アルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するための分析方法およびかかる方法に使用するキット
【課題】アルカリ性スフィンゴミエリナーゼの存在についての診断方法を提供する。
【解決手段】患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）の存在を評価するための蛍光定量的分析方法およびかかる方法に使用されるキット。アルカリ性ＳＭａｓｅは大腸癌などの重篤な病状のマーカーである。
【解決手段】患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）の存在を評価するための蛍光定量的分析方法およびかかる方法に使用されるキット。アルカリ性ＳＭａｓｅは大腸癌などの重篤な病状のマーカーである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼの存在の評価を必要とする患者の便または体液におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの存在を評価するための分析方法に関する。本発明はまた、かかる分析方法を実施するためのキットにも関する。
【０００２】
より具体的には、本発明の方法は、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出のためのインビトロでの蛍光定量的方法であり、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼは以下に詳細に記載するように、大腸癌や家族性大腸ポリープ症などの、重篤な病状のマーカーである。
【背景技術】
【０００３】
酵素、スフィンゴミエリナーゼ（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＳＭａｓｅ）は、スフィンゴミエリンのセラミドとコリンリン酸塩への加水分解を触媒する。
【０００４】
３種類のＳＭａｓｅ（酸性、中性およびアルカリ性）が今日までに同定されており、これらは以下のようないくつかのアイソフォームとして存在する：
−リソソーム酸性ＳＭａｓｅ（Ａ−ＳＭａｓｅ）；
−細胞基質Ｚｎ２＋−依存性酸性ＳＭａｓｅ；
−膜中性マグネシウム−依存性ＳＭａｓｅ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）；
−細胞基質マグネシウム−非依存性Ｎ−ＳＭａｓｅ；および、
−アルカリ性ＳＭａｓｅ。
【０００５】
ＳＭａｓｅは広範な生理的および病理的プロセスにおいて役割を果たしていることが示されており、これらプロセスには以下が含まれる：エンドサイトーシスされたＳＭのリソソームによる加水分解、セラミドにより媒介される細胞のシグナル伝達、アテローム発生、最終分化、細胞周期の停止、アポトーシス、炎症、および真核生物のストレス応答の調節。
【０００６】
それぞれリソソームおよび膜結合酵素として細胞中に存在する酸性および中性ＳＭａｓｅとは対照的に、アルカリ性ＳＭａｓｅは組織差および種差を示す。ヒトにおいては、アルカリ性ＳＭａｓｅは腸粘膜および胆汁中にみられる。アルカリ性ＳＭａｓｅは、十二指腸にて出現し、腸内、特に空腸の遠位部分で高レベルに達し、そして結腸および直腸においてはかなりの量が存在する。このＳＭａｓｅは至適アルカリ性ｐＨ９．０を示し、Ｍｇ２＋−非依存性、胆汁酸塩−依存性そしてトリプシン耐性である。
【０００７】
アルカリ性ＳＭａｓｅの病理学的な重要性が最近認識されるようになったため。主に以下の理由による数々の研究が促進された。
【０００８】
第一に、この酵素は、ミルク、卵、肉および魚にかなりの量存在する食餌性スフィンゴミエリンの加水分解を担っている可能性がある。第二に、この酵素はコレステロールの吸収を調節している可能性がある。第三に、腸管にアルカリ性ＳＭａｓｅが存在すること、および該酵素の検出量が結腸直腸癌において選択的に減少していることは、この酵素が腸の発癌において役割を果たしていることを示唆する。というのは、生理的条件下では、この酵素はアポトーシスを刺激し、腸粘膜を発癌から保護するからである。
【０００９】
以前の研究により、生理的条件下では、アルカリ性ＳＭａｓｅは胆汁酸塩により、腸粘膜から管腔へと解離するということも示された。しかし、胆汁酸塩濃度が異常に高い病理的条件下では、胆汁酸塩によるアルカリ性ＳＭａｓｅの解離が酵素の生合成より過剰となり、その結果粘膜におけるアルカリ性ＳＭａｓｅ活性が低レベルとなり、大便または体液、即ち胆汁への該酵素の排出が異常に多くなる。その結果、正常の基準値を超える便または体液中へのアルカリ性ＳＭａｓｅの排出過剰は、結腸直腸癌および家族性大腸ポリープ症についての診断マーカーとして有用であると考えられる。したがって、腸管の上記病状を患っている可能性のある患者の便または体液中のアルカリ性ＳＭａｓｅを検出するための信頼できるアッセイが必要となる。
【００１０】
さらに、細菌株（例えば、ストレプトコッカス・ターモフィラス（Streptococcus termophilus)、乳酸桿菌(Lactobacilli））のなかには高ベルのＳＭａｓｅを含むものがあり、アルカリ性ＳＭａｓｅの評価により、プロバイオティクスおよび／またはプロバイオティクスに基づく産物による処理後の該細菌の数の変化を評価する方法が提供される。
【００１１】
アルカリ性ＳＭａｓｅのアッセイ方法は以前から知られている。ＳＭａｓｅの活性は、インビボでＳＭの放射性前駆体により細胞を標識し、標識産物のレベルを測定することにより、あるいはインビトロで放射標識されたＳＭまたは色素生産性のＳＭのアナログあるいは中性ＳＭの色素および蛍光誘導体を用いることにより、判定することができる。
【００１２】
