アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬
【課題】 感度及び精度が十分に高いアデノシン三リン酸の検出方法を提供すること。
【解決手段】 アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、アデノシン三リン酸を増幅させ、ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、増幅発光ステップにおいてルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンが、試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【解決手段】 アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、アデノシン三リン酸を増幅させ、ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、増幅発光ステップにおいてルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンが、試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」という）の検出方法及び検出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細菌等の微生物の検出方法として、すべての生物中に存在するＡＴＰを指標とし、生物発光（ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光）を測定することによって微生物中のＡＴＰを検出する方法が用いられるようになっている。
【０００３】
例えば、下記特許文献１〜３には、生物発光の持続性・安定性を高める技術として、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系にコエンザイムＡ、ポリリン酸、スルフヒドリル化合物等を添加することが開示されている。
【０００４】
また、下記特許文献４には、アデノシン一リン酸（以下、「ＡＭＰ」という）、アデニル酸キナーゼ（以下、「ＡＤＫ」という）、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」という）を、ＡＴＰを含む試料と混合させてＡＴＰを増幅させた後、ルシフェリン及びルシフェラーゼと反応させて発光を生じさせ、この発光量を測定してＡＴＰを検出する方法が開示されている。
【特許文献１】特許第３１７１５９５号公報
【特許文献２】特開平８−４７３９９号公報
【特許文献３】特開２００２−１９１３９６号公報
【特許文献４】特開２００１−２９９３９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記特許文献１〜３に開示された技術では、ＡＴＰ検出感度が不十分であり、極微量のＡＴＰを検出することができない。
【０００６】
他方、上記特許文献４に開示された技術では、ＡＴＰ検出感度が向上したものの、反応系中に不純物として混入しているＡＴＰ又はアデノシン二リン酸（以下、「ＡＤＰ」という）からＡＴＰが生成・増幅され、目的のＡＴＰ以外のＡＴＰもそのまま感度よく検出されるため、高い精度で目的のＡＴＰを検出することができない。
【０００７】
そこで、本発明は、ＡＴＰの検出感度及び精度が十分に高いＡＴＰの検出方法、及びそのようなＡＴＰの検出方法の実施を可能にするＡＴＰの検出用試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、下記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法を提供する。
（１）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（２）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＭＰ、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（３）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ポリリン酸、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
【０００９】
１分子のＡＴＰは、図１に示すように、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸及びＰＰＫとの反応により、２分子のＡＴＰに増幅される。従って、上記（１）〜（３）のＡＴＰ検出方法では、試料中のＡＴＰが増幅されることになり、十分に高いＡＴＰ検出感度が得られる。
【００１０】
また、ＡＴＰは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸が、試料と混合される前に既に混合されているため、ＡＴＰ増幅反応と発光反応とが同時に進行することになり、操作が簡便になる。
【００１１】
更に、ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼにはＡＴＰが不純物として混入している可能性が高いが、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素（ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼ）が酸素存在下でルシフェリン及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰは酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの反応により消費されてＡＭＰに変化している。また、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前は、ＡＴＰ増幅に必要なポリリン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中のＡＴＰは増幅されることなく、専ら消費されている。従って、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポリリン酸がＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰが増幅する可能性があるが、上記酵素中のＡＴＰの大半は増幅される前に消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。従って、上記（３）のＡＴＰの検出方法でも、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００１２】
上記（１）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をポリリン酸及びＡＭＰと混合させるステップと、得られた試料、ポリリン酸及びＡＭＰの混合物を酸素存在下でＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（２）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をポリリン酸と混合させるステップと、得られた試料及びポリリン酸の混合物を酸素存在下でＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をＡＭＰと混合させるステップと、得られた試料及びＡＭＰの混合物を酸素存在下でポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料を酸素存在下で同時にポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップからなるものであってもよい。
【００１３】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法においては、ＡＤＫ及びＰＰＫは融合タンパク質を形成していることが好ましい。このような融合タンパク質を用いることによって、ＡＤＫ及びＰＰＫの量の制御が容易になり、また、ＡＴＰ増幅反応の安定性が増し、検出結果の再現性が高くなる。
【００１４】
本発明はまた、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いられるＡＴＰの検出用試薬を提供する。すなわち、下記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬を提供する。
（i）ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（ii）ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（iii）ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
【００１５】
上記（i）の試薬は、ポリリン酸及びＡＭＰとともに用いることによって、上記（１）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。上記（ii）の試薬は、ポリリン酸とともに用いることによって、また、上記（iii）の試薬は、ＡＭＰとともに用いることによって、それぞれ上記（２）及び（３）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。
