アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
【課題】従来のＬ−アミノ酸生産菌よりも、高収率なＬ−アミノ酸生産菌を育種する。
【解決手段】Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるアミノ酸生産能を有し、かつピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物を培地、例えばエタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地で培養して、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する。
【解決手段】Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるアミノ酸生産能を有し、かつピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物を培地、例えばエタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地で培養して、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸系を生産する微生物及びＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン及びＬ−トリプトファンは飼料添加物等として広く用いられている。また、Ｌ−フェニルアラニンは、甘味料の原料として使用されている。Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−イソロイシンは、アミノ酸輸液やサプリメントに利用される。また、Ｌ−セリンは食品添加物や化粧品の原料などとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００３】
近年は、目的物質の発酵生産に組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強することによって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００４】
上記のような技術として、例えばＬ−リジンでは、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素をコードする遺伝子の発現増強（特許文献１）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（特許文献２）、及び、リンゴ酸酵素（特許文献３）の活性低下、等が知られている。
【０００５】
Ｌ−トリプトファンでは、フォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼ、アントラニレートシンターゼのフィードバック阻害の解除（特許文献４）、トリプトファナーゼの欠損（特許文献５）等が知られている。
【０００６】
Ｌ−フェニルアラニンでは、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼのフィードバック阻害の解除 (特許文献６）、及び、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーの欠損(特許文献７）等が知られている。
【０００７】
Ｌ−バリンでは、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H＋-ATPaseを欠失している変異株（特許文献８）等が、Ｌ−ロイシンではイソプロピルマレートシンターゼのフィードバック阻害の解除（特許文献９）等が、Ｌ−イソロイシンでは、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子等の発現強化（特許文献１０）等が知られている。
【０００８】
Ｌ−セリンでは、セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼを保持する菌株（特許文献１１）、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強された型細菌、さらにＬ−セリン分解能を欠失した細菌（特許文献１２）、及び、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有する細菌（特許文献１３）等が知られている。
【特許文献１】米国特許第6,040,160号
【特許文献２】米国特許第5,827,698号
【特許文献３】WO2005/010175
【特許文献４】米国特許第6,180,373号
【特許文献５】米国特許第4,371,614号
【特許文献６】米国特許第5,354,672号
【特許文献７】WO03/044191
【特許文献８】米国特許第5,888,783号
【特許文献９】米国特許第6,403,342号
【特許文献１０】米国特許第5,998,178号
【特許文献１１】米国特許第5,618,716号
【特許文献１２】米国特許第6,037,154号
【特許文献１３】米国特許第6,258,573号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来のＬ−アミノ酸生産は、主として糖質を炭素源として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによりアセチルＣｏＡをＴＣＡサイクルに供給することで成立している。しかし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの反応は脱炭酸を伴うため、必ず１分子のCO2が放出される。従って、さらに生産性を上昇させるためには、この脱炭酸を減少することが必要であると本発明者は考えた。そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、エタノールや脂肪酸などのアセチルＣｏＡを供給する物質を炭素源として、炭酸固定反応を触媒する酵素であるピルビン酸シンターゼ、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの酵素活性を上昇させることにより、さらには、ピルビン酸シンターゼの酵素活性に必要な還元型フェレドキシン又は還元型フラボドキシンをそれぞれの酸化型から生成する活性を有するフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの酵素活性を強化すること、あるいはフェレドキシン又はフラボドキシン産生能を向上させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物。
（２）ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（３）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（４）ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、前記微生物。
（５）ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、前記微生物。
（６）ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すポリペプチドをコードする、前記微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（７）ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む、前記微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（８）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードする、前記微生物：
（Ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号６において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
（９）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、前記微生物：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（１１）フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、前記微生物。
（１２）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、前記微生物。
（１３）好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記微生物。
（１４）微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、前記微生物。
（１５）微生物が、コリネ型細菌である前記微生物。
（１６）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１７）前記培地が、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含有することを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく発酵生産することができる。また、本発明の方法は、好ましい形態においては、脱炭酸を抑制し、炭酸固定反応を利用することで、炭酸ガスの排出が低減できる、環境に配慮した方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物である。
【００１４】
本発明において「Ｌ−アミノ酸」とは、特記しない限り前記Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンを意味する。
【００１５】
「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。本発明の微生物が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸であってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−アミノ酸生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよい。
【００１６】
また、「ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大する」とは、もともとピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼを有している微生物において、これらの少なくとも一方の酵素の活性が増大すること、及び、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼを有していない微生物にこれらの少なくとも一方の酵素の活性を付与することの両方を含む。
【００１７】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、又はこれらの両方の活性が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、またはピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物を親株とし、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強することによって得ることができる。
【００１８】
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１９】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００２０】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW31
10株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００２１】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997, 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００２２】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００２３】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２４】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２５】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２６】
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００２７】
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能
を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２９】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
【００３０】
本発明に用いる細菌は、エタノールの資化性を有する細菌であってもよい。このような細菌としては、元来エタノールの資化性を有する細菌、エタノールの資化性を付与された組換え株、又はエタノールの資化性が高まった変異株でもよい。エシェリヒア・コリにおいては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアルコールデヒドロゲナーゼの活性を有するAdhEの存在が知られている。
アセチル-CoA + NADH + H+ = アセトアルデヒド + NAD+ + ＣｏＡ
アセトアルデヒド + NADH + H+ = エタノール + NAD+
【００３１】
エシェリヒア・コリは好気条件ではエタノールは資化できないが、AdhEの変異によって、好気的にエタノールを資化出来るようになることが知られている（Clark D. P., and C
ronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。このような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された（Glu568Lys、E568K）がある。
【００３２】
さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばフェニルアラニン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。
【００３３】
コリネバクテリウム・グルタミカムは、複数のアルコールデヒドロゲナーゼを有しており、好気的にエタノールを資化できることが知られている（Pelechova J, Smekal F, Koura V, Plachy J, and Krumphanzl V. 1980. Folia Microbiol (Praha) 25: 341-346）。
【００３４】
本発明に用いる細菌は、油脂又は脂肪酸の資化性を有する細菌であってもよい。このような細菌としては、元来油脂もしくは脂肪酸の資化性を有する細菌、油脂もしくは脂肪酸の資化性を付与された組換え株、又は油脂もしくは脂肪酸の資化性が高まった変異株でもよい。エシェリヒア・コリにおいては、鎖長12以上の長鎖の脂肪酸を資化できることが知られている（Clark, D. P. and Cronan, J. E. 1996. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition (Neidhardt, F. C. Ed.) pp. 343-357）。さらに、中鎖や短鎖の脂肪酸を利用できるようになったエシェリヒア・コリの変異株が知られている（Nunn, W. D. et al. 1979. J. Biol. Chem. 254: 9130-9134; Salanitro, J. P. and Wegener, W. S. 1971. J. Bacteriol. 108: 885-892）。
【００３５】
本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地から回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量で培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンを含む。特に、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファンが好ましい。
【００３６】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００３７】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３８】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株
を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３９】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００４０】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはＬ−アミノ酸生産菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。Ｌ−アミノ酸生産菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００４１】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００４２】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００４３】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００４４】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００４５】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００４６】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196Δmez/pCABD2（WO2005/010175）やWC196ΔcadAΔldc/pCABD2（WO2006/078039）等が挙げられる。WC196Δmez/pCABD2株は、リンゴ酸酵素（マリックエンザイム）をコードするsfcA及びb2463遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。sfcA遺伝子及びb2463遺伝子の塩基配列、及び各遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号５２〜５５に示す。
【００４７】
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。このプラスミドを持つエシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2は、AJ12604と命名され、1991年1月28日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-11975の受託番号で寄託され、1991年9月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で寄託されている。
【００４８】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレート
シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００４９】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００５０】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００５１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E.
coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli
K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００５２】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926、米国特許第5,888,783号)を親株として用いることができる。
【００５３】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００５５】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００５６】
Ｌ−セリン生産菌
Ｌ−セリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、セリンによるフィード
バック阻害が減少した３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア・コリ（特許2584409号、米国特許第5,618,716号）が挙げられる。また、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強されたコリネ型細菌、さらにＬ−セリン分解能を欠失したコリネ型細菌（特開平11-253187号、米国特許第6,037,154号）、及び、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌（特開平11-266881号、米国特許第6,258,573号）も使用できる。
【００５７】
遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「保存的変異」については、後述のピルビン酸シンターゼ等に関する記載が、上記遺伝子にも適用される。
【００５８】
＜１−２＞ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物を、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変した微生物である。ピルビン酸シンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が増大するように改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、前記したように、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。
【００５９】
先にピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの酵素活性を高めるように細菌の改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与してもよい。なお、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強は、前記したような、遺伝子の発現を増強する方法によって行うことができる。すなわち、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる、内因性ピルビン酸シンターゼ遺伝子、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の発現増強によるものであってもよいし、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドの細菌への導入、またはこれらの遺伝子の細菌染色体への導入などによる外因性ピルビン酸シンターゼ遺伝子の発現増強であってもよい。
【００６０】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００６１】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 = 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 + ＣｏＡ
【００６２】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S., Ishii, M., Kodama, T., and Igarashi, Y. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、実施例に記載したように、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００６３】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のピルビン酸シンターゼ遺伝子、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼ遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌の遺伝子を利用することが可能である。
【００６４】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T., Ochiai, T., Morita, S., Nishiyama, A., Yamada, E., Arai, H., Ishii, M. and Igarashi, Y. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００６５】
エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1435284〜1438808に位置する、配列番号３に示す塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、
すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。配列番号４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。実施例に示したように、この遺伝子産物がピルビン酸シンターゼ活性を有し、同遺伝子の発現強化により、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することが実証された。
【００６６】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【００６７】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 = ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【００６８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H., Ono, K., Miyatake, K., Nakano, Y., and Kitaoka, S. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H., Ono, K., Miyatake, K., Nakano, Y., and Kitaoka, S. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C., Stejskal, F., Zhu, G., Keithly, J. S., and Martin, W. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。失活などの理由により活性が測定できない場合には、実施例に記載したように、ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現を確認することが可能である。
【００６９】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M., Inui, H., Yamaji, R., Yamamoto, T., Takenaka, S., Ueda, M., Nakano, Y., and Miyatake, K. 2000. FEBS Lett. 479: 155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C., Stejskal, F., Zhu,
G., Keithly, J. S., and Martin, W. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V., Ault, J. G., Stejskal, F., and Keithly, J. S.
