と同様にシラガニアン緩衝液で希釈した。
【００４３】
緩衝液による希釈を経た各濃度のアズキ煮汁由来の抽出物、甜茶抽出物、陽性対照、Ｄｓｃｇの薬液２０μＬずつを抗体感作後のラット細胞の培養液に添加し、３７℃で３０分間培養した。続いてジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）を２０μＬ添加し、３７℃で３０分間抗原刺激を行った。その後、氷冷下、１０分間静置し反応を止めた。各培地より上清を１０μＬずつ分取するとともに９６穴のプレートに移し替えた。プレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド（ｐ−ＮＡＧ）溶液を５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間発色させた。反応終了後、反応停止液を２００μＬ添加し、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍにおける吸光度“Ａ”を測定した。
【００４４】
前出の陽性対照も同様に処理し、吸光度“Ｂ”を求めた。また、前記のＤＮＰ−ＢＳＡの代わりにシラガニアン緩衝液のみの添加とした抗原刺激がない陰性対照の吸光度“Ｃ”も求めた。各吸光度に基づいて下記の式（ｉ）によりβ−ヘキソサミニダーゼの遊離抑制率（Ｐi）（単位：％）を求めた。
【００４５】
【数１】
【００４６】
さらに、試料によるβ−ヘキソサミニダーゼの直接的な阻害活性を算出した。そこで、ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３より調製したβ−ヘキソサミニダーゼ酵素液と、脱顆粒反応測定の際に使用した試料溶液から、下記の式（ｉｉ）により酵素直接阻害活性率（Ｑi）（単位：％）を求めた。試料処理による吸光度は“Ｄ”、陽性対照の吸光度は“Ｅ”である。両式（ｉ）及び（ｉｉ）より求めた酵素直接阻害活性率（Ｅi）と遊離抑制率（Ｆi）より、式（ｉｉｉ）に従い脱顆粒反応抑制率（Ｒi）（単位：％）を求めた。
【００４７】
【数２】
【００４８】
【数３】
【００４９】
図３のグラフは、４種類のアズキ煮汁由来の抽出物であるＷＥｘ、ＥｔＥｘ．４０、ＥｔＥｘ．６０、及びＥｔＥｘ．８０に関する脱顆粒反応抑制率（％）の結果である。同グラフ中の単位の５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬは、実験に供した培地中の濃度である。この結果より、いずれの溶出条件においても、脱顆粒反応の抑制が明らかとなった。また、反応活性は濃度依存的である。この中においても、ＥｔＥｘ．４０、つまり、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得たアズキ煮汁由来の抽出物が最も高い活性を有していることが明らかとなった。
【００５０】
図４のグラフは、アズキ煮汁由来抽出物のＥｔＥｘ．４０と、甜茶抽出物（Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．）及びクロモグリク酸ナトリウム（Ｄｓｃｇ）の脱顆粒反応抑制率（％）の比較結果である。同グラフ中の単位の５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬは、実験に供した培地中の濃度である。この結果は、アズキ由来抽出物（ＥｔＥｘ．４０）の抑制効果が既存の天然物抽出物や医薬品よりも優れていることを示す。
【００５１】
〈２．細胞内カルシウムイオン濃度の変動〉
Ｉ型アレルギーにおける脱顆粒反応には、カルシウムイオン（Ｃａ2+）の流入による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が関与すると考えられている。図２の模式図に示すように、活性酸素種（Ｈ2Ｏ2等）よりカルシウムイオンチャンネルが開き、細胞外から細胞内はカルシウムイオンが流入する経路と、ＩＰ３を介してのシグナル伝達から小胞体ＥＲよりカルシウムイオンが放出される経路が現在知られている。そこで、発明者は、脱顆粒反応抑制効果が最も高いアズキの煮汁に由来する抽出物である「ＥｔＥｘ．４０」に着目して、カルシウムイオンの流入に及ぼす影響を検証した。
【００５２】
細胞内カルシウム濃度は、株式会社同仁化学研究所製「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ−Ｆｌｕｏ ３」を使用して測定した。９６穴マイクロプレートにＩｇＥ感染処理のＲＢＬ−２Ｈ３細胞を播種し、各ウェルに３μＭの蛍光指示薬Ｆｌｕｏ３−ＡＭを含むＬｏａｄｉｎｇ緩衝液１００μＬを添加し、３７℃で３０分間かけて蛍光指示薬を取り込ませた。３０分後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））により２回洗浄して余分な蛍光指示薬を洗い流した。洗浄後、Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ緩衝液を８０μＬと、前記のＤＭＳＯ及びシラガニアン緩衝液で希釈調製を経たアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、または前記のＤＭＳＯ及びシラガニアン緩衝液で希釈調製を経た対照薬剤のＤｓｃｇのそれぞれを１０μＬずつ添加し、３０分間処理した。
【００５３】
処理後のマイクロプレートを蛍光測定用のマイクロプレートリーダーに装着し、抗原としてＤＮＰ−ＢＳＡを１０μＬ添加して反応を開始させた。３７℃を維持しながら５秒毎に、４分間の蛍光指示薬による蛍光強度を測定した。アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０に関する細胞内カルシウムイオン濃度の推移結果は図５であり、対照薬剤Ｄｓｃｇの推移結果は図６である。両グラフ中のエチレングリコールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）はカルシウムイオンを捕捉するキレート剤であり、比較のために用いた。
【００５４】
図５について、黒丸でプロットの折れ線のカルシウムイオン濃度は、抗原刺激（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）を伴う反応である（グラフ中、Ａｇ（＋））。白丸でプロットの折れ線は抗原刺激を伴わない反応である（グラフ中、Ａｇ（−））。黒三角でプロットの折れ線はＥＧＴＡを添加して抗原刺激を行った反応である。自明ながらカルシウムイオンはキレートされるため、黒丸の折れ線よりも低量である。次に、黒四角でプロットの折れ線はアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加して抗原刺激を行った反応である。ＥｔＥｘ．４０の添加は、細胞内カルシウムイオン濃度の抑制効果を発揮する。さらに、ＥｔＥｘ．４０は、抗原刺激がない状態、あるいはＥＧＴＡ添加と比較して細胞内カルシウムイオン濃度を低位側に維持する。
【００５５】
対照となる図６について、黒丸、白丸、黒三角のプロットの折れ線は図５と同様の処理を施した結果である。黒四角でプロットの折れ線はＤｓｃｇを添加して抗原刺激を行った反応である。Ｄｓｃｇは抗原刺激があった状態よりはカルシウムイオン濃度の増加を抑制しているものの、カルシウムイオン濃度の増加阻害活性は弱いといえる。両図の結果を踏まえると、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、細胞内カルシウムイオンの増加抑制に極めて強い活性を発現している。
【００５６】
〈３．細胞内ＲＯＳ産生抑制〉
生体内では、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種である「ＲＯＳ」が常時産生されている。白血球、特に好中球によるＲＯＳの産生量は顕著である。ＲＯＳは殺菌、異物除去等の免疫応答の誘導等のシグナル伝達物質となることが知られている。また、ＲＯＳは前述の細胞内カルシウムイオン濃度の増加を誘導し、これに関連して脱顆粒反応を起こすと考えられている。例えば、図２の模式図に示すＨ2Ｏ2等のＲＯＳによるカルシウムイオンチャンネルの開放、カルシウムイオンの流入の経路が挙げられる。前掲「２．細胞内カルシウムイオン濃度の変動」における結果から判明した細胞内カルシウムイオンの増加抑制活性を踏まえ、ＲＯＳの濃度の測定を検討した。そこで、活性酸素種を特異的に検出するＤＣＦ蛍光指示薬を用いて抗原刺激後の細胞内のＲＯＳ濃度の測定を試みた。
【００５７】
膜透過性プローブである２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ（以降、ＤＣＦＨ−ＤＡと称する。）は細胞外から細胞内へ移行し、細胞質中のエステラーゼにより加水分解されて２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以降、ＤＣＦＨと称する。）に変化する。ＤＣＦＨは膜透過性を失うため細胞内に留まる。ＤＣＦＨは過酸化水素（図２中、Ｈ2Ｏ2参照）等の細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）と反応し、酸化されて２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以降、ＤＣＦと称する。）となる。ＤＣＦは蛍光を発するため、ＤＣＦＨ−ＤＡを投与した細胞のＤＣＦ蛍光強度を測定することにより、細胞内の酸化状態（ＲＯＳの量）を定量化することができる。当該細胞内に抗酸化性の物質が存在すると、ＤＣＦの酸化は抑制され、蛍光強度の低減により被験物質の細胞内での抗酸化活性を評価できる。
【００５８】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を培養し、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ蛍光色素で３０分間処理して細胞内に取り込ませた。３０分後、細胞内に取り込まれなかった蛍光色素をＰＢＳ（−）により洗浄後、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤であるｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以降、ＤＰＩと称する。）、陽性対照、陰性対照のそれぞれについて、前述の「１．脱顆粒反応抑制作用」の処理と同様に処理した。抗原処理後、１分間隔で１０分間経時的に蛍光強度を測定した。
【００５９】