これらの既知の一般に用いられているアッセイは完全には満足のいくものではなかった。というのは、これらアッセイは放射性アッセイであるため非常に危険である可能性があり、蛍光定量的アッセイよりも感度が低いためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、既知の方法の欠点を克服する、結腸直腸癌や家族性大腸ポリープ症、または胆嚢または肝疾患を患っている可能性のある患者の便または体液中のアルカリ性ＳＭａｓｅの信頼できる安価なアッセイを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、上記アッセイに使用するための分析用キットを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、様々な健康状態における、あるいは疾患または薬剤あるいはプロバイオティクスまたは食物サプリメントによる処置後の、細菌コロニー形成を評価することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の蛍光定量的、間接的アッセイ方法は、以下の反応の連続に基づく。
【００１７】
大便またはその他の体液中に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅの作用により、スフィンゴミエリンが加水分解されてセラミドとコリンリン酸になり、コリンリン酸はアルカリホスファターゼの作用により加水分解されてコリンが生じる。コリンオキシダーゼの存在下で、コリンから過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生じる。
【００１８】
後者の化合物を、西洋わさびペルオキシダーゼの存在下で、Ｈ２Ｏ２に対する高感度の蛍光発生プローブである１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン（以下、アンプレックス・レッド・試薬（Amplex Red Reagent）と称する）と反応させると、強い蛍光性の化合物であるレゾルフィン（resorufin）が生じる。蛍光は、蛍光測定（fluorocount）マイクロプレート蛍光光度計により、５３０−５６０ｎｍの励起、５９０ｎｍの蛍光検出にて測定される。
【００１９】
上記の連続する反応および蛍光検出手段に基づき、本発明のアルカリ性ＳＭａｓｅをアッセイする方法は、便について記載する以下の工程を含む。しかし、当業者にとって該方法を適宜常套の改変により胆汁などの体液に適用することが容易であることは明白である。
１）患者の便の試料を収集し、それを乾燥する工程；
２）乾燥させた試料から約３−４グラムを計量し、それを２０ｍｌのホモゲニゼーション・バッファー（０．２５Ｍ スクロース、０．１５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４）に懸濁する工程；
３）試料を４０００ｒｐｍ、＋４℃で６０分間遠心分離する工程；
４）上清を回収し、４０００ｒｐｍ、＋４℃で１５分間再び遠心分離する工程；
５）標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイ（Pierce Protein Assay）により上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲３２ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌを用い、そしてピペットにより２５μｌの各試料をウェルに移す工程；
６）２５μｌの各試料に、６５μｌのアッセイ・バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ９．０）および１０μｌの２９μＭスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに３ｍＭの濃度で胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）を添加する工程；
７）３７℃で１時間インキュベートする工程；
８）ピペットにより１００μｌの各標準（以下を参照）および１０μｌのスフィンゴミエリン（２９μＭ）を取り、試料と同様に３７℃で１時間インキュベートする工程；
９）１時間後、１００μｌの反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、７５０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭアンプレックスレッド、８Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．２Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
１０）反応物を１時間以上、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
１１）蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程；
１２）各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールからの値を差し引くことにより補正する工程。
【００２０】
本発明はまた、上記の方法にしたがって患者の便または体液中のアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキットにも関し、該キットは別々に以下の試薬の試料を含有する試験管を含む：
ａ）便または体液中のアルカリ性スフィンゴミエリナーゼによって、コリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン；
ｂ）コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ；
ｃ）コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ；
