アラビノフラノシダーゼＢ提示酵母及びその利用
【課題】キシラン分解物の効率的な製造方法及びそれに用いる材料を提供する。
【解決手段】５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。キシランを、このポリヌクレオチドを保持する酵母並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【解決手段】５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。キシランを、このポリヌクレオチドを保持する酵母並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表層にアラビノフラノシダーゼを保持する酵母及びそれを用いたキシラン分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境やエネルギーに対する関心が高まるなか、エタノールの自動車燃料としての直接利用やガソリンのような既存燃料への一部添加が検討されている。これにより、化石燃料への依存度が減り、懸念されている化石燃料の枯渇を防ぐことができる。また、エタノールは、通常のガソリンに比べ、環境汚染が非常に少ない燃料である。
【０００３】
従来、発酵による工業用アルコールの製造原料として、サトウキビから得られる糖質、トウモロコシ等の食用作物から得られるデンプン等が主に用いられている。しかし、これらの農作物は高価であるため、燃料用エタノール（バイオエタノール）の製造原料として使用するのは実用的ではない。また、将来、地球規模での食料不足が予測される点でも、農作物をエタノール発酵原料として用いることは実用的ではない。
【０００４】
一方、木質系バイオマスは、大量かつ低価格で入手でき、また食用に供されるものでないため、バイオエタノール原料として期待されている。木質系バイオマスは、セルロース５０％程度、ヘミセルロース２０〜３０％程度、及びリグニン２０〜３０％程度で構成されている。セルロースは、グルコースの重合体である。ヘミセルロースの主成分はキシランであり、キシランは、例えば広葉樹やイネ科植物では、Ｄ−キシロース残基がβ−１，４結合したキシラン主鎖にＬ−アラビノース、グルクロン酸、４−Ｏ−メチルグルクロン酸などが短い側鎖として結合した多糖類である。
【０００５】
高分子多糖は糖分解酵素で加水分解して単糖にすることにより初めてエタノール発酵の基質となり得る。木質系バイオマスは、食用作物に較べて、ヘミセルロースの含有比率が高いため、ヘミセルロースの加水分解反応の効率が木質系バイオマスからのエタノール生産効率を定める大きな要素となっている。
【０００６】
キシラン主鎖のキシロース間のβ−１，４結合を分解する酵素として、キシラナーゼ及びキシロシダーゼが知られている。しかし、アラビノース側鎖が付加した枝分かれ部分にはこれらの酵素が作用し難いため、これらの酵素だけでは十分にキシランを加水分解することができず、キシロースの回収率が低く、ひいてはバイオエタノールの生産効率が低くなる。
【０００７】
側鎖のアラビノースと主鎖のキシロースとの間の結合を分解する酵素は、アラビノフラノシダーゼである。アラビノフラノシダーゼをキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼと共にキシランに作用させれば、キシランの分解によるキシロースの収率が向上することが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
しかし、キシラナーゼやキシロシダーゼと異なり、アラビノフラノシダーゼは工業利用できる程度に大量に生産する技術が確立されていない。また、これらの酵素を生産する微生物を用いてキシランの分解によりキシロースを生産することも考えられるが、キシランは高分子であるため細胞膜を透過し難く、その結果キシロースの生産効率が悪い。
【０００９】
【非特許文献１】平成１５年度 第５５回 日本生物工学大会 講演要旨集 ｐ１９ 岐阜大・農 高見澤ら
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、キシラン分解物の効率的な製造方法及びそれに用いる材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
（１） 上流側から、酵母細胞内で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、及び、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチドを発現可能な状態で保持する酵母は、アラビノフラノシダーゼとＮ末端にＧＰＩアンカー付着シグナルを有する細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質が、細胞表面に高密度に固定されたものとなる。
【００１２】
タンパク質が、細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に高密度に固定され得るか否かは、タンパク質の種類によって大きく異なり、成功しない例もある。また、表層提示されたとしても、固定された状態で活性を示すことができるか否かはタンパク質の種類によって大きく異なり、細胞表層に固定されることにより活性を失う場合もある。このような状況の下で、本発明者は、キシロース製造に有用なアラビノフラノシダーゼを細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質として酵母細胞表層に提示させ、かつ高い酵素活性を発現させることに成功した。
（２） キシランを、上記のアラビノフラノシダーゼ提示酵母、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下でインキュベートすることにより、主鎖のキシロース間の結合及び側鎖のアラビノースと主鎖のキシロースとの間を結合が効率的に分解することができ、キシロースやアラビノースなどのキシラン分解物を高収率で製造することができる。
【００１３】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のポリヌクレオチド、酵母及びキシラン分解物の製造方法を提供する。
【００１４】
項１． ５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【００１５】
項２． 細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンをコードする配列に含まれる項１に記載のポリヌクレオチド。
【００１６】
項３． 細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から３２０ないしは６００個のアミノ酸をコードする配列中に含まれる項２に記載のポリヌクレオチド。
【００１７】
項４． アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来する酵素である項１、２又は３に記載のポリヌクレオチド。
【００１８】
項５． 酵母細胞で機能できるプロモーターに発現可能な状態で連結された、項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【００１９】
項６． 項５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００２０】
項７． 項５に記載のポリヌクレオチド又は項６に記載の発現ベクターを保持する酵母。
【００２１】
項８． キシランを、項７に記載の酵母及びキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【００２２】
項９． 酵母が担体に固定化されている項８に記載の方法。
【００２３】
項１０． キシランを項７に記載の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物を、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【００２４】
項１１． 酵母が担体に固定化されている項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、活性なアラビノフラノシダーゼを細胞表層に高密度に保持する酵母が得られた。この酵母細胞とキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼとを、キシランに作用させることにより、効率的にキシランを分解して、キシロース及びアラビノースを始めとするキシラン分解物を得ることができる。
【００２６】
詳述すれば、キシランの主鎖のβ−１，４結合を分解するキシラナーゼ及びキシロシダーゼは工業利用できるだけの量を入手できるが、それに見合った量のアラビノフラノシダーゼを低コストで生産する技術は存在しなかった。
【００２７】
本発明の酵母は細胞表面に活性なアラビノフラノシダーゼを保持しているため、この酵母を培養することにより、大量のアラビノフラノシダーゼを安価に入手できる。
【００２８】
また、本発明の酵母は細胞表面にアラビノフラノシダーゼが高密度に固定されているため、反応液中の酵母密度を高くすることにより、アラビノフラノシダーゼ濃度を高くすることができる。これにより、本発明の酵母をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼとともに反応液中に存在させることにより、キシランの側鎖を効率的に分解するとともに、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによるキシラン主鎖の分解を促進し、その結果、キシロースを含むキシラン分解物の回収率及び製造速度が向上する。
【００２９】
また本発明の酵母は細胞表面上にアラビノフラノシダーゼが固定されているため、細胞膜を透過し難い高分子のキシランを効率的に分解できる。
【００３０】
本発明によれば、従来、加水分解が難しかったキシランを効率的に加水分解できるため、木質系バイオマスのエタノール発酵による利用の路が開けた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、５’末端から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、及び、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を含むポリヌクレオチドである。これを図１に示す。
分泌シグナル配列
本発明のポリヌクレオチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３２】
本発明において、ポリヌクレオチドは、特に言及しない限り、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。また特に言及しない限り、２本鎖又は１本鎖のいずれであってもよい。また特に言及しない限り、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよく、ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ−末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、２０個程度のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
【００３４】
本発明においては、アラビノフラノシダーゼを酵母の細胞外に分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、どのようなものでも用いることができ、その起源は問わない。例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα因子の分泌シグナルペプチド配列等を好適に用いることができる。特に、分泌効率の点で、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列が好ましい。また、アスペルギルス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列も好ましいものとして挙げられる。
アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列
本発明において、アラビノフラノシダーゼ活性とは、キシラン主鎖のキシロースと側鎖のアラビノースとの間の結合を分解する活性をいう。アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列は、アラビノフラノシダーゼの全長をコードするポリヌクレオチドであってもよく、アラビノフラノシダーゼ活性を示す限り、酵素活性を示す一部の領域をコードするポリヌクレオチドであってもよい。また、アラビノフラノシダーゼ活性を示す限り、天然アラビノフラノシダーゼをコードする配列において、１又は２以上のヌクレオチドが欠失、付加又は置換された配列であってもよい。
【００３５】
アラビノフラノシダーゼの起源は特に限定されず、微生物、植物、動物などのいずれの生物に由来する酵素であってもよい。中でも、調製や取り扱いが容易である点で、微生物由来のものが好ましく、アスペルギルス・オリゼ由来のものがより好ましい。アスペルギルス・オリゼ由来のアラビノフラノシダーゼは、耐熱性に優れるため、反応槽内の温度制御が困難な工業スケールのリアクターで使用することができる点で、実用性の高い酵素である。