図７のグラフはアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加後の推移を示し、黒四角でプロットの折れ線はアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加して抗原刺激を行った際の経時変化である。図８のグラフはＤＰＩ投与後の推移を示し、黒四角でプロットの折れ線はＤＰＩを添加して抗原刺激を行った際の経時変化である。両グラフとも、黒丸でプロットの折れ線は、抗原刺激（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）を伴う反応である（グラフ中、Ａｇ（＋））。白丸でプロットの折れ線は抗原刺激を伴わない反応である（グラフ中、Ａｇ（−））。
【００６０】
図示のとおり、ＤＰＩの細胞内ＲＯＳ産生抑制の効果は、陽性対照と比較して明らかである。その上で、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０はＤＰＩよりもＲＯＳ産生を有意に抑制することが判明した。また、陰性対照よりもＲＯＳ産生を抑制することも明らかとなった。
【００６１】
〈４．ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害活性〉
細胞内へのカルシウムイオンの流入を調節するカルシウムチャンネルは細胞膜に存在する。このカルシウムチャンネルは細胞内のＲＯＳ（前記参照）により調節される。マスト細胞における抗原刺激後の細胞内ＲＯＳ産生にＮＡＤＰＨオキシダーゼ（以降、ＮＯＸと称する。）が関与することが報告されている。ＮＯＸの活性化を図２の模式図を用いて簡単に説明する。はじめに、Ｒａｃは細胞質に存在するサブユニットｐ４０phox、ｐ４７phox、ｐ６７phoxと結合して四量体を形成する。次に、この四量体が細胞膜サブユニットｇｐ９１phox、ｐ２２phox側へ移行することによりＲＯＳは産生される。そこで、膜画分及び細胞質画分を調べることにより、ＮＯＸの活性をサブユニットの移行の結果として把握することができる。
【００６２】
膜画分及び細胞質画分の分離に際し、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製のＰｒｏｔｅｏ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｃｏｄｅ３５３７９０）を用い調製した。図９は細胞膜画分及び細胞質画分のタンパク質のウエスタンブロットの写真である。左から、陰性対照となる抗原刺激なし「Ａｇ（−）」、陽性対照となる抗原刺激あり（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）「Ａｇ（＋）」、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加の順である。
【００６３】
抗原刺激あり（Ａｇ（＋））にあっては、ｐ４０phox、ｐ６７phox、ｐ４７phox、及びＲａｃは細胞膜側から検出できたため、膜側への移行が明らかである。これに対し、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加では、細胞膜側からｐ６７phox及びＲａｃはほとんど検出されない。従って、細胞質に存在するサブユニット（ｐ４０phox、ｐ４７phox、ｐ６７phox、及びＲａｃ）の一括での膜側への移行抑制を確認することができた。
【００６４】
〈５．抗酸化活性〉
細胞内ＲＯＳ濃度は、添加した試料自体の抗酸化活性により低下することも推測される。そこで、試料自体の抗酸化活性を明らかにする必要がある。ラジカル発生剤として汎用される２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（以降、ＤＰＰＨと称する。）におけるラジカル補足能により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで各試料のラジカル消去能を測定した。ＤＰＰＨはラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を有する。抗酸化物質により還元されることにより、５１７ｎｍの吸光度は低下する。吸光度の低下を測定することにより、試料（化合物）の抗酸化活性を測定できる。
【００６５】
ＤＰＰＨを５０％エタノール水溶液に溶解して２５０μＭの溶液に調製し、０．２２μｍのフィルターにより濾過し不溶物を除去し使用に供した。試料として、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、ビタミンＣ（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ビタミンＥ（α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、換算用にｔｒｏｌｏｘを用い、これらをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、５０％エタノールにより希釈した。９６穴マイクロプレートに２０μＬずつ前記の試料溶液を分注した。ここにＤＰＰＨ溶液を１８０μＬ添加し、室温下で２０分間反応させた。反応後、５１７ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
図１０のグラフは、各濃度のアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０（黒丸のプロット）、ビタミンＣ（黒三角のプロット）、ビタミンＥ（黒四角のプロット）のＤＰＰＨラジカル捕捉能の結果である。アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、ビタミンＣ、Ｅの３倍以上の高い抗酸化活性を示している。これまでの知見から、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０が作用する細胞内ＲＯＳ産生の抑制とは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害活性と抗酸化活性の双方に起因すると推測される。
【００６７】
〈６．リン酸化タンパク質の定量比較〉
図２の模式図から理解されるように、脱顆粒反応の上流では各種タンパク質のリン酸化が生じ、サイトカイン遺伝子の発現、アラキドン酸カスケード等の要因となっていることが明らかになりつつある。そこで、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０が実際にリン酸化の抑制に作用するか否かを調べた。
【００６８】
前述の「１．脱顆粒反応抑制作用」と同様に、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０の処理、抗原刺激を行った細胞を用意した。細胞抽出物の調製に際し、細胞を氷冷ＰＢＳ（−）により２回洗浄した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｌｏｒａｔｅ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳを含有する緩衝液を調製し、同緩衝液により氷上で超音波ホモジェナイズした。溶解物を４℃で２００００×ｇ（１４５００ｒｐｍ）、３分間遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として使用した。個々の細胞抽出物について、ＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）によりタンパク質濃度を測定し、等濃度となるように希釈した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロッキングし、各種抗体でプローブした。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体を反応させ、ＥＣＬ法（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ法）を用いて発色させた。
【００６９】
図１１及び図１２の泳動写真は、陰性対照となる抗原刺激なし「Ａｇ（−）」、陽性対照となる抗原刺激あり（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）「Ａｇ（＋）」、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加の順に示した各リン酸化タンパク質の検出結果である。「Ｌｙｎ」と「ｐ−Ｌｙｎ」、「Ｓｙｋ」と「ｐ−Ｓｙｋ」、「ｃＰＬＡ2」と「ｐ−ｃＰＬＡ2」、「Ａｋｔ」と「ｐ−Ａｋｔ」、そして「ＰＬＣγ１，ＰＬＣγ２」の結果から、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加した細胞について、主にＬｙｎ、Ｓｙｋ、ＰＬＣγ１，ＰＬＣγ２のリン酸化を強く抑制することが判明した。従って、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、アレルギー反応の作用機序におけるシグナル伝達系の上流に作用しているといえる（図２参照）。
【００７０】
〈７．血管透過性亢進抑制作用〉
これまで述べたｉｎ ｖｉｔｒｏの系において、発明者は、本発明のアズキ由来抽出物（ＥｔＥｘ．４０）はアレルギー反応の抑制に有効であることを確信した。そこで、発明者は、次に述べるｉｎ ｖｉｖｏの系においても効果を検証することとした。ＰＣＡ反応（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）はＩ型アレルギー症状のひとつである血管透過性の亢進を測定する試験法である。エバンスブルー生理食塩水、ＩｇＥ−ＤＮＰ、及びＤＮＰ−ＢＳＡ抗原をマウスの尾静脈から投与し、ＤＮＰ抗原刺激によりアレルギー反応を誘導した。１時間後、麻酔により致死させ、皮膚を剥離した。
【００７１】
図１３及び図１４は、陰性対照〔Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ〕、陽性対照〔Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ〕、アズキの煮汁粉末〔ＨＷＥＡ（マウス体重当たり、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ）〕、アズキ由来抽出物〔ＥｔＥｘ．４０（マウス体重当たり、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ）〕、及び甜茶抽出物〔Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．（マウス体重当たり、１０００ｍｇ／ｋｇ）〕の結果である。アズキの煮汁粉末とは、アズキを熱湯で茹でた際の煮汁の乾燥物である。アズキの煮汁粉末、アズキ由来抽出物、甜茶抽出物については、抗原刺激に先立ってマウスの尾静脈から投与して剥離したマウスの皮膚写真の結果である。各投与物について、３匹のマウスを用意して実験に供した。
