アミノ酸産生の代謝工学
【課題】バリン産生減少によるアミノ酸産生の改善およびＡＨＡＳ活性減少によるアミノ酸産生の改善の提供。
【解決手段】（１）アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃであって（ａ）デキストロースからアミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学変異誘発；および（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；からなる群から選択される方法により、親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸について栄養要求性などである、工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースからアミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで収率Ｚパーセントは、収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、を包含する方法により得られる、微生物Ｃ。
【解決手段】（１）アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃであって（ａ）デキストロースからアミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学変異誘発；および（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；からなる群から選択される方法により、親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸について栄養要求性などである、工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースからアミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで収率Ｚパーセントは、収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、を包含する方法により得られる、微生物Ｃ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明分野）
本発明は、微生物遺伝学および組み換えＤＮＡ技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、アミノ酸の発酵産生に関する。本発明により、アミノ酸産生に有用な微生物、アミノ酸産生を向上させる方法、およびアミノ酸産生プロセスが提供される。
【０００２】
（関連分野）
発酵によるアミノ酸産生は、糖密、酢酸およびエタノールなどの廉価な炭素源からの安価な産生を可能とする。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａがアミノ酸の工業生産に有用である（Ｓ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２：４６４−４６８（１９５７））という認識に従って、発酵プロセスによるアミノ酸の商業生産が、変異株の分離を用いてより実施可能になった。アミノ酸産生の微生物プロセスで用いられる微生物を４つのクラスに分類し得る：野生型株、栄養要求性変異株、調節変異株および栄養要求性調節変異株（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ ＯＦ ＦＯＯＤ ＡＮＤ ＦＥＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｍ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編、（１９７８）、ｐｐ．６４９−６６１）。発酵により産生されたアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較して、微生物プロセスによるアミノ酸産生を優位なプロセスとし；微生物プロセスにより産生されるアミノ酸は、通常Ｌ−型である。
【０００３】
Ｌ−リシンは、工業的発酵により産生されるアミノ酸の一例である。この必須アミノ酸の商業的産生は、グラム陽性微生物であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Ｋｌｅｅｍａｎｎ，Ａら、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＵＬＬＭＡＮ‘Ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．Ａ２，ｐｐ．５７−９７、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（１９８５））を利用して主に行なわれ；累積的に、これら３つの微生物は現在、一年間におよそ２５０，０００トンのＬ−リシンを産生すると報告されている。
【０００４】
発酵プロセスによるＬ−リシン産生の経済的重要性があるなら、生産コストを下げると同時に、産生される総量を増加させることが有用であろう。それを目標として、Ｌ−リシン合成の生化学的経路が集中的にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（最近、Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）によってレビューされた）において研究されている。リシン経路への入り口は、Ｌ−アスパラギン酸で始まる（図１参照）。Ｌ−アスパラギン酸自身は、オキサロ酢酸のアミノ基転移により産生される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特殊な性質は、リシン中間体ピペリジン２，６−ジカルボキシレートを二つの異なるルートで、すなわち、スクシニル化中間体に関する反応によってか、またはジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの単一反応によって、ジアミノピメリン酸に変換するその能力である。全体的に見ると、経路への炭素流量は、２点で調節される：第一に、Ｌ−スレオニンおよびＬ−リシン両方のレベルによるアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害によるもの、第二は、ジヒドロジピコリン酸合成レベルの調節によるものである。従って、これら２つの酵素の活性を調節解除および増加させることにより、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおいてＬ−リシン産生を増加させ得る。
【０００５】
Ｌ−リシン合成を導く生化学的経路に加えて、最近の証拠は、細胞から媒質へのリシン輸送に関する考察が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリシン過剰産生株の開発において考慮されるべき別の条件であるということを示す。Ｋｒａｍｅｒおよびその同僚による研究は、易漏出性の膜の性質の結果として起こる細胞からの受動的輸送だけで、リシン流出が説明されるものではないことを示す；これらのデータは、以下のような性質を持つ特定のキャリアを示唆する：（１）トランスポーターは、リシンに対するかなり高いＫｍ値（２０ｍＭ）を有する；（２）トランスポーターは、ＯＨ-共輸送系（取り込み系は、Ｈ+対向輸送系である）および（３）トランスポーターは正に荷電しており、膜電位が分泌を刺激する（Ｓ．ＢｒｏｅｒおよびＲ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：１３７−１４３（１９９１））。
【０００６】
栄養要求性または抵抗性の性質について分離された様々な株を利用したいくつかの発酵プロセスが、Ｌ−リシン産生に関して当該分野において公知である：米国特許第２，９７９，４３９号は、ホモセリン（またはメチオニンおよびスレオニン）要求性の変異体を開示し；米国特許第３，７００，５５７号は、スレオニン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、シスチン、またはシステインについて栄養要求性を有する変異株を開示し；米国特許第３，７０７，４４１号は、リシンアナログに対して抵抗性を持つ変異体を開示し；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リシン産生能力およびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する抵抗性の両方を有する変異株を開示し；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、スレオニン、スレオニンおよびメチオニン、ロイシン、イソロイシンまたはそれらの組み合わせについて栄養要求性を有し、かつリシン、スレオニン、イソロイシンまたはそれらのアナログに対する抵抗性を有する変異体を開示し；米国特許第３，８２５，４７２号は、リシンアナログに対する抵抗性を有する変異株を開示し；米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リシンを産生し、かつアスパラギン酸アナログおよびサルファ剤の少なくとも一つに対して抵抗性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異株を開示し；米国特許第５，８４６，７９０号は、ビオチン作用抑制剤非存在化でＬ−グルタミン酸およびＬ−リシンを産生し得る変異株が開示し；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース、２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノースまたはその誘導体に対して抵抗性を持つ、Ｌ−リシンの産生に関して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に分類される株を開示する。
【０００７】
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａのＬ−リシン発酵産生の分野における、より最近の発展は、リシン産生を増大させるための分子生物学技術の使用と関連がある。以下の例は、本技術の典型的な例として提供されるものである：米国特許出願番第４，５６０，６５４号および同第５，２３６，８３１号は、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対して感受性のあるホストＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物に対して、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対する抵抗性およびリシン産生能の両方を付与するＤＮＡフラグメントをベクターＤＮＡに挿入した組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転換することにより得られるＬ−リシン産生変異株を開示し；米国特許出願第５，７６６，９２５号は、ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌（Ｌ−リシンおよびＬ−スレオニンにより脱感作されるフィードバック阻害を有する）由来のアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを有するＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失したＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌の染色体ＤＮＡに組み込むことにより産生される変異株を開示する。
【０００８】
Ｌ−リシンに加えて、他のアミノ酸、例えば、分枝鎖アミノ酸であるＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン産生にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび関連生物が有用である。分枝鎖アミノ酸生合成に至る生化学的経路もまた良く研究されている。アスパラギン酸経路への炭素流量は、Ｌ−イソロイシン産生に利用されうる、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニン産生に送り込まれうる（図１Ｂ）。５つの反応により、Ｌ−スレオニンからＬ−イソロイシンが産生される。すなわち、これらの反応を触媒する酵素には、次のものが含まれる。（１）スレオニンデヒドラターゼ、（２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ、（３）イソメロレダクターゼ、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、および（５）トランスアミナーゼＢ、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソロイシン合成特有である、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素は、また他の分枝鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。スレオニンからイソロイシンへの炭素流量は、スレオニンデヒドラターゼおよびアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）により制御される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるイソロイシン経路の酵素をコードする遺伝子（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤおよびｉｌｖＥ）クローニングを利用して（Ｃ．Ｃｏｒｄｅｓら、Ｇｅｎｅ １１２：１１３−１１６（１９９２）；Ｂ．Ｍｏｅｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：８０６５−８０７２（１９９２）および、Ｃ．Ｋｅｉｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９９３））、新規株を作製するために組み換えＤＮＡ技術を適用し得る。
【０００９】
分枝鎖アミノ酸生合成経路における酵素活性の向上によるアミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの産生における発展について説明されている。さらに、ｉｌｖＢＮオペロンによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性の改善による分枝鎖アミノ酸産生における改善について説明されている。（概要として、Ｈ．Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）を参照）。
【００１０】
分枝鎖アミノ酸産生の例示的なプロセスには、次のものが含まれる。米国特許第５，１８８，９４８号において、ポリケチドに対して抵抗性である微生物を利用したＬ−バリン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第５，５２１，０７４号において、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物を利用したＬ−バリン産生のためのプロセスが開示されている。これらの微生物は、ａ）バリン産生能、ｂ）唯一の炭素源として酢酸を含む培地中における、Ｌ−バリンに対する抵抗性、およびｃ）唯一の炭素源としてグルコースを含む培地中における、ピルビン酸アナログに対する感受性を示す。米国特許第４，６０１，９８３号において、コリネフォルム細菌において複製可能で、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン産生に使用されるホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持つ蛋白質産生をコードする遺伝子配列が開示されている。米国特許第４，４４２，２０８号において、組み換えＤＮＡ技術によって得られた、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸抵抗性を持つＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を利用した、Ｌ−イソロイシン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第４，６５６，１３５号において、Ｌ−イソロイシン産生のためのプロセスが開示されている。このプロセスには、メチルリシン抵抗性またはα−ケトマロン酸抵抗性を持ち、液体培地中でＬ−イソロイシン産生し得、その液体培養液から蓄積したＬ−イソロイシンを回収しうるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の培養が含まれる。米国特許第５，１１８，６１９号において、Ｄ−ラクテートを利用する変異体による、Ｄ，Ｌ−α−ヒドロキシブチレートからのＬ−イソロイシン発酵産生のための方法が開示されている。米国特許第５，７６３，２３１号において、Ｌ−ロイシン産生のためのプロセスが開示されている。このプロセスは、培養培地中でのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属株をインキュベーションする工程および、得られた細胞をサッカリドおよび酢酸またはその塩と反応させて、反応溶液中でＬ−ロイシンを形成かつ蓄積させる工程を包含する。および、米国特許第３，９７０，５１９号において、ロイシンまたはそのアナログによるフィードバック阻害に対して抵抗性を持ち、Ｌ−ロイシンを産生するための増殖栄養としてイソロイシン、スレオニンまたはメチオニンのうち少なくとも一つを必要とする株が開示されている。
【００１１】
バリン産生減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。
【００１２】
ＡＨＡＳ活性減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によって以下が提供される：
（１）アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃであって、ここで該微生物Ｃは、以下の工程：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法により得られる、微生物Ｃ。
（２） 項目１に記載の微生物Ｃであって、ここでアミノ酸Ｘは、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、微生物Ｃ。
（３） 微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目２に記載の微生物Ｃ。