【００１６】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬においては、ＡＤＫ及びＰＰＫは融合タンパク質を形成していることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＡＴＰの検出感度及び精度が十分に高いＡＴＰの検出方法、及びそのようなＡＴＰの検出方法の実施を可能にするＡＴＰの検出用試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明のＡＴＰの検出方法及び検出用試薬の実施形態について説明する。
【００１９】
（ＡＴＰの検出方法）
本発明のＡＴＰの検出方法は、試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップと、ルシフェリンが発した光の量を測定するステップとを含み、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸が、試料と混合される前に既に酸素存在下で混合されていることを特徴とする。
【００２０】
すなわち、本発明のＡＴＰの検出方法は、下記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法である。
（１）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（２）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＭＰ、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（３）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ポリリン酸、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
【００２１】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料と、ポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの混合は、二ステップに分けて、まずポリリン酸及びＡＭＰ、又はポリリン酸のみ、若しくはＡＭＰのみを試料と混合させ、次にその混合物と残りの物質とを混合させても、また、一ステップで試料とすべての物質とを混合させてもよい。
【００２２】
一ステップで試料とすべての物質とを混合させる場合、混合は酸素存在下で行う。二ステップに分ける場合は、初めのステップの混合は必ずしも酸素存在下で行わなくてもよいが、後のステップの混合は酸素存在下で行う。
【００２３】
１分子のＡＴＰは、図１に示すように、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸及びＰＰＫとの反応により、２分子のＡＴＰに増幅される。従って、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰが増幅されることになり、十分に高いＡＴＰ検出感度が得られる。
【００２４】
また、ＡＴＰは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（１）〜（３）のＡＴＰ検出方法では、ＡＴＰを含む試料と、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸とが同時に混合され、ＡＴＰ増幅反応と発光反応とが同時に進行するため、反応条件（反応時間、反応温度等）の制御は一回で済み、操作が簡便になる。
【００２５】
更に、ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼにはＡＴＰが不純物として混入している可能性が高いが、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素（ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼ）が酸素存在下でルシフェリン及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰは酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの反応により消費されてＡＭＰに変化している。また、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前は、ＡＴＰ増幅に必要なポリリン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中のＡＴＰは増幅されることなく、専ら消費されている。従って、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポリリン酸がＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰが増幅する可能性があるが、上記酵素中のＡＴＰの大半は増幅される前に消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。従って、上記（３）のＡＴＰの検出方法でも、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００２６】
試料と、ポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの混合を二ステップに分ける場合は、ルシフェリン及びルシフェラーゼのいずれか一方は、後のステップだけでなく、初めのステップでも試料と混合させることができる。初めのステップでルシフェリン又はルシフェラーゼを混合させる場合は、両ステップでルシフェリン又はルシフェラーゼが混合されることになる。この場合、初めのステップでは、ルシフェリン及びルシフェラーゼの両方が混合されるわけではないので、試料中のＡＴＰが発光を生じさせることはない。なお、初めのステップでルシフェラーゼが混合される場合は、ルシフェラーゼ中に混入しているＡＴＰが後のステップで増幅されて検出される可能性があるが、大半は増幅される前に発光反応に供されて消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。また、２価金属イオンは、後のステップだけでなく、初めのステップでも試料と混合させることができる。
【００２７】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法におけるいずれの混合も、液体溶媒中で行うのが好ましく、特に緩衝液中で行うのが好ましい。混合を緩衝液中で行うことによって、ｐＨが一定範囲に維持され、ＡＴＰ検出過程の安定性、及び検出結果の再現性が高まる。緩衝液のｐＨは好ましくは４〜９であり、更に好ましくは７〜８である。酸素存在下で行う混合は、空気に接した緩衝液中で行えばよい。
【００２８】
ポリリン酸は化学式（ＰＯ３−）ｎ（ｎ≧２）で表される化合物であり、図１に示されたＡＴＰ増幅反応のサイクルにおいて、連続的にＡＤＰにリン酸基を供与してＡＴＰを生成する役割を果たす。ポリリン酸に含まれるリン酸基の数ｎは、好ましくは１０≦ｎ≦１０００であり、より好ましくは１０≦ｎ≦１００である。ｎ＜１０の場合は、リン酸基の数が少なく、リン酸基が連続的に供与されにくいため、他方、ｎ＞１０００の場合は、分子が大きく、ポリリン酸がＡＤＰ及びＰＰＫと反応しにくいため、ＡＴＰが十分に増幅されない傾向がある。１０≦ｎ≦１００の場合は、ポリリン酸がＡＤＰ及びＰＰＫと反応しやすく、ＡＴＰの増幅がより確実に実現される。ポリリン酸は、市販のものを用いることができる。
【００２９】
ＡＤＫ及びＰＰＫは、互いに別個のタンパク質として存在していても、融合して一個の融合タンパク質を形成していてもよいが、融合タンパク質を形成していることが好ましい。このような融合タンパク質を用いれば、ＡＤＫ及びＰＰＫの量を制御しやすくなり、また、ＡＴＰ増幅反応の安定性が増し、検出結果の再現性が高くなる。
【００３０】
ＡＤＫ及びＰＰＫとしては、動物、植物及び微生物のいずれに由来するものも用いることができるが、酵素の調製の簡便さの点から大腸菌由来のものが好適である。ＡＤＫ又はＰＰＫは、例えば、公知の方法に従って、酵素の遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入することにより、大腸菌の菌体内で大量生産させることができる。大腸菌の菌体内で生産された酵素は、公知の方法に従って菌体を破壊した後、クロマトグラフィー、電気泳動等により精製して用いる。精製したＡＤＫ及びＰＰＫは、更にアピラーゼで処理することにより酵素中のＡＴＰ及びＡＤＰをできるだけ除去してから用いるのが好ましい。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質も、両酵素の遺伝子を連結させた融合遺伝子をベクターに組み込む点を除けば、上記と同様の方法で調製することができる（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004) 参照）。
【００３１】
ルシフェリン及びルシフェラーゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェリン及びルシフェラーゼは、市販のものを用いることができる。
【００３２】
