アテローム性動脈硬化症の治療においてＣＥＨ活性を増強またはＡＣＡＴ活性を阻害するペプチド、それらのペプチドを含む薬学的組成物、およびそれらの使用方法
マクロファージ・コレステロールエステルヒドロラーゼ活性に対する効果を増強しかつ/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害する、哺乳類血清アミロイドAアイソフォーム2.1 (SAA2.1)の選択されたドメインのペプチドおよび模倣体、ならびにその化合物および組成物を提供する。これらの組成物を、アテローム性動脈硬化症ならびに冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療および/または予防に使用する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
コレステロールの貯蔵を阻害するのにならびに被験体において炎症部位またはアテローム性動脈硬化部位からのコレステロールの流動および放出を増強するのに有用なペプチドが同定された。本発明は単離ペプチド、より好ましくは化学的におよび組換え的に合成されたペプチドを含む合成ペプチド、化合物ならびにこれらのペプチドおよび化合物の模倣体、ならびに1つもしくは複数のこれらのペプチドもしくはその一部分、または化合物、あるいはこれらの模倣体を含む薬学的組成物、ならびにアテローム性動脈硬化症および炎症に加えてさらに冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療および/または予防にこれらのペプチドまたはその模倣体、化合物またはその模倣体および薬学的組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心疾患を含めて、心臓血管疾患は、北米では成人の死因の単独1位である(2002 Heart and Stroke Statistical Update)。冠状動脈におけるアテローム性動脈硬化の発生および進行は、心臓発作および狭心症を引き起こす可能性がある。1999年には、1260万人の米国人が冠状動脈性心疾患を抱えていると推定された。1999年の死因のおよそ5つに1つは冠状動脈性心疾患によるものとされており、米国およびカナダの全死亡数はそれぞれ500,000人および42,000人を超えていた。10,200万人を超える米国成人が高い危険性の境界域にある血中コレステロールレベル、または冠状動脈性心疾患を発症する危険性の高い血中コレステロールレベルを有するものと推定されている。心臓発作が我々の医療制度に及ぼす即時の社会的および経済的負担に加えて、冠状動脈性心疾患イベントの後遺症に付随する多大な費用もかかる。男性の約25％および女性の約38％が心臓発作から1年後に死亡しており、冠状動脈性心疾患による死亡は人の生産年齢ピークの間に起こる傾向がある(BRFSS [1997], MMWR vol. 49, No. SS-2, March 24, 2000, CDC/NCHS)。労働力人口での早発的および永久的な能力喪失状態と関係する冠状動脈性心疾患のさらなる経済的負担もある。1998年には、冠状動脈性心疾患に対し100億ドル以上が医療保険受給者に支払われた(Health Care Financing Review, Statistical Supplement [2000], HFCA)。
【０００３】
患者には、現在、心臓血管疾患/冠状動脈性心疾患を治療するのにいくつかの異なる薬物の選択肢がある。これらの薬物は降圧薬および抗高脂血症薬を含めて、さまざまなクラスに分類される。これらの製品は冠状動脈性心疾患の進行の低減および心臓発作の予防に有益であるということが示されているが、それらは寛容性が低いために、場合によっては、肝臓の補整効果による薬効の軽減のために、個体によってはその有効性が限定されることがある(Turley, S. D. (2002) Am.J. Managed Care 8 (2 Suppl):S29-32)。
【０００４】
マクロファージおよび平滑筋細胞などの、いくつかの大動脈および動脈細胞型における脂質、とりわけコレステロールの蓄積はアテローム性動脈硬化症の決定的な病理学的特徴である(Gotlieb et al. (1999) Blood Vessels. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. L., editors. Lippincott-Raven, Philadelphia, New York. 481-530)。この問題と関係する2つの中心的課題を理解するために、主要な研究努力が費やされている。第1のものは、これらの細胞に、コレステロールが運搬されて取り込まれる機構に関する。第2のものは、これらの細胞がその細胞自身から過剰なコレステロールを輸送し除去する過程に関する。アテローム性動脈硬化症の治療および予防では、目的の1つはこれらの細胞の生存性に悪影響を及ぼす大量のコレステロールの細胞内蓄積を抑え、それによって最終的には血管壁の構造的完全性を変化させることである。
【０００５】
類似の一連の事象が急性組織傷害でも起こる。そのような傷害は局所的な細胞死をもたらし、局所炎症および全身性急性期反応を発動する(Fantone, J. C. and Ward, P. A. (1994) Inflammation. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. editors. Lippincott, Philadephia. 32-6)。局所的なコレステロール処理の変化はこの過程の重要な要素である。急性組織傷害の部位で、瀕死の細胞はコレステロールに富む細胞膜断片を含んだ大量の細胞残屑を放出する(Fantone, J. C. and Ward, P. A. (1994) Inflammation. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. editors. Lippincott, Philadephia. 32-6)。急性炎症の一環として、傷害部位に到達したマクロファージはこれらの断片をさらに処理するために取り込み、それによって相当なコレステロール負荷を受け、その結果、アテローム性動脈硬化症で見られるものに類似した泡沫細胞になる。急性組織傷害およびその結果として起こる急性炎症過程の間、排出または再利用に向けてコレステロールを移動させるのにコレステロール除去機構が必要になる。
【０００６】
組織傷害に反応して肝臓で合成される主要な急性期(acute phase：AP)タンパク質の1つ、血清アミロイドA(serum amyloid：SAA)の生理学的役割は、これらの事象および過程に直接関連する。SAAは多重遺伝子族によってコードされる6億年以上にわたって保存されてきた4種の多型タンパク質の群を表す(Jensen et al. (1997) J. Immunol. 158: 384-392；Santiago et al. (2000) J. Exp. Zool. 288: 3335-344)。アイソフォームSAA1.1およびSAA2.1は急性期の組織傷害において血漿中に存在しており、最も徹底的に調べられている。
【０００７】
研究者らはヒトおよび動物モデルにおける複数のSAA遺伝子やその対立遺伝子多型の体系的な命名法に対する必要性を認識していたので、血清アミロイドAに対する命名法が1999年に改訂された(Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1999 6:67-70)。主な改訂はマウスSaa1およびSaa2遺伝子の再命名であった。染色体マッピングに基づけば、マウスSaa2の遺伝子座はヒトSAA1に対応するものと思われる。したがって、マウスでの命名法がヒトでの命名法と完全に適合するように変更された。
【０００８】
下記表は、SAAのマウスおよびヒトタンパク質に対して改訂された命名法ならびにその対応配列を示している。これらの表は1999年のAmyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 6:67-70にある開示に基づいている。しかしながら、本明細書に示される表は、アライメントを明確にするためにおよび付加的なアミノ酸を含むマウスアイソフォームSAA3の残基(-1)に番号を付与するために変更されている。
【０００９】
（表１）マウスSAAタンパク質
【００１０】
（表２）ヒトSAAタンパク質
本特許出願で使用したSAAタンパク質の命名法は、上記表に記載の改訂された命名法に対応している。しかしながら、この1999年の改訂前に刊行された学術文献およびこの1999年の改訂前に出願された特許出願は旧命名法を使用している可能性があり、したがって、例えば、マウスSaa1をマウスSaa2と呼んでおり、逆の場合も同じであるということを理解しなければならない。
【００１１】
SAAアイソフォームのSAA1.1およびSAA2.1は、組織傷害および炎症のさまざまな要因に反応して肝細胞により主に産生される(Morrow et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4718-4722)。活性化マクロファージによって放出され、肝細胞の細胞質および核内の一連の下流エフェクターを介して作用する、インターロイキン-1、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子などのサイトカインによって、肝臓によるSAA1.1およびSAA2.1の合成が誘発される。
SAA1.1およびSAA2.1遺伝子に対する最大転写速度は、組織傷害後の3〜4時間で見られ、傷害より18〜24時間以内に、これらの2種のタンパク質の血漿濃度が1〜5 μg/mLから500〜1000 μg/mL(500〜1000倍の増加)に上昇する(McAdam et al. (1978) J. Clin. Invest. 61:390-394；McAdam, K. P., Sipe, J. D. (1976) J. Exp. Med. 144:1121-1127)。SAA1.1およびSAA2.1は肝細胞からいったん分泌されると、高比重リポタンパク質(HDL)分画中に主に見出され、これらはHDLアポリポタンパク質の30〜80％を形成し、したがってHDL分画のアポリポタンパク質組成の大規模な再編成を引き起こす(Benditt et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4092-4096；Hoffman, J. S. and Benditt, E. P. (1982) J. Biol. Chem. 257: 10518-10522)。
【００１２】
現在、組織傷害の間に観察されているSAA発現の増加がアテローム性硬化病変に対する有益な役割と関係するのかどうか、またはSAAレベルの増加が実際には、アテローム性動脈硬化の発生における役割と関係するのかどうかの論争がる。
【００１３】
SAAアイソフォームレベルの上昇は臨床症状が明らかになるのに先立って、アテローム性動脈硬化症に直結する初期の病的血管事象の間に観察される(Kisilevsky, R. and Tam, S. -P. (2002) Pediatric Pathol. and Mol. Med. 21:291-303に概説されている)。この上昇によって、研究者のなかにはSAAレベルがアテローム性動脈硬化症において原因となる、寄与的な役割を果たしている可能性があるということを提唱するものもいる。
【００１４】
しかしながら、SAAおよびそのアイソフォームがマクロファージからのコレステロールの流出を促進させるという報告もある。
【００１５】
例えば、高比重リポタンパク質-血清アミロイドA(HDL-SAA)は、低比重リポタンパク質/超低比重リポタンパク質(LDL/VLDL)からコレステロールを受け入れる能力が低下していることが示されており、それによってHDLは、その導入経路(afferent route)において、可能な限り少ないコレステロールを運搬しているマクロファージに到達することができるようになる(Kisilevsky et al. (1996) Amyloid 3: 252-260)。すなわち、この形態のHDLは、コレステロール蓄積マクロファージからコレステロールを受け入れる能力がより高い。HDL-SAAはまた、HDL単独のものと比較して、マクロファージに対し3倍から4倍高い親和性を有することが実証されている。さらに、AP炎症反応のある動物から採取されたマクロファージ上のHDL-SAA結合部位の数に増加が見られた。マクロファージを使った競合研究(Kisilevsky, R. and Subrahmanyan, L. (1992) Lab. Invest. 66: 778-785)から、非標識HDL-SAAは効果的に標識HDL-SAAに取り代わったが、HDL単独のものではそうならなかった。HDL-SAAによるこの選択的置換は、マクロファージ上にSAA受容体が存在することを示唆している可能性が高い。このようなSAA受容体はマクロファージ上のアポA-1の結合部位に対し別個であり付加的である(Kisilevsky, R. and Subrahmanyan, L. (1992) Lab. Invest. 66: 778-785；米国特許第6,004,936号)。SAA受容体の存在は、HDL-SAAがマクロファージへの結合の直後にクラスリン被覆ピット中に存在していたという証明からさらに支持されている。これらのピットおよびその結果生ずるエンドソームは、受容体を介した飲食作用の概念、SAAが効果的に結合する細胞表面ヘパラン硫酸に依存する過程と一致している(Ancsin, J. and Kisilevsky, R. (1999) J. Biol. Chem. 274:7172-7181；Rocken, C. and Kisilevsky, R. (1997) Amyloid 4: 259-273)。
【００１６】
より最近の研究では、SAAは、マクロファージによるHDLの取込みを増強し(Banka et al. (1995) J. Lipid Res. 36:1058-10865)、コレステロールに対する親和性を有する(Liang, J. S. and Sipe, J. D. (1995) J. Lipid Res. 36:37-46)ということが実証されている。ヒトアポSAA1(現在ではSAA1.1と称される)の1〜18位の残基および40〜63位の残基、ならびにヒトアポSAA4(現在ではSAA4と称される)の1〜18位の残基に対応する合成ペプチドを利用して、アポSAA1はコレステロールをアミノ末端領域で結合するがアポSAA4は結合しないということが示された(Liang et al. (1996) J. Lipid Res. 37:2109-2116)。
【００１７】
さらに、マウスSAA2.1は、無傷のマウスマクロファージにおいて培養下でおよポストヌクレア(post-nuclear)ホモジネートでマクロファージのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性を用量依存的に阻害することが示されたが、マウスSAA1.1では示されなかった(Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181)。逆相HPLCにより精製したマウスSAA2.1の臭化シアン生成による切断断片のさらなる試験から、マウスSAA2.11〜16はACAT活性を用量依存的に阻害するのに絶大な効果があるということが示された。対照的に、マウスSAA2.124〜103はACAT活性に阻害効果を示さなかった(Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181)。
【００１８】
マウスSAA2.1は、肝臓、マクロファージおよび膵臓のコレステロールエステラーゼ活性をインビトロで刺激することも示されている(Lindhorst et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1339:143-154；Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181；Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。この効果は、臭化シアン切断によって遊離されたマウスSAA2.1の80残基のCOOH末端領域にあることが示された(Ely et al.(2001) Amyloid 8:169-181)。この80残基の領域には、マウスSAA2.1の24〜103位の残基が含まれる。
【００１９】
HDL-SAAおよびマウスSAA2.1含有リポソームが、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の顕著な減少およびコレステロール流出活性の増強を引き起こす能力が培養下のマクロファージで確認されている(Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。[3H]-コレステロール負荷マクロファージを炎症マウスに静脈注射することによって、同じように処置した炎症のない対照動物と比較した場合、血漿中に放出される放射性標識コレステロールの量が3倍から3.5倍増加することも報告されている(Tam et al. J. Lipid Res. 2002 43:1410-1420)。この研究では、マクロファージのコレステロール流出は、コレステロール逆輸送経路の初期段階に重要なタンパク質であるATP結合カセット輸送体、ABCA1と共役していることが示された。さらに、[3H]-コレステロール蓄積マクロファージは、組織培養下でHDL-SAA2.1(マウス)によって前処理し、次いで非炎症マウスに注射した場合、そのコレステロールを血漿中に素早く放出させた(Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。この結果は、マクロファージをHDL単独のもので処理した場合には観察されなかった。
【００２０】
このように、アイソフォームSAA1.1およびSAA2.1は炎症の間に上方制御されており；それらは進化的に保存されており；ならびにそれらはコレステロール逆輸送経路においてHDLおよびHDLの確定されている役割と主に関連している。
【００２１】
米国特許第5,318,958号は、HDLに対する血清アミロイドA親和性のあるリガンドに結合したHDLの有効量を投与することによって、インビボでマクロファージのコレステロールの放出および回収を増強する方法を開示している。この特許で開示されているこの方法の好ましいリガンドは、血清アミロイドAそのものである。
【００２２】
米国特許第6,004,936号は、米国特許第5,318,958号に類似の方法について記述している。しかしながら、米国特許第6,004,936号で主張されている方法では、血清アミロイド親和性を有するリガンドは投与前にHDLに結合されていない。この特許では、血清アミロイド親和性を有する好ましいリガンドはSAA2.1のような血清アミロイドAの非アミロイド生成性のアイソフォームであることが開示されている。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
哺乳類血清アミロイドAアイソフォーム2.1(SAA2.1)および1.1(SAA1.1)の選択されたペプチドドメインならびにその模倣体は、マクロファージ・コレステロールエステルヒドロラーゼ(CEH)活性に対する強力な増強効果および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性に対する阻害効果を有することが本明細書で実証される。本明細書で示されるように、これらのペプチドおよびその模倣体は、マクロファージのコレステロールを、コレステロール輸送体およびコレステロールアクセプターである高比重リポタンパク質(HDL)の存在下で細胞から迅速に輸送される輸送可能な形態へ移行させる。すなわち、これらのペプチドおよびその模倣体は、コレステロールの貯蔵を阻害する方法、ならびに被験体において炎症部位またはアテローム性動脈硬化部位からのコレステロールの流動および放出を増強する方法において、有用である。
【００２４】
したがって、本発明は、ペプチドおよび化合物ならびにこれらのペプチドおよび化合物の模倣体と、これらのペプチドもしくはその一部分、これらのペプチドもしくはその一部分の化合物および模倣体または化合物を含む薬学的組成物と、マクロファージのコレステロール代謝酵素であるコレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性を調節するためのこれらのペプチド、化合物および薬学的組成物の使用方法とを提供する。
【００２５】
本発明の一つの局面は、SAAタンパク質のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインのペプチド、ペプチド変異体またはその模倣体に関する。今回、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインが、マウスSAA2.1のC末端の74〜103位の残基およびマウスSAA1.1のC末端の77〜103位の残基にあると同定された。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインは、マウスSAA2.1のN末端の1〜16位の残基にあり、ならびにヒトSAA1.1およびSAA2.1のN末端の1〜23位の残基にある。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる好ましいペプチドまたはその模倣体には、式
またはその一部分を含む単離ペプチドまたはその模倣体が含まれ、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。同様に好ましいのは、
を含むペプチドまたはその模倣体、および
を含むペプチドまたはその一部分のペプチド変異体またはその模倣体である。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００２６】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明の好ましいペプチドには、式
またはその一部分を含む単離ペプチドまたはそのペプチド変異体もしくは一部分あるいはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1のN末端の類似領域またはそのペプチド変異体もしくは一部分が含まれ、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、nは1または2である。nが1である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびにX3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸である。nが2である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびにXb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。同様に好ましいのは、
を含む単離ペプチドまたはこれらのペプチドうちの1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分である。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００２７】
好ましい変異体には、1つまたは複数のD型アミノ酸を含み、同等に有効であるが但しインビボで分解を受けにくいペプチド、および環状ペプチドが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２８】
同様に好ましいのは、本発明の2つまたはそれ以上の連結または結合ペプチドを含む変異体である。特に好ましいのは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できるペプチドに連結または結合されたコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できるペプチドを含む変異体である。
【００２９】
本発明は同様に、上記のペプチド、ペプチド変異体またはその一部分のいずれかの模倣体に関する。
【００３０】
本発明の他の局面は、Y-ZまたはQ-Y-Zの式を有する化合物に関し、式中、Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する本発明の単離ペプチドまたは模倣体を含み；ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；ならびにQを含む態様では、Qは、Q-Y-Z化合物の能力を同様に増強する、Y-Zに連結された他の化合物を含んでもよい。QはZと同一であってもよくまたはZとは異なっていてもよい。典型的なZまたはQ化合物には、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質が含まれるが、これらに限定されることはない。Zおよび/またはQの典型的な標的化物質には、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたはSAA受容体に対するリガンドなどのマクロファージ標的化物質、肝臓標的化物質、抗体および、例えば、Fab断片などのその活性断片、ならびにアテローム斑および/または炎症部位に特異的なさらなる物質が含まれる。
【００３１】
本発明の他の局面は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害しかつ/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチド、ペプチド変異体もしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物はさらに、インビボ投与に薬学的に適した賦形剤を含む。一つの態様では、単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物を脂質と複合体化する。ペプチドもしくはその模倣体または化合物を封入するリン脂質小胞を使用することもできる。
【００３２】
本発明の他の局面は、コレステロール代謝酵素の活性を改変するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。具体的には、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体、または本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体を含む薬学的組成物を用いて、コレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性を改変することができる。本発明の好ましい態様では、その酵素活性をインビボで改変する。より好ましいのは、ヒトでの酵素活性の改変である。
【００３３】
本発明の他の局面は、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を増加かつ/または促進するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。本発明の好ましい態様では、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進がインビボで起こる。より好ましいのは、ヒトでのアテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進である。
【００３４】
本発明の他の局面は、炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を増加かつ/または促進するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。本発明の好ましい態様では、炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進がインビボで起こる。より好ましいのは、ヒトでの炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進である。
【００３５】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３６】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、心臓血管疾患の治療方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３７】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、冠状動脈性心疾患の治療方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３８】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を治療または予防する方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３９】
発明の詳細な説明
およそ1300万人の北米人がコレステロール低下薬物を服用しており、これらの個体の大部分が現在、スタチンとして知られる部類の薬物で治療されている。コレステロール合成阻害剤(スタチン)は、大部分が安全で非常に効果的であると考えられる。しかしながら、この薬物の部類には最近いくつかの失敗が起きている。例えば、Bayer社のスタチンBaycol(商標)の2001年の自主回収、AstraZeneca社のスタチンCrestor(商標)の北米への導入遅延、および長期にわたるスタチンの使用に伴う健康上の危機に関する最近の懸念(Clearfield, M.B., (2002) Expert Opin. Pharmacother. 3:469-477)は、新薬の必要性を示唆するものである。
【００４０】
したがって、製薬会社は、現在の市販薬のものとは異なる機序を介して働く薬物を現在開発中である。異なる機序を通じて作用する2種類またはそれ以上の種類の薬物による治療は、実際に、コレステロールレベルを低下させるその能力の組み合わせにおいて付加的または相乗的とすることができる(Brown, W. V. (2001) Am. J. Cardiol. 87 (5A): 23B-27B；Buckert, E. (2002) Cardiology 97: 59-66)。最近になってFDAに承認されたEzetimibe(Zetia(商標)、Merck)は、単独でコレステロールレベルを顕著に低下させることができる。さらに、Ezetimibeはコレステロール吸収を減少させることによって作用する(すなわち、コレステロール輸送を遮断する)ので、これをコレステロール合成阻害剤(スタチン)とともに投与して、いずれかの薬物を単独で投与する場合よりもはるかに血漿コレステロールレベルを減少させることもできる(Davis et al. (2001) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21: 2031-2038；Rader, D.J. (2002) Am. J. Managed Care 8 (2 Suppl): S40-44)。
【００４１】
臨床試験中のAvasimibe (Pfizer)、Eflucimibe (Eli Lilly)およびCS-505 (Sankyo)などの他の薬物は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性の阻害を目的としている。
【００４２】
Esperion Therapeutics社、Tularik Inc社およびカナダの会社Xenon Genetics社などの会社は、体外へのコレステロールの排泄に重要であることが知られているコレステロール逆輸送経路で中心的な役割を果たすHDL、つまりいわゆる「善玉コレステロール」のレベルを増加させる方法を開発中である。
【００４３】
しかしながら、アテローム性動脈硬化症の治療に向けた新規化合物を作出するよう製薬会社によって相当な努力が続けられてきたが、現在のところ、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強させることによって、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる能力を有する薬物は市場に存在していない。
【００４４】
マクロファージなどの血管細胞におけるコレステロールの蓄積は、アテローム性動脈硬化症の決定的な病理学的特徴である。マクロファージは脂質の貯蔵および除去において重要な細胞である。マクロファージの泡沫細胞(コレステロール蓄積マクロファージ)への転換は、アテローム斑の形成において初期の重要な病理学的過程である。
【００４５】
細胞のコレステロールバランスの維持には、2種類の酵素が重要である。
【００４６】
コレステロールエステラーゼおよびコレステリルエステルヒドロラーゼとも呼ばれるコレステロールエステルヒドロラーゼは、マクロファージからのコレステロールの除去または流出を促進させる。この酵素は中性型だけでなく酸性型でも存在しており、本発明の全て局面はいずれの型にも適用可能であるが、中性型の修飾が好ましい。
【００４７】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼは、マクロファージによるコレステロールの貯蔵を促進する。急性期炎症反応の間、血清アミロイドA(SAA)のアイソフォーム1.1および2.1は高比重リポタンパク質の主成分となり、この複合体はマクロファージよって内部に取り入れられる。本明細書で示されるように、マウスSAA1.1ではなく、マウスSAA2.1は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害し、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強し、それによって輸送可能な形態のコレステロールの方へそのバランスを移行させる。血清アミロイドA(SAA)はマクロファージに対するアポA-1結合親和性とは異なる、マクロファージに対する特異的な結合親和性を有することが実証されている。マウスアイソフォーム2.1は、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するとともに、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害することが示された最初のタンパク質である。しかしながら、本明細書で明らかなように、ヒトSAA1.1およびヒトSAA2.1は、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強し、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害するペプチドドメインを含むものである。
【００４８】
本発明者らは精製酵素、細胞ホモジネートおよび全細胞を利用し、急性期-HDL(AP-HDL；HDL-SAA)が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼおよびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性に及ぼすインビトロ効果ならびに細胞コレステロール輸送に及ぼすインビトロ効果を研究した。マクロファージの顆粒ホモジネートをアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの供給源として用いたインビトロ研究の結果から、マウスSAA2.1は用量依存的にアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害することが示された。対照的に、マウスSAA1.1およびアポA-1は効果がなかった。本発明者らは、マウスSAA2.1を含むリポソームだけでなく、AP-HDLも組織培養下にある無傷のコレステロール蓄積マクロファージにおいて、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の顕著な減少およびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性の増強を引き起こすことを示した。対照的に、HDL単独、SAA2.1を含まないリポソームおよびマウスSAA1.1またはアポA-1を含むリポソームは、酵素活性に効果がなかった。放射性標識コレステロールを予め負荷し炎症性または非炎症性マウスに静脈注射したマクロファージを利用し、高いSAA2.1レベルを有する炎症性マウスは、その非炎症性対照マウスよりもコレステロールを迅速におよび大きな(6倍大きな)度合いで流出することが明らかになった。さらに、マウスSAA1.1、マウスSAA2.1またはアポA-1のいずれかを含むリポソームで予め処理し、その後、非炎症性マウスに静脈注射したコレステロール蓄積マクロファージを利用し、本発明者らは今回、マウスアイソフォーム2.1を含むリポソームだけが炎症性マウスで認められた大きなコレステロール放出効果を再現することを明らかにした。
【００４９】
インビトロおよびインビボの両アッセイ法を利用し、マウスSAA2.1のこれらの特異的性質は2箇所のペプチドドメインにあることが実証された。マウスSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインは、SAA2.1のN末端の1〜16位の残基にある。しかしながら、マウスSAA2.1の臭化シアン切断によって放出されたこのN末端の16残基のドメインは、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性には効果がなかった。その代わりに、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するマウスSAA2.1のC末端の30残基のドメインが今回、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するマウスSAA2.1の領域として同定された。具体的には、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するドメインは、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸に対応するものと同定された。
【００５０】
本明細書で示されるように、マウスSAA2.1ならびにヒトSAA1.1およびヒトSAA2.1の中にあるこれらのドメインを含んだアミノ酸配列を有する単離ペプチドは、インビトロとインビボの両方で、マクロファージのコレステロールエステルヒドロラーゼ活性に対する強力な増強効果およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に対する阻害効果を有する。これらのドメインまたはその一部分のアミノ酸配列を含むように合成されたペプチドは、マクロファージのコレステロールを、機能的なコレステロール輸送体およびコレステロールアクセプター、つまり高比重リポタンパク質の存在下で細胞から迅速に輸送される輸送可能な形態へ移行させる能力を有する。さらに、これらの単離ペプチドは、単回の静脈注射によって4日間にわたりインビボでマクロファージのコレステロールを動態化することから、非常に活性がある。
【００５１】
マウスSAA2.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基
21〜50位のアミノ酸残基
51〜80位のアミノ酸残基
および74〜103位のアミノ酸残基
に対応するペプチドをそれぞれ、固相ペプチド合成により合成した。同様に、ヒトSAA1.1および/またはヒトSAA2.1の1〜23位のアミノ酸残基
に対応するペプチド、ならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
ヒトSAA2.1の79〜96位の残基
ヒトSAA2.1の80〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の81〜96位の残基
に対応するペプチドを合成した。さらに、マウスSAA1.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基
に対応するペプチド、ならびにマウスSAA1.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基にN末端のアルギニンを加えた
