アンギオテンシス変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の調製のためのプロセスおよびその使用
【課題】強力なＡＣＥ阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画の酵素加水分解物の調製のためのプロセスを提供すること。
【解決手段】大豆粉末のグリシニンからのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の調製のためのプロセスおよびそのＡＣＥ阻害剤としての使用。
【解決手段】大豆粉末のグリシニンからのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の調製のためのプロセスおよびそのＡＣＥ阻害剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強力なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画グリシニンの酵素的加水分解物の調製のためのプロセスに関する。本発明はまた、ＡＣＥ阻害剤としてのグリシニンのポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、インビボおよびインビトロにおいて産生された食品タンパク質の部分酵素加水分解物からのペプチドは、食品科学者からこれまでになく大いに注目されている。オピオイド活性、抗高血圧活性、抗菌活性、ミネラル結合活性、抗血栓活性、抗胃活性、腸活動の増強などといった、健康上の利点をもつ多くの生体ペプチドが、食品タンパク質加水分解物から同定されている。こうしたペプチドは、親タンパク質の配列中に潜在性の状態で隠されており、インビボ／インビトロの消化を通じた、あるいは食品加工を通じたタンパク質分解プロセスによって放出されてよい。日常の食品タンパク質に由来する生物活性ペプチドは、新規の機能食品添加物の開発において、および治療目的のために有用であろう。
【０００３】
高血圧は、動脈硬化、卒中、心筋梗塞、および末期腎疾患の主要な独立したリスク因子の一つである。アンギオテンシンＩ−変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１、本文では「ＡＣＥ」と呼ばれる）は、ジペプチジル−カルボキシペプチダーゼであり、血圧の調整において重要な生理学的役割を果たす。ＡＣＥは、活性型のデカペプチド、アンギオテンシンＩを、最も強力な天然に生じる既知の昇圧物質である、強力な血管収縮薬オクタペプチド、アンギオテンシンＩＩへ変換することにより血圧を上昇させる。ＡＣＥはまた、降圧作用を有する血管拡張性ブラジキニンを劣化させる。この酵素は、その他の内在性ポリペプチドの局所レベルの調整において生理学的役割を有している。こうした理由のため、ＡＣＥの阻害剤は人体における血圧調節に有用である。ＡＣＥ活性は高血圧および動脈硬化の発症と密接に関連することから、インビトロのＡＣＥ阻害が治療薬のスクリーニングのために使用されてきた。カプトプリル（Captopril）およびＤ−２メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリンのような治療用の血圧抑制薬が、ＡＣＥ阻害剤として合成されてきた。合成ＡＣＥ阻害剤は非常に強力であり、一般に安全とはみなされない副作用を有する。
【０００４】
最近、種々の食品供給源または、酵素的消化後の食品タンパク質加水分解物からの、精製されたＡＣＥ阻害ペプチドの単離および同定に興味が集中している。食品タンパク質に由来するＡＣＥ阻害剤は、オーシマらにより１９７９年に初めて報告された（Oshima, G., Shimabukuro, H., and Nagasawa, K. 「Peptide inhibitors of Angiotensin converting enzyme digests of gelatin by bacterial collagenase」、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、１９７９年、第５５６巻、ｐ．１２８）。以来、ＡＣＥ阻害剤を含有するタンパク質消化物は、牛乳、卵、鶏肉、豚肉 牛肉、魚、および大豆、トウモロコシ、および微細藻類を含む多様な食用供給源から産生されてきた（アリヨシ（Ariyoshi, Y.、１９９３年）、「Angiotensin converting enzyme inhibitors derived from food proteins（食品タンパク質に由来するアンギオテンシン変換酵素阻害剤）」、トレンズ・イン・フード・サイエンス・アンド・テクノロジー（Trends Food Sci. Technol.）、第4巻、ｐ．１３９−１４４）。カゼインおよび大豆タンパク質に由来するペプチドは、低い毒性および高い安全性の期待に基づき開発されてきた。ＡＣＥ阻害活性を示すペプチドは、カゼイン（特開昭６２−２７０５３３、６４−５４９７、６４−８３０９６号公報）および大豆タンパク質（特開平０３−１６７１９８１号公報）の酵素的加水分解物から分離されている。
【０００５】
大豆は、世界中の良質タンパク質の供給源である。脱脂大豆は、ほぼ５０〜５５％のタンパク質を含有する。大豆の主要なタンパク質は、沈降係数に基づき、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ、および１５Ｓタンパク質として分類される貯蔵グロブリンである。１１Ｓ分画はグリシニンとして知られており、全タンパク質の２５〜３５％を構成する（リウー（Liu）著、「Soybeans : Chemistry, Technology and Utilization（大豆：化学、技術および利用）」、チャップマン＆ホール（Capman & Hall）、ニューヨーク、１９９７年、ｐ．２５−１１３）。
【０００６】
ポッター（Potter）、１９９５年の公表された論文（「Overview of proposed mechanisms for the hypocholesterolomic effect of soy（大豆の血中コレステロール低下効果に関して提案された機構の概要）」）が参照されてよく、これにおいて、動脈硬化および高血圧の原因となる、高脂血性または高コレステロール血性の疾患の予防に対し、大豆タンパク質が薬効を有することが示されている。本発明においては、全大豆タンパク質の２５〜３５％を構成するグリシニンが、抗高血圧ペプチドを産生するべく使用されている。
【０００７】
ユー（Yu）ら、１９９６年の公表された論文（「Effect of soybean hydrolysate on hypertension in spontaneously hypertensive rats（自然発生高血圧ラットの高血圧に対する大豆加水分解物の効果）」、ジャーナル・オブ・ザ・コリアン・ソサイエティ・オブ・サイエンス・アンド・ニュートリション（J. Korean Soc. Food. Sci. Nutr.）、第２５巻、ｐ．１０３１−１０３６）が参照されてよく、これにおいて筆者らは、大豆加水分解物がインビボの血管組織においてＡＣＥ阻害作用を及ぼし、かつ自然発生高血圧ラットにおいて収縮期血圧を低下させたこと証明している。本発明は、単離されたタンパク質分画、大豆タンパク質のグリシニンを使用しており、全大豆タンパク質ではない。
【０００８】
シン（Shin）ら、１９９５年の公表された論文（「Fractionation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from soybean paste（大豆ペーストからのアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの分画法）」、ジャーナル・オブ・ザ・コリアン・ソサイエティ・オブ・サイエンス・アンド・ニュートリション（J. Korean Soc. Food Sci. Nutr.）、第２７巻、ｐ．２３０−２３４））が参照されてよく、これにおいて、発酵された大豆ペーストからの分画がＡＣＥ阻害成分を含有すること、および分画Ｆ５３がインビトロにおいて強力な阻害作用を及ぼすことが実証されている。本発明は、単離された大豆タンパク質の精製されたグリシニン分画を利用している。
【０００９】