また、２価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、Ｍｇ２＋が好ましい。
【００３３】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いる装置は、試料と各種物質との混合を行うための容器と、混合によって生じた光の量を測定する手段とを備えるものであればよい。
【００３４】
混合のための容器としては、光の集積度を高める観点から、マイクロチューブ、マイクロプレート又はマイクロチャネルチップを用いることが好ましい。
【００３５】
発光量を測定する手段としては、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００３６】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法を用いて試料中のＡＴＰを定量する場合は、各種のＡＴＰ濃度の標準溶液について、用いる検出方法と同様の操作を行って発光量の経時変化を求めておき、これと、試料について求めた発光量の経時変化とを比較すればよい。
【００３７】
（ＡＴＰの検出用試薬）
本発明のＡＴＰの検出用試薬は、下記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬である。
（i）ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（ii）ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（iii）ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
【００３８】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬は、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いることができる。上記（i）の試薬は、ポリリン酸及びＡＭＰとともに用いることによって、上記（１）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。上記（ii）の試薬は、ポリリン酸とともに用いることによって、また、上記（iii）の試薬は、ＡＭＰとともに用いることによって、それぞれ上記（２）及び（３）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。
【００３９】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬は、上記（１）〜（３）以外のＡＴＰの検出方法においても用いることができる。すなわち、例えば、ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、ＡＴＰを増幅させる増幅ステップと、増幅ステップで得られた混合物に更にルシフェリン及びルシフェラーゼを混合させて、発光を生じさせる発光ステップと、発光ステップで発せられた光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法において用いることができる。具体的には、上記増幅ステップにおいて試料と混合させるポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンの一部として、上記（i）〜（iii）のいずれかのＡＴＰの検出用試薬を用いることができる。
【００４０】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬を得るために行う混合は、大気に接した液体溶媒中、特に緩衝液中で行うのが好ましい。緩衝液のｐＨは好ましくは４〜９であり、更に好ましくは７〜８である。
【００４１】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬におけるＡＤＫ及びＰＰＫは、互いに別個のタンパク質として存在していても、融合して一個の融合タンパク質を形成していてもよいが、融合タンパク質を形成していることが好ましい。
【００４２】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬におけるルシフェリン及びルシフェラーゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。
【００４３】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬における２価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、Ｍｇ２＋が好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例及び比較例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ａ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。更に、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（融合タンパク質：２．３６ｍｇ／ｍＬ）（１．７μＬ）と、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びＭｇ２＋を含有する。）（９８．３μＬ）とを混合した溶液Ｂを調製して、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００４６】
次に、９６穴マイクロプレートのウェル中で２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）（各５０μＬ）に溶液Ａ（５０μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｂ（１００μＬ）を混合させて、発光量（ＣＰＳ／１０）を経時的に測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、Perkin-Elmer社製 Wallac 1420 ＡＲＶＯＭＸマルチラベルマイクロプレートカウンターを用いた。
【００４７】
表１は、実施例１における発光量の経時変化を示す。また、図２は、実施例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００４８】
【表１】
【００４９】
表１及び図２から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後４〜５分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後１０分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００５０】
（実施例２）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｃ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ）を調製した。更に、ポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（ポリリン酸：５０ｍＭ）（４．６μＬ）と、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（融合タンパク質：２．２ｍｇ／ｍＬ）（１．８μＬ）と、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（９３．６μＬ）とを混合した溶液Ｄを調製して、ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００５１】
次に、９６穴マイクロプレートのウェル中で２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）（各５０μＬ）に溶液Ｃ（５０μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｄ（１００μＬ）を混合させて、発光量（ＣＰＳ／１０）を経時的に測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、Perkin-Elmer社製 Wallac 1420 ＡＲＶＯＭＸマルチラベルマイクロプレートカウンターを用いた。
【００５２】
表２は、実施例２における発光量の経時変化を示す。また、図３は、実施例２における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表１及び図２から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後４〜５分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後１０分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００５５】