に対応するペプチドを合成した。合成ペプチドである配列番号：1〜7は、L型アミノ酸を含む。天然型のSAA1.1およびSAA2.1がグリコシル化されないのと同様に、本発明のこれらの合成ペプチドもグリコシル化されない。
【００５２】
さらに、マウスSAA2.1の臭化シアン切断は、16 mer(SAA2.11〜16)の不溶性断片ならびに2つの可溶性断片、7 mer(SAA2.117〜23)および80 mer(SAA2.124〜103；本明細書で配列番号：23として記載)の断片をもたらすことが明らかにされている(Ancsin, J. et al. J. Biol. Chem. 274: 7172-7181, 1999)。マウスSAA1.1の場合、76位の残基でIleをMetと置換してさらなる切断部位を導入し、これによって80 merの断片を53 mer(SAA1.124〜76)および27 mer(SAA1.177〜103)の断片に切断することができる。マウスSAA2.1およびSAA1.1の最後の27残基は次の通りである:
これらの2つの配列におけるアミノ酸残基の唯一の相違は、101位(太字および下線)に存在する。
【００５３】
これらの合成ペプチドを利用して、コレステロールエステルヒドロラーゼの調節に関与しているSAA2.1中のドメインのマッピング、ならびにコレステロールエステルヒドロラーゼ活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の調節に有用な組成物の同定を行った。
【００５４】
本明細書で示されるように、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともにJ774マクロファージを予めインキュベーションすることによって、HDL含有培地へのマクロファージの[3H]コレステロールの流出速度の顕著な増加が起こった。本発明者らは今回、天然のマウスSAA1.1タンパク質(SAA1.177〜103；配列番号：9)のCNBr切断から生じたさらに短いペプチドを含むリポソームも類似の効果を有するということを見出した。具体的には、培地への[3H]コレステロールの流出が、マウスSAA1.177〜103で処理したマクロファージとマウスSAA2.174〜103で処理したマクロファージの両者で類似しているということが実証された。
【００５５】
これらのデータから、マウスSAAの74〜76位の残基は、マクロファージのコレステロールの流出を促進させるのに必要ではない可能性が示唆される。さらに、101位の残基は不必要であると考えられる。実際に、約12種の配列の試験から、SAA1.1およびSAA2.1の、プロリンに富んだ末端8残基は、CEH増強活性に不必要である可能性が高いということが示唆されている。したがって、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸までの19残基のペプチドがCEH増強特性を保有するものと考えられる。さらに、ヒトSAA1.1の78〜96位の残基に対応する共通配列
を含むペプチド、ならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の79〜96位の残基
に対応するペプチドは、コレステロールの輸送を増加させることが本明細書で示される。すなわち、このペプチドならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の79〜96位の残基
に対応するペプチドは同様に、CEH増強特性を保有するものと考えられる。
【００５６】
加えて、これらのデータから、SAA1.1およびSAA2.1の三次構造(すなわち、3次元構造、タンパク質の折り畳み)間の相違がさらに明らかとなる。これはSAA2.1とは異なり、天然のSAA1.1タンパク質がマクロファージのコレステロール流出を促進させないためである。この情報およびさらなるモデリングの研究は、低分子模倣体の設計に向けたSAAのタンパク質およびペプチドの分子モデリングに有用である。
【００５７】
本発明者らは同様に、そのようなペプチドが1つまたは複数のD型アミノ酸を含むように修飾することによって、インビボでさらに安定となり分解を受けにくくなるものと予想される同等に有効なペプチドが得られることを示した。図2を参照されたい。全てD-アミノ酸からなるマウスSAA1.1のアミノ酸配列、77〜103位に対応する合成ペプチド(D型
本明細書では配列番号：10とも呼ばれる)は、細胞を対応する天然のL-アミノ酸のマウスSAA1.1のペプチドで並行的に処理した場合に、培地へのマクロファージのコレステロール輸送の促進において類似の効果があった。
【００５８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性の促進に関与するSAA2.1のドメインの同定は、放射性標識コレステリルエステルを予め負荷したJ774細胞で行った。これらの実験は、遊離したコレステロールおよび[14C]オレイン酸塩の再エステル化を阻止するため、Sandoz 58-035、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の存在下で行った。インキュベーションを0〜24時間までの時間続け、その後、細胞中の[14C]-標識コレステリルオレイン酸の残量を測定して、コレステリルエステルの加水分解反応速度を決定した。再エステル化が遮断された状態では、タンパク質を含まないリポソームまたはマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位および51〜80位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドをそれぞれ含むリポソームの存在下で培養した細胞中の[14C]-標識コレステリルオレイン酸の加水分解反応速度には有意な相違がなかった。しかしながら、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含む等量のリポソームによって、これらのコレステロール蓄積マウス細胞でコレステロールエステルヒドロラーゼ活性が3倍増加した。
【００５９】
コレステリルエステルへの[14C]オレイン酸塩の取込みを、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の指標として利用して、この酵素活性を阻害する組成物を同定した。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの相対活性は、リポソームの非存在下にてまたはタンパク質を含まないリポソームもしくはマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位および74〜103位のアミノ酸に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームの存在下にて、培地中で培養しておいたコレステロール蓄積マウス細胞で測定した。6時間のインキュベーション後、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームに曝露しておいた細胞だけが、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の2倍の減少を示したが、その一方で他のリポソーム処理によってはこの酵素の活性に対する有意な効果がなかった。
【００６０】
マウスSAA2.1の上記合成ペプチドのうちの1つを含むリポソームとともにプレインキュベートしたコレステロール負荷J774細胞からのコレステロール流出についても調べた。これらの実験では、[3H]コレステロールで標識したコレステロール負荷マウスマクロファージをマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位または74〜103位のアミノ酸に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともに4時間プレインキュベートした。いくつかの態様では、マウスSAA2.1の1〜20位および74〜103位のアミノ酸残基に対応する2種の合成ペプチドを等モルで組み合わせたもの(各0.5 μM)についてもアッセイした。インキュベーション後、その細胞をDMEM/BSAで徹底的に洗浄して、プレインキュベーション培地中の放射能およびリポソームを全て除去した。この流出追跡はDMEM/BSAのみまたはHDL (50 μg/mL)含有培地から成った。さまざまな時点で、その流出培地を回収し、[3H]コレステロールおよび遊離コレステロール量についてアッセイした。結果から、0.2％ BSA含有培地への[3H]コレステロールの流出は、全カウントの6.1±1.1％であることが示唆された。HDL(50 μg/mL)の存在下で培養した細胞は、細胞の全[3H]ステロールのうちの31.2±2.2％を培地に輸送した。マウスSAA2.1の21〜50位または51〜80位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとの細胞のプレインキュベーションでは、HDL含有培地への[3H]コレステロール流出の割合に何ら有意な変化は起こらなかった。しかしながら、[3H]コレステロールで標識したコレステロール蓄積J774細胞を、マウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともにプレインキュベートした場合に、細胞を引き続いてHDLの存在下で培養すると、細胞の全[3H]コレステロールのうちの60.6±3.6％および46.7±3.1％が培地中に放出されることが観測された。SAA2.1のこれら2種の合成ペプチドを組み合わせたものとの類似の培養条件下でのプレインキュベーションによっては、HDLへの細胞の全[3H]コレステロールのうちの88.5±3.5％の輸送が起こった。さらに、最初の2時間中のHDL培地へのコレステロール流出の初速度は、いずれかの合成ペプチドのみを含むリポソームによる結果と比較して2倍速かった。
【００６１】
さらに、図10に示されるように、完全長のマウスSAA2.1タンパク質を含むリポソームおよびマウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームの等モル濃度によるコレステロール流出の比較から、マウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームを投与されているコレステロール蓄積J744細胞からの統計学的に有意に高いコレステロール流出が示された。
【００６２】
マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソーム、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームおよびこれらのペプチドの組み合わせ(配列番号：1 + 配列番号：4)をモル比1:1で含むリポソームについても、コレステロール蓄積マウスマクロファージにおけるコレステロール輸送の用量反応曲線を作成した。結果を図3Aおよび図3Bに示す。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれた。各ペプチド単独のものによってコレステロール流出は増加し、対照と比較したコレステロール流出の割合(％)は、各ペプチド単独のものの量が増加するのに伴って増加した。さらに、図3Aおよび図3Bに示されるように、その2種のペプチドを組み合わせたものでは、相加的効果を超える効果が得られた。例えば、図3Aおよび図3Bに示されるように、1 μMの各ペプチド単独のものによるコレステロール流出は約200％であったのに対し、1 μMの各ペプチドの組み合わせによるコレステロール流出は500％であった。
【００６３】
これらのペプチドは今回、ヒト由来単球細胞においてコレステロール流出を増加させることも実証された。これらの単球は、ホルボールミリスチン酸アセテート(100 nM)でマクロファージに分化した。これらの実験では、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチド、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチド、マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えたもの(配列番号：7)に対応するペプチド、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソーム製剤に、コレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞を曝露した。これらの実験の結果を図4に示す。マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：5)に対応する、不活性なペプチドとは異なり、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えたもの(配列番号：7)に対応するペプチドを含むリポソーム製剤は、これらのヒト細胞におけるコレステロール流出を、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)およびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドよりはよくないにせよ、同程度に効果的に増加させた。
【００６４】
このように、コレステロール輸送の割合は、異なるペプチドを使っておよび/またはペプチドの濃度増加に伴って増加させることができる。
【００６５】
類似の研究をヒトSAA1.1の78〜96位の残基
に対応するペプチドを用いて行った。図5Aおよび図5Bは、ヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸(配列番号：12)に対応するペプチドを含むリポソームまたはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームを投与したマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究から得られた用量反応曲線を示す。試験したペプチド濃度は、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMとした。図5Aおよび図5Bによって示されるように、ヒトSAA1.1ペプチド(配列番号：12)は、用量の増加に応じたコレステロール流出の増加という点で、そのマウスペプチドよりも効果的ではないにせよ、少なくとも同程度に効果的であった。したがって、これらの結果は、配列番号：12を含むヒトSAA1.1ペプチドがコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のエンハンサーであるということを示している。
【００６６】
図9はヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)、ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)、ヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)、ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)またはヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤によるマウス774細胞におけるコレステロール流出の経時的変化の研究を示す。図中に示されるように、ヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)を含むリポソーム製剤は、試験した製剤のうち最も高いコレステロール輸送増強活性を示した。ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)またはヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)を含むリポソーム製剤もコレステロール輸送増強活性を示し、それぞれがヒトSAA1.178〜96を含むリポソーム製剤の約半分の活性を持っていた。ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)またはヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤は、皆無かそれに近いコレステロール輸送増強活性しか示さず、したがって、少なくとも79位の残基の存在がこれらのペプチドの活性に重要であるということを示唆している。
【００６７】
コレステロール流出の経時的変化を、ヒトSAA1.1の78〜96位の残基に対応するペプチドを各種濃度で含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞でも行った。この実験の結果を図6に示す。図中に示されるように、マクロファージからのコレステロールの流出は、試験したペプチドの全濃度に対し0時間から24時間までの期間にわたって増加し続けた。
【００６８】
マウスに[3H]コレステロール-蓄積マクロファージを最初に静脈注射し、その後、マウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位または74〜103位の残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームを24時間後に注射するといったさらなるインビボ研究も行った。この研究の結果を図1に示す。図1のグラフに示された時点で、約25 μlの血液を各動物の尾静脈から採血した。この血液試料を遠心して血漿から赤血球を分離し、血漿中の[3H]-コレステロールをシンチレーション計測により測定した。結果は測定4回の平均±SEMである。この図で示されるように、SAA2.1ペプチドの1〜20位の残基(アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメイン)または74〜103位の残基(コレステロールヒドロラーゼエステル増強ドメイン)を含むリポソームの静脈注射は、血漿中放射活性(dpm)の増加によって測定される[3H]-コレステロールの流出を劇的に増加させた。この同じ研究において、ヒトアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害性のSAA1.1ペプチドドメイン(これはヒトおよびマウスのSAA2.1のそのドメインに等価である)もインビボでのコレステロール輸送を促進させた。
【００６９】
これらの実験は、天然のSAA2.1タンパク質を含むリポソーム、あるいはマウスアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはマウスもしくはヒトコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインを含んだ合成ペプチドを含むリポソームが、インビボでのコレステロール流出を顕著に増加させたことを実証している。さらに、この増加は4日間にわたり続いた。さらに、ヒトアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害性のSAAペプチドドメインもインビボでのコレステロール流出を促進させた。このように、これらのデータはSAA、具体的にはこのタンパク質のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよびコレステロールヒドロラーゼエステル増強ドメインがアテローム斑に位置するコレステロール蓄積マクロファージからのコレステロールの除去の促進に果たす中心的な役割を実証するものである。このデータは、アテロームの発生を低減するかもしくは予防するためにおよび/またはアテローム性硬化病変に位置するマクロファージからのコレステロールの流出を増加させることによってアテローム斑の退縮を引き起こすために、これらのドメインのペプチドまたは模倣体を設計することおよび利用することの有用性を立証するものである。このようなペプチドまたはその模倣体は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に有用であり、アテローム性動脈硬化症と関係する冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療に有用であるものと考えられる。
【００７０】
コレステロールの輸送過程は、ATP結合カセット輸送体(ABCA1)経路と共役している。アポリポタンパク質への脂質流出は、cAMP類似体を用いたマウスマクロファージの処理によって刺激されることが以前に示されている(Lin et al. 2002 Biochem Biophys Res. Commun. 290: 663-669；Oram et al. 2000 J. Biol. Chem 275: 34508-34511)。また、ABCA1の発現はcAMP処理によって誘導される(Lin et al. 2002 Biochem Biophys Res. Commun. 290: 663-669；Oram et al. 2000 J. Biol. Chem 275: 34508-34511)。本発明者らは、コレステロール蓄積J774マクロファージとのインキュベート時の各種のアポリポタンパク質を含むリポソームによるコレステロールの流出に及ぼす8-ブロモ-cAMP(0.3 mM)の効果を本明細書の中で調べた。そのような細胞をSandoz 58-035、つまりACAT阻害剤の存在下において[3H]-コレステロールで予め標識して、その細胞から放出される放射性標識コレステロールの全てがエステル化されていないコレステロールのプールに由来するものであることを確実とし、この細胞を8-ブロモ-cAMPで12時間処理した。これに続いて各種のアクセプターとのインキュベーションを行った。細胞の標識コレステロールの放出率(fractional release)を時間の関数として測定した。未処理細胞と比較した場合、cAMPによる前処理はSAA2.1およびアポA-1を含むリポソームへのコレステロール流出の初速度の62.1％および32.7％の増加をもたらした。細胞をcAMPによる前処理の有無にかかわらずSAA1.1リポソームに曝露した場合、流出の刺激は観測されなかった。さらに、SAA1.1リポソームはコレステロール蓄積マクロファージからのコレステロールの流出を促進させるうえで、タンパク質を含まないリポソーム以上に効果的ではないということが以前に実証されている(Tam et al. 2002 J. Lipid Res. 43: 1410-1420)。さらに、cAMPによる処理は、リポソームを含まない培地へのコレステロールの輸送を刺激しなかった。
【００７１】
シクロデキストリンのようなアポリポタンパク質を含まないアクセプターが、マクロファージからのコレステロールの除去を触媒する能力を有するかどうか調べるため、コレステロールを負荷および標識したJ774細胞をリポソームおよびメチル-β-シクロデキストリン(0.1 mM) (CD)とともにインキュベートした。リポソームを含まない培地へのコレステロールの流出の刺激は、この濃度のCDで観測されなかった。対照的に、SAA2.1を含むリポソームで処理した細胞では、CD処理によってコレステロール流出の初速度の4倍増加が生じたが、SAA1.1を含むリポソームでは生じず、同様にタンパク質を含まないリポソームでも生じなかった。さらに、cAMPによる前処理は、SAA2.1およびCDを含むリポソームに曝露した細胞においてコレステロール流出のさらなる増加(45.5％)を引き起こした。
【００７２】
したがって、本発明は、アテローム性動脈硬化症ならびにアテローム性動脈硬化症と関係する冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の予防および/または治療に用いる、単離ペプチド、Y-ZおよびQ-Y-Z化合物ならびにこれらの模倣体、および単離ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、SAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの、ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物、またはこれらの模倣体；および/またはSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの、ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物、またはこれらの模倣体を含む。したがって、本発明の好ましい組成物は、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸もしくはヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸を含むペプチドもしくはその一部分、および/またはSAA2.1の1〜16位の残基を含むペプチドもしくはその一部分、あるいはこれらのペプチドの一方もしくは両方の模倣体またはその一部分を含む。
【００７３】
「その一部分」により、本明細書に記載の単離ペプチドに類似の生物活性を示すペプチドであるが、しかし(1) マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1の19残基のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたは16残基のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインのさらに短い断片を含む、あるいは(2) マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1の19残基のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたは16残基のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分だけと重複する、ペプチドを含むように意図される。例えば、約1〜12位、約1〜13位または約1〜14位の残基に及ぶ、マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分を含むペプチドも、マウスSAA2.1の1〜20位の残基ならびにヒトSAA1.1およびSAA2.1の1〜23位の残基の合成ペプチドと同様に、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するものと考えられる。同様に、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性を有するマウスSAA2.1の74〜103位の残基の30アミノ酸配列のうちの好ましい一部分が同定されており、これにはこのドメインの77〜95位の残基に対応する19アミノ酸の領域が含まれる。同様に、ヒトSAA1.1の、それぞれ、79〜96位または78〜96位の残基に対応する18〜19アミノ酸の領域が同定されており、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強特性を有すると実証されている。類似の生物活性を有するこれらの77〜95、78〜96または79〜96残基のペプチドのうちのさらに短い部分を、これらの77〜95、78〜96または79〜96残基のペプチドと同じ方法で同定することができる。したがって、本発明は、同様に本明細書で開示されるペプチドの部分に関する。
【００７４】
本発明の好ましいペプチドは、マウスSAA1.1タンパク質の配列の1〜20位のアミノ酸残基にN末端のアルギニンを加えたもの(RGFFSFIGEAFQGAGDMWRAY；配列番号：7)に対応する合成ペプチドである。
【００７５】
合成により、本明細書では、そのペプチドが化学的手段によりまたは組換えにより合成的に調製されることを意味する。
【００７６】
さらに、本明細書に開示されるペプチドのコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性に関与する構造を保存しながら、開示のペプチドにおけるアミノ酸のさまざまな置換が可能であるものと当然理解されるであろうが、これによって限定することを意図するものではない。保存的置換は、例えば、米国特許第5,264,558号などの、特許文献に記述されている。したがって、例えば、非極性脂肪族の中性アミノ酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間での交換が可能であるものと予想される。同様に、極性脂肪族の中性アミノ酸、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間での置換を行うことができる可能性があるものと考えられる。荷電性の酸性アミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸の間での置換を行うことができる可能性があるものと考えられ、同様に荷電性の塩基性アミノ酸、リジンおよびアルギニンの間での置換を行うことができるものと考えられる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む芳香族アミノ酸の間での置換も可能である可能性が高いものと考えられる。場合によっては、ヒスチジンと塩基性アミノ酸リジンおよびアルギニンとを相互に置換することができる。これらの類の置換および交換は当業者に周知である。その他の置換も可能であろう。本明細書に記載のペプチドとの変異ペプチドの配列同一性の割合(％)が大きくなるほど、生物活性の保持率が大きくなるものと予想される。したがって、本明細書に記述されるコレステロールエステルヒドロラーゼを増強する活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する活性を有するペプチド変異体は本発明の範囲内に含まれる。
【００７７】
本発明で用いるのに好ましいのは、単離ペプチド
またはその一部分であり、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、nは1または2である。したがって、nが1である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、X2は疎水性または非極性アミノ酸であり；ならびにX3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸である。nが2である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびにXb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸、またはその模倣体である。塩橋を形成するXaおよびX6のアミノ酸の組み合わせの例には、XaがアルギニンであることおよびX6がアスパラギン酸またはグリシンであることを含むが、これに限定されることはない。より好ましいのは、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基
ヒトSAA1.1またはSAA2.1の1〜23位のアミノ酸残基
および
からなる単離ペプチドである。本発明のこれらの単離ペプチドは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害することができる。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００７８】
本発明で用いるのに好ましいコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる単離ペプチドは、
またはその一部分を含み、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。好ましいのは、
を含むペプチドであり、式中、X1およびX9、X12もしくはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに/またはX17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である。塩橋を形成できるアミノ酸の組み合わせの例には、X1がアスパラギン酸であること、およびX9、X12またはX18がアルギニンであることを含む。単離ペプチドまたは模倣体は、80個未満のアミノ酸残基、より好ましくは18〜79個のアミノ酸、より好ましくは18〜50個のアミノ酸、より好ましくは18〜35個、18〜30個または18〜25個のアミノ酸を有することが好ましい。同様に好ましいのは、単離ペプチド
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分、または
のペプチド変異体である。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００７９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するためにおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害するために本発明で用いるのに同様に好ましいのは、Y-ZまたはQ-Y-Zの式を有する化合物である。これらの化合物では、任意の許容される結合手段およびZまたはQの選択に基づいて選択される結合手段を介して、ZはYに連結されておりおよび/またはQはY-Zに連結されている。許容される結合手段の例には共有結合、非共有結合、水素結合、抗体-抗原認識またはリガンド結合が含まれるが、決してこれらに限定されることはない。式Y-ZまたはQ-Y-Zを有する化合物では、Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する本発明の単離ペプチドまたは模倣体を含み；ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；ならびにQを含む態様では、QはZと同一であってもよくまたはZとは異なっていてもよく、Qは同様に化合物Q-Y-Zの能力を増強する。典型的なZまたはQ化合物には、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質が含まれるが、これらに限定されることはない。Zおよび/またはQの典型的な標的化物質には、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたはSAA受容体に対するリガンドなどのマクロファージ標的化物質、肝臓標的化物質、抗体および、例えば、Fab断片などのその活性断片、ならびにアテローム斑および/または炎症部位に特異的なさらなる物質が含まれる。
【００８０】
本明細書において「単離(された)」とは、その天然宿主細胞中の天然ペプチドまたはタンパク質に元来付随するその他の細胞成分から実質的に分離されているペプチドのことを意味する。この用語は、その天然由来の環境から取り除かれているペプチド、「単離ペプチド」が自然界で見出されるペプチドまたはタンパク質の全部または一部分に付随していないペプチド、単離ペプチドが自然界では連結していないかまたは異なる様式で連結しているペプチドに作動可能に連結しているペプチド、もっと長い配列の一部としては自然界に存在しないペプチドあるいは自然界には見られないアミノ酸を含んだペプチドを含むように意図される。「単離(された)」という用語は同様に、組換えにより発現されるペプチド、化学的に合成されるペプチド、または異種系により生物学的に合成されるペプチド類似体に言及して使用することができる。
【００８１】
本明細書において「ヒト等価体」とは、本明細書の参照マウスペプチドに類似の活性を有するヒトSAA2.1またはヒトSAA1.1に由来するペプチド配列のことを意味する。
【００８２】
「に由来する」という語句は、特定の種に由来し、その特定の種から単離されたペプチドまたは模倣体だけでなく宿主細胞の発現系で組換えにより発現されるかまたは化学的に合成されるアミノ酸配列が同一のペプチドも含むように意図される。
【００８３】
本明細書において「模倣体」とは、類似のまたは増強されたアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性および/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ調節活性を示す、ペプチド(これは組換え体であってもよい)、およびペプチド模倣体、ならびに有機低分子を含むように意図される。これらには、SAA2.1またはSAA1.1の野生型ドメインの配列に対して保存的アミノ酸置換を含むペプチド変異体、およびSAA2.1またはSAA1.1の野生型ドメインと高い割合(％)の配列同一性、少なくとも、例えば80％、85％、90％の配列同一性、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性、より好ましくは少なくとも99.5％または99.9％の配列同一性を有するペプチド変異体が含まれる。整列のための周知技術のいずれかに従い、変異ペプチドを参照ペプチドと整列させて、配列同一性の割合(％)を評価することができる。例えば、整列のためのいずれかの周知技術を利用して、参照ペプチドよりも長さが大きい変異ペプチドを参照ペプチドと整列し、参照ペプチドの長さを超えて伸びうる変異ペプチドのさらなるアミノ酸にかかわらず、配列同一性の割合(％)を参照ペプチドの長さにわたって計算する。
【００８４】
好ましい変異体には、1つまたは複数のD型アミノ酸を含み、同等に有効であるが但しインビボで分解を受けにくいペプチド、および環状ペプチドが含まれるが、これらに限定されることはない。環状ペプチドは、ペプチド結合または環状デプシ(depsicyclic)末端残基(すなわち、ジスルフィド結合)を含むがこれらに限定されない、さまざまな手段によって環状にすることができる。
【００８５】
同様に好ましいのは、本発明の2つまたはそれ以上の連結または結合ペプチドを含む変異体である。特に好ましいのは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できるペプチドに連結または結合されたコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できるペプチドを含む変異体である。
【００８６】
本明細書では「ペプチド模倣体」という用語は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性および/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を調節するうえで配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドの適切な代用物として機能するペプチド類似体を含むように意図される。ペプチド模倣体はこれらのペプチドドメインに対し、類似の化学的特性、例えば、親和性だけでなく、有効性および機能も保有しなければならない。すなわち、ペプチド模倣体は構造の制限なく、SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの機能を示す。本発明のペプチド模倣体、すなわち、SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの類似体は、本明細書に記述される機能特性を供与するアミノ酸残基またはその他の成分を含む。ペプチド模倣体ならびにその調製および使用の方法は、Medicinal Chemistry (Vuirick, F.J. ed), Academic Press, San Diego, CA中の年次報告書にあるMorgan et al. 1989, 「Approaches to the discovery of non-peptide ligands for peptide receptors and peptidases」, 243-253に記述されている。
【００８７】
本発明の模倣体はSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインに対し類似の構造形状を有するように設計してもよい。例えば、本発明のSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの模倣体は、
