アレルゲンの検出方法及び検出用キット
【課題】 卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、又は落花生アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、これらアレルゲンを抽出し、これらアレルゲンがＳＤＳ変性／ＳＤＳ未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供すること。
【解決手段】 ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の、オボアルブミン、乳アレルゲンのαｓ１カゼイン、又はβ−ラクトグロブリン、小麦グリアジン、そばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料のＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液を用いて各アレルゲンを正確に検出することができる。
【解決手段】 ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の、オボアルブミン、乳アレルゲンのαｓ１カゼイン、又はβ−ラクトグロブリン、小麦グリアジン、そばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料のＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液を用いて各アレルゲンを正確に検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の試料中に含まれるＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、αｓ１カゼイン、小麦グリアジン、そばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、Ａｒａ ｈ１又はβ−ラクトグロブリンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ−ラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１が知られている。
【０００３】
従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（例えば、特許文献２参照）等が知られている。
【０００４】
また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（例えば、特許文献３参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。
【０００５】
さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、非特許文献１参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、非特許文献２参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平０５−２４９１１１号公報
【特許文献２】特開平０７−１４０１４４号公報
【特許文献３】特開２００３−１５５２９７号公報
【特許文献４】特開２００２−２５３２３０号公報
【非特許文献１】Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984
【非特許文献２】Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン又は落花生アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン又は落花生アレルゲンを抽出し、上記アレルゲンがＳＤＳ変性／ＳＤＳ未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定原材料である卵白、乳、小麦、そば又は落花生の各アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料のＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液を用いて各アレルゲンを正確に検出することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を利用した免疫反応に供することを特徴とするアレルゲンの検出方法や、（２）ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液が、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清であることを特徴とする前記（１）記載のアレルゲンの検出方法や、（３）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（４）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする前記（１）又は前記（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（５）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（６）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（７）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（８）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（９）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を備えたことを特徴とするアレルゲンの検出用キットや、（１０）２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（９）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１１）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１２）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１３）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１４）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１５）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１６）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットに関する。
【００１１】
さらに本発明は（１７）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３や、（１８）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４や、（１９）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１や、（２０）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２や、（２１）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３や、（２２）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４や、（２３）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４や、（２４）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、食品等に含まれる卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、落花生アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液として用いて、正確に定性かつ定量的に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のアレルゲンの検出方法としては、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体（以下、これらを総称して「本件モノクローナル抗体」ということがある）を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記本件モノクローナル抗体を利用した免疫反応に供する方法であれば特に制限されず、上記ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液として、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清を用いることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のアレルゲンの検出用キットとしては、本件モノクローナル抗体を備えたキットであれば特に制限されず、２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１５】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４等を好適に例示することができる。また、ＰＤＯＡ３とＰＤＯＡ４を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１６】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２等を好適に例示することができる。また、Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１７】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２等を好適に例示することができる。また、ＰＧＬ１とＰＧＬ２を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１８】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３等を好適に例示することができる。また、ＰＢＷ１等の２４Ｄａタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体と、ＰＢＷ２等の７６ｋＤａタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組合せや、ＰＢＷ２とＰＢＷ３等の未変性そば粗タンパク質と加熱変性そば粗タンパク質を共に認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１９】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４等を好適に例示することができる。また、ＰβＬＧ３やＰβＬＧ４等の加熱変性β−ラクトグロブリンを認識する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体と、ＰβＬＧ１やＰβＬＧ２等の未変性β−ラクトグロブリンを認識する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体との組合せ、中でも、（ＰβＬＧ１＋ＰβＬＧ３）と（ＰβＬＧ２＋ＰβＬＧ４）などのこれらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００２０】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５等を好適に例示することができる。また、ＰＡｈ１−４とＰＡｈ１−５を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００２１】
以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性／変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを含む試料を、標識化した前記本件モノクローナル抗体と接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に前記本件モノクローナル抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。
【００２２】
不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体と異なるエピトープを認識する標識本件モノクローナル抗体（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中の食物アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識本件モノクローナル抗体を作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識本件モノクローナル抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された本件モノクローナル抗体と食物アレルゲンであるタンパク質が結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、食物アレルゲンと結合する本件モノクローナル抗体をあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を捕捉させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、本件モノクローナル抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。
【００２３】
上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００２４】
本発明のアレルゲンの検出方法やアレルゲン検出用キットに用いられる本件モノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、本件モノクローナル抗体として、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、本件モノクローナル抗体は、未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性のアレルゲンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。
【００２５】
本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性の食物アレルゲンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えばＳＤＳ未変性及び／若しくはＳＤＳ変性の食物アレルゲン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性の食物アレルゲンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００２６】
細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本件モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。また、未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性食物アレルゲンモノクローナル抗体を得ることができる場合もある。この場合、抗変性アレルゲンモノクローナル抗体等の本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性の食物アレルゲンに対してのみ特異的に反応する本件モノクローナル抗体を得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００２７】
また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。
【００２８】
本発明のアレルゲン検出用キットには、有効成分としての本件モノクローナル抗体、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の本件モノクローナル抗体を含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる本件モノクローナル抗体溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含む緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明のアレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５を挙げることができる。これらハイブリドーマはそれぞれ、Mouse-Mouse Hybridoma ＰＤＯＡ３、Mouse-Mouse Hybridoma ＰＤＯＡ４の表示で平成１７（２００５）年９月６日（受託日）付で、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ１、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ２、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ３、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ４の表示で平成１８年（２００６）年２月２日（受託日）付で、ＰＡｈ１−４、ＰＡｈ１−５の表示で平成１８（２００６）年７月２０日（受託日）付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に受託されている。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
１．材料及び方法
１）ニワトリオボアルブミン（以下「ＯＡ」という）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙Ｎｏ．１（アドバンテック東洋社製）で濾過した。そして、得られたろ液に０．５Ｍの硫酸を添加しｐＨ４．６に調整後、一晩放置した。８，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗ＯＡ画分を得た。粗ＯＡはさらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＡを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥ＯＡを用い、生理食塩水で０．１％のＯＡ溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。以後、未変性のＯＡをＮＯＡとする。