（実施例３）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ａ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。更に、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質、ルシフェリン及びルシフェラーゼ（和光純薬工業社製ルシフェラーゼ組換え体）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｅ（融合タンパク質：４０μｇ／ｍＬ；ルシフェリン：２．７μＭ；ルシフェラーゼ：０．４５μｇ／ｍＬ）を調製して、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００５６】
次に、エッペンチューブ中でＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ）（１００μＬ）に溶液Ａ（１００μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｅ（２００μＬ）を混合させた。ＡＴＰ溶液と溶液Ａとの混合液に溶液Ｅを混合させてから一分毎に、１０μＬの混合液をルミチューブに取り、これにキッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（５０μＬ）を更に混合させて、その発光量（ＲＬＵ）を測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、キッコーマン社製ルミテスタＣ−１０００を用いた。
【００５７】
表３は、実施例３における発光量の経時変化を示す。また、図４は、実施例３における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３及び図４から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後２分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後６分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００６０】
（比較例１）
まず、ＡＴＰ、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した３種の溶液Ｆ（ＡＴＰ：２．０Ｅ−１１Ｍ，２．０Ｅ−１０Ｍ，２．０Ｅ−９Ｍ；ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。また、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｇ（融合タンパク質：４０μｇ／ｍＬ）を調製した。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004））に記載の方法に従って調製した。
【００６１】
次に、エッペンチューブ中で３種の溶液Ｆ（ＡＴＰ：２．０Ｅ−１１Ｍ，２．０Ｅ−１０Ｍ，２．０Ｅ−９Ｍ）（各１００μＬ）に溶液Ｇ（１００μＬ）を混合させた後、一定時間ごとに溶液Ｆ及びＧの混合溶液１０μＬをルミチューブに取り、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（５０μＬ）を更に混合させて、発光量（ＲＬＵ）を経時的に測定した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、キッコーマン社製ルミテスターＣ−１０００を用いた。
【００６２】
表４は、比較例１における発光量の経時変化を示す。図５は、比較例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
表４及び図５から明らかなように、実施例１〜３と同様に、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。
【００６５】
しかし、実施例１及び２の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）と、比較例１の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が２．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）とを比較すると、実施例１及び２の方が明らかに、発光量が大きく、かつ、コントロールとの差異も大きいことが分かる。また、実施例３の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合における反応開始後６分の発光量）と、比較例１の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が２．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）とを比較すると、実施例３の方が明らかに、発光量が大きく、かつ、コントロールとの差異も大きいことが分かる。
【００６６】
実施例１〜３及び比較例１により、本発明のＡＴＰの検出方法又は検出用試薬を用いれば、極微量のＡＴＰであっても十分に高い感度及び精度で検出することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のＡＴＰの検出方法は、ＡＴＰを指標とした細菌等の微生物の検出方法として利用することができる。また、ＡＴＰを産生する酵素（アセテートカイネース等）の活性の測定に利用することもできる。更に、グリセリン、グルコース、クレアチン、クレアチニンなどの生成系ではＡＴＰを同時に生じるが、これらの化合物の検出に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＡＴＰ増幅過程を示す図である。
【図２】実施例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図３】実施例２における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図４】実施例３における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図５】比較例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」という）の検出方法及び検出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細菌等の微生物の検出方法として、すべての生物中に存在するＡＴＰを指標とし、生物発光（ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光）を測定することによって微生物中のＡＴＰを検出する方法が用いられるようになっている。
【０００３】
例えば、下記特許文献１〜３には、生物発光の持続性・安定性を高める技術として、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系にコエンザイムＡ、ポリリン酸、スルフヒドリル化合物等を添加することが開示されている。
【０００４】
また、下記特許文献４には、アデノシン一リン酸（以下、「ＡＭＰ」という）、アデニル酸キナーゼ（以下、「ＡＤＫ」という）、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」という）を、ＡＴＰを含む試料と混合させてＡＴＰを増幅させた後、ルシフェリン及びルシフェラーゼと反応させて発光を生じさせ、この発光量を測定してＡＴＰを検出する方法が開示されている。
【特許文献１】特許第３１７１５９５号公報
【特許文献２】特開平８−４７３９９号公報
【特許文献３】特開２００２−１９１３９６号公報
【特許文献４】特開２００１−２９９３９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記特許文献１〜３に開示された技術では、ＡＴＰ検出感度が不十分であり、極微量のＡＴＰを検出することができない。
【０００６】
他方、上記特許文献４に開示された技術では、ＡＴＰ検出感度が向上したものの、反応系中に不純物として混入しているＡＴＰ又はアデノシン二リン酸（以下、「ＡＤＰ」という）からＡＴＰが生成・増幅され、目的のＡＴＰ以外のＡＴＰもそのまま感度よく検出されるため、高い精度で目的のＡＴＰを検出することができない。
【０００７】
そこで、本発明は、ＡＴＰの検出感度及び精度が十分に高いＡＴＰの検出方法、及びそのようなＡＴＰの検出方法の実施を可能にするＡＴＰの検出用試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、下記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法を提供する。
（１）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（２）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＭＰ、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（３）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ポリリン酸、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
【０００９】
１分子のＡＴＰは、図１に示すように、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸及びＰＰＫとの反応により、２分子のＡＴＰに増幅される。従って、上記（１）〜（３）のＡＴＰ検出方法では、試料中のＡＴＰが増幅されることになり、十分に高いＡＴＰ検出感度が得られる。