例えば、配列番号：1の1〜11位の残基、配列番号：6の2〜12位の残基または配列番号：7の1〜12位の残基により特徴付けられるものなどの、芳香族アミノ酸を模倣する構造であって、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの阻害活性を示すのに適した高次構造に折り畳まれているかまたは積み重ねられている(例えば、pi-結合型)構造を含むように設計することができる。さまざまな公知のACAT阻害剤に見られる芳香族性(McCarthy et al. J. Med. Chem. 1994 37: 1252-1255)を考慮に入れると、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤のような芳香族領域を有する本発明の模倣体の有効性が同様にして当然予想される。SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの積み重ねられたまたは折り畳まれた芳香族アミノ酸を模倣する本発明のポリペプチド模倣体またはペプチド模倣体の場合、包含するのに好ましいアミノ酸には、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインを有する本発明の模倣体は同様に、
またはその一部分の塩橋の高次構造を模倣する構造を含むように設計してもよく、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【００８９】
SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの模倣体は、それぞれ、配列番号：1、6、7、13もしくは14、または配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29の合成ペプチドに類似の構造を有するように設計することもできる。これらのペプチド模倣体は配列番号：1、6、7、13もしくは14または配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29と比べ、周囲のアミノ酸と相互作用して、これらの合成ペプチドに類似の構造を形成する保存的アミノ酸置換を有するペプチド配列を含んでもよい。テトラヒドロイソキノリン成分などの配座固定成分をフェニルアラニンに代えて置換してもよく、その一方で、ヒスチジン・バイオイソステアをヒスチジンに代えて置換して、胆汁排出による初回通過クリアランスを減少させてもよい。本発明のペプチド模倣体はペプチド骨格の修飾を含んでもよい。アミド結合の代用物を含む類似体を使用して、骨格の回転自由度、分子内および分子間水素結合の様式、部分的および全体的な極性および疎水性の変更ならびに経口による生物学的利用能を含むが、これらに限定されない、ペプチドの構造および機能に関する側面を研究することが多い。等比体積のアミド結合模倣体の例には、Ψ[CH2S]、Ψ[CH2NH]、Ψ[CSNH2]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH2]およびΨ[(E)または(Z)CH=CH]が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９０】
模倣体は同様に、天然に存在するSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインと比較して拡張および/または付加によるアミノ酸残基の繰り返しを有するように設計することができる。例えば、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分、
例えば、配列番号：1の1〜11位の残基、配列番号：6の2〜12位の残基、または配列番号：7の1〜12位の残基のうちの2つまたはそれ以上の繰り返しであって、隣接していてもおよび/または安定化アミノ酸により分離されていてもよい繰り返しを含む模倣体をアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性阻害剤とすることができる。あるいは、そのような繰り返しは別の芳香族アミノ酸に代えて、芳香族アミノ酸、例えば、Fに代えてW、HまたはYの1つまたは複数の置換を含んでいてもよい。さらに、配列番号：6の12〜13位の残基の領域中にある内部残基と水素結合を形成すると考えられる配列番号：6の最初のアルギニンのような、ペプチドの高次構造の活性および/または安定性にとって重要であると考えられるこれらのペプチドのアミノ酸を模倣体の中に組み入れて、その活性および/または安定性を増強させてもよい。常法に従い、宿主細胞を遺伝子操作して、そのような模倣体を発現させることができる。
【００９１】
これらのペプチドドメインの同定によって、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する有機低分子の設計とその後の合成のために、これらのペプチドに基づいた分子モデリングも可能となる。これらの有機低分子は配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドの構造および活性を模倣する。しかしながら、これらの有機低分子はアミノ酸を含む代わりに、化学的または物理的類似性を有し概ね類似の生物活性を示すそのバイオイソステア、置換基または基を含む。
【００９２】
バイオイソステリズム(生物学的等価性)は、薬物設計の当業者により利用されている主要な修飾手法であって、配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29などのリード化合物の毒性の弱毒化および活性の改変に有用であることが示されている主要な修飾手法である。バイオイソステリック(生物学的等価性の)手法は、The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action (Silverman, RB, Academic Press, Inc. 1992 San Diego, CA, pages 19-23)などの標準的な参考書籍に詳細に論じられている。古典的なバイオイソステアは、同じ数の価電子を有するが異なる数の原子を持ちうる化学基を含む。したがって、例えば、一価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、CH3、NH2、OH、FおよびCl；Cl、PH2およびSH；Brおよびi-Pr；ならびにIおよびt-Buが含まれるが、これらに限定されることはない。二価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、-CH2-およびNH；O、SおよびSe；ならびにCOCH2、CONHR、CO2RおよびCOSRが含まれるが、これらに限定されることはない。三価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、CH=およびN=；ならびにP=およびAs=が含まれるが、これらに限定されることはない。四価の原子を有する古典的なバイオイソステアには、CおよびSi；ならびに=C+=、=N+=および=P+=が含まれるが、これらに限定されることはない。環等価体を有する古典的なバイオイソステアには、ベンゼンおよびチオフェン；ベンゼンおよびピリジン；ならびにテトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、シクロペンタンおよびピロリジンが含まれるが、これらに限定されることはない。非古典的なバイオイソステアでも類似の生物活性をもたらすが、しかしこれは同じ数の原子を持っておらず、古典的なバイオイソステアの電子的および立体的規則には適合しない。典型的な非古典的バイオイソステアを下記表に示す。
本発明の有機低分子模倣体の設計に有用なさらなるバイオイソステリック交換には、鎖状構造と環状構造との交換反応が含まれる。
【００９３】
本発明のペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体は、その必要性のある被験体、好ましくはヒトに投与するのに薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化されることが好ましい。そのような組成物の製剤化の方法は当技術分野において周知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985などの標準的な参考書籍に開示されている。本発明の組成物は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性もしくはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のいずれかを調節する、またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性およびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のどちらも調節する単一のペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含んでもよい。さらに、本発明の組成物は、配列番号：1、6、7、13もしくは14のペプチドまたはその一部分もしくは模倣体および配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29のペプチドまたはその一部分もしくは模倣体を含んでもよい。これらの組成物は単独でまたは第二のコレステロールを低下させる薬物もしくは物質との併用で投与されてもよい。例えば、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を阻害する配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29のペプチドまたはその模倣体を含む本発明の組成物をACAT阻害剤との併用で被験体に投与することができる。典型的なACAT阻害剤には、Zetia(商標) (Merck)、Avasimibe (Pfizer)、Eflucimibe (Eli Lilly)およびCS-505 (Sankyo)が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の組成物は、シクロデキストリンのようなアポリポタンパク質を含まないアクセプターとともに被験体に投与されてもよい。本発明の単離ペプチドまたは模倣体との併用で投与できる典型的なさならるコレステロールを低下させる薬物または物質には、スタチン、樹脂または胆汁酸抑制薬(Bays et al. Expert Opinion on Pharmacotherapy 2003 4(11): 1901-38；Kajinami et al. Expert Opinion on Investigational Drugs 2001 11 (6): 831-5)、ナイアシン(Van et al. Am. J. Cardiol. 2002 89 (11): 1306-8；Ganji et al. J. Nutri. Biochem. 2003 14 (6): 298-305；Robinson et al. Progress in Cardiovasc. Nursing 2001 16(1): 14-20；Knopp, R.H. Am. J. Cardiol. 2000 86 (12A): 51L-56L)、肝臓X受容体アゴニスト(Tontonoz et al. Molecular Endocrinology 2003 17: 985-993)、Ca2+アンタゴニスト(Delsing et al. Cardiovasc. Pharmacol. 2003 42(1): 63-70)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR；Lee et al. Endocrinology 2003 144: 2201-2207)のモジュレーターが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９４】
本発明で用いるのに好ましい製剤化は、ペプチドもしくはその模倣体またはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物を脂質と複合体化することである。製剤化として同様に好ましいのは、ペプチドもしくはその模倣体あるいはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体をリン脂質小胞の中に封入することである。本出願を通じて実証されるように、本発明で有用な典型的なリン脂質小胞はリポソームである。本発明のペプチドもしくはその模倣体あるいはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体を含むリポソームは、Epsteinら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985))、Hwangら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980))、欧州特許第52,322号、欧州特許第36,676号；欧州特許第88,046号；欧州特許第143,949号；欧州特許第142,641号；日本国特許出願第83-118008号、および欧州特許第102,324号、ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号により記述されているような周知の方法のいずれかにしたがって調製することができ、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。好ましいリポソームは、その脂質含量がコレステロールの約10モルパーセントを超える、好ましくはコレステロールの10〜40モルパーセントの範囲にある小さな(約200〜800オングストローム)単層型のものであり、その選択の割合は最適なペプチド療法に応じて調整される。しかしながら、本開示を読んだとき当業者には明らかなように、リポソーム以外のリン脂質小胞を使用することもできる。
【００９５】
本発明のペプチド、化合物およびこれらの模倣体または薬学的組成物は、患者に埋め込まれた冠状動脈ステントを介して投与することもできる。本発明のペプチド、化合物およびこれらの模倣体または薬学的組成物を溶出する冠状動脈ステントは、周知の技術にしたがって調製し埋め込むことができる(例えば、Woods et al. (2004) Annu. Rev. Med. 55:169-78)；al-Lamce et al. (2003) Med. Device Technol. 2003 14: 12-141 Lewis et al. 2002 J. Long Term Eff. Med. Implants 12:231-50；Tsuji et al. 2003 Int. J. Cardiovasc. Intervent. 5:13-6を参照されたい)。
【００９６】
本発明の薬学的組成物は、コレステロール代謝酵素の活性、具体的には、コレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性の調節に有用である。好ましい態様では、その薬学的組成物を利用して、マクロファージでの酵素活性を改変する。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、インビボでの酵素活性を改変する。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、哺乳類、具体的にはヒトでの酵素活性を改変する。
【００９７】
本発明の薬学的組成物は、アテローム斑および/または炎症部位にある貯蔵コレステロールの流動および流出の促進にも有用である。好ましい態様では、その薬学的組成物を利用して、インビボにおいてアテローム斑または炎症部位に位置するマクロファージおよびその他の組織からの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、哺乳類、具体的にはヒトにおいてアテローム斑または炎症部位に位置するマクロファージおよびその他の組織からの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる。
【００９８】
したがって、本発明の組成物を、被験体、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに投与して、アテローム性動脈硬化症を治療かつ/または予防することができる。この組成物は、経口経路、経静脈経路、筋肉内経路、腹腔内経路、局所経路、経直腸経路、経皮経路、舌下経路、口腔経路、鼻腔内経路または吸入による経路を含むが、これらに限定されない種々の経路により投与されてもよい。少なくとも経口投与の場合、1つまたは複数のD型アミノ酸を有するペプチドを含む組成物を投与することが好ましいものと思われる。当業者は治療される病気の重症度、ならびに年齢、体重および同様のものなどの患者に特異的な要因に基づいて、製剤および投与経路ならびに投与の用量および頻度を日常的に選択することができる。マクロファージからのコレステロールの流出を促進させる際の本発明の合成ペプチドの持続的な活性は、これらの薬学的組成物に対する毎日の、1日おきまたは週2回の投与計画の実現可能性を示唆するものである。
【００９９】
前述のインビトロおよびインビボアッセイに加えて、アテローム性動脈硬化症を治療かつ/または予防する本発明の組成物の効力をアポEノックアウトによるアテローム生成のマウスモデル(Davis et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 21:2031-2038)などの動物モデルで実証することもできる。これらのマウスは、動脈硬化食で飼育された場合、その大動脈中に脂質を急速に沈着する。このアポEノックアウトマウスはアテローム性動脈硬化症の有効なモデルであり、アテローム性動脈硬化症を軽減させる際のEzetimibe(Zetia(商標)；Merck)の有効性を実証するために使われている(Davis et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 21:2031-2038)。アテローム性動脈硬化症を治療または予防する際の、例えば、配列番号：1、4もしくは6のペプチドまたはその模倣体の1つまたは複数を含む組成物などの、本発明の組成物の効力を同じ方法で実証することができる。
【０１００】
アテローム性動脈硬化症の度合いを抑制するかまたは軽減する際の、配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドを含む組成物などの、本発明の組成物のインビボでの有効性を上記のアテローム生成の齧歯類モデルで実証することができる。本発明の組成物がアテローム性動脈硬化症の退縮を引き起こす能力を実証するため、この齧歯類を実施例11に記述されているような、動脈硬化食で2週間飼育する。次いで、この動物を2群、つまり動脈硬化食をさらに2週間継続する一方の群、動脈硬化食を同じ期間継続するがしかし本発明の組成物も受け取るもう一方の群に分ける。本発明の組成物がアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を実験の後に、つまりその大動脈を動物から取り出して縦方向に切開するときに評価する。脂質が占有する内皮表面の領域を測定する。同様に、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定する。
【０１０１】
この齧歯類モデルを利用して、インビボでのSAA2.1ペプチド(配列番号：1および4ならびにそれらの組み合わせ)の抗アテローム生成活性を調べた。SAA2.1ペプチドによる処置マウス由来の肝臓は、未処置マウスの脂肪肝で観察された白っぽい色と比較して、より正常な赤みがかった色を示した。これらのデータは、これらのSAA2.1ペプチドがマクロファージでのコレステロール代謝を調節するということだけでなく、肝臓内でのコレステロール代謝も調節するということを示唆するものである。
【０１０２】
さらに、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤がアポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制しその退縮を誘発する能力について調べた。
【０１０３】
退縮実験では、アポEノックアウトマウスを実施例11に記載の動脈硬化食で4週間飼育し、その後、それらを2群に分けた。一方の群は、動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は、動脈硬化食を同じ期間継続したが、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図7AのB群および図7Bのhf+p1群)またはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図7AのD群および図7Bのhf+p4群)も受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図7AのA群および図7Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料(chow diet)で飼育した(図7AのC群および図7Bの低脂肪群)。図7Bには、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとを受け取ったさらなる追加群が示されており、これはhf+p1+p4と称されている。図7Bは、図7Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のデータを含むものである。2週間後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドO(Oil Red O)で染色した。図7Aのデータは、実際の脂質陽性領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図7Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として示している。これらの図面に示されるように、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤で処置したマウスは、高脂肪食で飼育した対照動物と比較して、大動脈病変の退縮を示した。
【０１０４】
抑制実験では、アポEノックアウトマウスは高脂肪食で飼育し、同時に、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図8Aの2の群および図8Bのhf+p1群)、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図8Aの4の群および図8Bのhf+p4群)またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドとを含むリポソーム(配列番号：1 + 配列番号：4；図8Aの5の群および図8Bのhf+p(1+4)群)を受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図8Aの1の群および図8Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育した(図8Aの3の群および図8Bの低脂肪群)。図8Bには、「空のリポソーム」と称される追加実験群が含まれており、この群は、ペプチドを含むリポソームと同じであるが但しタンパク質-ペプチドを含まない空のリポソームで処置された動物にあたる。この群は、リポソームで処置されなかった高脂肪および低脂肪(食)群とは異なる。図8Bに示されるデータは、図8Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験を含むものである。20日後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。これらの実験のデータを図8Aおよび図8Bに示す。図面中に示されるように、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤で処置したマウスは対照動物と比較して、大動脈病変の減少を示した。
【０１０５】
この十分に認められているアテローム性動脈硬化症齧歯類モデルでのこれらの実験によって、SAAペプチドまたは模倣体を含む本発明の薬学的組成物がさまざまな組織および/または細胞でコレステロール代謝経路を調節するというさらなる証拠が得られる。薬物動態学的スケーリング法などの技術を利用し、齧歯類でのこれらの研究を使って、ヒトを含むその他の種で体内動態を予測し薬物動態学的等価性を規定することや投与計画を設計することができる(Mordenti, J. (1986) J. Pharmceutical Sciences 75 (11): 1028-1040)。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物の投与は同様に、冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療にならびに炎症の予防または治療に有用であるものと予想される。
【０１０７】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願において引用されている全ての文献、係属中の特許出願および特許公報の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
実施例
実施例1: 動物
Swiss-white CD1系の6〜8週齢雌性マウスをCharles River, Montreal, Quebecから入手した。マウスは、12時間の明暗サイクルの恒温室中で飼育した。それらにPurina Lab固形飼料および水を自由に与えた。
【０１０９】
アポEノックアウトマウスは、Jackson Laboratories, Maine, U.S.Aから入手した。
【０１１０】
実施例2: 化学物質
全ての化学物質は試薬用とし、Fisher Scientific (Nepean, Ont.)、Sigma (St. Louis, MO)、ICN (Aurora, OH)またはBioRad (Hercules, CA)から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、Life Technologies (Burlington, Ont.)から購入した。放射性標識した[1-14C]-オレイン酸(52 mCi/mmol)、[1,2,6,7-3H(N)]-コレステロール(82 Ci/mmol)および[コレステリル-1,2,6,7-3H(N)]-オレイン酸(84 Ci/mmol)は、DuPont NEN (Boston, MA)から入手した。
【０１１１】
実施例3: ペプチド
PE Applied Biosystems 433Aペプチド合成機においてα-アミノ保護基として9-フルオレニルメトキシカルボニルを用いた固相ペプチド合成によって、以下のペプチドを合成した:
合成ペプチドの純度を、分析的高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびイオンスプレー質量分析により確認した。これらのペプチドを蒸留水に対し透析し、使用前に凍結乾燥した。
【０１１２】
実施例4: コレステロールの供給源としての赤血球膜の調製
組織傷害部位でのマクロファージによる細胞膜断片の摂取を模倣するため、Elyら(Amyloid 2001 8: 169-181)により記述されている手順にしたがって、赤血球膜断片を調製し、コレステロールの供給源として使用した。同量のコレステロール(赤血球膜断片として)を全ての実験で使用した。Allainらの方法(Clin. Chem. 1974 20:470-475)を利用し、Sigma社のコレステロール20試薬キット(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を活用して、赤血球膜調製物中のコレステロール濃度を測定した。
【０１１３】
実施例5: HDL、AP-HDLの調製ならびにアポA-1およびSAAアイソフォームの精製
HDLおよびAP-HDLは、AncsinとKisilevsky (Amyloid 1999 6:37-47；J. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)により記述されている手順にしたがって連続的密度浮揚を利用し、それぞれ正常マウスおよび炎症マウスから単離した。この手順では、マウスの背側上部の弛緩性皮膚下に2％ AgNO3 0.5 mLを皮下注射することによって、炎症を誘発した。24時間後に、CO2麻酔の後で、これらの動物を心臓穿刺により放血させて、その血液を0.5％ EDTA(終濃度)に回収した。次いで、遠心によって血漿を赤血球から分離した。炎症およびSAA合成の誘導ならびにマウス急性期血漿からのアポA-1、SAA1.1およびSAA2.1の単離は、AncsinとKisilevsky (J. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)の記述どおり行った。これらのタンパク質の分離および精製は、AncsinとKisilevsky(Amyloid 1999 6:37-47)の記述どおり逆相高圧液体クロマトグラフィーによって行った。単離したタンパク質の純度は、AncsinとKisilevsky(Amyloid 1999 6:37-47およびJ. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)の記述どおり質量分析およびN末端配列解析によって確認した。
【０１１４】
実施例6: アポリポタンパク質-脂質複合体の調製および特徴付け
アポA-1、SAA1.1、SAA2.1、マウスSAA1.1およびSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基にそれぞれ対応する合成ペプチド、ならびにマウスSAA2.1の21〜50位、51〜80位および74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを脂質とともに再構成して、リポソームを形成させた。モル比100/25/1/250の1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン/コレステロール/アポリポタンパク質/コール酸ナトリウムを用い、Jonasら(J. Biol. Chem. 1989 264: 4818-4825)により記述されているコール酸塩透析手順によって、これらのリポソームを作製した。コレステロールを含有させてリポソームを安定化し、リポソームをHDLのものにさらに似た組成とした。全ての調製は10 mM Tris-HC1、pH 7.4、0.15 M NaClおよび0.005％ EDTAを含有する緩衝液0.5 mL中で行った。この反応混合液を徹底的に撹拌し、4℃で12時間から16時間インキュベートした。平衡時間の終わりに、この試料を4℃のリン酸緩衝生理食塩水中で徹底的に透析した。1時間、15℃、15000×gの遠心によって未反応または沈降脂質を除去した後、そのリポソームを1.5×50 cm Sepharose CL-4Bカラムでろ過した。このリポソームを濃縮後、0.45 μm径のMillipore社製フィルターに通してろ過滅菌し、さまざまな濃度で組織培地と混合した。さまざまなタンパク質を含むリポソームの化学組成は、Lowryらの方法(J. Biol. Chem. 1951 193:265-275)を用いたタンパク質定量、比色キット(Wako Chemicals USA, Richmond, VA)を用いたリン脂質定量、および遊離コレステロールの酵素的分析(Sigma社製のコレステロール試薬キット, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO)から得た。
【０１１５】
実施例7: 細胞培養
J774マクロファージ(American Type Culture Collection, Manassas, VA；ATCC＃T1B-67由来)を1ウェルあたり細胞100万個で維持し、10％ FBSを添加したDMEM 2 mL中で90％のコンフルエンスまで増殖させた。培地は1週間に3回交換した。いくつかの実験では、ほぼコンフルエントな単層をクロロキン(100 μM)または8-ブロモ-cAMP(0.3 mM)の存在下で培養した。
【０１１６】
実施例8: コレステロール負荷および細胞によるコレステロールエステル化の測定
細胞にコレステロールを負荷するため、ほぼコンフルエントな単層を脂肪酸不含の2 mg/mLウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS-BSA)で3回洗浄し、5％リポタンパク質枯渇血清(LPDS) (d > 1.25 g/mL)および赤血球膜コレステロール175 μgを添加したDMEM中で5時間インキュベートした。添加したコレステロールのプール平衡のために、細胞培養物をPBS-BSAで2回洗浄し、5％ LPDS含有DMEM中で一晩インキュベートした。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの相対活性は、リポソームを含まない培地、タンパク質を含まないリポソームを含んだ培地またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)にそれぞれ対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームを含んだ培地で培養しておいたコレステロール蓄積細胞で測定した。上記の培地とともに3時間インキュベーション後、[14C]オレイン酸塩を添加し、細胞をさらに3時間インキュベートした(Mendez et al. J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705；Oram et al. Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)。細胞を氷上で冷却し、PBS-BSAで2回、PBSで2回洗浄した。内部標準として[3H]-コレステリルオレイン酸(6000 dpm/ウェル)の添加後、脂質を標識細胞から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、コレステリルエステルへの放射能の取込みをアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の一つの指標として定量した。
【０１１７】
実施例9: J774細胞でのコレステリルエステルの加水分解反応速度
新たにコンフルエントなJ774細胞を上述の赤血球膜によるコレステロール負荷の間に[14C]オレイン酸塩で標識した。次いで、細胞を5％ LPDSならびに天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-1、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)および74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドを含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するDMEM 2 mLとともに最大24時間までインキュベートした。コレステリルエステルの加水分解反応速度を測定するため、2 μg/mLのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤Sandoz 58-035 (プロパンイミド、3-(デシルジメチルシリル)-N-[2-(4-メチルフェニル)-1-フェニルエチル]-(9C1))をリポタンパク質またはリポソームとのインキュベーションの間に添加して、遊離した[14C]オレイン酸塩および遊離コレステロールの再エステル化を阻止した。コレステリルエステルの加水分解反応速度にはリソソームコレステリルエステルヒドロラーゼが必要となるかどうかを調べるために、細胞を50 μg/mLの天然HDLとクロロキン(100 μM)または50 μg/mLのSAA-HDLとクロロキンとの存在下で培養した。クロロキンは、リソソームのプロトン勾配をなくす作用物質である。さまざまな時点で、細胞脂質を抽出し、上述のようにコレステリルエステルの放射能について分析した。
【０１１８】
実施例10: 組織培養およびインビボでのコレステロール流出
J774細胞にコレステロールを負荷し、0.5 μCi/mL [3H]-コレステロールとともに3時間インキュベートし、続けて一晩の平衡時間インキュベートした。流出の研究の前に、細胞をPBS/BSAで4回洗浄した。次いで、細胞をBSAならびに5％ LPDSおよび天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-1、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドに加えて2 μg/mLのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤Sandoz 58-035を含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するDMEMとともに37℃でインキュベートした。その流出培地を0時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、遠心して細胞残屑を除去し、次いでこれを使用して輸送によるカウントを測定した。次いで、その細胞層を氷冷PBS/BSAで2回およびPBSで2回洗浄した。この細胞の一部を0.1 N NaOHに溶解して、残留放射能と細胞タンパク質含有量の両者を推定した。細胞脂質を細胞の残存部分から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、細胞のコレステロール全カウントを定量した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウント(細胞 + 培地のカウント)のうちの割合(％)として算出した。
【０１１９】
2 μM マウス・アポA-1、SAA1.1またはSAA2.1を含むリポソームを含有する培地へのJ774細胞からのコレステロールの輸送がcAMP依存性の過程であるかどうかを調べるために、培地への2 μM マウス・アポA-1、SAA1.1またはSAA2.1を含むリポソームの添加前に、放射性標識コレステロール蓄積細胞を8-Br-cAMP (0.3 mM)とともに一晩インキュベートした。次いで、培地へのコレステロールの流出を上記の表示時点で測定した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウントのうちの割合(％)として算出した。
【０１２０】
インビボでのコレステロール輸送を測定するため、前述のように赤血球膜および[3H]-コレステロールを用いてJ774マクロファージにコレステロールを負荷した。細胞をPBS/BSAで4回洗浄し、その後、培養皿から剥がした。細胞500万個をDMEM 200 μl中で対照マウスまたは炎症マウスに尾静脈から注入した。さまざまな時点で、血液約25 μlを各動物の尾静脈からヘパリン化キャピラリチューブの中に採血し、次いでAdams Autocrit Centrifuge中で5分間遠心して赤血球を血漿から分離した。シンチレーション分光測定によって血漿中に[3H]-コレステロールが出現するのを測定して、コレステロールの流出を定量した。
【０１２１】
J774細胞からの血漿へのコレステロールの輸送が、ABCA1輸送体経路によって調節されるかどうか、または注入細胞の内因性破壊によるものであるかどうかを研究するために、放射性標識コレステロール蓄積細胞を400 μM(終濃度)の4,4'-ジイソ-チオシアノスチルベン-2,2'-ジスルホン酸(DIDS)とともに一晩インキュベートし、非炎症および炎症マウスへの注入の前に、DIDSが含まれないように洗浄した。Kisilevskyら(Nat. Med. 1995 1:143-148)の記述どおり、2％ AgNO3溶液0.5 mLの皮下注射によって、炎症を小さな無菌性膿瘍の形態で背側に誘発させた。
【０１２２】
実施例11: アテローム性動脈硬化症の退縮の判定によるペプチドの有効性の評価
アテローム性動脈硬化症の退縮におけるSAA2.1ペプチドの有効性を調べた。試験したペプチドには、配列番号：1および配列番号：4が含まれた。これらのペプチドを2週間にわたるアテローム生成誘導の間、4日に1回(すなわち、6 mg/kg用量を4回)静脈注射した。
【０１２３】