シン（Shin）ら、２００１年の公表された論文（「His-His-Leu, an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide derived from Korean soybean paste, exerts antihypertensive activity in vivo（韓国大豆ペースト由来のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕは、インビボにおいて抗高血圧作用を及ぼす）」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第４９巻、ｐ．３００４−３００９）もまた参照されてよく、これにおいて筆者らは、Ｆ５３分画のＡＣＥ阻害ペプチドを単離および同定し、精製されたペプチドのインビボにおけるＡＣＥ阻害作用および血圧低下作用を確認した。彼らはまた、合成ペプチドＨｉｓ−Ｈｉａ−Ｌｅｕが、結果として大動脈における有意な血圧低下を生じ、三回のペプチドの注射が収縮期血圧を６１ｍｍＨｇまで低下させたことも示している。シン（Shin）らの米国特許第６，２３２，４３８号が参照されてよく、これにおいて、式、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＬｅｕまたはＨｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕを有する高度に安全かつ活性のある阻害剤、および生理的に許容されるそれらの塩を調製するためのプロセスが記述されている。本発明はしかしながら、単離されたグリシニンを使用しており、大豆ペーストは使用していない。
【００１０】
ミウラ（Miura）ら、１９９３年の米国特許第５，２４３，０２７号が参照されてよく、これにおいてＡＣＥ阻害ペプチドは、細菌の無細胞抽出物の酸加水分解によって産生される。本発明は酵素を用いて加水分解物を産生しており、その供給源は植物タンパク質である。
【００１１】
マルヤマおよびスズキ（Maruyama and Suzuki）、１９８２年、およびマルヤマ（Maruyama）ら、１９８５年、の公表された論文（Maruyama, S and Suzuki, H.著、「A peptide inhibitor of angiotensin−I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein（カゼイントリプシン加水分解物中の、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素のペプチド阻害剤）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４６巻、ｐ．１３９３）、（Maruyama, S., Nakagomi, K., Tomizuka, N. and Suzuki, H.著、「Angiotensin-I converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of Casein. II Isolation and bradykinin potentiating activity on the uterus and ileum of rats（カゼインの酵素加水分解物由来のアンギオテンシン−Ｉ変換酵素阻害剤。ＩＩ 単離および、ラット子宮および回腸に対するブラジキニン増強活性）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４９巻、ｐ．１４０５）が参照されてよく、これにおいて筆者らは、カゼインのトリプシン加水分解物から精製されたペンタ−ペプチドおよびヘプタ−ペプチドが、ＡＣＥを阻害したことを証明している。
【００１２】
ウーおよびディング（Wu and Ding）、２００１年は、彼らの公表された論文（「Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats（大豆タンパク質由来のアンギオテンシン変換阻害ペプチドの自然発生高血圧ラットに対する血圧降下および生理的作用）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４９巻、ｐ．５０１−５０５）において、大豆タンパク質由来のＡＣＥ阻害ペプチド粉末の血圧降下活性を、インビボで、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日／4週間分の餌という用量で、自然発生高血圧ラットにおいて証明した。
【００１３】
ウーおよびディング（Wu and Ding）、２００２年の公表された論文（「Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides（大豆タンパク質由来のアンギオテンシンＩ-変換酵素阻害ペプチドの阻害および安定性の特徴づけ）」フード・リサーチ・インターナショナル（Food Research International）、第３５巻、ｐ．３６７−３７５）もまた参照されてよく、大豆タンパク質のアルカリ加水分解物が、限外濾過の後、０．０６５ｍｇのタンパク質／ｍＬというＩＣ５０値を有していた。二つの最も強力なペプチドはＡｐ−Ｌｅｕ−ＰｒｏおよびＡｓｐ−Ｇｌｙであり、ＩＣ５０値は各々４．８および１２．３μＭであった。本発明はしかしながら、全大豆タンパク質の一つの分画、グリシニンを用いており、またアルカラーゼ（Alcalase）以外の種々のプロテアーゼを使用している。
【００１４】
ミヨシ（Miyoshi）ら、１９９１年は、彼らの公表された論文「Structures and activity on angiotensin-converting enzyme inhibitors in α-zein hydrolysate（α−ゼインにおけるアンギオテンシン変換酵素阻害剤の構造および活性）」（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１３１３−１３１８、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１２２１、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１４０７）において、トウモロコシの内乳タンパク質の主要成分、α−ゼインのサーモリシン加水分解物からペプチドを単離し、それらがＡＣＥを阻害することを示した。トリペプチドＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏは、各々０．２７、１．７、１．９μＭのＩＣ５０値を有していた。自然発生高血圧ラットに対する合成ペプチドＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの血圧降下活性は、３０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射の後、血圧が１５ｍｍＨｇまで低下されたことを示した。本発明は、大豆の貯蔵タンパク質、グリシニンを使用している。
【００１５】
サトウ（Sato）ら、２００２年による、さらにもう一つの公表された論文（ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第５０巻、ｐ．６２４５−６２５２）が参照されてよく、これにおいて、褐藻、ワカメ（Undaria pinnatifida）のプロテアーゼＳ「アマノ（Amano）」消化物からのＡＣＥ阻害ペプチドの単離同定および、これらのペプチドのインビトロにおける胃腸プロテアーゼに対する抵抗性の研究が報告されている。自然発生高血圧ラットの血圧は、１ｍｇ／ｋｇ体重の単回の経口投与量の後に低下した。本発明は、プロテアーゼＳ「アマノ」以外のプロテアーゼを使用して加水分解物を産生している。さらに、ＡＣＥ阻害ペプチドは、大豆の主要貯蔵タンパク質グリシニンから得られている。
【００１６】
シュー（Hsu）ら、２００２年、により公表された論文（ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第５０巻、ｐ．６１０９−６１１３）もまた参照されてよく、これにおいて彼らは、ヤム（ジオスコレア・アラタ（Dioscorea alata））塊茎の貯蔵タンパク質、ジオスコリンのペプシン加水分解物がＡＣＥ阻害を示したことを報告している。本発明において使用された貯蔵タンパク質は豆果からであり、加水分解物を調製するために使用された酵素はペプシン以外である。
【００１７】
さらにいくつかの特許（米国特許第５−５１０３３１、５−１０６８３４、４−９１４１２９、４−８８９８６９、４−７９８８２１、４−７５８５８４、４−７０３０４３、４−３８５０５０、４−１９１７５３、４−０１３７９１号）は、ＡＣＥ阻害剤としての、合成ペプチドおよびペプチド類似体の調製を記述している。本発明は、ＡＣＥ阻害剤としての、植物タンパク質の酵素加水分解物のためのプロセスを記述している。
【００１８】
さらに、トリからナノペプチドまでの範囲のＡＣＥペプチドについての多数の特許が提出されている：米国特許第５−４４９６６１、５０７１９５５、４−６９２４５９、４−５８５７５８、４−５１２９７９、４−１９１７５３号、欧州特許第１７４１６２号；特開平０５−２９９４８４４、０５−２６２７９０、０４−２４７１００号公報。しかしながら、抗高血圧ペプチドの供給源としてのグリシニンの使用に関連したものはない。