【００１０】
また、ＡＴＰは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸が、試料と混合される前に既に混合されているため、ＡＴＰ増幅反応と発光反応とが同時に進行することになり、操作が簡便になる。
【００１１】
更に、ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼにはＡＴＰが不純物として混入している可能性が高いが、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素（ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼ）が酸素存在下でルシフェリン及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰは酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの反応により消費されてＡＭＰに変化している。また、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前は、ＡＴＰ増幅に必要なポリリン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中のＡＴＰは増幅されることなく、専ら消費されている。従って、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポリリン酸がＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰが増幅する可能性があるが、上記酵素中のＡＴＰの大半は増幅される前に消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。従って、上記（３）のＡＴＰの検出方法でも、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００１２】
上記（１）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をポリリン酸及びＡＭＰと混合させるステップと、得られた試料、ポリリン酸及びＡＭＰの混合物を酸素存在下でＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（２）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をポリリン酸と混合させるステップと、得られた試料及びポリリン酸の混合物を酸素存在下でＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料をＡＭＰと混合させるステップと、得られた試料及びＡＭＰの混合物を酸素存在下でポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップとからなるものであってもよい。また、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法における増幅発光ステップは、試料を酸素存在下で同時にポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップからなるものであってもよい。
【００１３】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法においては、ＡＤＫ及びＰＰＫは融合タンパク質を形成していることが好ましい。このような融合タンパク質を用いることによって、ＡＤＫ及びＰＰＫの量の制御が容易になり、また、ＡＴＰ増幅反応の安定性が増し、検出結果の再現性が高くなる。
【００１４】
本発明はまた、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いられるＡＴＰの検出用試薬を提供する。すなわち、下記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬を提供する。
（i）ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（ii）ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（iii）ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
【００１５】
上記（i）の試薬は、ポリリン酸及びＡＭＰとともに用いることによって、上記（１）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。上記（ii）の試薬は、ポリリン酸とともに用いることによって、また、上記（iii）の試薬は、ＡＭＰとともに用いることによって、それぞれ上記（２）及び（３）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。
【００１６】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬においては、ＡＤＫ及びＰＰＫは融合タンパク質を形成していることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＡＴＰの検出感度及び精度が十分に高いＡＴＰの検出方法、及びそのようなＡＴＰの検出方法の実施を可能にするＡＴＰの検出用試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明のＡＴＰの検出方法及び検出用試薬の実施形態について説明する。
【００１９】
（ＡＴＰの検出方法）
本発明のＡＴＰの検出方法は、試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させるステップと、ルシフェリンが発した光の量を測定するステップとを含み、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸が、試料と混合される前に既に酸素存在下で混合されていることを特徴とする。
【００２０】
すなわち、本発明のＡＴＰの検出方法は、下記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法である。
（１）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（２）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ＡＭＰ、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
（３）ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記ＡＴＰを増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法であって、前記ポリリン酸、前記ＡＤＫ、前記ＰＰＫ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするＡＴＰの検出方法
【００２１】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料と、ポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの混合は、二ステップに分けて、まずポリリン酸及びＡＭＰ、又はポリリン酸のみ、若しくはＡＭＰのみを試料と混合させ、次にその混合物と残りの物質とを混合させても、また、一ステップで試料とすべての物質とを混合させてもよい。
【００２２】
一ステップで試料とすべての物質とを混合させる場合、混合は酸素存在下で行う。二ステップに分ける場合は、初めのステップの混合は必ずしも酸素存在下で行わなくてもよいが、後のステップの混合は酸素存在下で行う。
【００２３】
１分子のＡＴＰは、図１に示すように、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ポリリン酸及びＰＰＫとの反応により、２分子のＡＴＰに増幅される。従って、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰが増幅されることになり、十分に高いＡＴＰ検出感度が得られる。
【００２４】
また、ＡＴＰは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（１）〜（３）のＡＴＰ検出方法では、ＡＴＰを含む試料と、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン、又はこれらの物質及びＡＭＰ若しくはポリリン酸とが同時に混合され、ＡＴＰ増幅反応と発光反応とが同時に進行するため、反応条件（反応時間、反応温度等）の制御は一回で済み、操作が簡便になる。
【００２５】