【００３２】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化ＯＡ（以下「ＲＣＭＯＡ」という）を用いた。
【００３３】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＯＡを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＡ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【００３４】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＲＣＭＯＡ溶液１００ｍｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００３５】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＲＣＭＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＲＣＭＯＡに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００３６】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＯＡ（ＮＯＡ）あるいは還元カルボキシメチル化ＯＡ（ＲＣＭＯＡ）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＯＡは、精製ＯＡ（上記凍結乾燥物）を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＯＡとした。培養上清のＮＯＡあるいはＲＣＭＯＡに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【００３７】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００３８】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡ）に抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗アレルゲンポリクロナール抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクロナール抗体にＮＯＡ（液相ＮＯＡ）又はＲＣＭＯＡ（液相ＲＣＭＯＡ）を結合させた状態で、抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse
immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００３９】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００４０】
２．結果
１）抗ＯＡＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＲＣＭＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ８種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１に示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
２）組合せ条件
変性ＯＡを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。用いた抗原には、尿素及び２−メルカプトエタノールで処理したＯＡ（ＵＤＯＡ）、並びにＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで処理したＯＡ（ＳＤＳＯＡ）を使用した。その結果を表２に示した。この組合わせの中から、ＵＤＯＡおよびＳＤＳＯＡをはさむことのできるＭＡｂの組合わせを選択した。
【００４３】
【表２】
【実施例２】
【００４４】
食品中のＯＡを検出するために、食肉に全卵粉を加え、実施例１で選択したＭＡｂの組合せについて、下記のサンプルの評価を実施した。
１）肉に２００ｐｐｍの乾燥全卵粉加え混合したものを１ｇ量り取り、そこに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱後、ＰＢＳＴで１０倍に希釈した。乾燥全卵粉を加えないものを対照とした。
２）肉に２００ｐｐｍの乾燥全卵粉加え混合したものを０．５ｇ量り取り、１０Ｍ尿素７．６ｍｌ、０．２ｍｌ、２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、１００ｍｌ容メスフラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌにメスアップした。乾燥全卵粉を加えないものを対照とした。
表３に、サンドイッチＥＬＩＳＡの吸光値の結果を示した。その結果、ＳＤＳＯＡを検出することのできる６５Ｆ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）と９６２Ｈ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）の組合せが最も適していると考えられた。一方、ＵＤＯＡでは対照の吸光値が高く、食肉製品を尿素で変性することは不適当と考えられた。
【００４５】
【表３】
【実施例３】
【００４６】
［イムノクロマトによる変性ＯＡの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように９６２Ｈ２のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００４７】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるように６５Ｆ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００４８】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・卵たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（卵）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 44, 2003, 213-219）に従い、市販鶏卵より卵たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表４「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の卵たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００４９】
【表４】
【００５０】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００５１】
２．結果
ＰＤＯＡ３及び金コロイド標識のＰＤＯＡ４組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳによる抽出が食肉製品では推奨されるが、ＰＤＯＡ３及びＰＤＯＡ４はＵＤＯＡも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＯＡを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例４】
【００５２】
１．材料及び方法
１）αｓ１カゼイン（以下「αＣＮ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（１９５９）に従い、αＣＮの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．４）、４Ｍの尿素を含むＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．３Ｍ）により精製を行った。精製したαＣＮ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００５３】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００５４】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でαＣＮを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗αＣＮ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００５５】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％αＣＮ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００５６】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗αＣＮ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりαＣＮに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００５７】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性αＣＮ（以下「Ｎ−αＣＮ」という）、尿素処理αＣＮ（以下「Ｄ−αＣＮ」という）、市販のカゼインナトリウムの未変性物（以下「Ｎ−ＣＮ」という）又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物（以下「Ｄ−ＣＮ」という）の４種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−αＣＮは、精製αＣＮを１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のＮ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮあるいはＤ−ＣＮに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００５８】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein Ｇカラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００５９】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００６０】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００６１】
２ 結果
１）ＭＡｂの選択
乳の主要アレルゲンであるαｓ１カゼイン（αＣＮ）を特異的に認識する６種類のＭＡｂが得られた。これら６種類のＭＡｂにおける、それぞれ固相とした各抗原Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、又はＤ−ＣＮに対する特異性をダイレクトＥＬＩＳＡにより調べた。また、これらＭＡｂのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表５に示す。表５中、＋は各固相抗原に対し陽性であることを、−は陰性であることを示す。表５に示されるように、全ての状態の抗原に結合するＭＡｂであるＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を選択した。
【００６２】
【表５】
【００６３】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を用いて、全てのＭＡｂの組合せについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。Ｐａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３をそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、αＣＮあるいはＣＮを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより選出した。さらに、精製αＣＮを１ｍｇ量り、ＳＤＳを０．５％及び２-メルカプトエタノールを０．５％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳ−αＣＮの検出の可能性も検討した。その結果、Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、Ｄ−ＣＮ、ＳＤＳ−αＣＮを検出できる組合せとしてＰａｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）とＰａｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）を選択した。
【実施例５】
【００６４】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳ−ＣＮの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００６５】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００６６】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・乳たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（牛乳）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 120-127）に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より乳たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表６「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の乳たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００６７】
【表６】
【００６８】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００６９】
２．結果
Ｐａｓ１ＣＮ１及び金コロイド標識のＰａｓ１ＣＮ２組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、８０℃で５分の抽出で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、Ｐａｓ１ＣＮ１及びＰａｓ１ＣＮ２はＤ−ＣＮも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してαＣＮを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例６】
【００７０】
１．材料及び方法
小麦粉に２倍量のｎ−ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂小麦粉に０．１％塩化ナトリウム溶液を２倍量加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた沈殿に２０倍量の０．０１Ｎ酢酸を加え、撹拌後、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物に７０％となるようにエタノールを加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、粗ＧＬ画分を得た。粗ＧＬ画分はさらに、Sephacryl S-200HR（Amersham Biosciences）を用いたゲルろ過により精製した。移動相には０．１Ｎ酢酸を用いてＧＬを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００７１】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００７２】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＧＬを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＧＬ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００７３】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＧＬ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００７４】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＧＬ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＧＬに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００７５】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＧＬ（以下「ＮＧＬ」という）あるいは還元カルボキシメチル化ＧＬ（以下「ＲＣＭＧＬ」という）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（以下「ＡＧＬ」という）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（以下「ＥＧＬ」という）、変性剤で可溶化したＧＬ（以下「ＤＧＬ」という）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＧＬは、精製ＧＬを１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇ尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＧＬとした。培養上清のＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ及びＤＧＬに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【００７６】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００７７】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００７８】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００７９】