【００１９】
酵素加水分解は、その大規模の商業的可用性のためだけでなく、かかる製品の高品質の故に、テイラーメイドＡＣＥ阻害ペプチドの調製のために最も好適であると考えられる。かかる加水分解物は、一以上の有効成分を低濃度に含有するペプチド種の複合混合物である。ＡＣＥ阻害活性を示すほとんどのペプチドは単離および特徴づけされているものであるが、それは広範かつ費用のかかるプロトコールであり、制限因子となっている。しかしながら、商業化の観点から考えると、それは単一の精製されたペプチドではなく、ペプチド混合物であることが可能であり、「生理的機能性食品」における使用のための健康増進成分として適用されるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の主要な目的は、強力なＡＣＥ阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画の酵素加水分解物の調製のためのプロセスを提供することである。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、そのアミノ酸配列が既知であるグリシニンタンパク質分画を使用することである。
【００２２】
本発明のさらにもう一つの目的は、異なるプロテアーゼを用いて加水分解物を調製することである。
【００２３】
本発明のなおもう一つの目的は、プロリンに対してＣ−末端を切断する特異性をもつ植物プロテアーゼを使用することである。
【００２４】
本発明のさらにもう一つの目的は、逆相ＨＰＬＣにより、ＡＣＥ阻害ペプチドを精製することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、強力なアンギオテンシン変換酵素（Angiotensin converting enzyme、ＡＣＥ）阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画の酵素加水分解物の調製のためのプロセスを提供する。本発明はまた、ＡＣＥ阻害剤としてのグリシニンポリペプチドの使用も提供する。
【００２６】
したがって、本発明は脱脂大豆粉末のグリシニンからの、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドの調製のためのプロセスであって、
（ａ）脱脂大豆粉末からグリシニンを単離すること；
（ｂ）１０〜２５％溶液のグリシニンを緩衝液中に分散させること；
（ｃ）混合物を、蛋白質分解酵素（２〜４％w／v）を用いて加水分解すること；
（ｄ）混合物を３７〜５０℃において１６〜１８時間にわたりインキュベートすること；
（ｅ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ−１００％）の添加により反応を停止すること；
（ｆ）混合物を約４〜８℃の温度において、１５〜２０，０００ｒｐｍで３０〜４０分間遠心分離すること；および
（ｇ）ポリペプチドを含有するタンパク質加水分解物の混合物を得ること；
（ｈ）ＡＣＥ阻害活性を有する２、３、および４と呼ばれる活性ペプチド分画を分離精製すること、
の段階を含むプロセスを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の一つの態様においては、グリシニンは脱脂大豆粉末からの単離されたタンパク質分画である。
【００２８】
本発明のもう一つの態様においては、段階（ａ）の緩衝液は、トリス−ＨＣｌおよびリン酸ナトリウムから選ばれる。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの態様においては、段階（ａ）のｐＨは６．２〜８．２の範囲内に、かつモル濃度は０．０５〜０．１Ｍに維持される。
【００３０】
本発明のなおもう一つの態様においては、加水分解物を調製するべく、異なるプロテアーゼが用いられる。
【００３１】
本発明のさらにもう一つの態様においては、プロリンに対しＣ−末端を切断する特異性をもつ植物プロテアーゼが使用される。
【００３２】
本発明のなおもう一つの態様においては、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、ウシキモトリプシン、もしくは植物プロテアーゼから選ばれる真菌プロテアーゼ、またはショウガ（Zingiber officinale）からのプロテアーゼ、または上記の組み合せである。
【００３３】
本発明のさらなる態様においては、段階（ｈ）はオクタデシルカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび７０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行なわれる。
【００３４】
本発明はまた、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害特性を有するポリペプチド分画の使用も提供する。
【００３５】
本発明の一つの態様、使用においては、分画２、３および４のＡＣＥ阻害活性は、各々６６、８１および７５％である。
【００３６】
本発明のもう一つの態様である、使用においては、インビトロのＡＣＥ阻害のＩＣ５０値は、５〜３９μgＮ２当量の範囲内である。本発明の一つの態様においては、上清はＡＣＥ阻害活性を含有する加水分解物でよい。
【００３７】
大豆粉末用のグリシニンの単離
１０〜１５％の脱脂大豆粉末（w／v）の水性スラリーは、β−メルカプトエタノール（０．１％v／v）を含んで調製される。スラリーは、周囲温度において4〜６時間撹拌することにより抽出される。スラリーは、６０００〜８０００ｒｐｍで３０〜４５分間、周囲温度において遠心分離される。グリシニンは、固体ＭｇＣｌ２を最終濃度５ｍＭまで添加することにより、上清から沈殿される。沈殿されたグリシニンは遠心分離によって集められ、凍結乾燥される。
【００３８】
インビトロのＡＣＥ阻害活性の測定：
インビトロのＡＣＥ阻害活性の測定は、クーシュマンおよびチャン（Cushman and Cheung）、（１９７１年）（「Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin0I converting enzyme of rabbit lung（ウサギ肺のアンギオテンシン０Ｉ変換酵素の分光光度分析および特性）」、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem. Pharmacol.）、第２０巻、ｐ．１６３７−１６４８）によって記述された分光光度法から修正された、ＲＰ-ＨＰＬＣによって行なわれる。ＡＣＥはブタの肺または腎臓の粉末（本研究所において調製された）から、１％（w／v）NａＣｌを含有する１０倍（w／v）の１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）により、４℃において一晩抽出され、遠心分離され（３０分間、１５，００ｒｐｍ、４℃）、上清は同じ緩衝液に対して２４時間、緩衝液を２回交換して透析された。遠視分離され、上清が酵素の供給源として使用された。酵素活性は、基質である合成ペプチド、ヒプリル−Ｈｉｓ Ｌｅｕ（ＨＨＬ、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co））から放出された馬尿酸を２２８ｎｍにおいてモニターすることによりアッセイされた。アッセイ混合物は全２００μＬ中に以下の溶液を含有していた：１％（w／v）NａＣｌを含有する１００μＬの１００ｍＭホウ酸緩衝液、５０μＬの５ｍＭ ＨＨＬ、および２５μＬのＡＣＥ（単位）。阻害を測定するためには、加水分解物またはペプチド分画は酵素とともにプレインキュベートされた。３７℃で３０分間のインキュベーションの後、２５０μＬの１Ｎ ＨＣＬを添加することにより反応は停止され、遠心分離された。生成物、馬尿酸は、シムパック・オクタデシル（Shimpak Octadecyl）カラム（４．６x２５０ｍｍ、５μ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡを含有する５０％メタノールを０．８ｍＬ／分の流速で用いてＨＨＬから分離され、２２８ｎｍにおいて検出された。ペプチド／加水分解物のＡＣＥ阻害の測定のための典型的なクロマトグラムは、図１に示されている。ＡＣＥ阻害活性を５０％まで低減するために必要なペプチド／加水分解物の濃度が、ＩＣ５０値として同定される。
【００３９】
本発明の新規かつ独創的な観点は、以下の態様の形状においてさらに説明される：
・主要な油料種子中に２５〜３０％程度まで生じ、そのタンパク質配列が既知であり、かつＡＣＥの阻害剤となる所望のペプチド配列を、潜伏性の形状で含有する植物タンパク質を同定すること。