（４） 微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目３に記載の微生物Ｃ。
（５） 工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目３に記載の微生物Ｃ。
（６） 工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異的変異誘発である、項目３に記載の微生物Ｃ。
（７） 微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株であって、該株は、以下の特徴：
（ａ）分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンの１つ以上についての栄養要求性またはブラディトローフ性；
（ｂ）培地で培養される場合、以下：
（ｉ）グリシン；
（ｉｉ）アラニン；
（ｉｉｉ）メチオニン；
（ｉｖ）フェニルアラニン；
（ｖ）トリプトファン；
（ｖｉ）プロリン；
（ｖｉｉ）セリン；
（ｖｉｉｉ）トレオニン；
（ｉｘ）システイン；
（ｘ）チロシン；
（ｘｉ）アスパラギン；
（ｘｉｉ）グルタミン；
（ｘｉｉｉ）アスパラギン酸；
（ｘｉｖ）グルタミン酸；
（ｘｖ）リジン；
（ｘｖｉ）アルギニン；および
（ｘｖｉｉ）ヒスチジン、
からなる群からら選択されるアミノ酸を産生すること；ならびに
（ｃ）少なくとも３０％である、デキストロースからの工程（ｂ）のアミノ酸のパーセント収率を生じること、
を有する、株。
（８） 前記ｉｌｖＢＮオペロンにおける変異によりさらに特徴付けられる、項目７に記載の微生物。
（９） 前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、欠失、挿入または点変異である、項目８に記載の微生物。
（１０） 前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、配列番号３または配列番号５の配列により特徴付けられる、項目９に記載の微生物。
（１１） ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１４９の同定特徴を有する微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
（１２） ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１５０の同定特徴を有する微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
（１３） アミノ酸Ｘの産生を増加する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発させて、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
（１４） 前記アミノ酸Ｘが、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（１５） 前記微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（１６） 前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目１５に記載の方法。
（１７） 工程（ｂ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目１５に記載の方法。
（１８） 工程（ｂ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異的変異である、項目１５に記載の方法。
（１９） アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで該微生物Ｃは、以下：
（ｉ）デキストロースから収率Ｙパーセントの該アミノ酸を産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｉｉ）以下：
（１）ランダム化学変異誘発；および
（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性である、工程；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から栄養要求性である少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、該微生物Ｃは、該アミノ酸Ｘをデキストロースから収率Ｙパーセントで産生する、工程、
を包含する方法により得られる、工程；
（ｂ）該微生物Ｃから産生される該アミノ酸Ｘを回収する工程、
を包含する、プロセス。
（２０） 前記アミノ酸Ｘが、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目１９に記載のプロセス。
（２１） 前記微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目２０に記載のプロセス。
（２２） 前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目２１に記載のプロセス。
（２３） 前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目２１に記載のプロセス。
（２４） 前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢｎオペロンの部位特異的変異誘発である、項目２１に記載のプロセス。
（本発明の要旨）
本発明の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物を提供することである。変換効率は次の式により定量され得る。
すなわち、［（ｇ 産生されたアミノ酸／ｇ 消費されたデキストロース）×１００］＝パーセント収率およびデキストロースからの収率として表される。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、変異誘発により一つ以上の分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性に改変され、所望するアミノ酸に対して、親株よりも高いパーセント収率を生じるという能力について選択された微生物を提供する。
【００１５】
より具体的な、ランダム化学変異誘発に親株を供することにより得られた微生物を提供する本発明の実施形態において、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である変異誘発された変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換可能な変異株を選択する。別の具体的な本発明の実施形態は、ｉｌｖＢＮオペロンの核酸配列における改変（すなわち、変異）を導入するために、ｒＤＮＡ法を利用し、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフである変異誘発変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換可能な改変体を選択して得られる微生物を提供する。
【００１６】
好適な実施形態において、本発明微生物はＬ−リシンを産生する。その他の好適な本発明の実施形態は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物を指向し、そして特に好適な微生物は、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物である。最も好適な実施形態において、微生物は、ＮＲＲＬ番号Ｂ−３０１４９（ＬＣ１０としても知られている）またはＮＲＲＬ番号Ｂ−３０１５０（ＢＦ１００−１０３０としても知られている）という同定特徴を有し、これらの株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ ＵＳＡに１９９９年６月２９日に寄託された。
【００１７】
本発明の別の目的は、親株の変異誘発、一つ以上の分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性である細胞の選択、および所望するアミノ酸の親株よりも高いデキストロースからのパーセント収率で産生する分枝鎖アミノ酸栄養要求性の選択によりアミノ酸産生を増加させる方法を提供する。
【００１８】
好適な実施形態において、本方法は、ランダム化学変異誘導または組み換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術を用いて一つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンまたはバリンに対して栄養要求性またはブラディトローフであるように改変されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養から得られる、デキストロースからのアミノ酸Ｌ−リシンの収率の向上を指向する。
【００１９】
１つの特定の実施形態において、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの化学変異誘発の結果である。代替の具体的な実施形態において、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、ｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペロンの変異誘発の結果である。
【００２０】
本発明の別の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物によるアミノ酸産生プロセスを提供することである。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、培地中での、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフであるように親株を誘発し、そして、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することより得られた微生物を培養する工程を包含するアミノ酸産生プロセスを提供する。
【００２２】
本プロセスの好適な実施形態において、親株をランダム化学変異誘発に供し、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である変異を誘発された改変体を単離し、そして親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することにより、発酵に利用される微生物が得られる。本プロセスにおけるその他の好適な実施形態において、ｒＤＮＡ法によりｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列を変化させ（つまり、変異の導入）、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフである変異を誘発された変異体を分離し、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することにより、発酵に利用される微生物を得る。
前記の一般的記述および次の詳細な記述は例示的であり、かつ例示のみであり、特許請求の範囲のとおりの本発明のさらなる説明を提供することを意図されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−リシン産生を導く生化学的経路の略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−イソロイシン産生に至る生化学的経路概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの、ｉｌｖＢＮオペロンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（好適な実施形態の詳細な説明）
（１．定義）
明細書および特許請求の範囲の明確で矛盾のない理解を提供するために、これらの語が使われるべき範囲を含めて、次の定義を提供する。
【００２５】
栄養要求性株：本明細書中で使用される場合、栄養要求性株なる語は、増殖するために、獲得遺伝的欠損のために合成不可能な、特定の代謝物質の外的な源を必要とする微生物株を意味する。
【００２６】
アミノ酸補充：本明細書中で使用される場合、「アミノ酸補充」なる語は、成長に必要とされ、栄養要求性成長を助けるために最小培地に添加されるアミノ酸を意味している。
【００２７】
ブラディトローフ：本明細書中で使用される場合、ブラディトローフなる語は、特異的な代謝物質の外的な源がない状態において遅い成長を示す微生物株を意味している。ブラディトローフ微生物は、代謝物質を合成しうるが、獲得遺伝的欠損のために、合成速度が親株での同じ代謝物質の合成速度よりも遅い。
【００２８】
分枝アミノ酸：本明細書中で使用される場合、この語は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンなど、Ｒ基が分枝した炭素構造を持つアミノ酸を意味している。
【００２９】
炭素流動：本明細書中で使用される場合、この語は、生体内の両方向性、異化作用性および／または同化作用性の生化学的合成的経路の間の炭素の移動を意味している。
【００３０】
染色体組込み：本明細書中で使用される場合、この語は、外因性ＤＮＡ断片の、宿主生物染色体への挿入を意味している。より具体的には、この語は、外因性ＤＮＡ断片と宿主細胞染色体との適切な領域間の相同的組み換えを意味するものとして使用される。
【００３１】
高収率誘導体：本明細書中で使用される場合、この語は、その誘導体が由来する親株と比較した場合、高い収率で、デキストロースから特異的なアミノ酸を産生する微生物株を意味している。
【００３２】
変異：本明細書中で使用される場合、この語は、目的のヌクレオチド配列における、単一塩基対変化、挿入または欠失を意味している。
【００３３】
オペロン：本明細書中で使用される場合、この語は、構造遺伝子および調節エレメントを含む、ＤＮＡにおける細菌遺伝子発現および調節の単位を意味している。オペロンに含まれる調節エレメントの例には、プロモーターおよびオペレーターが含まれるがこれに限定されない。
【００３４】
親株：本明細書中で使用される場合、この語は、本発明の微生物を得るためにある形態の変異誘発に供される微生物株を意味している。
【００３５】
デキストロースからの収率パーセント：本明細書中で使用される場合、この語は、次の式で定義されるデキストロースからのアミノ酸収率を意味している。すなわち、
［（ｇ 産生されたアミノ酸／ｇ 消費されたデキストロース）×１００］＝％収率、である。
【００３６】
表現型：本明細書中で使用される場合、この語は、微生物の遺伝的構成に依存した、識別できる形質的特徴を意味している。
【００３７】
相対的成長：本明細書中で使用される場合、この語は、規定された期間にわたって、規定された培養液中で、親株の成長と子孫株の成長を直接的に比較することによって、成長の評価を提供する測定を意味している。
【００３８】
変異誘発：本明細書中で使用される場合、この語は、ＤＮＡにおいて変異が発生するプロセスを意味している。「ランダム」変異誘発を用いて、変異の正確な部位を予想することはできず、微生物ゲノムのどこでも起こり、また、放射線照射または化学処理などの因子により引き起こされる物理的損傷の結果として変異が引き起こされる。ｒＤＮＡ変異誘発は、クローニングされた目的のＤＮＡを指向し、それはランダムまたは部位特異的なものでありうる。
【００３９】
（２．分枝鎖アミノ酸合成に対する炭素流量の減少、および非分枝型アミノ酸産生の増加に基づいた本発明の微生物）
本発明は、概して、炭素流動を非分枝鎖アミノ酸合成に向けるために、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の作製を提供する。より具体的に、ロイシン、イソロイシンまたはバリンなどの、一つ以上の分枝鎖アミノ酸（例えば、イソロイシンおよびバリン）を必要とする特異的な栄養要求性表現型を選択するか、またはイソロイシン、ロイシンおよびバリン合成への炭素流量を減少させるｉｌｖＢＮオペロンにおける変異を設計することにより、この系の炭素流動を、他の代謝経路（例えば、Ｌ−リシン合成）で利用できるようにし得る。
【００４０】
１つの特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃを提供する。ここで、この微生物Ｃは、次の方法によって得られる：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
【００４１】
デキストロースからの収率パーセントは、好適には、式［（ｇ 産生されたアミノ酸／Ｌ ／ ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）×１００］を用いて計算される。
【００４２】
親微生物は、アミノ酸Ｘを産生しうる、当該分野で既知の任意の微生物からも選択されうる。特に好適な親微生物は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである。
【００４３】
本発明の株は、当業者にとって既知で利用可能な任意の方法および技術によっても、調製され得る。本発明細菌株の構築に適した方法の例には、次のものが含まれるが、これに限らない：Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような適した薬剤を用いた変異誘発；線状ＤＮＡ断片の形質転換および相同的組み換えを介した遺伝子組込み技術；およびバクテリオファージを介した形質導入。これらの方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．Ｓｉｎｇｅｒ およびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ ＆Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ． Ｇｌｉｃｋ およびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；およびＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）において説明されている。
【００４４】
（Ａ．ランダム変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の構築）
本発明のある具体的で好適な実施形態により、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン生合成に共通の酵素的ステップの改変が、デキストロースからのＬ−リシンのパーセント収率を向上させ得ることを提供する。
【００４５】