本発明者らはすでに、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子ａｂｆＡをアスペルギルス・オリゼから取得している。また、この酵素を酵母表層に提示させることにも成功している（特願２００４−６１３７９）。今回さらに、別の遺伝子として、既に見つかっているアスペルギルス・オリゼ由来のａｂｆＢ遺伝子に着目した。そして、ａｂｆＢについて、酵母細胞表層におけるアラビノフラノシダーゼの酵素活性を検討した。
今回用いたアスペルギルス・オリゼ由来のアラビノフラノシダーゼをコードするＤＮＡ配列を配列番号８に示す。また、コードするポリペプチドがアラビノフラノシダーゼ活性を有する限り、配列番号８又はこの配列において、１又は２以上のポリヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたものであってもよい。例えば、置換後の対応アミノ酸が、置換前のアミノ酸と、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性等の点で同じ性質を有するような置換を行うことができる。
細胞表層局在タンパク質
＜細胞表層局在タンパク質＞
本発明方法では、細胞表層に固定化され又は付着ないしは接着して、そこに局在するタンパク質であればよく、公知のものを制限なく使用できる。
【００３６】
細胞膜に局在するタンパク質としては、膜貫通タンパク質や細胞表層局在タンパク質が挙げられる。膜貫通タンパク質は、疎水性アミノ酸領域部分で脂質二重膜を貫通しているタンパク質であり、受容体タンパク質に多く見られる。一方、細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。その他に、固定化の機構が明らかにされていない細胞表層局在タンパク質もあり、本発明方法ではそれらも使用できる。細胞表層局在タンパク質としては、後述する各種ＧＰＩアンカリングタンパク質、やＢＧＬ２などが知られている。ＢＧＬ２は、酵母のβ−グルカナーゼであり、細胞壁に強く結合することは分かっているが、その機構は不明のタンパク質である。また、ＢＧＬ２は、ＧＰＩアンカータンパク質と共通するモチーフは有さない。
＜ＧＰＩアンカリングタンパク質＞
細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：エタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカリングタンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカリングタンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
【００３７】
ＧＰＩアンカリングタンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は以下のようにして行われる。即ち、ＧＰＩアンカリングタンパク質は、転写及び翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカリングタンパク質のＣ末端又はその近傍の領域には、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカリングタンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔及びゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
【００３８】
ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
【００３９】
ＧＰＩアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を図２に示す。
＜本発明の細胞表層局在タンパク質の１例としてのＧＰＩアンカリングタンパク質＞
このように、ＧＰＩアンカリングタンパク質は、本発明にいう細胞表層局在タンパク質の１種であって、しかもＧＰＩアンカー付着シグナルを有するものである。本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列からなる配列として、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含むＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードするポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４０】
ＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む、通常Ｃ末端の領域である。この細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、アラビノフラノシダーゼ活性を阻害しない限り、その他ＧＰＩアンカリングタンパク質のどのような部分を含んでいてもよい。
【００４１】
ＧＰＩアンカリングタンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよく、公知のＧＰＩアンカリングタンパク質を制限なく使用できる。公知のＧＰＩアンカリングタンパク質としては、例えば、酵母の性凝集タンパク質であるα−又はａ−アグルチニン、Ｆｌｏ１タンパク質、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，６−１０，１９９３） 、大腸菌マルトーストランスポーターＬａｍＢ、大腸菌鞭毛タンパク質ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、枯草菌細胞壁溶解酵素ＣｗｌＢ等が挙げられる。
【００４２】
特に、酵母のα−アグルチニンを好適に使用できる。α−アグルチニンのＣ末端側から３２０ないしは６００個のアミノ酸からなる領域（即ち、Ｃ末端から３２０個のアミノ酸からなる領域、Ｃ末端から３２１個のアミノ酸からなる領域、……Ｃ末端から５９９個のアミノ酸からなる領域、又はＣ末端から６００個のアミノ酸からなる領域）を用いることが好ましく、Ｃ末端側から３２０個のアミノ酸からなる領域をコードするポリヌクレオチド配列を用いることがより好ましい。α−アグルチニンのＣ末端側から３２０個のアミノ酸からなる配列には、４カ所の糖鎖結合部位が存在する。ＧＰＩアンカーがＰＩ−ＰＬＣにより切断された後、この糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、α−アグルチニンの細胞壁への固定を増強する。
【００４３】
α−アグルチニンのようなＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列は、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列との双方を本来的に含んでいるが、本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とが、別々の起源から調製されたものであってもよい。
ポリヌクレオチドの作製方法
分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの製造方法は、当業者には周知の技術である。
【００４４】
例えば、分泌シグナル配列とアラビノフラノシダーゼの構造遺伝子との結合は、ＤＮＡ連結酵素（Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ＴａｋａＲａ社）等を用いて行うことができる。さらにこの配列と、例えばＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列とを結合する際も同様にできる。
（２）発現ベクター
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）が酵母細胞内で発現できるように連結された発現ベクターである。即ち、本発明の発現ベクターにおいては、酵母細胞で機能できるプロモーターの下流に、このプロモーターにより発現できるように本発明のポリヌクレオチドが連結されている。
【００４５】
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であっても良い。ベクターの調製が容易である点および酵母細胞の形質転換が容易である点でプラスミドベクターであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの構築や、本発明のポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みを大腸菌を用いて簡単に行うことができるように、酵母と大腸菌との間のシャトルベクターであることが好ましい。このようなシャトルベクターは公知のものを制限なく使用できる。
【００４６】
酵母−大腸菌シャトルベクターとしては、例えば、酵母の２μｍプラスミド又は酵母染色体の複製開始点（Ｏｒｉ）を大腸菌プラスミドベクターに挿入したものが挙げられる。このシャトルベクターは、この酵母の複製開始点と大腸菌の複製開始点（ＣｏｌＥ１）とを有している。また、通常、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を備えていればよい。また、アラビノフラノシダーゼ構造遺伝子を発現させるために、通常、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列も含んでいればよい。本発明のポリヌクレオチドを挿入する酵母−大腸菌シャトルベクターとしては、ｐＹＥ２２ｍ、ｐＹＧＡ２２７０等が挙げられる。これらのベクターのＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとの間のこのプロモーターにより発現可能な位置に、本発明のポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００４７】
発現ベクター中の本発明のポリヌクレオチドの状態を図２に示す。
（３）酵母
本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを保持する酵母である。本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド（ここでは主にＤＮＡ）又は発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。「ポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入」とは、酵母細胞中にポリヌクレオチド又は発現ベクターを導入し、融合タンパク質を発現させることを意味する。
【００４８】
導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。
【００４９】
本発明の発現ベクターのプロモーターとＧＰＩアンカー付着シグナルとの間を、適当な制限酵素を用いて切断して得られる線状ポリヌクレオチドを上記例示した形質転換方法で酵母細胞に導入することもできる。
【００５０】
また、上記例示した形質転換方法で、酵母細胞で機能できるプロモーターに本発明のポリヌクレオチドを発現可能に連結したＤＮＡ断片を酵母細胞に導入することもできる。
【００５１】
本発明の酵母中に導入されたＤＮＡは、アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現できる限り、酵母細胞内でどのような形態で存在していてもよい。このＤＮＡは、例えば、プラスミドの状態、相同組換えにより宿主染色体に組み込まれた状態、又は宿主の核外遺伝子などに挿入された状態で存在していればよい。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドが導入された酵母は、常法に従い、例えばＴＲＰ１のような選択マーカーによる形質又はアラビノフラノシダーゼ活性等を指標として選択することができる。
【００５３】
得られた酵母の細胞表層にアラビノフラノシダーゼが固定されていることは、常法により確認できる。例えば、被験酵母に、抗アラビノフラノシダーゼ抗体と、ＦＩＴＣのような蛍光色素で標識した２次抗体、アルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体等とを作用させる方法、抗アラビノフラノシダーゼ抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
＜宿主＞
宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕ ｙｅａｓｔ）に属するものであればよく、特に限定されない。その中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅに属するものが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属であるものがより好ましい。
【００５４】
中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しい工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で、実用酵母が好ましい。実用酵母としては清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など、発酵食品に深く関与する酵母が挙げられる。実用酵母の中でも、高い発酵能と高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。