２ 結果
１）ＭＡｂの選択
小麦の主要アレルゲンであるグリアジン（ＧＬ）は、水に不溶性で、酢酸やエタノールに溶けるタンパク質である。そこで、ＰＢＳに溶かしたＧＬ（ＮＧＬ）、還元カルボキシメチル化ＧＬ（ＲＣＭＧＬ）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（ＡＧＬ）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（ＥＧＬ）、変性剤で可溶化したＧＬ（ＤＧＬ）を調製し、どの状態のＧＬに特異的に結合するＭＡｂであるかを検証した。抗ＧＬＭＡｂの各状態のＧＬに対するダイレクトＥＬＩＳＡの結果を表７に示す。表１に示されるように、全ての状態のＧＬに結合するＭＡｂであるＰＧＬ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）、ＰＧＬ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を選択した。
【００８０】
【表７】
【００８１】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰＧＬ１、ＰＧＬ２、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。グリアジンはＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ、ＤＧＬを用いた。さらに、グリアジンを１ｍｇ量り、ＳＤＳを１％及び２−メルカプトエタノールを１％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳＧＬの検出の可能性も検討した。その結果、いずれの状態のＧＬでも最も高く検出できたのは、ＰＧＬ１とＰＧＬ２の組合わせであった。その他の組合せについてはサンドイッチＥＬＩＳＡにて全てのＧＬを検出できない、または検出感度が極めて低かった。以上の結果から、食品に様々な状態で含まれるＧＬを検出するＭＡｂとしてＰＧＬ１とＰＧＬ２を選択した。
【実施例７】
【００８２】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳＧＬの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００８３】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００８４】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・小麦たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（小麦）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 128-134）に従い、市販小麦粉末より小麦たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表８「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の小麦たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００８５】
【表８】
【００８６】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００８７】
２．結果
ＰＧＬ１及び金コロイド標識のＰＧＬ２組合わせにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＰＧＬ１及びＰＧＬ２はＤＧＬも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＧＬを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例８】
【００８８】
１．抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの確立
１ 材料及び方法
１）そば２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質の調製
市販そば粉に５倍量の精製水を加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿に１Ｍ塩化ナトリウムを５倍量加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を得た。上清を透析により脱塩し、凍結乾燥を行って得られた画分をそば粗タンパク質画分とした。このそば粗タンパク質画分をさらにプレップセル９６０（BioRad）を用いて精製を行った。２４ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳと５％２−メルカプトエタノールが含まれるサンプルバッファーに溶解後、９５℃で４分間加熱したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、２４ｋＤａタンパク質を得た。７６ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳが含まれ、２−メルカプトエタノールが含まれないサンプルバッファーに溶解したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、７６ｋＤａタンパク質を得た。得られた各画分は透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれを作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【００８９】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００９０】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫で２４ｋＤａタンパク質溶液又は７６ｋＤａタンパク質溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗２４ｋＤａタンパク質抗体価及び抗７６ｋＤａタンパク質抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００９１】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液又は０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれ１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００９２】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗２４ｋＤａタンパク質抗体又は７６ｋＤａタンパク質抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡにより２４ｋＤａタンパク質又は７６ｋＤａタンパク質に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００９３】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＰＢＳで希釈したそば粗タンパク質（以下「ＮＢＷ」ということがある）、あるいは変性剤により可溶化したそば粗タンパク質（以下「ＤＢＷ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。そば粗タンパク質は、そば粉に２０倍量のＰＢＳＴを加え４℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものをそば粉抽出物として調製した。変性剤による可溶化は、そば粗タンパク質を１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行い、これをＤＢＷとした。培養上清の２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＮＢＷ、及びＤＢＷに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００９４】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００９５】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００９６】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００９７】
２ 結果
１）抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂと７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
２４ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ５種類、及び、７６ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ４種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表９及び表１０に示した。
【００９８】
【表９】
【００９９】
【表１０】
【０１００】
２）組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、ＮＢＷ及びＤＢＷを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。さらに、ＢＷを１ｍｇ量り、ＳＤＳを０．５％及び２-メルカプトエタノールを０．５％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳＢＷの検出の可能性も検討した。その結果、ＮＢＷを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）とビオチン化抗体ＰＢＷ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）を、また、ＤＢＷ及びＳＤＳＢＷを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）とビオチン化抗体ＰＢＷ２を選択した。
【実施例９】
【０１０１】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳＤＢＷの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ３のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１０２】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで各８ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ１及びＰＢＷ２のＭＡｂ溶液を棟梁混合し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１０３】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・そばたんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（そば）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 313-318）に従い、市販小麦粉末よりそばたんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１１「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の小麦たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
・サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１gを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１０６】
２．結果
ＰＢＷ１、ＰＢＷ２及び金コロイド標識のＰＢＷ３の組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件でまで検出することができた。このことから、ＰＢＷ１、ＰＢＷ２及びＰＢＷ３を組み合わせることではＤＢＷも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＢＷを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例１０】
【０１０７】
１．材料及び方法
１）β−ラクトグロブリン（以下「βＬＧ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（1959）に従い、ホエーの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．４Ｍ）により精製を行った。精製したβＬＧ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性βＬＧ（以下「Ｎ−βＬＧ」ということがある）とした。このＮ−βＬＧを１０ｍｇ量り、１．４Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、尿素１．２ｇ、２−メルカプトエタノール３３μｌを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行い、さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、還元カルボキシメチル化βＬＧ（以下「Ｒ−βＬＧ」ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【０１０８】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、最終免疫にはそれぞれＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧを用いた。
【０１０９】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【０１１０】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったことを確認後、Ｎ−βＬＧ免疫マウスには０．１％Ｎ−βＬＧ溶液１００μｌを、またＲ−βＬＧ免疫マウスには０．１％Ｒ−βＬＧ溶液１００μｌ尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１１１】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１１２】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。培養上清のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１１３】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１１４】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１１５】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１１６】
２．結果
１）抗Ｎ−βＬＧおよびＲ−βＬＧの特性とクラス、サブクラス
Ｎ−βＬＧおよびＲ−βＬＧに対する特異性を持つＭＡｂ３７種類を得た。それぞれ固相とした抗原に対する特異性を表１２に示した。
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
２）組合せ条件
ＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。抗原には、Ｎ−βＬＧ（ＮＬＧ）、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールで処理したＳＤＳ−βＬＧ（ＳＤＳＬＧ）を使用した。その結果を表１３に示した。この組み合わせの中から、ＮＬＧ、ＳＤＳＬＧをはさむことのできる組合せを選択した。
【０１１９】
【表１３】
【実施例１１】
【０１２０】
［イムノクロマトによるＭＡｂのスクリーニング］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
実施例１０で選択されたＭＡｂについて、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１２１】
２）抗体固定化メンブレンの作製
実施例１０で選択されたＭＡｂについて、ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１２２】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。
【０１２３】
４）検出用サンプルの調製
食品中のホエータンパク質を検出するために、食肉にホエーたんぱく質を加え、下記のサンプルの評価を実施した。
［１］豚赤肉に２００ｐｐｍのホエータンパク質を加え混合したものを１ｇ量り取り、そこにＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、ＰＢＳＴで１０倍に希釈した。ホエータンパク質を加えないものを対照とした。
［２］豚赤肉に２００ｐｐｍのホエータンパク質を加え混合したものを１ｇ量り取り、そこに０．５％ＳＤＳおよび１％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱後した。冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。ホエータンパク質を加えないものを対照とした。
【０１２４】
２．結果
表１３に示された結果から、ＮＬＧを検出できる組合せとして、７８１Ａ９（ＰβＬＧ１：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）と７５８Ｃ５（ＰβＬＧ２：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）を、また、ＳＤＳＬＧを検出できる組合せとして、７６１Ｇ９（ＰβＬＧ３：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）と３（ＰβＬＧ４：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）を選択した。
