アレルギー感作の防止
本発明は、エンテロウイルス・ワクチンを使って、アレルギー感作およびそれに伴う疾患を予防および治療することに関する。エンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれかつアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、アレルギー感作、特にＩｇＥ媒介感作の危険性を減少させることに関し、また、アレルギー感作の臨床的疾患への進行の危険性を減少させることにより喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎や結膜炎のようなアレルギー性疾患が予防または治療されることに関する。より正確には、本願は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する医薬組成物を製造するための特定のウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近数十年間、アレルギー性疾患の有病率は先進国で常に増加している。新生児の免疫系は未熟で、新生児期から幼児期にわたって発達する。健常児は生活環境の中の病原菌に対して免疫応答を発達させるが、その一方、生活環境の中の無害因子に対してアレルギー反応をおこし、アレルギー性疾患に至る子供の割合が増加している。
【０００３】
アレルギー性疾患発症を予防するために、いくつかの試みがなされてきた。何年もの間、母乳のみを与えることや幼少期に猫や犬のようなアレルギーを誘発する原因と考えられるものとの接触を避けることがアレルギー性疾患の危険性を減少させる手段とされてきた。しかし、結果は納得のいくようなものではなかった。
【０００４】
アレルギー性疾患の原因に対する最近の仮説は「衛生仮説」と呼ばれるもので、それは、アレルギー性疾患の有病率は、衛生基準の低い国よりも生活および衛生基準の高い豊かな国で著しく高いという事実に基づいている。さらに、兄弟数とアレルギー性疾患との逆相関関係が、疫学調査において証明されている（非特許文献１，２）。農場で育つことで、アレルギー性鼻炎や感作有病率がより低くなることと関連があると考えられる（非特許文献３，４，５）。農場に住んではいないが定期的に家畜と接触をもつ子供もまたアレルギー感作有病率は低かった（非特許文献４）。
【０００５】
これらの関連性の根底にある理由はほとんど分かっていないが、「衛生仮説」では、小児期に様々な病原菌にさらされることが、免疫系の成熟を促し、アレルギー性疾患から保護するとする説明が与えられる（非特許文献２，６）。アレルギーへの取り組みとして考えられる１つの取り組みは、プロバイオティクス細菌、特に、乳酸菌の投与であり、それらの菌は寛容原性免疫応答を促進することが示されている。
【０００６】
いくつかの研究が、喘息およびアレルギーの発症におけるＴｈ２極性ＣＤ４およびＴ細胞の役割を提示してきたが（非特許文献７〜９）、アレルギー感作を調節する正確な免疫機序は知られていない。
ＴＭ偏向免疫応答は、Ｔｈ２細胞の影響を下方調節し（非特許文献７）、または、制御性Ｔ細胞はＴｈ１およびＴｈ２細胞両方の機能を制御するとともに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを制御する（非特許文献８，９）。
【０００７】
矛盾する報告もあるが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（非特許文献１０〜１３）、トキソプラズマ原虫（非特許文献１２，１３）およびヘリコバクター・ピロリ（非特許文献１２〜１４）のような感染症、および細菌成分（非特許文献１５〜１７）は、アレルギー性疾患の危険性低下と関連があるとする疫学的な裏付けがあり、そのことより、微生物負荷は小児期におけるアレルギー発症から保護する重要な環境因子であるとする仮説を裏付ける。
さらに、英国において、５歳までの胃腸感染症数とアトピーの危険性とに逆相関が単独に見られた（非特許文献１９）。ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）に幼少期に感染すると、幼児のＩｇＥ感作、アトピー性疾患およびアレルギー発症を防ぐことも報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０３１１９５号公報
【特許文献２】ＷＯ９３／１１２５１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】カルマウス・ダブリュ（Ｋａｒｍａｕｓ Ｗ）、ボテザン・シー（Ｂｏｔｅｚａｎ Ｃ）著、「兄弟の数が多いほど、アレルギーや喘息を防ぐ？レビュー（Ｄｏｅｓ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｉｂｌｉｎｇｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ａｓｔｈｍａ？ Ａ ｒｅｖｉｅｗ．）」、「ジェイ・エピデミオル・コミュニティ・ヘルス（Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ）」、２００２年、第５６号、第２０９〜２１７頁
【００１０】
【非特許文献２】ストラッチャン・ディーピー（Ｓｔｒａｃｈａｎ ＤＰ）著、「ファミリーサイズ、感染症およびアトピー：“衛生仮説”の最初の１０年（Ｆａｍｉｌｙ ｓｉｚｅ， ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｏｐｙ： Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ “ｈｙｇｉｅｎｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ”）」、ソラックス（Ｔｈｏｒａｘ）、２０００年、補遺５５−１号、Ｓ２−１０
【００１１】
【非特許文献３】フォン・ハーツェン・エル（ｖｏｎ Ｈｅｒｔｚｅｎ Ｌ）、マケラ・エム（Ｍａｋｅｌａ Ｍ）、ペテイズ・ティ（Ｐｅｔａｙｓ Ｔ）等著、「フィンランド人とロシア人との間で広がるアトピーにおける格差：２つの発生地域の比較（Ｇｒｏｗｉｎｇ ｄｉｓｐａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｔｏｐｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｆｉｎｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｕｓｓｉａｎｓ： Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」２００６年、第１１７号、第１５１〜１５７頁
【００１２】
【非特許文献４】リードラー・ジェイ（Ｒｉｅｄｌｅｒ Ｊ）、エダー・ダブリュ（Ｅｄｅｒ Ｗ）、オベルフェルド・ジー（Ｏｂｅｒｆｅｌｄ Ｇ）、シュレウアー・エム（Ｓｃｈｒｅｕｅｒ Ｍ）著、「農場に住むオーストリア人の子供は花粉症、喘息、アレルギー感作が少ない（Ａｕｓｔｒｉａｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｎ ａ ｆａｒｍ ｈａｖｅ ｌｅｓｓ ｈａｙ ｆｅｖｅｒ， ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．）クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）、２０００年、第３０号、第１９４〜２００頁
【００１３】
【非特許文献５】キルペレイネン・エム（Ｋｉｌｐｅｌａｉｎｅｎ Ｍ）、テルホ・イーオー（Ｔｅｒｈｏ ＥＯ）、ヘレニウス・エイチ（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ Ｈ）、コスケンヴオ・エム（Ｋｏｓｋｅｎｖｕｏ Ｍ）著、「子供時代の農場環境はアレルギーの発症を予防する（Ｆａｒｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｅｓ）」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２０００年、第３０号、第２０１〜２０８頁
【００１４】
【非特許文献６】ストラッチャン・ディーピー（Ｓｔｒａｃｈａｎ ＤＰ）著、「花粉症、衛生、家庭サイズ」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、１９８９年、第２９９号、第１２５９〜６０頁
【００１５】
【非特許文献７】モスマン・ティーアール（Ｍｏｓｍａｎｎ ＴＲ）、サド・エス（Ｓａｄ Ｓ）著、「Ｔ細胞サブセット：Ｔｈ１、Ｔｈ２他の膨張宇宙（Ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｕｎｉｖｅｒｓｅ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ：Ｔｈ１ ， Ｔｈ２ ａｎｄ ｍｏｒｅ）」、「イミュノル・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ）」、１９９６年、第１７号、第１３８〜１４６頁
【００１６】
【非特許文献８】ウメツ・ディーティ（Ｕｍｅｔｓｕ ＤＴ）、アクバリ（Ａｋｂａｒｉ Ｏ）、デクライフ・アールエイチ（Ｄｅｋｒｕｙｆｆ ＲＨ）著、「制御性Ｔ細胞はアレルギー性疾患および喘息の発症を制御する（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｓｔｈｍａ）」、 「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００３年、第１１２号、第４８０〜４８７頁
【００１７】
【非特許文献９】クロット・ド・ラファイル・エムエー（Ｃｕｒｏｔｔｏ ｄｅ Ｌａｆａｉｌｌｅ ＭＡ）、ラファイル・ジェイジェイ（Ｌａｆａｉｌｌｅ ＪＪ）著、「自己免疫およびアレルギーにおけるＣＤ４（＋）制御性Ｔ細胞（ＣＤ４（＋） ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｙ）」、「カー・オピン・イミュノル（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００２年、第１４号、第７７１〜７７８頁
【００１８】
【非特許文献１０】マッキンター・ジェイジェイ（ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＪＪ）、ウメツ・エスイー（Ｕｍｅｔｓｕ ＳＥ）、マカウバス・シー（Ｍａｃａｕｂａｓ Ｃ）等著、「免疫学：Ａ型肝炎ウイルスはアトピー性疾患に関連する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ ｌｉｎｋ ｔｏ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００３年、第４２５号、第５７６頁
【００１９】
【非特許文献１１】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロスミニ・エフ（Ｒｏｓｍｉｎｉ Ｆ）、フェリングノ・エル（Ｆｅｒｒｉｇｎｏ Ｌ）等著、「Ａ型肝炎ウイルスに対する抗体を有するイタリア軍事学校生徒のアトピー有病率の断面遡及的研究（Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｏｐｙ ａｍｏｎｇ Ｉｔａｌｉａｎ ｍｉｌｉｔａｒｙ ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、１９９７年、第３１４号、第９９９〜１００３頁
【００２０】
【非特許文献１２】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロスミニ・エフ（Ｒｏｓｍｉｎｉ Ｆ）、リオンディーノ・エス（Ｒｉｏｎｄｉｎｏ Ｓ）等著、「アトピーおよびアレルギー性喘息の観点における、食物媒介および糞口病原菌への曝露対空気中の浮遊ウイルスへの曝露：疫学的研究」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、２０００年、第３２０号、第４１２〜４１７頁
【００２１】
【非特許文献１３】リンネバーグ・エー（Ｌｉｎｎｅｂｅｒｇ Ａ）、オスターガード・シー（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｃ）、トゥヴェーデ・エム（Ｔｖｅｄｅ Ｍ）等著、「デンマーク人成人の微生物およびアトピー性疾患に対するＩｇＧ抗体：コペンハーゲン・アレルギー研究（ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｄａｎｉｓｈ ａｄｕｌｔｓ： Ｔｈｅ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ａｌｌｅｒｇｙ ｓｔｕｄｙ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００３年、第１１１号、第８４７〜８５３頁
【００２２】
【非特許文献１４】コスネン・ティーユー（Ｋｏｓｕｎｅｎ ＴＵ）、フック・ニカネ・ジェイ（Ｈｏｏｋ−Ｎｉｋａｎｎｅ Ｊ）、サロマ・エー（Ｓａｌｏｍａａ Ａ）、サルナ・エス（Ｓａｒｎａ Ｓ）、アロマ・エー（Ａｒｏｍａａ Ａ）、ハーテラ・ティ（Ｈａａｈｔｅｌａ Ｔ）著、「１９７３年から１９９４年までのフィンランド住民のアレルゲン特異性免疫グロブリン抗体の増加およびヘリコバクター・ピロリ感染症との考えられる関係（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ １９７３ ｔｏ １９９４ ｉｎ ａ Ｆｉｎｎｉｓｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２００２年、第３２号、第３７３〜３７８頁
【００２３】
【非特許文献１５】ジェレーダ・ジェイイー（Ｇｅｒｅｄａ ＪＥ）、レン・ディーワイ（Ｌｅｕｎｇ ＤＹ）、リウ・エーエイチ（Ｌｉｕ ＡＨ）著、「環境的エンドトキシンのレベルおよびアトピー性疾患の流行（Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）」、「ジェイエーエムエー（ＪＡＭＡ）」、２０００年、第２８４号、第１６５２〜１６５３頁
【００２４】
【非特許文献１６】ジェレーダ・ジェイイー（Ｇｅｒｅｄａ ＪＥ）、レオン・ディーワイ（Ｌｅｕｎｇ ＤＹ）、サタヤキコム・エー（Ｔｈａｔａｙａｔｉｋｏｍ Ａ）等著、「喘息の高い危険性を持つ乳児における、ハウスダスト・エンドトキシン曝露、Ｔ細胞１型発達、およびアレルギー感作の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｕｓｅ−ｄｕｓｔ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ， ｔｙｐｅ １ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｓｔｈｍａ）」、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２０００年、第３５５号、第１６８０〜１６８３頁
【００２５】
【非特許文献１７】フォン・ムチュス・イー（ｖｏｎ Ｍｕｔｉｕｓ Ｅ）、ブラウン−ファーランダー・シー（Ｂｒａｕｎ−Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ Ｃ）、シエール・アール（Ｓｃｈｉｅｒｌ Ｒ）等著、「エンドトキシンまたは他の病原菌への曝露はアトピーの発症を防ぐかもしれない（Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｙ」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２０００年、第３０号、第１２３０〜１２３４頁
【００２６】
【非特許文献１８】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロンチェッティ・アール（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ Ｒ）著、「感染症はアトピーから防ぐ？（Ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｏｐｙ？）」、「カー・オピン・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１年、第１号、第４１３〜４１９頁
【００２７】