【００５５】
一般に、微生物にとってエタノールは有毒である。エタノール発酵する酵母も例外ではなく、エタノール濃度が８％（ｖ／ｖ）を超えると自身が生産したエタノールにより徐々に死滅してしまう。ここで、清酒酵母はエタノール濃度が２０％にも達する清酒モロミで長年選抜及び育種されてきた株であり、一般的な酵母に比べ極めて高いエタノール耐性を持っている。
本発明においては、酵母を用いてキシランの分解により、キシロースやアラビノースを製造するが、これらの５炭糖はエタノール発酵原料に供される。エタノール発酵では、培養液中のエタノール濃度を究極まで高めることが重要であることから、そこに用いられる酵母にはエタノール耐性能が高いことが求められる。
清酒酵母としては、日本醸造協会頒布の「きょうかい酵母」およびこれらを親株とした突然変異株などが挙げられる。また他にも、清酒醸造で使用されている酵母であればいずれも有用である。形質転換マーカーとして栄養要求性遺伝子を用いる場合は、これら清酒酵母に突然変異などの手法を用いて栄養要求性を付与した株を用いればよく、そのような栄養要求性としてはウラシル要求性、トリプトファン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、アデニン要求性などが挙げられる。清酒酵母にウラシル要求性を付与した例としては「きょうかい９号酵母」を宿主として突然変異法により取得したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕが挙げられる。
＜アラビノフラノシダーゼ活性＞
上記のようにして得られる本発明の酵母のアラビノフラノシダーゼ活性は、菌体１ｍｇあたり通常３〜１０×１０−５Ｕ程度である。酵母のアラビノフラノシダーゼ活性は実施例に記載の方法により測定した値である。
（４）第１のキシラン分解物の製造方法
本発明の第１のキシラン分解物の製造方法は、キシランを、本発明の酵母とキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。
キシラン
例えばスギ、ブナ、竹のような木材；雑草；籾殻、ふすまのような種子殻；稲藁；とうもろこしかす、サトウキビの絞りかす（バガス）のような植物かす；大豆ミールのような穀類等の植物性バイオマスから、爆砕、溶媒抽出、水蒸気蒸留、超臨界炭酸ガス抽出、加圧熱水抽出などの方法で、キシランおよびアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースを抽出することができる。
【００５６】
本発明方法では、キシランをヘミセルロースそのままの形で分解に供することもでき、又はヘミセルロースから分離されたキシランを分解に供することもできる。
酵母
反応液中の酵母密度は、酵母１細胞当たりに固定されているアラビノフラノシダーゼの数及び活性により異なるが、反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性が０．０２〜５Ｕ／ｌ程度となる密度とすることが好ましく、０．０５〜２Ｕ／ｌ程度となる密度とすることがより好ましい。
【００５７】
酵母は、そのまま反応液中に含まれていてもよく、又は、固定化されていてもよいが、連続反応、回分式反応又は半回分式反応により連続使用できる点で、固定化されていることが好ましい。「固定化」とは、酵母が遊離の状態ではない状態を意味し、例えば、酵母が担体に結合、付着又は担体内部に取り込まれた状態を指す。固定化方法は特に限定されず、公知の微生物固定化方法を採用できる。このような公知の固定化方法としては、細孔を有する担体に酵母を保持させる方法、格子やマイクロカプセルにより酵母を包括する方法などが挙げられる。
【００５８】
担体としては、反応液中の水又は溶媒に対して不溶性の物質からなるものを用いる。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール、セルロース等の樹脂からなる多孔質体を好適に使用できる。また、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、シリコンフォームのような発泡体も多孔質体として使用できる。担体内で良好に酵母を増殖させることができ、さらに活性が低下した酵母や死滅した酵母を脱離させずに長期間保持することができる点で、多孔質の担体が望ましい。
【００５９】
多孔質体の細孔（開口部）の直径は、酵母の種類によっても異なるが、通常５０〜１０００μｍ程度が好ましく、５０〜１００μｍ程度がより好ましい。上記開口部直径の範囲であれば、酵母の侵入及び増殖が容易であるとともに、高密度で酵母を保持することができる。
【００６０】
また担体の外形は、特に限定されず、球状、立方体状又は不定形などの粒状；網目状、シート状などのいずれの形状であってもよい。調製が容易である点で、粒状であることが好ましい。粒子の大きさは、例えば球状の場合直径が２〜５０ｍｍ程度、立方体状の場合２〜５０ｍｍ角程度とすればよい。
【００６１】
包括による酵母の固定化方法としては、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、κ−カラギーナン、合成プレポリマー（光架橋性樹脂プレポリマー、ウレタンプレポリマー等）などを用いて格子状に酵母を包括する方法；相分離法、界面重合法、水中乾燥法などの手法で高分子半透膜からなるマイクロカプセルで酵母を覆うことによりこれを包括する方法が挙げられる。また、酵母を互いに架橋する方法もあげられる。
キシラナーゼ・キシロシダーゼ
キシランの主鎖のキシロース間のβ−１，４結合を分解するために、反応液中にキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼを添加する。キシラナーゼ及びキシロシダーゼは、いずれもキシラン主鎖のβ−１，４結合を切断する活性を有する。この中で、キシラナーゼは、エンド型酵素であり、キシラン主鎖の部位に関係なく切断する活性を有する。一方、キシロシダーゼは、エキソ型酵素であり、キシラン主鎖の末端から順番にキシロースを一つずつ切断する。従って、キシラナーゼ単独ではキシランからキシロースを製造することはできない。また、キシロシダーゼはキシラン末端から分解するという性質上、反応速度が遅くなる。本発明方法では、キシラナーゼとキシロシダーゼとを組み合わせて使用することが好ましい。
【００６２】
これらの酵素は、どのような生物に由来するものであってもよい。例えば、バクテリアやカビ等の起源のものを使用できる。中でも、酵素の大量調製が容易である等の点でカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）起源のものを使用することが好ましい。
【００６３】
キシロシダーゼ及びキシラナーゼの使用量は、反応液中の活性が、通常０．１〜２００Ｕ／ｌ程度、好ましくは１〜２０Ｕ／ｌ程度となるようにすればよい。これらの酵素活性は実施例に記載の方法により測定された値である。
反応
アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによるキシランの分解反応は、反応容器内の反応液中に遊離の酵母又は固定化された酵母を懸濁した状態で行うことができる。また、カラムのような反応容器内に遊離又は固定化された酵母を充填したバイオリアクターを用いて行うこともできる。また、反応は連続式、回分式（バッチ式）又は半回分式のいずれの方式で行ってもよい。
【００６４】
反応液中には、基質のみ含まれていてもよく、又はこれに加えてｐＨ調製のための緩衝剤や酵母の生存に必要な公知の物質が含まれていてもよい。
【００６５】
反応液中の基質（キシラン）の濃度は、通常０．０２〜２０重量％程度とすることが好ましく、０．０５〜５重量％程度とすることがより好ましい。基質濃度が余りに低いと、実用的なキシロース製造効率が得られない。逆に、基質濃度が余りに高いと、反応液の粘度が上がり、攪拌や温度制御等が難しくなったり、反応液の浸透圧が上がり、酵母に多大なストレスがかかる状態になったりする場合がある。極度のストレスは細胞増殖の悪化や細胞の死滅（破壊）の引き金となり、その結果、理想的な反応効率が得られなくなる。しかし、上記詰範囲であれば、このような問題は生じない。
【００６６】
反応液のｐＨは、アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの至適ｐＨを含む４〜８程度が好ましい。反応の進行とともに反応液のｐＨが低下するため、上記ｐＨ範囲になるように調整することが望ましい。
【００６７】
反応温度は、酵母が保持するアラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼが活性を示す温度であればよく、通常２０〜６０℃程度が好ましい。耐熱性酵素を用いる場合は、さらに高温で行うことができる。この場合、酵母が生育できなくても、表層のアラビノフラノシダーゼは活性を有したまま固定されているため、分解反応には支障がない。
【００６８】
反応液中にキシランの他にセルロースなどが混在する場合には、セルラーゼ等の各種糖加水分解酵素を併用してもよい。
【００６９】
反応液中の各成分濃度を、例えば、ガスクロマトグラフやＨＰＬＣなどで経時的に測定することによりモニターすることにより、基質の追加量、反応時間、ｐＨ調整剤の添加量などを決定すればよい。
キシラン分解物の回収
キシランの起源生物種によっても異なるが、上記の反応により反応液中に主にキシロース、アラビノース等が生成する。反応終了後の反応液から、遠心分離などにより単糖を分離すればよい。これによりキシラン分解物を回収できる。これらの単糖は、そのまま、エタノール発酵の基質として用いることができる。
（５）第２のキシラン分解物の製造方法
本発明の第２のキシラン分解物の製造方法は、キシランを本発明の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。
アラビノフラノシダーゼによる分解工程（工程（ａ））
基質、酵母及び反応方法については、第１の方法と同様である。反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性についても第１の方法と同様である。反応終了後の反応液は、そのまま、又は遠心分離などによりアラビノースを回収して除去した後、次工程に供される。
キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによる分解工程（工程（ｂ））
本発明の酵母を用いてキシランの側鎖のアラビノースを分解した後に、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼにより主鎖のキシロースを分解する。反応方法及びキシラン分解物の回収方法は第１の方法と同様である。また反応液中の酵素活性についても第１の方法と同様である。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７０】
本発明において、酵素活性は以下の方法により測定した値である。
＜アラビノフラノシダーゼ活性の検出＞
アラビノフラノシダーゼ活性の有無は、菌体又は培養上清を１ｍＭ ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で３時間静置した後、遊離した４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを目視にて確認した。遊離４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌは黄色を呈するため、この呈色を確認する。
＜菌体のアラビノフラノシダーゼ活性の定量＞
アラビノフラノシダーゼ活性は、菌体又は培養上清を１ｍＭ ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で３時間静置した後、遊離した４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量から求めた。アラビノフラノシダーゼ活性１Ｕ＝４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ から１分間に１μｍｏｌの４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
＜キシラナーゼ活性の定量＞
キシラナーゼ活性の測定は、菌体又は培養上清又は精製酵素溶液を１％ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ社）を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で２時間静置した後、遊離した糖の還元力をソモギーネルソン法により定量した。キシラナーゼ活性１Ｕ＝ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ から１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元力を生成する酵素量、と定義した。
＜キシロシダーゼ活性の定量＞
キシロシダーゼ活性は、菌体又は培養上清精製酵素溶液を１ｍＭ ２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｘｙｌｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で５分間静置した後、遊離した２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量から求めた。キシロシダーゼ活性活性１Ｕ＝２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｘｙｌｏｓｉｄｅ から１分間に１μｍｏｌの２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