【実施例１２】
【０１２５】
［イムノクロマトによるＮＬＧおよびＳＤＳＬＧの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
［１］ＮＬＧ検出用（ＰＬＧ２）
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ２のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
［２］ＳＤＳＬＧ（ＰＬＧ４）
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ４のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
［３］組み合わせ（ＰＬＧ２＋ＰＬＧ４）
［１］および［２］で調整したＰＬＧ２とＰＬＧ４の金コロイド溶液を等量で混合し、ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１２６】
２）抗体固定化メンブレンの作製
［１］ＮＬＧ検出用（ＰＬＧ１）
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ１のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
［２］ＳＤＳＬＧ検出用（ＰＬＧ３）
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ３のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
［３］組み合わせ（ＰＬＧ１＋ＰＬＧ３）
ＰＢＳで８ｍｇ／ｍｌとなるように調製したＰＬＧ１およびＰＬＧ３のＭＡｂ溶液を等量で混合し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１２７】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
［１］乳たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（牛乳）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 120-127）に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より乳たんぱく質を調製した。
［２］モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１４に示す配合にて各濃度の乳たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【０１２８】
【表１４】
【０１２９】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
［１］加熱温度
未加熱のサンプルと、加熱サンプルを用意し、加熱サンプルについては加熱温度を７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
［２］サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。未加熱サンプルを１ｇ量り取り、それにＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。一方、加熱サンプルを１ｇ量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び１％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１３０】
２．結果
［１］Ｎ−βＬＧ検出用（ＰＬＧ１、ＰＬＧ２の組み合わせ）
ＰＬＧ１及び金コロイド標識ＰＬＧ２の組み合わせにより、２ｐｐｍまで検出することができた。
［２］ＳＤＳＬＧ検出用（ＰＬＧ３、ＰＬＧ４の組み合わせ）
ＰＬＧ３及び金コロイド標識ＰＬＧ４の組み合わせにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。
［３］組み合わせ
ＰＬＧ１とＰＬＧ３の混合メンブレンと、ＰＬＧ２とＰＬＧ４の混合金コロイド溶液の組み合わせにより、未加熱のサンプルを２ｐｐｍまで、一方、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。
【実施例１３】
【０１３１】
１．材料及び方法
１）Ａｒａ ｈ１の調製
市販生落花生に５倍量の２０ｍＭbis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後３０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度１００００×ｇで遠心分離を行い、上清を得た。上清をさらにSource Q（GEヘルスケア バイオサイエンス）を用いて、２０ｍＭ bis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０から１Ｍ）により精製を行った。精製したＡｒａ ｈ１画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ａｒａ ｈ１（以下ＮＡｈ１という）とした。また、上清をプレップセル９６０（BioRad）を用いて精製を行い、得られたＡｒａ ｈ１画分を蒸留水により透析した後、凍結乾燥したものを未変性ｐｒｅｐ Ａｒａ ｈ１（以下「ＮＰＡｈ１」という）とした。尿素処理Ａｒａ ｈ１（以下ＤＡｈ１という）はＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、６ｇ 尿素、０．２ ｍｌ ２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥという）、１ｍｌ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．６）、１．５ ｍｌ 蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で1時間オイルバスで加熱し、処理を行った。その後、蒸留水による透析を行い、凍結乾燥したものとした。還元カルボキシメチル化処理Ａｒａ ｈ１（以下「ＲＣＭＡｈ１」という）は、ＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−ＭＥを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行った。その後、蒸留水による透析を行い、凍結乾燥したものをＲＣＭＡｈ１とした。
【０１３２】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫は、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１３３】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＮＡｈ１、ＤＡｈ１の抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【０１３４】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１３５】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１３６】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、落花生の粗タンパク質の未変性（以下ＮＰ−eという）、尿素処理（以下ＤＰ−eという）あるいは還元カルボキシメチル処理（以下ＲＣＭＰ−eという）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、Ｐ−eは落花生に５倍量の２０ｍＭ bis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で2時間攪拌後遠心分離を二回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。培養上清のＮＰ−e、ＤＰ−eあるいはＲＣＭＰ−eに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１３７】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）により精製した。
【０１３８】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＡｈ１又はＲＣＭＡｈ１をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＡｈ１又はＲＣＭＡｈ１）に抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗アレルゲンポリクロナール抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクロナール抗体にＮＡｈ１（液相ＮＡｈ１）又はＲＣＭＡｈ１（液相ＲＣＭＡｈ１）を結合させた状態で、抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１３９】
２．結果
１）抗Ａｒａ ｈ１ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
落花生に対する特異性を持つＭＡｂ２２種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１５, １６, １７, １８に示した。
【０１４０】
【表１５】
【０１４１】
【表１６】
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
【表１８】
【実施例１４】
【０１４４】
［イムノクロマトによる変性落花生タンパク質の検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれのＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１４５】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれのＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１４６】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下の方法で調製した落花生タンパク質を供試した。
【０１４７】
１．落花生タンパク質の調製
穐山ら（特定原材料（落花生）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 325-331）に従い、市販落花生より落花生タンパク質を調製した。
【０１４８】
２．落花生タンパク質の検出
定性試験のため上記の方法で調整した落花生タンパク質を１ｇ量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−ＭＥを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１４９】
３．モデル食肉製品の作製
定性試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１９に示す配合にて各濃度の落花生たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【０１５０】
【表１９】
【０１５１】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【０１５２】
１．加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
【０１５３】
２．サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−ＭＥを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１５４】
２．結果
表５にイムノクロマトによる定性試験の結果を示した。その結果、ＳＤＳ処理した落花生タンパク質を検出には、金コロイド標識のＰＡｈ１−４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）とメンブレン塗布のＰＡｈ１−５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）の組合せが最も適していると考えられた。また、この組み合わせで、食肉製品からの添加回収試験では、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。また、この組み合わせで、未変性の落花生タンパク質も同様に検出可能なことがわかった。このことから、ＰＡｈ１−４とＰＡｈ１−５を組み合わせることで、未変性及び変性の落花生タンパク質を検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、タンパク変性剤を選択して落花生を抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【０１５５】
【表２０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の試料中に含まれるＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、αｓ１カゼイン、小麦グリアジン、そばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、Ａｒａ ｈ１又はβ−ラクトグロブリンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ−ラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１が知られている。
【０００３】
従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（例えば、特許文献２参照）等が知られている。
【０００４】
また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（例えば、特許文献３参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。
【０００５】
さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、非特許文献１参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、非特許文献２参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平０５−２４９１１１号公報
【特許文献２】特開平０７−１４０１４４号公報
【特許文献３】特開２００３−１５５２９７号公報
【特許文献４】特開２００２−２５３２３０号公報
【非特許文献１】Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984
【非特許文献２】Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン又は落花生アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン又は落花生アレルゲンを抽出し、上記アレルゲンがＳＤＳ変性／ＳＤＳ未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定原材料である卵白、乳、小麦、そば又は落花生の各アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料のＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液を用いて各アレルゲンを正確に検出することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を利用した免疫反応に供することを特徴とするアレルゲンの検出方法や、（２）ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液が、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清であることを特徴とする前記（１）記載のアレルゲンの検出方法や、（３）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（４）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする前記（１）又は前記（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（５）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（６）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（７）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法や、（８）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルゲンの検出方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（９）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を備えたことを特徴とするアレルゲンの検出用キットや、（１０）２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（９）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１１）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１２）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１３）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１４）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１５）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットや、（１６）ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載のアレルゲンの検出用キットに関する。
【００１１】