・その特異性が様々であり、かつ充分に定義されているプロテアーゼを用いて、タンパク質から所望のペプチドを放出すること。
・真菌プロテアーゼを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して４．３〜５．２μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・ウシキモトリプシンを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して２５〜３０μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・ウシトリプシンを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して７〜２０μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・植物プロテアーゼを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して３０〜３５μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・低分子ペプチド分画は、５０％より大きい阻害を示した。
【００４０】
本発明のさらに完全な理解は、以下の実施例への参照によって実現されるであろう。しかしながら以下の実施例は、本文に開示された発明を制限するためのものではなく、単なる例として示されている。
【実施例】
【００４１】
実施例１
５gの単離されたグリシニンは、５０ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。５０ｍｇの真菌プロテアーゼ（２，２６０単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの５０ｍｇの真菌プロテアーゼが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡを最終濃度５％（w／v）まで添加することにより停止された。混合物は遠心分離され、上清は活性検査に使用された。ＩＣ５０値、ＡＣＥ活性がブタ肺ＡＣＥの５０％まで阻害される濃度は、４．４８μgＮ２当量であった。
【００４２】
実施例２
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。１０ｍｇのウシトリプシン（１６００単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１０ｍｇのウシトリプシンが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ腎臓ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、１８．３７μgＮ２当量であった。
【００４３】
実施例３
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。１０ｍｇのウシキモトリプシン（２，１６８単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１０ｍｇのウシキモトリプシンが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ肺ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、２９．０μgＮ２当量であった。
【００４４】
実施例４
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解され、５０℃において１０分間インキュベートされた。２２０単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１００単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、ＴＣＡを最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ肺ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、３３．５７μgＮ２当量であった。
【００４５】
実施例５
１００ｍgの単離されたグリシニンは、１ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。２ｍｇのウシキモトリプシン（２，１６８単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において８時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１００単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃においてさらに５時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。５０μＬの上清は７２％の阻害を示した。
【００４６】
実施例６
５００ｍｇの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において５〜１０分間インキュベートされた。この段階において、２％（w／w）の真菌プロテアーゼ（２，２６０単位／ｍｇタンパク質）が添加され、１８時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度１０％まで添加することにより停止され、氷冷され、１５，０００ｒｐｍで３０分間、４℃において遠心分離された。さらに、上清中に存在するペプチドは、Ｃ−１８シムパックカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび、０．０５％ＴＦＡを含有する水中の７０％ＣＨ３ＣＮの勾配を、０〜３５％にわたり、０．７ｍＬ／分の流速で使用して分離された。ペプチドは２２０ｎｍにおいて検出された。５つのペプチド分画（図２に示された）が集められ、ＡＣＥ阻害活性用に使用された。ペプチド分画２、３、および４は、各々６６、８１、および７５％の阻害を示した。
【００４７】
本発明の利点
１．上記のプロセス用の原料は、高い窒素溶解性をもつ脱脂大豆粉末であり、豊富に入手できる。
２．大豆の主要な貯蔵タンパク質、グリシニンは全タンパク質の２５〜３５％を占め、最小数の段階を用いて単離されることが可能である。
３．グリシニンのアミノ酸配列は既知である。グリシニンは、既知の配列内に潜在しているＡＣＥ阻害ペプチドの供給源である。
４．これらのペプチドは、種々の、かつ充分に定義された特異性をもつ様々なプロテアーゼにより、グリシニンから放出されることが可能である。こうした何杯ものペプチドは、インビトロにおけるブタ肺および腎臓ＡＣＥの強力な阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ａ）典型的なＡＣＥ活性のクロマトグラム、およびｂ）加水分解物／ペプチド分画によるＡＣＥ阻害の典型的なクロマトグラムを表す。ＨＡ：馬尿酸、ＨＨＬ：ヒプリル・ヒスチジル・ロイシン。
【図２】グリシニンの真菌プロテアーゼ消化物のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強力なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画グリシニンの酵素的加水分解物の調製のためのプロセスに関する。本発明はまた、ＡＣＥ阻害剤としてのグリシニンのポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、インビボおよびインビトロにおいて産生された食品タンパク質の部分酵素加水分解物からのペプチドは、食品科学者からこれまでになく大いに注目されている。オピオイド活性、抗高血圧活性、抗菌活性、ミネラル結合活性、抗血栓活性、抗胃活性、腸活動の増強などといった、健康上の利点をもつ多くの生体ペプチドが、食品タンパク質加水分解物から同定されている。こうしたペプチドは、親タンパク質の配列中に潜在性の状態で隠されており、インビボ／インビトロの消化を通じた、あるいは食品加工を通じたタンパク質分解プロセスによって放出されてよい。日常の食品タンパク質に由来する生物活性ペプチドは、新規の機能食品添加物の開発において、および治療目的のために有用であろう。
【０００３】