2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【００７０】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子として、配列番号５に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる（GenBank Accession No. AB021127）。配列番号６には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. BAB12024）。
【００７１】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００７２】
「フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【００７３】
還元型フェレドキシン + NADP+ = 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００７４】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A., Arakaki, A. K., Cortez, N., and Carrillo, N. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【００７５】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P., Neuer, G., Ludwig-Festl, M., and Knappe, J. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００７６】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ−アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V., Reichard, P., Eliasson, R., Pontis, E., Krook
, M., Jornvall, H., and Haggard-Ljungquist, E. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ−プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H., Yamaguchi, E., Matsunaga, K., Aramaki, H., and Horiuchi, T. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）。
【００７７】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。配列番号８にはFprのアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No.
BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【００７８】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００７９】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J., Sabri, M., Marshall, K. R., Lawson, R. J., Lewis, D. G., Clift, D., Balding, P. R., Dunford, A. J., Warman, A. J., McVey, J. P., Quinn, A. M., Sutcliffe, M. J., Scrutton, N. S., and Munro, A. W. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００８０】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００８１】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００８２】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウ
ェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００８３】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E., Wang, C. W., and Swartz, J. R. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【００８４】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、ピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C., Chen, L. M., and Matthews, R. G. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S., Bobst, C., Hemann, C. F., Hille, R., and Tabita, F. R. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのフェレドキシン遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシンあるいはフラボドキシンを用いることもできる。
【００８５】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号９に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号１１に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号１０及び配列番号１２には、Fdx及びYfhLのアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC75578及びAAC75615）。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号１３に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号１５に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号１４及び配列番号１６には、fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。
【００８６】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置する配列番号１７に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号１９に示すフェレドキシンII遺伝子を例示すること
ができる。配列番号１８及び配列番号２０には、フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIがコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示す
ることができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであって
もよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００８７】
これらのピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、フラボドキシンをコードする遺伝子（以後、総称して、本発明の遺伝子という）は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列、又は野生型のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００８８】
上記置換は、機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である
【００８９】
より具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００９０】
また、それぞれ本発明の遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様に本発明の遺伝子は、機能を有する限り、コードされるタンパク質のＮ末端側、及び／又は、C末端側が延長又は、削られていてもよい。例えば延長する長さは、
アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
【００９１】
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては本発明の遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードしているかどうかは、例えば、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する微生物に導入し、各タンパク質の活性を測定することによって確認できる。
【００９２】
本発明の遺伝子は、上述の塩基配列を有するDNA、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードするDNAであってもよい。
【００９３】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70％以上、好ましくは80％以上、より好ましく90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
【００９４】
プローブは、本発明の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【００９５】
上記の保存的バリアントに関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与について記載した酵素及び遺伝子にも適用される。
【００９６】
上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ−アミノ酸生産能の付与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。
【００９７】
例えば、クロロビウム・テピダムのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３５、３６に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法（polymerase chain react
ion）法（White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得することができる。
エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３８、３９に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【００９８】
ユーグレナ・グラシリスのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子は、配列番号５に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４０、４１に示すプライマーを用いて、ユーグレナ・グラシリスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【００９９】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子は、配列番号７の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４２、４３に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１００】
エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子fdxは、配列番号９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４４、４５に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１０１】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子fldAは、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フラボドキシン遺伝子fldBは、配列番号１５の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１０２】
また、クロロビウム・テピダムのフェレドキシンＩ遺伝子は、配列番号１７の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フェレドキシンII遺伝子は、配列番号１９の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１０３】
他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【０１０４】
本発明の遺伝子、及びＬ−アミノ酸生合成系遺伝子の発現の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによって本発明の遺伝子のコピー数を高めたり、本発明の遺伝子の発現調節配列を改変したりすることによって達成することができる。また、本発明の遺伝子の発現の増強は、本発明の遺伝子の発現を上昇させるようなアクチベーターを増幅させるか、及び／又は、本発明の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。
以下に、遺伝子の発現を増強する方法について説明する。
【０１０５】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【０１０６】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.
Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【０１０７】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１０８】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１０９】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldst
einとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【０１１０】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F.
J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【０１１１】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【０１１２】
ピルビン酸シンターゼが複数のサブユニットからなる場合は、各々のサブユニットをコードする遺伝子の発現は、別個に増強してもよく、ポリシストロンとして同時に増強してもよい。また、遺伝子をベクターを用いて微生物に導入する場合、各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクター分子に同時に担持させてもよく、異なるベクター分子に別個に担持させてもよい。また、遺伝子を染色体に挿入する場合も、各サブユニットをコードする遺伝子は、染色体上の同一部位に同時に挿入してもよく、異なる位置に別個に挿入してもよい。
【０１１３】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。
【０１１４】
本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1
aceE遺伝子 配列番号46）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolipoyltransacetylase, EC:2.3.1.12 aceF遺伝子 配列番号48）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4 lpdA遺伝子 配列番号50）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をPDH活性という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 1982. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。
【０１１５】
E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
= [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine +
CO2
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine = acetyl-CoA + enzyme N6-(d
ihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
+ H+
【０１１６】
酵素活性を低下させるには、具体的には、染色体上のPDHをコードする遺伝子、具体的にはaceE、aceF、及びlpdAの１又は２以上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【０１１７】
本発明においては、相同組換えを利用して、染色体上の遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することによって、細胞内の酵素活性を低下させることが好ましい。しかしながらPDH活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【０１１８】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生する酵素タンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【０１１９】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に酵素をコードする遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、酵素タンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【０１２０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は、前述のRedドリブンインテグレーション法、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステムとを組合わせた方法等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）などによって行うことができる。
上記PDHの活性低下に関する記載は、前述した他の酵素の「活性の低下」、又は他の遺
伝子の「破壊」にも、適用することできる。
【０１２１】
また、本発明の微生物は、嫌気または微好気の条件で培養を行う場合には、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、嫌気または微好気の条件で有機酸またはエタノールを産生しないように改変された微生物であってもよい。ここで有機酸としては、乳酸、ギ酸、酢酸が挙げられる。有機酸またはエタノールを産生しないように改変する方法としては、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を破壊する方法が挙げられる（Verumi, G. N., Eiteman, M. A., and
Altman, E. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28: 325-332; 特開2005-95169）。
【０１２２】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を培地中または菌体内に生成蓄積させ、該培地または菌体よりL-アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法である。
【０１２３】
ここで本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、培地中のエタノールまたは脂肪酸は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１２４】
ここで、本発明において上記流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、
そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【０１２５】
炭素源としては、脱炭酸反応を伴わずにアセチルＣｏＡを産生し得るものが好ましく、具体的には、エタノール、脂肪酸、あるいは、分解により脂肪酸を生じる油脂を含む脂肪酸エステル等が挙げられる。以下、前記炭素源としてエタノール又は脂肪酸を用いる場合について例示する。
【０１２６】
エタノールは、分子式C2H5OHで表される一価のアルコールであり、純粋な物質としても利用されるし、エタノール発酵などで生じた培養液中のエタノール等、エタノールを含む混合物をそのまま用いることも可能である。
【０１２７】
脂肪酸は、一般式CmHnCOOHで表される一価のカルボン酸である。 L-アミノ酸生産能を有する細菌に利用されうるものであれば、どんな鎖長でも構わず、どのような鎖長の脂肪酸をどのような比率で含んでいても構わない。好ましい脂肪酸は、オレイン酸（C17H33COOH）及びパルミチン酸（C15H31COOH）であり、オレイン酸が特に好ましい。オレイン酸は油脂の加水分解でオレイン酸を含む長鎖脂肪酸の混合物を得ることが可能である。本発明に用いられるオレイン酸は、パーム油などの油脂の加水分解物として得ることが可能で、動物油、植物油、廃食油やその他の混合油脂や、チョコレート等の脂肪分を含む食品から抽出されたもののいずれを用いてもよい。また、脂肪酸は、遊離の酸として利用可能であるが、ナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩あるいは、アンモニウム塩として用いることも可能である。
【０１２８】
本発明の方法で使用する培地に含まれるエタノール又は脂肪酸の量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、２０w/v%以下、好ましくは１０w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含むことが好ましい。また、エタノールまたは脂肪酸は培地中に炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１２９】
また、流加培地として使用する場合は、エタノール又は脂肪酸を単独の炭素源として添加する場合、培地中に１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下含むことが好ましく、０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含むことが好ましい。
【０１３０】
なお、エタノールの濃度は、様々な方法で測定することが可能であるが、酵素法による測定が、簡便かつ一般的である（Swift, R. 2003. Addiction 98: 73-80）。脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィやHPLCなどの一般的な方法で測定することが可能である（TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21: 686-697; Lin, J. T., Snyder, L. R., and McKeon, T. A. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）。
【０１３１】
さらに本発明の培地には、エタノールと脂肪酸を混合して添加してもよい。エタノールと脂肪酸の添加濃度は、本発明の方法に使用する細菌がこれらの脂肪酸を炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中にエタノールと脂肪酸の混合物のみを炭素源として添加する場合、あわせて２０w/v%以下、好ましくは１０w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、エタノールと脂肪酸の混合物は、培地中に本発明に使用する細菌が炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、培地中にエタノールと脂肪酸の混合物のみを炭素源として添加する場合、オレイン酸とあわせて０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１３２】