最も好適な実施形態において、本発明は、親株に対するランダム変異誘発を行い、その後特定の表現型を選択することより、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の産生を提供する。変異誘発を行うために選択した親株は、目的のアミノ酸を産生することが知られている任意の株でもあり得る。好適な生物には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が含まれ、最も好適な生物には、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が含まれる。
【００４６】
親株は、当該分野で既知の任意のランダム変異誘発を用いて、変異誘発され得る。これには、放射線照射および化学的方法が含まれるがこれに限らない。特に好適なものは、ランダム化学的変異誘発であり、最も好適なものは、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２））によって記述されているアルキル化剤法である。
【００４７】
例として、次のように化学的変異誘発を行った。リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の培養は、富化培地中で、３０℃にて、吸光度が６．０に達するまで行った。細胞を、最小培地で洗浄し、１００ｍｇ／ｍｌのＮＴＧを含む最小培地で再懸濁した。細胞を、突然変異原に、３０℃で３０分間曝露した。細胞を最小培地で洗浄し、富化培地に播種した。富化培地および最小培地上に、富化培地で生じたコロニーのレプリカをとった。富化培地上で生育したが最小培地上では生育しなかったコロニーを、栄養要求性株として分類した。栄養要求性変異体に対して、最小培地および、１０ｍＭＬイソロイシンおよび１０ｍＭＬ−バリンを含む最小培地上にレプリカをとった。イソロイシンおよびバリンによりレスキューされたコロニーを、バリン栄養要求性株として分類した。株Ｂ４Ｂは、化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株である。
【００４８】
（Ｂ．ｒＤＮＡ方法論を介した変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の構築）
本発明のその別の具体的な好適な実施形態は、分枝鎖アミノ酸の生合成に重要なタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏ 変異誘発をもたらすために、組み換えＤＮＡ技術を利用する。次いで、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性で、親株よりも高収率でデキストロースから非分枝鎖アミノ酸を産生する変異株を作製することを目的として、親株を改変するために変異されたＤＮＡを使用し得る。
【００４９】
ある具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡが、当該分野で既知の任意の方法によっても組み換えＤＮＡ技術を介して変異され得る。当業者によって既知であろうように、クローン化ＤＮＡにおける変異は、単一のヌクレオチド変化（点変異）、多重ヌクレオチド変化、ヌクレオチド欠損または挿入を含み得る。組み換えＤＮＡ技術の一般的方法は、当業者により既知であり、例えば、核酸精製、制限酵素消化、ライゲーション、遺伝子クローニング、遺伝子配列決定、遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）などの基礎技術を記載する多くの一般の実験マニュアルにおいて見出され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９４）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲプロトコール）、 Ｉｎｎｉｓら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４０７−４１５頁（１９９０）を参照すること。）
さらに、クローン化ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発を具体的に示す参考文献は、当業者により既知である。例えば、部位指向性変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム化学的変異誘発、カセット変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびその他の方法が、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）において詳しく説明されている。
【００５０】
別の具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡは、ホスト細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏで変異を起こし得る。このタイプの「ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発」には、一つ以上のＤＮＡ修復経路に変異を持つＥ．ｃｏｌｉ株のＤＮＡの増殖によって、目的の任意のクローン化ＤＮＡにおけるランダム変異を作り出すプロセスが含まれる。これらの「変異誘発遺伝子（ｍｕｔａｔｏｒ）」株は、野生型の親株よりも高いランダム変異頻度を持つ。これらの株の一つにおけるＤＮＡの生育により、ＤＮＡ中でランダム変異が作り出される。これを行うために設計された系は、当業者にとって既知であり、そして商業的に利用し得る。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．により、そのＤＮＡ修復遺伝子（ＭｕｔＨ，ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳ）が欠失され、その結果短時間で多くの異なる変異が起こるＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１ Ｒｅｄ Ｓｔｒａｉｎを利用した系が提供される。１０，０００までの変異が３０時間に起こり得、その結果当該分野で既知の方法により変異ＤＮＡから完全な変異ＤＮＡライブラリーを用意し得る。
【００５１】
変異のために選択されたクローン化ＤＮＡは、分枝鎖アミノ酸合成に重要であるとして当該分野で既知である任意の配列でもあり得る。その配列には、合成に重要な一つ以上の酵素、または輸送および排出に重要な一つ以上のタンパク質産物をコードする配列が含まれるがそれに限らない。最も好適なものは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンの、クローン化配列である。分枝鎖アミノ酸合成に関係するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子がクローニングされている。例えば、イソロイシン経路に対して遺伝子配列が利用できる（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤおよびｉｌｖＥ）。（Ｃ．Ｃｏｒｄｅｓら、Ｇｅｎｅ１１２：１１３−１１６（１９９２）；Ｂ．Ｍｏｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：８０６５−８０７２（１９９２）；およびＣ．Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９９３））。
【００５２】
Ｌ−スレオニンから、５つの反応でＬ−イソロイシンが産生される。これらの反応を触媒する酵素は、（１）スレオニンジヒドラターゼ（ｉｌｖＡ）、（２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢ）、（３）イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、および（５）トランスアミナーゼＢ（ｉｌｖＥ）、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソロイシン合成に特有な、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素はまた、他の分枝鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株におけるイソロイシン生合成に関係する酵素経路は図２で表される。
【００５３】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびイソメロレダクターゼ（ＩＲ）は、イソロイシン、バリン、ロイシンおよびパントテナートに対して、代謝物の流れにおいて続いて起こる反応を触媒する。他の細菌でのように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株のＡＨＡＳは、二つの遺伝子ｉｌｖＢおよびｉｌｖＮによりコードされている。遺伝子分断により、これらの遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて単一のＡＨＡＳ活性をコードしていることが実証された（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ，Ｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９７３））。３．９，２．３および１．１ｋｂの３個の転写産物が、ノーザンブロット解析により、ｉｎ ｖｉｖｏで同定された。それらは、それぞれｉｌｖＢＮＣ、ｉｌｖＮＣ、ｉｌｖＣメッセンジャーと対応する。ｉｌｖＣ転写産物（ＩＲをコードする）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｉｌｖオペロンからの最も量の多い転写産物である。さらなる解析により、このオペロンで３個のプロモーターが活性であること、ｉｌｖＢＮＣおよびｉｌｖＮＣメッセンジャーの定常レベルが著しく単一ＡＨＡＳの全体としての活性に寄与していることが示されている。
【００５４】
最も好適な本発明の実施形態において、クローン化ｉｌｖＢＮオペロンＤＮＡ配列内で欠損を作り出すことを目的として、制限酵素消化により、変異を作製し得る。次に、変異誘発されたｉｌｖＢＮ配列を、相同的組み換えにより、野生型配列と置き換え、分枝鎖アミノ酸に対する栄養要求性に関してスクリーニングし得る。
【００５５】
その他の本発明の実施形態は、一つ以上の分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンに対する栄養要求性を示し、そしてデキストロースから、親株のパーセント収率よりも高い、目的のアミノ酸のパーセント収率を産み出す微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに引き出される。特に好適な実施形態において、産生されるアミノ酸は、Ｌ−リシンである。
【００５６】
本発明の他の非常に好適な実施形態は、実質的にＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４９またはＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１５０の性質全てを持つ微生物に引き出される。
【００５７】
（３．アミノ酸の産生を増加させる方法）
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生を増加させる方法を提供する。本発明は、アミノ酸Ｘの産生を増加させる方法を広く提供する。その方法が以下：
（ａ）デキストロースから上記アミノ酸をパーセント収率Ｙで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学的変異誘発；およひ
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、１つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンについて栄養要求性である、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、パーセント収率Ｚでデキストロースから上記アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択することであって、ここで上記パーセント収率Ｚは、上記パーセント収率Ｙよりも大きい、工程、
を包含する。
【００５８】
ある特に好適な実施形態において、デキストロースから決定されたパーセント収率で目的のアミノ酸を産生する、該当分野で既知である任意の株が、親株として選択され得る。デキストロースからのパーセント収率は、次の式を用いて簡便に計算され得る［（ｇアミノ酸／Ｌ／（ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００。
【００５９】
この生物を選択し、アミノ酸のデキストロースからの（パーセント収率を決定した後、好適には、生物のゲノム全体に指向されたランダム変異誘発技術、または目的のクローン化ＤＮＡに対して指向されるｒＤＮＡ技術、のいずれかにより、変異誘発に供される。用いた変異誘発の特定の方法に関わらず、変異された生物をスクリーニングし、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性に基づいて選択される。次いで、どの株がデキストロースから所望されるアミノ酸を親株よりも高いパーセント収率で産生するかを決定するために、選択された栄養要求性株をスクリーニングし得る。
【００６０】
本発明の種々の実施形態は、生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，およびＥ．ｃｏｌｉ．から目的のアミノ酸産生を増加させる方法を含む。さらに、特定の実施形態に依存して、本発明は、グリシン；アラニン；メチオニン；フェニルアラニン；トリプトファン；プロリン；セリン；スレオニン；システイン；チロシン；アスパラギン；グルタミン；アスパラギン酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン；およびヒスチジンなどの非分枝鎖アミノ酸の産生を増加する方法を提供する。
【００６１】
好適な実施形態において、本発明は、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性株を作り、炭素の流れをロイシン、イソロイシンおよびバリンの合成から転用することによって非分枝鎖アミノ酸産生を増加する方法を提供する。特に好適な実施形態は、変異誘発された親株から、バリンおよびイソロイシン合成に対して栄養要求性である株を選択することによってアミノ酸の産生を増加する方法に引き出される。
【００６２】
本発明は、アミノ酸の生産を増加するための方法について、種々の好適な実施形態をさらに提供し、ここで親株は、ランダムな変異誘発技術（例えば、放射線変異誘発または化学物質変異誘発）、またはｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペロンの変異誘発のいずれかにより、変異誘発され得る。１つの特定の好適な実施形態において、親株は、ランダムな化学物質変異誘発により変異誘発され得る。別の特定の好適な実施形態では、親株はクローン化されたｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列に指向されたｒＤＮＡ技術によって変異誘発される。
【００６３】
（４．アミノ酸の産生のためののプロセス）
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。本発明は、一般的にアミノ酸Ｘの産生のためのプロセスを提供し、これは以下を含む：
アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、上記プロセスは、以下：
（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで上記微生物Ｃは、以下の方法：
（ｉ）デキストロースからパーセント収率Ｙの上記アミノ酸を産生する親微生物Ａを選択すること；
（ｉｉ）以下：
（１）ランダム化学的変異誘発；および
（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、上記微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性である、こと；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から少なくとも１つの微生物Ｃを選択することであって、上記微生物Ｃは、上記アミノ酸Ｘをデキストロースからパーセント収率Ｚで産生し、ここで上記パーセント収率Ｚは、パーセント収率Ｙより大きい、こと；
により得られる、工程；ならびに
（ｂ）上記微生物Ｃから産生される上記アミノ酸Ｘを回収する工程、
を包含する。
【００６４】
本発明の好適な実施形態は、培養される微生物を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｒｕｍ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉを含む群から選択するプロセスに引き出される。特に好適であるのは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｒｕｍ属の生物に引き出されるプロセスである。本発明プロセスのために選択される微生物は、目的のアミノ酸、特に非分枝鎖アミノ酸を産生するものである。さらに特に好適な微生物は、グリシン；アラニン；メチオニン；フェニルアラニン；トリプトファン；プロリン；セリン；スレオニン；システイン；チロシン；アスパラギン；グルタミン；アスパラギン酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン；およびヒスチジンを産生する微生物である。選り抜きのアミノ酸の産生レベルは、デキストロースからのパーセント収率を計算する以下の式によって簡便に決定し得る［（ｇ アミノ酸／Ｌ／（ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００。
【００６５】
本発明のプロセスにおいて使用される微生物は、選択される親株の変異誘発によって好適に得られる。本発明の好適な実施形態は、ゲノム全体に指向されるランダム変異誘発、または目的のクローン化されたＤＮＡのｒＤＮＡ変異誘発に、選択された親株が供されるプロセスを含む。
本発明の特に好適な実施形態において、親株は放射線処理、または化学物質処理による変異誘発を含むがそれに限定されない、ランダム変異誘発に供される。より特に好適な実施形態は、親株のランダム化学変異誘発に引き出される。
本発明の別の特に好適な実施形態は、親株のｒＤＮＡ変異誘発を提供する。より特に好適な実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発に引き出される。変異誘発されたｉｌｖＢＮオペロンまたはそのフラグメントの変異された形態は、当業者に周知である相同的組み換え技術を介して野生型のｉｌｖＢＮオペロン配列と置き換えられ得る（実施例６を参照のこと）。