更に、ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼにはＡＴＰが不純物として混入している可能性が高いが、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素（ＡＤＫ、ＰＰＫ及びルシフェラーゼ）が酸素存在下でルシフェリン及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰは酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの反応により消費されてＡＭＰに変化している。また、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前は、ＡＴＰ増幅に必要なポリリン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中のＡＴＰは増幅されることなく、専ら消費されている。従って、上記（１）及び（２）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（３）のＡＴＰの検出方法では、試料中のＡＴＰがＡＴＰ増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポリリン酸がＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合されているため、上記酵素中のＡＴＰが増幅する可能性があるが、上記酵素中のＡＴＰの大半は増幅される前に消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。従って、上記（３）のＡＴＰの検出方法でも、試料中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００２６】
試料と、ポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンとの混合を二ステップに分ける場合は、ルシフェリン及びルシフェラーゼのいずれか一方は、後のステップだけでなく、初めのステップでも試料と混合させることができる。初めのステップでルシフェリン又はルシフェラーゼを混合させる場合は、両ステップでルシフェリン又はルシフェラーゼが混合されることになる。この場合、初めのステップでは、ルシフェリン及びルシフェラーゼの両方が混合されるわけではないので、試料中のＡＴＰが発光を生じさせることはない。なお、初めのステップでルシフェラーゼが混合される場合は、ルシフェラーゼ中に混入しているＡＴＰが後のステップで増幅されて検出される可能性があるが、大半は増幅される前に発光反応に供されて消費されるので、試料中のＡＴＰの検出には影響しない。また、２価金属イオンは、後のステップだけでなく、初めのステップでも試料と混合させることができる。
【００２７】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法におけるいずれの混合も、液体溶媒中で行うのが好ましく、特に緩衝液中で行うのが好ましい。混合を緩衝液中で行うことによって、ｐＨが一定範囲に維持され、ＡＴＰ検出過程の安定性、及び検出結果の再現性が高まる。緩衝液のｐＨは好ましくは４〜９であり、更に好ましくは７〜８である。酸素存在下で行う混合は、空気に接した緩衝液中で行えばよい。
【００２８】
ポリリン酸は化学式（ＰＯ３−）ｎ（ｎ≧２）で表される化合物であり、図１に示されたＡＴＰ増幅反応のサイクルにおいて、連続的にＡＤＰにリン酸基を供与してＡＴＰを生成する役割を果たす。ポリリン酸に含まれるリン酸基の数ｎは、好ましくは１０≦ｎ≦１０００であり、より好ましくは１０≦ｎ≦１００である。ｎ＜１０の場合は、リン酸基の数が少なく、リン酸基が連続的に供与されにくいため、他方、ｎ＞１０００の場合は、分子が大きく、ポリリン酸がＡＤＰ及びＰＰＫと反応しにくいため、ＡＴＰが十分に増幅されない傾向がある。１０≦ｎ≦１００の場合は、ポリリン酸がＡＤＰ及びＰＰＫと反応しやすく、ＡＴＰの増幅がより確実に実現される。ポリリン酸は、市販のものを用いることができる。
【００２９】
ＡＤＫ及びＰＰＫは、互いに別個のタンパク質として存在していても、融合して一個の融合タンパク質を形成していてもよいが、融合タンパク質を形成していることが好ましい。このような融合タンパク質を用いれば、ＡＤＫ及びＰＰＫの量を制御しやすくなり、また、ＡＴＰ増幅反応の安定性が増し、検出結果の再現性が高くなる。
【００３０】
ＡＤＫ及びＰＰＫとしては、動物、植物及び微生物のいずれに由来するものも用いることができるが、酵素の調製の簡便さの点から大腸菌由来のものが好適である。ＡＤＫ又はＰＰＫは、例えば、公知の方法に従って、酵素の遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入することにより、大腸菌の菌体内で大量生産させることができる。大腸菌の菌体内で生産された酵素は、公知の方法に従って菌体を破壊した後、クロマトグラフィー、電気泳動等により精製して用いる。精製したＡＤＫ及びＰＰＫは、更にアピラーゼで処理することにより酵素中のＡＴＰ及びＡＤＰをできるだけ除去してから用いるのが好ましい。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質も、両酵素の遺伝子を連結させた融合遺伝子をベクターに組み込む点を除けば、上記と同様の方法で調製することができる（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004) 参照）。
【００３１】
ルシフェリン及びルシフェラーゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェリン及びルシフェラーゼは、市販のものを用いることができる。
【００３２】
また、２価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、Ｍｇ２＋が好ましい。
【００３３】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いる装置は、試料と各種物質との混合を行うための容器と、混合によって生じた光の量を測定する手段とを備えるものであればよい。
【００３４】
混合のための容器としては、光の集積度を高める観点から、マイクロチューブ、マイクロプレート又はマイクロチャネルチップを用いることが好ましい。
【００３５】
発光量を測定する手段としては、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００３６】
上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法を用いて試料中のＡＴＰを定量する場合は、各種のＡＴＰ濃度の標準溶液について、用いる検出方法と同様の操作を行って発光量の経時変化を求めておき、これと、試料について求めた発光量の経時変化とを比較すればよい。
【００３７】
（ＡＴＰの検出用試薬）
本発明のＡＴＰの検出用試薬は、下記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬である。
（i）ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（ii）ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
（iii）ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするＡＴＰの検出用試薬
【００３８】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬は、上記（１）〜（３）のＡＴＰの検出方法において用いることができる。上記（i）の試薬は、ポリリン酸及びＡＭＰとともに用いることによって、上記（１）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。上記（ii）の試薬は、ポリリン酸とともに用いることによって、また、上記（iii）の試薬は、ＡＭＰとともに用いることによって、それぞれ上記（２）及び（３）のＡＴＰの検出方法の実施を可能にする。
【００３９】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬は、上記（１）〜（３）以外のＡＴＰの検出方法においても用いることができる。すなわち、例えば、ＡＴＰを含有する試料をポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、ＡＴＰを増幅させる増幅ステップと、増幅ステップで得られた混合物に更にルシフェリン及びルシフェラーゼを混合させて、発光を生じさせる発光ステップと、発光ステップで発せられた光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるＡＴＰの検出方法において用いることができる。具体的には、上記増幅ステップにおいて試料と混合させるポリリン酸、ＡＭＰ、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンの一部として、上記（i）〜（iii）のいずれかのＡＴＰの検出用試薬を用いることができる。
【００４０】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬を得るために行う混合は、大気に接した液体溶媒中、特に緩衝液中で行うのが好ましい。緩衝液のｐＨは好ましくは４〜９であり、更に好ましくは７〜８である。
【００４１】
上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬におけるＡＤＫ及びＰＰＫは、互いに別個のタンパク質として存在していても、融合して一個の融合タンパク質を形成していてもよいが、融合タンパク質を形成していることが好ましい。
【００４２】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬におけるルシフェリン及びルシフェラーゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。