ｄ）過酸化水素とｅ）との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
ｅ）その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプラー・レッド試薬（Ampler Red Reagent（１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン））；および、
ｆ）濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【００２１】
本発明の分析方法を好適に実施するためには、上記キットの要素に加えて、以下のさらなる材料および装置が必要である：
スクロース；
塩化カリウム（ＫＣｌ）；
一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）；
Ｔｒｉｚｍａ塩基；
ＥＤＴＡ；
塩化ナトリウム；
タウロコール酸（ＴＣ）；
タウロデオキシコール酸（ＴＤＣ）；
グリココール酸（ＧＣ）；
グリコケノ（Glycocheno）デオキシコール酸（ＧＣＤＣ）；
β−グリセロリン酸；
ＡＴＰ二ナトリウム塩；
ＥＧＴＡ；
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬；
ウシ血清アルブミン；
冷却遠心機；
５５０−５６２ｎｍにて測定可能なマイクロプレート・リーダー、および、
蛍光測定マイクロプレート蛍光光度計。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】蛍光アッセイを用いたスフィンゴミエリナーゼの検出。各反応物は特定のアッセイバッファー中の示された量の細菌スフィンゴミエリナーゼを含有していた。反応物は３７℃で１時間インキュベートした。蛍光は励起５３０nm、蛍光検出５９０nmにて蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＳＭａｓｅ活性の定量を行うには、以下の手段をとるべきである。
【００２４】
検量線作成
キットにＳＭａｓｅの標準調製物を与える。これは、ｐＨ９で作用するタイプのＳＭａｓｅを含有する細菌抽出物からなる。以下の操作を行う。
ＳＭａｓｅ検量線の作成：濃度標準を希釈して段階希釈を作成する。
ＳＭａｓｅ標準を１ｍｌのアッセイ・バッファー（ｐＨ９．０）により再構成する；この再構成により９６ｍＵ／ｍｌのストック溶液を作成する。
０．５００ｍｌのアッセイ・バッファーをピペットにより各試験管に移す。ストック溶液を用いて限界希釈を作成する。各試験管を次の工程へ移す前によく混合する。未希釈の標準を高濃度標準（９６ｍＵ／ｍｌ）とし、検量線は以下の濃度の点を含むようにする（ｍＵ／ｍｌ）：９６−４８−２４−１２−６−３。バッファーはゼロ標準とする（０ｍＵ／ｍｌ）。
【００２５】
典型的検量線
図１に単に一例としての検量線を示す。検量線はアッセイする試料の各セットについて作成すべきである。
【００２６】
結果の計算
各標準と試料についての二連の読みを平均し、平均ゼロ標準蛍光を差し引く。
標準活性（ｍＵ／ｍｌ）に対して標準蛍光をプロットして最適曲線を引く。各試料のＳＭａｓｅ活性を決定するために、まずｙ−軸上の蛍光値をみつけ、検量線まで水平線を引く。交差点において、ｘ−軸まで垂直線を引き、対応するＳＭａｓ活性を読み取る。
【００２７】
記載した方法によりインビトロでのＳＭａｓｅ活性のアッセイが可能となる；これは、有機試料におけるアルカリ性ＳＭａｓｅを検出する目的で開発された。
【００２８】
アルカリ性ＳＭａｓｅを特異的にアッセイするためであるが、該方法は酸性および中性ＳＭａｓｅ活性を検出する条件を用いる。具体的には：
−ホモゲニゼーション・バッファーは中性のｐＨであるが、中性ＳＭａｓｅを排除するためにプロテアーゼおよびホスファターゼ・インヒビターを含まない。というのは中性ＳＭａｓｅはプロテアーゼおよびホスファターゼの活性に対して高感度であり、そのためこれらの酵素により阻害されるからである；
−ホモゲニゼーション・バッファーは、Ｍｇ依存性中性ＳＭａｓｅ活性を阻害するためにＭｇＣｌ２を含まない；
−反応バッファーはβ−グリセロリン酸およびＡＴＰを含むため、中性ｐＨでなお活性である酸性ＳＭａｓｅを妨げるために、この反応バッファーにおいて中性ＳＭａｓｅを阻害するための高濃度のＥＤＴＡとＥＧＴＡが存在する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼの存在の評価を必要とする患者の便または体液におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの存在を評価するための分析方法に関する。本発明はまた、かかる分析方法を実施するためのキットにも関する。
【０００２】
より具体的には、本発明の方法は、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出のためのインビトロでの蛍光定量的方法であり、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼは以下に詳細に記載するように、大腸癌や家族性大腸ポリープ症などの、重篤な病状のマーカーである。
【背景技術】
【０００３】
酵素、スフィンゴミエリナーゼ（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＳＭａｓｅ）は、スフィンゴミエリンのセラミドとコリンリン酸塩への加水分解を触媒する。
【０００４】
３種類のＳＭａｓｅ（酸性、中性およびアルカリ性）が今日までに同定されており、これらは以下のようないくつかのアイソフォームとして存在する：
−リソソーム酸性ＳＭａｓｅ（Ａ−ＳＭａｓｅ）；
−細胞基質Ｚｎ２＋−依存性酸性ＳＭａｓｅ；