【非特許文献１９】カリナン・ピー（Ｃｕｌｌｉｎａｎ Ｐ）、ハリス・ジェイエム（Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ）、ニューマン・テイラー・エージェイ（Ｎｅｗｍａｎ Ｔａｙｌｏｒ ＡＪ）等著、「早期感染は成人アトピーにおける兄弟の影響を説明できるか？（Ｃａｎ ｅａｒｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｓｉｂｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｔｏｐｙ？）」、「ユウ・レスピア・ジェイ（Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ）」、２００３年、第２２号、第９５６〜９６１頁
【００２８】
【非特許文献２０】ベン・シーエス（Ｂｅｎｎ ＣＳ）、メルバイ・エム（Ｍｅｌｂｙｅ Ｍ）、ウォルファート・ジェイ（Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ Ｊ）、ビヨルクステン・ビー（Ｂｊｏｒｋｓｔｅｎ Ｂ）、アービー・ピー（Ａａｂｙ Ｐ）、「生後１８ヶ月間の兄弟効果、感染性疾患、およびアトピー性皮膚炎のコホート研究（Ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｂｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ， ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｉｒｓｔ １８ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ｌｉｆｅ）」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、２００４年、第３２８号、第１２２３頁
【００２９】
【非特許文献２１】バゲル・ピー（Ｂａｇｅｒ Ｐ）、ウエステルガルド・ティ（Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｔ）、ロストガルド・ケイ（Ｒｏｓｔｇａａｒｄ Ｋ）、ヒャルグリム・エイチ（Ｈｊａｌｇｒｉｍ Ｈ）、メルバイ・エム（Ｍｅｌｂｙｅ Ｍ）、「子供時代の感染性とアトピーの危険性（Ａｇｅ ａｔ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｔｏｐｙ）」、「ソラックス（Ｔｈｏｒａｘ）」、２００２年、第５７号、第３７９〜３８２頁
【００３０】
【非特許文献２２】コンドラショワ・エー（Ｋｏｎｄｒａｓｈｏｖａ Ａ）、ロマノフ・エー（Ｒｏｍａｎｏｖ Ａ）、ルーナネン・エー（Ｒｅｕｎａｎｅｎ Ａ）等著、「フィンランド東部境界の１型糖尿病の発生率における６倍勾配−疾患原因における環境の重要な役割の証拠（Ａ ｓｉｘ−ｆｏｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｅａｓｔｅｒｎ ｂｏｒｄｅｒ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ − ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、「アン・メッド（Ａｎｎ Ｍｅｄ）」、２００５年、第３７号、第６７〜７２頁
【００３１】
【非特許文献２３】マキ・エム（Ｍａｋｉ Ｍ）、ムスタラフティ・ケイ（Ｍｕｓｔａｌａｈｔｉ Ｋ）、コッコネン・ジェイ（Ｋｏｋｋｏｎｅｎ Ｊ）等著、「フィンランドの子供のセリアック病有病率（Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ）」、「エヌ・イングル・ジェイ・メッド（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）」、２００３年、第３４８号、第２５１７〜２５２４頁
【００３２】
【非特許文献２４】ヴァルチアイネン・イー（Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ Ｅ）、ペテイズ・ティ（Ｐｅｔａｙｓ Ｔ）、ハーテラ・ティ（Ｈａａｈｔｅｌａ Ｔ）、ジョーシラティ・ピー（Ｊｏｕｓｉｌａｈｔｉ Ｐ）、ペッカネン・ジェイ（Ｐｅｋｋａｎｅｎ Ｊ）著、「フィンランド北カレリアおよびロシア・カレリア共和国におけるアレルギー性疾患、皮膚プリックテスト応答およびＩｇＥレベル（Ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ａｎｄ ＩｇＥ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ， Ｆｉｎｌａｎｄ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋａｒｅｌｉａ， Ｒｕｓｓｉａ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００２年、第１０９号、第６４３〜６４８頁
【００３３】
【非特許文献２５】サルミネン・ケイ（Ｓａｌｍｉｎｅｎ Ｋ）、サデハリュ・ケイ（Ｓａｄｅｈａｒｊｕ Ｋ）、ロンロット・エム（Ｌｏｎｎｒｏｔ Ｍ）等著、「出産予定コホート研究において、エンテロウイルス感染はベータ細胞自己免疫の誘導に関連する（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｂｉｒｔｈ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ）」、「ジェイ・メッド・ヴィロール（Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ）」、２００３年、第６９号、第９１〜９８頁
【００３４】
【非特許文献２６】ロイヴァイネン・エム（Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ Ｍ）、ニップ・エム（Ｋｎｉｐ Ｍ）、ヒョティ・エイチ（Ｈｙｏｔｙ Ｈ）等著、「数種の異なるエンテロウイルス血清型は、前糖尿病自己免疫発現および顕性ＩＤＤＭの発症に関連することが可能である（Ｓｅｖｅｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｃａｎ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｉａｂｅｔｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ａｎｄ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｏｖｅｒｔ ＩＤＤＭ）」、「フィンランドにおける小児性糖尿病（ＤｉＭｅ）研究グループ （Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ （ＤｉＭｅ） Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ）」、「ジェイ・メッド・ヴィロール（Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ）」１９９８年、第５６号、第７４〜８頁
【００３５】
【非特許文献２７】イソマキ・ピー（Ｉｓｏｍａｋｉ Ｐ）等著、「ＳＯＣＳの発現は 関節リュウマチにおいて変化する（Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＯＣＳ ｉｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）」、「リュウマチ学（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００７年、第４６号、第１５３８〜４６頁
【００３６】
【非特許文献２８】プァッフル・エムダブリュ（Ｐｆａｆｆｌ Ｍ Ｗ）、「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける相対的定量化のための新しい数学的モデル（Ａ ｎｅｗ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、「核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第２９号、第２００２〜２００７頁
【００３７】
【非特許文献２９】オルトマン・ディ（Ａｌｔｍａｎ Ｄ）、オルトマン・ディ・ジー（Ａｌｔｍａｎ ＤＧ）、ブライアント・ティ（Ｂｒｙａｎｔ Ｔ）、ガードナー・エム（Ｇａｒｄｎｅｒ Ｍ）、 ガードナー・エム・ジェイ（Ｇａｒｄｎｅｒ ＭＪ）、マーチン・ディ（Ｍａｃｈｉｎ Ｄ）著、「確信のある統計：ロンドン（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ：Ｌｏｎｄｏｎ）」、ビーエムジェイ・ブックス（ＢＭＪ Ｂｏｏｋｓ）、２０００年
【００３８】
【非特許文献３０】ウー・ケイ（Ｗｕ Ｋ）、ビ・ワイ（Ｂｉ Ｙ）、スン・ケイ（Ｓｕｎ Ｋ）、ワン・シー（Ｗａｎｇ Ｃ）、「ＩＬ−１０産生する制御性Ｔ細胞１型およびアレルギー（ＩＬ−１０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｙｐｅ １ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｙ）」、「セル・モル・イミュノル（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」 ２００７年、第４号、第２６９〜７５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
しかし、全ての細菌感染がアトピー性疾患の有病率に保護的効果を持つとは限らない。例えば、クロストリジウム・ディフィシレ、キャンピロバクター・ジェジュニ、および腸炎エルシニアのような腸内細菌に対する血清反応陽性は、成人デンマーク人のアトピーの高い有病率と関連があることが分かった（非特許文献１３）。最近、ベン氏らは、生後６ヶ月間の感染症（大概は上気道感染）がアトピーの危険性を増すことを報告し（非特許文献２０）、ベーガー氏と共同研究者は、１歳前に空中浮遊菌（麻疹、風疹、流行性耳下腺炎および水痘）に起因する感染数が増加するのに伴いアトピーの危険性も上昇することを観察した（非特許文献２１）。
【００４０】
アレルギー感作の危険性を減少させ、それによりアレルギー感作を伴う疾患の予防または治療を防ぐ効果的な手段が明らかに必要である。特に、喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎および結膜炎のようなアレルギー性疾患、および食物が引き起こすアレルギーの発症を防止することが必要である。本発明はこれらの必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
本発明は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療するためのエンテロウイルスの使用を基本とする。より詳しくは、本発明は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する医薬組成物の製造におけるエンテロウイルスの使用であって、そのエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれる外因性核酸配列でありかつアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まない。本発明では、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する方法も開示される。この方法では、エンテロウイルスを含有する医薬組成物の有効量が、それを必要とするヒトに投与され、そのエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれてアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まない。
発明の詳細な意味は従属項において定義される。他の目的、詳細、効果は以下に示す詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】異なるエンテロウイルス血清型に対する血清反応陽性による、ロシア・カレリア人小児のアレルゲン特異的ＩｇＥの有病率を示す図である。
【図２】感染性エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、熱処理された精製エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、異なるＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、レジキモド）および多クローン性のＴ型刺激細胞（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）に刺激される、末梢血単核細胞培養におけるＦｏｘＰ３ｍＲＮＡの誘導を示す図である。細胞は２４時間培養後に集菌された。結果は、媒体処理された細胞に対するＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡの相対発現量として示される。ＥＶはエンテロウイルスである。
【図３】感染性エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、熱処理された精製エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、異なるＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、レジキモド）および多クローン性のＴ型刺激細胞（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）に刺激される、末梢血単核細胞培養におけるＩＬ−１０ｍＲＮＡの誘導を示す図である。細胞は２４時間培養後に集菌された。結果は、媒体処理された細胞に対するＩＬ−１０ ｍＲＮＡの相対発現量として示される。ＥＶはエンテロウイルスである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、アレルギー感作およびそれに伴う疾患が、エンテロウイルスを免疫活性材料として含む組成物を用い予防接種することで防げることを発見したことに基づく。
外因性核酸配列を含む組み換えウイルス（その外因性核酸配列はウイルスゲノムに組み込まれ、アレルゲンのエピトープおよび理論上存在するタンパク質分解的切断部位をコードするものである）は、アレルギーに対する効果を証明する例は何もないにもかかわらず、アレルギーに対するワクチンとしてこれまでに提案されていた（特許文献２）。
【００４４】
このアプローチは、本発明とは全く違う。それは、このウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれ、抗原をコードする外因性核酸配列（これは、抗原に対して望ましい免疫応答を導くと信じられている）に対する受動的「担体」または運搬手段として機能するが、本発明はエンテロウイルス自体によって誘導される免疫調節性効果に基づくからである。
【００４５】
したがって、本発明のエンテロウイルスは活性成分であり、予防または治療すべきアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする組み込まれた外因性核酸配列を含まない。しかし、本発明で使用されるエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれる非コード外因性核酸配列を含んでもよいし、ウイルスゲノムに組み込まれないコードまたは非コード外因性核酸配列を含んでもよい。本発明で使用されるエンテロウイルスは、外因性タンパク質も含んでよい。本発明の実施形態では、エンテロウイルスは外因性タンパク質をコードする外因性核酸を含まず、特に外因性タンパク質をコードする組み込まれた外因性核酸を含まない。
【００４６】
本発明において、「アレルゲン」とは、アレルギー性免疫応答を誘導する化合物であり、タンパク質全体または免疫活性のある断片（例えば、エピトープ）だけであってもよい。核酸はこのことから明らかにアレルゲンとは考えられない。
エンテロウイルス群には１００を超える異なった血清型がある。エンテロウイルス感染は通常無症状であるが、各種の疾患を引き起こすこともある。ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＢ群、コクサッキーウイルスＡ群、エコーウイルスおよび番号をふられたエンテロウイルスは、各種疾患の発症に関係するとして知られているエンテロウイルスである。エンテロウイルス感染は糞口感染経路で拡がり、粘膜および腸管関連の免疫系を通して宿主感染させる。エンテロウイルス感染は、免疫系の強力な活性剤であり、免疫系に激しい変化をもたらす。