また、エタノールと脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度であればいずれでもかまわないが、エタノール１に対して脂肪酸を２以下、好ましくは１．５以下、特に好ましくは１以下程度の割合で混合する。下限は、脂肪酸を混合していればいずれでもよいが、エタノール１に対して、０．０５以上、望ましくは０．１以上混合していることが好ましい。
。
【０１３３】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、エタノールもしくは脂肪酸、またはエタノールと脂肪酸の両方に加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセロールなどの多価アルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。特にグルコース、スクロース、フルクトース、グリセロールが好ましい。グリセロールとしてバイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールを使用することもできる。炭素源は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中のエタノールもしくは脂肪酸、またはエタノールと脂肪酸の混合物の比率は１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であることが好ましい。
【０１３４】
なお、本発明において、エタノールあるいは脂肪酸は、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間エタノール又は脂肪酸が不足している期間があって
もよい。一時的とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％、２０％、最大で３０％の時間で脂肪酸が不足していてもよい。
【０１３５】
培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【０１３６】
本発明の培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他にリン酸源、硫黄源を含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１３７】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１３８】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１３９】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【０１４０】
目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正とな
るように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。
【０１４１】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、イオン交換樹脂法及び沈殿法や、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【０１４２】
本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【０１４３】
本発明において、流加培養、あるいは連続培養を行う際には、一時的にエタノールあるいは脂肪酸またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【０１４４】
流加培養に用いられる流加培地は、エタノールまたは脂肪酸とその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。ここで一定濃度以下とは、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下になるように添加する培地を調製することを意味する。
【０１４５】
その他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、グリセロールが好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【０１４６】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ−アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【０１４７】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ−アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【０１４８】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【０１４９】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜き開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。。
【実施例】
【０１５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１５１】
〔実施例１〕＜エシェリヒア・コリ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）変異株の構築＞
エシェリヒア・コリが、好気的にエタノールを資化出来るようにアルコールデヒドロゲナーゼAdhEの変異体の取得を行った。エシェリヒア・コリ由来の野生型AdhE遺伝子（adhe）の塩基配列とコードされるアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２１と配列番号２２に示した。
【０１５２】
＜１−１＞エシェリヒア・コリMG1655::PL-tacadhE株の構築
エシェリヒア・コリadhE遺伝子のプロモーター領域のPL-tacプロモーターによる置換は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって実施した。
【０１５３】
本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3'側にそれぞれデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子組み換え株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子組み換え株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【０１５４】
PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子をコードするcat遺伝子を含む断片を国際特許出願WO2006/043730記載のエシェリヒア・コリMG1655PL-tacxylE株のゲノムを鋳型として、配列番号２３と配列番号２４に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。配列番号２３のプライマーはadhE遺伝子の上流領域に相補的な配列を含み、配列番号２４のプライマーはadhE遺伝子の5'領域に相補的な配列を含んでいる。
【０１５５】
PL-tacプロモーターの配列を配列番号２５に示した。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaq DNA polymerase (Fermentas社)を用いた。得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。この断片を温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。
【０１５６】
2%エタノールを含むM9プレート培地（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, New York）上に生育してきた約100クローンから、さらに2%エタノールを含むM9プレート培地上で36時間以内に生育してきた株のCmR遺伝子とプロモーター領域の配列を調べるため、配列番号２６と配列番号２７に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。adhE遺伝子のプロモーター領域にCmR遺伝子を含んでいることが確認されたクローンの一つから、温度感受性プラスミドpKD46を37℃で培養することにより除去して、MG1655::PL-tacadhE株を得た。
【０１５７】
＜１−２＞エシェリヒア・コリMG1655ΔadhE株の構築
エシェリヒア・コリMG1655(ATCC 700926)野生型のadhE遺伝子を、DatsenkoとWannerによって開発された方法により不活性型adhE遺伝子に置き換えた。カナマイシン耐性(KanR)遺伝子をコードするkan遺伝子を含む断片をプラスミドpACYC177 (GenBank/EMBL accession number X06402、Fermentas社)を鋳型として、配列番号２８と配列番号２９に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。配列番号２８のプライマーはadhE遺伝子の318 bp上流の領域に40塩基の相補的な配列を含み、配列番号２９のプライマーはadhE遺伝子の3'側の領域に41塩基の相補的な配列を含んでいる。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaq DNA polymerase (Fermentas社)を用いた。得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。この断片をプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。
【０１５８】
20 μg/mlカナマイシンを含むLBプレート培地（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）上に生育してきたクローンのKmR遺伝子の存在を確認するため、配列番号３０と配列番号３１に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。adhE遺伝子領域にKmR遺伝子を含んでいることが確認されたクローンの一つから、温度感受性プラスミドpKD46を37℃で培養することにより除去して、MG1655ΔadhE株を得た。
【０１５９】
＜１−３＞変異型アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE*）の構築
Glu568Lys (E568K)変異をAdhEに導入するため、adhE遺伝子の塩基配列の1662-1701と1703-1730に相補的で、1702位の塩基にg→aの変異が入った配列番号３２に示したプライマーと、adhE遺伝子の塩基配列の3’末端側領域に相同的な配列番号３３に示したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリMG1655株ゲノムを鋳型としてPCRを行った。PCRにはGene
Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とPyrobest DNA polymerase
(宝酒造)を用いた。得られた1.05 kbpの増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。
【０１６０】
エシェリヒア・コリMG1655::PL-tac adhE株ゲノムを鋳型として、配列番号３４に示したプライマーと変異の導入された1.05 kbpの断片をプライマーとしてPCRを行った。配列番号３４のプライマーは、adhE遺伝子の開始コドンから402-425 bp上流に位置するプライマーである。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaKaRa LA DNA polymerase (宝酒造)を用いた。得られた4.7 kbpの増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。
【０１６１】
野生型のadhE遺伝子領域を変異型adhE遺伝子と組み換えるため、CmR遺伝子とPL-tacプロモーター下流の変異型adhE遺伝子を含む 4.7 kbp断片（cat-PL-tacadhE*）を、DatsenkoとWannerの方法を用いて、MG1655ΔadhE/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。得られたクローンは2%エタノールを唯一の炭素源として含むM9プレート培地上で選抜した。生育してきたクローンのadhE遺伝子の配列を決定したところ、アミノ酸置換を伴う変異としてGlu568Lys (gag-aag)、Ile554Ser (atc-agc)、Glu22Gly (gaa-gga)、Met236
Val (atg-gtg)、Tyr461Cys (tac-tgc)、及びAla786Val (gca-gta)が同定され、本クローンをMG1655::PL-tacadhE*株と名付けた。
【０１６２】
エシェリヒア・コリMG1655::PL-tacadhE*株をドナーとして、P1vir ファージをMG1655Δtdh rhtA*株に感染させるP1トランスダクション(Miller, J.H. (1972) Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)により、MG1655Δtdh rhtA* PL-tacadhE*株を得た。MG1655Δtdh, rhtA*株は、MG1655株より、DatsenkoとWannerの方法により、スレオニンデヒドロゲナーゼをコードするtdh遺伝子が破壊され、rhtA遺伝子に最小培地中で高濃度のスレオニンに対する耐性を付与するrhtA23変異（Livshits, V. A., Zakataeva, N. P., Aleshin, V. V., Vitushkina, M. V. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135）が導入された株である。
【０１６３】
＜１−４＞エシェリヒア・コリWC196Δmez株由来アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）変異株の構築
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655Δtdh rhtA adhE*をドナーとして国際特許公報WO2005/010175に記載のL-リジン生産菌WC196Δmez/pCABD2株にP1トランスダクションを行い、WC196Δmez adhE*/pCABD2株を得た。pCABD2は、米国特許No. 6,040,160に記載のL-リジンによるフィードバック阻害耐性であるdapA*遺伝子、L-リジンによるフィードバック阻害耐性であるlysC*遺伝子、dapB遺伝子、及びddh遺伝子を搭載したプラスミドである。
【０１６４】
〔実施例２〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
【０１６５】
＜２−１＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムは、至適生育温度が48℃の中高温性独立栄養細菌であり、クロロビウム・テピダムTLS株のゲノム配列がEisenらによって明らかにされている（Eisen, J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9509-9514）。この菌株からピルビン酸シンターゼ遺伝子を単離し、発現するプラスミドを構築した。
【０１６６】
＜２−２＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現発現株のピルビン酸シンターゼ活性の測定
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号３５、３６に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をSacIで切断し、pSTV28（タカラバイオ社製）のSacI部位に挿入してプラスミドを構築し、pSTV-PSと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸シンターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pSTV-PSからピルビン酸シンターゼ遺伝子をSacIで切り出してpMW-PthrのSacI部位に挿入し、ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PSを構築した。pMW-PthrはベクターpMW219（ニッポンジーン社製）のHindIIIサイトとXbaIサイトの間にエシェリヒア・コリK-12株のスレオニンオペロン（thrABC）のプロモーター領域（Pthr）を有しており、このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子発現が可能なプラスミドである。用いたスレオニンオペロンのプロモーター配列を配列番号３７に示した。
【０１６７】
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-PS、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PS、 対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/
pMW-Pthrと名付けた。
【０１６８】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、50mM HEPES緩衝液（pH 8.0）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機で破砕し、15000rpmで15分間遠心した後、得られた上清を粗酵素液とした。
粗酵素液中のタンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）を用いて測定し、250μg総タンパク質分の粗酵素液を活性測定に供した。
【０１６９】
活性測定は、以下のようにして行った。下記の反応溶液2mlに粗酵素液を加えて反応を行った。まず基質となるピルビン酸以外を全て含んだ反応溶液を分光測定用セルに加え、ゴム栓とアルミキャップを用いてセルを密閉した。シリンジを用いてアルゴンガスを5分間セルの中に吹き込みセル内の酸素濃度を低下させた後に、セルを分光光度計（日立社製U-3210 Spectrophotometer）にセットし、シリンジを用いてピルビン酸溶液を添加して反応を開始した。37℃で30分反応を行い、経時的に578nmの吸光度を測定することにより、還元型メチルビオロゲンの量の変化をみた。結果を表１に示す。表中、比活性の単位はU/mg proteinである。1Uは１分間当たり１nmolのメチルビオロゲンを還元する活性と定義した。
【０１７０】
〔反応液〕
MgCl2 1mM
Dithiothreitol 1mM
メチルビオロゲン 5mM
CoA 0.25mM
ピルピン酸 10mM (測定開始直前に添加)
HEPES (pH8.0) 50mM
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
〔実施例３〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
ピルビン酸シンターゼ活性に必要な補酵素再生系として、エシェリヒア・コリ由来のフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子とエシェリヒア・コリ由来のフェレドキシン遺伝子を用いて、これらの遺伝子とピルビン酸シンターゼ遺伝子の３つの遺伝子を同時に発現するプラスミドを構築した。エシェリヒア・コリのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子としてはfpr遺伝子、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子としてはfdx遺伝子を用いた。
【０１７３】
＜３−１＞エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号４２、４３に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をSmaIで切断し、pMW-PthrのSmaI部位に挿入し、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プラスミドを構築し、pMW-Pthr-fprと名付
けた。
【０１７４】
＜３−３＞エシェリヒア・コリ由来フェレドキシンfdx遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号４４、４５に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フェレドキシンfdx遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMW-PthrのEcoRI部位に挿入し、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドpMW-Pthr-fdxを構築した。
【０１７５】
＜３−４＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMW-Pthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMW-Pthr-fdxをSmaIで処理したものと連結してpMW-Pthr-fpr-fdxを得た。次にpMW-Pthr-PSをSacIで切断し、得られたPS遺伝子断片を、pMW-Pthr-fpr-fdxをSacIで処理したものと連結して、クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子発現増強プラスミドpMW Pthr-fpr-PS-fdxを構築した。
【０１７６】
上記の各プラスミドにおいて、クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子はPthrによって、他の遺伝子もPthrからのリードスルーによって転写される。
【０１７７】
〔実施例４〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０１７８】
＜４−１＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez 株への導入
WC196Δmez/pCABD2に、pMW-Pthr-fpr-PS-fdx、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現株を、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdx、対照株をWC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１７９】
＜４−２＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez/pCABD2/pMW Pthr、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdxの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩前培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のオレイン酸培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に72時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液中の生菌数についても計測した。２連の培養の平均値を表２に示す。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０１８０】
〔オレイン酸培地組成〕
オレイン酸ナトリウム 20g/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０１８１】
【表２】
【０１８２】
〔実施例５〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに見いだされているピルビン酸シンターゼ遺伝子と相同性を有するydbK遺伝子の発現プラスミドを構築し、活性を測定した。
【０１８３】
＜５−１＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３８、３９に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をKpnIで切断し、pSTV28（タカラバイオ社製）のKpnI部位に挿入してプラスミドを構築し、pSTV-ydbKと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸シンターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pSTV-ydbKからピルビン酸シンターゼ遺伝子をKpnIで切り出してpMW-PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-ydbKを構築した。