−膜中性マグネシウム−依存性ＳＭａｓｅ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）；
−細胞基質マグネシウム−非依存性Ｎ−ＳＭａｓｅ；および、
−アルカリ性ＳＭａｓｅ。
【０００５】
ＳＭａｓｅは広範な生理的および病理的プロセスにおいて役割を果たしていることが示されており、これらプロセスには以下が含まれる：エンドサイトーシスされたＳＭのリソソームによる加水分解、セラミドにより媒介される細胞のシグナル伝達、アテローム発生、最終分化、細胞周期の停止、アポトーシス、炎症、および真核生物のストレス応答の調節。
【０００６】
それぞれリソソームおよび膜結合酵素として細胞中に存在する酸性および中性ＳＭａｓｅとは対照的に、アルカリ性ＳＭａｓｅは組織差および種差を示す。ヒトにおいては、アルカリ性ＳＭａｓｅは腸粘膜および胆汁中にみられる。アルカリ性ＳＭａｓｅは、十二指腸にて出現し、腸内、特に空腸の遠位部分で高レベルに達し、そして結腸および直腸においてはかなりの量が存在する。このＳＭａｓｅは至適アルカリ性ｐＨ９．０を示し、Ｍｇ２＋−非依存性、胆汁酸塩−依存性そしてトリプシン耐性である。
【０００７】
アルカリ性ＳＭａｓｅの病理学的な重要性が最近認識されるようになったため。主に以下の理由による数々の研究が促進された。
【０００８】
第一に、この酵素は、ミルク、卵、肉および魚にかなりの量存在する食餌性スフィンゴミエリンの加水分解を担っている可能性がある。第二に、この酵素はコレステロールの吸収を調節している可能性がある。第三に、腸管にアルカリ性ＳＭａｓｅが存在すること、および該酵素の検出量が結腸直腸癌において選択的に減少していることは、この酵素が腸の発癌において役割を果たしていることを示唆する。というのは、生理的条件下では、この酵素はアポトーシスを刺激し、腸粘膜を発癌から保護するからである。
【０００９】
以前の研究により、生理的条件下では、アルカリ性ＳＭａｓｅは胆汁酸塩により、腸粘膜から管腔へと解離するということも示された。しかし、胆汁酸塩濃度が異常に高い病理的条件下では、胆汁酸塩によるアルカリ性ＳＭａｓｅの解離が酵素の生合成より過剰となり、その結果粘膜におけるアルカリ性ＳＭａｓｅ活性が低レベルとなり、大便または体液、即ち胆汁への該酵素の排出が異常に多くなる。その結果、正常の基準値を超える便または体液中へのアルカリ性ＳＭａｓｅの排出過剰は、結腸直腸癌および家族性大腸ポリープ症についての診断マーカーとして有用であると考えられる。したがって、腸管の上記病状を患っている可能性のある患者の便または体液中のアルカリ性ＳＭａｓｅを検出するための信頼できるアッセイが必要となる。
【００１０】
さらに、細菌株（例えば、ストレプトコッカス・ターモフィラス（Streptococcus termophilus)、乳酸桿菌(Lactobacilli））のなかには高ベルのＳＭａｓｅを含むものがあり、アルカリ性ＳＭａｓｅの評価により、プロバイオティクスおよび／またはプロバイオティクスに基づく産物による処理後の該細菌の数の変化を評価する方法が提供される。
【００１１】
アルカリ性ＳＭａｓｅのアッセイ方法は以前から知られている。ＳＭａｓｅの活性は、インビボでＳＭの放射性前駆体により細胞を標識し、標識産物のレベルを測定することにより、あるいはインビトロで放射標識されたＳＭまたは色素生産性のＳＭのアナログあるいは中性ＳＭの色素および蛍光誘導体を用いることにより、判定することができる。
【００１２】
これらの既知の一般に用いられているアッセイは完全には満足のいくものではなかった。というのは、これらアッセイは放射性アッセイであるため非常に危険である可能性があり、蛍光定量的アッセイよりも感度が低いためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、既知の方法の欠点を克服する、結腸直腸癌や家族性大腸ポリープ症、または胆嚢または肝疾患を患っている可能性のある患者の便または体液中のアルカリ性ＳＭａｓｅの信頼できる安価なアッセイを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、上記アッセイに使用するための分析用キットを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、様々な健康状態における、あるいは疾患または薬剤あるいはプロバイオティクスまたは食物サプリメントによる処置後の、細菌コロニー形成を評価することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の蛍光定量的、間接的アッセイ方法は、以下の反応の連続に基づく。
【００１７】
大便またはその他の体液中に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅの作用により、スフィンゴミエリンが加水分解されてセラミドとコリンリン酸になり、コリンリン酸はアルカリホスファターゼの作用により加水分解されてコリンが生じる。コリンオキシダーゼの存在下で、コリンから過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生じる。
【００１８】
後者の化合物を、西洋わさびペルオキシダーゼの存在下で、Ｈ２Ｏ２に対する高感度の蛍光発生プローブである１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン（以下、アンプレックス・レッド・試薬（Amplex Red Reagent）と称する）と反応させると、強い蛍光性の化合物であるレゾルフィン（resorufin）が生じる。蛍光は、蛍光測定（fluorocount）マイクロプレート蛍光光度計により、５３０−５６０ｎｍの励起、５９０ｎｍの蛍光検出にて測定される。
【００１９】
上記の連続する反応および蛍光検出手段に基づき、本発明のアルカリ性ＳＭａｓｅをアッセイする方法は、便について記載する以下の工程を含む。しかし、当業者にとって該方法を適宜常套の改変により胆汁などの体液に適用することが容易であることは明白である。