これらのペプチドがアテローム性動脈硬化症の退縮を引き起こすかどうかを判定するために、動物を動脈硬化食(Paigenの齧歯類用動脈硬化食: ココアバター、コレステロールおよびコール酸の入ったPurina 5015(CI3002, Research Diets, Inc.))で2週間飼育し、その後、それらを各動物5匹からなる2群に分けた。一方の群は動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は動脈硬化食を同じ期間継続したが、ペプチドを含むリポソーム(前述のように、4用量)も受け取った。
【０１２４】
これらのペプチドがアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を評価するため、実験の後に、その大動脈を動物から取り出して縦方向に切開した。その内皮表面をオイルレッドOで染色し、脂質が占有した領域を画像解析によって測定した。さらに、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定した。血液を採血して、総血漿コレステロールレベルを測定した。
【０１２５】
SAA2.1ペプチド(配列番号：1および4)による処置マウスおよび未処置マウス由来の肝臓も回収した。総肝臓組織コレステロールおよびLDLレベルを分析することになっている。SAA2.1ペプチドによる処置肝臓の予備実験によって、それらが未処置マウスの肝臓で観察された白っぽい色と比較して、より正常な赤みがかった色をしていることが示された。これらのデータは、これらのSAA2.1ペプチドがマクロファージでのコレステロール代謝を調節するだけでなく、肝臓内でのコレステロール代謝も調節することを示唆する初めてのものである。これによってさらに、これらのSAAペプチドがさらなる組織/細胞でコレステロール代謝経路を調節できることが示唆される。
【０１２６】
実施例12: アテローム性動脈硬化症の抑制の判定によるペプチドの有効性の評価
アテローム性動脈硬化症を阻止するうえでのSAA2.1ペプチドの有効性について調べた。試験したペプチドには、配列番号：1および配列番号：4ならびに両ペプチドを等モルで組み合わせたものを含めた。これらのペプチドを含むリポソームを2〜3週間にわたるアテローム生成誘導の間、4日に1回(抑制実験の場合、6 mg/kg用量を5回)、8〜12週齢のアポEノックアウトマウスに静脈注射した。
【０１２７】
動物を5群(1群につき動物5匹)に分けた。陰性対照群は通常の固形飼料で飼育したのに対し、その他の4群は動脈硬化食(実施例11に記述したPaigenの齧歯類用動脈硬化食)を受け取った。これらの群の中で、ある群は高脂肪食を3週間継続した。その他の群は高脂肪食を同じ期間継続したが、配列番号：1のペプチドを含むリポソーム、配列番号：4のペプチドを含むリポソーム、またはこれらの両ペプチドを等モルで組み合わせたものを含むリポソームのいずれか(前段落で記述したように5用量)も受け取った。
【０１２８】
これらのペプチドがアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を評価するため、実験の後に、その大動脈を動物から取り出して縦方向に切開した。その内皮表面をオイルレッドOで染色し、脂質が占有した領域を画像解析によって測定した。さらに、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定した。血液を分離して、総血漿コレステロールレベルを測定した。
【０１２９】
実施例13: マウスSAA1.1の77〜103位の残基に対応するL-アミノ酸およびD-アミノ酸のペプチドによって調節された組織培養でのコレステロール流出
[3H]コレステロールを負荷したマクロファージをマウスSAA1.1の77〜103位のアミノ酸残基(配列番号：9)に対応する臭化シアン放出性の0.5 μMペプチド、対応する配列(配列番号：10)のD-アミノ酸の0.5 μM合成ペプチド、またはマウスSAA2.1の天然L-アミノ酸の74〜103位の残基(配列番号：7)に対応する0.5 μM合成ペプチドを含むリポソームの非存在下または存在下でプレインキュベートした。インキュベーション後、その細胞を0.2％ウシ血清アルブミン(BSA)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で徹底的に洗浄して、プレインキュベーション培地中の放射能およびリポソームを全て除去した。流出追跡用の培地はDMEM/BSAのみまたはHDL (50 μg/mL)含有培地で構成した。図2を参照されたい。この結果は各種のリポソーム前処理による、細胞から培地のアクセプター、つまりHDLへのコレステロールの流出を示す。その流出培地を1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、[3H]コレステロールについて分析した。総[3H]コレステロールは、(1.8〜2.1)×106 dpm/mg細胞タンパク質であった。
【０１３０】
実施例14: ヒト単球細胞系THP-1でのコレステロール流出
マウスSAA2.1がヒト由来単球細胞系THP-1(American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手；ATCC＃TIB-202)からのコレステロール輸送を増加するかどうかを判定するために、研究を行った。2 mM L-グルタミン、4.5 g/L グルコース、10 mM HEPES、1.0 mMピルビン酸ナトリウムを含有し、0.05 mM 2-メルカプトエタノールおよび10％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培地30 mlの入ったT-75フラスコの中で、ヒト単球を培養した。その後、細胞500万個を6-ウェル組織培養プレートの各ウェルの中に入れた。ホルボールミリスチン酸アセテート(100 nM)で処理することによって、この単球をマクロファージに分化させた。0.2％ウシ血清アルブミン中にて37℃で6時間、0.5 μCi/mL [3H]-コレステロールで予め標識しておいた赤血球膜断片(コレステロールとしては175 μg)ともにインキュベートすることによって、THP-1マクロファージをコレステロールで濃縮し、続けて一晩の平衡時間に進んだ。流出の研究の前に、細胞をPBS/BSAで4回洗浄した。次いで、細胞を5％ LPDSおよび天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-I、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドを含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するRPMI-BSA 2 mLとともに37℃でインキュベートした。その流出培地を0時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、遠心して細胞残屑を除去し、次いでこれを使用して輸送によるカウントを測定した。次いで、その細胞層を氷冷PBS/BSAで2回およびPBSで2回洗浄した。この細胞の一部を0.1 N NaOHに溶解して、残留放射能と細胞タンパク質含有量の両者を推定した。細胞脂質を細胞の残存部分から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、細胞のコレステロール全カウントを定量した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウント(細胞 + 培地のカウント)のうちの割合(％)として算出した。
【０１３１】
実施例16: 統計分析
対応のないスチューデントのt検定を使って、各群の平均を比較した。P < 0.05の値を統計学的に有意と見なした。大動脈の組織切片をANOVAにより比較した。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】各種のSAA2.1合成ペプチドを含むリポソームがマクロファージのコレステロール流出に及ぼすインビボ効果を調べた実験結果の線グラフである。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒丸として示されている。マウスSAA2.1の21〜50位のアミノ酸(配列番号：2)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白丸として示されている。マウスSAA2.1の51〜80位のアミノ酸(配列番号：3)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒三角として示されている。マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白三角として示されている。マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：5)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒四角として示されている。ヒトSAA1.1の1〜23位のアミノ酸(配列番号：6)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白四角として示されている。
【図２】組織培養においてマウスSAA1.1の77〜103位の残基に対応するL型(配列番号：9)およびD型(配列番号：10)アミノ酸のペプチドによって調節されたコレステロール流出を示す線グラフである。マウスSAA1.1の77〜103位のアミノ酸残基に対応する臭化シアン放出性の0.5 μMペプチドを含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、白丸で示されている。対応する配列のD型(配列番号：10)アミノ酸の合成ペプチドを含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、黒三角で示されている。マウスSAA2.1の天然L型の74〜103位のアミノ酸残基を含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、白の逆三角で示されている。対照、つまりDMEM/BSAのみからなる流出追跡用の培地は、黒丸として示されている。この結果は、これらのリポソームによる前処理後の細胞からの培地中のアクセプター、つまりHDLへのコレステロールの流出を示す。様々な時点で、その流出培地を回収し、[3H]コレステロールについて分析した。総[3H]コレステロールは、(1.8〜2.1)×106 dpm/mg細胞タンパク質であった。結果は、測定4回の平均±SEMである。
【図３】AおよびBは、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソーム、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソーム、またはこれらのペプチドをリポソームとして1:1の比率で組み合わせたもの(配列番号：1 + 配列番号：4)を投与したマウスマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究の用量反応データを示す線グラフである。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれる。図3Aでは、X軸、つまり濃度が均等目盛で示されており、図3Bでは、X軸、つまり濃度が対数目盛で示されている。これらのグラフによって示されるように、各ペプチド単独のものでは、用量の増加に応じてコレステロール流出が増加した。さらに、その2種のペプチドを組み合わせたものでは、相加的効果を超える効果が得られた。
【図４】本発明の各種のペプチドを含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞からのコレステロール流出の経時的変化を示す線グラフである。リポソームのみに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸で示されている。HDLに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白丸で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒三角で示されている。マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白三角で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えた(配列番号：7)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒四角で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白四角で示されている。
【図５】AおよびBは、ヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸(配列番号：12)に対応するペプチドを含むリポソームおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームを投与したマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究の用量反応データを示す線グラフである。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれる。図5Aでは、X軸、つまり濃度が均等目盛で示されており、図5Bでは、X軸、つまり濃度が対数目盛で示されている。これらのグラフによって示されるように、ヒトSAA1.1ペプチドは用量の増加に応じたコレステロール流出の増加という点で、そのマウスペプチドよりも効果的ではないにせよ、少なくとも同程度に効果的であった。
【図６】ヒトSAA1.1の78〜96位の残基のペプチドを各種濃度で含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞からのコレステロール流出の経時的変化を示す線グラフである。0.05 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸として示されている。0.05 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸で示されている。0.1 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白丸で示されている。0.5 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒三角で示されている。1.0 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白三角で示されている。2.5 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒四角で示されている。5.0 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白四角で示されている。
【図７】AおよびBは、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤が、アポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制するかまたはその退縮を誘発する能力を示す棒グラフである。図7Bは、図7Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のさらなるデータを含むものである。これらの実験では、動物を動脈硬化食(Paigenの齧歯類用動脈硬化食: ココアバター、コレステロールおよびコール酸の入ったPurina 5015(CI3002, Research Diets, Inc.))で4週間飼育し、その後、それらを2群に分けた。一方の群は、動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は、動脈硬化食を同じ期間継続したが、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図7AのB群；図7Bのhf+p1群)またはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図7AのD群；図7Bのhf+p4群)も受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図7AのA群；図7Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育した(図7AのC群；図7Bの低脂肪群)。図7Bには、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとを受け取った追加群が示されており、これはhf+p1+p4と称されている。2週間後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。図7Aのデータは、実際の脂質陽性の領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図7Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として示している。図7Aでは、動物5匹を各群で使用した。図7Bに示された各群の動物数はnとして記載されている。
【図８】AおよびBは、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤がアポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制する能力を示す棒グラフである。図8Bは、図8Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のさらなるデータを含むものである。図8Aに示される抑制実験では、アポEノックアウトマウスは高脂肪食で飼育し、同様に4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；2の群)、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；4の群)またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドとを含むリポソーム(配列番号：1 + 配列番号：4；5の群)を受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(1の群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育された(3の群)。20日後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。図8Aのデータは、実際の脂質陽性の領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図8Aでは、動物5匹を1〜3および5の群で使用した。4の群では、動物1匹が実験の間に死亡したので、動物4匹を使用した。図8Bには、「空のリポソーム」と称される追加実験群が含まれており、この群は、ペプチドを含むリポソームで使用されたものと同じであるが、但しタンパク質-ペプチドを含まない空のリポソームで処置された動物にあたる。この群は、リポソームで処置されなかった高脂肪および低脂肪(食)群とは異なる。図8Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として表している。図8Bでは、動物数はnとして記載されている。「高脂肪食」、「低脂肪食」、「hf+p1」、「hf+p4」およびhf+p(1+4)と称される群は、図8Aのそれぞれ、1、3、2、4および5の群に対応する。
【図９】本発明の各種のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ペプチドのリポソーム製剤の存在下でのマウスJ774細胞におけるインビトロでのコレステロール流出の経時的変化の研究を示す線グラフである。ヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒丸として示されている。ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、白丸として示されている。ヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒三角として示されている。ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、白三角として示されている。ヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒四角として示されている。
【図１０】コレステロール蓄積J774細胞でのコレステロール流出に対する等モル濃度と、完全長のマウスSAA2.1を含むリポソームとマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)およびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとの効果を比較する棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
コレステロールの貯蔵を阻害するのにならびに被験体において炎症部位またはアテローム性動脈硬化部位からのコレステロールの流動および放出を増強するのに有用なペプチドが同定された。本発明は単離ペプチド、より好ましくは化学的におよび組換え的に合成されたペプチドを含む合成ペプチド、化合物ならびにこれらのペプチドおよび化合物の模倣体、ならびに1つもしくは複数のこれらのペプチドもしくはその一部分、または化合物、あるいはこれらの模倣体を含む薬学的組成物、ならびにアテローム性動脈硬化症および炎症に加えてさらに冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療および/または予防にこれらのペプチドまたはその模倣体、化合物またはその模倣体および薬学的組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心疾患を含めて、心臓血管疾患は、北米では成人の死因の単独1位である(2002 Heart and Stroke Statistical Update)。冠状動脈におけるアテローム性動脈硬化の発生および進行は、心臓発作および狭心症を引き起こす可能性がある。1999年には、1260万人の米国人が冠状動脈性心疾患を抱えていると推定された。1999年の死因のおよそ5つに1つは冠状動脈性心疾患によるものとされており、米国およびカナダの全死亡数はそれぞれ500,000人および42,000人を超えていた。10,200万人を超える米国成人が高い危険性の境界域にある血中コレステロールレベル、または冠状動脈性心疾患を発症する危険性の高い血中コレステロールレベルを有するものと推定されている。心臓発作が我々の医療制度に及ぼす即時の社会的および経済的負担に加えて、冠状動脈性心疾患イベントの後遺症に付随する多大な費用もかかる。男性の約25％および女性の約38％が心臓発作から1年後に死亡しており、冠状動脈性心疾患による死亡は人の生産年齢ピークの間に起こる傾向がある(BRFSS [1997], MMWR vol. 49, No. SS-2, March 24, 2000, CDC/NCHS)。労働力人口での早発的および永久的な能力喪失状態と関係する冠状動脈性心疾患のさらなる経済的負担もある。1998年には、冠状動脈性心疾患に対し100億ドル以上が医療保険受給者に支払われた(Health Care Financing Review, Statistical Supplement [2000], HFCA)。
【０００３】
患者には、現在、心臓血管疾患/冠状動脈性心疾患を治療するのにいくつかの異なる薬物の選択肢がある。これらの薬物は降圧薬および抗高脂血症薬を含めて、さまざまなクラスに分類される。これらの製品は冠状動脈性心疾患の進行の低減および心臓発作の予防に有益であるということが示されているが、それらは寛容性が低いために、場合によっては、肝臓の補整効果による薬効の軽減のために、個体によってはその有効性が限定されることがある(Turley, S. D. (2002) Am.J. Managed Care 8 (2 Suppl):S29-32)。
【０００４】
マクロファージおよび平滑筋細胞などの、いくつかの大動脈および動脈細胞型における脂質、とりわけコレステロールの蓄積はアテローム性動脈硬化症の決定的な病理学的特徴である(Gotlieb et al. (1999) Blood Vessels. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. L., editors. Lippincott-Raven, Philadelphia, New York. 481-530)。この問題と関係する2つの中心的課題を理解するために、主要な研究努力が費やされている。第1のものは、これらの細胞に、コレステロールが運搬されて取り込まれる機構に関する。第2のものは、これらの細胞がその細胞自身から過剰なコレステロールを輸送し除去する過程に関する。アテローム性動脈硬化症の治療および予防では、目的の1つはこれらの細胞の生存性に悪影響を及ぼす大量のコレステロールの細胞内蓄積を抑え、それによって最終的には血管壁の構造的完全性を変化させることである。
【０００５】
類似の一連の事象が急性組織傷害でも起こる。そのような傷害は局所的な細胞死をもたらし、局所炎症および全身性急性期反応を発動する(Fantone, J. C. and Ward, P. A. (1994) Inflammation. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. editors. Lippincott, Philadephia. 32-6)。局所的なコレステロール処理の変化はこの過程の重要な要素である。急性組織傷害の部位で、瀕死の細胞はコレステロールに富む細胞膜断片を含んだ大量の細胞残屑を放出する(Fantone, J. C. and Ward, P. A. (1994) Inflammation. In Pathology. Rubin, E. and Farber, J. editors. Lippincott, Philadephia. 32-6)。急性炎症の一環として、傷害部位に到達したマクロファージはこれらの断片をさらに処理するために取り込み、それによって相当なコレステロール負荷を受け、その結果、アテローム性動脈硬化症で見られるものに類似した泡沫細胞になる。急性組織傷害およびその結果として起こる急性炎症過程の間、排出または再利用に向けてコレステロールを移動させるのにコレステロール除去機構が必要になる。
【０００６】
組織傷害に反応して肝臓で合成される主要な急性期(acute phase：AP)タンパク質の1つ、血清アミロイドA(serum amyloid：SAA)の生理学的役割は、これらの事象および過程に直接関連する。SAAは多重遺伝子族によってコードされる6億年以上にわたって保存されてきた4種の多型タンパク質の群を表す(Jensen et al. (1997) J. Immunol. 158: 384-392；Santiago et al. (2000) J. Exp. Zool. 288: 3335-344)。アイソフォームSAA1.1およびSAA2.1は急性期の組織傷害において血漿中に存在しており、最も徹底的に調べられている。
【０００７】
研究者らはヒトおよび動物モデルにおける複数のSAA遺伝子やその対立遺伝子多型の体系的な命名法に対する必要性を認識していたので、血清アミロイドAに対する命名法が1999年に改訂された(Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1999 6:67-70)。主な改訂はマウスSaa1およびSaa2遺伝子の再命名であった。染色体マッピングに基づけば、マウスSaa2の遺伝子座はヒトSAA1に対応するものと思われる。したがって、マウスでの命名法がヒトでの命名法と完全に適合するように変更された。
【０００８】
下記表は、SAAのマウスおよびヒトタンパク質に対して改訂された命名法ならびにその対応配列を示している。これらの表は1999年のAmyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 6:67-70にある開示に基づいている。しかしながら、本明細書に示される表は、アライメントを明確にするためにおよび付加的なアミノ酸を含むマウスアイソフォームSAA3の残基(-1)に番号を付与するために変更されている。
【０００９】
（表１）マウスSAAタンパク質
【００１０】
（表２）ヒトSAAタンパク質
本特許出願で使用したSAAタンパク質の命名法は、上記表に記載の改訂された命名法に対応している。しかしながら、この1999年の改訂前に刊行された学術文献およびこの1999年の改訂前に出願された特許出願は旧命名法を使用している可能性があり、したがって、例えば、マウスSaa1をマウスSaa2と呼んでおり、逆の場合も同じであるということを理解しなければならない。
【００１１】
SAAアイソフォームのSAA1.1およびSAA2.1は、組織傷害および炎症のさまざまな要因に反応して肝細胞により主に産生される(Morrow et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4718-4722)。活性化マクロファージによって放出され、肝細胞の細胞質および核内の一連の下流エフェクターを介して作用する、インターロイキン-1、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子などのサイトカインによって、肝臓によるSAA1.1およびSAA2.1の合成が誘発される。
SAA1.1およびSAA2.1遺伝子に対する最大転写速度は、組織傷害後の3〜4時間で見られ、傷害より18〜24時間以内に、これらの2種のタンパク質の血漿濃度が1〜5 μg/mLから500〜1000 μg/mL(500〜1000倍の増加)に上昇する(McAdam et al. (1978) J. Clin. Invest. 61:390-394；McAdam, K. P., Sipe, J. D. (1976) J. Exp. Med. 144:1121-1127)。SAA1.1およびSAA2.1は肝細胞からいったん分泌されると、高比重リポタンパク質(HDL)分画中に主に見出され、これらはHDLアポリポタンパク質の30〜80％を形成し、したがってHDL分画のアポリポタンパク質組成の大規模な再編成を引き起こす(Benditt et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4092-4096；Hoffman, J. S. and Benditt, E. P. (1982) J. Biol. Chem. 257: 10518-10522)。
【００１２】
現在、組織傷害の間に観察されているSAA発現の増加がアテローム性硬化病変に対する有益な役割と関係するのかどうか、またはSAAレベルの増加が実際には、アテローム性動脈硬化の発生における役割と関係するのかどうかの論争がる。
【００１３】
SAAアイソフォームレベルの上昇は臨床症状が明らかになるのに先立って、アテローム性動脈硬化症に直結する初期の病的血管事象の間に観察される(Kisilevsky, R. and Tam, S. -P. (2002) Pediatric Pathol. and Mol. Med. 21:291-303に概説されている)。この上昇によって、研究者のなかにはSAAレベルがアテローム性動脈硬化症において原因となる、寄与的な役割を果たしている可能性があるということを提唱するものもいる。
【００１４】
しかしながら、SAAおよびそのアイソフォームがマクロファージからのコレステロールの流出を促進させるという報告もある。
【００１５】
例えば、高比重リポタンパク質-血清アミロイドA(HDL-SAA)は、低比重リポタンパク質/超低比重リポタンパク質(LDL/VLDL)からコレステロールを受け入れる能力が低下していることが示されており、それによってHDLは、その導入経路(afferent route)において、可能な限り少ないコレステロールを運搬しているマクロファージに到達することができるようになる(Kisilevsky et al. (1996) Amyloid 3: 252-260)。すなわち、この形態のHDLは、コレステロール蓄積マクロファージからコレステロールを受け入れる能力がより高い。HDL-SAAはまた、HDL単独のものと比較して、マクロファージに対し3倍から4倍高い親和性を有することが実証されている。さらに、AP炎症反応のある動物から採取されたマクロファージ上のHDL-SAA結合部位の数に増加が見られた。マクロファージを使った競合研究(Kisilevsky, R. and Subrahmanyan, L. (1992) Lab. Invest. 66: 778-785)から、非標識HDL-SAAは効果的に標識HDL-SAAに取り代わったが、HDL単独のものではそうならなかった。HDL-SAAによるこの選択的置換は、マクロファージ上にSAA受容体が存在することを示唆している可能性が高い。このようなSAA受容体はマクロファージ上のアポA-1の結合部位に対し別個であり付加的である(Kisilevsky, R. and Subrahmanyan, L. (1992) Lab. Invest. 66: 778-785；米国特許第6,004,936号)。SAA受容体の存在は、HDL-SAAがマクロファージへの結合の直後にクラスリン被覆ピット中に存在していたという証明からさらに支持されている。これらのピットおよびその結果生ずるエンドソームは、受容体を介した飲食作用の概念、SAAが効果的に結合する細胞表面ヘパラン硫酸に依存する過程と一致している(Ancsin, J. and Kisilevsky, R. (1999) J. Biol. Chem. 274:7172-7181；Rocken, C. and Kisilevsky, R. (1997) Amyloid 4: 259-273)。
【００１６】
より最近の研究では、SAAは、マクロファージによるHDLの取込みを増強し(Banka et al. (1995) J. Lipid Res. 36:1058-10865)、コレステロールに対する親和性を有する(Liang, J. S. and Sipe, J. D. (1995) J. Lipid Res. 36:37-46)ということが実証されている。ヒトアポSAA1(現在ではSAA1.1と称される)の1〜18位の残基および40〜63位の残基、ならびにヒトアポSAA4(現在ではSAA4と称される)の1〜18位の残基に対応する合成ペプチドを利用して、アポSAA1はコレステロールをアミノ末端領域で結合するがアポSAA4は結合しないということが示された(Liang et al. (1996) J. Lipid Res. 37:2109-2116)。
【００１７】
さらに、マウスSAA2.1は、無傷のマウスマクロファージにおいて培養下でおよポストヌクレア(post-nuclear)ホモジネートでマクロファージのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性を用量依存的に阻害することが示されたが、マウスSAA1.1では示されなかった(Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181)。逆相HPLCにより精製したマウスSAA2.1の臭化シアン生成による切断断片のさらなる試験から、マウスSAA2.11〜16はACAT活性を用量依存的に阻害するのに絶大な効果があるということが示された。対照的に、マウスSAA2.124〜103はACAT活性に阻害効果を示さなかった(Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181)。
【００１８】
マウスSAA2.1は、肝臓、マクロファージおよび膵臓のコレステロールエステラーゼ活性をインビトロで刺激することも示されている(Lindhorst et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1339:143-154；Ely et al. (2001) Amyloid 8:169-181；Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。この効果は、臭化シアン切断によって遊離されたマウスSAA2.1の80残基のCOOH末端領域にあることが示された(Ely et al.(2001) Amyloid 8:169-181)。この80残基の領域には、マウスSAA2.1の24〜103位の残基が含まれる。
【００１９】
HDL-SAAおよびマウスSAA2.1含有リポソームが、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の顕著な減少およびコレステロール流出活性の増強を引き起こす能力が培養下のマクロファージで確認されている(Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。[3H]-コレステロール負荷マクロファージを炎症マウスに静脈注射することによって、同じように処置した炎症のない対照動物と比較した場合、血漿中に放出される放射性標識コレステロールの量が3倍から3.5倍増加することも報告されている(Tam et al. J. Lipid Res. 2002 43:1410-1420)。この研究では、マクロファージのコレステロール流出は、コレステロール逆輸送経路の初期段階に重要なタンパク質であるATP結合カセット輸送体、ABCA1と共役していることが示された。さらに、[3H]-コレステロール蓄積マクロファージは、組織培養下でHDL-SAA2.1(マウス)によって前処理し、次いで非炎症マウスに注射した場合、そのコレステロールを血漿中に素早く放出させた(Tam et al. (2002) J. Lipid Res. 43:1410-1420)。この結果は、マクロファージをHDL単独のもので処理した場合には観察されなかった。
【００２０】
このように、アイソフォームSAA1.1およびSAA2.1は炎症の間に上方制御されており；それらは進化的に保存されており；ならびにそれらはコレステロール逆輸送経路においてHDLおよびHDLの確定されている役割と主に関連している。
【００２１】
米国特許第5,318,958号は、HDLに対する血清アミロイドA親和性のあるリガンドに結合したHDLの有効量を投与することによって、インビボでマクロファージのコレステロールの放出および回収を増強する方法を開示している。この特許で開示されているこの方法の好ましいリガンドは、血清アミロイドAそのものである。
【００２２】
米国特許第6,004,936号は、米国特許第5,318,958号に類似の方法について記述している。しかしながら、米国特許第6,004,936号で主張されている方法では、血清アミロイド親和性を有するリガンドは投与前にHDLに結合されていない。この特許では、血清アミロイド親和性を有する好ましいリガンドはSAA2.1のような血清アミロイドAの非アミロイド生成性のアイソフォームであることが開示されている。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
哺乳類血清アミロイドAアイソフォーム2.1(SAA2.1)および1.1(SAA1.1)の選択されたペプチドドメインならびにその模倣体は、マクロファージ・コレステロールエステルヒドロラーゼ(CEH)活性に対する強力な増強効果および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性に対する阻害効果を有することが本明細書で実証される。本明細書で示されるように、これらのペプチドおよびその模倣体は、マクロファージのコレステロールを、コレステロール輸送体およびコレステロールアクセプターである高比重リポタンパク質(HDL)の存在下で細胞から迅速に輸送される輸送可能な形態へ移行させる。すなわち、これらのペプチドおよびその模倣体は、コレステロールの貯蔵を阻害する方法、ならびに被験体において炎症部位またはアテローム性動脈硬化部位からのコレステロールの流動および放出を増強する方法において、有用である。
【００２４】