【００４７】
本発明において、「エンテロウイルス」は、エンテロウイルス全体および、その成分またはその組み合わせを含む。エンテロウイルスは、弱毒化または非弱毒化された生エンテロウイルス株、遺伝子組み換えされた株、またはエンテロウイルス株由来の成分（例えばサブユニットまたはペプチド）、構造タンパク質成分またはそれらの組み合わせ（例えば粒子状のウイルス）、またはゲノムまたはゲノム断片（例えば、免疫学的に活性なウイルスタンパク質をコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡ）であってもよい。エンテロウイルスは、死滅した、つまり、不活化エンテロウイルス株であってもよい。
【００４８】
アレルギー感作の予防および治療において特に有用なエンテロウイルスは、免疫調節性経路を誘導またはＴｈ２型免疫応答を下方調節する性能により特定可能である。このようなエンテロウイルスは、制御性Ｔ細胞、および／またはＴｈ１／Ｔｈ２バランス、および／または免疫調節性サイトカイン（例えば、異なるエンテロウイルスを有する抹消血白血球の生体外刺激する際、または、エンテロウイルス感染している小児の生体内におけるかいずれかのＩＬ−１０）の産生への効果を分析することによって特定される。このようなエンテロウイルスは、通常、ＰｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、またはＩＬ−１０や他の免疫調節性サイトカインを産生する制御性Ｔ細胞を活性化させるべきである。このようなエンテロウイルスは、例えば、ＩＬ−４または他のＴｈ２型サイトカインの産生の減少、および／またはそれに平行したＴｈ１型細胞の活性増加およびインターフェロン・ガンマまたは他のＴｈ１型サイトカインの増加産生を反映してＴｈ２型細胞の活性を低下させることもある。
【００４９】
本発明で特に有用なエンテロウイルスは、疫学調査における保護的効果によっても特定可能である。このようなエンテロウイルスは、通常、アレルギー感作またはアレルギー症状を発症した人に比べて、アレルギー感作またはアレルギー症状を発症していない個人により頻繁に見受けられるはずであった。これらのウイルスは、血液から血清型特異的抗体を測定することや、この種の疫学調査で検出されるウイルスの抗原性または遺伝子的特性を分析することによって特定可能である。
【００５０】
弱毒化されたウイルスとは、その毒性を低下させたウイルスのことである。これは、細胞培養におけるウイルスの連続継代、化学処置による抗原修飾、組み換えまたはキメラウイルスの構築、ウイルスゲノムの突然変異、特定遺伝子領域の削除または挿入、温度感性突然変異体の選択、または照射などの異なる方法により行なわれる。あるいは、エンテロウイルスは、弱毒化された自然ウイルス分離株であってもよいし、または臨床疾患を引き起こす能力が低下した感染ウイルスｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００５１】
弱毒化または非弱毒化された生エンテロウイルスは、便宜上、経口投与される。一回の予防摂取量は、感染または自然また獲得免疫系を活性化し、または、ヒトに制御性Ｔ細胞または制御性サイトカインを誘導する力価の感染ウイルス、または感染ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。この一回分投与量は、弱毒化されたセービン型生ポリオウイルス株で、最低でもポリオウイルス１型を１０５．５〜１０６ＴＣＩＤ５０、ポリオウイルス２型を１０５ＴＣＩＤ５０、ポリオウイルス３型を１０５．５〜１０５．８ＴＣＩＤ５０を含む従来のセービン型経口生ポリオウイルスワクチンに使用される一回分投与量に相当する。この投与量は、安全で感染性があり、または自然また獲得免疫系を活性化させることができることが確認されたなら、他の投与量であってもよい。（ＴＣＩＤは組織培養感染量；ＴＣＩＤ５０は５０％の組織培養に感染させる量を示す。）
【００５２】
あるいは、エンテロウイルスには、感染性が不活化されたウイルス全体、または、ウイルスの特定の抗原構造、タンパク質またはペプチドを含むサブユニットワクチン、またはそれらの組み合わせ（例えば粒子状ウイルス）、またはウイルス全体または個別のウイルス性タンパク質をコードするウイルス性ＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片、または不活化状態のウイルスが含まれる。
【００５３】
不活化ワクチンは細胞培養でウイルスを増殖させ、サッカロースまたは他の高密度媒体により形成される密度勾配で、そのウイルスを感染細胞および培養媒体から高速遠心分離により精製することによって産生される。あるいは、ウイルスはクロマトグラフィにより精製される。精製されたウイルスの感染性は、そのウイルスを化学処置（例えば、ＩＰＶを産生するのに使用されるようなホルマリン不活化）、照射または熱処理により不活化することで破壊される。サブユニットワクチンは、精製されたウイルス性タンパク質または組み替えウイルス性タンパク質、ウイルス性抗原エピトープに対応する合成ペプチド、粒子状ウイルスまたは空のウイルスカプシド（感染中に産生されるが、ウイルスゲノムを欠く）からなる。これらのサブユニットワクチンはそのまま、又はハプテンまたは担体（例えば、ＩＳＣＯＭ粒子、キトサン、ＴＬＲアゴニスト、生分解性微粒子）に抱合されて投与される。
【００５４】
上述したエンテロウイルスは、注射により非経口で、経口で、皮内に、経皮に、舌下に、吸入として、または経直腸的に与えられる。
一回分投与量は、ヒトに適切な免疫応答を誘導することが可能な力価のウイルス構造を含む。この投与量は、一回分投与量につきウイルス性タンパク質を１．８〜２μｇ、ポリオウイルス１型の抗原性Ｄユニットを２０〜４０、ポリオウイルス２型の抗原性Ｄユニットを４〜８、およびポリオウイルス３型の抗原性Ｄユニットを１６〜３２含むソーク型不活化ポリオウイルスワクチンに使用される量に相当する。この投与量は、安全で感染性があり、または自然また獲得免疫系を刺激、または制御性Ｔ細胞または制御性サイトカインを誘導させることができることが確認されたなら、他の投与量であってもよい。
【００５５】
エンテロウイルスは、同時にまたは連続的に与えられる１以上のエンテロウイルス血清型を含む異なる組み合わせで与えられる。
異なるエンテロウイルスが同時に与えられる場合は、医薬組成物は異なるエンテロウイルスの混合物の形態をとりうる。エンテロウイルスは、アレルゲンに対して寛容原性応答を促進するために、少なくとも１つのアレルゲン（例えば、アレルゲン全体またはその免疫学的に活性なサブユニット）と組み合わせて与えられる。本発明の一実施形態としては、ワクチンは唯一の免疫活性材料としてエンテロウイルスを含有するものとされ、また別の実施形態においては、エンテロウイルスと１以上の外因性アレルゲンとの混合物を含有するものとすることができる。
【００５６】
エンテロウイルスは医薬組成物に調製され、この医薬組成物は免疫刺激を引き起こす活性材料に加えて、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、ハプテン、アジュバントを含みうる。
賦形剤、担体、ハプテン、アジュバントは、例えば、フェノキシエタノール、塩化マグネシウム、サッカロース、チオマーサル、ホルムアルデヒド、フェノール、抗生物質（防腐剤）またはアルミニウム塩、ポリマー微粒子、ＩＳＣＯＭ微粒子、担体タンパク質（例えば、コレラ毒素）、リポソーム、タンパク質ミセル（ハプテン／アジュバント）、またはＴＬＲアゴニストを含む。
医薬組成物は、好ましくは、生後５年以内の小児に投与され、より好ましくは、３年以内、特に２年以内で、最も好ましくは、生後１年以内で投与され、後年追加免疫を行い、アレルギー感作を防ぐ。既に感作された人は、疾患の症状の有無にかかわらず、何歳でも医薬組成物を投与されてよい。
【００５７】
医薬組成物の「有効量」とは、中和抗体または細胞媒介応答のいずれか、または両方を導くことによって、免疫を誘導しウイルスに対して受容者を保護可能な獲得または自然免疫応答のいずれかを導くことができる量である。あるいは、医薬組成物の「有効量」としては、ウイルスに対する保護的免疫が誘導されなかったとしても、制御性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）または活性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を誘導することができるか、または、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの好適なシフトを誘導することができる量としても良い。
制御性サイトカイン、細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ２のシフトの誘導は、ウイルス特異的免疫応答またはアレルゲン特異的免疫応答、または両方において起こり得る。また、異なる抗原またはアレルゲン特異性を有する広範囲の免疫応答に影響する、免疫系へのより汎用的な効果でもありうる。このような汎用的な効果は、一般に、ＩＬ−１０のような溶解性の免疫調節性サイトカインによってもたらされる。
【００５８】
免疫系が病原体を含む生活環境中の異質成分にさらされると、免疫応答が誘導される。その免疫応答はＴｈ１型またはＴｈ２型反応のいずれかで占められる。両反応は感染と戦っているが、Ｔｈ２細胞はアレルギーも促進している。Ｔｈ１／Ｔｈ２型細胞の適切なバランスは、適切な反応に不可欠である。しかし、アレルギー疾患に感染しやすい対象者では、Ｔｈ２型反応が支配的である。さらに、これらの人たちは制御性Ｔ細胞および免疫調節の他の成分の異常機能を有する場合もある。
【００５９】
「アレルギー感作」とは、多くは無害の各種生活環境抗原に対してのアレルゲン特異的ＩｇＥの産生を導くＴｈ２型優位免疫応答をもたらすことを指す。アレルゲン特異的ＩｇＥはアレルギー疾患の症状を誘発する過敏性反応を引き起こす。この種の免疫応答は、例えば、血液サンプルからアレルゲン特異的ＩｇＥを分析することにより測られる。アレルゲン特異的ＩｇＥのレベルが上昇すると、ある特定のアレルゲンに対するアレルギー感作を示す。さらに、総ＩｇＥ免疫グロブリンが高レベルにあることはアレルギー感作を示す。皮膚プリックテストも、アレルギー疾患を診断するのに用いられる。エンテロウイルスを含有する医薬組成物は、アレルギー感作を伴ういかなる疾患も予防または治療できるワクチンである。
【００６０】
ＩｇＥ媒介アレルギー感作は、アレルギー性湿疹、アレルギー性喘息、ＩｇＥ媒介食物または薬品アレルギー、アレルギー性結膜炎または鼻炎のような各種アレルギー疾患を引き起こす。エンテロウイルス・ワクチンはＩｇＥ媒介感作の危険性を減らすことができ、それにより、アレルギー性鼻炎や喘息のようなＩｇＥ感作により誘発される疾患を予防することができる。
エンテロウイルス・ワクチンは、アレルギー感作を予防するために、出生コホート全体、または、少なくとも家族の一員がアレルギー反応または疾患と診断された家族の子供のような、人口のうちの選ばれたグループに投与される。
さらに、エンテロウイルス・ワクチンは、無症状のアレルギー感作（症状のない、アレルゲン特異的ＩｇＥ濃度の増加）を有する人に、臨床症状を発症しないように使用されることもできる。つまり、エンテロウイルス・ワクチンは、アレルギー症状や疾患を軽減するのに用いられることもできる。
フィンランドおよびロシアの小児における細菌感染およびアレルギー感作の有病率におけるばらつきや関連性が、地理的には隣接する地域であるが、社会経済学的および文化的に著しく異なる２つの地域という独特の疫学的設定で研究された。
【００６１】
［方法］
［対象者］
ロシア・カレリア人研究コホートは、２６６人の学童を含み、フィンランド人コホートも同様に２６６人の学童を含んだ。学童は、健常児を表し、アレルギーまたは他の疾患の可能性に応じて選ばれなかった。カレリア共和国の全ての子供は、フィンランド民族かカレリア民族いずれか一方の両親を持ち、このことはフィンランドの子供たちの民族的背景に近いものとなる（非特許文献２２）。研究コホートは、各国より１１４人の男児と１５２人の女児を含んだ。サンプリングの平均年齢は、両コホートで１１．４歳（７から１５歳の範囲）であった。
【００６２】
血液サンプルは、カレリア人の無作為に選ばれた学童、総計で１９８８人から採られた。母親および父親の民族的背景が記録され、両親がフィンランド民族かカレリア民族のいずれか一方である子供は全て本研究に含まれた（Ｎ＝２６６）。このカレリア人の子供に対して、フィンランド人の子供のコホートを、年齢、性、サンプリング時期により対応させた。このサンプリング時期は１ヶ月も離れていず、このことにより細菌やアレルゲンへの曝露に関して季節の影響を最小にした。フィンランド人コホートはカレリア人コホートと同様にして集められ、フィンランドのオウル地区に住む３６５４人の学童を当初含んだ（非特許文献２３）。血液サンプルはそれぞれの子供より採られた。
【００６３】
［ＩｇＥおよびウイルス抗体］
アレルゲン特異的ＩｇＥのレベルは、Ｕｎｉ−ＣＡＰ（登録商標）フルオロ酵素免疫測定法（ファーマシア・ダイアグノスティックス、ウプサラ、スウェーデン）を使用し測定された。２つの一般的な吸入アレルゲン（樺と猫）および卵アルブミンに対する特異的ＩｇＥが製造者の指示により分析された。これらのアレルゲンへの曝露は両集団で極めて類似すると思われることから、これらのアレルゲンが選ばれた。アレルゲン特異的ＩｇＥとして、０．３５ＩＵ／Ｉ以上の値は陽性であると考えられた。過去の研究では、１００ＩＵ／Ｉを超える総ＩｇＥ値はアトピー素因のマーカーとして考えられてきた（非特許文献２４）。
【００６４】
集団反応性エンテロウイルス抗体は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）および前述のように抗原として熱処理されたコクサッキーウイルスＢ４（ＣＢＶ４）を使い分析された［２５］。この方法によると、血清型に特異的ではないが、いくつかのエンテロウイルス血清型に交差反応性がある抗体を検出する。熱処理がウイルスの隠された交差反応性を顕在化させるので、いくつかの血清型に対して交差反応性がある抗体を検出するこの方法の性能は、ウイルス抗原を熱処理することで高められる。
【００６５】
抗体（所定の血清型に特異なもの）は前述の血小板中和分析を用い測定された（非特許文献２６）。この方法は、分析で使用される血清型に特異である中和抗体を測定する。２種類のコクサッキーウイルスＢ血清型（ＣＢＶ４およびＣＢＶ５）および２種類のエコーウイルス血清型（エコーウイルス９および同１１）に対する抗体を、ＡＴＣＣ標識ウイルス株を使って調べた。
ＩｇＧクラスＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗体を、製造業者（デイドベーリング株式会社、マーバーグ、ドイツ）の指示に従い、エンザイグノスト（登録商標）抗ＨＡＶ市販ＥＩＡキットを使い測定した。ベーリング・ＥｌｉｓａプロセッサＩＩＩが、テストの処理をさらに進めるためと抗体レベルの演算のために使用された。
【００６６】
［免疫調節経路の誘導］
免疫調節経路へのエンテロウイルスの効果が、単核細胞培養物をエンテロウイルスで刺激することにより分析された。健康な検査技師から採取した末梢血単核細胞が、製造業者の指示に従い、ＢＤバキュテナー（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブ（ＢＤ、フランクリン・レイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）を用い精製された。単核細胞はＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）で２回洗浄され、丸底マイクロタイタープレートウェル（コスター９６ウェル細胞培養ダスター、コーニング社、コーニング、ＮＹ、ＵＳＡ）で、ウェルにつき１００μｌ当たり２００，０００の細胞を用いて、＋３７℃（５％ＣＯ２）で４８時間培養された。培地は、ＲＰＭＩ１６４０中に１０％ヒト血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミンと以下の刺激薬のうちの１つを含有した。培地（制御）、感染性エンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ４）（３ＰＦＵ／細胞）、１．０μｇ／ｍｌ濃度の高純度熱処理ＣＢＶ４、５μｇ／ｍｌ濃度のｄｓＲＮＡ類似体（ＴＬＲ−３アゴニスト）ポリ（Ｉ：Ｃ）（アレキス・バイオケミカルズ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）、５μｇ／ｍｌ濃度のＴＬＲ７／８アゴニスト・レジキモド（アレキス・バイオケミカルズ）、１００μｇ／ｍｌ濃度のＴＬＲ４アゴニストとして大腸菌血清型Ｊ５からのＬＰＳ（Ｒｃ）および多クローン性Ｔ細胞活性化因子として溶解性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）。