１）患者の便の試料を収集し、それを乾燥する工程；
２）乾燥させた試料から約３−４グラムを計量し、それを２０ｍｌのホモゲニゼーション・バッファー（０．２５Ｍ スクロース、０．１５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４）に懸濁する工程；
３）試料を４０００ｒｐｍ、＋４℃で６０分間遠心分離する工程；
４）上清を回収し、４０００ｒｐｍ、＋４℃で１５分間再び遠心分離する工程；
５）標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイ（Pierce Protein Assay）により上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲３２ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌを用い、そしてピペットにより２５μｌの各試料をウェルに移す工程；
６）２５μｌの各試料に、６５μｌのアッセイ・バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ９．０）および１０μｌの２９μＭスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに３ｍＭの濃度で胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）を添加する工程；
７）３７℃で１時間インキュベートする工程；
８）ピペットにより１００μｌの各標準（以下を参照）および１０μｌのスフィンゴミエリン（２９μＭ）を取り、試料と同様に３７℃で１時間インキュベートする工程；
９）１時間後、１００μｌの反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、７５０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭアンプレックスレッド、８Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．２Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
１０）反応物を１時間以上、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
１１）蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程；
１２）各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールからの値を差し引くことにより補正する工程。
【００２０】
本発明はまた、上記の方法にしたがって患者の便または体液中のアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキットにも関し、該キットは別々に以下の試薬の試料を含有する試験管を含む：
ａ）便または体液中のアルカリ性スフィンゴミエリナーゼによって、コリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン；
ｂ）コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ；
ｃ）コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ；
ｄ）過酸化水素とｅ）との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
ｅ）その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプラー・レッド試薬（Ampler Red Reagent（１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン））；および、
ｆ）濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【００２１】
本発明の分析方法を好適に実施するためには、上記キットの要素に加えて、以下のさらなる材料および装置が必要である：
スクロース；
塩化カリウム（ＫＣｌ）；
一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）；
Ｔｒｉｚｍａ塩基；
ＥＤＴＡ；
塩化ナトリウム；
タウロコール酸（ＴＣ）；
タウロデオキシコール酸（ＴＤＣ）；
グリココール酸（ＧＣ）；
グリコケノ（Glycocheno）デオキシコール酸（ＧＣＤＣ）；
β−グリセロリン酸；
ＡＴＰ二ナトリウム塩；
ＥＧＴＡ；
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬；
ウシ血清アルブミン；
冷却遠心機；
５５０−５６２ｎｍにて測定可能なマイクロプレート・リーダー、および、
蛍光測定マイクロプレート蛍光光度計。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】蛍光アッセイを用いたスフィンゴミエリナーゼの検出。各反応物は特定のアッセイバッファー中の示された量の細菌スフィンゴミエリナーゼを含有していた。反応物は３７℃で１時間インキュベートした。蛍光は励起５３０nm、蛍光検出５９０nmにて蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＳＭａｓｅ活性の定量を行うには、以下の手段をとるべきである。
【００２４】
検量線作成
キットにＳＭａｓｅの標準調製物を与える。これは、ｐＨ９で作用するタイプのＳＭａｓｅを含有する細菌抽出物からなる。以下の操作を行う。
ＳＭａｓｅ検量線の作成：濃度標準を希釈して段階希釈を作成する。