【０１８４】
＜５−２＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株のピルビン酸シンターゼ活性の測定
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-ydbK、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-ydbK、対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１８５】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、実施例２に記載のクロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株の活性測定法と同じ方法で、活性を測定した。結果を表３に示す。対照株WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrではピルビン酸シンターゼの活性は確認されなかったが、エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-ydbKでは8.0U/mgの活性が確認された。結果を表３に示す。比活性の単位は表１と同様である。
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
〔実施例６〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
実施例３に記載のエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子を含むプラスミドpMW-Pthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子を含むプラスミドpMW-Pthr-fdxをSmaIで処理したものと連結してpMW-Pthr-fpr-fdxを得た。次にpMW-Pthr-ydbKをKpnIで切断し、得られたydbK遺伝子断片を、pMW-Pthr-fpr-fdxをKpnIで処理したものと連結して、エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子発現増強プラスミドpMW-Pthr-fpr-ydbK-fdxを構築した。
【０１８８】
〔実施例７〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０１８９】
＜７−１＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez adhE*株への導入
WC196Δmez adhE*/pCABD2に、pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、対照株をWC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１９０】
＜７−２＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdxの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩、培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のエタノール培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に96時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンと残存エタノールをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液の濁度についても測定した。２連の培養の平均値を表４に示す。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０１９１】
〔エタノール培地組成〕
エタノール 20ml/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
〔実施例８〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
ユーグレナ・グラシリスは至適生育27℃の光合成原生生物である。これよりピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ遺伝子を単離し、本遺伝子を発現するプラスミドを構築した。
【０１９４】
＜８−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
ユーグレナ・グラシリスの染色体を鋳型として、配列番号４０、４１に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片KpnIで切断し、pUC19（タカラバイオ社製）のKpnI部位に挿入してプラスミドを構築し、pUC-PNOと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pUC-PNOからピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをKpnIで切り出してpMW-PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PNOを構築した。
【０１９５】
＜８−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ発現の確認
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW Pthrと名付けた。
【０１９６】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。培養液1mlを20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地20mlに接種し、37℃で5時間振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、1mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波破砕機で破砕し、15000rpmで15分間遠心した後、得られた上清を粗抽出液とした。粗抽出液中のタンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）を用いて測定し、10μgのタンパク質を含む粗抽出液をサンプル調製に供した。サンプル調製は、粗抽出液にNuPAGE LDS サンプルバッファー（インビトロジェン社製）の濃度が1.1倍になるように加えた後、NuPAGE
サンプルリデューシングエイジェント(インビトロジェン社製)を終濃度10％となるように加え、70℃で10分間加熱処理することで行った。調整したサンプルをNuPAGE Tris-Acetate ゲル3-8％（インビトロジェン社製）を用いて電気泳動した。マーカーとしてMagicMark
XP Western Protein Standard（インビトロジェン社製）を使用した。
【０１９７】
電気泳動後のゲルをiBlot Gel Transfer Device（インビトロジェン社製）を用いてメンブレンに転写した。転写後のブロッキングから検出までの操作はWesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit（インビトロジェン社製）を用いて行った。まずメンブレンを30分間ブロッキング処理した後、純水で2回洗浄し、1000倍希釈した抗PNO血清溶液中にて１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄液で3回洗浄し、二次抗体溶液中にて30分インキュベートした。メンブレンを洗浄液で3回洗浄し、さらに純水で2回洗浄した後、検出試薬をかけ、ルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム社製）にて検出した。結果を図１に示す。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNO株では200kD付近にPNOと推定されるバンドが検出された。一方、対照株のWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr株ではそのようなバンドは検出されなかった。
【０１９８】
〔実施例９〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築＞
実施例８に記載のユーグレナ・グラシリス由来のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片を含むプラスミドpUC-PNOから、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片をKpnIで切り出してpMW PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PNOを構築した。
【０１９９】
〔実施例１０〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０２００】
＜１０−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez 株への導入
WC196Δmez/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０２０１】
＜１０−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNOの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩、培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のオレイン酸培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に72時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液中の生菌数についても計測した。２連の培養の平均値を表５に示す。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０２０２】
〔オレイン酸培地組成〕
オレイン酸ナトリウム 20g/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０２０３】
【表５】
【０２０４】
〔実施例１１〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
＜１１−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅用プラスミドのWC196Δmez adhE*株への導入
WC196Δmez adhE*/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０２０５】
＜１１−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr 、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNOの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩前培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のエタノール培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に96時間培養した。培養96時間目に1mlをサンプリングし、培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液の濁度についても測定した。２連の培養の平均値を表６に示す。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０２０６】
〔エタノール培地組成〕
エタノール 20ml/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０２０７】
【表６】
【０２０８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. tepidumピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号３：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子(ydbK)の塩基配列
配列番号４：E. coliピルビン酸シンターゼ(YdbK)のアミノ酸配列
配列番号５：E. gracilis ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号６：E. gracilis ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼのアミノ酸配列
配列番号７：E. coli フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)の塩基配列
配列番号８：E. coli フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)がコードするアミノ酸配列
配列番号９：E. coli フェレドキシン遺伝子(fdx)の塩基配列
配列番号10：E. coli フェレドキシン遺伝子(fdx)がコードするアミノ酸配列
配列番号11：E. coli フェレドキシン遺伝子(yfhL)の塩基配列
配列番号12：E. coli フェレドキシン遺伝子(yhfL)がコードするアミノ酸配列
配列番号13：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldA)の塩基配列
配列番号14：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldA)がコードするアミノ酸配列
配列番号15：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldB)の塩基配列
配列番号16：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldB)がコードするアミノ酸配列
配列番号17：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号18：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号19：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子の塩基配列
配列番号20：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号21：E. coliアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)の塩基配列
配列番号22：E. coliアルコールデヒドロゲナーゼ(AdhE)のアミノ酸配列
配列番号23：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー１
配列番号24：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー2
配列番号25：PL-tacプロモーターの塩基配列
配列番号26：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー3
配列番号27：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー4
配列番号28：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー１
配列番号29：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー2
配列番号30：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー3
配列番号31：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー4
配列番号32：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号33：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号34：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー３
配列番号35：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号36：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号37：スレオニンオペロンプロモーター配列
配列番号38：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号39：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号40：E. gracilisピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号41：E. gracilisピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号42：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー１配列番号43：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー２配列番号44：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー１
配列番号45：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー２
配列番号46：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニット遺伝子（aceE）の塩基配列
配列番号47：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニットのアミノ酸配列
配列番号48：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニット遺伝子（aceF）の塩基配列
配列番号49：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニットのアミノ酸配列
配列番号50：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニット遺伝子（lpdA）の塩基配列
配列番号51：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニットのアミノ酸配列
配列番号52：E. coliリンゴ酸酵素をコードする遺伝子（sfcA ）の塩基配列
配列番号53：E. coli sfcA遺伝子がコードするリンゴ酸酵素のアミノ酸配列
配列番号54：E. coliリンゴ酸酵素をコードする遺伝子（b2463）の塩基配列
配列番号55：E. coli b2463遺伝子がコードするリンゴ酸酵素のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ（PNO）遺伝子の発現を示すウェスタンブロットの写真。レーン１:マーカーレーン２:WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrからの粗酵素抽出液レーン３:WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNOからの粗酵素抽出液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸系を生産する微生物及びＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン及びＬ−トリプトファンは飼料添加物等として広く用いられている。また、Ｌ−フェニルアラニンは、甘味料の原料として使用されている。Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−イソロイシンは、アミノ酸輸液やサプリメントに利用される。また、Ｌ−セリンは食品添加物や化粧品の原料などとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００３】
近年は、目的物質の発酵生産に組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強することによって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００４】
上記のような技術として、例えばＬ−リジンでは、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素をコードする遺伝子の発現増強（特許文献１）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（特許文献２）、及び、リンゴ酸酵素（特許文献３）の活性低下、等が知られている。
【０００５】
Ｌ−トリプトファンでは、フォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼ、アントラニレートシンターゼのフィードバック阻害の解除（特許文献４）、トリプトファナーゼの欠損（特許文献５）等が知られている。
【０００６】
Ｌ−フェニルアラニンでは、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼのフィードバック阻害の解除 (特許文献６）、及び、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーの欠損(特許文献７）等が知られている。
【０００７】
Ｌ−バリンでは、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H＋-ATPaseを欠失している変異株（特許文献８）等が、Ｌ−ロイシンではイソプロピルマレートシンターゼのフィードバック阻害の解除（特許文献９）等が、Ｌ−イソロイシンでは、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子等の発現強化（特許文献１０）等が知られている。
【０００８】
Ｌ−セリンでは、セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼを保持する菌株（特許文献１１）、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強された型細菌、さらにＬ−セリン分解能を欠失した細菌（特許文献１２）、及び、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有する細菌（特許文献１３）等が知られている。
【特許文献１】米国特許第6,040,160号
【特許文献２】米国特許第5,827,698号
【特許文献３】WO2005/010175
【特許文献４】米国特許第6,180,373号
【特許文献５】米国特許第4,371,614号
【特許文献６】米国特許第5,354,672号
【特許文献７】WO03/044191
【特許文献８】米国特許第5,888,783号
【特許文献９】米国特許第6,403,342号
【特許文献１０】米国特許第5,998,178号
【特許文献１１】米国特許第5,618,716号
【特許文献１２】米国特許第6,037,154号
【特許文献１３】米国特許第6,258,573号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来のＬ−アミノ酸生産は、主として糖質を炭素源として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによりアセチルＣｏＡをＴＣＡサイクルに供給することで成立している。しかし、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの反応は脱炭酸を伴うため、必ず１分子のCO2が放出される。従って、さらに生産性を上昇させるためには、この脱炭酸を減少することが必要であると本発明者は考えた。そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、エタノールや脂肪酸などのアセチルＣｏＡを供給する物質を炭素源として、炭酸固定反応を触媒する酵素であるピルビン酸シンターゼ、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの酵素活性を上昇させることにより、さらには、ピルビン酸シンターゼの酵素活性に必要な還元型フェレドキシン又は還元型フラボドキシンをそれぞれの酸化型から生成する活性を有するフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの酵素活性を強化すること、あるいはフェレドキシン又はフラボドキシン産生能を向上させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物。