【００７２】
図面では白黒で表現されるため、投与物毎の相違を読みとりにくくなっている。陰性対照はＩ型アレルギー反応の発現なしであるため、最も白い状態である。これに対し、陽性対照はＩ型アレルギー反応の発現状態である。アレルギー反応により毛細血管が拡張してエバンスブルーが染み出すため皮膚全体に青みを帯びる。図の写真では濃さが増す。従って、各投与物を投与した後のエバンスブルーの染み出しの程度（すなわち皮膚の濃さ）が陽性対照よりも低くなれば抗アレルギー性を発揮していることになる。結果、図示のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の抗アレルギー性能が優れており、その内、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇの濃度の投与物が顕著である。
【００７３】
図１３及び図１４の染色の結果を踏まえ、剥離した皮膚より色素分を抽出し、吸光光度計により７２０ｎｍの吸光度を測定した。こうして、静脈注射後のマウスにおける血管透過亢進抑制作用を数値化して評価した。その結果は図１５のグラフであり、前掲の図１３及び図１４の写真の結果と一致した。アズキ煮汁粉末と甜茶抽出物は概ね同程度の血管透過性亢進抑制作用を示した。低濃度のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０もこれらと同程度の効果を示した。しかし、５００ｍｇ／ｋｇ濃度のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の場合、いずれの投与例よりも顕著に血管透過性亢進抑制作用を示した。
【００７４】
これまでの結果並びにｉｎ ｖｉｖｏの系においても本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物が抗アレルギー活性を具備する知見を得た。そして、発明者は、既存品よりも高い効能を発揮すると考えられるアズキ由来の抗アレルギー剤を得ることができた。また、血管透過性亢進抑制作用の実験を踏まえ、本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は、Ｉ型アレルギー反応を抑制する活性に優れていることも明らかにした。
【００７５】
［食品への応用］
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は抗アレルギー剤として有効に作用すると考えられる。このため、当該アズキ由来抽出物（抗アレルギー剤）を個々の食品に配合して、実際に調理、製造した。以下に、食品・飲料の名称、そのレシピ（組成）：左欄、及び配合割合（重量パーセント表記）：右欄を開示する。
【００７６】
〈１．水ようかん〉
寒天 ０．４０
水 ４５．３５
砂糖 ２７．００
小倉生あん ２７．００
食塩 ０．１０
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７７】
〈２．ようかん〉
寒天 ０．６５
水 ２４．００
砂糖 ２４．００
小倉生あん ４８．００
水あめ ３．２０
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７８】
〈３．小倉あん〉
アズキ ３１．００
砂糖 ３５．８０
食塩 ０．０５
水 ３３．００
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７９】
〈４．どら焼き〉
薄力粉 ２０．２０
上白糖 １７．００
全卵 １７．５０
はちみつ ２．５０
重曹 ０．２０
水 １２．４５
アズキ由来抽出物 ０．１５
小倉あん ３０．００
（合計） １００．００
【００８０】
〈５．小豆のムース〉
こしあん ３１．００
粉ゼラチン １．４０
生クリーム １４．２０
卵白 １０．５０
砂糖 ４．３０
水 ３８．４５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８１】
〈６．アイスクリーム〉
卵黄 １１．００
グラニュー糖 １７．８０
牛乳 ５３．２０
生クリーム １７．８０
バニラ香料 ０．０５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８２】
〈７．キャンデー〉
水あめ ４５．００
砂糖 ５４．７５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８３】
〈８．キャラメル〉
水あめ ３４．５０
砂糖 １９．７０
小麦粉 ４．８５
無糖練乳 ３４．６０
食塩 ０．２０
ショートニング ５．９０
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００８４】
〈９．カスタードプディング〉
牛乳 ５８．９０
卵 ２４．００
砂糖 １７．００
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８５】
〈１０．コーヒーゼリー〉
コーヒー（液体） ８２．９０
砂糖 ８．３０
粉ゼラチン １．４０
コーヒーリキュール ０．３０
水 ７．００
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８６】
〈１１．グミ〉
グラニュー糖 ３９．００
水 ５１．８５
ゼラチン ６．８０
クエン酸 ０．５０
フルーツ香料 １．６０
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００８７】
〈１２．ババロア〉
牛乳 ４７．４０
生クリーム １９．００
卵黄 １２．６０
砂糖 １９．００
ゼラチン １．９０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８８】
〈１３．マシュマロ〉
水あめ ４６．３０
砂糖 ５０．９０
ゼラチン ２．７０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８９】
〈１４．カステラ〉
全卵 ３４．３０
卵黄 ３．８０
砂糖 ３４．３０
はちみつ ４．８０
米飴 １．９０
薄力粉 １８．００
水 ２．８０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９０】
〈１５．ホットケーキ〉
卵 １９．７０
砂糖 １３．４０
牛乳 ２３．４０
ベーキングパウダー １．８０
薄力粉 ３６．００
バター ５．４０
食塩 ０．１５
バニラ香料 ０．０５
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９１】
〈１６．クッキー〉
マーガリン １２．２０
ショートニング １２．２０
砂糖 １８．４０
全卵 ８．２０
薄力粉 ４４．８０
強力粉 ４．１０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９２】
〈１７．フルーツジュース〉
フルーツ果汁 ５０．００
果糖ブドウ糖液糖 １０．００
クエン酸 ０．３０
フルーツ香料 ０．２０
水 ３９．２５
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００９３】
〈１８．炭酸飲料〉
果糖ブドウ糖液糖 １１．００
クエン酸 ０．２０
クエン酸ナトリウム ０．０５
フルーツ香料 ０．２０
炭酸水 ８８．４５
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９４】
〈１９．錠剤〉
セルロース ３０．００
ステアリン酸カルシウム ２．５０
二酸化ケイ素 １．５０
アズキ粉末 ５９．４０
デンプン ６．５０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９５】
この結果から理解できるように、本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（抗アレルギー剤）は、広汎な食品種に添加することができるため、通常の食事からの摂取が可能となる。従って、日常生活の質（ＱＯＬ）の改善への効果が期待できる。なお、列記の食品、飲料は例示である。本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（抗アレルギー剤）の添加対象は、当然これら以外の食品、飲料、その他の薬剤にも広げることができる。また、配合割合も開示の量に限定されることはなく、必要により加減できる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
アズキ煮汁に由来するエタノール水溶液の抽出物が抗アレルギー活性を有することを明らかにした。そこで、アズキ由来抗アレルギー剤を得るに至った。特に、Ｉ型のアレルギー反応の軽減に効果を発揮する抗アレルギー剤として有用である。さらに、当該抗アレルギー剤を添加した食品を作り出すことにより、日常生活から無理なく摂取することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アズキ由来抗アレルギー剤及びこれを含有する食品に関し、特に、アズキの熱水抽出物に由来する抗アレルギー剤であり、当該抗アレルギー剤を添加した食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー疾患の代表的な症状は、スギやヒノキ等の花粉に起因するアレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等である。現状、これらの治療、症状改善においては、抗ヒスタミン薬等のメディエーター遊離抑制剤、抗トロンボキサン薬（ＴＸＡ２拮抗剤、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤）、ロイコトリエン拮抗剤（ＲＴｓ拮抗剤）、Ｔｈ２サイトカイン阻害剤等が処方されている。前記の医薬品は症状改善に一定の効果を上げるものの、全身の倦怠感を引き起こす等の副作用も存在する。
【０００３】