ＳＭａｓｅ標準を１ｍｌのアッセイ・バッファー（ｐＨ９．０）により再構成する；この再構成により９６ｍＵ／ｍｌのストック溶液を作成する。
０．５００ｍｌのアッセイ・バッファーをピペットにより各試験管に移す。ストック溶液を用いて限界希釈を作成する。各試験管を次の工程へ移す前によく混合する。未希釈の標準を高濃度標準（９６ｍＵ／ｍｌ）とし、検量線は以下の濃度の点を含むようにする（ｍＵ／ｍｌ）：９６−４８−２４−１２−６−３。バッファーはゼロ標準とする（０ｍＵ／ｍｌ）。
【００２５】
典型的検量線
図１に単に一例としての検量線を示す。検量線はアッセイする試料の各セットについて作成すべきである。
【００２６】
結果の計算
各標準と試料についての二連の読みを平均し、平均ゼロ標準蛍光を差し引く。
標準活性（ｍＵ／ｍｌ）に対して標準蛍光をプロットして最適曲線を引く。各試料のＳＭａｓｅ活性を決定するために、まずｙ−軸上の蛍光値をみつけ、検量線まで水平線を引く。交差点において、ｘ−軸まで垂直線を引き、対応するＳＭａｓ活性を読み取る。
【００２７】
記載した方法によりインビトロでのＳＭａｓｅ活性のアッセイが可能となる；これは、有機試料におけるアルカリ性ＳＭａｓｅを検出する目的で開発された。
【００２８】
アルカリ性ＳＭａｓｅを特異的にアッセイするためであるが、該方法は酸性および中性ＳＭａｓｅ活性を検出する条件を用いる。具体的には：
−ホモゲニゼーション・バッファーは中性のｐＨであるが、中性ＳＭａｓｅを排除するためにプロテアーゼおよびホスファターゼ・インヒビターを含まない。というのは中性ＳＭａｓｅはプロテアーゼおよびホスファターゼの活性に対して高感度であり、そのためこれらの酵素により阻害されるからである；
−ホモゲニゼーション・バッファーは、Ｍｇ依存性中性ＳＭａｓｅ活性を阻害するためにＭｇＣｌ２を含まない；
−反応バッファーはβ−グリセロリン酸およびＡＴＰを含むため、中性ｐＨでなお活性である酸性ＳＭａｓｅを妨げるために、この反応バッファーにおいて中性ＳＭａｓｅを阻害するための高濃度のＥＤＴＡとＥＧＴＡが存在する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法：
１）患者から得た患者の便試料を乾燥する工程；
２）乾燥させた試料から３−４グラムを計量し、それを２０ｍｌのホモゲニゼーション・バッファー（０．２５Ｍ スクロース、０．１５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４）に懸濁する工程；
３）試料を４０００ｒｐｍ、＋４℃で６０分間遠心分離する工程；
４）上清を回収し、４０００ｒｐｍ、＋４℃で１５分間再び遠心分離する工程；
５）標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイにより上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲３２ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌを用い、そしてピペットにより２５μｌの各試料をウェルに移す工程；
６）２５μｌの各試料に、６５μｌのアッセイ・バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ９．０）および１０μｌの２９μＭスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに３ｍＭの濃度で胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）を添加する工程；
７）３７℃で１時間インキュベートする工程；
８）ピペットにより１００μｌの各標準凍結乾燥細菌スフィンゴミエリナーゼおよび１０μｌのスフィンゴミエリン（２９μＭ）を取り、試料と同様に３７℃で１時間インキュベートする工程；
９）１時間後、１００μｌの反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、７５０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭアンプレックスレッド、８Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．２Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
１０）反応物を１時間以上、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
１１）蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程；
１２）各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことにより補正する工程。
【請求項２】
患者から得た体液に対して行う、請求項１の方法。
【請求項３】
以下の試薬の試料を別々に含有する試験管を含む、患者の便または体液におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット：
ａ）便または体液中に存在する、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼによってコリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン；
ｂ）コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ；
ｃ）コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ；
ｄ）過酸化水素とｅ）との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