したがって、本発明は、ペプチドおよび化合物ならびにこれらのペプチドおよび化合物の模倣体と、これらのペプチドもしくはその一部分、これらのペプチドもしくはその一部分の化合物および模倣体または化合物を含む薬学的組成物と、マクロファージのコレステロール代謝酵素であるコレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性を調節するためのこれらのペプチド、化合物および薬学的組成物の使用方法とを提供する。
【００２５】
本発明の一つの局面は、SAAタンパク質のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインのペプチド、ペプチド変異体またはその模倣体に関する。今回、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインが、マウスSAA2.1のC末端の74〜103位の残基およびマウスSAA1.1のC末端の77〜103位の残基にあると同定された。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインは、マウスSAA2.1のN末端の1〜16位の残基にあり、ならびにヒトSAA1.1およびSAA2.1のN末端の1〜23位の残基にある。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる好ましいペプチドまたはその模倣体には、式
またはその一部分を含む単離ペプチドまたはその模倣体が含まれ、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。同様に好ましいのは、
を含むペプチドまたはその模倣体、および
を含むペプチドまたはその一部分のペプチド変異体またはその模倣体である。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００２６】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明の好ましいペプチドには、式
またはその一部分を含む単離ペプチドまたはそのペプチド変異体もしくは一部分あるいはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1のN末端の類似領域またはそのペプチド変異体もしくは一部分が含まれ、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、nは1または2である。nが1である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびにX3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸である。nが2である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびにXb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。同様に好ましいのは、
を含む単離ペプチドまたはこれらのペプチドうちの1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分である。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００２７】
好ましい変異体には、1つまたは複数のD型アミノ酸を含み、同等に有効であるが但しインビボで分解を受けにくいペプチド、および環状ペプチドが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２８】
同様に好ましいのは、本発明の2つまたはそれ以上の連結または結合ペプチドを含む変異体である。特に好ましいのは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できるペプチドに連結または結合されたコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できるペプチドを含む変異体である。
【００２９】
本発明は同様に、上記のペプチド、ペプチド変異体またはその一部分のいずれかの模倣体に関する。
【００３０】
本発明の他の局面は、Y-ZまたはQ-Y-Zの式を有する化合物に関し、式中、Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する本発明の単離ペプチドまたは模倣体を含み；ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；ならびにQを含む態様では、Qは、Q-Y-Z化合物の能力を同様に増強する、Y-Zに連結された他の化合物を含んでもよい。QはZと同一であってもよくまたはZとは異なっていてもよい。典型的なZまたはQ化合物には、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質が含まれるが、これらに限定されることはない。Zおよび/またはQの典型的な標的化物質には、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたはSAA受容体に対するリガンドなどのマクロファージ標的化物質、肝臓標的化物質、抗体および、例えば、Fab断片などのその活性断片、ならびにアテローム斑および/または炎症部位に特異的なさらなる物質が含まれる。
【００３１】
本発明の他の局面は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害しかつ/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチド、ペプチド変異体もしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物はさらに、インビボ投与に薬学的に適した賦形剤を含む。一つの態様では、単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物を脂質と複合体化する。ペプチドもしくはその模倣体または化合物を封入するリン脂質小胞を使用することもできる。
【００３２】
本発明の他の局面は、コレステロール代謝酵素の活性を改変するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。具体的には、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体、または本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体を含む薬学的組成物を用いて、コレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性を改変することができる。本発明の好ましい態様では、その酵素活性をインビボで改変する。より好ましいのは、ヒトでの酵素活性の改変である。
【００３３】
本発明の他の局面は、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を増加かつ/または促進するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。本発明の好ましい態様では、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進がインビボで起こる。より好ましいのは、ヒトでのアテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進である。
【００３４】
本発明の他の局面は、炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を増加かつ/または促進するための、これらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体、またはこれらのペプチド、化合物およびこれらの模倣体を含む薬学的組成物の使用に関する。本発明の好ましい態様では、炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進がインビボで起こる。より好ましいのは、ヒトでの炎症部位に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出の増加および/または促進である。
【００３５】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３６】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、心臓血管疾患の治療方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３７】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、冠状動脈性心疾患の治療方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３８】
本発明の他の局面は、本発明のペプチド、化合物もしくはこれらの模倣体または薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を治療または予防する方法に関する。好ましい態様では、被験体はヒトである。
【００３９】
発明の詳細な説明
およそ1300万人の北米人がコレステロール低下薬物を服用しており、これらの個体の大部分が現在、スタチンとして知られる部類の薬物で治療されている。コレステロール合成阻害剤(スタチン)は、大部分が安全で非常に効果的であると考えられる。しかしながら、この薬物の部類には最近いくつかの失敗が起きている。例えば、Bayer社のスタチンBaycol(商標)の2001年の自主回収、AstraZeneca社のスタチンCrestor(商標)の北米への導入遅延、および長期にわたるスタチンの使用に伴う健康上の危機に関する最近の懸念(Clearfield, M.B., (2002) Expert Opin. Pharmacother. 3:469-477)は、新薬の必要性を示唆するものである。
【００４０】
したがって、製薬会社は、現在の市販薬のものとは異なる機序を介して働く薬物を現在開発中である。異なる機序を通じて作用する2種類またはそれ以上の種類の薬物による治療は、実際に、コレステロールレベルを低下させるその能力の組み合わせにおいて付加的または相乗的とすることができる(Brown, W. V. (2001) Am. J. Cardiol. 87 (5A): 23B-27B；Buckert, E. (2002) Cardiology 97: 59-66)。最近になってFDAに承認されたEzetimibe(Zetia(商標)、Merck)は、単独でコレステロールレベルを顕著に低下させることができる。さらに、Ezetimibeはコレステロール吸収を減少させることによって作用する(すなわち、コレステロール輸送を遮断する)ので、これをコレステロール合成阻害剤(スタチン)とともに投与して、いずれかの薬物を単独で投与する場合よりもはるかに血漿コレステロールレベルを減少させることもできる(Davis et al. (2001) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21: 2031-2038；Rader, D.J. (2002) Am. J. Managed Care 8 (2 Suppl): S40-44)。
【００４１】
臨床試験中のAvasimibe (Pfizer)、Eflucimibe (Eli Lilly)およびCS-505 (Sankyo)などの他の薬物は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)活性の阻害を目的としている。
【００４２】
Esperion Therapeutics社、Tularik Inc社およびカナダの会社Xenon Genetics社などの会社は、体外へのコレステロールの排泄に重要であることが知られているコレステロール逆輸送経路で中心的な役割を果たすHDL、つまりいわゆる「善玉コレステロール」のレベルを増加させる方法を開発中である。
【００４３】
しかしながら、アテローム性動脈硬化症の治療に向けた新規化合物を作出するよう製薬会社によって相当な努力が続けられてきたが、現在のところ、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強させることによって、アテローム斑に位置するマクロファージからの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる能力を有する薬物は市場に存在していない。
【００４４】
マクロファージなどの血管細胞におけるコレステロールの蓄積は、アテローム性動脈硬化症の決定的な病理学的特徴である。マクロファージは脂質の貯蔵および除去において重要な細胞である。マクロファージの泡沫細胞(コレステロール蓄積マクロファージ)への転換は、アテローム斑の形成において初期の重要な病理学的過程である。
【００４５】
細胞のコレステロールバランスの維持には、2種類の酵素が重要である。
【００４６】
コレステロールエステラーゼおよびコレステリルエステルヒドロラーゼとも呼ばれるコレステロールエステルヒドロラーゼは、マクロファージからのコレステロールの除去または流出を促進させる。この酵素は中性型だけでなく酸性型でも存在しており、本発明の全て局面はいずれの型にも適用可能であるが、中性型の修飾が好ましい。
【００４７】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼは、マクロファージによるコレステロールの貯蔵を促進する。急性期炎症反応の間、血清アミロイドA(SAA)のアイソフォーム1.1および2.1は高比重リポタンパク質の主成分となり、この複合体はマクロファージよって内部に取り入れられる。本明細書で示されるように、マウスSAA1.1ではなく、マウスSAA2.1は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害し、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強し、それによって輸送可能な形態のコレステロールの方へそのバランスを移行させる。血清アミロイドA(SAA)はマクロファージに対するアポA-1結合親和性とは異なる、マクロファージに対する特異的な結合親和性を有することが実証されている。マウスアイソフォーム2.1は、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するとともに、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害することが示された最初のタンパク質である。しかしながら、本明細書で明らかなように、ヒトSAA1.1およびヒトSAA2.1は、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強し、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害するペプチドドメインを含むものである。
【００４８】
本発明者らは精製酵素、細胞ホモジネートおよび全細胞を利用し、急性期-HDL(AP-HDL；HDL-SAA)が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼおよびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性に及ぼすインビトロ効果ならびに細胞コレステロール輸送に及ぼすインビトロ効果を研究した。マクロファージの顆粒ホモジネートをアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの供給源として用いたインビトロ研究の結果から、マウスSAA2.1は用量依存的にアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害することが示された。対照的に、マウスSAA1.1およびアポA-1は効果がなかった。本発明者らは、マウスSAA2.1を含むリポソームだけでなく、AP-HDLも組織培養下にある無傷のコレステロール蓄積マクロファージにおいて、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の顕著な減少およびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性の増強を引き起こすことを示した。対照的に、HDL単独、SAA2.1を含まないリポソームおよびマウスSAA1.1またはアポA-1を含むリポソームは、酵素活性に効果がなかった。放射性標識コレステロールを予め負荷し炎症性または非炎症性マウスに静脈注射したマクロファージを利用し、高いSAA2.1レベルを有する炎症性マウスは、その非炎症性対照マウスよりもコレステロールを迅速におよび大きな(6倍大きな)度合いで流出することが明らかになった。さらに、マウスSAA1.1、マウスSAA2.1またはアポA-1のいずれかを含むリポソームで予め処理し、その後、非炎症性マウスに静脈注射したコレステロール蓄積マクロファージを利用し、本発明者らは今回、マウスアイソフォーム2.1を含むリポソームだけが炎症性マウスで認められた大きなコレステロール放出効果を再現することを明らかにした。
【００４９】
インビトロおよびインビボの両アッセイ法を利用し、マウスSAA2.1のこれらの特異的性質は2箇所のペプチドドメインにあることが実証された。マウスSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインは、SAA2.1のN末端の1〜16位の残基にある。しかしながら、マウスSAA2.1の臭化シアン切断によって放出されたこのN末端の16残基のドメインは、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性には効果がなかった。その代わりに、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するマウスSAA2.1のC末端の30残基のドメインが今回、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するマウスSAA2.1の領域として同定された。具体的には、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するドメインは、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸に対応するものと同定された。
【００５０】
本明細書で示されるように、マウスSAA2.1ならびにヒトSAA1.1およびヒトSAA2.1の中にあるこれらのドメインを含んだアミノ酸配列を有する単離ペプチドは、インビトロとインビボの両方で、マクロファージのコレステロールエステルヒドロラーゼ活性に対する強力な増強効果およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に対する阻害効果を有する。これらのドメインまたはその一部分のアミノ酸配列を含むように合成されたペプチドは、マクロファージのコレステロールを、機能的なコレステロール輸送体およびコレステロールアクセプター、つまり高比重リポタンパク質の存在下で細胞から迅速に輸送される輸送可能な形態へ移行させる能力を有する。さらに、これらの単離ペプチドは、単回の静脈注射によって4日間にわたりインビボでマクロファージのコレステロールを動態化することから、非常に活性がある。
【００５１】
マウスSAA2.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基
21〜50位のアミノ酸残基
51〜80位のアミノ酸残基
および74〜103位のアミノ酸残基
に対応するペプチドをそれぞれ、固相ペプチド合成により合成した。同様に、ヒトSAA1.1および/またはヒトSAA2.1の1〜23位のアミノ酸残基
に対応するペプチド、ならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
ヒトSAA2.1の79〜96位の残基
ヒトSAA2.1の80〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の81〜96位の残基
に対応するペプチドを合成した。さらに、マウスSAA1.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基
に対応するペプチド、ならびにマウスSAA1.1タンパク質配列の1〜20位のアミノ酸残基にN末端のアルギニンを加えた
に対応するペプチドを合成した。合成ペプチドである配列番号：1〜7は、L型アミノ酸を含む。天然型のSAA1.1およびSAA2.1がグリコシル化されないのと同様に、本発明のこれらの合成ペプチドもグリコシル化されない。
【００５２】
さらに、マウスSAA2.1の臭化シアン切断は、16 mer(SAA2.11〜16)の不溶性断片ならびに2つの可溶性断片、7 mer(SAA2.117〜23)および80 mer(SAA2.124〜103；本明細書で配列番号：23として記載)の断片をもたらすことが明らかにされている(Ancsin, J. et al. J. Biol. Chem. 274: 7172-7181, 1999)。マウスSAA1.1の場合、76位の残基でIleをMetと置換してさらなる切断部位を導入し、これによって80 merの断片を53 mer(SAA1.124〜76)および27 mer(SAA1.177〜103)の断片に切断することができる。マウスSAA2.1およびSAA1.1の最後の27残基は次の通りである:
これらの2つの配列におけるアミノ酸残基の唯一の相違は、101位(太字および下線)に存在する。
【００５３】
これらの合成ペプチドを利用して、コレステロールエステルヒドロラーゼの調節に関与しているSAA2.1中のドメインのマッピング、ならびにコレステロールエステルヒドロラーゼ活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の調節に有用な組成物の同定を行った。
【００５４】
本明細書で示されるように、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともにJ774マクロファージを予めインキュベーションすることによって、HDL含有培地へのマクロファージの[3H]コレステロールの流出速度の顕著な増加が起こった。本発明者らは今回、天然のマウスSAA1.1タンパク質(SAA1.177〜103；配列番号：9)のCNBr切断から生じたさらに短いペプチドを含むリポソームも類似の効果を有するということを見出した。具体的には、培地への[3H]コレステロールの流出が、マウスSAA1.177〜103で処理したマクロファージとマウスSAA2.174〜103で処理したマクロファージの両者で類似しているということが実証された。
【００５５】
これらのデータから、マウスSAAの74〜76位の残基は、マクロファージのコレステロールの流出を促進させるのに必要ではない可能性が示唆される。さらに、101位の残基は不必要であると考えられる。実際に、約12種の配列の試験から、SAA1.1およびSAA2.1の、プロリンに富んだ末端8残基は、CEH増強活性に不必要である可能性が高いということが示唆されている。したがって、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸までの19残基のペプチドがCEH増強特性を保有するものと考えられる。さらに、ヒトSAA1.1の78〜96位の残基に対応する共通配列
を含むペプチド、ならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の79〜96位の残基
に対応するペプチドは、コレステロールの輸送を増加させることが本明細書で示される。すなわち、このペプチドならびにヒトSAA2.1の78〜96位の残基
およびヒトSAA2.1の79〜96位の残基
に対応するペプチドは同様に、CEH増強特性を保有するものと考えられる。
【００５６】
加えて、これらのデータから、SAA1.1およびSAA2.1の三次構造(すなわち、3次元構造、タンパク質の折り畳み)間の相違がさらに明らかとなる。これはSAA2.1とは異なり、天然のSAA1.1タンパク質がマクロファージのコレステロール流出を促進させないためである。この情報およびさらなるモデリングの研究は、低分子模倣体の設計に向けたSAAのタンパク質およびペプチドの分子モデリングに有用である。
【００５７】
本発明者らは同様に、そのようなペプチドが1つまたは複数のD型アミノ酸を含むように修飾することによって、インビボでさらに安定となり分解を受けにくくなるものと予想される同等に有効なペプチドが得られることを示した。図2を参照されたい。全てD-アミノ酸からなるマウスSAA1.1のアミノ酸配列、77〜103位に対応する合成ペプチド(D型
本明細書では配列番号：10とも呼ばれる)は、細胞を対応する天然のL-アミノ酸のマウスSAA1.1のペプチドで並行的に処理した場合に、培地へのマクロファージのコレステロール輸送の促進において類似の効果があった。
【００５８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性の促進に関与するSAA2.1のドメインの同定は、放射性標識コレステリルエステルを予め負荷したJ774細胞で行った。これらの実験は、遊離したコレステロールおよび[14C]オレイン酸塩の再エステル化を阻止するため、Sandoz 58-035、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の存在下で行った。インキュベーションを0〜24時間までの時間続け、その後、細胞中の[14C]-標識コレステリルオレイン酸の残量を測定して、コレステリルエステルの加水分解反応速度を決定した。再エステル化が遮断された状態では、タンパク質を含まないリポソームまたはマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位および51〜80位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドをそれぞれ含むリポソームの存在下で培養した細胞中の[14C]-標識コレステリルオレイン酸の加水分解反応速度には有意な相違がなかった。しかしながら、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含む等量のリポソームによって、これらのコレステロール蓄積マウス細胞でコレステロールエステルヒドロラーゼ活性が3倍増加した。
【００５９】
コレステリルエステルへの[14C]オレイン酸塩の取込みを、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の指標として利用して、この酵素活性を阻害する組成物を同定した。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの相対活性は、リポソームの非存在下にてまたはタンパク質を含まないリポソームもしくはマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位および74〜103位のアミノ酸に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームの存在下にて、培地中で培養しておいたコレステロール蓄積マウス細胞で測定した。6時間のインキュベーション後、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームに曝露しておいた細胞だけが、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の2倍の減少を示したが、その一方で他のリポソーム処理によってはこの酵素の活性に対する有意な効果がなかった。
【００６０】
マウスSAA2.1の上記合成ペプチドのうちの1つを含むリポソームとともにプレインキュベートしたコレステロール負荷J774細胞からのコレステロール流出についても調べた。これらの実験では、[3H]コレステロールで標識したコレステロール負荷マウスマクロファージをマウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位または74〜103位のアミノ酸に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともに4時間プレインキュベートした。いくつかの態様では、マウスSAA2.1の1〜20位および74〜103位のアミノ酸残基に対応する2種の合成ペプチドを等モルで組み合わせたもの(各0.5 μM)についてもアッセイした。インキュベーション後、その細胞をDMEM/BSAで徹底的に洗浄して、プレインキュベーション培地中の放射能およびリポソームを全て除去した。この流出追跡はDMEM/BSAのみまたはHDL (50 μg/mL)含有培地から成った。さまざまな時点で、その流出培地を回収し、[3H]コレステロールおよび遊離コレステロール量についてアッセイした。結果から、0.2％ BSA含有培地への[3H]コレステロールの流出は、全カウントの6.1±1.1％であることが示唆された。HDL(50 μg/mL)の存在下で培養した細胞は、細胞の全[3H]ステロールのうちの31.2±2.2％を培地に輸送した。マウスSAA2.1の21〜50位または51〜80位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとの細胞のプレインキュベーションでは、HDL含有培地への[3H]コレステロール流出の割合に何ら有意な変化は起こらなかった。しかしながら、[3H]コレステロールで標識したコレステロール蓄積J774細胞を、マウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームとともにプレインキュベートした場合に、細胞を引き続いてHDLの存在下で培養すると、細胞の全[3H]コレステロールのうちの60.6±3.6％および46.7±3.1％が培地中に放出されることが観測された。SAA2.1のこれら2種の合成ペプチドを組み合わせたものとの類似の培養条件下でのプレインキュベーションによっては、HDLへの細胞の全[3H]コレステロールのうちの88.5±3.5％の輸送が起こった。さらに、最初の2時間中のHDL培地へのコレステロール流出の初速度は、いずれかの合成ペプチドのみを含むリポソームによる結果と比較して2倍速かった。
【００６１】
さらに、図10に示されるように、完全長のマウスSAA2.1タンパク質を含むリポソームおよびマウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームの等モル濃度によるコレステロール流出の比較から、マウスSAA2.1の1〜20位または74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを含むリポソームを投与されているコレステロール蓄積J744細胞からの統計学的に有意に高いコレステロール流出が示された。
【００６２】
マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソーム、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームおよびこれらのペプチドの組み合わせ(配列番号：1 + 配列番号：4)をモル比1:1で含むリポソームについても、コレステロール蓄積マウスマクロファージにおけるコレステロール輸送の用量反応曲線を作成した。結果を図3Aおよび図3Bに示す。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれた。各ペプチド単独のものによってコレステロール流出は増加し、対照と比較したコレステロール流出の割合(％)は、各ペプチド単独のものの量が増加するのに伴って増加した。さらに、図3Aおよび図3Bに示されるように、その2種のペプチドを組み合わせたものでは、相加的効果を超える効果が得られた。例えば、図3Aおよび図3Bに示されるように、1 μMの各ペプチド単独のものによるコレステロール流出は約200％であったのに対し、1 μMの各ペプチドの組み合わせによるコレステロール流出は500％であった。
【００６３】
これらのペプチドは今回、ヒト由来単球細胞においてコレステロール流出を増加させることも実証された。これらの単球は、ホルボールミリスチン酸アセテート(100 nM)でマクロファージに分化した。これらの実験では、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチド、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチド、マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えたもの(配列番号：7)に対応するペプチド、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソーム製剤に、コレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞を曝露した。これらの実験の結果を図4に示す。マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：5)に対応する、不活性なペプチドとは異なり、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えたもの(配列番号：7)に対応するペプチドを含むリポソーム製剤は、これらのヒト細胞におけるコレステロール流出を、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)およびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドよりはよくないにせよ、同程度に効果的に増加させた。
【００６４】
このように、コレステロール輸送の割合は、異なるペプチドを使っておよび/またはペプチドの濃度増加に伴って増加させることができる。
【００６５】
類似の研究をヒトSAA1.1の78〜96位の残基
に対応するペプチドを用いて行った。図5Aおよび図5Bは、ヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸(配列番号：12)に対応するペプチドを含むリポソームまたはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームを投与したマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究から得られた用量反応曲線を示す。試験したペプチド濃度は、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMとした。図5Aおよび図5Bによって示されるように、ヒトSAA1.1ペプチド(配列番号：12)は、用量の増加に応じたコレステロール流出の増加という点で、そのマウスペプチドよりも効果的ではないにせよ、少なくとも同程度に効果的であった。したがって、これらの結果は、配列番号：12を含むヒトSAA1.1ペプチドがコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のエンハンサーであるということを示している。
【００６６】
図9はヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)、ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)、ヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)、ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)またはヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤によるマウス774細胞におけるコレステロール流出の経時的変化の研究を示す。図中に示されるように、ヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)を含むリポソーム製剤は、試験した製剤のうち最も高いコレステロール輸送増強活性を示した。ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)またはヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)を含むリポソーム製剤もコレステロール輸送増強活性を示し、それぞれがヒトSAA1.178〜96を含むリポソーム製剤の約半分の活性を持っていた。ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)またはヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤は、皆無かそれに近いコレステロール輸送増強活性しか示さず、したがって、少なくとも79位の残基の存在がこれらのペプチドの活性に重要であるということを示唆している。
【００６７】
コレステロール流出の経時的変化を、ヒトSAA1.1の78〜96位の残基に対応するペプチドを各種濃度で含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞でも行った。この実験の結果を図6に示す。図中に示されるように、マクロファージからのコレステロールの流出は、試験したペプチドの全濃度に対し0時間から24時間までの期間にわたって増加し続けた。
【００６８】
マウスに[3H]コレステロール-蓄積マクロファージを最初に静脈注射し、その後、マウスSAA2.1の1〜20位、21〜50位、51〜80位または74〜103位の残基に対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームを24時間後に注射するといったさらなるインビボ研究も行った。この研究の結果を図1に示す。図1のグラフに示された時点で、約25 μlの血液を各動物の尾静脈から採血した。この血液試料を遠心して血漿から赤血球を分離し、血漿中の[3H]-コレステロールをシンチレーション計測により測定した。結果は測定4回の平均±SEMである。この図で示されるように、SAA2.1ペプチドの1〜20位の残基(アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメイン)または74〜103位の残基(コレステロールヒドロラーゼエステル増強ドメイン)を含むリポソームの静脈注射は、血漿中放射活性(dpm)の増加によって測定される[3H]-コレステロールの流出を劇的に増加させた。この同じ研究において、ヒトアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害性のSAA1.1ペプチドドメイン(これはヒトおよびマウスのSAA2.1のそのドメインに等価である)もインビボでのコレステロール輸送を促進させた。
【００６９】
これらの実験は、天然のSAA2.1タンパク質を含むリポソーム、あるいはマウスアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはマウスもしくはヒトコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインを含んだ合成ペプチドを含むリポソームが、インビボでのコレステロール流出を顕著に増加させたことを実証している。さらに、この増加は4日間にわたり続いた。さらに、ヒトアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害性のSAAペプチドドメインもインビボでのコレステロール流出を促進させた。このように、これらのデータはSAA、具体的にはこのタンパク質のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよびコレステロールヒドロラーゼエステル増強ドメインがアテローム斑に位置するコレステロール蓄積マクロファージからのコレステロールの除去の促進に果たす中心的な役割を実証するものである。このデータは、アテロームの発生を低減するかもしくは予防するためにおよび/またはアテローム性硬化病変に位置するマクロファージからのコレステロールの流出を増加させることによってアテローム斑の退縮を引き起こすために、これらのドメインのペプチドまたは模倣体を設計することおよび利用することの有用性を立証するものである。このようなペプチドまたはその模倣体は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に有用であり、アテローム性動脈硬化症と関係する冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療に有用であるものと考えられる。