【実施例１】
【００７１】
（分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼの構造遺伝子配列、α−アグルチニンの一部の配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの作製）
掲題のＤＮＡを作製した手順を、図３を参照して説明する。
（Ａ） 常法に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼの分泌シグナル配列を取得した。簡単に述べると、５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：１）及び５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴ−３’（配列番号：２）を合成し、これをプライマーとして、プラスミドｐＮＧＢ１（Ｇｅｎｅ ２０７ １２７−１３４ （１９９８））を鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後に分泌シグナル配列をアラビノフラノシダーゼと融合させるため、制限酵素サイトＥｃｏＲＩとＳａｌＩを付加するようにした。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、約１００ｂｐのグルコアミラーゼ分泌シグナル配列を取得した。配列表の配列番号：７にその配列を示す
（Ｂ） 常法に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのアラビノフラノシダーゼＢのｃＤＮＡを取得した。簡単に述べると、まず、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅから全ＲＮＡを抽出し、ついで、オリゴｄＴセルロースを用いてＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。
【００７３】
次にＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社のＲＴ−ＰＣＲ ＫＩＴを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ混合物を取得した。即ち、５’−ｇｔｃｇａｃＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号：３）及び５’−ｇｔｔａａｃＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡ−３’（配列番号：４）を合成し、これをプライマーとして、先ほどのｃＤＮＡ混合物を鋳型にＰＣＲした。ＰＣＲは、５０℃／３０分−９４℃／２分の後、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／２分のサイクルを３０回繰り返す条件で行った。ここで、両プライマーの設計には、後にアラビノフラノシダーゼの一方の末端を分泌シグナル配列と融合させるために制限酵素サイトＳａｌＩを付加し、他方の末端をα−アグルチニンのＣ末端の一部と融合させるため、制限酵素サイトＨｐａＩを付加し、また翻訳終止コドンを除去した。
【００７４】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＳａｌＩとＨｐａＩで切断し、約１．５ｋｂｐのアラビノフラノシダーゼｃＤＮＡ断片を得た。配列表の配列番号：８にその配列を示す。
（Ｃ） α−アグルチニンのＣ末端の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を有する遺伝子（３２０アミノ酸）を有する配列を取得するため、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ８−１から、常法により染色体ＤＮＡを単離し、５’−ｃｃｃｇｇｇｇｃｔｃｇＡＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号：５）および５’−ｇｇｔａｃｃＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：６）の２つのプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／２分のサイクルを３０回繰り返した。
【００７５】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、ＳｍａＩとＫｐｎＩとで消化して、ＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片を得た。このＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片には、α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする配列と、３’非コード領域の４４６ｂｐとを含んでおり、この配列中にＧＰＩアンカー付着シグナル配列が含まれている。配列表の配列番号：９にその配列を示す。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドの１実施例である目的ＤＮＡは、（Ａ）で得られた分泌シグナル配列と（Ｂ）で得られたアラビノフラノシダーゼ遺伝子と（Ｃ）で得られたＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片を、常法に従いＤＮＡ連結酵素（Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ）等を用いて接続することより得られる。
【００７７】
得られた目的ＤＮＡをプラスミドｐＲＳ４０６ Ｐｓｅｄ１のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ切断部位に挿入して、本発明の１実施例である目的プラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢを得た。
【実施例２】
【００７８】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の作製）
実施例１で得られたプラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢと名付けた（以下、単にＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢという）。
【００７９】
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのアラビノフラノシダーゼ活性を測定した。コントロールとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールは、培地および菌体にアラビノフラノシダーゼ活性はみとめられなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢの培地中にはほとんどアラビノフラノシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ菌体はアラビノフラノシダーゼ活性を有していた。
【実施例３】
【００８０】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼＢを有する酵母によるキシランの分解）
実施例２で得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢをＹＮＢ培地で生育させた後、集菌、洗浄し、菌体を反応液（０．５％Ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｏａｔ ｓｐｅｌｔｓ（ＳＩＧＭＡ社製）（ｐＨ５．０））にアラビノフラノシダーゼ活性が５ｍＵとなるように加え、キシラナーゼ、キシロシダーゼをそれぞれ２０ｍＵ加え、３０℃で反応させた。反応３時間後、遠心し、その上清のキシロースを定量し、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを加えなかった場合と比較した。
その結果、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを添加することにより、キシロース生産量が１８％上昇した。用いたＸｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｏａｔ ｓｐｅｌｔｓ（ＳＩＧＭＡ社製）のアラビノース含量は１０％であるので、この結果から、ａｂｆＢを用いた場合、ほぼ完全にキシランからアラビノース側鎖を除くことができたことが分かった。
【実施例４】
【００８１】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の固定化）
０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ培地３Ｌを含む気泡塔型培養槽に、６ｍｍ角のポリウレタンフォームＢＳＰｓを、１，０００個／Ｌとなるように投入し、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢとともに６〜２０Ｌ／分の通気量で培養した。これにより、ポリウレタンフォームに酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢが固定された。
【００８２】
この酵母のアラビノフラノシダーゼ活性はポリウレタンフォーム１個当たり０．０１Ｕであった。
【実施例５】
【００８３】
（固定化された細胞表層にアラビノフラノシダーゼＢを有する酵母によるキシランの分解）
実施例４で得られたポリウレタンフォームに固定された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ３，０００個に新たに反応液：粗キシラン１００ｇ、キシラナーゼ（総活性１５０Ｕ量）、キシロシダーゼ（総活性１５０Ｕ量）、および０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ培地３Ｌを加え、３〜２０Ｌ／分の通気量で気泡塔型培養槽内で３０℃、２４時間接触させた。反応中、ＫＯＨを用いて、ｐＨを５．０〜６．０にコントロールした。
【００８４】
第１サイクルの反応液を回収した後、新たな反応液を加え、２サイクルの反応を行い、これを５サイクルまで行った。第１サイクル終了後の反応液組成を分析した結果、培養槽内に１１．５ｇのキシロースが生産されていることがわかった。なお、ポリウレタンフォームに固定された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ（アラビノフラノシダーゼ）を加えなかった場合には、培養槽内には９．５ｇのキシロースが生産されていた。即ち、アラビノフラノシダーゼを添加することにより、約２０％のキシロースの生産増加が見られた。
第２サイクル以降も活性は落ちることなく、固定化された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢは高いアラビノフラノシダーゼ活性を発現した。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明のポリヌクレオチドの構成を示す図である。
【図２】ＧＰＩアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を説明する図である。
【図３】実施例における表層提示ベクター作成の模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表層にアラビノフラノシダーゼを保持する酵母及びそれを用いたキシラン分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境やエネルギーに対する関心が高まるなか、エタノールの自動車燃料としての直接利用やガソリンのような既存燃料への一部添加が検討されている。これにより、化石燃料への依存度が減り、懸念されている化石燃料の枯渇を防ぐことができる。また、エタノールは、通常のガソリンに比べ、環境汚染が非常に少ない燃料である。
【０００３】
従来、発酵による工業用アルコールの製造原料として、サトウキビから得られる糖質、トウモロコシ等の食用作物から得られるデンプン等が主に用いられている。しかし、これらの農作物は高価であるため、燃料用エタノール（バイオエタノール）の製造原料として使用するのは実用的ではない。また、将来、地球規模での食料不足が予測される点でも、農作物をエタノール発酵原料として用いることは実用的ではない。
【０００４】
一方、木質系バイオマスは、大量かつ低価格で入手でき、また食用に供されるものでないため、バイオエタノール原料として期待されている。木質系バイオマスは、セルロース５０％程度、ヘミセルロース２０〜３０％程度、及びリグニン２０〜３０％程度で構成されている。セルロースは、グルコースの重合体である。ヘミセルロースの主成分はキシランであり、キシランは、例えば広葉樹やイネ科植物では、Ｄ−キシロース残基がβ−１，４結合したキシラン主鎖にＬ−アラビノース、グルクロン酸、４−Ｏ−メチルグルクロン酸などが短い側鎖として結合した多糖類である。
【０００５】