しかし、選択された親株またはクローン化されたＤＮＡ配列は、変異誘発され、その結果として生ずる子孫は分枝鎖アミノ酸合成（すなわち、ロイシン、イソロイシンまたはバリン）の栄養要求性に関してスクリーニングされ、そして選択される。そのような変異体の選択は当業者に周知である。特に好適な実施形態は、バリンおよびイソロイシンの生合成に対する栄養要求性株に引き出される。
最終的には、本発明のプロセスの微生物の選択は、選り抜きのアミノ酸の産生に依存する。デキストロースからのパーセント収率を決めるために、式［（ｇ アミノ酸／Ｌ ／ ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００の式を利用し、所望する微生物が、選り抜きのアミノ酸のデキストロースからのパーセント収率が親株よりも高い点に基づいて選択される。
【００６６】
本発明の他の実施形態は、本発明の微生物を培養する特定の方法により変更するプロセスに引き出される。従って、アミノ酸産生に引き出される本発明プロセスにおいて行われ得る、種々の発酵技術が周知である。
適切な炭素源の例示的な例には、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜のような炭水化物；酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸およびフマル酸のような有機酸；およびグリセロールのようなアルコールが含まれるが、その限りではない。
適切な窒素源の例示的な例としては、アンモニアガスおよび液体アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムのような無機酸または有機酸のアンモニウム塩；ならびに、肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズ固形加水分解産物および酵母抽出物を含む他の窒素含有物が挙げられるがその限りではない。
【００６７】
一般的に、アミノ酸は商業的に本発明からバッチ型または流加型などの発酵プロセスにおいて産生され得る。バッチ型発酵において、発酵の開始時に全ての栄養素を添加する。流加型発酵または広い意味での流加型発酵においては、一つまたは多数の栄養素を、発酵開始すぐ、または培養がある一定の状態に達した後、または、添加される栄養素が培養液から使い果たされたとき、培養液に連続的に補給される。広義の流加型発酵のバッチの改変には、繰り返し流加型、またはフィルアンドドロー（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ）発酵があり、発酵槽の内容物の一部をある時点（例えば、発酵物が満たされたとき、栄養物の補給が続けられている間）で除去する。この方法において、発酵をより長時間に延長し得る。
【００６８】
発酵の別の型、連続的発酵、またはケモスタット培養は、完全培地の連続補給を使用するが、その一方で、発酵物におけるブロスの体積をほぼ同じに保つような方法で培養液を連続的または半連続的に回収する。連続的発酵は、原則的には、無限に維持され得る。
【００６９】
バッチ発酵において、培地中の必須栄養素のうちの一つが消費されつくすまで、または発酵状態が不適当になるまで（例えば、ｐＨが、微生物増殖を抑制する値にまで低下する）生物は増殖する。流加型発酵において、通常、適切な増殖条件を維持するために、例えばｐＨコントロールを用いて測定を行い、そして一つ以上の必須栄養素が、消費されつくされることを防ぐために、これらの栄養素を培養液中に供給する。微生物は、栄養素補給の割合により規定された増殖速度で増殖し続けるだろう。一般的に、単一栄養素は、殆どの場合炭素源であるが、増殖を制限するものとなるであろう。同じ原理は、連続発酵にも適用され、通常、培地中の単一栄養素は限られており、全ての他の栄養素は過剰である。限られた栄養素は、培養液体中に非常に低い濃度、しばしば、測定不能である程低濃度で存在するであろう。異なる型の栄養素制限が使用され得る。炭素源制限はもっとも頻繁に使用される。他の例としては、窒素源による制限、酸素による制限、ビタミンまたはアミノ酸のような特定の栄養素による制限（微生物がそのような化合物について栄養素要求性の場合）、硫黄による制限および亜リン酸による制限がある。
【００７０】
アミノ酸は当業者に周知の方法によって回収され得る。例示的な手順は、Ｖａｎ Ｗａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１２７−１３２（１９９７）および米国特許第３，５６５，９５１号で提供される。両文献とも本明細書中で参考として援用される。
【００７１】
本明細書中に引用される全ての特許および刊行物は明確に参考として援用される。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
（化学的変異誘発およびバリン栄養要求性株の選択）
リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＦ１００を、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７２ （Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７２ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で記載されているように、アルキル化剤により、変異誘発を行った。最小培地（ＭＭ）上にコロニーのレプリカを取った。ＭＭ上で増殖しなかったが完全培地（ＣＭ）で増殖したコロニーを栄養要求性株として同定した。Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンを補給した場合ＭＭ上で成長可能なそれらの栄養要求性株を、リシン収率解析を行うために選択した。
【００７３】
ＭＭは、１リットル中の、２０ｇのＤ−グルコース、１０ｇの硫酸アンモニウム、２．５ｇの尿素、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．４ｇのＭｇＳＯ4，７Ｈ2Ｏ・１ｇのＮａＣｌ、０．０１ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのパントテン酸、５０ｍｇのビオチン、２００ｍｇのチアミン、および５０ｍｇのナイアシンアミドから構成され、ｐＨ７．２であった。Ｌ−アミノ酸をＭＭの補助剤として用いた場合、５０ｍｇ／Ｌのそれぞれのアミノ酸を使用した。ＭＭＩＶは、イソロイシンおよびバリンを添加したＭＭであった。
【００７４】
親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した最小寒天培地上で化学的変異誘発によって産み出された高収率誘導体は、表１で示す。補助剤は、５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−アミノ酸であった。成長は、３０Ｃにて３日後の相対的コロニーサイズとして示す。
【００７５】
（実施例２）
（ｒＤＮＡ技術を用いた分枝鎖栄養要求性株の産生）
（１．欠損ｉｌｖＢ遺伝子の調製）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ＡＴＣＣ２１７９９）のｉｌｖＢＮオペロンをＰＣＲで増幅し、ｐＡＬ２０３を作製するためにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローニングした。ｉｌｖＢ遺伝子には、２つのＥｃｏＮＩ制限酵素部位により挟まれた３９０ｂｐの領域が含まれる。ＥｃｏＮＩは、プラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔを切断しない。ＥｃｏＮＩを用いてプラスミドｐＡＬ２０３を切断し、ｐＡＬ２０３ｄｅｌｔａを回収するようにセルフライゲーションさせることにより、ｉｌｖＢ欠損対立遺伝子を設計した。
【００７６】
（２．改変ｉｌｖＢＮ対立遺伝子のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体への相同的組み換え）
二重交差による対立遺伝子交換のためのベクターを、Ｍａｌｏｙら、１９９６（ＭａｌｏｙＳ．Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ Ｖ．Ｊ．，およびＴａｙｌｏｒ Ｒ．Ｋ．１９９６ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）により記述されているように構築した。ＡＴＣＣ３７７６６は、Ｅ．ｃｏｌｉ．中で複製するが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中では複製しないプラスミド、ｐＫ１８４の元となるものであった。ｓａｃＢ遺伝子をｐＪＣ３に挿入するために、ＳｓｐＩ部位にサブクローニングした。ｐＪＣ３は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し得ない。どのカナマイシン耐性コロニーも、相同的組み換えによりクローニングされた遺伝子内の部位に相同的組み換えを行うことにより染色体へ導入されたベクターを有する。導入されたベクターにおけるｓａｃＢ遺伝子の致死発現により、スクロース存在下での成長が阻害される。スクロース存在下での成長には、クローニングされた挿入断片の相同的領域に沿って生じる第二の交差が必要とされる。第一および第二の交差が、改変（欠損、部位突然変異）に隣接する場合、ｉｌｖＢＮの改変対立遺伝子は、宿主株の染色体上に存在する対立遺伝子と交換される。
【００７７】
ｐＡＬ２０３Δ由来のｉｌｖＢＮオペロンの改変対立遺伝子を、導入ベクターｐＪＣ３にサブクローニングし、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのＢＦ１００株に対して電気穿孔法を行い、スクロースを欠いているがカナマイシンを含むリッチ培地（ＤＭＫ）プレートに播種した。コロニーを採取し、スクロースおよびカナマイシンを含まないリッチブロス中で４８時間成長させた。培養液を、カナマイシンを欠くがスクロースを含むリッチプレート上に、ストリークした。シングルコロニーをスクロースプレートから採取し、ＤＭＫ，ＳＭ１，ＭＭおよびＭＭＩＶプレート上に、レプリカを取った。スクロース上で成長し得るもので、ＭＭ上では成長し得ないがＭＭＩＶ上で成長可能であるカナマイシン耐性を持たないコロニーを選択し、フラスコでの実験へと進めた。ＬＣ１０は、ＢＦ１００由来栄養要求性株である。
【００７８】
親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した一連の最小寒天プレート上での組み換えＤＮＡ法を用いて産生した高収率誘導体を、表２に示す。補助剤は、５０ｍｇ／ＬのＬ−アミノ酸である。成長は、３０Ｃにて３日後の相対的コロニーサイズとして示す。
【００７９】
（実施例３）
（ランダム化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−リシン収率の震盪フラスコ培養による分析）
ＳＭ１プレートからシングルコロニーを拾い、ＳＭ１ブロスに移すことによりＢ４Ｂ種菌を調製した。ＳＭ１は、水１Ｌ中に、５０ｇスクロース、３ｇＫ2ＨＰＯ4、３ｇ尿素、０．５ｇＭｇＳＯ4，７Ｈ2０、２０ｇポリペプトン、５ｇビーフ抽出物、０．９ｍｇＤ−ビオチン、３ｍｇチアミン、１２５ｍｇナイアシンアミド、０．５ｇＬ−メチオニン、０．２５ｇＬ−スレオニン、０．５ｇララニンを混合して調製し、ｐＨ７．３に調整した。プレートには２０ｇ／Ｌの寒天が含まれていた。ＳＭ１ブロス中で成長培養を１６時間行った後、等容量の３０％グリセロールを添加し、培養液を−８０Ｃにて凍結した。
【００８０】
２０ｍｌのＳＦＭが入ったバッフル付き２５０ｍｌシード震盪フラスコに、０．１ｍｌの解凍種菌を播種した。播種培地（ＳＦＭ）は、水１Ｌ中の、６０ｇ Ｄ−グルコース、３ｇ Ｋ2ＨＰＯ４、３ｇ 尿素、０．５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２０ｇ ポリペプト
ン、５ｇ ビーフ抽出物、３ｍｇ Ｄ−ビオチン、１２５ｍｇ ナイアシンアミド、０．５ｇ Ｌ―メチオニン、０．２５ｇ Ｌ−スレオニン、および０．５ｇ Ｌ−アラニンで構成され、ｐＨ７．３に調整した。培養物は、３０Ｃにて、１６時間成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通気した。種培養のうち２ｍｌを、２１ｍｌの発酵培地（ＦＭ４）の播種に使用した。ＦＭ４培地は、１６ｍｌの主要培地と５ｍｌのデキストロースストックを混合して調製した。デキストロースストックは、１８０ｇ Ｄ−グルコースに５００ｍｌの水を添加して調製した。主要培地には、１Ｌ中に、０．０８３ｇのＭｎＳＯ4、
０．４ｍｇ Ｄ−ビオチン、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、ラフィネートおよび５０ｇのＣａＣＯ3が含まれていた。ＦＭ４の最終容量が４％の乾燥固体になるようにコーンスティープを添加した。ＦＭ４の最終容量が５％硫酸アンモニウムになるようにラフィネートを添加した。３０Ｃにて、４８時間、２５０ｍｌのバッフル付き震盪フラスコで、培養物を成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通気を行った。
【００８１】
表３にて、震盪フラスコ中での、バリンおよびイソロイシン要求性に対する選択により向上させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生でのデータを示す。
【００８２】
（実施例４）
（ｒＤＮＡ法により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−リシン収率の震盪フラスコ測定）
表４にて、震盪フラスコ中での、ｉｌｖＢＮオペロンの染色体コピーから３９０塩基対のＤＮＡ配列のを欠失させることにより改善したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生におけるデータを示す（実施例２参照）。培養物を成長させ、実施例３に記載のように分析した。
【００８３】
（実施例５）
（バリン栄養要求性によるリシン収率の微小発酵測定）
２Ｌのバッフル付き震盪フラスコ中で、５００ｍＬ ＳＭ１で、１８時間、種菌を成長させた。３．１ＬのＦＭ４培地を、４Ｌ 微小発酵槽で使用した。温度およびｐＨを、３２Ｃおよび７．２にそれぞれ維持した。２０時間の時点で、フラスコの撹拌を７００ｒｐｍから９５０ｒｐｍに増加させた。４．５ＬＰＭで空気を供給した。デキストロースを、３ｇ／Ｌになるように維持した。発酵時間は、４８時間であった。
【００８４】
表５にて、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを合成し得ないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を用いた４リットル発酵装置中での、Ｌ−リシン産生におけるデータを示す。
【００８５】
（実施例６）
（クローン化ＩＬＶＢＮのＩｎ Ｖｉｖｏ変異誘発により産生されたブラディトローフによるＬ−リシン産生）
（１．機能的ＡＨＡＳ酵素を産生する、欠損型ｉｌｖＢＮオペロンの調製）
ｐＶＡＬ１を得るために、ｐＡＬ２０３のｉｌＶＢＮオペロンを、シャトルベクターｐＭ２にサブクローニングした。ｐＭ２は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方で複製し得る。ｐＶａｌＩを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．の変異誘発株ＸＬ１ＲＥＤに形質転換した。ＸＬ１ＲＥＤキット説明書に従って、変異誘発プラスミドを調製し、バリン栄養要求性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して電気穿孔法を行った。バリン栄養要求性株は、イソロイシンおよびバリン補給、または機能的ｉｌｎＢＮオペロンを用いた遺伝学的補足なしではＭＭプレート上で成長不可能である。
【００８６】
ＳＭ１プレートからカナマイシン耐性形質転換株を選択し、ＭＭプレート上にレプリカをとった。ＭＭプレート上で成長したそれらのコロニーは、ｉｌｎＢＮ欠損の機能的補完性を示した。親プラスミド（ｐＶＡＬ１）を持つバリン栄養要求性コロニーよりも小さいコロニーを、バリン栄養要求性活性アッセイを行うために選択した。ｐＲＶ１Ｂ５は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍで複製し得るｐＶＡＬ１に由来するプラスミドである。バリン栄養要求性株において、そのプラスミドが産生したＡＨＡＳ活性は、ｐＶＡＬ１により産生されたＡＨＡＳ特異的活性の１％未満であった。この構築物のｉｌｖＢＮオペロンは、漏出ＡＨＡＳ活性を有する。
【００８７】
（２．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体ＤＮＡへの相同的組み換え）
ｉｌｖＢＮオペロンのＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子を、導入ベクターｐＪＣ３にサブクローニングし、実施例２で行われたような相同的組み換えにより、バリン栄養要求性株において漏出対立遺伝子を欠損対立遺伝子に交換するために使用した。ＢＦ１００−１０３０は、ＲＶ１Ｂ５対立遺伝子を用いて構築されたバリンブラディトローフ株である。表６にて、ＢＦ１００−１０３０が震盪フラスコ中で、親株よりも少量しかバリンを産生しないことを表すデータを示す。表７にて、ＢＦ１００−１０３０ブラディトローフ株が表５の栄養要求性株に対して改善した成長を有することを示す。表７にて、また、ブラディトローフにより、微小発酵において親株よりも少量のバリンしか産生しないことを示す。
【００８８】
（表）
次の表で示すデータは、実施例セクションで考察している。用語「成長」は、６６０ｎｍで測定された光学密度をいい；用語「力価」は、１リットルあたりのアミノ酸のグラム数をいい；用語「収率」は、以下の式：［（ｇ リシン／Ｌ／（ｇ デキストロース消費／Ｌ］×１００によって定義されること；Ｂ４Ｂ＝化学的変異誘発により構築されたバリン栄養要求性株；ＬＣ１０＝染色体ｉｌｖＢ遺伝子を、ｐＡＬ２０３ΔのｉｌｎＢ欠損対立遺伝子と置換することにより構築されたバリン栄養要求性株；ＢＦ１００−１０３０＝染色体ｉｌｎＢ遺伝子を、ＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子と置換することにより構築されたバリンブラディトローフであることに注意すること。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
【表３】
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】
【表８】
【００９７】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明分野）