そこで、近年、天然物由来成分をアレルギー疾患の症状改善に役立てようとする試みが数多く報告されている。例えば、甜茶（Ｒｕｂｕｓ ｓｕａｖｉｓｓｉｍｓ Ｓ．Ｌｅｅ）の抽出物を成分とする抗アレルギー剤（特許文献１、２等）がある。他に、杉（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｄ．Ｄｏｎ）の葉の抽出物（特許文献３）、「べにふうき」や「べにふじ」等の緑茶葉から抽出したカテキン類の抗アレルギー剤（特許文献４等）がある。これらの天然物を日常生活において積極的に摂取して比較的副作用を抑えながら、アレルギー反応の抑制、軽減に役立てようとする試みである。
【０００４】
前述の経緯とは別に、発明者は、以前からアズキに着目して各種の研究を行ってきた。アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、主に煮沸（炊きあげ）による加熱により軟らかく加工され、赤飯等の料理の食材、あるいは、砂糖が加えられ「小倉あん」等の製菓用食材に加工される。アズキの加工に際し、アズキの煮汁が大量に生じる。アズキの煮汁には、ポリフェノール類、サポニン類、アントシアニン類、さらには糖分子と結合した配糖体等も含有されていることが知られている。しかし、現状、利用されることなくそのまま廃棄されることが多い。
【０００５】
アズキの煮汁に着目し、この中に含まれる生理活性成分についての有効活用として、以下の研究が報告されている。例えば、アズキの煮汁から得られる配糖体については、抗腫瘍活性が報告されている（特許文献５、非特許文献１、２等参照）。また、アズキの煮汁のアルコール抽出物の生理作用については、血糖降下活性、細胞接着阻害、高脂血症予防等の効果が報告されている（非特許文献３、４、５、６等参照）。
【０００６】
そして、アズキに含まれる成分に関して抗アレルギーの生理活性効果について鋭意研究を重ねた発明者は、アレルギー疾患にもアズキに含まれる成分が有用である知見を得るに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２７００９５８号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６３１号公報
【特許文献３】特開２００７−２５４３２２号公報
【特許文献４】特許第４２７２６９１号公報
【特許文献５】特開２００３−６３９６７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】伊藤智広他、日本食品科学工学誌 第４９巻，第５号，ｐ．３３９−３４４（２００２年５月）
【非特許文献２】伊藤智広他、日本栄養・食料学会誌 第５８巻，第５号，ｐ．２８１−２８７（２００５年）
【非特許文献３】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（１２），２４２１−２４２６（２００４）
【非特許文献４】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（３），４４８−４５４（２００５）
【非特許文献５】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，１３４−１４１（２００９）
【非特許文献６】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，３１８−３２１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の点に鑑みなされたものであり、アズキの未利用な有効成分に着目し、新規かつ既存の抗アレルギー薬よりも高い薬効を備えたアズキ由来抗アレルギー剤、及びこれを含有する食品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、請求項１の発明は、アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１１】
請求項２の発明は、前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１２】
請求項３の発明は、前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する請求項１または２に記載のアズキ由来抗アレルギー剤に係る。
【００１３】
請求項４の発明は、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤含有食品に係る。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、アズキを熱湯で煮沸することで生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したため、これまで廃棄されていたアズキの未利用な有効成分に着目し、新規のアズキ由来抗アレルギー剤を得ることができた。
【００１５】
請求項２の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、請求項１の発明において、前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液であるため、既存の抗アレルギー薬よりも高い薬効を備えたアズキ由来抗アレルギー剤を得ることができた。
【００１６】
請求項３の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤によると、請求項１または２の発明において、前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈するため、Ｉ型アレルギーの症状改善に貢献できる。
【００１７】
請求項４の発明に係るアズキ由来抗アレルギー剤含有食品によると、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したため、日常的な食事から抗アレルギー剤を摂取することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のアズキ由来抗アレルギー剤を得る概略工程図である。
【図２】細胞内シグナル伝達モデルの模式図である。
【図３】４種類のアズキ煮汁由来抽出物の脱顆粒反応抑制率のグラフである。
【図４】アズキ煮汁由来抽出物、甜茶抽出物、及びクロモグリク酸ナトリウムの脱顆粒反応抑制率のグラフである。
【図５】アズキ由来抽出物に関する細胞内カルシウムイオン濃度のグラフである。
【図６】クロモグリク酸ナトリウムに関する細胞内カルシウムイオン濃度のグラフである。
【図７】アズキ由来抽出物添加後の細胞内ＲＯＳ産生のグラフである。
【図８】ＤＰＩ添加後の細胞内ＲＯＳ産生のグラフである。
【図９】細胞膜画分及び細胞質画分のタンパク質のウエスタンブロットの比較写真である。
【図１０】抗酸化活性を示したグラフである。
【図１１】抗原刺激の有無とアズキ由来抽出物添加の各リン酸化タンパク質の第１検出泳動写真である。
【図１２】抗原刺激の有無とアズキ由来抽出物添加の各リン酸化タンパク質の第２検出泳動写真である。
【図１３】陰性対照、陽性対照、及びアズキの煮汁粉末を投与してＰＣＡ反応を行ったマウスの剥離皮膚の写真である。
【図１４】アズキ由来抽出物及び甜茶抽出物を投与してＰＣＡ反応を行ったマウスの剥離皮膚の写真である。
【図１５】図１３及び図１４のマウスにおける血管透過亢進抑制作用を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤について、図１の概略工程図を用い、これを得る過程を説明する。はじめに、アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、蒸煮釜等において９０℃〜９５℃の熱湯中で、２０分〜６０分間煮沸（炊きあげ）される。当該加熱後、アズキと湯（煮汁）は分離される。アズキについては砂糖等が添加され小倉あんに加工される。
【００２０】
アズキを煮沸した際に生じる煮汁は室温に冷まされ、煮汁は上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）と沈殿物（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に分けられる。煮汁の分離には、フィルター濾過の他、後述の実施例の条件による遠心分離も用いられる。
【００２１】
煮汁の上清中には、各種の熱水可溶性成分が含まれている。そこで、上清内の成分の濃縮と溶出分離のため、上清はいったん合成吸着剤に吸着される。合成吸着剤は適宜の樹脂製カラム、樹脂ビーズ等である。後記の実施例では、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂からなる細孔を備えた粒径０．２５ｍｍ以上のビーズを用いた。
【００２２】
上清中の各種成分を吸着している合成吸着剤に対してエタノールの水溶液が添加、送通される。そして、合成吸着剤に吸着されているアズキの抽出物は溶出される。このように、アズキの煮沸、上清分離、吸着、溶出の過程を経ることにより得られる成分が、本発明に規定するアズキ由来抗アレルギー剤である。エタノール水溶液中に存在する溶出分の有無は、所定の波長（２８０ｎｍ）の吸光度を確認することにより容易に把握することができる。
【００２３】
エタノール水溶液は、全量水の状態から徐々にエタノール濃度が連続的に高められる濃度勾配（グラジエント）の溶液（ｖ／ｖ％）として調製され、前記の抽出物の溶出に供される。実施例において、エタノール水溶液の濃度（ｖ／ｖ％）は、当初の０％から、１０％ないし４０％濃度の溶液、４０％ないし６０％濃度の溶液、６０％ないし８０％濃度の溶液の４種類としている。濃度勾配を形成する精度上、概ね前記の濃度域毎に分けられる。なお、合成吸着剤を乾燥させると分離能が変動してしまうため、濃度の切り替えの際に必要量の水が送通される。
【００２４】
各エタノール水溶液濃度の溶出の画分（フラクション）から水分等を蒸発、乾燥することにより、エタノール水溶液の濃度毎に振り分けた抽出物を得ることができる。この抽出物がアズキ由来抗アレルギー剤である。前記の４種類のエタノール水溶液の濃度域にあっては、一様に抗アレルギー性を発現する。その中においても、１０％ないし４０％の濃度域のエタノール水溶液の抗アレルギー性の発現が顕著である。抽出物はアズキの煮汁由来の成分であるため、配糖体、色素成分、各種カテキン類等のポリフェノール成分が含まれていると想定される。従って、本発明のアズキ由来抗アレルギー剤とは、前記の配糖体等の成分をはじめ、複数の成分を含む混合物であると考えられる。