高分子多糖は糖分解酵素で加水分解して単糖にすることにより初めてエタノール発酵の基質となり得る。木質系バイオマスは、食用作物に較べて、ヘミセルロースの含有比率が高いため、ヘミセルロースの加水分解反応の効率が木質系バイオマスからのエタノール生産効率を定める大きな要素となっている。
【０００６】
キシラン主鎖のキシロース間のβ−１，４結合を分解する酵素として、キシラナーゼ及びキシロシダーゼが知られている。しかし、アラビノース側鎖が付加した枝分かれ部分にはこれらの酵素が作用し難いため、これらの酵素だけでは十分にキシランを加水分解することができず、キシロースの回収率が低く、ひいてはバイオエタノールの生産効率が低くなる。
【０００７】
側鎖のアラビノースと主鎖のキシロースとの間の結合を分解する酵素は、アラビノフラノシダーゼである。アラビノフラノシダーゼをキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼと共にキシランに作用させれば、キシランの分解によるキシロースの収率が向上することが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
しかし、キシラナーゼやキシロシダーゼと異なり、アラビノフラノシダーゼは工業利用できる程度に大量に生産する技術が確立されていない。また、これらの酵素を生産する微生物を用いてキシランの分解によりキシロースを生産することも考えられるが、キシランは高分子であるため細胞膜を透過し難く、その結果キシロースの生産効率が悪い。
【０００９】
【非特許文献１】平成１５年度 第５５回 日本生物工学大会 講演要旨集 ｐ１９ 岐阜大・農 高見澤ら
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、キシラン分解物の効率的な製造方法及びそれに用いる材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
（１） 上流側から、酵母細胞内で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、及び、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチドを発現可能な状態で保持する酵母は、アラビノフラノシダーゼとＮ末端にＧＰＩアンカー付着シグナルを有する細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質が、細胞表面に高密度に固定されたものとなる。
【００１２】
タンパク質が、細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に高密度に固定され得るか否かは、タンパク質の種類によって大きく異なり、成功しない例もある。また、表層提示されたとしても、固定された状態で活性を示すことができるか否かはタンパク質の種類によって大きく異なり、細胞表層に固定されることにより活性を失う場合もある。このような状況の下で、本発明者は、キシロース製造に有用なアラビノフラノシダーゼを細胞表層局在タンパク質との融合タンパク質として酵母細胞表層に提示させ、かつ高い酵素活性を発現させることに成功した。
（２） キシランを、上記のアラビノフラノシダーゼ提示酵母、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下でインキュベートすることにより、主鎖のキシロース間の結合及び側鎖のアラビノースと主鎖のキシロースとの間を結合が効率的に分解することができ、キシロースやアラビノースなどのキシラン分解物を高収率で製造することができる。
【００１３】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のポリヌクレオチド、酵母及びキシラン分解物の製造方法を提供する。
【００１４】
項１． ５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【００１５】
項２． 細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンをコードする配列に含まれる項１に記載のポリヌクレオチド。
【００１６】
項３． 細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から３２０ないしは６００個のアミノ酸をコードする配列中に含まれる項２に記載のポリヌクレオチド。
【００１７】
項４． アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来する酵素である項１、２又は３に記載のポリヌクレオチド。
【００１８】
項５． 酵母細胞で機能できるプロモーターに発現可能な状態で連結された、項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【００１９】
項６． 項５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００２０】
項７． 項５に記載のポリヌクレオチド又は項６に記載の発現ベクターを保持する酵母。
【００２１】
項８． キシランを、項７に記載の酵母及びキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【００２２】
項９． 酵母が担体に固定化されている項８に記載の方法。
【００２３】
項１０． キシランを項７に記載の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物を、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【００２４】
項１１． 酵母が担体に固定化されている項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、活性なアラビノフラノシダーゼを細胞表層に高密度に保持する酵母が得られた。この酵母細胞とキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼとを、キシランに作用させることにより、効率的にキシランを分解して、キシロース及びアラビノースを始めとするキシラン分解物を得ることができる。
【００２６】
詳述すれば、キシランの主鎖のβ−１，４結合を分解するキシラナーゼ及びキシロシダーゼは工業利用できるだけの量を入手できるが、それに見合った量のアラビノフラノシダーゼを低コストで生産する技術は存在しなかった。
【００２７】
本発明の酵母は細胞表面に活性なアラビノフラノシダーゼを保持しているため、この酵母を培養することにより、大量のアラビノフラノシダーゼを安価に入手できる。
【００２８】
また、本発明の酵母は細胞表面にアラビノフラノシダーゼが高密度に固定されているため、反応液中の酵母密度を高くすることにより、アラビノフラノシダーゼ濃度を高くすることができる。これにより、本発明の酵母をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼとともに反応液中に存在させることにより、キシランの側鎖を効率的に分解するとともに、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによるキシラン主鎖の分解を促進し、その結果、キシロースを含むキシラン分解物の回収率及び製造速度が向上する。
【００２９】
また本発明の酵母は細胞表面上にアラビノフラノシダーゼが固定されているため、細胞膜を透過し難い高分子のキシランを効率的に分解できる。
【００３０】
本発明によれば、従来、加水分解が難しかったキシランを効率的に加水分解できるため、木質系バイオマスのエタノール発酵による利用の路が開けた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、５’末端から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、及び、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を含むポリヌクレオチドである。これを図１に示す。
分泌シグナル配列
本発明のポリヌクレオチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３２】
本発明において、ポリヌクレオチドは、特に言及しない限り、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。また特に言及しない限り、２本鎖又は１本鎖のいずれであってもよい。また特に言及しない限り、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよく、ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ−末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、２０個程度のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
【００３４】
本発明においては、アラビノフラノシダーゼを酵母の細胞外に分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、どのようなものでも用いることができ、その起源は問わない。例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα因子の分泌シグナルペプチド配列等を好適に用いることができる。特に、分泌効率の点で、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列が好ましい。また、アスペルギルス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列も好ましいものとして挙げられる。
アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列
本発明において、アラビノフラノシダーゼ活性とは、キシラン主鎖のキシロースと側鎖のアラビノースとの間の結合を分解する活性をいう。アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列は、アラビノフラノシダーゼの全長をコードするポリヌクレオチドであってもよく、アラビノフラノシダーゼ活性を示す限り、酵素活性を示す一部の領域をコードするポリヌクレオチドであってもよい。また、アラビノフラノシダーゼ活性を示す限り、天然アラビノフラノシダーゼをコードする配列において、１又は２以上のヌクレオチドが欠失、付加又は置換された配列であってもよい。
【００３５】
アラビノフラノシダーゼの起源は特に限定されず、微生物、植物、動物などのいずれの生物に由来する酵素であってもよい。中でも、調製や取り扱いが容易である点で、微生物由来のものが好ましく、アスペルギルス・オリゼ由来のものがより好ましい。アスペルギルス・オリゼ由来のアラビノフラノシダーゼは、耐熱性に優れるため、反応槽内の温度制御が困難な工業スケールのリアクターで使用することができる点で、実用性の高い酵素である。
本発明者らはすでに、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子ａｂｆＡをアスペルギルス・オリゼから取得している。また、この酵素を酵母表層に提示させることにも成功している（特願２００４−６１３７９）。今回さらに、別の遺伝子として、既に見つかっているアスペルギルス・オリゼ由来のａｂｆＢ遺伝子に着目した。そして、ａｂｆＢについて、酵母細胞表層におけるアラビノフラノシダーゼの酵素活性を検討した。
今回用いたアスペルギルス・オリゼ由来のアラビノフラノシダーゼをコードするＤＮＡ配列を配列番号８に示す。また、コードするポリペプチドがアラビノフラノシダーゼ活性を有する限り、配列番号８又はこの配列において、１又は２以上のポリヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたものであってもよい。例えば、置換後の対応アミノ酸が、置換前のアミノ酸と、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性等の点で同じ性質を有するような置換を行うことができる。
細胞表層局在タンパク質
＜細胞表層局在タンパク質＞
本発明方法では、細胞表層に固定化され又は付着ないしは接着して、そこに局在するタンパク質であればよく、公知のものを制限なく使用できる。
【００３６】
細胞膜に局在するタンパク質としては、膜貫通タンパク質や細胞表層局在タンパク質が挙げられる。膜貫通タンパク質は、疎水性アミノ酸領域部分で脂質二重膜を貫通しているタンパク質であり、受容体タンパク質に多く見られる。一方、細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。その他に、固定化の機構が明らかにされていない細胞表層局在タンパク質もあり、本発明方法ではそれらも使用できる。細胞表層局在タンパク質としては、後述する各種ＧＰＩアンカリングタンパク質、やＢＧＬ２などが知られている。ＢＧＬ２は、酵母のβ−グルカナーゼであり、細胞壁に強く結合することは分かっているが、その機構は不明のタンパク質である。また、ＢＧＬ２は、ＧＰＩアンカータンパク質と共通するモチーフは有さない。
＜ＧＰＩアンカリングタンパク質＞
細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：エタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカリングタンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカリングタンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