本発明は、微生物遺伝学および組み換えＤＮＡ技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、アミノ酸の発酵産生に関する。本発明により、アミノ酸産生に有用な微生物、アミノ酸産生を向上させる方法、およびアミノ酸産生プロセスが提供される。
【０００２】
（関連分野）
発酵によるアミノ酸産生は、糖密、酢酸およびエタノールなどの廉価な炭素源からの安価な産生を可能とする。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａがアミノ酸の工業生産に有用である（Ｓ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２：４６４−４６８（１９５７））という認識に従って、発酵プロセスによるアミノ酸の商業生産が、変異株の分離を用いてより実施可能になった。アミノ酸産生の微生物プロセスで用いられる微生物を４つのクラスに分類し得る：野生型株、栄養要求性変異株、調節変異株および栄養要求性調節変異株（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ ＯＦ ＦＯＯＤ ＡＮＤ ＦＥＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｍ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編、（１９７８）、ｐｐ．６４９−６６１）。発酵により産生されたアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較して、微生物プロセスによるアミノ酸産生を優位なプロセスとし；微生物プロセスにより産生されるアミノ酸は、通常Ｌ−型である。
【０００３】
Ｌ−リシンは、工業的発酵により産生されるアミノ酸の一例である。この必須アミノ酸の商業的産生は、グラム陽性微生物であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Ｋｌｅｅｍａｎｎ，Ａら、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＵＬＬＭＡＮ‘Ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．Ａ２，ｐｐ．５７−９７、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（１９８５））を利用して主に行なわれ；累積的に、これら３つの微生物は現在、一年間におよそ２５０，０００トンのＬ−リシンを産生すると報告されている。
【０００４】
発酵プロセスによるＬ−リシン産生の経済的重要性があるなら、生産コストを下げると同時に、産生される総量を増加させることが有用であろう。それを目標として、Ｌ−リシン合成の生化学的経路が集中的にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（最近、Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）によってレビューされた）において研究されている。リシン経路への入り口は、Ｌ−アスパラギン酸で始まる（図１参照）。Ｌ−アスパラギン酸自身は、オキサロ酢酸のアミノ基転移により産生される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特殊な性質は、リシン中間体ピペリジン２，６−ジカルボキシレートを二つの異なるルートで、すなわち、スクシニル化中間体に関する反応によってか、またはジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの単一反応によって、ジアミノピメリン酸に変換するその能力である。全体的に見ると、経路への炭素流量は、２点で調節される：第一に、Ｌ−スレオニンおよびＬ−リシン両方のレベルによるアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害によるもの、第二は、ジヒドロジピコリン酸合成レベルの調節によるものである。従って、これら２つの酵素の活性を調節解除および増加させることにより、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおいてＬ−リシン産生を増加させ得る。
【０００５】
Ｌ−リシン合成を導く生化学的経路に加えて、最近の証拠は、細胞から媒質へのリシン輸送に関する考察が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリシン過剰産生株の開発において考慮されるべき別の条件であるということを示す。Ｋｒａｍｅｒおよびその同僚による研究は、易漏出性の膜の性質の結果として起こる細胞からの受動的輸送だけで、リシン流出が説明されるものではないことを示す；これらのデータは、以下のような性質を持つ特定のキャリアを示唆する：（１）トランスポーターは、リシンに対するかなり高いＫｍ値（２０ｍＭ）を有する；（２）トランスポーターは、ＯＨ-共輸送系（取り込み系は、Ｈ+対向輸送系である）および（３）トランスポーターは正に荷電しており、膜電位が分泌を刺激する（Ｓ．ＢｒｏｅｒおよびＲ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：１３７−１４３（１９９１））。
【０００６】
栄養要求性または抵抗性の性質について分離された様々な株を利用したいくつかの発酵プロセスが、Ｌ−リシン産生に関して当該分野において公知である：米国特許第２，９７９，４３９号は、ホモセリン（またはメチオニンおよびスレオニン）要求性の変異体を開示し；米国特許第３，７００，５５７号は、スレオニン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、シスチン、またはシステインについて栄養要求性を有する変異株を開示し；米国特許第３，７０７，４４１号は、リシンアナログに対して抵抗性を持つ変異体を開示し；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リシン産生能力およびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する抵抗性の両方を有する変異株を開示し；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、スレオニン、スレオニンおよびメチオニン、ロイシン、イソロイシンまたはそれらの組み合わせについて栄養要求性を有し、かつリシン、スレオニン、イソロイシンまたはそれらのアナログに対する抵抗性を有する変異体を開示し；米国特許第３，８２５，４７２号は、リシンアナログに対する抵抗性を有する変異株を開示し；米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リシンを産生し、かつアスパラギン酸アナログおよびサルファ剤の少なくとも一つに対して抵抗性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異株を開示し；米国特許第５，８４６，７９０号は、ビオチン作用抑制剤非存在化でＬ−グルタミン酸およびＬ−リシンを産生し得る変異株が開示し；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース、２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノースまたはその誘導体に対して抵抗性を持つ、Ｌ−リシンの産生に関して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に分類される株を開示する。
【０００７】
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａのＬ−リシン発酵産生の分野における、より最近の発展は、リシン産生を増大させるための分子生物学技術の使用と関連がある。以下の例は、本技術の典型的な例として提供されるものである：米国特許出願番第４，５６０，６５４号および同第５，２３６，８３１号は、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対して感受性のあるホストＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物に対して、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対する抵抗性およびリシン産生能の両方を付与するＤＮＡフラグメントをベクターＤＮＡに挿入した組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転換することにより得られるＬ−リシン産生変異株を開示し；米国特許出願第５，７６６，９２５号は、ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌（Ｌ−リシンおよびＬ−スレオニンにより脱感作されるフィードバック阻害を有する）由来のアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを有するＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失したＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌の染色体ＤＮＡに組み込むことにより産生される変異株を開示する。
【０００８】
Ｌ−リシンに加えて、他のアミノ酸、例えば、分枝鎖アミノ酸であるＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン産生にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび関連生物が有用である。分枝鎖アミノ酸生合成に至る生化学的経路もまた良く研究されている。アスパラギン酸経路への炭素流量は、Ｌ−イソロイシン産生に利用されうる、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニン産生に送り込まれうる（図１Ｂ）。５つの反応により、Ｌ−スレオニンからＬ−イソロイシンが産生される。すなわち、これらの反応を触媒する酵素には、次のものが含まれる。（１）スレオニンデヒドラターゼ、（２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ、（３）イソメロレダクターゼ、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、および（５）トランスアミナーゼＢ、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソロイシン合成特有である、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素は、また他の分枝鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。スレオニンからイソロイシンへの炭素流量は、スレオニンデヒドラターゼおよびアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）により制御される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるイソロイシン経路の酵素をコードする遺伝子（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤおよびｉｌｖＥ）クローニングを利用して（Ｃ．Ｃｏｒｄｅｓら、Ｇｅｎｅ １１２：１１３−１１６（１９９２）；Ｂ．Ｍｏｅｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：８０６５−８０７２（１９９２）および、Ｃ．Ｋｅｉｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９９３））、新規株を作製するために組み換えＤＮＡ技術を適用し得る。
【０００９】
分枝鎖アミノ酸生合成経路における酵素活性の向上によるアミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの産生における発展について説明されている。さらに、ｉｌｖＢＮオペロンによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性の改善による分枝鎖アミノ酸産生における改善について説明されている。（概要として、Ｈ．Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）を参照）。
【００１０】
分枝鎖アミノ酸産生の例示的なプロセスには、次のものが含まれる。米国特許第５，１８８，９４８号において、ポリケチドに対して抵抗性である微生物を利用したＬ−バリン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第５，５２１，０７４号において、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物を利用したＬ−バリン産生のためのプロセスが開示されている。これらの微生物は、ａ）バリン産生能、ｂ）唯一の炭素源として酢酸を含む培地中における、Ｌ−バリンに対する抵抗性、およびｃ）唯一の炭素源としてグルコースを含む培地中における、ピルビン酸アナログに対する感受性を示す。米国特許第４，６０１，９８３号において、コリネフォルム細菌において複製可能で、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン産生に使用されるホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持つ蛋白質産生をコードする遺伝子配列が開示されている。米国特許第４，４４２，２０８号において、組み換えＤＮＡ技術によって得られた、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸抵抗性を持つＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を利用した、Ｌ−イソロイシン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第４，６５６，１３５号において、Ｌ−イソロイシン産生のためのプロセスが開示されている。このプロセスには、メチルリシン抵抗性またはα−ケトマロン酸抵抗性を持ち、液体培地中でＬ−イソロイシン産生し得、その液体培養液から蓄積したＬ−イソロイシンを回収しうるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の培養が含まれる。米国特許第５，１１８，６１９号において、Ｄ−ラクテートを利用する変異体による、Ｄ，Ｌ−α−ヒドロキシブチレートからのＬ−イソロイシン発酵産生のための方法が開示されている。米国特許第５，７６３，２３１号において、Ｌ−ロイシン産生のためのプロセスが開示されている。このプロセスは、培養培地中でのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属株をインキュベーションする工程および、得られた細胞をサッカリドおよび酢酸またはその塩と反応させて、反応溶液中でＬ−ロイシンを形成かつ蓄積させる工程を包含する。および、米国特許第３，９７０，５１９号において、ロイシンまたはそのアナログによるフィードバック阻害に対して抵抗性を持ち、Ｌ−ロイシンを産生するための増殖栄養としてイソロイシン、スレオニンまたはメチオニンのうち少なくとも一つを必要とする株が開示されている。
【００１１】
バリン産生減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。
【００１２】
ＡＨＡＳ活性減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によって以下が提供される：
（１）アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃであって、ここで該微生物Ｃは、以下の工程：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法により得られる、微生物Ｃ。
（２） 項目１に記載の微生物Ｃであって、ここでアミノ酸Ｘは、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、微生物Ｃ。
（３） 微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目２に記載の微生物Ｃ。
（４） 微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目３に記載の微生物Ｃ。
（５） 工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目３に記載の微生物Ｃ。
（６） 工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異的変異誘発である、項目３に記載の微生物Ｃ。
（７） 微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株であって、該株は、以下の特徴：
（ａ）分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンの１つ以上についての栄養要求性またはブラディトローフ性；
（ｂ）培地で培養される場合、以下：
（ｉ）グリシン；
（ｉｉ）アラニン；
（ｉｉｉ）メチオニン；
（ｉｖ）フェニルアラニン；
（ｖ）トリプトファン；
（ｖｉ）プロリン；
（ｖｉｉ）セリン；
（ｖｉｉｉ）トレオニン；
（ｉｘ）システイン；
（ｘ）チロシン；
（ｘｉ）アスパラギン；
（ｘｉｉ）グルタミン；
（ｘｉｉｉ）アスパラギン酸；
（ｘｉｖ）グルタミン酸；
（ｘｖ）リジン；
（ｘｖｉ）アルギニン；および
（ｘｖｉｉ）ヒスチジン、
からなる群からら選択されるアミノ酸を産生すること；ならびに
（ｃ）少なくとも３０％である、デキストロースからの工程（ｂ）のアミノ酸のパーセント収率を生じること、
を有する、株。
（８） 前記ｉｌｖＢＮオペロンにおける変異によりさらに特徴付けられる、項目７に記載の微生物。
（９） 前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、欠失、挿入または点変異である、項目８に記載の微生物。
（１０） 前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、配列番号３または配列番号５の配列により特徴付けられる、項目９に記載の微生物。
（１１） ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１４９の同定特徴を有する微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