さらに本発明は（１７）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３や、（１８）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４や、（１９）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１や、（２０）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２や、（２１）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３や、（２２）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４や、（２３）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４や、（２４）ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、食品等に含まれる卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、落花生アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの抽出液として用いて、正確に定性かつ定量的に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のアレルゲンの検出方法としては、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体（以下、これらを総称して「本件モノクローナル抗体」ということがある）を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記本件モノクローナル抗体を利用した免疫反応に供する方法であれば特に制限されず、上記ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液として、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清を用いることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のアレルゲンの検出用キットとしては、本件モノクローナル抗体を備えたキットであれば特に制限されず、２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１５】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４等を好適に例示することができる。また、ＰＤＯＡ３とＰＤＯＡ４を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１６】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２等を好適に例示することができる。また、Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１７】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２等を好適に例示することができる。また、ＰＧＬ１とＰＧＬ２を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１８】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３等を好適に例示することができる。また、ＰＢＷ１等の２４Ｄａタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体と、ＰＢＷ２等の７６ｋＤａタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組合せや、ＰＢＷ２とＰＢＷ３等の未変性そば粗タンパク質と加熱変性そば粗タンパク質を共に認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００１９】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４等を好適に例示することができる。また、ＰβＬＧ３やＰβＬＧ４等の加熱変性β−ラクトグロブリンを認識する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体と、ＰβＬＧ１やＰβＬＧ２等の未変性β−ラクトグロブリンを認識する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体との組合せ、中でも、（ＰβＬＧ１＋ＰβＬＧ３）と（ＰβＬＧ２＋ＰβＬＧ４）などのこれらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００２０】
上記ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５等を好適に例示することができる。また、ＰＡｈ１−４とＰＡｈ１−５を組み合わせることで、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出液で、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。
【００２１】
以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性／変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを含む試料を、標識化した前記本件モノクローナル抗体と接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に前記本件モノクローナル抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。
【００２２】
不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体と異なるエピトープを認識する標識本件モノクローナル抗体（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中の食物アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識本件モノクローナル抗体を作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識本件モノクローナル抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された本件モノクローナル抗体と食物アレルゲンであるタンパク質が結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、食物アレルゲンと結合する本件モノクローナル抗体をあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を捕捉させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、本件モノクローナル抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。
【００２３】
上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００２４】
本発明のアレルゲンの検出方法やアレルゲン検出用キットに用いられる本件モノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、本件モノクローナル抗体として、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、本件モノクローナル抗体は、未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性のアレルゲンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。
【００２５】
本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性の食物アレルゲンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えばＳＤＳ未変性及び／若しくはＳＤＳ変性の食物アレルゲン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性又は還元カルボキシメチル化あるいは尿素変性の食物アレルゲンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００２６】
細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本件モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。また、未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性食物アレルゲンモノクローナル抗体を得ることができる場合もある。この場合、抗変性アレルゲンモノクローナル抗体等の本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性の食物アレルゲンに対してのみ特異的に反応する本件モノクローナル抗体を得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００２７】
また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。
【００２８】
本発明のアレルゲン検出用キットには、有効成分としての本件モノクローナル抗体、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の本件モノクローナル抗体を含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる本件モノクローナル抗体溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含む緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明のアレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５を挙げることができる。これらハイブリドーマはそれぞれ、Mouse-Mouse Hybridoma ＰＤＯＡ３、Mouse-Mouse Hybridoma ＰＤＯＡ４の表示で平成１７（２００５）年９月６日（受託日）付で、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ１、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ２、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ３、Mouse-Mouse Hybridoma ＰβＬＧ４の表示で平成１８年（２００６）年２月２日（受託日）付で、ＰＡｈ１−４、ＰＡｈ１−５の表示で平成１８（２００６）年７月２０日（受託日）付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に受託されている。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
１．材料及び方法
１）ニワトリオボアルブミン（以下「ＯＡ」という）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙Ｎｏ．１（アドバンテック東洋社製）で濾過した。そして、得られたろ液に０．５Ｍの硫酸を添加しｐＨ４．６に調整後、一晩放置した。８，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗ＯＡ画分を得た。粗ＯＡはさらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＡを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥ＯＡを用い、生理食塩水で０．１％のＯＡ溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。以後、未変性のＯＡをＮＯＡとする。
【００３２】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化ＯＡ（以下「ＲＣＭＯＡ」という）を用いた。
【００３３】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＯＡを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＡ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【００３４】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＲＣＭＯＡ溶液１００ｍｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００３５】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＲＣＭＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＲＣＭＯＡに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００３６】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＯＡ（ＮＯＡ）あるいは還元カルボキシメチル化ＯＡ（ＲＣＭＯＡ）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＯＡは、精製ＯＡ（上記凍結乾燥物）を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＯＡとした。培養上清のＮＯＡあるいはＲＣＭＯＡに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【００３７】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００３８】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡ）に抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗アレルゲンポリクロナール抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクロナール抗体にＮＯＡ（液相ＮＯＡ）又はＲＣＭＯＡ（液相ＲＣＭＯＡ）を結合させた状態で、抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse
immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００３９】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００４０】
２．結果
１）抗ＯＡＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＲＣＭＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ８種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１に示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
２）組合せ条件
変性ＯＡを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。用いた抗原には、尿素及び２−メルカプトエタノールで処理したＯＡ（ＵＤＯＡ）、並びにＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで処理したＯＡ（ＳＤＳＯＡ）を使用した。その結果を表２に示した。この組合わせの中から、ＵＤＯＡおよびＳＤＳＯＡをはさむことのできるＭＡｂの組合わせを選択した。
【００４３】
【表２】
【実施例２】
【００４４】
食品中のＯＡを検出するために、食肉に全卵粉を加え、実施例１で選択したＭＡｂの組合せについて、下記のサンプルの評価を実施した。
１）肉に２００ｐｐｍの乾燥全卵粉加え混合したものを１ｇ量り取り、そこに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱後、ＰＢＳＴで１０倍に希釈した。乾燥全卵粉を加えないものを対照とした。
２）肉に２００ｐｐｍの乾燥全卵粉加え混合したものを０．５ｇ量り取り、１０Ｍ尿素７．６ｍｌ、０．２ｍｌ、２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、１００ｍｌ容メスフラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌにメスアップした。乾燥全卵粉を加えないものを対照とした。
表３に、サンドイッチＥＬＩＳＡの吸光値の結果を示した。その結果、ＳＤＳＯＡを検出することのできる６５Ｆ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）と９６２Ｈ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）の組合せが最も適していると考えられた。一方、ＵＤＯＡでは対照の吸光値が高く、食肉製品を尿素で変性することは不適当と考えられた。
【００４５】
【表３】
【実施例３】
【００４６】
［イムノクロマトによる変性ＯＡの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように９６２Ｈ２のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００４７】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるように６５Ｆ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００４８】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・卵たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（卵）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 44, 2003, 213-219）に従い、市販鶏卵より卵たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表４「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の卵たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００４９】