高血圧は、動脈硬化、卒中、心筋梗塞、および末期腎疾患の主要な独立したリスク因子の一つである。アンギオテンシンＩ−変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１、本文では「ＡＣＥ」と呼ばれる）は、ジペプチジル−カルボキシペプチダーゼであり、血圧の調整において重要な生理学的役割を果たす。ＡＣＥは、活性型のデカペプチド、アンギオテンシンＩを、最も強力な天然に生じる既知の昇圧物質である、強力な血管収縮薬オクタペプチド、アンギオテンシンＩＩへ変換することにより血圧を上昇させる。ＡＣＥはまた、降圧作用を有する血管拡張性ブラジキニンを劣化させる。この酵素は、その他の内在性ポリペプチドの局所レベルの調整において生理学的役割を有している。こうした理由のため、ＡＣＥの阻害剤は人体における血圧調節に有用である。ＡＣＥ活性は高血圧および動脈硬化の発症と密接に関連することから、インビトロのＡＣＥ阻害が治療薬のスクリーニングのために使用されてきた。カプトプリル（Captopril）およびＤ−２メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリンのような治療用の血圧抑制薬が、ＡＣＥ阻害剤として合成されてきた。合成ＡＣＥ阻害剤は非常に強力であり、一般に安全とはみなされない副作用を有する。
【０００４】
最近、種々の食品供給源または、酵素的消化後の食品タンパク質加水分解物からの、精製されたＡＣＥ阻害ペプチドの単離および同定に興味が集中している。食品タンパク質に由来するＡＣＥ阻害剤は、オーシマらにより１９７９年に初めて報告された（Oshima, G., Shimabukuro, H., and Nagasawa, K. 「Peptide inhibitors of Angiotensin converting enzyme digests of gelatin by bacterial collagenase」、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、１９７９年、第５５６巻、ｐ．１２８）。以来、ＡＣＥ阻害剤を含有するタンパク質消化物は、牛乳、卵、鶏肉、豚肉 牛肉、魚、および大豆、トウモロコシ、および微細藻類を含む多様な食用供給源から産生されてきた（アリヨシ（Ariyoshi, Y.、１９９３年）、「Angiotensin converting enzyme inhibitors derived from food proteins（食品タンパク質に由来するアンギオテンシン変換酵素阻害剤）」、トレンズ・イン・フード・サイエンス・アンド・テクノロジー（Trends Food Sci. Technol.）、第4巻、ｐ．１３９−１４４）。カゼインおよび大豆タンパク質に由来するペプチドは、低い毒性および高い安全性の期待に基づき開発されてきた。ＡＣＥ阻害活性を示すペプチドは、カゼイン（特開昭６２−２７０５３３、６４−５４９７、６４−８３０９６号公報）および大豆タンパク質（特開平０３−１６７１９８１号公報）の酵素的加水分解物から分離されている。
【０００５】
大豆は、世界中の良質タンパク質の供給源である。脱脂大豆は、ほぼ５０〜５５％のタンパク質を含有する。大豆の主要なタンパク質は、沈降係数に基づき、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ、および１５Ｓタンパク質として分類される貯蔵グロブリンである。１１Ｓ分画はグリシニンとして知られており、全タンパク質の２５〜３５％を構成する（リウー（Liu）著、「Soybeans : Chemistry, Technology and Utilization（大豆：化学、技術および利用）」、チャップマン＆ホール（Capman & Hall）、ニューヨーク、１９９７年、ｐ．２５−１１３）。
【０００６】
ポッター（Potter）、１９９５年の公表された論文（「Overview of proposed mechanisms for the hypocholesterolomic effect of soy（大豆の血中コレステロール低下効果に関して提案された機構の概要）」）が参照されてよく、これにおいて、動脈硬化および高血圧の原因となる、高脂血性または高コレステロール血性の疾患の予防に対し、大豆タンパク質が薬効を有することが示されている。本発明においては、全大豆タンパク質の２５〜３５％を構成するグリシニンが、抗高血圧ペプチドを産生するべく使用されている。
【０００７】
ユー（Yu）ら、１９９６年の公表された論文（「Effect of soybean hydrolysate on hypertension in spontaneously hypertensive rats（自然発生高血圧ラットの高血圧に対する大豆加水分解物の効果）」、ジャーナル・オブ・ザ・コリアン・ソサイエティ・オブ・サイエンス・アンド・ニュートリション（J. Korean Soc. Food. Sci. Nutr.）、第２５巻、ｐ．１０３１−１０３６）が参照されてよく、これにおいて筆者らは、大豆加水分解物がインビボの血管組織においてＡＣＥ阻害作用を及ぼし、かつ自然発生高血圧ラットにおいて収縮期血圧を低下させたこと証明している。本発明は、単離されたタンパク質分画、大豆タンパク質のグリシニンを使用しており、全大豆タンパク質ではない。
【０００８】
シン（Shin）ら、１９９５年の公表された論文（「Fractionation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from soybean paste（大豆ペーストからのアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの分画法）」、ジャーナル・オブ・ザ・コリアン・ソサイエティ・オブ・サイエンス・アンド・ニュートリション（J. Korean Soc. Food Sci. Nutr.）、第２７巻、ｐ．２３０−２３４））が参照されてよく、これにおいて、発酵された大豆ペーストからの分画がＡＣＥ阻害成分を含有すること、および分画Ｆ５３がインビトロにおいて強力な阻害作用を及ぼすことが実証されている。本発明は、単離された大豆タンパク質の精製されたグリシニン分画を利用している。
【０００９】
シン（Shin）ら、２００１年の公表された論文（「His-His-Leu, an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide derived from Korean soybean paste, exerts antihypertensive activity in vivo（韓国大豆ペースト由来のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕは、インビボにおいて抗高血圧作用を及ぼす）」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第４９巻、ｐ．３００４−３００９）もまた参照されてよく、これにおいて筆者らは、Ｆ５３分画のＡＣＥ阻害ペプチドを単離および同定し、精製されたペプチドのインビボにおけるＡＣＥ阻害作用および血圧低下作用を確認した。彼らはまた、合成ペプチドＨｉｓ−Ｈｉａ−Ｌｅｕが、結果として大動脈における有意な血圧低下を生じ、三回のペプチドの注射が収縮期血圧を６１ｍｍＨｇまで低下させたことも示している。シン（Shin）らの米国特許第６，２３２，４３８号が参照されてよく、これにおいて、式、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＬｅｕまたはＨｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕを有する高度に安全かつ活性のある阻害剤、および生理的に許容されるそれらの塩を調製するためのプロセスが記述されている。本発明はしかしながら、単離されたグリシニンを使用しており、大豆ペーストは使用していない。
【００１０】
ミウラ（Miura）ら、１９９３年の米国特許第５，２４３，０２７号が参照されてよく、これにおいてＡＣＥ阻害ペプチドは、細菌の無細胞抽出物の酸加水分解によって産生される。本発明は酵素を用いて加水分解物を産生しており、その供給源は植物タンパク質である。
【００１１】
マルヤマおよびスズキ（Maruyama and Suzuki）、１９８２年、およびマルヤマ（Maruyama）ら、１９８５年、の公表された論文（Maruyama, S and Suzuki, H.著、「A peptide inhibitor of angiotensin−I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein（カゼイントリプシン加水分解物中の、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素のペプチド阻害剤）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４６巻、ｐ．１３９３）、（Maruyama, S., Nakagomi, K., Tomizuka, N. and Suzuki, H.著、「Angiotensin-I converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of Casein. II Isolation and bradykinin potentiating activity on the uterus and ileum of rats（カゼインの酵素加水分解物由来のアンギオテンシン−Ｉ変換酵素阻害剤。ＩＩ 単離および、ラット子宮および回腸に対するブラジキニン増強活性）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４９巻、ｐ．１４０５）が参照されてよく、これにおいて筆者らは、カゼインのトリプシン加水分解物から精製されたペンタ−ペプチドおよびヘプタ−ペプチドが、ＡＣＥを阻害したことを証明している。