【００２５】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤とは、アレルギー症状の治療、緩和に有用と考えられる薬効成分である。加えて、日常生活の質（ＱＯＬ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の改善に効果を発揮するとされる薬効成分である。薬剤として用いる場合、経口投与の剤型は錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の適宜である。また、注射薬、点滴薬、スプレー薬、点鼻薬、点眼薬等とすることもできる。列記の薬剤においては、アズキ由来抗アレルギー剤を単独としても他の薬剤を加え併用しても良い。
【００２６】
ここで、アレルギーと症状について、その種類に応じて簡単に説明する。一般的にアレルギーは以下のＩ型からＩＶ型に分類される。
【００２７】
［Ｉ型アレルギー（即時型）］
ＩＬ−４等のシグナルによりＢ細胞から分泌されるＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）は、マスト細胞や好塩基球細胞の表面の受容体ＦｃεＲＩに結合する。ＩｇＥに各種のアレルゲン（抗原）が結合すると、マスト細胞や好塩基球細胞からヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン等のケミカルメディエーターが分泌される。前記の各種ケミカルメディエーターにより、血管拡張によるむくみや鼻炎、気管支収縮による喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の症状を引き起こす。食物アレルギー、アナフィラキシーショックの症状もＩ型アレルギーに含まれる。
【００２８】
［ＩＩ型アレルギー（細胞傷害型）］
自己の細胞が抗原として認識されることにより、この細胞に対するＩｇＧ、ＩｇＭ等の抗体が産生される。自己の細胞同士で抗原抗体反応の攻撃が起きてしまう反応である。症状として、自己免疫性溶液性貧血、橋本病、バセドウ病等がある。
【００２９】
［ＩＩＩ型アレルギー（アルサス型）］
可溶性抗原とＩｇＧとの反応により免疫複合体が形成される。この免疫複合体による組織傷害に起因した反応である。症状として、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等がある。
【００３０】
［ＩＶ型アレルギー（遅延型）］
Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞の活性化によりＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５等のサイトカインが産性され、マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞により異物が処理される際の反応がある。症状として、アトピー性皮膚炎、ツベルクリン反応等がある。特に、Ｉ型アレルギーが進行した後のアトピー性皮膚炎の場合、炎症を悪化させやすい。
【００３１】
本発明のアズキ由来抗アレルギー剤は、上記のアレルギー反応の抑制に効果を発揮すると考えられる。とりわけ、後記の実施例に開示する細胞内の作用機序から理解できるように、Ｉ型アレルギー反応を抑制する効果が高いと推察される。Ｉ型アレルギーは緊急性を要する重篤な症状を発症する他、喘息、鼻水、くしゃみ等の日常生活における不快感の原因となる症状も多い。そこで、日常的に抗アレルギー剤を摂取することにより、常時マスト細胞や好塩基球細胞等に感作して症状を緩和することができれば、生活の質の向上、生活習慣に起因する疾病の改善に大きく貢献する。
【００３２】
本発明の抗アレルギー剤は、天然物であり、古くから食用されているアズキに由来する抽出物である。そのことから、本発明のアズキ由来抗アレルギー剤は食品と馴染み良い。よって、新たにアズキ由来抗アレルギー剤を添加したアズキ由来抗アレルギー剤含有食品を作ることができる。
【００３３】
アズキ由来抗アレルギー剤（アズキ煮汁抽出物）を添加可能な食品は、具体的に、水ようかん、ようかん、小倉あん、どら焼き、アズキのムース、アイスクリーム、飴（キャンデー）、キャラメル、カスタードプディング、コーヒーゼリー、グミ、ババロア、マシュマロ、カステラ、ホットケーキ、クッキー、フルーツジュース、炭酸飲料等がある。さらにはサプリメントとなる錠剤等も挙げられる。
【００３４】
列記のアズキ由来抗アレルギー剤含有食品を製造するに際し、アズキ由来抗アレルギー剤の含有量は、当該食品自体の味覚及び添加後の味の変化、他の添加成分、１回当たりの喫食量、喫食頻度、季節性、販売形態、さらに年齢、性別、職種を加味した需要者層等を総合的に考慮して規定される。食品に添加するアズキ由来抗アレルギー剤の量は自由であり、例えば０．０１重量％ないし１００重量％（つまり、全量アズキ由来抗アレルギー剤とする食品）、１重量％ないし８０重量％としても良い。
【実施例】
【００３５】
発明者らは、次述の手法、手順に従い、アズキよりアズキ由来抗アレルギー剤を抽出した。そして、抗アレルギー剤の細胞内における作用機序の確認、並びに生体における発現を確認した。
【００３６】
［アズキ煮汁由来の抽出物の調製］
原料となるアズキに北海道十勝産の小豆を用いた。開放型の蒸煮釜にアズキを投入し、水から加熱して４５分間煮沸した。煮上がって軟らかくなったアズキとその煮汁と分けた。煮汁を室温付近（約２０℃）になるまで冷ました後、１６５００×ｇ（９０００ｒｐｍ）、１０分間の遠心分離をした。遠心分離より得た上清１ｋｇに芳香族系合成吸着剤（三菱化学株式会社製 逆相吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０」）３００ｇを加えて４℃で１２時間攪拌した。合成吸着剤とそれ以外の液に分けた後、合成吸着剤を蒸留水により洗浄し、さらに４０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）により数回溶出を行った。
【００３７】
前記の洗浄、溶出した合成吸着剤をカラム（内径５ｍｍ×全長３００ｍｍ）に充填した。当該合成吸着剤充填カラムを複数本用意した。合成吸着剤充填カラムに対し、はじめは蒸留水のみを送通し、次第にエタノールの割合を高めながら溶液を調製して送通した。本実施例では、当初の蒸留水のみの溶出から、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液とする４種類の濃度による溶出を行った。溶出に供したエタノールは濃度勾配（グラジエント）を伴う。このため、濃度を切り替えるに際し濃度に幅が不可避的に生じる。そこで、上記のとおり濃度域を持った溶出条件とした。
【００３８】
蒸留水のみの溶出、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液から得た画分（フラクション）のそれぞれについて、ロータリーエバポレーター（柴田科学株式会社製）を用い、画分中の水分等を蒸発、乾固した。こうして、溶出条件の異なる４種類のアズキ煮汁由来の抽出物を得た。以降の明細書、図面において、蒸留水のみの溶出から得た抽出物を「ＷＥｘ」、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．４０」、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．６０」、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．８０」として表記する。
【００３９】
［細胞内機序の検証］
４種類の異なるアズキ煮汁由来の抽出物を調製した発明者は、細胞内における抗アレルギー性能の発現の有無、細胞内の作用部位を明らかにすることにより、アズキ煮汁由来の抽出物の薬効性を確認した。以下、検証実験を順に述べる。
【００４０】
〈１．脱顆粒反応抑制作用〉
溶出条件の異なる４種類のアズキ煮汁由来の抽出物について、脱顆粒反応抑制作用を抗アレルギー性能の指標として測定した。併せて、既存の抗アレルギー作用を発揮する薬剤等との比較も試みた。脱顆粒反応抑制作用は、図２に開示の好塩基球細胞等の細胞内シグナル伝達モデルの模式図における脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）に伴い、ケミカルメディエーター（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ）となるβ−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の分泌抑制効果を指標として用いた。
【００４１】
ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ添加のＭＥＭ培地に懸濁した。同培地にマウスモノクローナル抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体）を２００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間、前記のラット細胞を抗体で感作した。培養終了後、培地を吸引除去してシラガニアン緩衝液により２回洗浄し、同緩衝液１６０μＬに置換した。
【００４２】
添加用の薬液の調製に際し、はじめに、４種類のアズキ煮汁由来の抽出物であるＷＥｘ、ＥｔＥｘ．４０、ＥｔＥｘ．６０、及びＥｔＥｘ．８０と、比較として甜茶抽出物（以降、Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．と称する。）をそれぞれジメチルスルホキシド（以降、ＤＭＳＯと称する。）に溶解した。各抽出物を溶解したＤＭＳＯの最終濃度を０．１％以下とするまでシラガニアン緩衝液で希釈した。陽性対照としてＤＭＳＯのみをシラガニアン緩衝液で希釈した。また、抗アレルギー薬として用いる薬剤として、医薬品名「インタール」、分子名「クロモグリク酸ナトリウム：ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ」（以降、Ｄｓｃｇと称する。）を用い、このＤｓｃｇもＤＭＳＯに溶解し、抽出物の場合と同様にシラガニアン緩衝液で希釈した。
【００４３】