【００７０】
コレステロールの輸送過程は、ATP結合カセット輸送体(ABCA1)経路と共役している。アポリポタンパク質への脂質流出は、cAMP類似体を用いたマウスマクロファージの処理によって刺激されることが以前に示されている(Lin et al. 2002 Biochem Biophys Res. Commun. 290: 663-669；Oram et al. 2000 J. Biol. Chem 275: 34508-34511)。また、ABCA1の発現はcAMP処理によって誘導される(Lin et al. 2002 Biochem Biophys Res. Commun. 290: 663-669；Oram et al. 2000 J. Biol. Chem 275: 34508-34511)。本発明者らは、コレステロール蓄積J774マクロファージとのインキュベート時の各種のアポリポタンパク質を含むリポソームによるコレステロールの流出に及ぼす8-ブロモ-cAMP(0.3 mM)の効果を本明細書の中で調べた。そのような細胞をSandoz 58-035、つまりACAT阻害剤の存在下において[3H]-コレステロールで予め標識して、その細胞から放出される放射性標識コレステロールの全てがエステル化されていないコレステロールのプールに由来するものであることを確実とし、この細胞を8-ブロモ-cAMPで12時間処理した。これに続いて各種のアクセプターとのインキュベーションを行った。細胞の標識コレステロールの放出率(fractional release)を時間の関数として測定した。未処理細胞と比較した場合、cAMPによる前処理はSAA2.1およびアポA-1を含むリポソームへのコレステロール流出の初速度の62.1％および32.7％の増加をもたらした。細胞をcAMPによる前処理の有無にかかわらずSAA1.1リポソームに曝露した場合、流出の刺激は観測されなかった。さらに、SAA1.1リポソームはコレステロール蓄積マクロファージからのコレステロールの流出を促進させるうえで、タンパク質を含まないリポソーム以上に効果的ではないということが以前に実証されている(Tam et al. 2002 J. Lipid Res. 43: 1410-1420)。さらに、cAMPによる処理は、リポソームを含まない培地へのコレステロールの輸送を刺激しなかった。
【００７１】
シクロデキストリンのようなアポリポタンパク質を含まないアクセプターが、マクロファージからのコレステロールの除去を触媒する能力を有するかどうか調べるため、コレステロールを負荷および標識したJ774細胞をリポソームおよびメチル-β-シクロデキストリン(0.1 mM) (CD)とともにインキュベートした。リポソームを含まない培地へのコレステロールの流出の刺激は、この濃度のCDで観測されなかった。対照的に、SAA2.1を含むリポソームで処理した細胞では、CD処理によってコレステロール流出の初速度の4倍増加が生じたが、SAA1.1を含むリポソームでは生じず、同様にタンパク質を含まないリポソームでも生じなかった。さらに、cAMPによる前処理は、SAA2.1およびCDを含むリポソームに曝露した細胞においてコレステロール流出のさらなる増加(45.5％)を引き起こした。
【００７２】
したがって、本発明は、アテローム性動脈硬化症ならびにアテローム性動脈硬化症と関係する冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の予防および/または治療に用いる、単離ペプチド、Y-ZおよびQ-Y-Z化合物ならびにこれらの模倣体、および単離ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、SAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの、ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物、またはこれらの模倣体；および/またはSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの、ペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物、またはこれらの模倣体を含む。したがって、本発明の好ましい組成物は、マウスSAA2.1の77〜95位のアミノ酸もしくはヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸を含むペプチドもしくはその一部分、および/またはSAA2.1の1〜16位の残基を含むペプチドもしくはその一部分、あるいはこれらのペプチドの一方もしくは両方の模倣体またはその一部分を含む。
【００７３】
「その一部分」により、本明細書に記載の単離ペプチドに類似の生物活性を示すペプチドであるが、しかし(1) マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1の19残基のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたは16残基のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインのさらに短い断片を含む、あるいは(2) マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1の19残基のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインまたは16残基のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分だけと重複する、ペプチドを含むように意図される。例えば、約1〜12位、約1〜13位または約1〜14位の残基に及ぶ、マウスSAA2.1またはヒトSAA1.1もしくはSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分を含むペプチドも、マウスSAA2.1の1〜20位の残基ならびにヒトSAA1.1およびSAA2.1の1〜23位の残基の合成ペプチドと同様に、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するものと考えられる。同様に、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性を有するマウスSAA2.1の74〜103位の残基の30アミノ酸配列のうちの好ましい一部分が同定されており、これにはこのドメインの77〜95位の残基に対応する19アミノ酸の領域が含まれる。同様に、ヒトSAA1.1の、それぞれ、79〜96位または78〜96位の残基に対応する18〜19アミノ酸の領域が同定されており、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強特性を有すると実証されている。類似の生物活性を有するこれらの77〜95、78〜96または79〜96残基のペプチドのうちのさらに短い部分を、これらの77〜95、78〜96または79〜96残基のペプチドと同じ方法で同定することができる。したがって、本発明は、同様に本明細書で開示されるペプチドの部分に関する。
【００７４】
本発明の好ましいペプチドは、マウスSAA1.1タンパク質の配列の1〜20位のアミノ酸残基にN末端のアルギニンを加えたもの(RGFFSFIGEAFQGAGDMWRAY；配列番号：7)に対応する合成ペプチドである。
【００７５】
合成により、本明細書では、そのペプチドが化学的手段によりまたは組換えにより合成的に調製されることを意味する。
【００７６】
さらに、本明細書に開示されるペプチドのコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性に関与する構造を保存しながら、開示のペプチドにおけるアミノ酸のさまざまな置換が可能であるものと当然理解されるであろうが、これによって限定することを意図するものではない。保存的置換は、例えば、米国特許第5,264,558号などの、特許文献に記述されている。したがって、例えば、非極性脂肪族の中性アミノ酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間での交換が可能であるものと予想される。同様に、極性脂肪族の中性アミノ酸、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間での置換を行うことができる可能性があるものと考えられる。荷電性の酸性アミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸の間での置換を行うことができる可能性があるものと考えられ、同様に荷電性の塩基性アミノ酸、リジンおよびアルギニンの間での置換を行うことができるものと考えられる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む芳香族アミノ酸の間での置換も可能である可能性が高いものと考えられる。場合によっては、ヒスチジンと塩基性アミノ酸リジンおよびアルギニンとを相互に置換することができる。これらの類の置換および交換は当業者に周知である。その他の置換も可能であろう。本明細書に記載のペプチドとの変異ペプチドの配列同一性の割合(％)が大きくなるほど、生物活性の保持率が大きくなるものと予想される。したがって、本明細書に記述されるコレステロールエステルヒドロラーゼを増強する活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する活性を有するペプチド変異体は本発明の範囲内に含まれる。
【００７７】
本発明で用いるのに好ましいのは、単離ペプチド
またはその一部分であり、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、nは1または2である。したがって、nが1である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、X2は疎水性または非極性アミノ酸であり；ならびにX3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸である。nが2である場合、単離ペプチドは、
を含み、式中、Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびにXb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸、またはその模倣体である。塩橋を形成するXaおよびX6のアミノ酸の組み合わせの例には、XaがアルギニンであることおよびX6がアスパラギン酸またはグリシンであることを含むが、これに限定されることはない。より好ましいのは、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基
ヒトSAA1.1またはSAA2.1の1〜23位のアミノ酸残基
および
からなる単離ペプチドである。本発明のこれらの単離ペプチドは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害することができる。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００７８】
本発明で用いるのに好ましいコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる単離ペプチドは、
またはその一部分を含み、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。好ましいのは、
を含むペプチドであり、式中、X1およびX9、X12もしくはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに/またはX17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である。塩橋を形成できるアミノ酸の組み合わせの例には、X1がアスパラギン酸であること、およびX9、X12またはX18がアルギニンであることを含む。単離ペプチドまたは模倣体は、80個未満のアミノ酸残基、より好ましくは18〜79個のアミノ酸、より好ましくは18〜50個のアミノ酸、より好ましくは18〜35個、18〜30個または18〜25個のアミノ酸を有することが好ましい。同様に好ましいのは、単離ペプチド
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分、または
のペプチド変異体である。コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できる本発明のペプチドの範囲から除外されるのは、
からなるそれらの単離ペプチドである。
【００７９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するためにおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害するために本発明で用いるのに同様に好ましいのは、Y-ZまたはQ-Y-Zの式を有する化合物である。これらの化合物では、任意の許容される結合手段およびZまたはQの選択に基づいて選択される結合手段を介して、ZはYに連結されておりおよび/またはQはY-Zに連結されている。許容される結合手段の例には共有結合、非共有結合、水素結合、抗体-抗原認識またはリガンド結合が含まれるが、決してこれらに限定されることはない。式Y-ZまたはQ-Y-Zを有する化合物では、Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する本発明の単離ペプチドまたは模倣体を含み；ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；ならびにQを含む態様では、QはZと同一であってもよくまたはZとは異なっていてもよく、Qは同様に化合物Q-Y-Zの能力を増強する。典型的なZまたはQ化合物には、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質が含まれるが、これらに限定されることはない。Zおよび/またはQの典型的な標的化物質には、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたはSAA受容体に対するリガンドなどのマクロファージ標的化物質、肝臓標的化物質、抗体および、例えば、Fab断片などのその活性断片、ならびにアテローム斑および/または炎症部位に特異的なさらなる物質が含まれる。
【００８０】
本明細書において「単離(された)」とは、その天然宿主細胞中の天然ペプチドまたはタンパク質に元来付随するその他の細胞成分から実質的に分離されているペプチドのことを意味する。この用語は、その天然由来の環境から取り除かれているペプチド、「単離ペプチド」が自然界で見出されるペプチドまたはタンパク質の全部または一部分に付随していないペプチド、単離ペプチドが自然界では連結していないかまたは異なる様式で連結しているペプチドに作動可能に連結しているペプチド、もっと長い配列の一部としては自然界に存在しないペプチドあるいは自然界には見られないアミノ酸を含んだペプチドを含むように意図される。「単離(された)」という用語は同様に、組換えにより発現されるペプチド、化学的に合成されるペプチド、または異種系により生物学的に合成されるペプチド類似体に言及して使用することができる。
【００８１】
本明細書において「ヒト等価体」とは、本明細書の参照マウスペプチドに類似の活性を有するヒトSAA2.1またはヒトSAA1.1に由来するペプチド配列のことを意味する。
【００８２】
「に由来する」という語句は、特定の種に由来し、その特定の種から単離されたペプチドまたは模倣体だけでなく宿主細胞の発現系で組換えにより発現されるかまたは化学的に合成されるアミノ酸配列が同一のペプチドも含むように意図される。
【００８３】
本明細書において「模倣体」とは、類似のまたは増強されたアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性および/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ調節活性を示す、ペプチド(これは組換え体であってもよい)、およびペプチド模倣体、ならびに有機低分子を含むように意図される。これらには、SAA2.1またはSAA1.1の野生型ドメインの配列に対して保存的アミノ酸置換を含むペプチド変異体、およびSAA2.1またはSAA1.1の野生型ドメインと高い割合(％)の配列同一性、少なくとも、例えば80％、85％、90％の配列同一性、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性、より好ましくは少なくとも99.5％または99.9％の配列同一性を有するペプチド変異体が含まれる。整列のための周知技術のいずれかに従い、変異ペプチドを参照ペプチドと整列させて、配列同一性の割合(％)を評価することができる。例えば、整列のためのいずれかの周知技術を利用して、参照ペプチドよりも長さが大きい変異ペプチドを参照ペプチドと整列し、参照ペプチドの長さを超えて伸びうる変異ペプチドのさらなるアミノ酸にかかわらず、配列同一性の割合(％)を参照ペプチドの長さにわたって計算する。
【００８４】
好ましい変異体には、1つまたは複数のD型アミノ酸を含み、同等に有効であるが但しインビボで分解を受けにくいペプチド、および環状ペプチドが含まれるが、これらに限定されることはない。環状ペプチドは、ペプチド結合または環状デプシ(depsicyclic)末端残基(すなわち、ジスルフィド結合)を含むがこれらに限定されない、さまざまな手段によって環状にすることができる。
【００８５】
同様に好ましいのは、本発明の2つまたはそれ以上の連結または結合ペプチドを含む変異体である。特に好ましいのは、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害できるペプチドに連結または結合されたコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強できるペプチドを含む変異体である。
【００８６】
本明細書では「ペプチド模倣体」という用語は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性および/またはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を調節するうえで配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドの適切な代用物として機能するペプチド類似体を含むように意図される。ペプチド模倣体はこれらのペプチドドメインに対し、類似の化学的特性、例えば、親和性だけでなく、有効性および機能も保有しなければならない。すなわち、ペプチド模倣体は構造の制限なく、SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの機能を示す。本発明のペプチド模倣体、すなわち、SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの類似体は、本明細書に記述される機能特性を供与するアミノ酸残基またはその他の成分を含む。ペプチド模倣体ならびにその調製および使用の方法は、Medicinal Chemistry (Vuirick, F.J. ed), Academic Press, San Diego, CA中の年次報告書にあるMorgan et al. 1989, 「Approaches to the discovery of non-peptide ligands for peptide receptors and peptidases」, 243-253に記述されている。
【００８７】
本発明の模倣体はSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインに対し類似の構造形状を有するように設計してもよい。例えば、本発明のSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの模倣体は、
例えば、配列番号：1の1〜11位の残基、配列番号：6の2〜12位の残基または配列番号：7の1〜12位の残基により特徴付けられるものなどの、芳香族アミノ酸を模倣する構造であって、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの阻害活性を示すのに適した高次構造に折り畳まれているかまたは積み重ねられている(例えば、pi-結合型)構造を含むように設計することができる。さまざまな公知のACAT阻害剤に見られる芳香族性(McCarthy et al. J. Med. Chem. 1994 37: 1252-1255)を考慮に入れると、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤のような芳香族領域を有する本発明の模倣体の有効性が同様にして当然予想される。SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの積み重ねられたまたは折り畳まれた芳香族アミノ酸を模倣する本発明のポリペプチド模倣体またはペプチド模倣体の場合、包含するのに好ましいアミノ酸には、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインを有する本発明の模倣体は同様に、
またはその一部分の塩橋の高次構造を模倣する構造を含むように設計してもよく、式中、X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり、X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびにX2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【００８９】
SAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインまたはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインの模倣体は、それぞれ、配列番号：1、6、7、13もしくは14、または配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29の合成ペプチドに類似の構造を有するように設計することもできる。これらのペプチド模倣体は配列番号：1、6、7、13もしくは14または配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29と比べ、周囲のアミノ酸と相互作用して、これらの合成ペプチドに類似の構造を形成する保存的アミノ酸置換を有するペプチド配列を含んでもよい。テトラヒドロイソキノリン成分などの配座固定成分をフェニルアラニンに代えて置換してもよく、その一方で、ヒスチジン・バイオイソステアをヒスチジンに代えて置換して、胆汁排出による初回通過クリアランスを減少させてもよい。本発明のペプチド模倣体はペプチド骨格の修飾を含んでもよい。アミド結合の代用物を含む類似体を使用して、骨格の回転自由度、分子内および分子間水素結合の様式、部分的および全体的な極性および疎水性の変更ならびに経口による生物学的利用能を含むが、これらに限定されない、ペプチドの構造および機能に関する側面を研究することが多い。等比体積のアミド結合模倣体の例には、Ψ[CH2S]、Ψ[CH2NH]、Ψ[CSNH2]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH2]およびΨ[(E)または(Z)CH=CH]が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９０】
模倣体は同様に、天然に存在するSAA2.1のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインおよび/またはSAA2.1のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ドメインと比較して拡張および/または付加によるアミノ酸残基の繰り返しを有するように設計することができる。例えば、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ドメインの一部分、
例えば、配列番号：1の1〜11位の残基、配列番号：6の2〜12位の残基、または配列番号：7の1〜12位の残基のうちの2つまたはそれ以上の繰り返しであって、隣接していてもおよび/または安定化アミノ酸により分離されていてもよい繰り返しを含む模倣体をアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性阻害剤とすることができる。あるいは、そのような繰り返しは別の芳香族アミノ酸に代えて、芳香族アミノ酸、例えば、Fに代えてW、HまたはYの1つまたは複数の置換を含んでいてもよい。さらに、配列番号：6の12〜13位の残基の領域中にある内部残基と水素結合を形成すると考えられる配列番号：6の最初のアルギニンのような、ペプチドの高次構造の活性および/または安定性にとって重要であると考えられるこれらのペプチドのアミノ酸を模倣体の中に組み入れて、その活性および/または安定性を増強させてもよい。常法に従い、宿主細胞を遺伝子操作して、そのような模倣体を発現させることができる。
【００９１】
これらのペプチドドメインの同定によって、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強活性および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する有機低分子の設計とその後の合成のために、これらのペプチドに基づいた分子モデリングも可能となる。これらの有機低分子は配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドの構造および活性を模倣する。しかしながら、これらの有機低分子はアミノ酸を含む代わりに、化学的または物理的類似性を有し概ね類似の生物活性を示すそのバイオイソステア、置換基または基を含む。
【００９２】
バイオイソステリズム(生物学的等価性)は、薬物設計の当業者により利用されている主要な修飾手法であって、配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29などのリード化合物の毒性の弱毒化および活性の改変に有用であることが示されている主要な修飾手法である。バイオイソステリック(生物学的等価性の)手法は、The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action (Silverman, RB, Academic Press, Inc. 1992 San Diego, CA, pages 19-23)などの標準的な参考書籍に詳細に論じられている。古典的なバイオイソステアは、同じ数の価電子を有するが異なる数の原子を持ちうる化学基を含む。したがって、例えば、一価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、CH3、NH2、OH、FおよびCl；Cl、PH2およびSH；Brおよびi-Pr；ならびにIおよびt-Buが含まれるが、これらに限定されることはない。二価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、-CH2-およびNH；O、SおよびSe；ならびにCOCH2、CONHR、CO2RおよびCOSRが含まれるが、これらに限定されることはない。三価の原子および基を有する古典的なバイオイソステアには、CH=およびN=；ならびにP=およびAs=が含まれるが、これらに限定されることはない。四価の原子を有する古典的なバイオイソステアには、CおよびSi；ならびに=C+=、=N+=および=P+=が含まれるが、これらに限定されることはない。環等価体を有する古典的なバイオイソステアには、ベンゼンおよびチオフェン；ベンゼンおよびピリジン；ならびにテトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、シクロペンタンおよびピロリジンが含まれるが、これらに限定されることはない。非古典的なバイオイソステアでも類似の生物活性をもたらすが、しかしこれは同じ数の原子を持っておらず、古典的なバイオイソステアの電子的および立体的規則には適合しない。典型的な非古典的バイオイソステアを下記表に示す。
本発明の有機低分子模倣体の設計に有用なさらなるバイオイソステリック交換には、鎖状構造と環状構造との交換反応が含まれる。
【００９３】
本発明のペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体は、その必要性のある被験体、好ましくはヒトに投与するのに薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化されることが好ましい。そのような組成物の製剤化の方法は当技術分野において周知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985などの標準的な参考書籍に開示されている。本発明の組成物は、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性もしくはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のいずれかを調節する、またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性およびコレステロールエステルヒドロラーゼ活性のどちらも調節する単一のペプチドもしくはその一部分、Y-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはこれらの模倣体を含んでもよい。さらに、本発明の組成物は、配列番号：1、6、7、13もしくは14のペプチドまたはその一部分もしくは模倣体および配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29のペプチドまたはその一部分もしくは模倣体を含んでもよい。これらの組成物は単独でまたは第二のコレステロールを低下させる薬物もしくは物質との併用で投与されてもよい。例えば、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を阻害する配列番号：4、8、9、10、11、12、24、25、26もしくは29のペプチドまたはその模倣体を含む本発明の組成物をACAT阻害剤との併用で被験体に投与することができる。典型的なACAT阻害剤には、Zetia(商標) (Merck)、Avasimibe (Pfizer)、Eflucimibe (Eli Lilly)およびCS-505 (Sankyo)が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の組成物は、シクロデキストリンのようなアポリポタンパク質を含まないアクセプターとともに被験体に投与されてもよい。本発明の単離ペプチドまたは模倣体との併用で投与できる典型的なさならるコレステロールを低下させる薬物または物質には、スタチン、樹脂または胆汁酸抑制薬(Bays et al. Expert Opinion on Pharmacotherapy 2003 4(11): 1901-38；Kajinami et al. Expert Opinion on Investigational Drugs 2001 11 (6): 831-5)、ナイアシン(Van et al. Am. J. Cardiol. 2002 89 (11): 1306-8；Ganji et al. J. Nutri. Biochem. 2003 14 (6): 298-305；Robinson et al. Progress in Cardiovasc. Nursing 2001 16(1): 14-20；Knopp, R.H. Am. J. Cardiol. 2000 86 (12A): 51L-56L)、肝臓X受容体アゴニスト(Tontonoz et al. Molecular Endocrinology 2003 17: 985-993)、Ca2+アンタゴニスト(Delsing et al. Cardiovasc. Pharmacol. 2003 42(1): 63-70)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR；Lee et al. Endocrinology 2003 144: 2201-2207)のモジュレーターが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９４】
本発明で用いるのに好ましい製剤化は、ペプチドもしくはその模倣体またはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物を脂質と複合体化することである。製剤化として同様に好ましいのは、ペプチドもしくはその模倣体あるいはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体をリン脂質小胞の中に封入することである。本出願を通じて実証されるように、本発明で有用な典型的なリン脂質小胞はリポソームである。本発明のペプチドもしくはその模倣体あるいはY-ZもしくはQ-Y-Z化合物またはその模倣体を含むリポソームは、Epsteinら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985))、Hwangら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980))、欧州特許第52,322号、欧州特許第36,676号；欧州特許第88,046号；欧州特許第143,949号；欧州特許第142,641号；日本国特許出願第83-118008号、および欧州特許第102,324号、ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号により記述されているような周知の方法のいずれかにしたがって調製することができ、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。好ましいリポソームは、その脂質含量がコレステロールの約10モルパーセントを超える、好ましくはコレステロールの10〜40モルパーセントの範囲にある小さな(約200〜800オングストローム)単層型のものであり、その選択の割合は最適なペプチド療法に応じて調整される。しかしながら、本開示を読んだとき当業者には明らかなように、リポソーム以外のリン脂質小胞を使用することもできる。
【００９５】
本発明のペプチド、化合物およびこれらの模倣体または薬学的組成物は、患者に埋め込まれた冠状動脈ステントを介して投与することもできる。本発明のペプチド、化合物およびこれらの模倣体または薬学的組成物を溶出する冠状動脈ステントは、周知の技術にしたがって調製し埋め込むことができる(例えば、Woods et al. (2004) Annu. Rev. Med. 55:169-78)；al-Lamce et al. (2003) Med. Device Technol. 2003 14: 12-141 Lewis et al. 2002 J. Long Term Eff. Med. Implants 12:231-50；Tsuji et al. 2003 Int. J. Cardiovasc. Intervent. 5:13-6を参照されたい)。
【００９６】
本発明の薬学的組成物は、コレステロール代謝酵素の活性、具体的には、コレステロールエステルヒドロラーゼおよび/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性の調節に有用である。好ましい態様では、その薬学的組成物を利用して、マクロファージでの酵素活性を改変する。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、インビボでの酵素活性を改変する。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、哺乳類、具体的にはヒトでの酵素活性を改変する。
【００９７】
本発明の薬学的組成物は、アテローム斑および/または炎症部位にある貯蔵コレステロールの流動および流出の促進にも有用である。好ましい態様では、その薬学的組成物を利用して、インビボにおいてアテローム斑または炎症部位に位置するマクロファージおよびその他の組織からの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる。より好ましくは、その薬学的組成物を利用して、哺乳類、具体的にはヒトにおいてアテローム斑または炎症部位に位置するマクロファージおよびその他の組織からの貯蔵コレステロールの流動および流出を促進させる。
【００９８】
したがって、本発明の組成物を、被験体、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに投与して、アテローム性動脈硬化症を治療かつ/または予防することができる。この組成物は、経口経路、経静脈経路、筋肉内経路、腹腔内経路、局所経路、経直腸経路、経皮経路、舌下経路、口腔経路、鼻腔内経路または吸入による経路を含むが、これらに限定されない種々の経路により投与されてもよい。少なくとも経口投与の場合、1つまたは複数のD型アミノ酸を有するペプチドを含む組成物を投与することが好ましいものと思われる。当業者は治療される病気の重症度、ならびに年齢、体重および同様のものなどの患者に特異的な要因に基づいて、製剤および投与経路ならびに投与の用量および頻度を日常的に選択することができる。マクロファージからのコレステロールの流出を促進させる際の本発明の合成ペプチドの持続的な活性は、これらの薬学的組成物に対する毎日の、1日おきまたは週2回の投与計画の実現可能性を示唆するものである。
【００９９】
前述のインビトロおよびインビボアッセイに加えて、アテローム性動脈硬化症を治療かつ/または予防する本発明の組成物の効力をアポEノックアウトによるアテローム生成のマウスモデル(Davis et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 21:2031-2038)などの動物モデルで実証することもできる。これらのマウスは、動脈硬化食で飼育された場合、その大動脈中に脂質を急速に沈着する。このアポEノックアウトマウスはアテローム性動脈硬化症の有効なモデルであり、アテローム性動脈硬化症を軽減させる際のEzetimibe(Zetia(商標)；Merck)の有効性を実証するために使われている(Davis et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 21:2031-2038)。アテローム性動脈硬化症を治療または予防する際の、例えば、配列番号：1、4もしくは6のペプチドまたはその模倣体の1つまたは複数を含む組成物などの、本発明の組成物の効力を同じ方法で実証することができる。
【０１００】
アテローム性動脈硬化症の度合いを抑制するかまたは軽減する際の、配列番号：1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、24、25、26または29のペプチドを含む組成物などの、本発明の組成物のインビボでの有効性を上記のアテローム生成の齧歯類モデルで実証することができる。本発明の組成物がアテローム性動脈硬化症の退縮を引き起こす能力を実証するため、この齧歯類を実施例11に記述されているような、動脈硬化食で2週間飼育する。次いで、この動物を2群、つまり動脈硬化食をさらに2週間継続する一方の群、動脈硬化食を同じ期間継続するがしかし本発明の組成物も受け取るもう一方の群に分ける。本発明の組成物がアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を実験の後に、つまりその大動脈を動物から取り出して縦方向に切開するときに評価する。脂質が占有する内皮表面の領域を測定する。同様に、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定する。