【００１２】
ウーおよびディング（Wu and Ding）、２００１年は、彼らの公表された論文（「Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats（大豆タンパク質由来のアンギオテンシン変換阻害ペプチドの自然発生高血圧ラットに対する血圧降下および生理的作用）」、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第４９巻、ｐ．５０１−５０５）において、大豆タンパク質由来のＡＣＥ阻害ペプチド粉末の血圧降下活性を、インビボで、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日／4週間分の餌という用量で、自然発生高血圧ラットにおいて証明した。
【００１３】
ウーおよびディング（Wu and Ding）、２００２年の公表された論文（「Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides（大豆タンパク質由来のアンギオテンシンＩ-変換酵素阻害ペプチドの阻害および安定性の特徴づけ）」フード・リサーチ・インターナショナル（Food Research International）、第３５巻、ｐ．３６７−３７５）もまた参照されてよく、大豆タンパク質のアルカリ加水分解物が、限外濾過の後、０．０６５ｍｇのタンパク質／ｍＬというＩＣ５０値を有していた。二つの最も強力なペプチドはＡｐ−Ｌｅｕ−ＰｒｏおよびＡｓｐ−Ｇｌｙであり、ＩＣ５０値は各々４．８および１２．３μＭであった。本発明はしかしながら、全大豆タンパク質の一つの分画、グリシニンを用いており、またアルカラーゼ（Alcalase）以外の種々のプロテアーゼを使用している。
【００１４】
ミヨシ（Miyoshi）ら、１９９１年は、彼らの公表された論文「Structures and activity on angiotensin-converting enzyme inhibitors in α-zein hydrolysate（α−ゼインにおけるアンギオテンシン変換酵素阻害剤の構造および活性）」（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１３１３−１３１８、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１２２１、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、第５５巻、ｐ．１４０７）において、トウモロコシの内乳タンパク質の主要成分、α−ゼインのサーモリシン加水分解物からペプチドを単離し、それらがＡＣＥを阻害することを示した。トリペプチドＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏは、各々０．２７、１．７、１．９μＭのＩＣ５０値を有していた。自然発生高血圧ラットに対する合成ペプチドＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの血圧降下活性は、３０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射の後、血圧が１５ｍｍＨｇまで低下されたことを示した。本発明は、大豆の貯蔵タンパク質、グリシニンを使用している。
【００１５】
サトウ（Sato）ら、２００２年による、さらにもう一つの公表された論文（ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第５０巻、ｐ．６２４５−６２５２）が参照されてよく、これにおいて、褐藻、ワカメ（Undaria pinnatifida）のプロテアーゼＳ「アマノ（Amano）」消化物からのＡＣＥ阻害ペプチドの単離同定および、これらのペプチドのインビトロにおける胃腸プロテアーゼに対する抵抗性の研究が報告されている。自然発生高血圧ラットの血圧は、１ｍｇ／ｋｇ体重の単回の経口投与量の後に低下した。本発明は、プロテアーゼＳ「アマノ」以外のプロテアーゼを使用して加水分解物を産生している。さらに、ＡＣＥ阻害ペプチドは、大豆の主要貯蔵タンパク質グリシニンから得られている。
【００１６】
シュー（Hsu）ら、２００２年、により公表された論文（ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）、第５０巻、ｐ．６１０９−６１１３）もまた参照されてよく、これにおいて彼らは、ヤム（ジオスコレア・アラタ（Dioscorea alata））塊茎の貯蔵タンパク質、ジオスコリンのペプシン加水分解物がＡＣＥ阻害を示したことを報告している。本発明において使用された貯蔵タンパク質は豆果からであり、加水分解物を調製するために使用された酵素はペプシン以外である。
【００１７】
さらにいくつかの特許（米国特許第５−５１０３３１、５−１０６８３４、４−９１４１２９、４−８８９８６９、４−７９８８２１、４−７５８５８４、４−７０３０４３、４−３８５０５０、４−１９１７５３、４−０１３７９１号）は、ＡＣＥ阻害剤としての、合成ペプチドおよびペプチド類似体の調製を記述している。本発明は、ＡＣＥ阻害剤としての、植物タンパク質の酵素加水分解物のためのプロセスを記述している。
【００１８】
さらに、トリからナノペプチドまでの範囲のＡＣＥペプチドについての多数の特許が提出されている：米国特許第５−４４９６６１、５０７１９５５、４−６９２４５９、４−５８５７５８、４−５１２９７９、４−１９１７５３号、欧州特許第１７４１６２号；特開平０５−２９９４８４４、０５−２６２７９０、０４−２４７１００号公報。しかしながら、抗高血圧ペプチドの供給源としてのグリシニンの使用に関連したものはない。
【００１９】
酵素加水分解は、その大規模の商業的可用性のためだけでなく、かかる製品の高品質の故に、テイラーメイドＡＣＥ阻害ペプチドの調製のために最も好適であると考えられる。かかる加水分解物は、一以上の有効成分を低濃度に含有するペプチド種の複合混合物である。ＡＣＥ阻害活性を示すほとんどのペプチドは単離および特徴づけされているものであるが、それは広範かつ費用のかかるプロトコールであり、制限因子となっている。しかしながら、商業化の観点から考えると、それは単一の精製されたペプチドではなく、ペプチド混合物であることが可能であり、「生理的機能性食品」における使用のための健康増進成分として適用されるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の主要な目的は、強力なＡＣＥ阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画の酵素加水分解物の調製のためのプロセスを提供することである。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、そのアミノ酸配列が既知であるグリシニンタンパク質分画を使用することである。
【００２２】
本発明のさらにもう一つの目的は、異なるプロテアーゼを用いて加水分解物を調製することである。
【００２３】
本発明のなおもう一つの目的は、プロリンに対してＣ−末端を切断する特異性をもつ植物プロテアーゼを使用することである。
【００２４】
本発明のさらにもう一つの目的は、逆相ＨＰＬＣにより、ＡＣＥ阻害ペプチドを精製することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、強力なアンギオテンシン変換酵素（Angiotensin converting enzyme、ＡＣＥ）阻害活性を立証する、選択された大豆貯蔵タンパク質分画の酵素加水分解物の調製のためのプロセスを提供する。本発明はまた、ＡＣＥ阻害剤としてのグリシニンポリペプチドの使用も提供する。
【００２６】
したがって、本発明は脱脂大豆粉末のグリシニンからの、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドの調製のためのプロセスであって、
（ａ）脱脂大豆粉末からグリシニンを単離すること；