緩衝液による希釈を経た各濃度のアズキ煮汁由来の抽出物、甜茶抽出物、陽性対照、Ｄｓｃｇの薬液２０μＬずつを抗体感作後のラット細胞の培養液に添加し、３７℃で３０分間培養した。続いてジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）を２０μＬ添加し、３７℃で３０分間抗原刺激を行った。その後、氷冷下、１０分間静置し反応を止めた。各培地より上清を１０μＬずつ分取するとともに９６穴のプレートに移し替えた。プレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド（ｐ−ＮＡＧ）溶液を５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間発色させた。反応終了後、反応停止液を２００μＬ添加し、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍにおける吸光度“Ａ”を測定した。
【００４４】
前出の陽性対照も同様に処理し、吸光度“Ｂ”を求めた。また、前記のＤＮＰ−ＢＳＡの代わりにシラガニアン緩衝液のみの添加とした抗原刺激がない陰性対照の吸光度“Ｃ”も求めた。各吸光度に基づいて下記の式（ｉ）によりβ−ヘキソサミニダーゼの遊離抑制率（Ｐi）（単位：％）を求めた。
【００４５】
【数１】
【００４６】
さらに、試料によるβ−ヘキソサミニダーゼの直接的な阻害活性を算出した。そこで、ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３より調製したβ−ヘキソサミニダーゼ酵素液と、脱顆粒反応測定の際に使用した試料溶液から、下記の式（ｉｉ）により酵素直接阻害活性率（Ｑi）（単位：％）を求めた。試料処理による吸光度は“Ｄ”、陽性対照の吸光度は“Ｅ”である。両式（ｉ）及び（ｉｉ）より求めた酵素直接阻害活性率（Ｅi）と遊離抑制率（Ｆi）より、式（ｉｉｉ）に従い脱顆粒反応抑制率（Ｒi）（単位：％）を求めた。
【００４７】
【数２】
【００４８】
【数３】
【００４９】
図３のグラフは、４種類のアズキ煮汁由来の抽出物であるＷＥｘ、ＥｔＥｘ．４０、ＥｔＥｘ．６０、及びＥｔＥｘ．８０に関する脱顆粒反応抑制率（％）の結果である。同グラフ中の単位の５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬは、実験に供した培地中の濃度である。この結果より、いずれの溶出条件においても、脱顆粒反応の抑制が明らかとなった。また、反応活性は濃度依存的である。この中においても、ＥｔＥｘ．４０、つまり、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得たアズキ煮汁由来の抽出物が最も高い活性を有していることが明らかとなった。
【００５０】
図４のグラフは、アズキ煮汁由来抽出物のＥｔＥｘ．４０と、甜茶抽出物（Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．）及びクロモグリク酸ナトリウム（Ｄｓｃｇ）の脱顆粒反応抑制率（％）の比較結果である。同グラフ中の単位の５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬは、実験に供した培地中の濃度である。この結果は、アズキ由来抽出物（ＥｔＥｘ．４０）の抑制効果が既存の天然物抽出物や医薬品よりも優れていることを示す。
【００５１】
〈２．細胞内カルシウムイオン濃度の変動〉
Ｉ型アレルギーにおける脱顆粒反応には、カルシウムイオン（Ｃａ2+）の流入による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が関与すると考えられている。図２の模式図に示すように、活性酸素種（Ｈ2Ｏ2等）よりカルシウムイオンチャンネルが開き、細胞外から細胞内はカルシウムイオンが流入する経路と、ＩＰ３を介してのシグナル伝達から小胞体ＥＲよりカルシウムイオンが放出される経路が現在知られている。そこで、発明者は、脱顆粒反応抑制効果が最も高いアズキの煮汁に由来する抽出物である「ＥｔＥｘ．４０」に着目して、カルシウムイオンの流入に及ぼす影響を検証した。
【００５２】
細胞内カルシウム濃度は、株式会社同仁化学研究所製「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ−Ｆｌｕｏ ３」を使用して測定した。９６穴マイクロプレートにＩｇＥ感染処理のＲＢＬ−２Ｈ３細胞を播種し、各ウェルに３μＭの蛍光指示薬Ｆｌｕｏ３−ＡＭを含むＬｏａｄｉｎｇ緩衝液１００μＬを添加し、３７℃で３０分間かけて蛍光指示薬を取り込ませた。３０分後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））により２回洗浄して余分な蛍光指示薬を洗い流した。洗浄後、Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ緩衝液を８０μＬと、前記のＤＭＳＯ及びシラガニアン緩衝液で希釈調製を経たアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、または前記のＤＭＳＯ及びシラガニアン緩衝液で希釈調製を経た対照薬剤のＤｓｃｇのそれぞれを１０μＬずつ添加し、３０分間処理した。
【００５３】
処理後のマイクロプレートを蛍光測定用のマイクロプレートリーダーに装着し、抗原としてＤＮＰ−ＢＳＡを１０μＬ添加して反応を開始させた。３７℃を維持しながら５秒毎に、４分間の蛍光指示薬による蛍光強度を測定した。アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０に関する細胞内カルシウムイオン濃度の推移結果は図５であり、対照薬剤Ｄｓｃｇの推移結果は図６である。両グラフ中のエチレングリコールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）はカルシウムイオンを捕捉するキレート剤であり、比較のために用いた。
【００５４】
図５について、黒丸でプロットの折れ線のカルシウムイオン濃度は、抗原刺激（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）を伴う反応である（グラフ中、Ａｇ（＋））。白丸でプロットの折れ線は抗原刺激を伴わない反応である（グラフ中、Ａｇ（−））。黒三角でプロットの折れ線はＥＧＴＡを添加して抗原刺激を行った反応である。自明ながらカルシウムイオンはキレートされるため、黒丸の折れ線よりも低量である。次に、黒四角でプロットの折れ線はアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加して抗原刺激を行った反応である。ＥｔＥｘ．４０の添加は、細胞内カルシウムイオン濃度の抑制効果を発揮する。さらに、ＥｔＥｘ．４０は、抗原刺激がない状態、あるいはＥＧＴＡ添加と比較して細胞内カルシウムイオン濃度を低位側に維持する。
【００５５】
対照となる図６について、黒丸、白丸、黒三角のプロットの折れ線は図５と同様の処理を施した結果である。黒四角でプロットの折れ線はＤｓｃｇを添加して抗原刺激を行った反応である。Ｄｓｃｇは抗原刺激があった状態よりはカルシウムイオン濃度の増加を抑制しているものの、カルシウムイオン濃度の増加阻害活性は弱いといえる。両図の結果を踏まえると、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、細胞内カルシウムイオンの増加抑制に極めて強い活性を発現している。
【００５６】
〈３．細胞内ＲＯＳ産生抑制〉
生体内では、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種である「ＲＯＳ」が常時産生されている。白血球、特に好中球によるＲＯＳの産生量は顕著である。ＲＯＳは殺菌、異物除去等の免疫応答の誘導等のシグナル伝達物質となることが知られている。また、ＲＯＳは前述の細胞内カルシウムイオン濃度の増加を誘導し、これに関連して脱顆粒反応を起こすと考えられている。例えば、図２の模式図に示すＨ2Ｏ2等のＲＯＳによるカルシウムイオンチャンネルの開放、カルシウムイオンの流入の経路が挙げられる。前掲「２．細胞内カルシウムイオン濃度の変動」における結果から判明した細胞内カルシウムイオンの増加抑制活性を踏まえ、ＲＯＳの濃度の測定を検討した。そこで、活性酸素種を特異的に検出するＤＣＦ蛍光指示薬を用いて抗原刺激後の細胞内のＲＯＳ濃度の測定を試みた。
【００５７】
膜透過性プローブである２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ（以降、ＤＣＦＨ−ＤＡと称する。）は細胞外から細胞内へ移行し、細胞質中のエステラーゼにより加水分解されて２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以降、ＤＣＦＨと称する。）に変化する。ＤＣＦＨは膜透過性を失うため細胞内に留まる。ＤＣＦＨは過酸化水素（図２中、Ｈ2Ｏ2参照）等の細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）と反応し、酸化されて２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以降、ＤＣＦと称する。）となる。ＤＣＦは蛍光を発するため、ＤＣＦＨ−ＤＡを投与した細胞のＤＣＦ蛍光強度を測定することにより、細胞内の酸化状態（ＲＯＳの量）を定量化することができる。当該細胞内に抗酸化性の物質が存在すると、ＤＣＦの酸化は抑制され、蛍光強度の低減により被験物質の細胞内での抗酸化活性を評価できる。
【００５８】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を培養し、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ蛍光色素で３０分間処理して細胞内に取り込ませた。３０分後、細胞内に取り込まれなかった蛍光色素をＰＢＳ（−）により洗浄後、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤であるｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以降、ＤＰＩと称する。）、陽性対照、陰性対照のそれぞれについて、前述の「１．脱顆粒反応抑制作用」の処理と同様に処理した。抗原処理後、１分間隔で１０分間経時的に蛍光強度を測定した。
【００５９】
図７のグラフはアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加後の推移を示し、黒四角でプロットの折れ線はアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加して抗原刺激を行った際の経時変化である。図８のグラフはＤＰＩ投与後の推移を示し、黒四角でプロットの折れ線はＤＰＩを添加して抗原刺激を行った際の経時変化である。両グラフとも、黒丸でプロットの折れ線は、抗原刺激（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）を伴う反応である（グラフ中、Ａｇ（＋））。白丸でプロットの折れ線は抗原刺激を伴わない反応である（グラフ中、Ａｇ（−））。