ｅ）その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプレックス・レッド試薬（（１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン））；および、
ｆ）濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【請求項４】
以下の工程を含む患者からの生物学的材料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法：
１）患者から得た生物学的材料の試料をホモゲニゼーション・バッファー（０．２４−０．２６Ｍ スクロース、０．１４−０．１６Ｍ ＫＣｌ、４５−５５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４に調整）に懸濁する工程；
２）試料を少なくとも１回遠心分離して上清を回収する工程；
３）上清中のタンパク質含量を測定する工程；
４）上清の試料に、アッセイ・バッファー（４４−５５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１．９−２．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１４−０．１６Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ８．９−９．１）および２８−３０μＭスフィンゴミエリンおよびアッセイ・バッファー（２．９−３．１ｍＭの濃度の胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）含有）を添加する工程；
５）アッセイ混合物を３７℃で１時間インキュベートする工程；
６）工程５）からの試料と、２８−３１μＭのスフィンゴミエリンを混合し、３７℃で１時間インキュベートする工程；
７）反応バッファー（４５−５５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．３−７．５、９−１１ｍＭ β−グリセロリン酸、７４５−７５５μＭ ＡＴＰ、４−６ｍＭ ＥＤＴＡ、４−６ｍＭ ＥＧＴＡ、９５−１０５μＭアンプレックスレッド試薬、７−９Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．１−０．３Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼおよび１．５−２．５Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
８）反応混合物を少なくとも１時間、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
９）励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程。
【請求項５】
各試料について、蛍光の読みをスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことによりバックグラウンドの蛍光について補正する、請求項４の方法。
【請求項６】
ピアス・プロテイン・アッセイによりタンパク質含量を測定する請求項４または５の方法。
【請求項７】
以下を含む患者から得た生物学的試料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット：
ａ）スフィンゴミエリン
ｂ）アルカリホスファターゼ，
ｃ）コリンオキシダーゼ，
ｄ）西洋わさびペルオキシダーゼ，
ｅ）アンプレックス・レッド試薬
ｆ）凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【請求項１】
以下の工程を含む患者の便におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法：
１）患者から得た患者の便試料を乾燥する工程；
２）乾燥させた試料から３−４グラムを計量し、それを２０ｍｌのホモゲニゼーション・バッファー（０．２５Ｍ スクロース、０．１５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４）に懸濁する工程；
３）試料を４０００ｒｐｍ、＋４℃で６０分間遠心分離する工程；
４）上清を回収し、４０００ｒｐｍ、＋４℃で１５分間再び遠心分離する工程；
５）標準としてウシ血清アルブミンを用いてピアス・プロテイン・アッセイにより上清中のタンパク質含量を測定し、各試料についてタンパク質濃度範囲３２ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌを用い、そしてピペットにより２５μｌの各試料をウェルに移す工程；
６）２５μｌの各試料に、６５μｌのアッセイ・バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ９．０）および１０μｌの２９μＭスフィンゴミエリンを添加し、そしてアッセイ・バッファーに３ｍＭの濃度で胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）を添加する工程；
７）３７℃で１時間インキュベートする工程；
８）ピペットにより１００μｌの各標準凍結乾燥細菌スフィンゴミエリナーゼおよび１０μｌのスフィンゴミエリン（２９μＭ）を取り、試料と同様に３７℃で１時間インキュベートする工程；
９）１時間後、１００μｌの反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、７５０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭアンプレックスレッド、８Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．２Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