（１２） ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１５０の同定特徴を有する微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
（１３） アミノ酸Ｘの産生を増加する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発させて、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
（１４） 前記アミノ酸Ｘが、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（１５） 前記微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（１６） 前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目１５に記載の方法。
（１７） 工程（ｂ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目１５に記載の方法。
（１８） 工程（ｂ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異的変異である、項目１５に記載の方法。
（１９） アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで該微生物Ｃは、以下：
（ｉ）デキストロースから収率Ｙパーセントの該アミノ酸を産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｉｉ）以下：
（１）ランダム化学変異誘発；および
（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性である、工程；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から栄養要求性である少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、該微生物Ｃは、該アミノ酸Ｘをデキストロースから収率Ｙパーセントで産生する、工程、
を包含する方法により得られる、工程；
（ｂ）該微生物Ｃから産生される該アミノ酸Ｘを回収する工程、
を包含する、プロセス。
（２０） 前記アミノ酸Ｘが、以下：
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）トレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン；
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；および
（ｑ）ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目１９に記載のプロセス。
（２１） 前記微生物Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および
（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、項目２０に記載のプロセス。
（２２） 前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目２１に記載のプロセス。
（２３） 前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目２１に記載のプロセス。
（２４） 前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢｎオペロンの部位特異的変異誘発である、項目２１に記載のプロセス。
（本発明の要旨）
本発明の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物を提供することである。変換効率は次の式により定量され得る。
すなわち、［（ｇ 産生されたアミノ酸／ｇ 消費されたデキストロース）×１００］＝パーセント収率およびデキストロースからの収率として表される。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、変異誘発により一つ以上の分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性に改変され、所望するアミノ酸に対して、親株よりも高いパーセント収率を生じるという能力について選択された微生物を提供する。
【００１５】
より具体的な、ランダム化学変異誘発に親株を供することにより得られた微生物を提供する本発明の実施形態において、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である変異誘発された変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換可能な変異株を選択する。別の具体的な本発明の実施形態は、ｉｌｖＢＮオペロンの核酸配列における改変（すなわち、変異）を導入するために、ｒＤＮＡ法を利用し、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフである変異誘発変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換可能な改変体を選択して得られる微生物を提供する。
【００１６】
好適な実施形態において、本発明微生物はＬ−リシンを産生する。その他の好適な本発明の実施形態は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物を指向し、そして特に好適な微生物は、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物である。最も好適な実施形態において、微生物は、ＮＲＲＬ番号Ｂ−３０１４９（ＬＣ１０としても知られている）またはＮＲＲＬ番号Ｂ−３０１５０（ＢＦ１００−１０３０としても知られている）という同定特徴を有し、これらの株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ ＵＳＡに１９９９年６月２９日に寄託された。
【００１７】
本発明の別の目的は、親株の変異誘発、一つ以上の分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性である細胞の選択、および所望するアミノ酸の親株よりも高いデキストロースからのパーセント収率で産生する分枝鎖アミノ酸栄養要求性の選択によりアミノ酸産生を増加させる方法を提供する。
【００１８】
好適な実施形態において、本方法は、ランダム化学変異誘導または組み換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術を用いて一つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンまたはバリンに対して栄養要求性またはブラディトローフであるように改変されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養から得られる、デキストロースからのアミノ酸Ｌ−リシンの収率の向上を指向する。
【００１９】
１つの特定の実施形態において、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの化学変異誘発の結果である。代替の具体的な実施形態において、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、ｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペロンの変異誘発の結果である。
【００２０】
本発明の別の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物によるアミノ酸産生プロセスを提供することである。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、培地中での、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフであるように親株を誘発し、そして、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することより得られた微生物を培養する工程を包含するアミノ酸産生プロセスを提供する。
【００２２】
本プロセスの好適な実施形態において、親株をランダム化学変異誘発に供し、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である変異を誘発された改変体を単離し、そして親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することにより、発酵に利用される微生物が得られる。本プロセスにおけるその他の好適な実施形態において、ｒＤＮＡ法によりｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列を変化させ（つまり、変異の導入）、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフである変異を誘発された変異体を分離し、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することにより、発酵に利用される微生物を得る。
前記の一般的記述および次の詳細な記述は例示的であり、かつ例示のみであり、特許請求の範囲のとおりの本発明のさらなる説明を提供することを意図されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−リシン産生を導く生化学的経路の略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−イソロイシン産生に至る生化学的経路概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの、ｉｌｖＢＮオペロンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体についてのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（好適な実施形態の詳細な説明）
（１．定義）
明細書および特許請求の範囲の明確で矛盾のない理解を提供するために、これらの語が使われるべき範囲を含めて、次の定義を提供する。
【００２５】
栄養要求性株：本明細書中で使用される場合、栄養要求性株なる語は、増殖するために、獲得遺伝的欠損のために合成不可能な、特定の代謝物質の外的な源を必要とする微生物株を意味する。
【００２６】
アミノ酸補充：本明細書中で使用される場合、「アミノ酸補充」なる語は、成長に必要とされ、栄養要求性成長を助けるために最小培地に添加されるアミノ酸を意味している。
【００２７】
ブラディトローフ：本明細書中で使用される場合、ブラディトローフなる語は、特異的な代謝物質の外的な源がない状態において遅い成長を示す微生物株を意味している。ブラディトローフ微生物は、代謝物質を合成しうるが、獲得遺伝的欠損のために、合成速度が親株での同じ代謝物質の合成速度よりも遅い。
【００２８】
分枝アミノ酸：本明細書中で使用される場合、この語は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンなど、Ｒ基が分枝した炭素構造を持つアミノ酸を意味している。
【００２９】
炭素流動：本明細書中で使用される場合、この語は、生体内の両方向性、異化作用性および／または同化作用性の生化学的合成的経路の間の炭素の移動を意味している。
【００３０】
染色体組込み：本明細書中で使用される場合、この語は、外因性ＤＮＡ断片の、宿主生物染色体への挿入を意味している。より具体的には、この語は、外因性ＤＮＡ断片と宿主細胞染色体との適切な領域間の相同的組み換えを意味するものとして使用される。
【００３１】
高収率誘導体：本明細書中で使用される場合、この語は、その誘導体が由来する親株と比較した場合、高い収率で、デキストロースから特異的なアミノ酸を産生する微生物株を意味している。
【００３２】
変異：本明細書中で使用される場合、この語は、目的のヌクレオチド配列における、単一塩基対変化、挿入または欠失を意味している。
【００３３】
オペロン：本明細書中で使用される場合、この語は、構造遺伝子および調節エレメントを含む、ＤＮＡにおける細菌遺伝子発現および調節の単位を意味している。オペロンに含まれる調節エレメントの例には、プロモーターおよびオペレーターが含まれるがこれに限定されない。
【００３４】
親株：本明細書中で使用される場合、この語は、本発明の微生物を得るためにある形態の変異誘発に供される微生物株を意味している。
【００３５】
デキストロースからの収率パーセント：本明細書中で使用される場合、この語は、次の式で定義されるデキストロースからのアミノ酸収率を意味している。すなわち、
［（ｇ 産生されたアミノ酸／ｇ 消費されたデキストロース）×１００］＝％収率、である。
【００３６】
表現型：本明細書中で使用される場合、この語は、微生物の遺伝的構成に依存した、識別できる形質的特徴を意味している。
【００３７】
相対的成長：本明細書中で使用される場合、この語は、規定された期間にわたって、規定された培養液中で、親株の成長と子孫株の成長を直接的に比較することによって、成長の評価を提供する測定を意味している。
【００３８】
変異誘発：本明細書中で使用される場合、この語は、ＤＮＡにおいて変異が発生するプロセスを意味している。「ランダム」変異誘発を用いて、変異の正確な部位を予想することはできず、微生物ゲノムのどこでも起こり、また、放射線照射または化学処理などの因子により引き起こされる物理的損傷の結果として変異が引き起こされる。ｒＤＮＡ変異誘発は、クローニングされた目的のＤＮＡを指向し、それはランダムまたは部位特異的なものでありうる。
【００３９】
（２．分枝鎖アミノ酸合成に対する炭素流量の減少、および非分枝型アミノ酸産生の増加に基づいた本発明の微生物）
本発明は、概して、炭素流動を非分枝鎖アミノ酸合成に向けるために、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の作製を提供する。より具体的に、ロイシン、イソロイシンまたはバリンなどの、一つ以上の分枝鎖アミノ酸（例えば、イソロイシンおよびバリン）を必要とする特異的な栄養要求性表現型を選択するか、またはイソロイシン、ロイシンおよびバリン合成への炭素流量を減少させるｉｌｖＢＮオペロンにおける変異を設計することにより、この系の炭素流動を、他の代謝経路（例えば、Ｌ−リシン合成）で利用できるようにし得る。
【００４０】
１つの特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃを提供する。ここで、この微生物Ｃは、次の方法によって得られる：
（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学変異誘発；および
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；
からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚパーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
【００４１】
デキストロースからの収率パーセントは、好適には、式［（ｇ 産生されたアミノ酸／Ｌ ／ ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）×１００］を用いて計算される。
【００４２】
親微生物は、アミノ酸Ｘを産生しうる、当該分野で既知の任意の微生物からも選択されうる。特に好適な親微生物は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである。
【００４３】
本発明の株は、当業者にとって既知で利用可能な任意の方法および技術によっても、調製され得る。本発明細菌株の構築に適した方法の例には、次のものが含まれるが、これに限らない：Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような適した薬剤を用いた変異誘発；線状ＤＮＡ断片の形質転換および相同的組み換えを介した遺伝子組込み技術；およびバクテリオファージを介した形質導入。これらの方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．Ｓｉｎｇｅｒ およびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ ＆Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ． Ｇｌｉｃｋ およびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；およびＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）において説明されている。
【００４４】
（Ａ．ランダム変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の構築）
本発明のある具体的で好適な実施形態により、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン生合成に共通の酵素的ステップの改変が、デキストロースからのＬ−リシンのパーセント収率を向上させ得ることを提供する。
【００４５】
最も好適な実施形態において、本発明は、親株に対するランダム変異誘発を行い、その後特定の表現型を選択することより、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の産生を提供する。変異誘発を行うために選択した親株は、目的のアミノ酸を産生することが知られている任意の株でもあり得る。好適な生物には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が含まれ、最も好適な生物には、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が含まれる。
【００４６】
親株は、当該分野で既知の任意のランダム変異誘発を用いて、変異誘発され得る。これには、放射線照射および化学的方法が含まれるがこれに限らない。特に好適なものは、ランダム化学的変異誘発であり、最も好適なものは、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２））によって記述されているアルキル化剤法である。
【００４７】