（２）ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（３）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（４）ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、前記微生物。
（５）ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、前記微生物。
（６）ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すポリペプチドをコードする、前記微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（７）ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む、前記微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（８）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードする、前記微生物：
（Ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号６において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
（９）ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、前記微生物：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（１１）フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、前記微生物。
（１２）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、前記微生物。
（１３）好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記微生物。
（１４）微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、前記微生物。
（１５）微生物が、コリネ型細菌である前記微生物。
（１６）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１７）前記培地が、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含有することを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく発酵生産することができる。また、本発明の方法は、好ましい形態においては、脱炭酸を抑制し、炭酸固定反応を利用することで、炭酸ガスの排出が低減できる、環境に配慮した方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物である。
【００１４】
本発明において「Ｌ−アミノ酸」とは、特記しない限り前記Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンを意味する。
【００１５】
「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。本発明の微生物が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸であってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−アミノ酸生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよい。
【００１６】
また、「ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大する」とは、もともとピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼを有している微生物において、これらの少なくとも一方の酵素の活性が増大すること、及び、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼを有していない微生物にこれらの少なくとも一方の酵素の活性を付与することの両方を含む。
【００１７】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、又はこれらの両方の活性が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、またはピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物を親株とし、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強することによって得ることができる。
【００１８】
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１９】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００２０】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW31
10株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００２１】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997, 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００２２】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００２３】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２４】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２５】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２６】
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００２７】
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能
を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２９】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
【００３０】
本発明に用いる細菌は、エタノールの資化性を有する細菌であってもよい。このような細菌としては、元来エタノールの資化性を有する細菌、エタノールの資化性を付与された組換え株、又はエタノールの資化性が高まった変異株でもよい。エシェリヒア・コリにおいては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアルコールデヒドロゲナーゼの活性を有するAdhEの存在が知られている。
アセチル-CoA + NADH + H+ = アセトアルデヒド + NAD+ + ＣｏＡ
アセトアルデヒド + NADH + H+ = エタノール + NAD+
【００３１】
エシェリヒア・コリは好気条件ではエタノールは資化できないが、AdhEの変異によって、好気的にエタノールを資化出来るようになることが知られている（Clark D. P., and C
ronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。このような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された（Glu568Lys、E568K）がある。
【００３２】
さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばフェニルアラニン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。
【００３３】
コリネバクテリウム・グルタミカムは、複数のアルコールデヒドロゲナーゼを有しており、好気的にエタノールを資化できることが知られている（Pelechova J, Smekal F, Koura V, Plachy J, and Krumphanzl V. 1980. Folia Microbiol (Praha) 25: 341-346）。
【００３４】
本発明に用いる細菌は、油脂又は脂肪酸の資化性を有する細菌であってもよい。このような細菌としては、元来油脂もしくは脂肪酸の資化性を有する細菌、油脂もしくは脂肪酸の資化性を付与された組換え株、又は油脂もしくは脂肪酸の資化性が高まった変異株でもよい。エシェリヒア・コリにおいては、鎖長12以上の長鎖の脂肪酸を資化できることが知られている（Clark, D. P. and Cronan, J. E. 1996. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition (Neidhardt, F. C. Ed.) pp. 343-357）。さらに、中鎖や短鎖の脂肪酸を利用できるようになったエシェリヒア・コリの変異株が知られている（Nunn, W. D. et al. 1979. J. Biol. Chem. 254: 9130-9134; Salanitro, J. P. and Wegener, W. S. 1971. J. Bacteriol. 108: 885-892）。
【００３５】
本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地から回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量で培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンを含む。特に、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファンが好ましい。
【００３６】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００３７】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３８】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株
を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３９】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００４０】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはＬ−アミノ酸生産菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。Ｌ−アミノ酸生産菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００４１】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００４２】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００４３】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００４４】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００４５】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００４６】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196Δmez/pCABD2（WO2005/010175）やWC196ΔcadAΔldc/pCABD2（WO2006/078039）等が挙げられる。WC196Δmez/pCABD2株は、リンゴ酸酵素（マリックエンザイム）をコードするsfcA及びb2463遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。sfcA遺伝子及びb2463遺伝子の塩基配列、及び各遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号５２〜５５に示す。
【００４７】
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。このプラスミドを持つエシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2は、AJ12604と命名され、1991年1月28日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-11975の受託番号で寄託され、1991年9月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で寄託されている。
【００４８】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレート
シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００４９】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００５０】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００５１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E.
coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli
K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００５２】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926、米国特許第5,888,783号)を親株として用いることができる。
【００５３】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００５５】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００５６】
Ｌ−セリン生産菌
Ｌ−セリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、セリンによるフィード
バック阻害が減少した３−ホスフォグリセレートデヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア・コリ（特許2584409号、米国特許第5,618,716号）が挙げられる。また、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強されたコリネ型細菌、さらにＬ−セリン分解能を欠失したコリネ型細菌（特開平11-253187号、米国特許第6,037,154号）、及び、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌（特開平11-266881号、米国特許第6,258,573号）も使用できる。
【００５７】
遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「保存的変異」については、後述のピルビン酸シンターゼ等に関する記載が、上記遺伝子にも適用される。
【００５８】
＜１−２＞ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物を、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変した微生物である。ピルビン酸シンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が増大するように改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、前記したように、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。
【００５９】
先にピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの酵素活性を高めるように細菌の改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与してもよい。なお、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強は、前記したような、遺伝子の発現を増強する方法によって行うことができる。すなわち、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる、内因性ピルビン酸シンターゼ遺伝子、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の発現増強によるものであってもよいし、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドの細菌への導入、またはこれらの遺伝子の細菌染色体への導入などによる外因性ピルビン酸シンターゼ遺伝子の発現増強であってもよい。
【００６０】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００６１】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 = 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 + ＣｏＡ
【００６２】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S., Ishii, M., Kodama, T., and Igarashi, Y. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、実施例に記載したように、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００６３】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のピルビン酸シンターゼ遺伝子、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼ遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌の遺伝子を利用することが可能である。
【００６４】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T., Ochiai, T., Morita, S., Nishiyama, A., Yamada, E., Arai, H., Ishii, M. and Igarashi, Y. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００６５】
エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1435284〜1438808に位置する、配列番号３に示す塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、
すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。配列番号４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。実施例に示したように、この遺伝子産物がピルビン酸シンターゼ活性を有し、同遺伝子の発現強化により、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することが実証された。
【００６６】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【００６７】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 = ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【００６８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H., Ono, K., Miyatake, K., Nakano, Y., and Kitaoka, S. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H., Ono, K., Miyatake, K., Nakano, Y., and Kitaoka, S. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C., Stejskal, F., Zhu, G., Keithly, J. S., and Martin, W. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。失活などの理由により活性が測定できない場合には、実施例に記載したように、ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現を確認することが可能である。
【００６９】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M., Inui, H., Yamaji, R., Yamamoto, T., Takenaka, S., Ueda, M., Nakano, Y., and Miyatake, K. 2000. FEBS Lett. 479: 155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C., Stejskal, F., Zhu,
G., Keithly, J. S., and Martin, W. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V., Ault, J. G., Stejskal, F., and Keithly, J. S.
2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【００７０】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子として、配列番号５に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる（GenBank Accession No. AB021127）。配列番号６には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. BAB12024）。
【００７１】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００７２】
「フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【００７３】
還元型フェレドキシン + NADP+ = 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００７４】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A., Arakaki, A. K., Cortez, N., and Carrillo, N. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【００７５】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P., Neuer, G., Ludwig-Festl, M., and Knappe, J. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００７６】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ−アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V., Reichard, P., Eliasson, R., Pontis, E., Krook
, M., Jornvall, H., and Haggard-Ljungquist, E. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ−プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H., Yamaguchi, E., Matsunaga, K., Aramaki, H., and Horiuchi, T. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）。
【００７７】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。配列番号８にはFprのアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No.
BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【００７８】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００７９】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J., Sabri, M., Marshall, K. R., Lawson, R. J., Lewis, D. G., Clift, D., Balding, P. R., Dunford, A. J., Warman, A. J., McVey, J. P., Quinn, A. M., Sutcliffe, M. J., Scrutton, N. S., and Munro, A. W. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００８０】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００８１】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００８２】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウ
ェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００８３】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E., Wang, C. W., and Swartz, J. R. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【００８４】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、ピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C., Chen, L. M., and Matthews, R. G. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S., Bobst, C., Hemann, C. F., Hille, R., and Tabita, F. R. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのフェレドキシン遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシンあるいはフラボドキシンを用いることもできる。
【００８５】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号９に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号１１に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号１０及び配列番号１２には、Fdx及びYfhLのアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC75578及びAAC75615）。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号１３に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号１５に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号１４及び配列番号１６には、fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。
【００８６】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置する配列番号１７に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号１９に示すフェレドキシンII遺伝子を例示すること
ができる。配列番号１８及び配列番号２０には、フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIがコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示す
ることができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであって
もよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００８７】
これらのピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、フラボドキシンをコードする遺伝子（以後、総称して、本発明の遺伝子という）は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列、又は野生型のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００８８】
上記置換は、機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である
【００８９】
より具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００９０】
また、それぞれ本発明の遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様に本発明の遺伝子は、機能を有する限り、コードされるタンパク質のＮ末端側、及び／又は、C末端側が延長又は、削られていてもよい。例えば延長する長さは、
アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
【００９１】
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては本発明の遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードしているかどうかは、例えば、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する微生物に導入し、各タンパク質の活性を測定することによって確認できる。
【００９２】
本発明の遺伝子は、上述の塩基配列を有するDNA、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードするDNAであってもよい。
【００９３】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70％以上、好ましくは80％以上、より好ましく90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
【００９４】
プローブは、本発明の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【００９５】
上記の保存的バリアントに関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与について記載した酵素及び遺伝子にも適用される。
【００９６】
上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ−アミノ酸生産能の付与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。
【００９７】
例えば、クロロビウム・テピダムのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３５、３６に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法（polymerase chain react
ion）法（White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得することができる。
エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３８、３９に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【００９８】
ユーグレナ・グラシリスのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子は、配列番号５に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４０、４１に示すプライマーを用いて、ユーグレナ・グラシリスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【００９９】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子は、配列番号７の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４２、４３に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１００】
エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子fdxは、配列番号９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４４、４５に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１０１】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子fldAは、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フラボドキシン遺伝子fldBは、配列番号１５の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１０２】
また、クロロビウム・テピダムのフェレドキシンＩ遺伝子は、配列番号１７の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フェレドキシンII遺伝子は、配列番号１９の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１０３】
他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【０１０４】
本発明の遺伝子、及びＬ−アミノ酸生合成系遺伝子の発現の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによって本発明の遺伝子のコピー数を高めたり、本発明の遺伝子の発現調節配列を改変したりすることによって達成することができる。また、本発明の遺伝子の発現の増強は、本発明の遺伝子の発現を上昇させるようなアクチベーターを増幅させるか、及び／又は、本発明の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。
以下に、遺伝子の発現を増強する方法について説明する。
【０１０５】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【０１０６】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.
Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【０１０７】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１０８】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１０９】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldst
einとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【０１１０】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F.
J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【０１１１】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【０１１２】
ピルビン酸シンターゼが複数のサブユニットからなる場合は、各々のサブユニットをコードする遺伝子の発現は、別個に増強してもよく、ポリシストロンとして同時に増強してもよい。また、遺伝子をベクターを用いて微生物に導入する場合、各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクター分子に同時に担持させてもよく、異なるベクター分子に別個に担持させてもよい。また、遺伝子を染色体に挿入する場合も、各サブユニットをコードする遺伝子は、染色体上の同一部位に同時に挿入してもよく、異なる位置に別個に挿入してもよい。
【０１１３】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。
【０１１４】
本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1
aceE遺伝子 配列番号46）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolipoyltransacetylase, EC:2.3.1.12 aceF遺伝子 配列番号48）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4 lpdA遺伝子 配列番号50）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をPDH活性という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 1982. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。
【０１１５】
E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
= [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine +
CO2
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine = acetyl-CoA + enzyme N6-(d
ihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
+ H+
【０１１６】
酵素活性を低下させるには、具体的には、染色体上のPDHをコードする遺伝子、具体的にはaceE、aceF、及びlpdAの１又は２以上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【０１１７】
本発明においては、相同組換えを利用して、染色体上の遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することによって、細胞内の酵素活性を低下させることが好ましい。しかしながらPDH活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【０１１８】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生する酵素タンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【０１１９】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に酵素をコードする遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、酵素タンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【０１２０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は、前述のRedドリブンインテグレーション法、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステムとを組合わせた方法等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）などによって行うことができる。
上記PDHの活性低下に関する記載は、前述した他の酵素の「活性の低下」、又は他の遺
伝子の「破壊」にも、適用することできる。
【０１２１】
また、本発明の微生物は、嫌気または微好気の条件で培養を行う場合には、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、嫌気または微好気の条件で有機酸またはエタノールを産生しないように改変された微生物であってもよい。ここで有機酸としては、乳酸、ギ酸、酢酸が挙げられる。有機酸またはエタノールを産生しないように改変する方法としては、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を破壊する方法が挙げられる（Verumi, G. N., Eiteman, M. A., and
Altman, E. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28: 325-332; 特開2005-95169）。
【０１２２】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を培地中または菌体内に生成蓄積させ、該培地または菌体よりL-アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法である。
【０１２３】
ここで本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、培地中のエタノールまたは脂肪酸は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１２４】
ここで、本発明において上記流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、
そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【０１２５】
炭素源としては、脱炭酸反応を伴わずにアセチルＣｏＡを産生し得るものが好ましく、具体的には、エタノール、脂肪酸、あるいは、分解により脂肪酸を生じる油脂を含む脂肪酸エステル等が挙げられる。以下、前記炭素源としてエタノール又は脂肪酸を用いる場合について例示する。
【０１２６】
エタノールは、分子式C2H5OHで表される一価のアルコールであり、純粋な物質としても利用されるし、エタノール発酵などで生じた培養液中のエタノール等、エタノールを含む混合物をそのまま用いることも可能である。
【０１２７】
脂肪酸は、一般式CmHnCOOHで表される一価のカルボン酸である。 L-アミノ酸生産能を有する細菌に利用されうるものであれば、どんな鎖長でも構わず、どのような鎖長の脂肪酸をどのような比率で含んでいても構わない。好ましい脂肪酸は、オレイン酸（C17H33COOH）及びパルミチン酸（C15H31COOH）であり、オレイン酸が特に好ましい。オレイン酸は油脂の加水分解でオレイン酸を含む長鎖脂肪酸の混合物を得ることが可能である。本発明に用いられるオレイン酸は、パーム油などの油脂の加水分解物として得ることが可能で、動物油、植物油、廃食油やその他の混合油脂や、チョコレート等の脂肪分を含む食品から抽出されたもののいずれを用いてもよい。また、脂肪酸は、遊離の酸として利用可能であるが、ナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩あるいは、アンモニウム塩として用いることも可能である。
【０１２８】
本発明の方法で使用する培地に含まれるエタノール又は脂肪酸の量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、２０w/v%以下、好ましくは１０w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含むことが好ましい。また、エタノールまたは脂肪酸は培地中に炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１２９】
また、流加培地として使用する場合は、エタノール又は脂肪酸を単独の炭素源として添加する場合、培地中に１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下含むことが好ましく、０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含むことが好ましい。
【０１３０】
なお、エタノールの濃度は、様々な方法で測定することが可能であるが、酵素法による測定が、簡便かつ一般的である（Swift, R. 2003. Addiction 98: 73-80）。脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィやHPLCなどの一般的な方法で測定することが可能である（TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21: 686-697; Lin, J. T., Snyder, L. R., and McKeon, T. A. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）。
【０１３１】
さらに本発明の培地には、エタノールと脂肪酸を混合して添加してもよい。エタノールと脂肪酸の添加濃度は、本発明の方法に使用する細菌がこれらの脂肪酸を炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中にエタノールと脂肪酸の混合物のみを炭素源として添加する場合、あわせて２０w/v%以下、好ましくは１０w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、エタノールと脂肪酸の混合物は、培地中に本発明に使用する細菌が炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、培地中にエタノールと脂肪酸の混合物のみを炭素源として添加する場合、オレイン酸とあわせて０．００１w/v%以上、好ましくは０．０５w/v%以上、さらに好ましくは０．１w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１３２】
また、エタノールと脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度であればいずれでもかまわないが、エタノール１に対して脂肪酸を２以下、好ましくは１．５以下、特に好ましくは１以下程度の割合で混合する。下限は、脂肪酸を混合していればいずれでもよいが、エタノール１に対して、０．０５以上、望ましくは０．１以上混合していることが好ましい。
。
【０１３３】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、エタノールもしくは脂肪酸、またはエタノールと脂肪酸の両方に加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセロールなどの多価アルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。特にグルコース、スクロース、フルクトース、グリセロールが好ましい。グリセロールとしてバイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールを使用することもできる。炭素源は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中のエタノールもしくは脂肪酸、またはエタノールと脂肪酸の混合物の比率は１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であることが好ましい。
【０１３４】
なお、本発明において、エタノールあるいは脂肪酸は、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間エタノール又は脂肪酸が不足している期間があって
もよい。一時的とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％、２０％、最大で３０％の時間で脂肪酸が不足していてもよい。
【０１３５】
培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【０１３６】