【００６０】
図示のとおり、ＤＰＩの細胞内ＲＯＳ産生抑制の効果は、陽性対照と比較して明らかである。その上で、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０はＤＰＩよりもＲＯＳ産生を有意に抑制することが判明した。また、陰性対照よりもＲＯＳ産生を抑制することも明らかとなった。
【００６１】
〈４．ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害活性〉
細胞内へのカルシウムイオンの流入を調節するカルシウムチャンネルは細胞膜に存在する。このカルシウムチャンネルは細胞内のＲＯＳ（前記参照）により調節される。マスト細胞における抗原刺激後の細胞内ＲＯＳ産生にＮＡＤＰＨオキシダーゼ（以降、ＮＯＸと称する。）が関与することが報告されている。ＮＯＸの活性化を図２の模式図を用いて簡単に説明する。はじめに、Ｒａｃは細胞質に存在するサブユニットｐ４０phox、ｐ４７phox、ｐ６７phoxと結合して四量体を形成する。次に、この四量体が細胞膜サブユニットｇｐ９１phox、ｐ２２phox側へ移行することによりＲＯＳは産生される。そこで、膜画分及び細胞質画分を調べることにより、ＮＯＸの活性をサブユニットの移行の結果として把握することができる。
【００６２】
膜画分及び細胞質画分の分離に際し、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製のＰｒｏｔｅｏ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｃｏｄｅ３５３７９０）を用い調製した。図９は細胞膜画分及び細胞質画分のタンパク質のウエスタンブロットの写真である。左から、陰性対照となる抗原刺激なし「Ａｇ（−）」、陽性対照となる抗原刺激あり（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）「Ａｇ（＋）」、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加の順である。
【００６３】
抗原刺激あり（Ａｇ（＋））にあっては、ｐ４０phox、ｐ６７phox、ｐ４７phox、及びＲａｃは細胞膜側から検出できたため、膜側への移行が明らかである。これに対し、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加では、細胞膜側からｐ６７phox及びＲａｃはほとんど検出されない。従って、細胞質に存在するサブユニット（ｐ４０phox、ｐ４７phox、ｐ６７phox、及びＲａｃ）の一括での膜側への移行抑制を確認することができた。
【００６４】
〈５．抗酸化活性〉
細胞内ＲＯＳ濃度は、添加した試料自体の抗酸化活性により低下することも推測される。そこで、試料自体の抗酸化活性を明らかにする必要がある。ラジカル発生剤として汎用される２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（以降、ＤＰＰＨと称する。）におけるラジカル補足能により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで各試料のラジカル消去能を測定した。ＤＰＰＨはラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を有する。抗酸化物質により還元されることにより、５１７ｎｍの吸光度は低下する。吸光度の低下を測定することにより、試料（化合物）の抗酸化活性を測定できる。
【００６５】
ＤＰＰＨを５０％エタノール水溶液に溶解して２５０μＭの溶液に調製し、０．２２μｍのフィルターにより濾過し不溶物を除去し使用に供した。試料として、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０、ビタミンＣ（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ビタミンＥ（α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、換算用にｔｒｏｌｏｘを用い、これらをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、５０％エタノールにより希釈した。９６穴マイクロプレートに２０μＬずつ前記の試料溶液を分注した。ここにＤＰＰＨ溶液を１８０μＬ添加し、室温下で２０分間反応させた。反応後、５１７ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
図１０のグラフは、各濃度のアズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０（黒丸のプロット）、ビタミンＣ（黒三角のプロット）、ビタミンＥ（黒四角のプロット）のＤＰＰＨラジカル捕捉能の結果である。アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、ビタミンＣ、Ｅの３倍以上の高い抗酸化活性を示している。これまでの知見から、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０が作用する細胞内ＲＯＳ産生の抑制とは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害活性と抗酸化活性の双方に起因すると推測される。
【００６７】
〈６．リン酸化タンパク質の定量比較〉
図２の模式図から理解されるように、脱顆粒反応の上流では各種タンパク質のリン酸化が生じ、サイトカイン遺伝子の発現、アラキドン酸カスケード等の要因となっていることが明らかになりつつある。そこで、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０が実際にリン酸化の抑制に作用するか否かを調べた。
【００６８】
前述の「１．脱顆粒反応抑制作用」と同様に、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０の処理、抗原刺激を行った細胞を用意した。細胞抽出物の調製に際し、細胞を氷冷ＰＢＳ（−）により２回洗浄した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｌｏｒａｔｅ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳを含有する緩衝液を調製し、同緩衝液により氷上で超音波ホモジェナイズした。溶解物を４℃で２００００×ｇ（１４５００ｒｐｍ）、３分間遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として使用した。個々の細胞抽出物について、ＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）によりタンパク質濃度を測定し、等濃度となるように希釈した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロッキングし、各種抗体でプローブした。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体を反応させ、ＥＣＬ法（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ法）を用いて発色させた。
【００６９】
図１１及び図１２の泳動写真は、陰性対照となる抗原刺激なし「Ａｇ（−）」、陽性対照となる抗原刺激あり（ＤＮＰ−ＢＳＡ投与）「Ａｇ（＋）」、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０添加の順に示した各リン酸化タンパク質の検出結果である。「Ｌｙｎ」と「ｐ−Ｌｙｎ」、「Ｓｙｋ」と「ｐ−Ｓｙｋ」、「ｃＰＬＡ2」と「ｐ−ｃＰＬＡ2」、「Ａｋｔ」と「ｐ−Ａｋｔ」、そして「ＰＬＣγ１，ＰＬＣγ２」の結果から、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０を添加した細胞について、主にＬｙｎ、Ｓｙｋ、ＰＬＣγ１，ＰＬＣγ２のリン酸化を強く抑制することが判明した。従って、アズキ由来抽出物のＥｔＥｘ．４０は、アレルギー反応の作用機序におけるシグナル伝達系の上流に作用しているといえる（図２参照）。
【００７０】
〈７．血管透過性亢進抑制作用〉
これまで述べたｉｎ ｖｉｔｒｏの系において、発明者は、本発明のアズキ由来抽出物（ＥｔＥｘ．４０）はアレルギー反応の抑制に有効であることを確信した。そこで、発明者は、次に述べるｉｎ ｖｉｖｏの系においても効果を検証することとした。ＰＣＡ反応（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）はＩ型アレルギー症状のひとつである血管透過性の亢進を測定する試験法である。エバンスブルー生理食塩水、ＩｇＥ−ＤＮＰ、及びＤＮＰ−ＢＳＡ抗原をマウスの尾静脈から投与し、ＤＮＰ抗原刺激によりアレルギー反応を誘導した。１時間後、麻酔により致死させ、皮膚を剥離した。
【００７１】
図１３及び図１４は、陰性対照〔Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ〕、陽性対照〔Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ〕、アズキの煮汁粉末〔ＨＷＥＡ（マウス体重当たり、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ）〕、アズキ由来抽出物〔ＥｔＥｘ．４０（マウス体重当たり、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ）〕、及び甜茶抽出物〔Ｒｕｂｕｓ ｅｘｔ．（マウス体重当たり、１０００ｍｇ／ｋｇ）〕の結果である。アズキの煮汁粉末とは、アズキを熱湯で茹でた際の煮汁の乾燥物である。アズキの煮汁粉末、アズキ由来抽出物、甜茶抽出物については、抗原刺激に先立ってマウスの尾静脈から投与して剥離したマウスの皮膚写真の結果である。各投与物について、３匹のマウスを用意して実験に供した。
【００７２】