【表４】
【００５０】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００５１】
２．結果
ＰＤＯＡ３及び金コロイド標識のＰＤＯＡ４組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳによる抽出が食肉製品では推奨されるが、ＰＤＯＡ３及びＰＤＯＡ４はＵＤＯＡも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＯＡを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例４】
【００５２】
１．材料及び方法
１）αｓ１カゼイン（以下「αＣＮ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（１９５９）に従い、αＣＮの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．４）、４Ｍの尿素を含むＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．３Ｍ）により精製を行った。精製したαＣＮ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００５３】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００５４】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でαＣＮを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗αＣＮ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００５５】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％αＣＮ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００５６】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗αＣＮ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりαＣＮに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００５７】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性αＣＮ（以下「Ｎ−αＣＮ」という）、尿素処理αＣＮ（以下「Ｄ−αＣＮ」という）、市販のカゼインナトリウムの未変性物（以下「Ｎ−ＣＮ」という）又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物（以下「Ｄ−ＣＮ」という）の４種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−αＣＮは、精製αＣＮを１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のＮ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮあるいはＤ−ＣＮに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００５８】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein Ｇカラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００５９】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００６０】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００６１】
２ 結果
１）ＭＡｂの選択
乳の主要アレルゲンであるαｓ１カゼイン（αＣＮ）を特異的に認識する６種類のＭＡｂが得られた。これら６種類のＭＡｂにおける、それぞれ固相とした各抗原Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、又はＤ−ＣＮに対する特異性をダイレクトＥＬＩＳＡにより調べた。また、これらＭＡｂのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表５に示す。表５中、＋は各固相抗原に対し陽性であることを、−は陰性であることを示す。表５に示されるように、全ての状態の抗原に結合するＭＡｂであるＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を選択した。
【００６２】
【表５】
【００６３】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を用いて、全てのＭＡｂの組合せについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。Ｐａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３をそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、αＣＮあるいはＣＮを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより選出した。さらに、精製αＣＮを１ｍｇ量り、ＳＤＳを０．５％及び２-メルカプトエタノールを０．５％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳ−αＣＮの検出の可能性も検討した。その結果、Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、Ｄ−ＣＮ、ＳＤＳ−αＣＮを検出できる組合せとしてＰａｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）とＰａｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）を選択した。
【実施例５】
【００６４】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳ−ＣＮの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００６５】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００６６】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・乳たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（牛乳）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 120-127）に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より乳たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表６「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の乳たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００６７】
【表６】
【００６８】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００６９】
２．結果
Ｐａｓ１ＣＮ１及び金コロイド標識のＰａｓ１ＣＮ２組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、８０℃で５分の抽出で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、Ｐａｓ１ＣＮ１及びＰａｓ１ＣＮ２はＤ−ＣＮも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してαＣＮを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例６】
【００７０】
１．材料及び方法
小麦粉に２倍量のｎ−ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂小麦粉に０．１％塩化ナトリウム溶液を２倍量加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた沈殿に２０倍量の０．０１Ｎ酢酸を加え、撹拌後、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物に７０％となるようにエタノールを加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、粗ＧＬ画分を得た。粗ＧＬ画分はさらに、Sephacryl S-200HR（Amersham Biosciences）を用いたゲルろ過により精製した。移動相には０．１Ｎ酢酸を用いてＧＬを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００７１】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００７２】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＧＬを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＧＬ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００７３】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＧＬ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００７４】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＧＬ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＧＬに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００７５】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＧＬ（以下「ＮＧＬ」という）あるいは還元カルボキシメチル化ＧＬ（以下「ＲＣＭＧＬ」という）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（以下「ＡＧＬ」という）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（以下「ＥＧＬ」という）、変性剤で可溶化したＧＬ（以下「ＤＧＬ」という）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＧＬは、精製ＧＬを１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇ尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＧＬとした。培養上清のＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ及びＤＧＬに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【００７６】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００７７】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００７８】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００７９】
２ 結果
１）ＭＡｂの選択
小麦の主要アレルゲンであるグリアジン（ＧＬ）は、水に不溶性で、酢酸やエタノールに溶けるタンパク質である。そこで、ＰＢＳに溶かしたＧＬ（ＮＧＬ）、還元カルボキシメチル化ＧＬ（ＲＣＭＧＬ）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（ＡＧＬ）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（ＥＧＬ）、変性剤で可溶化したＧＬ（ＤＧＬ）を調製し、どの状態のＧＬに特異的に結合するＭＡｂであるかを検証した。抗ＧＬＭＡｂの各状態のＧＬに対するダイレクトＥＬＩＳＡの結果を表７に示す。表１に示されるように、全ての状態のＧＬに結合するＭＡｂであるＰＧＬ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）、ＰＧＬ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を選択した。
【００８０】
【表７】
【００８１】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰＧＬ１、ＰＧＬ２、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。グリアジンはＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ、ＤＧＬを用いた。さらに、グリアジンを１ｍｇ量り、ＳＤＳを１％及び２−メルカプトエタノールを１％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳＧＬの検出の可能性も検討した。その結果、いずれの状態のＧＬでも最も高く検出できたのは、ＰＧＬ１とＰＧＬ２の組合わせであった。その他の組合せについてはサンドイッチＥＬＩＳＡにて全てのＧＬを検出できない、または検出感度が極めて低かった。以上の結果から、食品に様々な状態で含まれるＧＬを検出するＭＡｂとしてＰＧＬ１とＰＧＬ２を選択した。
【実施例７】
【００８２】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳＧＬの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００８３】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００８４】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・小麦たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（小麦）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 128-134）に従い、市販小麦粉末より小麦たんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表８「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の小麦たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００８５】
【表８】
【００８６】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
２）サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【００８７】
２．結果
ＰＧＬ１及び金コロイド標識のＰＧＬ２組合わせにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件で２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＰＧＬ１及びＰＧＬ２はＤＧＬも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＧＬを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例８】
【００８８】
１．抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの確立
１ 材料及び方法
１）そば２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質の調製