例として、次のように化学的変異誘発を行った。リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の培養は、富化培地中で、３０℃にて、吸光度が６．０に達するまで行った。細胞を、最小培地で洗浄し、１００ｍｇ／ｍｌのＮＴＧを含む最小培地で再懸濁した。細胞を、突然変異原に、３０℃で３０分間曝露した。細胞を最小培地で洗浄し、富化培地に播種した。富化培地および最小培地上に、富化培地で生じたコロニーのレプリカをとった。富化培地上で生育したが最小培地上では生育しなかったコロニーを、栄養要求性株として分類した。栄養要求性変異体に対して、最小培地および、１０ｍＭＬイソロイシンおよび１０ｍＭＬ−バリンを含む最小培地上にレプリカをとった。イソロイシンおよびバリンによりレスキューされたコロニーを、バリン栄養要求性株として分類した。株Ｂ４Ｂは、化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株である。
【００４８】
（Ｂ．ｒＤＮＡ方法論を介した変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の構築）
本発明のその別の具体的な好適な実施形態は、分枝鎖アミノ酸の生合成に重要なタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏ 変異誘発をもたらすために、組み換えＤＮＡ技術を利用する。次いで、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性で、親株よりも高収率でデキストロースから非分枝鎖アミノ酸を産生する変異株を作製することを目的として、親株を改変するために変異されたＤＮＡを使用し得る。
【００４９】
ある具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡが、当該分野で既知の任意の方法によっても組み換えＤＮＡ技術を介して変異され得る。当業者によって既知であろうように、クローン化ＤＮＡにおける変異は、単一のヌクレオチド変化（点変異）、多重ヌクレオチド変化、ヌクレオチド欠損または挿入を含み得る。組み換えＤＮＡ技術の一般的方法は、当業者により既知であり、例えば、核酸精製、制限酵素消化、ライゲーション、遺伝子クローニング、遺伝子配列決定、遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）などの基礎技術を記載する多くの一般の実験マニュアルにおいて見出され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９４）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲプロトコール）、 Ｉｎｎｉｓら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４０７−４１５頁（１９９０）を参照すること。）
さらに、クローン化ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発を具体的に示す参考文献は、当業者により既知である。例えば、部位指向性変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム化学的変異誘発、カセット変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびその他の方法が、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）において詳しく説明されている。
【００５０】
別の具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡは、ホスト細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏで変異を起こし得る。このタイプの「ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発」には、一つ以上のＤＮＡ修復経路に変異を持つＥ．ｃｏｌｉ株のＤＮＡの増殖によって、目的の任意のクローン化ＤＮＡにおけるランダム変異を作り出すプロセスが含まれる。これらの「変異誘発遺伝子（ｍｕｔａｔｏｒ）」株は、野生型の親株よりも高いランダム変異頻度を持つ。これらの株の一つにおけるＤＮＡの生育により、ＤＮＡ中でランダム変異が作り出される。これを行うために設計された系は、当業者にとって既知であり、そして商業的に利用し得る。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．により、そのＤＮＡ修復遺伝子（ＭｕｔＨ，ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳ）が欠失され、その結果短時間で多くの異なる変異が起こるＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１ Ｒｅｄ Ｓｔｒａｉｎを利用した系が提供される。１０，０００までの変異が３０時間に起こり得、その結果当該分野で既知の方法により変異ＤＮＡから完全な変異ＤＮＡライブラリーを用意し得る。
【００５１】
変異のために選択されたクローン化ＤＮＡは、分枝鎖アミノ酸合成に重要であるとして当該分野で既知である任意の配列でもあり得る。その配列には、合成に重要な一つ以上の酵素、または輸送および排出に重要な一つ以上のタンパク質産物をコードする配列が含まれるがそれに限らない。最も好適なものは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンの、クローン化配列である。分枝鎖アミノ酸合成に関係するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子がクローニングされている。例えば、イソロイシン経路に対して遺伝子配列が利用できる（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤおよびｉｌｖＥ）。（Ｃ．Ｃｏｒｄｅｓら、Ｇｅｎｅ１１２：１１３−１１６（１９９２）；Ｂ．Ｍｏｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４：８０６５−８０７２（１９９２）；およびＣ．Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９９３））。
【００５２】
Ｌ−スレオニンから、５つの反応でＬ−イソロイシンが産生される。これらの反応を触媒する酵素は、（１）スレオニンジヒドラターゼ（ｉｌｖＡ）、（２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢ）、（３）イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ）、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、および（５）トランスアミナーゼＢ（ｉｌｖＥ）、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソロイシン合成に特有な、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素はまた、他の分枝鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株におけるイソロイシン生合成に関係する酵素経路は図２で表される。
【００５３】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびイソメロレダクターゼ（ＩＲ）は、イソロイシン、バリン、ロイシンおよびパントテナートに対して、代謝物の流れにおいて続いて起こる反応を触媒する。他の細菌でのように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株のＡＨＡＳは、二つの遺伝子ｉｌｖＢおよびｉｌｖＮによりコードされている。遺伝子分断により、これらの遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて単一のＡＨＡＳ活性をコードしていることが実証された（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ，Ｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５５９５−５６０３（１９７３））。３．９，２．３および１．１ｋｂの３個の転写産物が、ノーザンブロット解析により、ｉｎ ｖｉｖｏで同定された。それらは、それぞれｉｌｖＢＮＣ、ｉｌｖＮＣ、ｉｌｖＣメッセンジャーと対応する。ｉｌｖＣ転写産物（ＩＲをコードする）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｉｌｖオペロンからの最も量の多い転写産物である。さらなる解析により、このオペロンで３個のプロモーターが活性であること、ｉｌｖＢＮＣおよびｉｌｖＮＣメッセンジャーの定常レベルが著しく単一ＡＨＡＳの全体としての活性に寄与していることが示されている。
【００５４】
最も好適な本発明の実施形態において、クローン化ｉｌｖＢＮオペロンＤＮＡ配列内で欠損を作り出すことを目的として、制限酵素消化により、変異を作製し得る。次に、変異誘発されたｉｌｖＢＮ配列を、相同的組み換えにより、野生型配列と置き換え、分枝鎖アミノ酸に対する栄養要求性に関してスクリーニングし得る。
【００５５】
その他の本発明の実施形態は、一つ以上の分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンに対する栄養要求性を示し、そしてデキストロースから、親株のパーセント収率よりも高い、目的のアミノ酸のパーセント収率を産み出す微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに引き出される。特に好適な実施形態において、産生されるアミノ酸は、Ｌ−リシンである。
【００５６】
本発明の他の非常に好適な実施形態は、実質的にＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４９またはＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１５０の性質全てを持つ微生物に引き出される。
【００５７】
（３．アミノ酸の産生を増加させる方法）
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生を増加させる方法を提供する。本発明は、アミノ酸Ｘの産生を増加させる方法を広く提供する。その方法が以下：
（ａ）デキストロースから上記アミノ酸をパーセント収率Ｙで産生する親微生物Ａを選択する工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）ランダム化学的変異誘発；およひ
（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、該微生物Ｂは、１つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンについて栄養要求性である、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から、パーセント収率Ｚでデキストロースから上記アミノ酸Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択することであって、ここで上記パーセント収率Ｚは、上記パーセント収率Ｙよりも大きい、工程、
を包含する。
【００５８】
ある特に好適な実施形態において、デキストロースから決定されたパーセント収率で目的のアミノ酸を産生する、該当分野で既知である任意の株が、親株として選択され得る。デキストロースからのパーセント収率は、次の式を用いて簡便に計算され得る［（ｇアミノ酸／Ｌ／（ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００。
【００５９】
この生物を選択し、アミノ酸のデキストロースからの（パーセント収率を決定した後、好適には、生物のゲノム全体に指向されたランダム変異誘発技術、または目的のクローン化ＤＮＡに対して指向されるｒＤＮＡ技術、のいずれかにより、変異誘発に供される。用いた変異誘発の特定の方法に関わらず、変異された生物をスクリーニングし、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性に基づいて選択される。次いで、どの株がデキストロースから所望されるアミノ酸を親株よりも高いパーセント収率で産生するかを決定するために、選択された栄養要求性株をスクリーニングし得る。
【００６０】
本発明の種々の実施形態は、生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，およびＥ．ｃｏｌｉ．から目的のアミノ酸産生を増加させる方法を含む。さらに、特定の実施形態に依存して、本発明は、グリシン；アラニン；メチオニン；フェニルアラニン；トリプトファン；プロリン；セリン；スレオニン；システイン；チロシン；アスパラギン；グルタミン；アスパラギン酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン；およびヒスチジンなどの非分枝鎖アミノ酸の産生を増加する方法を提供する。
【００６１】
好適な実施形態において、本発明は、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性株を作り、炭素の流れをロイシン、イソロイシンおよびバリンの合成から転用することによって非分枝鎖アミノ酸産生を増加する方法を提供する。特に好適な実施形態は、変異誘発された親株から、バリンおよびイソロイシン合成に対して栄養要求性である株を選択することによってアミノ酸の産生を増加する方法に引き出される。
【００６２】
本発明は、アミノ酸の生産を増加するための方法について、種々の好適な実施形態をさらに提供し、ここで親株は、ランダムな変異誘発技術（例えば、放射線変異誘発または化学物質変異誘発）、またはｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペロンの変異誘発のいずれかにより、変異誘発され得る。１つの特定の好適な実施形態において、親株は、ランダムな化学物質変異誘発により変異誘発され得る。別の特定の好適な実施形態では、親株はクローン化されたｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列に指向されたｒＤＮＡ技術によって変異誘発される。
【００６３】
（４．アミノ酸の産生のためののプロセス）
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。本発明は、一般的にアミノ酸Ｘの産生のためのプロセスを提供し、これは以下を含む：
アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、上記プロセスは、以下：
（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで上記微生物Ｃは、以下の方法：
（ｉ）デキストロースからパーセント収率Ｙの上記アミノ酸を産生する親微生物Ａを選択すること；
（ｉｉ）以下：
（１）ランダム化学的変異誘発；および
（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂを産生させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工程であって、上記微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性である、こと；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から少なくとも１つの微生物Ｃを選択することであって、上記微生物Ｃは、上記アミノ酸Ｘをデキストロースからパーセント収率Ｚで産生し、ここで上記パーセント収率Ｚは、パーセント収率Ｙより大きい、こと；
により得られる、工程；ならびに
（ｂ）上記微生物Ｃから産生される上記アミノ酸Ｘを回収する工程、
を包含する。
【００６４】
本発明の好適な実施形態は、培養される微生物を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｒｕｍ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉを含む群から選択するプロセスに引き出される。特に好適であるのは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｒｕｍ属の生物に引き出されるプロセスである。本発明プロセスのために選択される微生物は、目的のアミノ酸、特に非分枝鎖アミノ酸を産生するものである。さらに特に好適な微生物は、グリシン；アラニン；メチオニン；フェニルアラニン；トリプトファン；プロリン；セリン；スレオニン；システイン；チロシン；アスパラギン；グルタミン；アスパラギン酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン；およびヒスチジンを産生する微生物である。選り抜きのアミノ酸の産生レベルは、デキストロースからのパーセント収率を計算する以下の式によって簡便に決定し得る［（ｇ アミノ酸／Ｌ／（ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００。
【００６５】
本発明のプロセスにおいて使用される微生物は、選択される親株の変異誘発によって好適に得られる。本発明の好適な実施形態は、ゲノム全体に指向されるランダム変異誘発、または目的のクローン化されたＤＮＡのｒＤＮＡ変異誘発に、選択された親株が供されるプロセスを含む。
本発明の特に好適な実施形態において、親株は放射線処理、または化学物質処理による変異誘発を含むがそれに限定されない、ランダム変異誘発に供される。より特に好適な実施形態は、親株のランダム化学変異誘発に引き出される。
本発明の別の特に好適な実施形態は、親株のｒＤＮＡ変異誘発を提供する。より特に好適な実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発に引き出される。変異誘発されたｉｌｖＢＮオペロンまたはそのフラグメントの変異された形態は、当業者に周知である相同的組み換え技術を介して野生型のｉｌｖＢＮオペロン配列と置き換えられ得る（実施例６を参照のこと）。
しかし、選択された親株またはクローン化されたＤＮＡ配列は、変異誘発され、その結果として生ずる子孫は分枝鎖アミノ酸合成（すなわち、ロイシン、イソロイシンまたはバリン）の栄養要求性に関してスクリーニングされ、そして選択される。そのような変異体の選択は当業者に周知である。特に好適な実施形態は、バリンおよびイソロイシンの生合成に対する栄養要求性株に引き出される。
最終的には、本発明のプロセスの微生物の選択は、選り抜きのアミノ酸の産生に依存する。デキストロースからのパーセント収率を決めるために、式［（ｇ アミノ酸／Ｌ ／ ｇ 消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００の式を利用し、所望する微生物が、選り抜きのアミノ酸のデキストロースからのパーセント収率が親株よりも高い点に基づいて選択される。
【００６６】
本発明の他の実施形態は、本発明の微生物を培養する特定の方法により変更するプロセスに引き出される。従って、アミノ酸産生に引き出される本発明プロセスにおいて行われ得る、種々の発酵技術が周知である。