本発明の培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他にリン酸源、硫黄源を含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１３７】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１３８】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１３９】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【０１４０】
目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正とな
るように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。
【０１４１】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、イオン交換樹脂法及び沈殿法や、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【０１４２】
本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【０１４３】
本発明において、流加培養、あるいは連続培養を行う際には、一時的にエタノールあるいは脂肪酸またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【０１４４】
流加培養に用いられる流加培地は、エタノールまたは脂肪酸とその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。ここで一定濃度以下とは、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下になるように添加する培地を調製することを意味する。
【０１４５】
その他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、グリセロールが好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【０１４６】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ−アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【０１４７】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ−アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【０１４８】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【０１４９】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜き開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。。
【実施例】
【０１５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１５１】
〔実施例１〕＜エシェリヒア・コリ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）変異株の構築＞
エシェリヒア・コリが、好気的にエタノールを資化出来るようにアルコールデヒドロゲナーゼAdhEの変異体の取得を行った。エシェリヒア・コリ由来の野生型AdhE遺伝子（adhe）の塩基配列とコードされるアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２１と配列番号２２に示した。
【０１５２】
＜１−１＞エシェリヒア・コリMG1655::PL-tacadhE株の構築
エシェリヒア・コリadhE遺伝子のプロモーター領域のPL-tacプロモーターによる置換は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって実施した。
【０１５３】
本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3'側にそれぞれデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子組み換え株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子組み換え株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【０１５４】
PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子をコードするcat遺伝子を含む断片を国際特許出願WO2006/043730記載のエシェリヒア・コリMG1655PL-tacxylE株のゲノムを鋳型として、配列番号２３と配列番号２４に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。配列番号２３のプライマーはadhE遺伝子の上流領域に相補的な配列を含み、配列番号２４のプライマーはadhE遺伝子の5'領域に相補的な配列を含んでいる。
【０１５５】
PL-tacプロモーターの配列を配列番号２５に示した。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaq DNA polymerase (Fermentas社)を用いた。得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。この断片を温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。
【０１５６】
2%エタノールを含むM9プレート培地（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, New York）上に生育してきた約100クローンから、さらに2%エタノールを含むM9プレート培地上で36時間以内に生育してきた株のCmR遺伝子とプロモーター領域の配列を調べるため、配列番号２６と配列番号２７に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。adhE遺伝子のプロモーター領域にCmR遺伝子を含んでいることが確認されたクローンの一つから、温度感受性プラスミドpKD46を37℃で培養することにより除去して、MG1655::PL-tacadhE株を得た。
【０１５７】
＜１−２＞エシェリヒア・コリMG1655ΔadhE株の構築
エシェリヒア・コリMG1655(ATCC 700926)野生型のadhE遺伝子を、DatsenkoとWannerによって開発された方法により不活性型adhE遺伝子に置き換えた。カナマイシン耐性(KanR)遺伝子をコードするkan遺伝子を含む断片をプラスミドpACYC177 (GenBank/EMBL accession number X06402、Fermentas社)を鋳型として、配列番号２８と配列番号２９に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。配列番号２８のプライマーはadhE遺伝子の318 bp上流の領域に40塩基の相補的な配列を含み、配列番号２９のプライマーはadhE遺伝子の3'側の領域に41塩基の相補的な配列を含んでいる。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaq DNA polymerase (Fermentas社)を用いた。得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。この断片をプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。
【０１５８】
20 μg/mlカナマイシンを含むLBプレート培地（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）上に生育してきたクローンのKmR遺伝子の存在を確認するため、配列番号３０と配列番号３１に示したプライマーを用いてPCR法による増幅を行った。adhE遺伝子領域にKmR遺伝子を含んでいることが確認されたクローンの一つから、温度感受性プラスミドpKD46を37℃で培養することにより除去して、MG1655ΔadhE株を得た。
【０１５９】
＜１−３＞変異型アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE*）の構築
Glu568Lys (E568K)変異をAdhEに導入するため、adhE遺伝子の塩基配列の1662-1701と1703-1730に相補的で、1702位の塩基にg→aの変異が入った配列番号３２に示したプライマーと、adhE遺伝子の塩基配列の3’末端側領域に相同的な配列番号３３に示したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリMG1655株ゲノムを鋳型としてPCRを行った。PCRにはGene
Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とPyrobest DNA polymerase
(宝酒造)を用いた。得られた1.05 kbpの増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。
【０１６０】
エシェリヒア・コリMG1655::PL-tac adhE株ゲノムを鋳型として、配列番号３４に示したプライマーと変異の導入された1.05 kbpの断片をプライマーとしてPCRを行った。配列番号３４のプライマーは、adhE遺伝子の開始コドンから402-425 bp上流に位置するプライマーである。PCRにはGene Amp PCR System 2700 amplificatory (Applied Biosystems)とTaKaRa LA DNA polymerase (宝酒造)を用いた。得られた4.7 kbpの増幅断片をアガロースゲル電気泳動で精製、回収した。
【０１６１】
野生型のadhE遺伝子領域を変異型adhE遺伝子と組み換えるため、CmR遺伝子とPL-tacプロモーター下流の変異型adhE遺伝子を含む 4.7 kbp断片（cat-PL-tacadhE*）を、DatsenkoとWannerの方法を用いて、MG1655ΔadhE/pKD46株にエレクトロポレーションにより導入した。得られたクローンは2%エタノールを唯一の炭素源として含むM9プレート培地上で選抜した。生育してきたクローンのadhE遺伝子の配列を決定したところ、アミノ酸置換を伴う変異としてGlu568Lys (gag-aag)、Ile554Ser (atc-agc)、Glu22Gly (gaa-gga)、Met236
Val (atg-gtg)、Tyr461Cys (tac-tgc)、及びAla786Val (gca-gta)が同定され、本クローンをMG1655::PL-tacadhE*株と名付けた。
【０１６２】
エシェリヒア・コリMG1655::PL-tacadhE*株をドナーとして、P1vir ファージをMG1655Δtdh rhtA*株に感染させるP1トランスダクション(Miller, J.H. (1972) Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)により、MG1655Δtdh rhtA* PL-tacadhE*株を得た。MG1655Δtdh, rhtA*株は、MG1655株より、DatsenkoとWannerの方法により、スレオニンデヒドロゲナーゼをコードするtdh遺伝子が破壊され、rhtA遺伝子に最小培地中で高濃度のスレオニンに対する耐性を付与するrhtA23変異（Livshits, V. A., Zakataeva, N. P., Aleshin, V. V., Vitushkina, M. V. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135）が導入された株である。
【０１６３】
＜１−４＞エシェリヒア・コリWC196Δmez株由来アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）変異株の構築
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655Δtdh rhtA adhE*をドナーとして国際特許公報WO2005/010175に記載のL-リジン生産菌WC196Δmez/pCABD2株にP1トランスダクションを行い、WC196Δmez adhE*/pCABD2株を得た。pCABD2は、米国特許No. 6,040,160に記載のL-リジンによるフィードバック阻害耐性であるdapA*遺伝子、L-リジンによるフィードバック阻害耐性であるlysC*遺伝子、dapB遺伝子、及びddh遺伝子を搭載したプラスミドである。
【０１６４】
〔実施例２〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
【０１６５】
＜２−１＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムは、至適生育温度が48℃の中高温性独立栄養細菌であり、クロロビウム・テピダムTLS株のゲノム配列がEisenらによって明らかにされている（Eisen, J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9509-9514）。この菌株からピルビン酸シンターゼ遺伝子を単離し、発現するプラスミドを構築した。
【０１６６】
＜２−２＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現発現株のピルビン酸シンターゼ活性の測定
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号３５、３６に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をSacIで切断し、pSTV28（タカラバイオ社製）のSacI部位に挿入してプラスミドを構築し、pSTV-PSと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸シンターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pSTV-PSからピルビン酸シンターゼ遺伝子をSacIで切り出してpMW-PthrのSacI部位に挿入し、ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PSを構築した。pMW-PthrはベクターpMW219（ニッポンジーン社製）のHindIIIサイトとXbaIサイトの間にエシェリヒア・コリK-12株のスレオニンオペロン（thrABC）のプロモーター領域（Pthr）を有しており、このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子発現が可能なプラスミドである。用いたスレオニンオペロンのプロモーター配列を配列番号３７に示した。
【０１６７】
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-PS、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PS、 対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/
pMW-Pthrと名付けた。
【０１６８】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、50mM HEPES緩衝液（pH 8.0）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機で破砕し、15000rpmで15分間遠心した後、得られた上清を粗酵素液とした。
粗酵素液中のタンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）を用いて測定し、250μg総タンパク質分の粗酵素液を活性測定に供した。
【０１６９】
活性測定は、以下のようにして行った。下記の反応溶液2mlに粗酵素液を加えて反応を行った。まず基質となるピルビン酸以外を全て含んだ反応溶液を分光測定用セルに加え、ゴム栓とアルミキャップを用いてセルを密閉した。シリンジを用いてアルゴンガスを5分間セルの中に吹き込みセル内の酸素濃度を低下させた後に、セルを分光光度計（日立社製U-3210 Spectrophotometer）にセットし、シリンジを用いてピルビン酸溶液を添加して反応を開始した。37℃で30分反応を行い、経時的に578nmの吸光度を測定することにより、還元型メチルビオロゲンの量の変化をみた。結果を表１に示す。表中、比活性の単位はU/mg proteinである。1Uは１分間当たり１nmolのメチルビオロゲンを還元する活性と定義した。
【０１７０】
〔反応液〕
MgCl2 1mM
Dithiothreitol 1mM
メチルビオロゲン 5mM
CoA 0.25mM
ピルピン酸 10mM (測定開始直前に添加)
HEPES (pH8.0) 50mM
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
〔実施例３〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
ピルビン酸シンターゼ活性に必要な補酵素再生系として、エシェリヒア・コリ由来のフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子とエシェリヒア・コリ由来のフェレドキシン遺伝子を用いて、これらの遺伝子とピルビン酸シンターゼ遺伝子の３つの遺伝子を同時に発現するプラスミドを構築した。エシェリヒア・コリのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子としてはfpr遺伝子、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子としてはfdx遺伝子を用いた。
【０１７３】
＜３−１＞エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号４２、４３に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をSmaIで切断し、pMW-PthrのSmaI部位に挿入し、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プラスミドを構築し、pMW-Pthr-fprと名付
けた。
【０１７４】
＜３−３＞エシェリヒア・コリ由来フェレドキシンfdx遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号４４、４５に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フェレドキシンfdx遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMW-PthrのEcoRI部位に挿入し、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドpMW-Pthr-fdxを構築した。
【０１７５】
＜３−４＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMW-Pthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMW-Pthr-fdxをSmaIで処理したものと連結してpMW-Pthr-fpr-fdxを得た。次にpMW-Pthr-PSをSacIで切断し、得られたPS遺伝子断片を、pMW-Pthr-fpr-fdxをSacIで処理したものと連結して、クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子発現増強プラスミドpMW Pthr-fpr-PS-fdxを構築した。
【０１７６】
上記の各プラスミドにおいて、クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子はPthrによって、他の遺伝子もPthrからのリードスルーによって転写される。
【０１７７】
〔実施例４〕＜クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０１７８】
＜４−１＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez 株への導入
WC196Δmez/pCABD2に、pMW-Pthr-fpr-PS-fdx、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現株を、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdx、対照株をWC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１７９】
＜４−２＞クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez/pCABD2/pMW Pthr、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdxの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩前培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のオレイン酸培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に72時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液中の生菌数についても計測した。２連の培養の平均値を表２に示す。クロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０１８０】
〔オレイン酸培地組成〕
オレイン酸ナトリウム 20g/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０１８１】
【表２】
【０１８２】
〔実施例５〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに見いだされているピルビン酸シンターゼ遺伝子と相同性を有するydbK遺伝子の発現プラスミドを構築し、活性を測定した。
【０１８３】
＜５−１＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３８、３９に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をKpnIで切断し、pSTV28（タカラバイオ社製）のKpnI部位に挿入してプラスミドを構築し、pSTV-ydbKと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸シンターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pSTV-ydbKからピルビン酸シンターゼ遺伝子をKpnIで切り出してpMW-PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-ydbKを構築した。
【０１８４】
＜５−２＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株のピルビン酸シンターゼ活性の測定
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-ydbK、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-ydbK、対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１８５】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、実施例２に記載のクロロビウム・テピダム由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株の活性測定法と同じ方法で、活性を測定した。結果を表３に示す。対照株WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrではピルビン酸シンターゼの活性は確認されなかったが、エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-ydbKでは8.0U/mgの活性が確認された。結果を表３に示す。比活性の単位は表１と同様である。
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
〔実施例６〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