【００６７】
制御性Ｔ細胞へのウイルスの効果が、ＦｏｘＰ３および１Ｌ−１０特異的ｍＲＮＡの発現を測定することによって分析された。分析はＲＴ−ＰＣＲおよび７９００ＨＴファスト・リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いなされた。
ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ＲＮイージー・ミニ・キットで抽出された。ＲＮＡ抽出中、オンカラムＤＮａｓｅ消化法が、ＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅセット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用い行なわれた。ＲＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素および緩衝剤（プロメガ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）およびランダム６量体プライマーを用い逆転写された。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲ分析のために、ＦｏｘＰ３およびＩＬ−１０用カスタムプライマーが設計された。一方、ハウスキーピング遺伝子ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）用のプライマーは、順方向プライマーに若干修飾した前述の公表（非特許文献２７）のものであった。各プライマーはエクソン−エクソン境界を架橋する１つのプライマーを有する。
プライマー配列は以下の通りであった。ＦｏｘＰ３順方向５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＣＣ−３’、逆方向５’−ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＡＣ Ｇ−３’、ＩＬ−１０順方向５’−ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＴＧ−３’、逆方向５’−ＡＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＡＴ−３’、ＴＢＰ順方向５’−ＣＧＡ ＡＴＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＡＡ ＧＣＧ ＧＴＴ−３’、および逆方向５’−ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＣ−３’。
【００６９】
合成ｃＤＮＡはＤｙＮＡｍｏ Ｆｌａｓｈ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（フィンズィムズ、エスポー、フィンランド）で増殖された。熱サイクル条件は、９５℃で７分、９５℃で１０秒、６００℃で３０秒、７８℃で３０秒を４０サイクル（プライマー二量体除去のため）、次に、６００℃で１分間の最後の延長を行なった。６０℃から９５℃の温度範囲の解離曲線工程が実行毎に最後に付け加えられた。データ解析のために、ＦＯＸＰ３およびＩＬ−１０の閾値サイクル（Ｃｔ）の値は、内因性制御遺伝子ＴＢＰのＣｔ値に正規化された。相対発現量値は前述のようにプァッフル（Ｐｆａｆｆｌ）法を用い演算された（非特許文献２８）。
【００７０】
［統計的方法］
統計的分析は、ＳＰＳＳプログラム・バージョン１２．０（ＳＰＳＳ社、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）および信頼性区間解析（ＣＩＡ）を用い行なわれた（非特許文献２９）。
特異的ＩｇＥの有病率、高い値（＞１００ＩＵ／ｌ）の総ＩｇＥおよび細菌抗体は、マクネマー・テストを用い、２つの対のコホートで比較された。対のコホートでの総ＩｇＥレベル（傾斜分布する連続型変数）の比較は、ウィルコクソン・サインド・ランク・テスト（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔ）を用いて行なわれた。
【００７１】
ロシア・カレリアおよびフィンランドのウイルス抗体、総ＩｇＥの高値、および特異的ＩｇＥの関係の分析にはクロス集計およびカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定が利用された。総ＩｇＥレベルと特異的ＩｇＥ（陽性または陰性と分類される）との関係が分析される際、および、ＣＢＶ４ＩｇＧレベルと特異的ＩｇＥとの関係分析には、マンホイットニーＵ検定が利用された。多変量解析法として、必要に応じてロジスティック回帰が各パラメータの単独作用を特定するために適用された。
モデルは、前進ステップワイズ手順に基づき選択された。項目の入力および削除の限界値は０．１０に等しかった。結果は、オッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（Ｃｌ）の評価に支持されている。欠落または無関係な値があった場合、そのケースはその特定のパラメータに関する分析に含まれなかった。そのようなケースの数は少なく、例えば、ロシア・カレリア人の子供の細菌血清学では、分析された細菌ごとの欠落ケースは０〜２であった。全ての分析は両側検定であった。統計的有意なＰ値（＜０．０５）が与えられる。
【００７２】
［結果］
アレルゲン特異的ＩｇＥの有病率は、フィンランドの子供よりもロシア・カレリアの子供のほうが著しく低かった（表１）。
エンテロウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス抗体の有病率は、フィンランドの子供よりもロシア・カレリアの子供のほうが著しく高かった（表２）。
さらに、ロシア・カレリアでは、アレルギー感作はエンテロウイルス抗体を保有する子供のほうにおいて稀であった。一方、そのような影響はＡ型肝炎抗体に関しては見られなかった（表３）。
要するに、エンテロウイルス血清反応陽性である子供の場合は５％だったのに比べて、エンテロウイルス血清反応陰性の子供の２２％が、少なくとも１つの陽性特異的ＩｇＥ結果を保有した。少なくとも１つのアレルゲン特異的ＩｇＥ（Ｐ＝０．０４８）を保有する子供では４９ＥＩＬＪ（範囲：０〜１５４）であったのに比べて、エンテロウイルス抗体レベルの中央値は、特異的ＩｇＥを保有しない子供では７４酵素免疫測定単位（ＥＩＵ）（範囲：０〜２２４）であった。
【００７３】
フィンランドでは、ＨＡＶ血清反応陽性の子供の数はとても少なく（表２）、そのことでＨＡＶ血清反応陽性の子供とアレルゲン特異的ＩｇＥとの関連を分析するのが難しくなった。しかし、フィンランドの子供にはエンテロウイルス抗体は頻繁に見受けられるが、ロシア・カレリアの子供とは対照的に、エンテロウイルス抗体はアレルゲン特異的ＩｇＥ応答との関連性を示さなかった（エンテロウイルス血清反応陽性である子供の場合は２３％だったのに比べて、エンテロウイルス血清反応陰性の子供の１８％も、少なくとも１つの陽性特異的ＩｇＥ結果を保有した）。
感染とアトピーの有病率の関係がロシア・カレリアの子供のみに観察され、フィンランドの子供には観察されなかったという事実は、フィンランドではエンテロウイルスや他の病原菌の広がりが著しく低いので、フィンランドの子供は大きくなってから感染しているという仮説により説明可能である。
衛生仮説によると、生後最初の数ヶ月にかかる感染は、腸管関連の免疫系の成熟と発達中の調節経路およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスに著しい影響を持つので、最も重要なものである。
【００７４】
異なる血清型でエンテロウイルスの保護的効果が違うかどうかを調べるために、我々は、総計２４４人のロシア・カレリア人の子供を、アレルゲン特異的ＩｇＥおよび４つの異なるエンテロウイルス血清型（ＣＢＶ４、ＣＢＶ５、エコーウイルス９およびエコーウイルス１１）に対する中和抗体に関して分析した。
中和抗体は、何十年も上昇したままなので、これらの抗体の存在は、分析で使用される血清型に過去において感染していたことを示す。
エコーウイルス１１は、アレルギー感作に対する強い保護と関連があった（図１）。つまり、エコーウイルス１１血清反応陰性の子供は３１．８％が表１に示される３つのアレルゲンの少なくとも１つに対してアレルゲン特異的ＩｇＥを保有していたのに対し、エコーウイルス１１血清反応陽性の子供（Ｐ＜０．００１）はたったの１３．２％であった。多重ロジスティック回帰分析において、エコーウイルス１１血清反応陽性は、アレルゲン特異的ＩｇＥに対して明白な単独作用を有した（Ｐ＜０．００１；ＯＲ３．２［９５％Ｃｌ１．７〜６．２］）。アレルギー感作に対するエンテロウイルスの保護的効果はウイルスの血清型に依存するということをこの結果は示す。
【００７５】
アレルギー感作に対するエンテロウイルスの保護的効果は、免疫系にエンテロウイルスが作用することによりもたらされる。アレルギー感作の発達は異常な免疫調節に関係があると、一般には信じられている。制御性Ｔ細胞は免疫調節において主要な役割を果たす。ウイルスが観察された抗アレルギー効果を生起可能なものとして考えられる仕組みの一つは、これらの細胞がウイルスによって活性化されることである。制御性Ｔ細胞は、具体的には、転写因子ＦｏｘＰ３（自然制御性Ｔ細胞）を発現し、ＩＬ−１０（Ｔｒ１制御性細胞）のような免疫調節性サイトカインを分泌する。特に、Ｔｒ１細胞によるＩＬ−１０の分泌は、アレルギー反応の下方調節において重要である（非特許文献３０）。
末梢血単核細胞を感染エンテロウイルスまたは体外で熱処理され精製されたエンテロウイルスに曝露することにより制御性細胞を刺激することができるかどうか分析した。ウイルスにより誘導された応答が、ＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、レジキモド、大腸菌、ＬＰＳ）および多クローン性のＴ型刺激細胞（単クローン性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の混合物）を用い得られた応答と比較された。
【００７６】
単核細胞の感染性ＣＢＶ４への曝露の結果、ＦｏｘＰ３特異的ｍＲＮＡの発現において明らかな増加（３．３倍）（図２）、および、モック処理された培養物に比べてＩＬ−１０特異的ｍＲＮＡにおいて３．６倍の増加となった（図３）。同様に、熱処理されたＣＢＶ４は、ＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡにおいて１．９倍の増加、およびＩＬ−１０ｍＲＮＡにおいて３〜４倍の増加という結果になった。ポリ（Ｉ：Ｃ）はＦｏｘＰ３もＩＬ−１０ｍＲＮＡも誘導しなかった。一方、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の組み合わせは、ＦｏｘＰ３およびＩＬ−１０の両方の発現を誘導した（それぞれ８．１倍、２．６倍の増加）。レジキモドおよびＬＰＳは、ＦｏｘＰ３発現を誘導しなかった（図２）が、ＩＬ−１０発現の明白な増加となった。
これらの結果は、エンテロウイルスは制御性Ｔ細胞を活性化させることができることを示す。エンテロウイルスにより誘導された活性化は、強力な単核Ｔ細胞活性化因子（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の混合物）を用いて得られるものに匹敵し、この現象の生物学的関連性を支持する結果となった。さらに、エンテロウイルスは、３つの古典的ＴＬＲアゴニストより強いＦｏｘＰ３発現、および、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８アゴニスト（それぞれＬＰＳおよびレジキモド）と同様の強さのＩＬ−１０発現を誘導することができた。
【００７７】
このように、これらの結果から、エンテロウイルスに感染することはアレルギー感作の危険性が減少することと関連があり、免疫調節性経路を刺激し、それによりアレルギー疾患を防ぐように免疫系を調節することができることが示される。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
１６６人のフィンランド児童のみがＡ型肝炎ウイルス抗体について調べられた。
この分析で用いられるエンテロウイルス抗原は、高純度のコクサッキーウイルスＢ４であって、異なるエンテロウイルス血清型に対する抗体と幅広く反応するように熱処理された。
【００８０】
【表３】
ＮＳは有意でないことを示す。＊前進ステップワイズモデル（入力および削除のためのＰ値は０．１０）
【技術分野】
【０００１】
本願は、アレルギー感作、特にＩｇＥ媒介感作の危険性を減少させることに関し、また、アレルギー感作の臨床的疾患への進行の危険性を減少させることにより喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎や結膜炎のようなアレルギー性疾患が予防または治療されることに関する。より正確には、本願は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する医薬組成物を製造するための特定のウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近数十年間、アレルギー性疾患の有病率は先進国で常に増加している。新生児の免疫系は未熟で、新生児期から幼児期にわたって発達する。健常児は生活環境の中の病原菌に対して免疫応答を発達させるが、その一方、生活環境の中の無害因子に対してアレルギー反応をおこし、アレルギー性疾患に至る子供の割合が増加している。
【０００３】
アレルギー性疾患発症を予防するために、いくつかの試みがなされてきた。何年もの間、母乳のみを与えることや幼少期に猫や犬のようなアレルギーを誘発する原因と考えられるものとの接触を避けることがアレルギー性疾患の危険性を減少させる手段とされてきた。しかし、結果は納得のいくようなものではなかった。
【０００４】
アレルギー性疾患の原因に対する最近の仮説は「衛生仮説」と呼ばれるもので、それは、アレルギー性疾患の有病率は、衛生基準の低い国よりも生活および衛生基準の高い豊かな国で著しく高いという事実に基づいている。さらに、兄弟数とアレルギー性疾患との逆相関関係が、疫学調査において証明されている（非特許文献１，２）。農場で育つことで、アレルギー性鼻炎や感作有病率がより低くなることと関連があると考えられる（非特許文献３，４，５）。農場に住んではいないが定期的に家畜と接触をもつ子供もまたアレルギー感作有病率は低かった（非特許文献４）。
【０００５】
これらの関連性の根底にある理由はほとんど分かっていないが、「衛生仮説」では、小児期に様々な病原菌にさらされることが、免疫系の成熟を促し、アレルギー性疾患から保護するとする説明が与えられる（非特許文献２，６）。アレルギーへの取り組みとして考えられる１つの取り組みは、プロバイオティクス細菌、特に、乳酸菌の投与であり、それらの菌は寛容原性免疫応答を促進することが示されている。
【０００６】
いくつかの研究が、喘息およびアレルギーの発症におけるＴｈ２極性ＣＤ４およびＴ細胞の役割を提示してきたが（非特許文献７〜９）、アレルギー感作を調節する正確な免疫機序は知られていない。
ＴＭ偏向免疫応答は、Ｔｈ２細胞の影響を下方調節し（非特許文献７）、または、制御性Ｔ細胞はＴｈ１およびＴｈ２細胞両方の機能を制御するとともに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを制御する（非特許文献８，９）。
【０００７】
矛盾する報告もあるが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（非特許文献１０〜１３）、トキソプラズマ原虫（非特許文献１２，１３）およびヘリコバクター・ピロリ（非特許文献１２〜１４）のような感染症、および細菌成分（非特許文献１５〜１７）は、アレルギー性疾患の危険性低下と関連があるとする疫学的な裏付けがあり、そのことより、微生物負荷は小児期におけるアレルギー発症から保護する重要な環境因子であるとする仮説を裏付ける。