【００３７】
ＧＰＩアンカリングタンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は以下のようにして行われる。即ち、ＧＰＩアンカリングタンパク質は、転写及び翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカリングタンパク質のＣ末端又はその近傍の領域には、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカリングタンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔及びゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
【００３８】
ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
【００３９】
ＧＰＩアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を図２に示す。
＜本発明の細胞表層局在タンパク質の１例としてのＧＰＩアンカリングタンパク質＞
このように、ＧＰＩアンカリングタンパク質は、本発明にいう細胞表層局在タンパク質の１種であって、しかもＧＰＩアンカー付着シグナルを有するものである。本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列からなる配列として、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含むＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードするポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４０】
ＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む、通常Ｃ末端の領域である。この細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、アラビノフラノシダーゼ活性を阻害しない限り、その他ＧＰＩアンカリングタンパク質のどのような部分を含んでいてもよい。
【００４１】
ＧＰＩアンカリングタンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよく、公知のＧＰＩアンカリングタンパク質を制限なく使用できる。公知のＧＰＩアンカリングタンパク質としては、例えば、酵母の性凝集タンパク質であるα−又はａ−アグルチニン、Ｆｌｏ１タンパク質、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，６−１０，１９９３） 、大腸菌マルトーストランスポーターＬａｍＢ、大腸菌鞭毛タンパク質ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、枯草菌細胞壁溶解酵素ＣｗｌＢ等が挙げられる。
【００４２】
特に、酵母のα−アグルチニンを好適に使用できる。α−アグルチニンのＣ末端側から３２０ないしは６００個のアミノ酸からなる領域（即ち、Ｃ末端から３２０個のアミノ酸からなる領域、Ｃ末端から３２１個のアミノ酸からなる領域、……Ｃ末端から５９９個のアミノ酸からなる領域、又はＣ末端から６００個のアミノ酸からなる領域）を用いることが好ましく、Ｃ末端側から３２０個のアミノ酸からなる領域をコードするポリヌクレオチド配列を用いることがより好ましい。α−アグルチニンのＣ末端側から３２０個のアミノ酸からなる配列には、４カ所の糖鎖結合部位が存在する。ＧＰＩアンカーがＰＩ−ＰＬＣにより切断された後、この糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、α−アグルチニンの細胞壁への固定を増強する。
【００４３】
α−アグルチニンのようなＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列は、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列との双方を本来的に含んでいるが、本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とが、別々の起源から調製されたものであってもよい。
ポリヌクレオチドの作製方法
分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの製造方法は、当業者には周知の技術である。
【００４４】
例えば、分泌シグナル配列とアラビノフラノシダーゼの構造遺伝子との結合は、ＤＮＡ連結酵素（Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ＴａｋａＲａ社）等を用いて行うことができる。さらにこの配列と、例えばＧＰＩアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列とを結合する際も同様にできる。
（２）発現ベクター
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）が酵母細胞内で発現できるように連結された発現ベクターである。即ち、本発明の発現ベクターにおいては、酵母細胞で機能できるプロモーターの下流に、このプロモーターにより発現できるように本発明のポリヌクレオチドが連結されている。
【００４５】
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であっても良い。ベクターの調製が容易である点および酵母細胞の形質転換が容易である点でプラスミドベクターであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの構築や、本発明のポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みを大腸菌を用いて簡単に行うことができるように、酵母と大腸菌との間のシャトルベクターであることが好ましい。このようなシャトルベクターは公知のものを制限なく使用できる。
【００４６】
酵母−大腸菌シャトルベクターとしては、例えば、酵母の２μｍプラスミド又は酵母染色体の複製開始点（Ｏｒｉ）を大腸菌プラスミドベクターに挿入したものが挙げられる。このシャトルベクターは、この酵母の複製開始点と大腸菌の複製開始点（ＣｏｌＥ１）とを有している。また、通常、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を備えていればよい。また、アラビノフラノシダーゼ構造遺伝子を発現させるために、通常、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列も含んでいればよい。本発明のポリヌクレオチドを挿入する酵母−大腸菌シャトルベクターとしては、ｐＹＥ２２ｍ、ｐＹＧＡ２２７０等が挙げられる。これらのベクターのＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとの間のこのプロモーターにより発現可能な位置に、本発明のポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００４７】
発現ベクター中の本発明のポリヌクレオチドの状態を図２に示す。
（３）酵母
本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを保持する酵母である。本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド（ここでは主にＤＮＡ）又は発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。「ポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入」とは、酵母細胞中にポリヌクレオチド又は発現ベクターを導入し、融合タンパク質を発現させることを意味する。
【００４８】
導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。
【００４９】
本発明の発現ベクターのプロモーターとＧＰＩアンカー付着シグナルとの間を、適当な制限酵素を用いて切断して得られる線状ポリヌクレオチドを上記例示した形質転換方法で酵母細胞に導入することもできる。
【００５０】
また、上記例示した形質転換方法で、酵母細胞で機能できるプロモーターに本発明のポリヌクレオチドを発現可能に連結したＤＮＡ断片を酵母細胞に導入することもできる。
【００５１】
本発明の酵母中に導入されたＤＮＡは、アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現できる限り、酵母細胞内でどのような形態で存在していてもよい。このＤＮＡは、例えば、プラスミドの状態、相同組換えにより宿主染色体に組み込まれた状態、又は宿主の核外遺伝子などに挿入された状態で存在していればよい。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドが導入された酵母は、常法に従い、例えばＴＲＰ１のような選択マーカーによる形質又はアラビノフラノシダーゼ活性等を指標として選択することができる。
【００５３】
得られた酵母の細胞表層にアラビノフラノシダーゼが固定されていることは、常法により確認できる。例えば、被験酵母に、抗アラビノフラノシダーゼ抗体と、ＦＩＴＣのような蛍光色素で標識した２次抗体、アルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体等とを作用させる方法、抗アラビノフラノシダーゼ抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
＜宿主＞
宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕ ｙｅａｓｔ）に属するものであればよく、特に限定されない。その中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅに属するものが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属であるものがより好ましい。
【００５４】
中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しい工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で、実用酵母が好ましい。実用酵母としては清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など、発酵食品に深く関与する酵母が挙げられる。実用酵母の中でも、高い発酵能と高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。
【００５５】
一般に、微生物にとってエタノールは有毒である。エタノール発酵する酵母も例外ではなく、エタノール濃度が８％（ｖ／ｖ）を超えると自身が生産したエタノールにより徐々に死滅してしまう。ここで、清酒酵母はエタノール濃度が２０％にも達する清酒モロミで長年選抜及び育種されてきた株であり、一般的な酵母に比べ極めて高いエタノール耐性を持っている。
本発明においては、酵母を用いてキシランの分解により、キシロースやアラビノースを製造するが、これらの５炭糖はエタノール発酵原料に供される。エタノール発酵では、培養液中のエタノール濃度を究極まで高めることが重要であることから、そこに用いられる酵母にはエタノール耐性能が高いことが求められる。
清酒酵母としては、日本醸造協会頒布の「きょうかい酵母」およびこれらを親株とした突然変異株などが挙げられる。また他にも、清酒醸造で使用されている酵母であればいずれも有用である。形質転換マーカーとして栄養要求性遺伝子を用いる場合は、これら清酒酵母に突然変異などの手法を用いて栄養要求性を付与した株を用いればよく、そのような栄養要求性としてはウラシル要求性、トリプトファン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、アデニン要求性などが挙げられる。清酒酵母にウラシル要求性を付与した例としては「きょうかい９号酵母」を宿主として突然変異法により取得したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕが挙げられる。
＜アラビノフラノシダーゼ活性＞
上記のようにして得られる本発明の酵母のアラビノフラノシダーゼ活性は、菌体１ｍｇあたり通常３〜１０×１０−５Ｕ程度である。酵母のアラビノフラノシダーゼ活性は実施例に記載の方法により測定した値である。
（４）第１のキシラン分解物の製造方法
本発明の第１のキシラン分解物の製造方法は、キシランを、本発明の酵母とキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。
キシラン
例えばスギ、ブナ、竹のような木材；雑草；籾殻、ふすまのような種子殻；稲藁；とうもろこしかす、サトウキビの絞りかす（バガス）のような植物かす；大豆ミールのような穀類等の植物性バイオマスから、爆砕、溶媒抽出、水蒸気蒸留、超臨界炭酸ガス抽出、加圧熱水抽出などの方法で、キシランおよびアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースを抽出することができる。
【００５６】