実施例３に記載のエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子を含むプラスミドpMW-Pthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子を含むプラスミドpMW-Pthr-fdxをSmaIで処理したものと連結してpMW-Pthr-fpr-fdxを得た。次にpMW-Pthr-ydbKをKpnIで切断し、得られたydbK遺伝子断片を、pMW-Pthr-fpr-fdxをKpnIで処理したものと連結して、エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子発現増強プラスミドpMW-Pthr-fpr-ydbK-fdxを構築した。
【０１８８】
〔実施例７〕＜エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０１８９】
＜７−１＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ＋リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez adhE*株への導入
WC196Δmez adhE*/pCABD2に、pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、対照株をWC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０１９０】
＜７−２＞エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdxの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩、培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のエタノール培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に96時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンと残存エタノールをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液の濁度についても測定した。２連の培養の平均値を表４に示す。エシェリヒア・コリ由来ピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０１９１】
〔エタノール培地組成〕
エタノール 20ml/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
〔実施例８〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築と活性測定＞
ユーグレナ・グラシリスは至適生育27℃の光合成原生生物である。これよりピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ遺伝子を単離し、本遺伝子を発現するプラスミドを構築した。
【０１９４】
＜８−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
ユーグレナ・グラシリスの染色体を鋳型として、配列番号４０、４１に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片KpnIで切断し、pUC19（タカラバイオ社製）のKpnI部位に挿入してプラスミドを構築し、pUC-PNOと名付けた。BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kitを使用してピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の全長にPCRエラーがないことを確認した後、pUC-PNOからピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをKpnIで切り出してpMW-PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PNOを構築した。
【０１９５】
＜８−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ発現の確認
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW Pthrと名付けた。
【０１９６】
上述の株を20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。培養液1mlを20mg/lのストレプトマイシン、及び40mg/lのカナマイシンを含んだLB培地20mlに接種し、37℃で5時間振とう培養した。菌体を遠心分離により回収し、1mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波破砕機で破砕し、15000rpmで15分間遠心した後、得られた上清を粗抽出液とした。粗抽出液中のタンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）を用いて測定し、10μgのタンパク質を含む粗抽出液をサンプル調製に供した。サンプル調製は、粗抽出液にNuPAGE LDS サンプルバッファー（インビトロジェン社製）の濃度が1.1倍になるように加えた後、NuPAGE
サンプルリデューシングエイジェント(インビトロジェン社製)を終濃度10％となるように加え、70℃で10分間加熱処理することで行った。調整したサンプルをNuPAGE Tris-Acetate ゲル3-8％（インビトロジェン社製）を用いて電気泳動した。マーカーとしてMagicMark
XP Western Protein Standard（インビトロジェン社製）を使用した。
【０１９７】
電気泳動後のゲルをiBlot Gel Transfer Device（インビトロジェン社製）を用いてメンブレンに転写した。転写後のブロッキングから検出までの操作はWesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit（インビトロジェン社製）を用いて行った。まずメンブレンを30分間ブロッキング処理した後、純水で2回洗浄し、1000倍希釈した抗PNO血清溶液中にて１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄液で3回洗浄し、二次抗体溶液中にて30分インキュベートした。メンブレンを洗浄液で3回洗浄し、さらに純水で2回洗浄した後、検出試薬をかけ、ルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム社製）にて検出した。結果を図１に示す。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNO株では200kD付近にPNOと推定されるバンドが検出された。一方、対照株のWC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr株ではそのようなバンドは検出されなかった。
【０１９８】
〔実施例９〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドの構築＞
実施例８に記載のユーグレナ・グラシリス由来のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片を含むプラスミドpUC-PNOから、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子断片をKpnIで切り出してpMW PthrのKpnI部位に挿入し、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ遺伝子発現用プラスミドpMW-Pthr-PNOを構築した。
【０１９９】
〔実施例１０〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
【０２００】
＜１０−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プラスミドのWC196Δmez 株への導入
WC196Δmez/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０２０１】
＜１０−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のオレイン酸を炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNOの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩、培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のオレイン酸培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に72時間培養した。培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液中の生菌数についても計測した。２連の培養の平均値を表５に示す。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０２０２】
〔オレイン酸培地組成〕
オレイン酸ナトリウム 20g/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０２０３】
【表５】
【０２０４】
〔実施例１１〕＜ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果＞
＜１１−１＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅用プラスミドのWC196Δmez adhE*株への導入
WC196Δmez adhE*/pCABD2に、pMW-Pthr-PNO、比較対照用のベクターpMW-Pthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得し、プラスミドの導入を確認した。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現株を、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNO、対照株をWC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthrと名付けた。
【０２０５】
＜１１−２＞ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株のエタノールを炭素源とした培養におけるＬ−リジン生産能への効果
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr 、WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNOの両株をLBプレート培地に植菌して、37℃で一晩前培養した。プレート1/8枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のエタノール培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に96時間培養した。培養96時間目に1mlをサンプリングし、培地中に蓄積したＬ−リジンをバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。また、培養液の濁度についても測定した。２連の培養の平均値を表６に示す。ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子発現増強株では対照に比してL-リジン蓄積の向上がみられた。
【０２０６】
〔エタノール培地組成〕
エタノール 20ml/L
MgSO4・7H20 1.0 g/L
(NH4)2SO4 12 g/L
KH2PO4 0.5g/L
酵母エキス 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・5H20 0.01g/L
カナマイシン 40mg/L
ストレプトマイシン 20mg/L
炭酸カルシウム 30g/L
pH7.0 (KOHで調整) 殺菌条件：115℃、10分
【０２０７】
【表６】
【０２０８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. tepidumピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号３：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子(ydbK)の塩基配列
配列番号４：E. coliピルビン酸シンターゼ(YdbK)のアミノ酸配列
配列番号５：E. gracilis ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号６：E. gracilis ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼのアミノ酸配列
配列番号７：E. coli フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)の塩基配列
配列番号８：E. coli フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)がコードするアミノ酸配列
配列番号９：E. coli フェレドキシン遺伝子(fdx)の塩基配列
配列番号10：E. coli フェレドキシン遺伝子(fdx)がコードするアミノ酸配列
配列番号11：E. coli フェレドキシン遺伝子(yfhL)の塩基配列
配列番号12：E. coli フェレドキシン遺伝子(yhfL)がコードするアミノ酸配列
配列番号13：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldA)の塩基配列
配列番号14：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldA)がコードするアミノ酸配列
配列番号15：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldB)の塩基配列
配列番号16：E. coli フラボドキシン遺伝子(fldB)がコードするアミノ酸配列
配列番号17：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号18：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号19：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子の塩基配列
配列番号20：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号21：E. coliアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)の塩基配列
配列番号22：E. coliアルコールデヒドロゲナーゼ(AdhE)のアミノ酸配列
配列番号23：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー１
配列番号24：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー2
配列番号25：PL-tacプロモーターの塩基配列
配列番号26：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー3
配列番号27：PL-tacプロモーターとクロラムフェニコール耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー4
配列番号28：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー１
配列番号29：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー2
配列番号30：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー3
配列番号31：カナマイシン耐性(CmR)遺伝子増幅プライマー4
配列番号32：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号33：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号34：E. coli変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子増幅プライマー３
配列番号35：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号36：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号37：スレオニンオペロンプロモーター配列
配列番号38：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号39：E. coliピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号40：E. gracilisピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号41：E. gracilisピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号42：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー１配列番号43：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー２配列番号44：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー１
配列番号45：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー２
配列番号46：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニット遺伝子（aceE）の塩基配列
配列番号47：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニットのアミノ酸配列
配列番号48：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニット遺伝子（aceF）の塩基配列
配列番号49：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニットのアミノ酸配列
配列番号50：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニット遺伝子（lpdA）の塩基配列
配列番号51：E. coliピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニットのアミノ酸配列
配列番号52：E. coliリンゴ酸酵素をコードする遺伝子（sfcA ）の塩基配列
配列番号53：E. coli sfcA遺伝子がコードするリンゴ酸酵素のアミノ酸配列
配列番号54：E. coliリンゴ酸酵素をコードする遺伝子（b2463）の塩基配列
配列番号55：E. coli b2463遺伝子がコードするリンゴ酸酵素のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】ユーグレナ・グラシリス由来ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ（PNO）遺伝子の発現を示すウェスタンブロットの写真。レーン１:マーカーレーン２:WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthrからの粗酵素抽出液レーン３:WC196ΔcadAΔldc/pCABD2/pMW-Pthr-PNOからの粗酵素抽出液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物。
【請求項２】
ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すポリペプチドをコードする、請求項４又は５に記載の微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む、請求項４又は５に記載の微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードする、請求項４又は５に記載の微生物：
（Ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号６において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は
（ｂ）のＤＮＡを含む、請求項４又は５に記載の微生物：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼの活性が増大するように改変された、請求項１、または請求項２〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、請求項１、または請求項２〜７、または請求項１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
好気的にエタノールを資化できるように改変された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１４】
微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
微生物が、コリネ型細菌である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項１７】
前記培地が、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含有することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された微生物。
【請求項２】
ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ピルビン酸シンターゼ、もしくは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性が増大した、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すポリペプチドをコードする、請求項４又は５に記載の微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む、請求項４又は５に記載の微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードする、請求項４又は５に記載の微生物：
（Ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号６において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は
（ｂ）のＤＮＡを含む、請求項４又は５に記載の微生物：
（ａ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼの活性が増大するように改変された、請求項１、または請求項２〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、請求項１、または請求項２〜７、または請求項１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
好気的にエタノールを資化できるように改変された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１４】
微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
微生物が、コリネ型細菌である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−セリンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項１７】
前記培地が、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含有することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２６３７９０（Ｐ２０１０−２６３７９０Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２８７３３（Ｐ２００７−２２８７３３）
【出願日】平成１９年９月４日（２００７．９．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月４日（２００７．９．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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