さらに、英国において、５歳までの胃腸感染症数とアトピーの危険性とに逆相関が単独に見られた（非特許文献１９）。ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）に幼少期に感染すると、幼児のＩｇＥ感作、アトピー性疾患およびアレルギー発症を防ぐことも報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０３１１９５号公報
【特許文献２】ＷＯ９３／１１２５１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】カルマウス・ダブリュ（Ｋａｒｍａｕｓ Ｗ）、ボテザン・シー（Ｂｏｔｅｚａｎ Ｃ）著、「兄弟の数が多いほど、アレルギーや喘息を防ぐ？レビュー（Ｄｏｅｓ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｉｂｌｉｎｇｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ａｓｔｈｍａ？ Ａ ｒｅｖｉｅｗ．）」、「ジェイ・エピデミオル・コミュニティ・ヘルス（Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ）」、２００２年、第５６号、第２０９〜２１７頁
【００１０】
【非特許文献２】ストラッチャン・ディーピー（Ｓｔｒａｃｈａｎ ＤＰ）著、「ファミリーサイズ、感染症およびアトピー：“衛生仮説”の最初の１０年（Ｆａｍｉｌｙ ｓｉｚｅ， ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｏｐｙ： Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ “ｈｙｇｉｅｎｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ”）」、ソラックス（Ｔｈｏｒａｘ）、２０００年、補遺５５−１号、Ｓ２−１０
【００１１】
【非特許文献３】フォン・ハーツェン・エル（ｖｏｎ Ｈｅｒｔｚｅｎ Ｌ）、マケラ・エム（Ｍａｋｅｌａ Ｍ）、ペテイズ・ティ（Ｐｅｔａｙｓ Ｔ）等著、「フィンランド人とロシア人との間で広がるアトピーにおける格差：２つの発生地域の比較（Ｇｒｏｗｉｎｇ ｄｉｓｐａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｔｏｐｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｆｉｎｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｕｓｓｉａｎｓ： Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」２００６年、第１１７号、第１５１〜１５７頁
【００１２】
【非特許文献４】リードラー・ジェイ（Ｒｉｅｄｌｅｒ Ｊ）、エダー・ダブリュ（Ｅｄｅｒ Ｗ）、オベルフェルド・ジー（Ｏｂｅｒｆｅｌｄ Ｇ）、シュレウアー・エム（Ｓｃｈｒｅｕｅｒ Ｍ）著、「農場に住むオーストリア人の子供は花粉症、喘息、アレルギー感作が少ない（Ａｕｓｔｒｉａｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｎ ａ ｆａｒｍ ｈａｖｅ ｌｅｓｓ ｈａｙ ｆｅｖｅｒ， ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．）クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）、２０００年、第３０号、第１９４〜２００頁
【００１３】
【非特許文献５】キルペレイネン・エム（Ｋｉｌｐｅｌａｉｎｅｎ Ｍ）、テルホ・イーオー（Ｔｅｒｈｏ ＥＯ）、ヘレニウス・エイチ（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ Ｈ）、コスケンヴオ・エム（Ｋｏｓｋｅｎｖｕｏ Ｍ）著、「子供時代の農場環境はアレルギーの発症を予防する（Ｆａｒｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｅｓ）」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２０００年、第３０号、第２０１〜２０８頁
【００１４】
【非特許文献６】ストラッチャン・ディーピー（Ｓｔｒａｃｈａｎ ＤＰ）著、「花粉症、衛生、家庭サイズ」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、１９８９年、第２９９号、第１２５９〜６０頁
【００１５】
【非特許文献７】モスマン・ティーアール（Ｍｏｓｍａｎｎ ＴＲ）、サド・エス（Ｓａｄ Ｓ）著、「Ｔ細胞サブセット：Ｔｈ１、Ｔｈ２他の膨張宇宙（Ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｕｎｉｖｅｒｓｅ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ：Ｔｈ１ ， Ｔｈ２ ａｎｄ ｍｏｒｅ）」、「イミュノル・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ）」、１９９６年、第１７号、第１３８〜１４６頁
【００１６】
【非特許文献８】ウメツ・ディーティ（Ｕｍｅｔｓｕ ＤＴ）、アクバリ（Ａｋｂａｒｉ Ｏ）、デクライフ・アールエイチ（Ｄｅｋｒｕｙｆｆ ＲＨ）著、「制御性Ｔ細胞はアレルギー性疾患および喘息の発症を制御する（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｓｔｈｍａ）」、 「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００３年、第１１２号、第４８０〜４８７頁
【００１７】
【非特許文献９】クロット・ド・ラファイル・エムエー（Ｃｕｒｏｔｔｏ ｄｅ Ｌａｆａｉｌｌｅ ＭＡ）、ラファイル・ジェイジェイ（Ｌａｆａｉｌｌｅ ＪＪ）著、「自己免疫およびアレルギーにおけるＣＤ４（＋）制御性Ｔ細胞（ＣＤ４（＋） ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｙ）」、「カー・オピン・イミュノル（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００２年、第１４号、第７７１〜７７８頁
【００１８】
【非特許文献１０】マッキンター・ジェイジェイ（ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＪＪ）、ウメツ・エスイー（Ｕｍｅｔｓｕ ＳＥ）、マカウバス・シー（Ｍａｃａｕｂａｓ Ｃ）等著、「免疫学：Ａ型肝炎ウイルスはアトピー性疾患に関連する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ ｌｉｎｋ ｔｏ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００３年、第４２５号、第５７６頁
【００１９】
【非特許文献１１】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロスミニ・エフ（Ｒｏｓｍｉｎｉ Ｆ）、フェリングノ・エル（Ｆｅｒｒｉｇｎｏ Ｌ）等著、「Ａ型肝炎ウイルスに対する抗体を有するイタリア軍事学校生徒のアトピー有病率の断面遡及的研究（Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｏｐｙ ａｍｏｎｇ Ｉｔａｌｉａｎ ｍｉｌｉｔａｒｙ ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、１９９７年、第３１４号、第９９９〜１００３頁
【００２０】
【非特許文献１２】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロスミニ・エフ（Ｒｏｓｍｉｎｉ Ｆ）、リオンディーノ・エス（Ｒｉｏｎｄｉｎｏ Ｓ）等著、「アトピーおよびアレルギー性喘息の観点における、食物媒介および糞口病原菌への曝露対空気中の浮遊ウイルスへの曝露：疫学的研究」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、２０００年、第３２０号、第４１２〜４１７頁
【００２１】
【非特許文献１３】リンネバーグ・エー（Ｌｉｎｎｅｂｅｒｇ Ａ）、オスターガード・シー（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｃ）、トゥヴェーデ・エム（Ｔｖｅｄｅ Ｍ）等著、「デンマーク人成人の微生物およびアトピー性疾患に対するＩｇＧ抗体：コペンハーゲン・アレルギー研究（ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｄａｎｉｓｈ ａｄｕｌｔｓ： Ｔｈｅ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ａｌｌｅｒｇｙ ｓｔｕｄｙ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００３年、第１１１号、第８４７〜８５３頁
【００２２】
【非特許文献１４】コスネン・ティーユー（Ｋｏｓｕｎｅｎ ＴＵ）、フック・ニカネ・ジェイ（Ｈｏｏｋ−Ｎｉｋａｎｎｅ Ｊ）、サロマ・エー（Ｓａｌｏｍａａ Ａ）、サルナ・エス（Ｓａｒｎａ Ｓ）、アロマ・エー（Ａｒｏｍａａ Ａ）、ハーテラ・ティ（Ｈａａｈｔｅｌａ Ｔ）著、「１９７３年から１９９４年までのフィンランド住民のアレルゲン特異性免疫グロブリン抗体の増加およびヘリコバクター・ピロリ感染症との考えられる関係（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ １９７３ ｔｏ １９９４ ｉｎ ａ Ｆｉｎｎｉｓｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２００２年、第３２号、第３７３〜３７８頁
【００２３】
【非特許文献１５】ジェレーダ・ジェイイー（Ｇｅｒｅｄａ ＪＥ）、レン・ディーワイ（Ｌｅｕｎｇ ＤＹ）、リウ・エーエイチ（Ｌｉｕ ＡＨ）著、「環境的エンドトキシンのレベルおよびアトピー性疾患の流行（Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）」、「ジェイエーエムエー（ＪＡＭＡ）」、２０００年、第２８４号、第１６５２〜１６５３頁
【００２４】
【非特許文献１６】ジェレーダ・ジェイイー（Ｇｅｒｅｄａ ＪＥ）、レオン・ディーワイ（Ｌｅｕｎｇ ＤＹ）、サタヤキコム・エー（Ｔｈａｔａｙａｔｉｋｏｍ Ａ）等著、「喘息の高い危険性を持つ乳児における、ハウスダスト・エンドトキシン曝露、Ｔ細胞１型発達、およびアレルギー感作の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｕｓｅ−ｄｕｓｔ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ， ｔｙｐｅ １ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｓｔｈｍａ）」、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２０００年、第３５５号、第１６８０〜１６８３頁
【００２５】
【非特許文献１７】フォン・ムチュス・イー（ｖｏｎ Ｍｕｔｉｕｓ Ｅ）、ブラウン−ファーランダー・シー（Ｂｒａｕｎ−Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ Ｃ）、シエール・アール（Ｓｃｈｉｅｒｌ Ｒ）等著、「エンドトキシンまたは他の病原菌への曝露はアトピーの発症を防ぐかもしれない（Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｙ」、「クリン・エクスポ・アレルギー（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２０００年、第３０号、第１２３０〜１２３４頁
【００２６】
【非特許文献１８】マトリカルディ・ピーエム（Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ ＰＭ）、ロンチェッティ・アール（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ Ｒ）著、「感染症はアトピーから防ぐ？（Ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｏｐｙ？）」、「カー・オピン・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１年、第１号、第４１３〜４１９頁
【００２７】
【非特許文献１９】カリナン・ピー（Ｃｕｌｌｉｎａｎ Ｐ）、ハリス・ジェイエム（Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ）、ニューマン・テイラー・エージェイ（Ｎｅｗｍａｎ Ｔａｙｌｏｒ ＡＪ）等著、「早期感染は成人アトピーにおける兄弟の影響を説明できるか？（Ｃａｎ ｅａｒｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｓｉｂｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｔｏｐｙ？）」、「ユウ・レスピア・ジェイ（Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ）」、２００３年、第２２号、第９５６〜９６１頁
【００２８】
【非特許文献２０】ベン・シーエス（Ｂｅｎｎ ＣＳ）、メルバイ・エム（Ｍｅｌｂｙｅ Ｍ）、ウォルファート・ジェイ（Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ Ｊ）、ビヨルクステン・ビー（Ｂｊｏｒｋｓｔｅｎ Ｂ）、アービー・ピー（Ａａｂｙ Ｐ）、「生後１８ヶ月間の兄弟効果、感染性疾患、およびアトピー性皮膚炎のコホート研究（Ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｂｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ， ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｉｒｓｔ １８ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ｌｉｆｅ）」、「ビーエムジェイ（ＢＭＪ）」、２００４年、第３２８号、第１２２３頁
【００２９】
【非特許文献２１】バゲル・ピー（Ｂａｇｅｒ Ｐ）、ウエステルガルド・ティ（Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｔ）、ロストガルド・ケイ（Ｒｏｓｔｇａａｒｄ Ｋ）、ヒャルグリム・エイチ（Ｈｊａｌｇｒｉｍ Ｈ）、メルバイ・エム（Ｍｅｌｂｙｅ Ｍ）、「子供時代の感染性とアトピーの危険性（Ａｇｅ ａｔ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｔｏｐｙ）」、「ソラックス（Ｔｈｏｒａｘ）」、２００２年、第５７号、第３７９〜３８２頁
【００３０】
【非特許文献２２】コンドラショワ・エー（Ｋｏｎｄｒａｓｈｏｖａ Ａ）、ロマノフ・エー（Ｒｏｍａｎｏｖ Ａ）、ルーナネン・エー（Ｒｅｕｎａｎｅｎ Ａ）等著、「フィンランド東部境界の１型糖尿病の発生率における６倍勾配−疾患原因における環境の重要な役割の証拠（Ａ ｓｉｘ−ｆｏｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｅａｓｔｅｒｎ ｂｏｒｄｅｒ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ − ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、「アン・メッド（Ａｎｎ Ｍｅｄ）」、２００５年、第３７号、第６７〜７２頁
【００３１】
【非特許文献２３】マキ・エム（Ｍａｋｉ Ｍ）、ムスタラフティ・ケイ（Ｍｕｓｔａｌａｈｔｉ Ｋ）、コッコネン・ジェイ（Ｋｏｋｋｏｎｅｎ Ｊ）等著、「フィンランドの子供のセリアック病有病率（Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ）」、「エヌ・イングル・ジェイ・メッド（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）」、２００３年、第３４８号、第２５１７〜２５２４頁
【００３２】