【００４３】
また、上記（i）〜（iii）のＡＴＰの検出用試薬における２価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、Ｍｇ２＋が好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例及び比較例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ａ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。更に、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（融合タンパク質：２．３６ｍｇ／ｍＬ）（１．７μＬ）と、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びＭｇ２＋を含有する。）（９８．３μＬ）とを混合した溶液Ｂを調製して、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００４６】
次に、９６穴マイクロプレートのウェル中で２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）（各５０μＬ）に溶液Ａ（５０μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｂ（１００μＬ）を混合させて、発光量（ＣＰＳ／１０）を経時的に測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、Perkin-Elmer社製 Wallac 1420 ＡＲＶＯＭＸマルチラベルマイクロプレートカウンターを用いた。
【００４７】
表１は、実施例１における発光量の経時変化を示す。また、図２は、実施例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００４８】
【表１】
【００４９】
表１及び図２から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後４〜５分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後１０分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００５０】
（実施例２）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｃ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ）を調製した。更に、ポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（ポリリン酸：５０ｍＭ）（４．６μＬ）と、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（融合タンパク質：２．２ｍｇ／ｍＬ）（１．８μＬ）と、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（９３．６μＬ）とを混合した溶液Ｄを調製して、ポリリン酸、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００５１】
次に、９６穴マイクロプレートのウェル中で２種のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ，４．０Ｅ−１２Ｍ）（各５０μＬ）に溶液Ｃ（５０μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｄ（１００μＬ）を混合させて、発光量（ＣＰＳ／１０）を経時的に測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、Perkin-Elmer社製 Wallac 1420 ＡＲＶＯＭＸマルチラベルマイクロプレートカウンターを用いた。
【００５２】
表２は、実施例２における発光量の経時変化を示す。また、図３は、実施例２における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表１及び図２から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後４〜５分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後１０分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００５５】
（実施例３）
まず、ＡＴＰをTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ）を調製した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ａ（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。更に、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質、ルシフェリン及びルシフェラーゼ（和光純薬工業社製ルシフェラーゼ組換え体）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｅ（融合タンパク質：４０μｇ／ｍＬ；ルシフェリン：２．７μＭ；ルシフェラーゼ：０．４５μｇ／ｍＬ）を調製して、ＡＤＫ、ＰＰＫ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンからなるＡＴＰの検出用試薬の溶液を得た。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004)）に記載の方法に従って調製した。
【００５６】
次に、エッペンチューブ中でＡＴＰ溶液（ＡＴＰ：４．０Ｅ−１３Ｍ）（１００μＬ）に溶液Ａ（１００μＬ）を混合させた後、更に溶液Ｅ（２００μＬ）を混合させた。ＡＴＰ溶液と溶液Ａとの混合液に溶液Ｅを混合させてから一分毎に、１０μＬの混合液をルミチューブに取り、これにキッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（５０μＬ）を更に混合させて、その発光量（ＲＬＵ）を測定した。また、ＡＴＰを含まないTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、キッコーマン社製ルミテスタＣ−１０００を用いた。
【００５７】
表３は、実施例３における発光量の経時変化を示す。また、図４は、実施例３における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３及び図４から明らかなように、ＡＴＰ溶液及びコントロールのいずれについても、反応開始後２分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量しか測定されなかったが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し始めた。また、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。反応開始後６分の時点では、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合でも、発光量は十分に大きく、かつ、コントロールとの差異も十分に大きかった。
【００６０】
（比較例１）
まず、ＡＴＰ、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した３種の溶液Ｆ（ＡＴＰ：２．０Ｅ−１１Ｍ，２．０Ｅ−１０Ｍ，２．０Ｅ−９Ｍ；ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）を調製した。また、ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液Ｇ（融合タンパク質：４０μｇ／ｍＬ）を調製した。ＡＤＫ及びＰＰＫの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004））に記載の方法に従って調製した。
【００６１】
次に、エッペンチューブ中で３種の溶液Ｆ（ＡＴＰ：２．０Ｅ−１１Ｍ，２．０Ｅ−１０Ｍ，２．０Ｅ−９Ｍ）（各１００μＬ）に溶液Ｇ（１００μＬ）を混合させた後、一定時間ごとに溶液Ｆ及びＧの混合溶液１０μＬをルミチューブに取り、キッコーマン社製ルシフェール（商標）２５０プラス（５０μＬ）を更に混合させて、発光量（ＲＬＵ）を経時的に測定した。また、ＡＭＰ及びポリリン酸（（ＰＯ３−）６５）（Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65）をTris−Ｍｇ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（ＡＭＰ：４．０Ｅ−５Ｍ；ポリリン酸：２ｍＭ）をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、キッコーマン社製ルミテスターＣ−１０００を用いた。
【００６２】
表４は、比較例１における発光量の経時変化を示す。図５は、比較例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