（ｂ）１０〜２５％溶液のグリシニンを緩衝液中に分散させること；
（ｃ）混合物を、蛋白質分解酵素（２〜４％w／v）を用いて加水分解すること；
（ｄ）混合物を３７〜５０℃において１６〜１８時間にわたりインキュベートすること；
（ｅ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ−１００％）の添加により反応を停止すること；
（ｆ）混合物を約４〜８℃の温度において、１５〜２０，０００ｒｐｍで３０〜４０分間遠心分離すること；および
（ｇ）ポリペプチドを含有するタンパク質加水分解物の混合物を得ること；
（ｈ）ＡＣＥ阻害活性を有する２、３、および４と呼ばれる活性ペプチド分画を分離精製すること、
の段階を含むプロセスを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の一つの態様においては、グリシニンは脱脂大豆粉末からの単離されたタンパク質分画である。
【００２８】
本発明のもう一つの態様においては、段階（ａ）の緩衝液は、トリス−ＨＣｌおよびリン酸ナトリウムから選ばれる。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの態様においては、段階（ａ）のｐＨは６．２〜８．２の範囲内に、かつモル濃度は０．０５〜０．１Ｍに維持される。
【００３０】
本発明のなおもう一つの態様においては、加水分解物を調製するべく、異なるプロテアーゼが用いられる。
【００３１】
本発明のさらにもう一つの態様においては、プロリンに対しＣ−末端を切断する特異性をもつ植物プロテアーゼが使用される。
【００３２】
本発明のなおもう一つの態様においては、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、ウシキモトリプシン、もしくは植物プロテアーゼから選ばれる真菌プロテアーゼ、またはショウガ（Zingiber officinale）からのプロテアーゼ、または上記の組み合せである。
【００３３】
本発明のさらなる態様においては、段階（ｈ）はオクタデシルカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび７０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行なわれる。
【００３４】
本発明はまた、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害特性を有するポリペプチド分画の使用も提供する。
【００３５】
本発明の一つの態様、使用においては、分画２、３および４のＡＣＥ阻害活性は、各々６６、８１および７５％である。
【００３６】
本発明のもう一つの態様である、使用においては、インビトロのＡＣＥ阻害のＩＣ５０値は、５〜３９μgＮ２当量の範囲内である。本発明の一つの態様においては、上清はＡＣＥ阻害活性を含有する加水分解物でよい。
【００３７】
大豆粉末用のグリシニンの単離
１０〜１５％の脱脂大豆粉末（w／v）の水性スラリーは、β−メルカプトエタノール（０．１％v／v）を含んで調製される。スラリーは、周囲温度において4〜６時間撹拌することにより抽出される。スラリーは、６０００〜８０００ｒｐｍで３０〜４５分間、周囲温度において遠心分離される。グリシニンは、固体ＭｇＣｌ２を最終濃度５ｍＭまで添加することにより、上清から沈殿される。沈殿されたグリシニンは遠心分離によって集められ、凍結乾燥される。
【００３８】
インビトロのＡＣＥ阻害活性の測定：
インビトロのＡＣＥ阻害活性の測定は、クーシュマンおよびチャン（Cushman and Cheung）、（１９７１年）（「Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin0I converting enzyme of rabbit lung（ウサギ肺のアンギオテンシン０Ｉ変換酵素の分光光度分析および特性）」、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem. Pharmacol.）、第２０巻、ｐ．１６３７−１６４８）によって記述された分光光度法から修正された、ＲＰ-ＨＰＬＣによって行なわれる。ＡＣＥはブタの肺または腎臓の粉末（本研究所において調製された）から、１％（w／v）NａＣｌを含有する１０倍（w／v）の１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）により、４℃において一晩抽出され、遠心分離され（３０分間、１５，００ｒｐｍ、４℃）、上清は同じ緩衝液に対して２４時間、緩衝液を２回交換して透析された。遠視分離され、上清が酵素の供給源として使用された。酵素活性は、基質である合成ペプチド、ヒプリル−Ｈｉｓ Ｌｅｕ（ＨＨＬ、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co））から放出された馬尿酸を２２８ｎｍにおいてモニターすることによりアッセイされた。アッセイ混合物は全２００μＬ中に以下の溶液を含有していた：１％（w／v）NａＣｌを含有する１００μＬの１００ｍＭホウ酸緩衝液、５０μＬの５ｍＭ ＨＨＬ、および２５μＬのＡＣＥ（単位）。阻害を測定するためには、加水分解物またはペプチド分画は酵素とともにプレインキュベートされた。３７℃で３０分間のインキュベーションの後、２５０μＬの１Ｎ ＨＣＬを添加することにより反応は停止され、遠心分離された。生成物、馬尿酸は、シムパック・オクタデシル（Shimpak Octadecyl）カラム（４．６x２５０ｍｍ、５μ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡを含有する５０％メタノールを０．８ｍＬ／分の流速で用いてＨＨＬから分離され、２２８ｎｍにおいて検出された。ペプチド／加水分解物のＡＣＥ阻害の測定のための典型的なクロマトグラムは、図１に示されている。ＡＣＥ阻害活性を５０％まで低減するために必要なペプチド／加水分解物の濃度が、ＩＣ５０値として同定される。
【００３９】
本発明の新規かつ独創的な観点は、以下の態様の形状においてさらに説明される：
・主要な油料種子中に２５〜３０％程度まで生じ、そのタンパク質配列が既知であり、かつＡＣＥの阻害剤となる所望のペプチド配列を、潜伏性の形状で含有する植物タンパク質を同定すること。
・その特異性が様々であり、かつ充分に定義されているプロテアーゼを用いて、タンパク質から所望のペプチドを放出すること。
・真菌プロテアーゼを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して４．３〜５．２μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・ウシキモトリプシンを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して２５〜３０μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・ウシトリプシンを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して７〜２０μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・植物プロテアーゼを用いて、ブタ肺および腎臓のＡＣＥの阻害に関して３０〜３５μgＮ２のＩＣ５０をもつグリシニンの加水分解物を得ること。
・低分子ペプチド分画は、５０％より大きい阻害を示した。
【００４０】
本発明のさらに完全な理解は、以下の実施例への参照によって実現されるであろう。しかしながら以下の実施例は、本文に開示された発明を制限するためのものではなく、単なる例として示されている。
【実施例】
【００４１】
実施例１
５gの単離されたグリシニンは、５０ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。５０ｍｇの真菌プロテアーゼ（２，２６０単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの５０ｍｇの真菌プロテアーゼが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡを最終濃度５％（w／v）まで添加することにより停止された。混合物は遠心分離され、上清は活性検査に使用された。ＩＣ５０値、ＡＣＥ活性がブタ肺ＡＣＥの５０％まで阻害される濃度は、４．４８μgＮ２当量であった。
【００４２】
実施例２