１０）反応物を１時間以上、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
１１）蛍光マイクロプレート・リーダーにおいて励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程；
１２）各点について、バックグラウンドの蛍光をスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことにより補正する工程。
【請求項２】
患者から得た体液に対して行う、請求項１の方法。
【請求項３】
以下の試薬の試料を別々に含有する試験管を含む、患者の便または体液におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット：
ａ）便または体液中に存在する、アルカリ性スフィンゴミエリナーゼによってコリンリン酸へと加水分解されるべきスフィンゴミエリン；
ｂ）コリンリン酸からコリンへの加水分解を触媒するアルカリホスファターゼ；
ｃ）コリンを過酸化水素へと酸化するコリンオキシダーゼ；
ｄ）過酸化水素とｅ）との反応を補助するための西洋わさびペルオキシダーゼ
ｅ）その蛍光が便または体液に存在するアルカリ性ＳＭａｓｅのマーカーとなる蛍光化合物レゾルフィンをもたらす、アンプレックス・レッド試薬（（１０−アセチル−３．７−ジヒドロキシフェノキサジン））；および、
ｆ）濃度標準として用いる凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【請求項４】
以下の工程を含む患者からの生物学的材料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの検出方法：
１）患者から得た生物学的材料の試料をホモゲニゼーション・バッファー（０．２４−０．２６Ｍ スクロース、０．１４−０．１６Ｍ ＫＣｌ、４５−５５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４含有、ｐＨ７．４に調整）に懸濁する工程；
２）試料を少なくとも１回遠心分離して上清を回収する工程；
３）上清中のタンパク質含量を測定する工程；
４）上清の試料に、アッセイ・バッファー（４４−５５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１．９−２．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１４−０．１６Ｍ ＮａＣｌ含有、ｐＨ８．９−９．１）および２８−３０μＭスフィンゴミエリンおよびアッセイ・バッファー（２．９−３．１ｍＭの濃度の胆汁酸塩（ＴＣ、ＴＤＣ、ＧＣ、ＧＣＤＣ）含有）を添加する工程；
５）アッセイ混合物を３７℃で１時間インキュベートする工程；
６）工程５）からの試料と、２８−３１μＭのスフィンゴミエリンを混合し、３７℃で１時間インキュベートする工程；
７）反応バッファー（４５−５５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．３−７．５、９−１１ｍＭ β−グリセロリン酸、７４５−７５５μＭ ＡＴＰ、４−６ｍＭ ＥＤＴＡ、４−６ｍＭ ＥＧＴＡ、９５−１０５μＭアンプレックスレッド試薬、７−９Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ、０．１−０．３Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼおよび１．５−２．５Ｕ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ含有）を添加する工程；
８）反応混合物を少なくとも１時間、３７℃で光から保護してインキュベートする工程；
９）励起範囲５３０−５６０ｎｍおよび発光検出５９０ｎｍにて蛍光を測定する工程。
【請求項５】
各試料について、蛍光の読みをスフィンゴミエリナーゼ非含有コントロールから得た値を差し引くことによりバックグラウンドの蛍光について補正する、請求項４の方法。
【請求項６】
ピアス・プロテイン・アッセイによりタンパク質含量を測定する請求項４または５の方法。
【請求項７】
以下を含む患者から得た生物学的試料におけるアルカリ性スフィンゴミエリナーゼを検出するためのキット：
ａ）スフィンゴミエリン
ｂ）アルカリホスファターゼ，
ｃ）コリンオキシダーゼ，
ｄ）西洋わさびペルオキシダーゼ，
ｅ）アンプレックス・レッド試薬
ｆ）凍結乾燥した細菌スフィンゴミエリナーゼ。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１９５２３９（Ｐ２００９−１９５２３９Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０４１３５（Ｐ２００９−１０４１３５）
【出願日】平成２１年４月２２日（２００９．４．２２）
【分割の表示】特願２００３−５５６５４８（Ｐ２００３−５５６５４８）の分割
【原出願日】平成１４年１２月１９日（２００２．１２．１９）
【出願人】（５０３２２０６７９）アクティアル・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２２日（２００９．４．２２）
【分割の表示】特願２００３−５５６５４８（Ｐ２００３−５５６５４８）の分割
【原出願日】平成１４年１２月１９日（２００２．１２．１９）
【出願人】（５０３２２０６７９）アクティアル・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ (10)
【Ｆターム（参考）】
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