適切な炭素源の例示的な例には、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜のような炭水化物；酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸およびフマル酸のような有機酸；およびグリセロールのようなアルコールが含まれるが、その限りではない。
適切な窒素源の例示的な例としては、アンモニアガスおよび液体アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムのような無機酸または有機酸のアンモニウム塩；ならびに、肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズ固形加水分解産物および酵母抽出物を含む他の窒素含有物が挙げられるがその限りではない。
【００６７】
一般的に、アミノ酸は商業的に本発明からバッチ型または流加型などの発酵プロセスにおいて産生され得る。バッチ型発酵において、発酵の開始時に全ての栄養素を添加する。流加型発酵または広い意味での流加型発酵においては、一つまたは多数の栄養素を、発酵開始すぐ、または培養がある一定の状態に達した後、または、添加される栄養素が培養液から使い果たされたとき、培養液に連続的に補給される。広義の流加型発酵のバッチの改変には、繰り返し流加型、またはフィルアンドドロー（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ）発酵があり、発酵槽の内容物の一部をある時点（例えば、発酵物が満たされたとき、栄養物の補給が続けられている間）で除去する。この方法において、発酵をより長時間に延長し得る。
【００６８】
発酵の別の型、連続的発酵、またはケモスタット培養は、完全培地の連続補給を使用するが、その一方で、発酵物におけるブロスの体積をほぼ同じに保つような方法で培養液を連続的または半連続的に回収する。連続的発酵は、原則的には、無限に維持され得る。
【００６９】
バッチ発酵において、培地中の必須栄養素のうちの一つが消費されつくすまで、または発酵状態が不適当になるまで（例えば、ｐＨが、微生物増殖を抑制する値にまで低下する）生物は増殖する。流加型発酵において、通常、適切な増殖条件を維持するために、例えばｐＨコントロールを用いて測定を行い、そして一つ以上の必須栄養素が、消費されつくされることを防ぐために、これらの栄養素を培養液中に供給する。微生物は、栄養素補給の割合により規定された増殖速度で増殖し続けるだろう。一般的に、単一栄養素は、殆どの場合炭素源であるが、増殖を制限するものとなるであろう。同じ原理は、連続発酵にも適用され、通常、培地中の単一栄養素は限られており、全ての他の栄養素は過剰である。限られた栄養素は、培養液体中に非常に低い濃度、しばしば、測定不能である程低濃度で存在するであろう。異なる型の栄養素制限が使用され得る。炭素源制限はもっとも頻繁に使用される。他の例としては、窒素源による制限、酸素による制限、ビタミンまたはアミノ酸のような特定の栄養素による制限（微生物がそのような化合物について栄養素要求性の場合）、硫黄による制限および亜リン酸による制限がある。
【００７０】
アミノ酸は当業者に周知の方法によって回収され得る。例示的な手順は、Ｖａｎ Ｗａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１２７−１３２（１９９７）および米国特許第３，５６５，９５１号で提供される。両文献とも本明細書中で参考として援用される。
【００７１】
本明細書中に引用される全ての特許および刊行物は明確に参考として援用される。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
（化学的変異誘発およびバリン栄養要求性株の選択）
リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＦ１００を、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７２ （Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７２ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で記載されているように、アルキル化剤により、変異誘発を行った。最小培地（ＭＭ）上にコロニーのレプリカを取った。ＭＭ上で増殖しなかったが完全培地（ＣＭ）で増殖したコロニーを栄養要求性株として同定した。Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンを補給した場合ＭＭ上で成長可能なそれらの栄養要求性株を、リシン収率解析を行うために選択した。
【００７３】
ＭＭは、１リットル中の、２０ｇのＤ−グルコース、１０ｇの硫酸アンモニウム、２．５ｇの尿素、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．４ｇのＭｇＳＯ4，７Ｈ2Ｏ・１ｇのＮａＣｌ、０．０１ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのパントテン酸、５０ｍｇのビオチン、２００ｍｇのチアミン、および５０ｍｇのナイアシンアミドから構成され、ｐＨ７．２であった。Ｌ−アミノ酸をＭＭの補助剤として用いた場合、５０ｍｇ／Ｌのそれぞれのアミノ酸を使用した。ＭＭＩＶは、イソロイシンおよびバリンを添加したＭＭであった。
【００７４】
親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した最小寒天培地上で化学的変異誘発によって産み出された高収率誘導体は、表１で示す。補助剤は、５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−アミノ酸であった。成長は、３０Ｃにて３日後の相対的コロニーサイズとして示す。
【００７５】
（実施例２）
（ｒＤＮＡ技術を用いた分枝鎖栄養要求性株の産生）
（１．欠損ｉｌｖＢ遺伝子の調製）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ＡＴＣＣ２１７９９）のｉｌｖＢＮオペロンをＰＣＲで増幅し、ｐＡＬ２０３を作製するためにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローニングした。ｉｌｖＢ遺伝子には、２つのＥｃｏＮＩ制限酵素部位により挟まれた３９０ｂｐの領域が含まれる。ＥｃｏＮＩは、プラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔを切断しない。ＥｃｏＮＩを用いてプラスミドｐＡＬ２０３を切断し、ｐＡＬ２０３ｄｅｌｔａを回収するようにセルフライゲーションさせることにより、ｉｌｖＢ欠損対立遺伝子を設計した。
【００７６】
（２．改変ｉｌｖＢＮ対立遺伝子のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体への相同的組み換え）
二重交差による対立遺伝子交換のためのベクターを、Ｍａｌｏｙら、１９９６（ＭａｌｏｙＳ．Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ Ｖ．Ｊ．，およびＴａｙｌｏｒ Ｒ．Ｋ．１９９６ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）により記述されているように構築した。ＡＴＣＣ３７７６６は、Ｅ．ｃｏｌｉ．中で複製するが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中では複製しないプラスミド、ｐＫ１８４の元となるものであった。ｓａｃＢ遺伝子をｐＪＣ３に挿入するために、ＳｓｐＩ部位にサブクローニングした。ｐＪＣ３は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し得ない。どのカナマイシン耐性コロニーも、相同的組み換えによりクローニングされた遺伝子内の部位に相同的組み換えを行うことにより染色体へ導入されたベクターを有する。導入されたベクターにおけるｓａｃＢ遺伝子の致死発現により、スクロース存在下での成長が阻害される。スクロース存在下での成長には、クローニングされた挿入断片の相同的領域に沿って生じる第二の交差が必要とされる。第一および第二の交差が、改変（欠損、部位突然変異）に隣接する場合、ｉｌｖＢＮの改変対立遺伝子は、宿主株の染色体上に存在する対立遺伝子と交換される。
【００７７】
ｐＡＬ２０３Δ由来のｉｌｖＢＮオペロンの改変対立遺伝子を、導入ベクターｐＪＣ３にサブクローニングし、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのＢＦ１００株に対して電気穿孔法を行い、スクロースを欠いているがカナマイシンを含むリッチ培地（ＤＭＫ）プレートに播種した。コロニーを採取し、スクロースおよびカナマイシンを含まないリッチブロス中で４８時間成長させた。培養液を、カナマイシンを欠くがスクロースを含むリッチプレート上に、ストリークした。シングルコロニーをスクロースプレートから採取し、ＤＭＫ，ＳＭ１，ＭＭおよびＭＭＩＶプレート上に、レプリカを取った。スクロース上で成長し得るもので、ＭＭ上では成長し得ないがＭＭＩＶ上で成長可能であるカナマイシン耐性を持たないコロニーを選択し、フラスコでの実験へと進めた。ＬＣ１０は、ＢＦ１００由来栄養要求性株である。
【００７８】
親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した一連の最小寒天プレート上での組み換えＤＮＡ法を用いて産生した高収率誘導体を、表２に示す。補助剤は、５０ｍｇ／ＬのＬ−アミノ酸である。成長は、３０Ｃにて３日後の相対的コロニーサイズとして示す。
【００７９】
（実施例３）
（ランダム化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−リシン収率の震盪フラスコ培養による分析）
ＳＭ１プレートからシングルコロニーを拾い、ＳＭ１ブロスに移すことによりＢ４Ｂ種菌を調製した。ＳＭ１は、水１Ｌ中に、５０ｇスクロース、３ｇＫ2ＨＰＯ4、３ｇ尿素、０．５ｇＭｇＳＯ4，７Ｈ2０、２０ｇポリペプトン、５ｇビーフ抽出物、０．９ｍｇＤ−ビオチン、３ｍｇチアミン、１２５ｍｇナイアシンアミド、０．５ｇＬ−メチオニン、０．２５ｇＬ−スレオニン、０．５ｇララニンを混合して調製し、ｐＨ７．３に調整した。プレートには２０ｇ／Ｌの寒天が含まれていた。ＳＭ１ブロス中で成長培養を１６時間行った後、等容量の３０％グリセロールを添加し、培養液を−８０Ｃにて凍結した。
【００８０】
２０ｍｌのＳＦＭが入ったバッフル付き２５０ｍｌシード震盪フラスコに、０．１ｍｌの解凍種菌を播種した。播種培地（ＳＦＭ）は、水１Ｌ中の、６０ｇ Ｄ−グルコース、３ｇ Ｋ2ＨＰＯ４、３ｇ 尿素、０．５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２０ｇ ポリペプト
ン、５ｇ ビーフ抽出物、３ｍｇ Ｄ−ビオチン、１２５ｍｇ ナイアシンアミド、０．５ｇ Ｌ―メチオニン、０．２５ｇ Ｌ−スレオニン、および０．５ｇ Ｌ−アラニンで構成され、ｐＨ７．３に調整した。培養物は、３０Ｃにて、１６時間成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通気した。種培養のうち２ｍｌを、２１ｍｌの発酵培地（ＦＭ４）の播種に使用した。ＦＭ４培地は、１６ｍｌの主要培地と５ｍｌのデキストロースストックを混合して調製した。デキストロースストックは、１８０ｇ Ｄ−グルコースに５００ｍｌの水を添加して調製した。主要培地には、１Ｌ中に、０．０８３ｇのＭｎＳＯ4、
０．４ｍｇ Ｄ−ビオチン、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、ラフィネートおよび５０ｇのＣａＣＯ3が含まれていた。ＦＭ４の最終容量が４％の乾燥固体になるようにコーンスティープを添加した。ＦＭ４の最終容量が５％硫酸アンモニウムになるようにラフィネートを添加した。３０Ｃにて、４８時間、２５０ｍｌのバッフル付き震盪フラスコで、培養物を成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通気を行った。
【００８１】
表３にて、震盪フラスコ中での、バリンおよびイソロイシン要求性に対する選択により向上させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生でのデータを示す。
【００８２】
（実施例４）
（ｒＤＮＡ法により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−リシン収率の震盪フラスコ測定）
表４にて、震盪フラスコ中での、ｉｌｖＢＮオペロンの染色体コピーから３９０塩基対のＤＮＡ配列のを欠失させることにより改善したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生におけるデータを示す（実施例２参照）。培養物を成長させ、実施例３に記載のように分析した。
【００８３】
（実施例５）
（バリン栄養要求性によるリシン収率の微小発酵測定）
２Ｌのバッフル付き震盪フラスコ中で、５００ｍＬ ＳＭ１で、１８時間、種菌を成長させた。３．１ＬのＦＭ４培地を、４Ｌ 微小発酵槽で使用した。温度およびｐＨを、３２Ｃおよび７．２にそれぞれ維持した。２０時間の時点で、フラスコの撹拌を７００ｒｐｍから９５０ｒｐｍに増加させた。４．５ＬＰＭで空気を供給した。デキストロースを、３ｇ／Ｌになるように維持した。発酵時間は、４８時間であった。
【００８４】
表５にて、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを合成し得ないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を用いた４リットル発酵装置中での、Ｌ−リシン産生におけるデータを示す。
【００８５】
（実施例６）
（クローン化ＩＬＶＢＮのＩｎ Ｖｉｖｏ変異誘発により産生されたブラディトローフによるＬ−リシン産生）
（１．機能的ＡＨＡＳ酵素を産生する、欠損型ｉｌｖＢＮオペロンの調製）
ｐＶＡＬ１を得るために、ｐＡＬ２０３のｉｌＶＢＮオペロンを、シャトルベクターｐＭ２にサブクローニングした。ｐＭ２は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方で複製し得る。ｐＶａｌＩを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．の変異誘発株ＸＬ１ＲＥＤに形質転換した。ＸＬ１ＲＥＤキット説明書に従って、変異誘発プラスミドを調製し、バリン栄養要求性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して電気穿孔法を行った。バリン栄養要求性株は、イソロイシンおよびバリン補給、または機能的ｉｌｎＢＮオペロンを用いた遺伝学的補足なしではＭＭプレート上で成長不可能である。
【００８６】
ＳＭ１プレートからカナマイシン耐性形質転換株を選択し、ＭＭプレート上にレプリカをとった。ＭＭプレート上で成長したそれらのコロニーは、ｉｌｎＢＮ欠損の機能的補完性を示した。親プラスミド（ｐＶＡＬ１）を持つバリン栄養要求性コロニーよりも小さいコロニーを、バリン栄養要求性活性アッセイを行うために選択した。ｐＲＶ１Ｂ５は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍで複製し得るｐＶＡＬ１に由来するプラスミドである。バリン栄養要求性株において、そのプラスミドが産生したＡＨＡＳ活性は、ｐＶＡＬ１により産生されたＡＨＡＳ特異的活性の１％未満であった。この構築物のｉｌｖＢＮオペロンは、漏出ＡＨＡＳ活性を有する。
【００８７】
（２．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体ＤＮＡへの相同的組み換え）
ｉｌｖＢＮオペロンのＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子を、導入ベクターｐＪＣ３にサブクローニングし、実施例２で行われたような相同的組み換えにより、バリン栄養要求性株において漏出対立遺伝子を欠損対立遺伝子に交換するために使用した。ＢＦ１００−１０３０は、ＲＶ１Ｂ５対立遺伝子を用いて構築されたバリンブラディトローフ株である。表６にて、ＢＦ１００−１０３０が震盪フラスコ中で、親株よりも少量しかバリンを産生しないことを表すデータを示す。表７にて、ＢＦ１００−１０３０ブラディトローフ株が表５の栄養要求性株に対して改善した成長を有することを示す。表７にて、また、ブラディトローフにより、微小発酵において親株よりも少量のバリンしか産生しないことを示す。
【００８８】
（表）
次の表で示すデータは、実施例セクションで考察している。用語「成長」は、６６０ｎｍで測定された光学密度をいい；用語「力価」は、１リットルあたりのアミノ酸のグラム数をいい；用語「収率」は、以下の式：［（ｇ リシン／Ｌ／（ｇ デキストロース消費／Ｌ］×１００によって定義されること；Ｂ４Ｂ＝化学的変異誘発により構築されたバリン栄養要求性株；ＬＣ１０＝染色体ｉｌｖＢ遺伝子を、ｐＡＬ２０３ΔのｉｌｎＢ欠損対立遺伝子と置換することにより構築されたバリン栄養要求性株；ＢＦ１００−１０３０＝染色体ｉｌｎＢ遺伝子を、ＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子と置換することにより構築されたバリンブラディトローフであることに注意すること。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
【表３】
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】
【表８】
【００９７】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【公開番号】特開２０１０−２２３７４（Ｐ２０１０−２２３７４Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４２８９５（Ｐ２００９−２４２８９５）
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【分割の表示】特願２００６−２００１３１（Ｐ２００６−２００１３１）の分割
【原出願日】平成１２年８月２日（２０００．８．２）
【出願人】（５０１１８３９７６）アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【分割の表示】特願２００６−２００１３１（Ｐ２００６−２００１３１）の分割
【原出願日】平成１２年８月２日（２０００．８．２）
【出願人】（５０１１８３９７６）アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー (12)
【Ｆターム（参考）】
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