市販そば粉に５倍量の精製水を加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿に１Ｍ塩化ナトリウムを５倍量加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を得た。上清を透析により脱塩し、凍結乾燥を行って得られた画分をそば粗タンパク質画分とした。このそば粗タンパク質画分をさらにプレップセル９６０（BioRad）を用いて精製を行った。２４ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳと５％２−メルカプトエタノールが含まれるサンプルバッファーに溶解後、９５℃で４分間加熱したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、２４ｋＤａタンパク質を得た。７６ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳが含まれ、２−メルカプトエタノールが含まれないサンプルバッファーに溶解したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、７６ｋＤａタンパク質を得た。得られた各画分は透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれを作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【００８９】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００９０】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫で２４ｋＤａタンパク質溶液又は７６ｋＤａタンパク質溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗２４ｋＤａタンパク質抗体価及び抗７６ｋＤａタンパク質抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００９１】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液又は０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれ１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００９２】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗２４ｋＤａタンパク質抗体又は７６ｋＤａタンパク質抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡにより２４ｋＤａタンパク質又は７６ｋＤａタンパク質に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００９３】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＰＢＳで希釈したそば粗タンパク質（以下「ＮＢＷ」ということがある）、あるいは変性剤により可溶化したそば粗タンパク質（以下「ＤＢＷ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。そば粗タンパク質は、そば粉に２０倍量のＰＢＳＴを加え４℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものをそば粉抽出物として調製した。変性剤による可溶化は、そば粗タンパク質を１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行い、これをＤＢＷとした。培養上清の２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＮＢＷ、及びＤＢＷに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００９４】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６ｃｅｌｌｓのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００９５】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００９６】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００９７】
２ 結果
１）抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂと７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
２４ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ５種類、及び、７６ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ４種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表９及び表１０に示した。
【００９８】
【表９】
【００９９】
【表１０】
【０１００】
２）組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、ＮＢＷ及びＤＢＷを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。さらに、ＢＷを１ｍｇ量り、ＳＤＳを０．５％及び２-メルカプトエタノールを０．５％含むＰＢＳで１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったＳＤＳＢＷの検出の可能性も検討した。その結果、ＮＢＷを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）とビオチン化抗体ＰＢＷ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）を、また、ＤＢＷ及びＳＤＳＢＷを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）とビオチン化抗体ＰＢＷ２を選択した。
【実施例９】
【０１０１】
［イムノクロマトによる変性ＳＤＳＤＢＷの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ３のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１０２】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで各８ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ１及びＰＢＷ２のＭＡｂ溶液を棟梁混合し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１０３】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
・そばたんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（そば）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 313-318）に従い、市販小麦粉末よりそばたんぱく質を調製した。
・モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１１「モデル食肉製品の配合表」に示す配合にて各濃度の小麦たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
１）加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
・サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１gを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、８０℃で５分、１５分、３０分あるいは沸騰水中で１時間加熱抽出し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１０６】
２．結果
ＰＢＷ１、ＰＢＷ２及び金コロイド標識のＰＢＷ３の組合せにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、全ての抽出条件でまで検出することができた。このことから、ＰＢＷ１、ＰＢＷ２及びＰＢＷ３を組み合わせることではＤＢＷも検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、たんぱく変性剤を選択してＢＷを抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【実施例１０】
【０１０７】
１．材料及び方法
１）β−ラクトグロブリン（以下「βＬＧ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（1959）に従い、ホエーの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．４Ｍ）により精製を行った。精製したβＬＧ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性βＬＧ（以下「Ｎ−βＬＧ」ということがある）とした。このＮ−βＬＧを１０ｍｇ量り、１．４Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、尿素１．２ｇ、２−メルカプトエタノール３３μｌを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行い、さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、還元カルボキシメチル化βＬＧ（以下「Ｒ−βＬＧ」ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【０１０８】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、最終免疫にはそれぞれＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧを用いた。
【０１０９】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【０１１０】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったことを確認後、Ｎ−βＬＧ免疫マウスには０．１％Ｎ−βＬＧ溶液１００μｌを、またＲ−βＬＧ免疫マウスには０．１％Ｒ−βＬＧ溶液１００μｌ尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１１１】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１１２】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、Ｎ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。培養上清のＮ−βＬＧあるいはＲ−βＬＧに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１１３】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１１４】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１１５】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１１６】
２．結果
１）抗Ｎ−βＬＧおよびＲ−βＬＧの特性とクラス、サブクラス
Ｎ−βＬＧおよびＲ−βＬＧに対する特異性を持つＭＡｂ３７種類を得た。それぞれ固相とした抗原に対する特異性を表１２に示した。
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
２）組合せ条件
ＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。抗原には、Ｎ−βＬＧ（ＮＬＧ）、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールで処理したＳＤＳ−βＬＧ（ＳＤＳＬＧ）を使用した。その結果を表１３に示した。この組み合わせの中から、ＮＬＧ、ＳＤＳＬＧをはさむことのできる組合せを選択した。
【０１１９】
【表１３】
【実施例１１】
【０１２０】
［イムノクロマトによるＭＡｂのスクリーニング］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
実施例１０で選択されたＭＡｂについて、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１２１】
２）抗体固定化メンブレンの作製
実施例１０で選択されたＭＡｂについて、ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１２２】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。
【０１２３】
４）検出用サンプルの調製
食品中のホエータンパク質を検出するために、食肉にホエーたんぱく質を加え、下記のサンプルの評価を実施した。
［１］豚赤肉に２００ｐｐｍのホエータンパク質を加え混合したものを１ｇ量り取り、そこにＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、ＰＢＳＴで１０倍に希釈した。ホエータンパク質を加えないものを対照とした。
［２］豚赤肉に２００ｐｐｍのホエータンパク質を加え混合したものを１ｇ量り取り、そこに０．５％ＳＤＳおよび１％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱後した。冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。ホエータンパク質を加えないものを対照とした。
【０１２４】
２．結果
表１３に示された結果から、ＮＬＧを検出できる組合せとして、７８１Ａ９（ＰβＬＧ１：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）と７５８Ｃ５（ＰβＬＧ２：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）を、また、ＳＤＳＬＧを検出できる組合せとして、７６１Ｇ９（ＰβＬＧ３：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）と３（ＰβＬＧ４：ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）を選択した。
【実施例１２】
【０１２５】
［イムノクロマトによるＮＬＧおよびＳＤＳＬＧの検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
［１］ＮＬＧ検出用（ＰＬＧ２）
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ２のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
［２］ＳＤＳＬＧ（ＰＬＧ４）
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ４のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
［３］組み合わせ（ＰＬＧ２＋ＰＬＧ４）
［１］および［２］で調整したＰＬＧ２とＰＬＧ４の金コロイド溶液を等量で混合し、ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１２６】
２）抗体固定化メンブレンの作製
［１］ＮＬＧ検出用（ＰＬＧ１）
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ１のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
［２］ＳＤＳＬＧ検出用（ＰＬＧ３）
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ３のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
［３］組み合わせ（ＰＬＧ１＋ＰＬＧ３）
ＰＢＳで８ｍｇ／ｍｌとなるように調製したＰＬＧ１およびＰＬＧ３のＭＡｂ溶液を等量で混合し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１２７】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
［１］乳たんぱく質の調製
穐山ら（特定原材料（牛乳）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 120-127）に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より乳たんぱく質を調製した。
［２］モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１４に示す配合にて各濃度の乳たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【０１２８】
【表１４】
【０１２９】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
［１］加熱温度
未加熱のサンプルと、加熱サンプルを用意し、加熱サンプルについては加熱温度を７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
［２］サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。未加熱サンプルを１ｇ量り取り、それにＰＢＳＴを１９ｍｌ加え撹拌し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。一方、加熱サンプルを１ｇ量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び１％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１３０】
２．結果
［１］Ｎ−βＬＧ検出用（ＰＬＧ１、ＰＬＧ２の組み合わせ）
ＰＬＧ１及び金コロイド標識ＰＬＧ２の組み合わせにより、２ｐｐｍまで検出することができた。
［２］ＳＤＳＬＧ検出用（ＰＬＧ３、ＰＬＧ４の組み合わせ）
ＰＬＧ３及び金コロイド標識ＰＬＧ４の組み合わせにより、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。
［３］組み合わせ
ＰＬＧ１とＰＬＧ３の混合メンブレンと、ＰＬＧ２とＰＬＧ４の混合金コロイド溶液の組み合わせにより、未加熱のサンプルを２ｐｐｍまで、一方、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。
【実施例１３】
【０１３１】
１．材料及び方法
１）Ａｒａ ｈ１の調製
市販生落花生に５倍量の２０ｍＭbis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後３０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度１００００×ｇで遠心分離を行い、上清を得た。上清をさらにSource Q（GEヘルスケア バイオサイエンス）を用いて、２０ｍＭ bis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０から１Ｍ）により精製を行った。精製したＡｒａ ｈ１画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ａｒａ ｈ１（以下ＮＡｈ１という）とした。また、上清をプレップセル９６０（BioRad）を用いて精製を行い、得られたＡｒａ ｈ１画分を蒸留水により透析した後、凍結乾燥したものを未変性ｐｒｅｐ Ａｒａ ｈ１（以下「ＮＰＡｈ１」という）とした。尿素処理Ａｒａ ｈ１（以下ＤＡｈ１という）はＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、６ｇ 尿素、０．２ ｍｌ ２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥという）、１ｍｌ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．６）、１．５ ｍｌ 蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で1時間オイルバスで加熱し、処理を行った。その後、蒸留水による透析を行い、凍結乾燥したものとした。還元カルボキシメチル化処理Ａｒａ ｈ１（以下「ＲＣＭＡｈ１」という）は、ＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−ＭＥを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行った。その後、蒸留水による透析を行い、凍結乾燥したものをＲＣＭＡｈ１とした。