図面では白黒で表現されるため、投与物毎の相違を読みとりにくくなっている。陰性対照はＩ型アレルギー反応の発現なしであるため、最も白い状態である。これに対し、陽性対照はＩ型アレルギー反応の発現状態である。アレルギー反応により毛細血管が拡張してエバンスブルーが染み出すため皮膚全体に青みを帯びる。図の写真では濃さが増す。従って、各投与物を投与した後のエバンスブルーの染み出しの程度（すなわち皮膚の濃さ）が陽性対照よりも低くなれば抗アレルギー性を発揮していることになる。結果、図示のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の抗アレルギー性能が優れており、その内、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇの濃度の投与物が顕著である。
【００７３】
図１３及び図１４の染色の結果を踏まえ、剥離した皮膚より色素分を抽出し、吸光光度計により７２０ｎｍの吸光度を測定した。こうして、静脈注射後のマウスにおける血管透過亢進抑制作用を数値化して評価した。その結果は図１５のグラフであり、前掲の図１３及び図１４の写真の結果と一致した。アズキ煮汁粉末と甜茶抽出物は概ね同程度の血管透過性亢進抑制作用を示した。低濃度のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０もこれらと同程度の効果を示した。しかし、５００ｍｇ／ｋｇ濃度のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の場合、いずれの投与例よりも顕著に血管透過性亢進抑制作用を示した。
【００７４】
これまでの結果並びにｉｎ ｖｉｖｏの系においても本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物が抗アレルギー活性を具備する知見を得た。そして、発明者は、既存品よりも高い効能を発揮すると考えられるアズキ由来の抗アレルギー剤を得ることができた。また、血管透過性亢進抑制作用の実験を踏まえ、本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は、Ｉ型アレルギー反応を抑制する活性に優れていることも明らかにした。
【００７５】
［食品への応用］
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は抗アレルギー剤として有効に作用すると考えられる。このため、当該アズキ由来抽出物（抗アレルギー剤）を個々の食品に配合して、実際に調理、製造した。以下に、食品・飲料の名称、そのレシピ（組成）：左欄、及び配合割合（重量パーセント表記）：右欄を開示する。
【００７６】
〈１．水ようかん〉
寒天 ０．４０
水 ４５．３５
砂糖 ２７．００
小倉生あん ２７．００
食塩 ０．１０
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７７】
〈２．ようかん〉
寒天 ０．６５
水 ２４．００
砂糖 ２４．００
小倉生あん ４８．００
水あめ ３．２０
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７８】
〈３．小倉あん〉
アズキ ３１．００
砂糖 ３５．８０
食塩 ０．０５
水 ３３．００
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００７９】
〈４．どら焼き〉
薄力粉 ２０．２０
上白糖 １７．００
全卵 １７．５０
はちみつ ２．５０
重曹 ０．２０
水 １２．４５
アズキ由来抽出物 ０．１５
小倉あん ３０．００
（合計） １００．００
【００８０】
〈５．小豆のムース〉
こしあん ３１．００
粉ゼラチン １．４０
生クリーム １４．２０
卵白 １０．５０
砂糖 ４．３０
水 ３８．４５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８１】
〈６．アイスクリーム〉
卵黄 １１．００
グラニュー糖 １７．８０
牛乳 ５３．２０
生クリーム １７．８０
バニラ香料 ０．０５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８２】
〈７．キャンデー〉
水あめ ４５．００
砂糖 ５４．７５
アズキ由来抽出物 ０．１５
（合計） １００．００
【００８３】
〈８．キャラメル〉
水あめ ３４．５０
砂糖 １９．７０
小麦粉 ４．８５
無糖練乳 ３４．６０
食塩 ０．２０
ショートニング ５．９０
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００８４】
〈９．カスタードプディング〉
牛乳 ５８．９０
卵 ２４．００
砂糖 １７．００
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８５】
〈１０．コーヒーゼリー〉
コーヒー（液体） ８２．９０
砂糖 ８．３０
粉ゼラチン １．４０
コーヒーリキュール ０．３０
水 ７．００
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８６】
〈１１．グミ〉
グラニュー糖 ３９．００
水 ５１．８５
ゼラチン ６．８０
クエン酸 ０．５０
フルーツ香料 １．６０
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００８７】
〈１２．ババロア〉
牛乳 ４７．４０
生クリーム １９．００
卵黄 １２．６０
砂糖 １９．００
ゼラチン １．９０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８８】
〈１３．マシュマロ〉
水あめ ４６．３０
砂糖 ５０．９０
ゼラチン ２．７０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００８９】
〈１４．カステラ〉
全卵 ３４．３０
卵黄 ３．８０
砂糖 ３４．３０
はちみつ ４．８０
米飴 １．９０
薄力粉 １８．００
水 ２．８０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９０】
〈１５．ホットケーキ〉
卵 １９．７０
砂糖 １３．４０
牛乳 ２３．４０
ベーキングパウダー １．８０
薄力粉 ３６．００
バター ５．４０
食塩 ０．１５
バニラ香料 ０．０５
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９１】
〈１６．クッキー〉
マーガリン １２．２０
ショートニング １２．２０
砂糖 １８．４０
全卵 ８．２０
薄力粉 ４４．８０
強力粉 ４．１０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９２】
〈１７．フルーツジュース〉
フルーツ果汁 ５０．００
果糖ブドウ糖液糖 １０．００
クエン酸 ０．３０
フルーツ香料 ０．２０
水 ３９．２５
アズキ由来抽出物 ０．２５
（合計） １００．００
【００９３】
〈１８．炭酸飲料〉
果糖ブドウ糖液糖 １１．００
クエン酸 ０．２０
クエン酸ナトリウム ０．０５
フルーツ香料 ０．２０
炭酸水 ８８．４５
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９４】
〈１９．錠剤〉
セルロース ３０．００
ステアリン酸カルシウム ２．５０
二酸化ケイ素 １．５０
アズキ粉末 ５９．４０
デンプン ６．５０
アズキ由来抽出物 ０．１０
（合計） １００．００
【００９５】
この結果から理解できるように、本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（抗アレルギー剤）は、広汎な食品種に添加することができるため、通常の食事からの摂取が可能となる。従って、日常生活の質（ＱＯＬ）の改善への効果が期待できる。なお、列記の食品、飲料は例示である。本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（抗アレルギー剤）の添加対象は、当然これら以外の食品、飲料、その他の薬剤にも広げることができる。また、配合割合も開示の量に限定されることはなく、必要により加減できる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
アズキ煮汁に由来するエタノール水溶液の抽出物が抗アレルギー活性を有することを明らかにした。そこで、アズキ由来抗アレルギー剤を得るに至った。特に、Ｉ型のアレルギー反応の軽減に効果を発揮する抗アレルギー剤として有用である。さらに、当該抗アレルギー剤を添加した食品を作り出すことにより、日常生活から無理なく摂取することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項２】
前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項３】
前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する請求項１または２に記載のアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤含有食品。
【請求項１】
アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項２】
前記エタノール水溶液が、１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項３】
前記抽出物が、Ｉ型アレルギー反応に対する活性を呈する請求項１または２に記載のアズキ由来抗アレルギー剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来抗アレルギー剤を食品に添加したことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤含有食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１７８６８０（Ｐ２０１１−１７８６８０Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４２１００（Ｐ２０１０−４２１００）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（３９００１４９０４）井村屋グループ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（３９００１４９０４）井村屋グループ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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