【非特許文献２４】ヴァルチアイネン・イー（Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ Ｅ）、ペテイズ・ティ（Ｐｅｔａｙｓ Ｔ）、ハーテラ・ティ（Ｈａａｈｔｅｌａ Ｔ）、ジョーシラティ・ピー（Ｊｏｕｓｉｌａｈｔｉ Ｐ）、ペッカネン・ジェイ（Ｐｅｋｋａｎｅｎ Ｊ）著、「フィンランド北カレリアおよびロシア・カレリア共和国におけるアレルギー性疾患、皮膚プリックテスト応答およびＩｇＥレベル（Ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ａｎｄ ＩｇＥ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ， Ｆｉｎｌａｎｄ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋａｒｅｌｉａ， Ｒｕｓｓｉａ）」、「ジェイ・アレルギー・クリン・イミュノル（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」、２００２年、第１０９号、第６４３〜６４８頁
【００３３】
【非特許文献２５】サルミネン・ケイ（Ｓａｌｍｉｎｅｎ Ｋ）、サデハリュ・ケイ（Ｓａｄｅｈａｒｊｕ Ｋ）、ロンロット・エム（Ｌｏｎｎｒｏｔ Ｍ）等著、「出産予定コホート研究において、エンテロウイルス感染はベータ細胞自己免疫の誘導に関連する（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｂｉｒｔｈ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ）」、「ジェイ・メッド・ヴィロール（Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ）」、２００３年、第６９号、第９１〜９８頁
【００３４】
【非特許文献２６】ロイヴァイネン・エム（Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ Ｍ）、ニップ・エム（Ｋｎｉｐ Ｍ）、ヒョティ・エイチ（Ｈｙｏｔｙ Ｈ）等著、「数種の異なるエンテロウイルス血清型は、前糖尿病自己免疫発現および顕性ＩＤＤＭの発症に関連することが可能である（Ｓｅｖｅｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｃａｎ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｉａｂｅｔｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ａｎｄ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｏｖｅｒｔ ＩＤＤＭ）」、「フィンランドにおける小児性糖尿病（ＤｉＭｅ）研究グループ （Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ （ＤｉＭｅ） Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ）」、「ジェイ・メッド・ヴィロール（Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ）」１９９８年、第５６号、第７４〜８頁
【００３５】
【非特許文献２７】イソマキ・ピー（Ｉｓｏｍａｋｉ Ｐ）等著、「ＳＯＣＳの発現は 関節リュウマチにおいて変化する（Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＯＣＳ ｉｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）」、「リュウマチ学（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００７年、第４６号、第１５３８〜４６頁
【００３６】
【非特許文献２８】プァッフル・エムダブリュ（Ｐｆａｆｆｌ Ｍ Ｗ）、「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける相対的定量化のための新しい数学的モデル（Ａ ｎｅｗ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、「核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第２９号、第２００２〜２００７頁
【００３７】
【非特許文献２９】オルトマン・ディ（Ａｌｔｍａｎ Ｄ）、オルトマン・ディ・ジー（Ａｌｔｍａｎ ＤＧ）、ブライアント・ティ（Ｂｒｙａｎｔ Ｔ）、ガードナー・エム（Ｇａｒｄｎｅｒ Ｍ）、 ガードナー・エム・ジェイ（Ｇａｒｄｎｅｒ ＭＪ）、マーチン・ディ（Ｍａｃｈｉｎ Ｄ）著、「確信のある統計：ロンドン（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ：Ｌｏｎｄｏｎ）」、ビーエムジェイ・ブックス（ＢＭＪ Ｂｏｏｋｓ）、２０００年
【００３８】
【非特許文献３０】ウー・ケイ（Ｗｕ Ｋ）、ビ・ワイ（Ｂｉ Ｙ）、スン・ケイ（Ｓｕｎ Ｋ）、ワン・シー（Ｗａｎｇ Ｃ）、「ＩＬ−１０産生する制御性Ｔ細胞１型およびアレルギー（ＩＬ−１０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｙｐｅ １ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｙ）」、「セル・モル・イミュノル（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ）」 ２００７年、第４号、第２６９〜７５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
しかし、全ての細菌感染がアトピー性疾患の有病率に保護的効果を持つとは限らない。例えば、クロストリジウム・ディフィシレ、キャンピロバクター・ジェジュニ、および腸炎エルシニアのような腸内細菌に対する血清反応陽性は、成人デンマーク人のアトピーの高い有病率と関連があることが分かった（非特許文献１３）。最近、ベン氏らは、生後６ヶ月間の感染症（大概は上気道感染）がアトピーの危険性を増すことを報告し（非特許文献２０）、ベーガー氏と共同研究者は、１歳前に空中浮遊菌（麻疹、風疹、流行性耳下腺炎および水痘）に起因する感染数が増加するのに伴いアトピーの危険性も上昇することを観察した（非特許文献２１）。
【００４０】
アレルギー感作の危険性を減少させ、それによりアレルギー感作を伴う疾患の予防または治療を防ぐ効果的な手段が明らかに必要である。特に、喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎および結膜炎のようなアレルギー性疾患、および食物が引き起こすアレルギーの発症を防止することが必要である。本発明はこれらの必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
本発明は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療するためのエンテロウイルスの使用を基本とする。より詳しくは、本発明は、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する医薬組成物の製造におけるエンテロウイルスの使用であって、そのエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれる外因性核酸配列でありかつアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まない。本発明では、アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する方法も開示される。この方法では、エンテロウイルスを含有する医薬組成物の有効量が、それを必要とするヒトに投与され、そのエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれてアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まない。
発明の詳細な意味は従属項において定義される。他の目的、詳細、効果は以下に示す詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】異なるエンテロウイルス血清型に対する血清反応陽性による、ロシア・カレリア人小児のアレルゲン特異的ＩｇＥの有病率を示す図である。
【図２】感染性エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、熱処理された精製エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、異なるＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、レジキモド）および多クローン性のＴ型刺激細胞（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）に刺激される、末梢血単核細胞培養におけるＦｏｘＰ３ｍＲＮＡの誘導を示す図である。細胞は２４時間培養後に集菌された。結果は、媒体処理された細胞に対するＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡの相対発現量として示される。ＥＶはエンテロウイルスである。
【図３】感染性エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、熱処理された精製エンテロウイルス（ＣＢＶ４）、異なるＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、レジキモド）および多クローン性のＴ型刺激細胞（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）に刺激される、末梢血単核細胞培養におけるＩＬ−１０ｍＲＮＡの誘導を示す図である。細胞は２４時間培養後に集菌された。結果は、媒体処理された細胞に対するＩＬ−１０ ｍＲＮＡの相対発現量として示される。ＥＶはエンテロウイルスである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、アレルギー感作およびそれに伴う疾患が、エンテロウイルスを免疫活性材料として含む組成物を用い予防接種することで防げることを発見したことに基づく。
外因性核酸配列を含む組み換えウイルス（その外因性核酸配列はウイルスゲノムに組み込まれ、アレルゲンのエピトープおよび理論上存在するタンパク質分解的切断部位をコードするものである）は、アレルギーに対する効果を証明する例は何もないにもかかわらず、アレルギーに対するワクチンとしてこれまでに提案されていた（特許文献２）。
【００４４】
このアプローチは、本発明とは全く違う。それは、このウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれ、抗原をコードする外因性核酸配列（これは、抗原に対して望ましい免疫応答を導くと信じられている）に対する受動的「担体」または運搬手段として機能するが、本発明はエンテロウイルス自体によって誘導される免疫調節性効果に基づくからである。
【００４５】
したがって、本発明のエンテロウイルスは活性成分であり、予防または治療すべきアレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする組み込まれた外因性核酸配列を含まない。しかし、本発明で使用されるエンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれる非コード外因性核酸配列を含んでもよいし、ウイルスゲノムに組み込まれないコードまたは非コード外因性核酸配列を含んでもよい。本発明で使用されるエンテロウイルスは、外因性タンパク質も含んでよい。本発明の実施形態では、エンテロウイルスは外因性タンパク質をコードする外因性核酸を含まず、特に外因性タンパク質をコードする組み込まれた外因性核酸を含まない。
【００４６】
本発明において、「アレルゲン」とは、アレルギー性免疫応答を誘導する化合物であり、タンパク質全体または免疫活性のある断片（例えば、エピトープ）だけであってもよい。核酸はこのことから明らかにアレルゲンとは考えられない。
エンテロウイルス群には１００を超える異なった血清型がある。エンテロウイルス感染は通常無症状であるが、各種の疾患を引き起こすこともある。ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＢ群、コクサッキーウイルスＡ群、エコーウイルスおよび番号をふられたエンテロウイルスは、各種疾患の発症に関係するとして知られているエンテロウイルスである。エンテロウイルス感染は糞口感染経路で拡がり、粘膜および腸管関連の免疫系を通して宿主感染させる。エンテロウイルス感染は、免疫系の強力な活性剤であり、免疫系に激しい変化をもたらす。
【００４７】
本発明において、「エンテロウイルス」は、エンテロウイルス全体および、その成分またはその組み合わせを含む。エンテロウイルスは、弱毒化または非弱毒化された生エンテロウイルス株、遺伝子組み換えされた株、またはエンテロウイルス株由来の成分（例えばサブユニットまたはペプチド）、構造タンパク質成分またはそれらの組み合わせ（例えば粒子状のウイルス）、またはゲノムまたはゲノム断片（例えば、免疫学的に活性なウイルスタンパク質をコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡ）であってもよい。エンテロウイルスは、死滅した、つまり、不活化エンテロウイルス株であってもよい。
【００４８】
アレルギー感作の予防および治療において特に有用なエンテロウイルスは、免疫調節性経路を誘導またはＴｈ２型免疫応答を下方調節する性能により特定可能である。このようなエンテロウイルスは、制御性Ｔ細胞、および／またはＴｈ１／Ｔｈ２バランス、および／または免疫調節性サイトカイン（例えば、異なるエンテロウイルスを有する抹消血白血球の生体外刺激する際、または、エンテロウイルス感染している小児の生体内におけるかいずれかのＩＬ−１０）の産生への効果を分析することによって特定される。このようなエンテロウイルスは、通常、ＰｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、またはＩＬ−１０や他の免疫調節性サイトカインを産生する制御性Ｔ細胞を活性化させるべきである。このようなエンテロウイルスは、例えば、ＩＬ−４または他のＴｈ２型サイトカインの産生の減少、および／またはそれに平行したＴｈ１型細胞の活性増加およびインターフェロン・ガンマまたは他のＴｈ１型サイトカインの増加産生を反映してＴｈ２型細胞の活性を低下させることもある。
【００４９】
本発明で特に有用なエンテロウイルスは、疫学調査における保護的効果によっても特定可能である。このようなエンテロウイルスは、通常、アレルギー感作またはアレルギー症状を発症した人に比べて、アレルギー感作またはアレルギー症状を発症していない個人により頻繁に見受けられるはずであった。これらのウイルスは、血液から血清型特異的抗体を測定することや、この種の疫学調査で検出されるウイルスの抗原性または遺伝子的特性を分析することによって特定可能である。
【００５０】
弱毒化されたウイルスとは、その毒性を低下させたウイルスのことである。これは、細胞培養におけるウイルスの連続継代、化学処置による抗原修飾、組み換えまたはキメラウイルスの構築、ウイルスゲノムの突然変異、特定遺伝子領域の削除または挿入、温度感性突然変異体の選択、または照射などの異なる方法により行なわれる。あるいは、エンテロウイルスは、弱毒化された自然ウイルス分離株であってもよいし、または臨床疾患を引き起こす能力が低下した感染ウイルスｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００５１】
弱毒化または非弱毒化された生エンテロウイルスは、便宜上、経口投与される。一回の予防摂取量は、感染または自然また獲得免疫系を活性化し、または、ヒトに制御性Ｔ細胞または制御性サイトカインを誘導する力価の感染ウイルス、または感染ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。この一回分投与量は、弱毒化されたセービン型生ポリオウイルス株で、最低でもポリオウイルス１型を１０５．５〜１０６ＴＣＩＤ５０、ポリオウイルス２型を１０５ＴＣＩＤ５０、ポリオウイルス３型を１０５．５〜１０５．８ＴＣＩＤ５０を含む従来のセービン型経口生ポリオウイルスワクチンに使用される一回分投与量に相当する。この投与量は、安全で感染性があり、または自然また獲得免疫系を活性化させることができることが確認されたなら、他の投与量であってもよい。（ＴＣＩＤは組織培養感染量；ＴＣＩＤ５０は５０％の組織培養に感染させる量を示す。）