【０１３２】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）４尾を用いた。初回免疫は、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１３３】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＮＡｈ１、ＤＡｈ１の抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用いた。
【０１３４】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％のＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１およびＮＰＡｈ１溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１３５】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＲＣＭＡｈ１陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１３６】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、落花生の粗タンパク質の未変性（以下ＮＰ−eという）、尿素処理（以下ＤＰ−eという）あるいは還元カルボキシメチル処理（以下ＲＣＭＰ−eという）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、Ｐ−eは落花生に５倍量の２０ｍＭ bis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で2時間攪拌後遠心分離を二回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。培養上清のＮＰ−e、ＤＰ−eあるいはＲＣＭＰ−eに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１３７】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、１尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をProtein G カラム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）により精製した。
【０１３８】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＡｈ１又はＲＣＭＡｈ１をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＡｈ１又はＲＣＭＡｈ１）に抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗アレルゲンポリクロナール抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクロナール抗体にＮＡｈ１（液相ＮＡｈ１）又はＲＣＭＡｈ１（液相ＲＣＭＡｈ１）を結合させた状態で、抗未変性／変性アレルゲンＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１３９】
２．結果
１）抗Ａｒａ ｈ１ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
落花生に対する特異性を持つＭＡｂ２２種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１５, １６, １７, １８に示した。
【０１４０】
【表１５】
【０１４１】
【表１６】
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
【表１８】
【実施例１４】
【０１４４】
［イムノクロマトによる変性落花生タンパク質の検出］
１．材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれのＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Schleicher & Schuell社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１４５】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれのＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１４６】
３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下の方法で調製した落花生タンパク質を供試した。
【０１４７】
１．落花生タンパク質の調製
穐山ら（特定原材料（落花生）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌, 45, 2004, 325-331）に従い、市販落花生より落花生タンパク質を調製した。
【０１４８】
２．落花生タンパク質の検出
定性試験のため上記の方法で調整した落花生タンパク質を１ｇ量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−ＭＥを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１４９】
３．モデル食肉製品の作製
定性試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１９に示す配合にて各濃度の落花生たんぱく質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【０１５０】
【表１９】
【０１５１】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【０１５２】
１．加熱温度
加熱温度は、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で行った。
【０１５３】
２．サンプルの前処理及び評価
各加熱温度で処理後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−ＭＥを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清をイムノクロマトキットに供試した。
【０１５４】
２．結果
表５にイムノクロマトによる定性試験の結果を示した。その結果、ＳＤＳ処理した落花生タンパク質を検出には、金コロイド標識のＰＡｈ１−４（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）とメンブレン塗布のＰＡｈ１−５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）の組合せが最も適していると考えられた。また、この組み合わせで、食肉製品からの添加回収試験では、７５℃・３０分、１００℃・１時間、１２１℃・２０分で加熱したモデル食肉製品全てで、２ｐｐｍまで検出することができた。また、この組み合わせで、未変性の落花生タンパク質も同様に検出可能なことがわかった。このことから、ＰＡｈ１−４とＰＡｈ１−５を組み合わせることで、未変性及び変性の落花生タンパク質を検出可能なことから、対象食品の特性にあわせ、タンパク変性剤を選択して落花生を抽出し、イムノクロマトキットにより迅速に検出することが可能となった。
【０１５５】
【表２０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を利用した免疫反応に供することを特徴とするアレルゲンの検出方法。
【請求項２】
ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液が、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清であることを特徴とする請求項１記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項３】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項４】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項５】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項６】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項７】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項８】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項９】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を備えたことを特徴とするアレルゲンの検出用キット。
【請求項１０】
２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１１】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１２】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１３】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１４】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１５】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１６】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１７】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３。
【請求項１８】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４。
【請求項１９】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１。
【請求項２０】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２。
【請求項２１】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３。
【請求項２２】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４。
【請求項２３】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４。
【請求項２４】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５。
【請求項１】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、アレルゲン含有又は未含有試料に、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液を、前記各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を利用した免疫反応に供することを特徴とするアレルゲンの検出方法。
【請求項２】
ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いた抽出液が、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えて、少なくとも８０℃で５分間以上加熱抽出し、冷却遠心後の上清であることを特徴とする請求項１記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項３】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項４】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項５】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項６】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項７】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項８】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルゲンの検出方法。
【請求項９】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼイン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジン、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のＡｒａ ｈ１、又はＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を備えたことを特徴とするアレルゲンの検出用キット。
【請求項１０】
２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１１】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のオボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１２】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のαｓ１カゼインを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１３】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の小麦グリアジンを認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１４】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のそばアレルゲン（分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質）を認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１５】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のβ−ラクトグロブリンを認識する２種類以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３、及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１６】
ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性の落花生アレルゲンＡｒａ ｈ１を認識する２種類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアレルゲンの検出用キット。
【請求項１７】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３。
【請求項１８】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０６５７）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４。
【請求項１９】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８０）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１。
【請求項２０】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８１）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２。
【請求項２１】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８２）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３。
【請求項２２】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８３）が産生する抗β−ラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４。
【請求項２３】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６７）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４。
【請求項２４】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９６８）が産生する抗Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５。
【公開番号】特開２００７−１０８１６９（Ｐ２００７−１０８１６９Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５０１１３（Ｐ２００６−２５０１１３）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月２５日 社団法人日本畜産学会発行の「２００５年度（平成１７年） 日本畜産学会第１０５回大会 講演要旨」に発表
【出願人】（０００１１３０６７）プリマハム株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月２５日 社団法人日本畜産学会発行の「２００５年度（平成１７年） 日本畜産学会第１０５回大会 講演要旨」に発表
【出願人】（０００１１３０６７）プリマハム株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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