【０１０１】
この齧歯類モデルを利用して、インビボでのSAA2.1ペプチド(配列番号：1および4ならびにそれらの組み合わせ)の抗アテローム生成活性を調べた。SAA2.1ペプチドによる処置マウス由来の肝臓は、未処置マウスの脂肪肝で観察された白っぽい色と比較して、より正常な赤みがかった色を示した。これらのデータは、これらのSAA2.1ペプチドがマクロファージでのコレステロール代謝を調節するということだけでなく、肝臓内でのコレステロール代謝も調節するということを示唆するものである。
【０１０２】
さらに、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤がアポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制しその退縮を誘発する能力について調べた。
【０１０３】
退縮実験では、アポEノックアウトマウスを実施例11に記載の動脈硬化食で4週間飼育し、その後、それらを2群に分けた。一方の群は、動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は、動脈硬化食を同じ期間継続したが、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図7AのB群および図7Bのhf+p1群)またはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図7AのD群および図7Bのhf+p4群)も受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図7AのA群および図7Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料(chow diet)で飼育した(図7AのC群および図7Bの低脂肪群)。図7Bには、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとを受け取ったさらなる追加群が示されており、これはhf+p1+p4と称されている。図7Bは、図7Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のデータを含むものである。2週間後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドO(Oil Red O)で染色した。図7Aのデータは、実際の脂質陽性領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図7Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として示している。これらの図面に示されるように、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤で処置したマウスは、高脂肪食で飼育した対照動物と比較して、大動脈病変の退縮を示した。
【０１０４】
抑制実験では、アポEノックアウトマウスは高脂肪食で飼育し、同時に、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図8Aの2の群および図8Bのhf+p1群)、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図8Aの4の群および図8Bのhf+p4群)またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドとを含むリポソーム(配列番号：1 + 配列番号：4；図8Aの5の群および図8Bのhf+p(1+4)群)を受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図8Aの1の群および図8Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育した(図8Aの3の群および図8Bの低脂肪群)。図8Bには、「空のリポソーム」と称される追加実験群が含まれており、この群は、ペプチドを含むリポソームと同じであるが但しタンパク質-ペプチドを含まない空のリポソームで処置された動物にあたる。この群は、リポソームで処置されなかった高脂肪および低脂肪(食)群とは異なる。図8Bに示されるデータは、図8Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験を含むものである。20日後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。これらの実験のデータを図8Aおよび図8Bに示す。図面中に示されるように、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤で処置したマウスは対照動物と比較して、大動脈病変の減少を示した。
【０１０５】
この十分に認められているアテローム性動脈硬化症齧歯類モデルでのこれらの実験によって、SAAペプチドまたは模倣体を含む本発明の薬学的組成物がさまざまな組織および/または細胞でコレステロール代謝経路を調節するというさらなる証拠が得られる。薬物動態学的スケーリング法などの技術を利用し、齧歯類でのこれらの研究を使って、ヒトを含むその他の種で体内動態を予測し薬物動態学的等価性を規定することや投与計画を設計することができる(Mordenti, J. (1986) J. Pharmceutical Sciences 75 (11): 1028-1040)。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物の投与は同様に、冠状動脈性心疾患および心臓血管疾患の治療にならびに炎症の予防または治療に有用であるものと予想される。
【０１０７】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願において引用されている全ての文献、係属中の特許出願および特許公報の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
実施例
実施例1: 動物
Swiss-white CD1系の6〜8週齢雌性マウスをCharles River, Montreal, Quebecから入手した。マウスは、12時間の明暗サイクルの恒温室中で飼育した。それらにPurina Lab固形飼料および水を自由に与えた。
【０１０９】
アポEノックアウトマウスは、Jackson Laboratories, Maine, U.S.Aから入手した。
【０１１０】
実施例2: 化学物質
全ての化学物質は試薬用とし、Fisher Scientific (Nepean, Ont.)、Sigma (St. Louis, MO)、ICN (Aurora, OH)またはBioRad (Hercules, CA)から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、Life Technologies (Burlington, Ont.)から購入した。放射性標識した[1-14C]-オレイン酸(52 mCi/mmol)、[1,2,6,7-3H(N)]-コレステロール(82 Ci/mmol)および[コレステリル-1,2,6,7-3H(N)]-オレイン酸(84 Ci/mmol)は、DuPont NEN (Boston, MA)から入手した。
【０１１１】
実施例3: ペプチド
PE Applied Biosystems 433Aペプチド合成機においてα-アミノ保護基として9-フルオレニルメトキシカルボニルを用いた固相ペプチド合成によって、以下のペプチドを合成した:
合成ペプチドの純度を、分析的高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびイオンスプレー質量分析により確認した。これらのペプチドを蒸留水に対し透析し、使用前に凍結乾燥した。
【０１１２】
実施例4: コレステロールの供給源としての赤血球膜の調製
組織傷害部位でのマクロファージによる細胞膜断片の摂取を模倣するため、Elyら(Amyloid 2001 8: 169-181)により記述されている手順にしたがって、赤血球膜断片を調製し、コレステロールの供給源として使用した。同量のコレステロール(赤血球膜断片として)を全ての実験で使用した。Allainらの方法(Clin. Chem. 1974 20:470-475)を利用し、Sigma社のコレステロール20試薬キット(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を活用して、赤血球膜調製物中のコレステロール濃度を測定した。
【０１１３】
実施例5: HDL、AP-HDLの調製ならびにアポA-1およびSAAアイソフォームの精製
HDLおよびAP-HDLは、AncsinとKisilevsky (Amyloid 1999 6:37-47；J. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)により記述されている手順にしたがって連続的密度浮揚を利用し、それぞれ正常マウスおよび炎症マウスから単離した。この手順では、マウスの背側上部の弛緩性皮膚下に2％ AgNO3 0.5 mLを皮下注射することによって、炎症を誘発した。24時間後に、CO2麻酔の後で、これらの動物を心臓穿刺により放血させて、その血液を0.5％ EDTA(終濃度)に回収した。次いで、遠心によって血漿を赤血球から分離した。炎症およびSAA合成の誘導ならびにマウス急性期血漿からのアポA-1、SAA1.1およびSAA2.1の単離は、AncsinとKisilevsky (J. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)の記述どおり行った。これらのタンパク質の分離および精製は、AncsinとKisilevsky(Amyloid 1999 6:37-47)の記述どおり逆相高圧液体クロマトグラフィーによって行った。単離したタンパク質の純度は、AncsinとKisilevsky(Amyloid 1999 6:37-47およびJ. Biol. Chem. 1999 274:7172-7181)の記述どおり質量分析およびN末端配列解析によって確認した。
【０１１４】
実施例6: アポリポタンパク質-脂質複合体の調製および特徴付け
アポA-1、SAA1.1、SAA2.1、マウスSAA1.1およびSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基にそれぞれ対応する合成ペプチド、ならびにマウスSAA2.1の21〜50位、51〜80位および74〜103位のアミノ酸残基に対応する合成ペプチドを脂質とともに再構成して、リポソームを形成させた。モル比100/25/1/250の1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン/コレステロール/アポリポタンパク質/コール酸ナトリウムを用い、Jonasら(J. Biol. Chem. 1989 264: 4818-4825)により記述されているコール酸塩透析手順によって、これらのリポソームを作製した。コレステロールを含有させてリポソームを安定化し、リポソームをHDLのものにさらに似た組成とした。全ての調製は10 mM Tris-HC1、pH 7.4、0.15 M NaClおよび0.005％ EDTAを含有する緩衝液0.5 mL中で行った。この反応混合液を徹底的に撹拌し、4℃で12時間から16時間インキュベートした。平衡時間の終わりに、この試料を4℃のリン酸緩衝生理食塩水中で徹底的に透析した。1時間、15℃、15000×gの遠心によって未反応または沈降脂質を除去した後、そのリポソームを1.5×50 cm Sepharose CL-4Bカラムでろ過した。このリポソームを濃縮後、0.45 μm径のMillipore社製フィルターに通してろ過滅菌し、さまざまな濃度で組織培地と混合した。さまざまなタンパク質を含むリポソームの化学組成は、Lowryらの方法(J. Biol. Chem. 1951 193:265-275)を用いたタンパク質定量、比色キット(Wako Chemicals USA, Richmond, VA)を用いたリン脂質定量、および遊離コレステロールの酵素的分析(Sigma社製のコレステロール試薬キット, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO)から得た。
【０１１５】
実施例7: 細胞培養
J774マクロファージ(American Type Culture Collection, Manassas, VA；ATCC＃T1B-67由来)を1ウェルあたり細胞100万個で維持し、10％ FBSを添加したDMEM 2 mL中で90％のコンフルエンスまで増殖させた。培地は1週間に3回交換した。いくつかの実験では、ほぼコンフルエントな単層をクロロキン(100 μM)または8-ブロモ-cAMP(0.3 mM)の存在下で培養した。
【０１１６】
実施例8: コレステロール負荷および細胞によるコレステロールエステル化の測定
細胞にコレステロールを負荷するため、ほぼコンフルエントな単層を脂肪酸不含の2 mg/mLウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS-BSA)で3回洗浄し、5％リポタンパク質枯渇血清(LPDS) (d > 1.25 g/mL)および赤血球膜コレステロール175 μgを添加したDMEM中で5時間インキュベートした。添加したコレステロールのプール平衡のために、細胞培養物をPBS-BSAで2回洗浄し、5％ LPDS含有DMEM中で一晩インキュベートした。アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼの相対活性は、リポソームを含まない培地、タンパク質を含まないリポソームを含んだ培地またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)にそれぞれ対応する0.5 μMの合成ペプチドを含むリポソームを含んだ培地で培養しておいたコレステロール蓄積細胞で測定した。上記の培地とともに3時間インキュベーション後、[14C]オレイン酸塩を添加し、細胞をさらに3時間インキュベートした(Mendez et al. J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705；Oram et al. Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)。細胞を氷上で冷却し、PBS-BSAで2回、PBSで2回洗浄した。内部標準として[3H]-コレステリルオレイン酸(6000 dpm/ウェル)の添加後、脂質を標識細胞から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、コレステリルエステルへの放射能の取込みをアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の一つの指標として定量した。
【０１１７】
実施例9: J774細胞でのコレステリルエステルの加水分解反応速度
新たにコンフルエントなJ774細胞を上述の赤血球膜によるコレステロール負荷の間に[14C]オレイン酸塩で標識した。次いで、細胞を5％ LPDSならびに天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-1、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)および74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドを含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するDMEM 2 mLとともに最大24時間までインキュベートした。コレステリルエステルの加水分解反応速度を測定するため、2 μg/mLのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤Sandoz 58-035 (プロパンイミド、3-(デシルジメチルシリル)-N-[2-(4-メチルフェニル)-1-フェニルエチル]-(9C1))をリポタンパク質またはリポソームとのインキュベーションの間に添加して、遊離した[14C]オレイン酸塩および遊離コレステロールの再エステル化を阻止した。コレステリルエステルの加水分解反応速度にはリソソームコレステリルエステルヒドロラーゼが必要となるかどうかを調べるために、細胞を50 μg/mLの天然HDLとクロロキン(100 μM)または50 μg/mLのSAA-HDLとクロロキンとの存在下で培養した。クロロキンは、リソソームのプロトン勾配をなくす作用物質である。さまざまな時点で、細胞脂質を抽出し、上述のようにコレステリルエステルの放射能について分析した。
【０１１８】
実施例10: 組織培養およびインビボでのコレステロール流出
J774細胞にコレステロールを負荷し、0.5 μCi/mL [3H]-コレステロールとともに3時間インキュベートし、続けて一晩の平衡時間インキュベートした。流出の研究の前に、細胞をPBS/BSAで4回洗浄した。次いで、細胞をBSAならびに5％ LPDSおよび天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-1、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドに加えて2 μg/mLのアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤Sandoz 58-035を含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するDMEMとともに37℃でインキュベートした。その流出培地を0時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、遠心して細胞残屑を除去し、次いでこれを使用して輸送によるカウントを測定した。次いで、その細胞層を氷冷PBS/BSAで2回およびPBSで2回洗浄した。この細胞の一部を0.1 N NaOHに溶解して、残留放射能と細胞タンパク質含有量の両者を推定した。細胞脂質を細胞の残存部分から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、細胞のコレステロール全カウントを定量した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウント(細胞 + 培地のカウント)のうちの割合(％)として算出した。
【０１１９】
2 μM マウス・アポA-1、SAA1.1またはSAA2.1を含むリポソームを含有する培地へのJ774細胞からのコレステロールの輸送がcAMP依存性の過程であるかどうかを調べるために、培地への2 μM マウス・アポA-1、SAA1.1またはSAA2.1を含むリポソームの添加前に、放射性標識コレステロール蓄積細胞を8-Br-cAMP (0.3 mM)とともに一晩インキュベートした。次いで、培地へのコレステロールの流出を上記の表示時点で測定した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウントのうちの割合(％)として算出した。
【０１２０】
インビボでのコレステロール輸送を測定するため、前述のように赤血球膜および[3H]-コレステロールを用いてJ774マクロファージにコレステロールを負荷した。細胞をPBS/BSAで4回洗浄し、その後、培養皿から剥がした。細胞500万個をDMEM 200 μl中で対照マウスまたは炎症マウスに尾静脈から注入した。さまざまな時点で、血液約25 μlを各動物の尾静脈からヘパリン化キャピラリチューブの中に採血し、次いでAdams Autocrit Centrifuge中で5分間遠心して赤血球を血漿から分離した。シンチレーション分光測定によって血漿中に[3H]-コレステロールが出現するのを測定して、コレステロールの流出を定量した。
【０１２１】
J774細胞からの血漿へのコレステロールの輸送が、ABCA1輸送体経路によって調節されるかどうか、または注入細胞の内因性破壊によるものであるかどうかを研究するために、放射性標識コレステロール蓄積細胞を400 μM(終濃度)の4,4'-ジイソ-チオシアノスチルベン-2,2'-ジスルホン酸(DIDS)とともに一晩インキュベートし、非炎症および炎症マウスへの注入の前に、DIDSが含まれないように洗浄した。Kisilevskyら(Nat. Med. 1995 1:143-148)の記述どおり、2％ AgNO3溶液0.5 mLの皮下注射によって、炎症を小さな無菌性膿瘍の形態で背側に誘発させた。
【０１２２】
実施例11: アテローム性動脈硬化症の退縮の判定によるペプチドの有効性の評価
アテローム性動脈硬化症の退縮におけるSAA2.1ペプチドの有効性を調べた。試験したペプチドには、配列番号：1および配列番号：4が含まれた。これらのペプチドを2週間にわたるアテローム生成誘導の間、4日に1回(すなわち、6 mg/kg用量を4回)静脈注射した。
【０１２３】
これらのペプチドがアテローム性動脈硬化症の退縮を引き起こすかどうかを判定するために、動物を動脈硬化食(Paigenの齧歯類用動脈硬化食: ココアバター、コレステロールおよびコール酸の入ったPurina 5015(CI3002, Research Diets, Inc.))で2週間飼育し、その後、それらを各動物5匹からなる2群に分けた。一方の群は動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は動脈硬化食を同じ期間継続したが、ペプチドを含むリポソーム(前述のように、4用量)も受け取った。
【０１２４】
これらのペプチドがアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を評価するため、実験の後に、その大動脈を動物から取り出して縦方向に切開した。その内皮表面をオイルレッドOで染色し、脂質が占有した領域を画像解析によって測定した。さらに、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定した。血液を採血して、総血漿コレステロールレベルを測定した。
【０１２５】
SAA2.1ペプチド(配列番号：1および4)による処置マウスおよび未処置マウス由来の肝臓も回収した。総肝臓組織コレステロールおよびLDLレベルを分析することになっている。SAA2.1ペプチドによる処置肝臓の予備実験によって、それらが未処置マウスの肝臓で観察された白っぽい色と比較して、より正常な赤みがかった色をしていることが示された。これらのデータは、これらのSAA2.1ペプチドがマクロファージでのコレステロール代謝を調節するだけでなく、肝臓内でのコレステロール代謝も調節することを示唆する初めてのものである。これによってさらに、これらのSAAペプチドがさらなる組織/細胞でコレステロール代謝経路を調節できることが示唆される。
【０１２６】
実施例12: アテローム性動脈硬化症の抑制の判定によるペプチドの有効性の評価
アテローム性動脈硬化症を阻止するうえでのSAA2.1ペプチドの有効性について調べた。試験したペプチドには、配列番号：1および配列番号：4ならびに両ペプチドを等モルで組み合わせたものを含めた。これらのペプチドを含むリポソームを2〜3週間にわたるアテローム生成誘導の間、4日に1回(抑制実験の場合、6 mg/kg用量を5回)、8〜12週齢のアポEノックアウトマウスに静脈注射した。
【０１２７】
動物を5群(1群につき動物5匹)に分けた。陰性対照群は通常の固形飼料で飼育したのに対し、その他の4群は動脈硬化食(実施例11に記述したPaigenの齧歯類用動脈硬化食)を受け取った。これらの群の中で、ある群は高脂肪食を3週間継続した。その他の群は高脂肪食を同じ期間継続したが、配列番号：1のペプチドを含むリポソーム、配列番号：4のペプチドを含むリポソーム、またはこれらの両ペプチドを等モルで組み合わせたものを含むリポソームのいずれか(前段落で記述したように5用量)も受け取った。
【０１２８】
これらのペプチドがアテローム性大動脈硬化症に及ぼす効果を評価するため、実験の後に、その大動脈を動物から取り出して縦方向に切開した。その内皮表面をオイルレッドOで染色し、脂質が占有した領域を画像解析によって測定した。さらに、大動脈の組織切片を顕微分析用に調製し、総脂質を分離して、組織の湿重量あたりのコレステロール量を測定した。血液を分離して、総血漿コレステロールレベルを測定した。
【０１２９】
実施例13: マウスSAA1.1の77〜103位の残基に対応するL-アミノ酸およびD-アミノ酸のペプチドによって調節された組織培養でのコレステロール流出
[3H]コレステロールを負荷したマクロファージをマウスSAA1.1の77〜103位のアミノ酸残基(配列番号：9)に対応する臭化シアン放出性の0.5 μMペプチド、対応する配列(配列番号：10)のD-アミノ酸の0.5 μM合成ペプチド、またはマウスSAA2.1の天然L-アミノ酸の74〜103位の残基(配列番号：7)に対応する0.5 μM合成ペプチドを含むリポソームの非存在下または存在下でプレインキュベートした。インキュベーション後、その細胞を0.2％ウシ血清アルブミン(BSA)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で徹底的に洗浄して、プレインキュベーション培地中の放射能およびリポソームを全て除去した。流出追跡用の培地はDMEM/BSAのみまたはHDL (50 μg/mL)含有培地で構成した。図2を参照されたい。この結果は各種のリポソーム前処理による、細胞から培地のアクセプター、つまりHDLへのコレステロールの流出を示す。その流出培地を1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、[3H]コレステロールについて分析した。総[3H]コレステロールは、(1.8〜2.1)×106 dpm/mg細胞タンパク質であった。
【０１３０】
実施例14: ヒト単球細胞系THP-1でのコレステロール流出
マウスSAA2.1がヒト由来単球細胞系THP-1(American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手；ATCC＃TIB-202)からのコレステロール輸送を増加するかどうかを判定するために、研究を行った。2 mM L-グルタミン、4.5 g/L グルコース、10 mM HEPES、1.0 mMピルビン酸ナトリウムを含有し、0.05 mM 2-メルカプトエタノールおよび10％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培地30 mlの入ったT-75フラスコの中で、ヒト単球を培養した。その後、細胞500万個を6-ウェル組織培養プレートの各ウェルの中に入れた。ホルボールミリスチン酸アセテート(100 nM)で処理することによって、この単球をマクロファージに分化させた。0.2％ウシ血清アルブミン中にて37℃で6時間、0.5 μCi/mL [3H]-コレステロールで予め標識しておいた赤血球膜断片(コレステロールとしては175 μg)ともにインキュベートすることによって、THP-1マクロファージをコレステロールで濃縮し、続けて一晩の平衡時間に進んだ。流出の研究の前に、細胞をPBS/BSAで4回洗浄した。次いで、細胞を5％ LPDSおよび天然HDL、SAA-HDL、2 μモルのアポA-I、SAA1.1もしくはSAA2.1を含むリポソーム、またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸残基(配列番号：1)、21〜50位のアミノ酸残基(配列番号：2)、51〜80位のアミノ酸残基(配列番号：3)もしくは74〜103位のアミノ酸残基(配列番号：4)に対応する0.5 μモルの合成ペプチドを含むリポソームのいずれかを50 μg/mL含有するRPMI-BSA 2 mLとともに37℃でインキュベートした。その流出培地を0時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間で回収し、遠心して細胞残屑を除去し、次いでこれを使用して輸送によるカウントを測定した。次いで、その細胞層を氷冷PBS/BSAで2回およびPBSで2回洗浄した。この細胞の一部を0.1 N NaOHに溶解して、残留放射能と細胞タンパク質含有量の両者を推定した。細胞脂質を細胞の残存部分から抽出し、Mendezら(J. Clin. Invest. 1994 94:1698-1705)およびOramら(Arterioscler. Thromb. 1991 11:403-414)の記述どおり薄層クロマトグラフィーによって分析した。適切なスポットの放射能を測定して、細胞のコレステロール全カウントを定量した。培地への放射性標識の流出を各ウェルの全カウント(細胞 + 培地のカウント)のうちの割合(％)として算出した。
【０１３１】
実施例16: 統計分析
対応のないスチューデントのt検定を使って、各群の平均を比較した。P < 0.05の値を統計学的に有意と見なした。大動脈の組織切片をANOVAにより比較した。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】各種のSAA2.1合成ペプチドを含むリポソームがマクロファージのコレステロール流出に及ぼすインビボ効果を調べた実験結果の線グラフである。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒丸として示されている。マウスSAA2.1の21〜50位のアミノ酸(配列番号：2)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白丸として示されている。マウスSAA2.1の51〜80位のアミノ酸(配列番号：3)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒三角として示されている。マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白三角として示されている。マウスSAA1.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：5)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、黒四角として示されている。ヒトSAA1.1の1〜23位のアミノ酸(配列番号：6)の合成ペプチドを含むリポソームに対する結果は、白四角として示されている。
【図２】組織培養においてマウスSAA1.1の77〜103位の残基に対応するL型(配列番号：9)およびD型(配列番号：10)アミノ酸のペプチドによって調節されたコレステロール流出を示す線グラフである。マウスSAA1.1の77〜103位のアミノ酸残基に対応する臭化シアン放出性の0.5 μMペプチドを含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、白丸で示されている。対応する配列のD型(配列番号：10)アミノ酸の合成ペプチドを含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、黒三角で示されている。マウスSAA2.1の天然L型の74〜103位のアミノ酸残基を含むリポソームによる処理後のコレステロール流出は、白の逆三角で示されている。対照、つまりDMEM/BSAのみからなる流出追跡用の培地は、黒丸として示されている。この結果は、これらのリポソームによる前処理後の細胞からの培地中のアクセプター、つまりHDLへのコレステロールの流出を示す。様々な時点で、その流出培地を回収し、[3H]コレステロールについて分析した。総[3H]コレステロールは、(1.8〜2.1)×106 dpm/mg細胞タンパク質であった。結果は、測定4回の平均±SEMである。
【図３】AおよびBは、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソーム、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソーム、またはこれらのペプチドをリポソームとして1:1の比率で組み合わせたもの(配列番号：1 + 配列番号：4)を投与したマウスマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究の用量反応データを示す線グラフである。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれる。図3Aでは、X軸、つまり濃度が均等目盛で示されており、図3Bでは、X軸、つまり濃度が対数目盛で示されている。これらのグラフによって示されるように、各ペプチド単独のものでは、用量の増加に応じてコレステロール流出が増加した。さらに、その2種のペプチドを組み合わせたものでは、相加的効果を超える効果が得られた。
【図４】本発明の各種のペプチドを含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞からのコレステロール流出の経時的変化を示す線グラフである。リポソームのみに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸で示されている。HDLに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白丸で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒三角で示されている。マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白三角で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸にN末端のアルギニンを加えた(配列番号：7)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒四角で示されている。マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白四角で示されている。
【図５】AおよびBは、ヒトSAA1.1の78〜96位のアミノ酸(配列番号：12)に対応するペプチドを含むリポソームおよびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームを投与したマクロファージにおけるインビトロでのコレステロール輸送研究の用量反応データを示す線グラフである。試験したペプチド濃度には、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1.0 μM、2.5 μMおよび5.0 μMが含まれる。図5Aでは、X軸、つまり濃度が均等目盛で示されており、図5Bでは、X軸、つまり濃度が対数目盛で示されている。これらのグラフによって示されるように、ヒトSAA1.1ペプチドは用量の増加に応じたコレステロール流出の増加という点で、そのマウスペプチドよりも効果的ではないにせよ、少なくとも同程度に効果的であった。
【図６】ヒトSAA1.1の78〜96位の残基のペプチドを各種濃度で含むリポソーム製剤に曝露したコレステロール蓄積ヒトTHP-1細胞からのコレステロール流出の経時的変化を示す線グラフである。0.05 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸として示されている。0.05 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒丸で示されている。0.1 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白丸で示されている。0.5 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒三角で示されている。1.0 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白三角で示されている。2.5 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、黒四角で示されている。5.0 μM hSAA1.178〜96を含むリポソームに曝露後のこれらのヒト細胞のコレステロール流出は、白四角で示されている。
【図７】AおよびBは、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤が、アポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制するかまたはその退縮を誘発する能力を示す棒グラフである。図7Bは、図7Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のさらなるデータを含むものである。これらの実験では、動物を動脈硬化食(Paigenの齧歯類用動脈硬化食: ココアバター、コレステロールおよびコール酸の入ったPurina 5015(CI3002, Research Diets, Inc.))で4週間飼育し、その後、それらを2群に分けた。一方の群は、動脈硬化食をさらに2週間継続した。もう一方の群は、動脈硬化食を同じ期間継続したが、4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；図7AのB群；図7Bのhf+p1群)またはマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；図7AのD群；図7Bのhf+p4群)も受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(図7AのA群；図7Bの高脂肪群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育した(図7AのC群；図7Bの低脂肪群)。図7Bには、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)に対応するペプチドを含むリポソームとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとを受け取った追加群が示されており、これはhf+p1+p4と称されている。2週間後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。図7Aのデータは、実際の脂質陽性の領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図7Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として示している。図7Aでは、動物5匹を各群で使用した。図7Bに示された各群の動物数はnとして記載されている。
【図８】AおよびBは、本発明のペプチドを含むリポソーム製剤がアポEノックアウトマウスにおいて大動脈病変を抑制する能力を示す棒グラフである。図8Bは、図8Aに示されるデータおよび同条件下で行われたその後の実験のさらなるデータを含むものである。図8Aに示される抑制実験では、アポEノックアウトマウスは高脂肪食で飼育し、同様に4日に1回、マウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：1；2の群)、マウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドを含むリポソーム(配列番号：4；4の群)またはマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸に対応するペプチドとマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸に対応するペプチドとを含むリポソーム(配列番号：1 + 配列番号：4；5の群)を受け取った。対照群はリポソームなしで高脂肪食のみを受け取った(1の群)。追加群は通常のマウス固形飼料で飼育された(3の群)。20日後、これらのマウスを殺処理し、その大動脈を解剖しオイルレッドOで染色した。図8Aのデータは、実際の脂質陽性の領域を示すオイルレッドOによる染色領域を、検査した大動脈全域の割合(％)として示している。図8Aでは、動物5匹を1〜3および5の群で使用した。4の群では、動物1匹が実験の間に死亡したので、動物4匹を使用した。図8Bには、「空のリポソーム」と称される追加実験群が含まれており、この群は、ペプチドを含むリポソームで使用されたものと同じであるが、但しタンパク質-ペプチドを含まない空のリポソームで処置された動物にあたる。この群は、リポソームで処置されなかった高脂肪および低脂肪(食)群とは異なる。図8Bのデータは、オイルレッドOによる染色領域を高脂肪食群(100％)に対する割合(％)として表している。図8Bでは、動物数はnとして記載されている。「高脂肪食」、「低脂肪食」、「hf+p1」、「hf+p4」およびhf+p(1+4)と称される群は、図8Aのそれぞれ、1、3、2、4および5の群に対応する。