【００５２】
あるいは、エンテロウイルスには、感染性が不活化されたウイルス全体、または、ウイルスの特定の抗原構造、タンパク質またはペプチドを含むサブユニットワクチン、またはそれらの組み合わせ（例えば粒子状ウイルス）、またはウイルス全体または個別のウイルス性タンパク質をコードするウイルス性ＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片、または不活化状態のウイルスが含まれる。
【００５３】
不活化ワクチンは細胞培養でウイルスを増殖させ、サッカロースまたは他の高密度媒体により形成される密度勾配で、そのウイルスを感染細胞および培養媒体から高速遠心分離により精製することによって産生される。あるいは、ウイルスはクロマトグラフィにより精製される。精製されたウイルスの感染性は、そのウイルスを化学処置（例えば、ＩＰＶを産生するのに使用されるようなホルマリン不活化）、照射または熱処理により不活化することで破壊される。サブユニットワクチンは、精製されたウイルス性タンパク質または組み替えウイルス性タンパク質、ウイルス性抗原エピトープに対応する合成ペプチド、粒子状ウイルスまたは空のウイルスカプシド（感染中に産生されるが、ウイルスゲノムを欠く）からなる。これらのサブユニットワクチンはそのまま、又はハプテンまたは担体（例えば、ＩＳＣＯＭ粒子、キトサン、ＴＬＲアゴニスト、生分解性微粒子）に抱合されて投与される。
【００５４】
上述したエンテロウイルスは、注射により非経口で、経口で、皮内に、経皮に、舌下に、吸入として、または経直腸的に与えられる。
一回分投与量は、ヒトに適切な免疫応答を誘導することが可能な力価のウイルス構造を含む。この投与量は、一回分投与量につきウイルス性タンパク質を１．８〜２μｇ、ポリオウイルス１型の抗原性Ｄユニットを２０〜４０、ポリオウイルス２型の抗原性Ｄユニットを４〜８、およびポリオウイルス３型の抗原性Ｄユニットを１６〜３２含むソーク型不活化ポリオウイルスワクチンに使用される量に相当する。この投与量は、安全で感染性があり、または自然また獲得免疫系を刺激、または制御性Ｔ細胞または制御性サイトカインを誘導させることができることが確認されたなら、他の投与量であってもよい。
【００５５】
エンテロウイルスは、同時にまたは連続的に与えられる１以上のエンテロウイルス血清型を含む異なる組み合わせで与えられる。
異なるエンテロウイルスが同時に与えられる場合は、医薬組成物は異なるエンテロウイルスの混合物の形態をとりうる。エンテロウイルスは、アレルゲンに対して寛容原性応答を促進するために、少なくとも１つのアレルゲン（例えば、アレルゲン全体またはその免疫学的に活性なサブユニット）と組み合わせて与えられる。本発明の一実施形態としては、ワクチンは唯一の免疫活性材料としてエンテロウイルスを含有するものとされ、また別の実施形態においては、エンテロウイルスと１以上の外因性アレルゲンとの混合物を含有するものとすることができる。
【００５６】
エンテロウイルスは医薬組成物に調製され、この医薬組成物は免疫刺激を引き起こす活性材料に加えて、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、ハプテン、アジュバントを含みうる。
賦形剤、担体、ハプテン、アジュバントは、例えば、フェノキシエタノール、塩化マグネシウム、サッカロース、チオマーサル、ホルムアルデヒド、フェノール、抗生物質（防腐剤）またはアルミニウム塩、ポリマー微粒子、ＩＳＣＯＭ微粒子、担体タンパク質（例えば、コレラ毒素）、リポソーム、タンパク質ミセル（ハプテン／アジュバント）、またはＴＬＲアゴニストを含む。
医薬組成物は、好ましくは、生後５年以内の小児に投与され、より好ましくは、３年以内、特に２年以内で、最も好ましくは、生後１年以内で投与され、後年追加免疫を行い、アレルギー感作を防ぐ。既に感作された人は、疾患の症状の有無にかかわらず、何歳でも医薬組成物を投与されてよい。
【００５７】
医薬組成物の「有効量」とは、中和抗体または細胞媒介応答のいずれか、または両方を導くことによって、免疫を誘導しウイルスに対して受容者を保護可能な獲得または自然免疫応答のいずれかを導くことができる量である。あるいは、医薬組成物の「有効量」としては、ウイルスに対する保護的免疫が誘導されなかったとしても、制御性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）または活性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を誘導することができるか、または、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの好適なシフトを誘導することができる量としても良い。
制御性サイトカイン、細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ２のシフトの誘導は、ウイルス特異的免疫応答またはアレルゲン特異的免疫応答、または両方において起こり得る。また、異なる抗原またはアレルゲン特異性を有する広範囲の免疫応答に影響する、免疫系へのより汎用的な効果でもありうる。このような汎用的な効果は、一般に、ＩＬ−１０のような溶解性の免疫調節性サイトカインによってもたらされる。
【００５８】
免疫系が病原体を含む生活環境中の異質成分にさらされると、免疫応答が誘導される。その免疫応答はＴｈ１型またはＴｈ２型反応のいずれかで占められる。両反応は感染と戦っているが、Ｔｈ２細胞はアレルギーも促進している。Ｔｈ１／Ｔｈ２型細胞の適切なバランスは、適切な反応に不可欠である。しかし、アレルギー疾患に感染しやすい対象者では、Ｔｈ２型反応が支配的である。さらに、これらの人たちは制御性Ｔ細胞および免疫調節の他の成分の異常機能を有する場合もある。
【００５９】
「アレルギー感作」とは、多くは無害の各種生活環境抗原に対してのアレルゲン特異的ＩｇＥの産生を導くＴｈ２型優位免疫応答をもたらすことを指す。アレルゲン特異的ＩｇＥはアレルギー疾患の症状を誘発する過敏性反応を引き起こす。この種の免疫応答は、例えば、血液サンプルからアレルゲン特異的ＩｇＥを分析することにより測られる。アレルゲン特異的ＩｇＥのレベルが上昇すると、ある特定のアレルゲンに対するアレルギー感作を示す。さらに、総ＩｇＥ免疫グロブリンが高レベルにあることはアレルギー感作を示す。皮膚プリックテストも、アレルギー疾患を診断するのに用いられる。エンテロウイルスを含有する医薬組成物は、アレルギー感作を伴ういかなる疾患も予防または治療できるワクチンである。
【００６０】
ＩｇＥ媒介アレルギー感作は、アレルギー性湿疹、アレルギー性喘息、ＩｇＥ媒介食物または薬品アレルギー、アレルギー性結膜炎または鼻炎のような各種アレルギー疾患を引き起こす。エンテロウイルス・ワクチンはＩｇＥ媒介感作の危険性を減らすことができ、それにより、アレルギー性鼻炎や喘息のようなＩｇＥ感作により誘発される疾患を予防することができる。
エンテロウイルス・ワクチンは、アレルギー感作を予防するために、出生コホート全体、または、少なくとも家族の一員がアレルギー反応または疾患と診断された家族の子供のような、人口のうちの選ばれたグループに投与される。
さらに、エンテロウイルス・ワクチンは、無症状のアレルギー感作（症状のない、アレルゲン特異的ＩｇＥ濃度の増加）を有する人に、臨床症状を発症しないように使用されることもできる。つまり、エンテロウイルス・ワクチンは、アレルギー症状や疾患を軽減するのに用いられることもできる。
フィンランドおよびロシアの小児における細菌感染およびアレルギー感作の有病率におけるばらつきや関連性が、地理的には隣接する地域であるが、社会経済学的および文化的に著しく異なる２つの地域という独特の疫学的設定で研究された。
【００６１】
［方法］
［対象者］
ロシア・カレリア人研究コホートは、２６６人の学童を含み、フィンランド人コホートも同様に２６６人の学童を含んだ。学童は、健常児を表し、アレルギーまたは他の疾患の可能性に応じて選ばれなかった。カレリア共和国の全ての子供は、フィンランド民族かカレリア民族いずれか一方の両親を持ち、このことはフィンランドの子供たちの民族的背景に近いものとなる（非特許文献２２）。研究コホートは、各国より１１４人の男児と１５２人の女児を含んだ。サンプリングの平均年齢は、両コホートで１１．４歳（７から１５歳の範囲）であった。
【００６２】
血液サンプルは、カレリア人の無作為に選ばれた学童、総計で１９８８人から採られた。母親および父親の民族的背景が記録され、両親がフィンランド民族かカレリア民族のいずれか一方である子供は全て本研究に含まれた（Ｎ＝２６６）。このカレリア人の子供に対して、フィンランド人の子供のコホートを、年齢、性、サンプリング時期により対応させた。このサンプリング時期は１ヶ月も離れていず、このことにより細菌やアレルゲンへの曝露に関して季節の影響を最小にした。フィンランド人コホートはカレリア人コホートと同様にして集められ、フィンランドのオウル地区に住む３６５４人の学童を当初含んだ（非特許文献２３）。血液サンプルはそれぞれの子供より採られた。
【００６３】
［ＩｇＥおよびウイルス抗体］
アレルゲン特異的ＩｇＥのレベルは、Ｕｎｉ−ＣＡＰ（登録商標）フルオロ酵素免疫測定法（ファーマシア・ダイアグノスティックス、ウプサラ、スウェーデン）を使用し測定された。２つの一般的な吸入アレルゲン（樺と猫）および卵アルブミンに対する特異的ＩｇＥが製造者の指示により分析された。これらのアレルゲンへの曝露は両集団で極めて類似すると思われることから、これらのアレルゲンが選ばれた。アレルゲン特異的ＩｇＥとして、０．３５ＩＵ／Ｉ以上の値は陽性であると考えられた。過去の研究では、１００ＩＵ／Ｉを超える総ＩｇＥ値はアトピー素因のマーカーとして考えられてきた（非特許文献２４）。
【００６４】
集団反応性エンテロウイルス抗体は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）および前述のように抗原として熱処理されたコクサッキーウイルスＢ４（ＣＢＶ４）を使い分析された［２５］。この方法によると、血清型に特異的ではないが、いくつかのエンテロウイルス血清型に交差反応性がある抗体を検出する。熱処理がウイルスの隠された交差反応性を顕在化させるので、いくつかの血清型に対して交差反応性がある抗体を検出するこの方法の性能は、ウイルス抗原を熱処理することで高められる。
【００６５】
抗体（所定の血清型に特異なもの）は前述の血小板中和分析を用い測定された（非特許文献２６）。この方法は、分析で使用される血清型に特異である中和抗体を測定する。２種類のコクサッキーウイルスＢ血清型（ＣＢＶ４およびＣＢＶ５）および２種類のエコーウイルス血清型（エコーウイルス９および同１１）に対する抗体を、ＡＴＣＣ標識ウイルス株を使って調べた。
ＩｇＧクラスＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗体を、製造業者（デイドベーリング株式会社、マーバーグ、ドイツ）の指示に従い、エンザイグノスト（登録商標）抗ＨＡＶ市販ＥＩＡキットを使い測定した。ベーリング・ＥｌｉｓａプロセッサＩＩＩが、テストの処理をさらに進めるためと抗体レベルの演算のために使用された。
【００６６】
［免疫調節経路の誘導］
免疫調節経路へのエンテロウイルスの効果が、単核細胞培養物をエンテロウイルスで刺激することにより分析された。健康な検査技師から採取した末梢血単核細胞が、製造業者の指示に従い、ＢＤバキュテナー（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブ（ＢＤ、フランクリン・レイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）を用い精製された。単核細胞はＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）で２回洗浄され、丸底マイクロタイタープレートウェル（コスター９６ウェル細胞培養ダスター、コーニング社、コーニング、ＮＹ、ＵＳＡ）で、ウェルにつき１００μｌ当たり２００，０００の細胞を用いて、＋３７℃（５％ＣＯ２）で４８時間培養された。培地は、ＲＰＭＩ１６４０中に１０％ヒト血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミンと以下の刺激薬のうちの１つを含有した。培地（制御）、感染性エンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ４）（３ＰＦＵ／細胞）、１．０μｇ／ｍｌ濃度の高純度熱処理ＣＢＶ４、５μｇ／ｍｌ濃度のｄｓＲＮＡ類似体（ＴＬＲ−３アゴニスト）ポリ（Ｉ：Ｃ）（アレキス・バイオケミカルズ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）、５μｇ／ｍｌ濃度のＴＬＲ７／８アゴニスト・レジキモド（アレキス・バイオケミカルズ）、１００μｇ／ｍｌ濃度のＴＬＲ４アゴニストとして大腸菌血清型Ｊ５からのＬＰＳ（Ｒｃ）および多クローン性Ｔ細胞活性化因子として溶解性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）。
【００６７】
制御性Ｔ細胞へのウイルスの効果が、ＦｏｘＰ３および１Ｌ−１０特異的ｍＲＮＡの発現を測定することによって分析された。分析はＲＴ−ＰＣＲおよび７９００ＨＴファスト・リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いなされた。
ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ＲＮイージー・ミニ・キットで抽出された。ＲＮＡ抽出中、オンカラムＤＮａｓｅ消化法が、ＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅセット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用い行なわれた。ＲＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素および緩衝剤（プロメガ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）およびランダム６量体プライマーを用い逆転写された。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲ分析のために、ＦｏｘＰ３およびＩＬ−１０用カスタムプライマーが設計された。一方、ハウスキーピング遺伝子ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）用のプライマーは、順方向プライマーに若干修飾した前述の公表（非特許文献２７）のものであった。各プライマーはエクソン−エクソン境界を架橋する１つのプライマーを有する。
プライマー配列は以下の通りであった。ＦｏｘＰ３順方向５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＣＣ−３’、逆方向５’−ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＡＣ Ｇ−３’、ＩＬ−１０順方向５’−ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＴＧ−３’、逆方向５’−ＡＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＡＴ−３’、ＴＢＰ順方向５’−ＣＧＡ ＡＴＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＡＡ ＧＣＧ ＧＴＴ−３’、および逆方向５’−ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＣ−３’。
【００６９】
合成ｃＤＮＡはＤｙＮＡｍｏ Ｆｌａｓｈ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（フィンズィムズ、エスポー、フィンランド）で増殖された。熱サイクル条件は、９５℃で７分、９５℃で１０秒、６００℃で３０秒、７８℃で３０秒を４０サイクル（プライマー二量体除去のため）、次に、６００℃で１分間の最後の延長を行なった。６０℃から９５℃の温度範囲の解離曲線工程が実行毎に最後に付け加えられた。データ解析のために、ＦＯＸＰ３およびＩＬ−１０の閾値サイクル（Ｃｔ）の値は、内因性制御遺伝子ＴＢＰのＣｔ値に正規化された。相対発現量値は前述のようにプァッフル（Ｐｆａｆｆｌ）法を用い演算された（非特許文献２８）。
【００７０】
［統計的方法］