本発明方法では、キシランをヘミセルロースそのままの形で分解に供することもでき、又はヘミセルロースから分離されたキシランを分解に供することもできる。
酵母
反応液中の酵母密度は、酵母１細胞当たりに固定されているアラビノフラノシダーゼの数及び活性により異なるが、反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性が０．０２〜５Ｕ／ｌ程度となる密度とすることが好ましく、０．０５〜２Ｕ／ｌ程度となる密度とすることがより好ましい。
【００５７】
酵母は、そのまま反応液中に含まれていてもよく、又は、固定化されていてもよいが、連続反応、回分式反応又は半回分式反応により連続使用できる点で、固定化されていることが好ましい。「固定化」とは、酵母が遊離の状態ではない状態を意味し、例えば、酵母が担体に結合、付着又は担体内部に取り込まれた状態を指す。固定化方法は特に限定されず、公知の微生物固定化方法を採用できる。このような公知の固定化方法としては、細孔を有する担体に酵母を保持させる方法、格子やマイクロカプセルにより酵母を包括する方法などが挙げられる。
【００５８】
担体としては、反応液中の水又は溶媒に対して不溶性の物質からなるものを用いる。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール、セルロース等の樹脂からなる多孔質体を好適に使用できる。また、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、シリコンフォームのような発泡体も多孔質体として使用できる。担体内で良好に酵母を増殖させることができ、さらに活性が低下した酵母や死滅した酵母を脱離させずに長期間保持することができる点で、多孔質の担体が望ましい。
【００５９】
多孔質体の細孔（開口部）の直径は、酵母の種類によっても異なるが、通常５０〜１０００μｍ程度が好ましく、５０〜１００μｍ程度がより好ましい。上記開口部直径の範囲であれば、酵母の侵入及び増殖が容易であるとともに、高密度で酵母を保持することができる。
【００６０】
また担体の外形は、特に限定されず、球状、立方体状又は不定形などの粒状；網目状、シート状などのいずれの形状であってもよい。調製が容易である点で、粒状であることが好ましい。粒子の大きさは、例えば球状の場合直径が２〜５０ｍｍ程度、立方体状の場合２〜５０ｍｍ角程度とすればよい。
【００６１】
包括による酵母の固定化方法としては、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、κ−カラギーナン、合成プレポリマー（光架橋性樹脂プレポリマー、ウレタンプレポリマー等）などを用いて格子状に酵母を包括する方法；相分離法、界面重合法、水中乾燥法などの手法で高分子半透膜からなるマイクロカプセルで酵母を覆うことによりこれを包括する方法が挙げられる。また、酵母を互いに架橋する方法もあげられる。
キシラナーゼ・キシロシダーゼ
キシランの主鎖のキシロース間のβ−１，４結合を分解するために、反応液中にキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼを添加する。キシラナーゼ及びキシロシダーゼは、いずれもキシラン主鎖のβ−１，４結合を切断する活性を有する。この中で、キシラナーゼは、エンド型酵素であり、キシラン主鎖の部位に関係なく切断する活性を有する。一方、キシロシダーゼは、エキソ型酵素であり、キシラン主鎖の末端から順番にキシロースを一つずつ切断する。従って、キシラナーゼ単独ではキシランからキシロースを製造することはできない。また、キシロシダーゼはキシラン末端から分解するという性質上、反応速度が遅くなる。本発明方法では、キシラナーゼとキシロシダーゼとを組み合わせて使用することが好ましい。
【００６２】
これらの酵素は、どのような生物に由来するものであってもよい。例えば、バクテリアやカビ等の起源のものを使用できる。中でも、酵素の大量調製が容易である等の点でカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）起源のものを使用することが好ましい。
【００６３】
キシロシダーゼ及びキシラナーゼの使用量は、反応液中の活性が、通常０．１〜２００Ｕ／ｌ程度、好ましくは１〜２０Ｕ／ｌ程度となるようにすればよい。これらの酵素活性は実施例に記載の方法により測定された値である。
反応
アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによるキシランの分解反応は、反応容器内の反応液中に遊離の酵母又は固定化された酵母を懸濁した状態で行うことができる。また、カラムのような反応容器内に遊離又は固定化された酵母を充填したバイオリアクターを用いて行うこともできる。また、反応は連続式、回分式（バッチ式）又は半回分式のいずれの方式で行ってもよい。
【００６４】
反応液中には、基質のみ含まれていてもよく、又はこれに加えてｐＨ調製のための緩衝剤や酵母の生存に必要な公知の物質が含まれていてもよい。
【００６５】
反応液中の基質（キシラン）の濃度は、通常０．０２〜２０重量％程度とすることが好ましく、０．０５〜５重量％程度とすることがより好ましい。基質濃度が余りに低いと、実用的なキシロース製造効率が得られない。逆に、基質濃度が余りに高いと、反応液の粘度が上がり、攪拌や温度制御等が難しくなったり、反応液の浸透圧が上がり、酵母に多大なストレスがかかる状態になったりする場合がある。極度のストレスは細胞増殖の悪化や細胞の死滅（破壊）の引き金となり、その結果、理想的な反応効率が得られなくなる。しかし、上記詰範囲であれば、このような問題は生じない。
【００６６】
反応液のｐＨは、アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの至適ｐＨを含む４〜８程度が好ましい。反応の進行とともに反応液のｐＨが低下するため、上記ｐＨ範囲になるように調整することが望ましい。
【００６７】
反応温度は、酵母が保持するアラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼが活性を示す温度であればよく、通常２０〜６０℃程度が好ましい。耐熱性酵素を用いる場合は、さらに高温で行うことができる。この場合、酵母が生育できなくても、表層のアラビノフラノシダーゼは活性を有したまま固定されているため、分解反応には支障がない。
【００６８】
反応液中にキシランの他にセルロースなどが混在する場合には、セルラーゼ等の各種糖加水分解酵素を併用してもよい。
【００６９】
反応液中の各成分濃度を、例えば、ガスクロマトグラフやＨＰＬＣなどで経時的に測定することによりモニターすることにより、基質の追加量、反応時間、ｐＨ調整剤の添加量などを決定すればよい。
キシラン分解物の回収
キシランの起源生物種によっても異なるが、上記の反応により反応液中に主にキシロース、アラビノース等が生成する。反応終了後の反応液から、遠心分離などにより単糖を分離すればよい。これによりキシラン分解物を回収できる。これらの単糖は、そのまま、エタノール発酵の基質として用いることができる。
（５）第２のキシラン分解物の製造方法
本発明の第２のキシラン分解物の製造方法は、キシランを本発明の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。
アラビノフラノシダーゼによる分解工程（工程（ａ））
基質、酵母及び反応方法については、第１の方法と同様である。反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性についても第１の方法と同様である。反応終了後の反応液は、そのまま、又は遠心分離などによりアラビノースを回収して除去した後、次工程に供される。
キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによる分解工程（工程（ｂ））
本発明の酵母を用いてキシランの側鎖のアラビノースを分解した後に、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼにより主鎖のキシロースを分解する。反応方法及びキシラン分解物の回収方法は第１の方法と同様である。また反応液中の酵素活性についても第１の方法と同様である。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７０】
本発明において、酵素活性は以下の方法により測定した値である。
＜アラビノフラノシダーゼ活性の検出＞
アラビノフラノシダーゼ活性の有無は、菌体又は培養上清を１ｍＭ ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で３時間静置した後、遊離した４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを目視にて確認した。遊離４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌは黄色を呈するため、この呈色を確認する。
＜菌体のアラビノフラノシダーゼ活性の定量＞
アラビノフラノシダーゼ活性は、菌体又は培養上清を１ｍＭ ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で３時間静置した後、遊離した４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量から求めた。アラビノフラノシダーゼ活性１Ｕ＝４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ から１分間に１μｍｏｌの４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
＜キシラナーゼ活性の定量＞
キシラナーゼ活性の測定は、菌体又は培養上清又は精製酵素溶液を１％ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ社）を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で２時間静置した後、遊離した糖の還元力をソモギーネルソン法により定量した。キシラナーゼ活性１Ｕ＝ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ から１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元力を生成する酵素量、と定義した。
＜キシロシダーゼ活性の定量＞
キシロシダーゼ活性は、菌体又は培養上清精製酵素溶液を１ｍＭ ２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｘｙｌｏｓｉｄｅを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に添加し、３０℃で５分間静置した後、遊離した２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量から求めた。キシロシダーゼ活性活性１Ｕ＝２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｘｙｌｏｓｉｄｅ から１分間に１μｍｏｌの２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
【実施例１】
【００７１】
（分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼの構造遺伝子配列、α−アグルチニンの一部の配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの作製）
掲題のＤＮＡを作製した手順を、図３を参照して説明する。
（Ａ） 常法に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼの分泌シグナル配列を取得した。簡単に述べると、５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：１）及び５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴ−３’（配列番号：２）を合成し、これをプライマーとして、プラスミドｐＮＧＢ１（Ｇｅｎｅ ２０７ １２７−１３４ （１９９８））を鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後に分泌シグナル配列をアラビノフラノシダーゼと融合させるため、制限酵素サイトＥｃｏＲＩとＳａｌＩを付加するようにした。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、約１００ｂｐのグルコアミラーゼ分泌シグナル配列を取得した。配列表の配列番号：７にその配列を示す
（Ｂ） 常法に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのアラビノフラノシダーゼＢのｃＤＮＡを取得した。簡単に述べると、まず、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅから全ＲＮＡを抽出し、ついで、オリゴｄＴセルロースを用いてＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。
【００７３】
次にＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社のＲＴ−ＰＣＲ ＫＩＴを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ混合物を取得した。即ち、５’−ｇｔｃｇａｃＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号：３）及び５’−ｇｔｔａａｃＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡ−３’（配列番号：４）を合成し、これをプライマーとして、先ほどのｃＤＮＡ混合物を鋳型にＰＣＲした。ＰＣＲは、５０℃／３０分−９４℃／２分の後、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／２分のサイクルを３０回繰り返す条件で行った。ここで、両プライマーの設計には、後にアラビノフラノシダーゼの一方の末端を分泌シグナル配列と融合させるために制限酵素サイトＳａｌＩを付加し、他方の末端をα−アグルチニンのＣ末端の一部と融合させるため、制限酵素サイトＨｐａＩを付加し、また翻訳終止コドンを除去した。
【００７４】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＳａｌＩとＨｐａＩで切断し、約１．５ｋｂｐのアラビノフラノシダーゼｃＤＮＡ断片を得た。配列表の配列番号：８にその配列を示す。
（Ｃ） α−アグルチニンのＣ末端の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を有する遺伝子（３２０アミノ酸）を有する配列を取得するため、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ８−１から、常法により染色体ＤＮＡを単離し、５’−ｃｃｃｇｇｇｇｃｔｃｇＡＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号：５）および５’−ｇｇｔａｃｃＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：６）の２つのプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−５２℃／１分−７２℃／２分のサイクルを３０回繰り返した。
【００７５】
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、ＳｍａＩとＫｐｎＩとで消化して、ＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片を得た。このＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片には、α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする配列と、３’非コード領域の４４６ｂｐとを含んでおり、この配列中にＧＰＩアンカー付着シグナル配列が含まれている。配列表の配列番号：９にその配列を示す。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドの１実施例である目的ＤＮＡは、（Ａ）で得られた分泌シグナル配列と（Ｂ）で得られたアラビノフラノシダーゼ遺伝子と（Ｃ）で得られたＳｍａＩ −ＫｐｎＩ断片を、常法に従いＤＮＡ連結酵素（Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ）等を用いて接続することより得られる。
【００７７】
得られた目的ＤＮＡをプラスミドｐＲＳ４０６ Ｐｓｅｄ１のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ切断部位に挿入して、本発明の１実施例である目的プラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢを得た。
【実施例２】
【００７８】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の作製）
実施例１で得られたプラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＫ１１３−ａｂｆＢが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢと名付けた（以下、単にＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢという）。
【００７９】
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのアラビノフラノシダーゼ活性を測定した。コントロールとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールは、培地および菌体にアラビノフラノシダーゼ活性はみとめられなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢの培地中にはほとんどアラビノフラノシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ菌体はアラビノフラノシダーゼ活性を有していた。
【実施例３】
【００８０】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼＢを有する酵母によるキシランの分解）
実施例２で得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢをＹＮＢ培地で生育させた後、集菌、洗浄し、菌体を反応液（０．５％Ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｏａｔ ｓｐｅｌｔｓ（ＳＩＧＭＡ社製）（ｐＨ５．０））にアラビノフラノシダーゼ活性が５ｍＵとなるように加え、キシラナーゼ、キシロシダーゼをそれぞれ２０ｍＵ加え、３０℃で反応させた。反応３時間後、遠心し、その上清のキシロースを定量し、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを加えなかった場合と比較した。
その結果、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢを添加することにより、キシロース生産量が１８％上昇した。用いたＸｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｏａｔ ｓｐｅｌｔｓ（ＳＩＧＭＡ社製）のアラビノース含量は１０％であるので、この結果から、ａｂｆＢを用いた場合、ほぼ完全にキシランからアラビノース側鎖を除くことができたことが分かった。
【実施例４】
【００８１】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の固定化）
０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ培地３Ｌを含む気泡塔型培養槽に、６ｍｍ角のポリウレタンフォームＢＳＰｓを、１，０００個／Ｌとなるように投入し、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢとともに６〜２０Ｌ／分の通気量で培養した。これにより、ポリウレタンフォームに酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢが固定された。
【００８２】
この酵母のアラビノフラノシダーゼ活性はポリウレタンフォーム１個当たり０．０１Ｕであった。
【実施例５】
【００８３】
（固定化された細胞表層にアラビノフラノシダーゼＢを有する酵母によるキシランの分解）
実施例４で得られたポリウレタンフォームに固定された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ３，０００個に新たに反応液：粗キシラン１００ｇ、キシラナーゼ（総活性１５０Ｕ量）、キシロシダーゼ（総活性１５０Ｕ量）、および０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、０．０７７％ ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社）、２％グルコースを含むＳＤ培地３Ｌを加え、３〜２０Ｌ／分の通気量で気泡塔型培養槽内で３０℃、２４時間接触させた。反応中、ＫＯＨを用いて、ｐＨを５．０〜６．０にコントロールした。
【００８４】
第１サイクルの反応液を回収した後、新たな反応液を加え、２サイクルの反応を行い、これを５サイクルまで行った。第１サイクル終了後の反応液組成を分析した結果、培養槽内に１１．５ｇのキシロースが生産されていることがわかった。なお、ポリウレタンフォームに固定された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢ（アラビノフラノシダーゼ）を加えなかった場合には、培養槽内には９．５ｇのキシロースが生産されていた。即ち、アラビノフラノシダーゼを添加することにより、約２０％のキシロースの生産増加が見られた。
第２サイクル以降も活性は落ちることなく、固定化された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ−ａｂｆＢは高いアラビノフラノシダーゼ活性を発現した。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明のポリヌクレオチドの構成を示す図である。
【図２】ＧＰＩアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を説明する図である。
【図３】実施例における表層提示ベクター作成の模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンをコードする配列に含まれる請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から３２０ないしは６００個のアミノ酸をコードする配列中に含まれる請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来する酵素である請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
酵母細胞で機能できるプロモーターに発現可能な状態で連結された、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチド又は請求項６に記載の発現ベクターを保持する酵母。
【請求項８】
キシランを、請求項７に記載の酵母及びキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【請求項９】
酵母が担体に固定化されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キシランを請求項７に記載の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物を、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【請求項１１】
酵母が担体に固定化されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
５’末端側から順に、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、アラビノフラノシダーゼ活性を示すポリペプチドをコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンをコードする配列に含まれる請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とＧＰＩアンカー付着シグナル配列とからなる配列が、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から３２０ないしは６００個のアミノ酸をコードする配列中に含まれる請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来する酵素である請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
酵母細胞で機能できるプロモーターに発現可能な状態で連結された、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチド又は請求項６に記載の発現ベクターを保持する酵母。
【請求項８】
キシランを、請求項７に記載の酵母及びキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【請求項９】
酵母が担体に固定化されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キシランを請求項７に記載の酵母の存在下で分解する工程（ａ）と、工程（ａ）により得られたキシラン部分分解物を、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程（ｂ）と、キシラン分解物を回収する工程とを含む、キシラン分解物の製造方法。
【請求項１１】
酵母が担体に固定化されている請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２０５３９（Ｐ２００７−２０５３９Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１１４５５（Ｐ２００５−２１１４５５）
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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