【図９】本発明の各種のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ペプチドのリポソーム製剤の存在下でのマウスJ774細胞におけるインビトロでのコレステロール流出の経時的変化の研究を示す線グラフである。ヒトSAA1.178〜96(配列番号：12)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒丸として示されている。ヒトSAA2.178〜96(配列番号：11)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、白丸として示されている。ヒトSAA2.179〜96(配列番号：26)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒三角として示されている。ヒトSAA2.180〜96(配列番号：27)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、白三角として示されている。ヒトSAA2.181〜96(配列番号：28)を含むリポソーム製剤の存在下での細胞のコレステロール流出は、黒四角として示されている。
【図１０】コレステロール蓄積J774細胞でのコレステロール流出に対する等モル濃度と、完全長のマウスSAA2.1を含むリポソームとマウスSAA2.1の1〜20位のアミノ酸(配列番号：1)およびマウスSAA2.1の74〜103位のアミノ酸(配列番号：4)に対応するペプチドを含むリポソームとの効果を比較する棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体であって、該単離ペプチドが、式
またはその一部分を含む、単離ペプチドまたはその模倣体：
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり；
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸であり、但し該単離ペプチドは、
からなることはない。
【請求項２】
X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに/または
X17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項３】
80個未満のアミノ酸残基を有する、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４】
18〜79個のアミノ酸残基を有する、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５】
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項６】
またはその一部分と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項７】
またはその一部分と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項８】
またはその一部分と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項９】
またはその一部分と少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１０】
またはその一部分を含むペプチドのアミノ酸配列において1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１１】
模倣体が有機低分子である、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１２】
合成的にまたは組換え的に製造される、請求項1から11のいずれか一項記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１３】
式Y-Zを有する化合物:
式中、
Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチドまたはその模倣体を含み；および
ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み;
但しY-Zは、
からなることはない。
【請求項１４】
Yは血清アミロイドAタンパク質のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ペプチドドメインを含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチドまたはその模倣体を含み、該ペプチドが、式
またはその一部分を含む、請求項13記載の化合物:
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり;
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項１６】
Zは、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１７】
Y-Zに連結されたQをさらに含む化合物であって、QがZと同一であるかまたはZとは異なり、Qが標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１８】
請求項1から12のいずれか一項記載の単離ペプチドもしくはその模倣体、または請求項13から17のいずれか一項記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質をさらに含む、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、脂質と複合体化される、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、リン脂質小胞の中に封入される、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項２３】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項３３】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項３７】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
請求項18、20または21記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を予防または阻害する方法。
【請求項４１】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体であって、該単離ペプチドが、式
またはその一部分を含む、単離ペプチドまたはその模倣体:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む：
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸であり、
但し該単離ペプチドは、
からなることはない。
【請求項４２】
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項41記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４３】
またはその一部分と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４４】
またはその一部分と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４５】
またはその一部分と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４６】
またはその一部分と少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４７】
またはその一部分を含むペプチドのアミノ酸配列において1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４８】
保存的置換の少なくとも1つが芳香族アミノ酸の置換である、請求項47記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４９】
模倣体が有機低分子である、請求項41記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５０】
合成的にまたは組換え的に製造される、請求項41から49のいずれか一項記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５１】
式Y-Zを有する化合物:
式中、
YはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するペプチドまたはその模倣体を含み；および
ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；
但しY-Zは、
からなることはない。
【請求項５２】
Yは血清アミロイドAタンパク質のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ペプチドドメインを含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５３】
YはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するペプチドまたはその模倣体を含み、該ペプチドが、式
またはその一部分を含む、請求項51記載の化合物:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項５４】
Zは、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５５】
Y-Zに連結されたQをさらに含む化合物であって、QがZと同一であるかまたはZとは異なり、Qが標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５６】
請求項41から50のいずれか一項記載の単離ペプチドもしくはその模倣体、または請求項51から55のいずれか一項記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５７】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質をさらに含む、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、脂質と複合体化される、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、リン脂質小胞の中に封入される、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項６１】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。
【請求項６５】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項64記載の方法。
【請求項６８】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項64記載の方法。
【請求項６９】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項64記載の方法。
【請求項７０】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項７１】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項７５】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
請求項56、58または59記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を予防または阻害する方法。
【請求項７９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体を含む、薬学的組成物。
【請求項８０】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体に連結されており、但し連結されている単離ペプチドまたはその模倣体が、
からなることはない、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
コレステロールエステルヒドロラーゼを増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、式
またはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物:
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり;
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項８２】
X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに/または
X17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である、請求項81記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
コレステロールエステルヒドロラーゼを増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、式
またはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項８５】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、脂質複合体中に共に製剤化されているかまたはそれぞれが脂質複合体中に別々に製剤化されており、かつ投与前に共に混合される、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、Zに結合されており、Zは標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質または化合物の溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質である、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
請求項13記載の化合物Y-Zおよび請求項51記載の化合物Y-Zを含む、薬学的組成物。
【請求項８９】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項９０】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項89記載の方法。
【請求項９２】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項89記載の方法。
【請求項９３】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項89記載の方法。
【請求項９４】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項９５】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項９７】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体をマクロファージに投与する段階を含む、マクロファージからのコレステロール流出を増加させる方法。
【請求項９９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、インビボで投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、ヒトのインビボで投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
マクロファージに、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体を投与する、請求項98記載の方法。
【請求項１０２】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、インビボで投与される、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、ヒトのインビボで投与される、請求項101記載の方法。
【請求項１０４】
請求項13記載の化合物Y-Zまたは請求項51記載の化合物Y-Zをマクロファージに投与する段階を含む、マクロファージからのコレステロール流出を増加させる方法。
【請求項１０５】
マクロファージに、請求項13記載の化合物Y-Zおよび請求項51記載の化合物Y-Zを投与する、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
を含む、単離ペプチド。
【請求項１】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体であって、該単離ペプチドが、式
またはその一部分を含む、単離ペプチドまたはその模倣体：
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり；
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸であり、但し該単離ペプチドは、
からなることはない。
【請求項２】
X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに/または
X17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項３】
80個未満のアミノ酸残基を有する、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４】
18〜79個のアミノ酸残基を有する、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５】
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項６】
またはその一部分と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項７】
またはその一部分と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項８】
またはその一部分と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項９】
またはその一部分と少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１０】
またはその一部分を含むペプチドのアミノ酸配列において1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、請求項5記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１１】
模倣体が有機低分子である、請求項1記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１２】
合成的にまたは組換え的に製造される、請求項1から11のいずれか一項記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項１３】
式Y-Zを有する化合物:
式中、
Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチドまたはその模倣体を含み；および
ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み;
但しY-Zは、
からなることはない。
【請求項１４】
Yは血清アミロイドAタンパク質のコレステロールエステルヒドロラーゼ増強ペプチドドメインを含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
Yはコレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強するペプチドまたはその模倣体を含み、該ペプチドが、式
またはその一部分を含む、請求項13記載の化合物:
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり;
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項１６】
Zは、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１７】
Y-Zに連結されたQをさらに含む化合物であって、QがZと同一であるかまたはZとは異なり、Qが標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１８】
請求項1から12のいずれか一項記載の単離ペプチドもしくはその模倣体、または請求項13から17のいずれか一項記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質をさらに含む、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、脂質と複合体化される、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、リン脂質小胞の中に封入される、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項２３】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項３３】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項18から21のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項３７】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
第二の物質が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
請求項18、20または21記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を予防または阻害する方法。
【請求項４１】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体であって、該単離ペプチドが、式
またはその一部分を含む、単離ペプチドまたはその模倣体:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む：
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸であり、
但し該単離ペプチドは、
からなることはない。
【請求項４２】
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項41記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４３】
またはその一部分と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４４】
またはその一部分と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４５】
またはその一部分と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４６】
またはその一部分と少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４７】
またはその一部分を含むペプチドのアミノ酸配列において1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、請求項42記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４８】
保存的置換の少なくとも1つが芳香族アミノ酸の置換である、請求項47記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項４９】
模倣体が有機低分子である、請求項41記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５０】
合成的にまたは組換え的に製造される、請求項41から49のいずれか一項記載の単離ペプチドまたはその模倣体。
【請求項５１】
式Y-Zを有する化合物:
式中、
YはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するペプチドまたはその模倣体を含み；および
ZはYの能力を増強する、Yに連結された化合物を含み；
但しY-Zは、
からなることはない。
【請求項５２】
Yは血清アミロイドAタンパク質のアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害ペプチドドメインを含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５３】
YはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害するペプチドまたはその模倣体を含み、該ペプチドが、式
またはその一部分を含む、請求項51記載の化合物:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項５４】
Zは、標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５５】
Y-Zに連結されたQをさらに含む化合物であって、QがZと同一であるかまたはZとは異なり、Qが標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質、溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質、または化合物の毒性もしくは副作用を低下させる物質を含む、請求項51記載の化合物。
【請求項５６】
請求項41から50のいずれか一項記載の単離ペプチドもしくはその模倣体、または請求項51から55のいずれか一項記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５７】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質をさらに含む、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、脂質と複合体化される、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、リン脂質小胞の中に封入される、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項６１】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。
【請求項６５】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項64記載の方法。
【請求項６８】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項64記載の方法。
【請求項６９】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項64記載の方法。
【請求項７０】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項７１】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
請求項56から59のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項７５】
アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患または冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質を投与する段階をさらに含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
第二の物質が、コレステロールエステルヒドロラーゼ増強薬、アポリポタンパク質を含まないアクセプター、スタチン、樹脂もしくは胆汁酸抑制薬、ナイアシン、肝臓X受容体アゴニスト、Ca2+アンタゴニスト、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のモジュレーターである、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
アポリポタンパク質を含まないアクセプターがシクロデキストリンである、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
請求項56、58または59記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体における炎症を予防または阻害する方法。
【請求項７９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体を含む、薬学的組成物。
【請求項８０】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体に連結されており、但し連結されている単離ペプチドまたはその模倣体が、
からなることはない、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
コレステロールエステルヒドロラーゼを増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、式
またはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物:
式中、
X1およびX9、X12またはX18は塩橋を形成できるアミノ酸であり;
X6はグルタミン酸もしくはリジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X13、X14、X15、X16およびX17は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項８２】
X2はグルタミンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X3およびX4は独立してアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X5およびX15は独立してアスパラギンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X7はトリプトファンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X8およびX11は独立してグリシンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X10はセリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X13はアスパラギン酸もしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X14はプロリンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり;
X16はヒスチジンもしくはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに/または
X17はフェニルアラニンもしくはその保存的置換であるアミノ酸である、請求項81記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
コレステロールエステルヒドロラーゼを増強する単離ペプチドまたはその模倣体が、
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、式
またはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、ならびに
nは1または2であり；
但し式中、nが1である場合、該単離ペプチドが、式
を含み:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
X、X1、X4、X5およびX6は独立して任意のアミノ酸であり、
X2は疎水性または非極性アミノ酸であり、ならびに
X3はヒスチジンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり；ならびに
式中、nが2である場合、該単離ペプチドが、式
を含む:
式中、
Fはフェニルアラニンまたはその保存的置換であるアミノ酸であり、
XaおよびX6は塩橋を形成できるアミノ酸であり、ならびに
Xb、X、X1、X2、X3、X4およびX5は独立して任意のアミノ酸である。
【請求項８５】
アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体または化合物が、
またはこれらのペプチドのうち1つのペプチドのペプチド変異体もしくはその一部分を含む、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、脂質複合体中に共に製剤化されているかまたはそれぞれが脂質複合体中に別々に製剤化されており、かつ投与前に共に混合される、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体および/またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、Zに結合されており、Zは標的化物質、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患もしくは冠状動脈性心疾患の治療用の第二の物質または化合物の溶解性、吸収、分布、半減期、生物学的利用能、安定性、活性および/もしくは有効性を増強する物質である、請求項79記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
請求項13記載の化合物Y-Zおよび請求項51記載の化合物Y-Zを含む、薬学的組成物。
【請求項８９】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてコレステロール代謝酵素の活性を調節する方法。
【請求項９０】
コレステロール代謝酵素がコレステロールエステルヒドロラーゼであり、かつその活性が増強される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
コレステロール代謝酵素がアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼであり、かつその活性が阻害される、請求項89記載の方法。
【請求項９２】
コレステロール代謝酵素がマクロファージの中に存在する、請求項89記載の方法。
【請求項９３】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項89記載の方法。
【請求項９４】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体においてアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項９５】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
請求項79から88のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体において冠状動脈性心疾患または心臓血管疾患を治療する方法。
【請求項９７】
薬学的組成物が、被験体に毎日、1日おき、または週2回投与される、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体をマクロファージに投与する段階を含む、マクロファージからのコレステロール流出を増加させる方法。
【請求項９９】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、インビボで投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドもしくはその模倣体またはアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドもしくはその模倣体が、ヒトのインビボで投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
マクロファージに、コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体を投与する、請求項98記載の方法。
【請求項１０２】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、インビボで投与される、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を増強する単離ペプチドまたはその模倣体およびアシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼを阻害する単離ペプチドまたはその模倣体が、ヒトのインビボで投与される、請求項101記載の方法。
【請求項１０４】
請求項13記載の化合物Y-Zまたは請求項51記載の化合物Y-Zをマクロファージに投与する段階を含む、マクロファージからのコレステロール流出を増加させる方法。
【請求項１０５】
マクロファージに、請求項13記載の化合物Y-Zおよび請求項51記載の化合物Y-Zを投与する、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
を含む、単離ペプチド。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５２３８５２（Ｐ２００７−５２３８５２Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５５８２（Ｐ２００６−５１５５８２）
【出願日】平成１６年６月１１日（２００４．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００８４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１０８４
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４５８２４５）クィーンズ ユニバーシティー アット キングストン (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１１日（２００４．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００８４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１０８４
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４５８２４５）クィーンズ ユニバーシティー アット キングストン (11)
【Ｆターム（参考）】
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