統計的分析は、ＳＰＳＳプログラム・バージョン１２．０（ＳＰＳＳ社、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）および信頼性区間解析（ＣＩＡ）を用い行なわれた（非特許文献２９）。
特異的ＩｇＥの有病率、高い値（＞１００ＩＵ／ｌ）の総ＩｇＥおよび細菌抗体は、マクネマー・テストを用い、２つの対のコホートで比較された。対のコホートでの総ＩｇＥレベル（傾斜分布する連続型変数）の比較は、ウィルコクソン・サインド・ランク・テスト（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔ）を用いて行なわれた。
【００７１】
ロシア・カレリアおよびフィンランドのウイルス抗体、総ＩｇＥの高値、および特異的ＩｇＥの関係の分析にはクロス集計およびカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定が利用された。総ＩｇＥレベルと特異的ＩｇＥ（陽性または陰性と分類される）との関係が分析される際、および、ＣＢＶ４ＩｇＧレベルと特異的ＩｇＥとの関係分析には、マンホイットニーＵ検定が利用された。多変量解析法として、必要に応じてロジスティック回帰が各パラメータの単独作用を特定するために適用された。
モデルは、前進ステップワイズ手順に基づき選択された。項目の入力および削除の限界値は０．１０に等しかった。結果は、オッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（Ｃｌ）の評価に支持されている。欠落または無関係な値があった場合、そのケースはその特定のパラメータに関する分析に含まれなかった。そのようなケースの数は少なく、例えば、ロシア・カレリア人の子供の細菌血清学では、分析された細菌ごとの欠落ケースは０〜２であった。全ての分析は両側検定であった。統計的有意なＰ値（＜０．０５）が与えられる。
【００７２】
［結果］
アレルゲン特異的ＩｇＥの有病率は、フィンランドの子供よりもロシア・カレリアの子供のほうが著しく低かった（表１）。
エンテロウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス抗体の有病率は、フィンランドの子供よりもロシア・カレリアの子供のほうが著しく高かった（表２）。
さらに、ロシア・カレリアでは、アレルギー感作はエンテロウイルス抗体を保有する子供のほうにおいて稀であった。一方、そのような影響はＡ型肝炎抗体に関しては見られなかった（表３）。
要するに、エンテロウイルス血清反応陽性である子供の場合は５％だったのに比べて、エンテロウイルス血清反応陰性の子供の２２％が、少なくとも１つの陽性特異的ＩｇＥ結果を保有した。少なくとも１つのアレルゲン特異的ＩｇＥ（Ｐ＝０．０４８）を保有する子供では４９ＥＩＬＪ（範囲：０〜１５４）であったのに比べて、エンテロウイルス抗体レベルの中央値は、特異的ＩｇＥを保有しない子供では７４酵素免疫測定単位（ＥＩＵ）（範囲：０〜２２４）であった。
【００７３】
フィンランドでは、ＨＡＶ血清反応陽性の子供の数はとても少なく（表２）、そのことでＨＡＶ血清反応陽性の子供とアレルゲン特異的ＩｇＥとの関連を分析するのが難しくなった。しかし、フィンランドの子供にはエンテロウイルス抗体は頻繁に見受けられるが、ロシア・カレリアの子供とは対照的に、エンテロウイルス抗体はアレルゲン特異的ＩｇＥ応答との関連性を示さなかった（エンテロウイルス血清反応陽性である子供の場合は２３％だったのに比べて、エンテロウイルス血清反応陰性の子供の１８％も、少なくとも１つの陽性特異的ＩｇＥ結果を保有した）。
感染とアトピーの有病率の関係がロシア・カレリアの子供のみに観察され、フィンランドの子供には観察されなかったという事実は、フィンランドではエンテロウイルスや他の病原菌の広がりが著しく低いので、フィンランドの子供は大きくなってから感染しているという仮説により説明可能である。
衛生仮説によると、生後最初の数ヶ月にかかる感染は、腸管関連の免疫系の成熟と発達中の調節経路およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスに著しい影響を持つので、最も重要なものである。
【００７４】
異なる血清型でエンテロウイルスの保護的効果が違うかどうかを調べるために、我々は、総計２４４人のロシア・カレリア人の子供を、アレルゲン特異的ＩｇＥおよび４つの異なるエンテロウイルス血清型（ＣＢＶ４、ＣＢＶ５、エコーウイルス９およびエコーウイルス１１）に対する中和抗体に関して分析した。
中和抗体は、何十年も上昇したままなので、これらの抗体の存在は、分析で使用される血清型に過去において感染していたことを示す。
エコーウイルス１１は、アレルギー感作に対する強い保護と関連があった（図１）。つまり、エコーウイルス１１血清反応陰性の子供は３１．８％が表１に示される３つのアレルゲンの少なくとも１つに対してアレルゲン特異的ＩｇＥを保有していたのに対し、エコーウイルス１１血清反応陽性の子供（Ｐ＜０．００１）はたったの１３．２％であった。多重ロジスティック回帰分析において、エコーウイルス１１血清反応陽性は、アレルゲン特異的ＩｇＥに対して明白な単独作用を有した（Ｐ＜０．００１；ＯＲ３．２［９５％Ｃｌ１．７〜６．２］）。アレルギー感作に対するエンテロウイルスの保護的効果はウイルスの血清型に依存するということをこの結果は示す。
【００７５】
アレルギー感作に対するエンテロウイルスの保護的効果は、免疫系にエンテロウイルスが作用することによりもたらされる。アレルギー感作の発達は異常な免疫調節に関係があると、一般には信じられている。制御性Ｔ細胞は免疫調節において主要な役割を果たす。ウイルスが観察された抗アレルギー効果を生起可能なものとして考えられる仕組みの一つは、これらの細胞がウイルスによって活性化されることである。制御性Ｔ細胞は、具体的には、転写因子ＦｏｘＰ３（自然制御性Ｔ細胞）を発現し、ＩＬ−１０（Ｔｒ１制御性細胞）のような免疫調節性サイトカインを分泌する。特に、Ｔｒ１細胞によるＩＬ−１０の分泌は、アレルギー反応の下方調節において重要である（非特許文献３０）。
末梢血単核細胞を感染エンテロウイルスまたは体外で熱処理され精製されたエンテロウイルスに曝露することにより制御性細胞を刺激することができるかどうか分析した。ウイルスにより誘導された応答が、ＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、レジキモド、大腸菌、ＬＰＳ）および多クローン性のＴ型刺激細胞（単クローン性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の混合物）を用い得られた応答と比較された。
【００７６】
単核細胞の感染性ＣＢＶ４への曝露の結果、ＦｏｘＰ３特異的ｍＲＮＡの発現において明らかな増加（３．３倍）（図２）、および、モック処理された培養物に比べてＩＬ−１０特異的ｍＲＮＡにおいて３．６倍の増加となった（図３）。同様に、熱処理されたＣＢＶ４は、ＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡにおいて１．９倍の増加、およびＩＬ−１０ｍＲＮＡにおいて３〜４倍の増加という結果になった。ポリ（Ｉ：Ｃ）はＦｏｘＰ３もＩＬ−１０ｍＲＮＡも誘導しなかった。一方、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の組み合わせは、ＦｏｘＰ３およびＩＬ−１０の両方の発現を誘導した（それぞれ８．１倍、２．６倍の増加）。レジキモドおよびＬＰＳは、ＦｏｘＰ３発現を誘導しなかった（図２）が、ＩＬ−１０発現の明白な増加となった。
これらの結果は、エンテロウイルスは制御性Ｔ細胞を活性化させることができることを示す。エンテロウイルスにより誘導された活性化は、強力な単核Ｔ細胞活性化因子（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の混合物）を用いて得られるものに匹敵し、この現象の生物学的関連性を支持する結果となった。さらに、エンテロウイルスは、３つの古典的ＴＬＲアゴニストより強いＦｏｘＰ３発現、および、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８アゴニスト（それぞれＬＰＳおよびレジキモド）と同様の強さのＩＬ−１０発現を誘導することができた。
【００７７】
このように、これらの結果から、エンテロウイルスに感染することはアレルギー感作の危険性が減少することと関連があり、免疫調節性経路を刺激し、それによりアレルギー疾患を防ぐように免疫系を調節することができることが示される。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
１６６人のフィンランド児童のみがＡ型肝炎ウイルス抗体について調べられた。
この分析で用いられるエンテロウイルス抗原は、高純度のコクサッキーウイルスＢ４であって、異なるエンテロウイルス血清型に対する抗体と幅広く反応するように熱処理された。
【００８０】
【表３】
ＮＳは有意でないことを示す。＊前進ステップワイズモデル（入力および削除のためのＰ値は０．１０）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療するための医薬組成物の製造におけるエンテロウイルスの使用であって、前記エンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれて前記アレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まないことを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記医薬組成物は、生エンテロウイルス株、遺伝子組み換えされたエンテロウイルス株、不活性化エンテロウイルス株、エンテロウイルス株由来の構造的成分、または微粒子状のウイルスのような、それらの組み合わせを含むことを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記医薬組成物は、前記ゲノムまたはエンテロウイルス株由来のゲノム断片を含むことを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、経口的に、皮内に、経皮的に、舌下に、鼻腔内に、吸入として、経直腸的に、または注射により非経口で与えられるものであることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、喘息、ＩｇＥ媒介感作、アレルギー性湿疹、食物または薬品アレルギー、または、アレルギー性鼻炎または結膜炎を予防または治療するため使用されるものであることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬組成物は生後２年以内の小児に投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の使用であって、異なるエンテロウイルス血清型を含有する医薬組成物が、同時にまたは連続的に投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、感作されたヒトのアレルギー症状を予防する、または、感作されたヒトのアレルギー症状を軽減するために用いられるものであることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれかに記載の使用であって、エンテロウイルスを含有する前記医薬組成物が、アレルゲンと組み合わせて投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項１０】
アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する方法であって、エンテロウイルスを含有する医薬組成物の有効量が前記医薬組成物を必要とするヒトに投与され、また、前記エンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれ、かつ前記アレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まないことを特徴とする方法。
【請求項１】
アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療するための医薬組成物の製造におけるエンテロウイルスの使用であって、前記エンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれて前記アレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まないことを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記医薬組成物は、生エンテロウイルス株、遺伝子組み換えされたエンテロウイルス株、不活性化エンテロウイルス株、エンテロウイルス株由来の構造的成分、または微粒子状のウイルスのような、それらの組み合わせを含むことを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記医薬組成物は、前記ゲノムまたはエンテロウイルス株由来のゲノム断片を含むことを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、経口的に、皮内に、経皮的に、舌下に、鼻腔内に、吸入として、経直腸的に、または注射により非経口で与えられるものであることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、喘息、ＩｇＥ媒介感作、アレルギー性湿疹、食物または薬品アレルギー、または、アレルギー性鼻炎または結膜炎を予防または治療するため使用されるものであることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬組成物は生後２年以内の小児に投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の使用であって、異なるエンテロウイルス血清型を含有する医薬組成物が、同時にまたは連続的に投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の使用であって、前記医薬組成物は、感作されたヒトのアレルギー症状を予防する、または、感作されたヒトのアレルギー症状を軽減するために用いられるものであることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれかに記載の使用であって、エンテロウイルスを含有する前記医薬組成物が、アレルゲンと組み合わせて投与されるものであることを特徴とする使用。
【請求項１０】
アレルギー感作を伴う疾患を予防または治療する方法であって、エンテロウイルスを含有する医薬組成物の有効量が前記医薬組成物を必要とするヒトに投与され、また、前記エンテロウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれ、かつ前記アレルギー感作を誘導するアレルゲンをコードする外因性核酸配列を含まないことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５１７９８２（Ｐ２０１０−５１７９８２Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４７７２１（Ｐ２００９−５４７７２１）
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５００３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９２９９６
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０９２１７８３９）
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＣＴＥＣＨ ＯＹ
【住所又は居所原語表記】Ｂｉｏｋａｔｕ ８， ＦＩ−３３５２０ Ｔａｍｐｅｒｅ （ＦＩ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５００３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９２９９６
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０９２１７８３９）
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＣＴＥＣＨ ＯＹ
【住所又は居所原語表記】Ｂｉｏｋａｔｕ ８， ＦＩ−３３５２０ Ｔａｍｐｅｒｅ （ＦＩ）
【Ｆターム（参考）】
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