表４及び図５から明らかなように、実施例１〜３と同様に、発光量及びその増加量はＡＴＰ量（ＡＴＰ濃度）に依存していた。
【００６５】
しかし、実施例１及び２の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）と、比較例１の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が２．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）とを比較すると、実施例１及び２の方が明らかに、発光量が大きく、かつ、コントロールとの差異も大きいことが分かる。また、実施例３の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が４．０Ｅ−１３Ｍの場合における反応開始後６分の発光量）と、比較例１の結果（特に、ＡＴＰの初期濃度が２．０Ｅ−１２Ｍの場合における反応開始後１０分の発光量）とを比較すると、実施例３の方が明らかに、発光量が大きく、かつ、コントロールとの差異も大きいことが分かる。
【００６６】
実施例１〜３及び比較例１により、本発明のＡＴＰの検出方法又は検出用試薬を用いれば、極微量のＡＴＰであっても十分に高い感度及び精度で検出することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のＡＴＰの検出方法は、ＡＴＰを指標とした細菌等の微生物の検出方法として利用することができる。また、ＡＴＰを産生する酵素（アセテートカイネース等）の活性の測定に利用することもできる。更に、グリセリン、グルコース、クレアチン、クレアチニンなどの生成系ではＡＴＰを同時に生じるが、これらの化合物の検出に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＡＴＰ増幅過程を示す図である。
【図２】実施例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図３】実施例２における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図４】実施例３における発光量の経時変化を示すグラフである。
【図５】比較例１における発光量の経時変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項２】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項３】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記ポリリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項４】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、得られた前記試料、前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸の混合物を酸素存在下で前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項１に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項５】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記ポリリン酸と混合させるステップと、得られた前記試料及び前記ポリリン酸の混合物を酸素存在下で前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項２に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項６】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、得られた前記試料及び前記アデノシン一リン酸の混合物を酸素存在下で前記ポリリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項３に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項７】
前記増幅発光ステップが、前記試料を酸素存在下で同時に前記ポリリン酸、前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップからなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項８】
前記アデニル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項９】
アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１０】
アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１１】
ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１２】
前記アデニル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成していることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項２】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項３】
アデノシン三リン酸を含有する試料をポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記ポリリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項４】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、得られた前記試料、前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸の混合物を酸素存在下で前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項１に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項５】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記ポリリン酸と混合させるステップと、得られた前記試料及び前記ポリリン酸の混合物を酸素存在下で前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項２に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項６】
前記増幅発光ステップが、前記試料を前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、得られた前記試料及び前記アデノシン一リン酸の混合物を酸素存在下で前記ポリリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップとからなることを特徴とする、請求項３に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項７】
前記増幅発光ステップが、前記試料を酸素存在下で同時に前記ポリリン酸、前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記２価金属イオンと混合させるステップからなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項８】
前記アデニル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
【請求項９】
アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１０】
アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１１】
ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【請求項１２】
前記アデニル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成していることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検出用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２８０３６５（Ｐ２００６−２８０３６５Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８８９９５（Ｐ２００５−２８８９９５）
【出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【出願人】（５０２２０５１４５）株式会社物産ナノテク研究所 (101)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【出願人】（５０２２０５１４５）株式会社物産ナノテク研究所 (101)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]