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。１０ｍｇのウシトリプシン（１６００単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１０ｍｇのウシトリプシンが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ腎臓ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、１８．３７μgＮ２当量であった。
【００４３】
実施例３
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。１０ｍｇのウシキモトリプシン（２，１６８単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１０ｍｇのウシキモトリプシンが添加され、３７℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ肺ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、２９．０μgＮ２当量であった。
【００４４】
実施例４
５００ｍgの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解され、５０℃において１０分間インキュベートされた。２２０単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃において4時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１００単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃においてさらに１２時間インキュベートされた。反応は、ＴＣＡを最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。ブタ肺ＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０値は、３３．５７μgＮ２当量であった。
【００４５】
実施例５
１００ｍgの単離されたグリシニンは、１ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において１０分間インキュベートされた。２ｍｇのウシキモトリプシン（２，１６８単位／ｍｇタンパク質）が添加され、３７℃において８時間インキュベートされた。これに続き、第二のアリコートの１００単位のショウガプロテアーゼが添加され、５０℃においてさらに５時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度５％まで添加することにより停止された。遠心分離された上清は、ＡＣＥ阻害ペプチド用のペプチド供給源として使用された。５０μＬの上清は７２％の阻害を示した。
【００４６】
実施例６
５００ｍｇの単離されたグリシニンは、２ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２中に溶解され、３７℃において５〜１０分間インキュベートされた。この段階において、２％（w／w）の真菌プロテアーゼ（２，２６０単位／ｍｇタンパク質）が添加され、１８時間インキュベートされた。反応は、１００％ＴＣＡ（w／v）を最終濃度１０％まで添加することにより停止され、氷冷され、１５，０００ｒｐｍで３０分間、４℃において遠心分離された。さらに、上清中に存在するペプチドは、Ｃ−１８シムパックカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび、０．０５％ＴＦＡを含有する水中の７０％ＣＨ３ＣＮの勾配を、０〜３５％にわたり、０．７ｍＬ／分の流速で使用して分離された。ペプチドは２２０ｎｍにおいて検出された。５つのペプチド分画（図２に示された）が集められ、ＡＣＥ阻害活性用に使用された。ペプチド分画２、３、および４は、各々６６、８１、および７５％の阻害を示した。
【００４７】
本発明の利点
１．上記のプロセス用の原料は、高い窒素溶解性をもつ脱脂大豆粉末であり、豊富に入手できる。
２．大豆の主要な貯蔵タンパク質、グリシニンは全タンパク質の２５〜３５％を占め、最小数の段階を用いて単離されることが可能である。
３．グリシニンのアミノ酸配列は既知である。グリシニンは、既知の配列内に潜在しているＡＣＥ阻害ペプチドの供給源である。
４．これらのペプチドは、種々の、かつ充分に定義された特異性をもつ様々なプロテアーゼにより、グリシニンから放出されることが可能である。こうした何杯ものペプチドは、インビトロにおけるブタ肺および腎臓ＡＣＥの強力な阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ａ）典型的なＡＣＥ活性のクロマトグラム、およびｂ）加水分解物／ペプチド分画によるＡＣＥ阻害の典型的なクロマトグラムを表す。ＨＡ：馬尿酸、ＨＨＬ：ヒプリル・ヒスチジル・ロイシン。
【図２】グリシニンの真菌プロテアーゼ消化物のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱脂大豆粉末のグリシニンからの、アンギオテンシン変換酵素（Angiotensin converting enzyme、ＡＣＥ）阻害ペプチドの調製のためのプロセスであって、
（ａ）１０〜２５％溶液のグリシニンを緩衝液中に分散させること；
（ｂ）混合物を、蛋白質分解酵素（２〜４％w／v）を用いて、６．６〜８．２の範囲内のｐＨにおいて加水分解すること；
（ｃ）混合物を３７〜５０℃において１６〜１８時間にわたりインキュベートすること；
（ｄ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ−１００％）の添加により反応を停止すること；
（ｅ）混合物を約４〜８℃の温度において、１５〜２０，０００ｒｐｍで３０〜４０分間遠心分離すること；
（ｆ）ポリペプチドを含有するタンパク質加水分解物の混合物を得ること；および
（ｇ）ＡＣＥ阻害活性を有する２、３、＆４と呼ばれる活性ペプチド分画を、オクタデシルカラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび７０％アセトニトリルの直線勾配を用いて分離精製すること、
の段階を含むプロセス。
【請求項２】
段階（ａ）の緩衝液が、トリス−ＨＣｌおよびリン酸ナトリウムから選ばれる、請求項１のプロセス。
【請求項３】
段階（ａ）において、モル濃度が０．０５〜０．１Ｍの範囲内である、請求項１のプロセス。
【請求項４】
段階（ｂ）において、プロテアーゼがプロリンに対しＣ−末端を切断する特異性をもつ、請求項１のプロセス。
【請求項５】
タンパク質分解酵素が、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、ウシキモトリプシン、もしくは植物プロテアーゼから選ばれる真菌プロテアーゼ、またはショウガ（Zingiber officinale）からのプロテアーゼ、または上記の組み合せである、請求項５のプロセス。
【請求項６】
前記ポリペプチド分画がアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤としての使用である、請求項１のポリペプチド分画の使用。
【請求項７】
分画２、３および４のＡＣＥ阻害活性が、各々６６、８１および７５％である、請求項９の使用。
【請求項８】
インビトロのＡＣＥ阻害のＩＣ５０値が、５〜３９μｇＮ２当量の範囲内である、請求項９の使用。
【請求項１】
脱脂大豆粉末のグリシニンからの、アンギオテンシン変換酵素（Angiotensin converting enzyme、ＡＣＥ）阻害ペプチドの調製のためのプロセスであって、
（ａ）１０〜２５％溶液のグリシニンを緩衝液中に分散させること；
（ｂ）混合物を、蛋白質分解酵素（２〜４％w／v）を用いて、６．６〜８．２の範囲内のｐＨにおいて加水分解すること；
（ｃ）混合物を３７〜５０℃において１６〜１８時間にわたりインキュベートすること；
（ｄ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ−１００％）の添加により反応を停止すること；
（ｅ）混合物を約４〜８℃の温度において、１５〜２０，０００ｒｐｍで３０〜４０分間遠心分離すること；
（ｆ）ポリペプチドを含有するタンパク質加水分解物の混合物を得ること；および
（ｇ）ＡＣＥ阻害活性を有する２、３、＆４と呼ばれる活性ペプチド分画を、オクタデシルカラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡおよび７０％アセトニトリルの直線勾配を用いて分離精製すること、
の段階を含むプロセス。
【請求項２】
段階（ａ）の緩衝液が、トリス−ＨＣｌおよびリン酸ナトリウムから選ばれる、請求項１のプロセス。
【請求項３】
段階（ａ）において、モル濃度が０．０５〜０．１Ｍの範囲内である、請求項１のプロセス。
【請求項４】
段階（ｂ）において、プロテアーゼがプロリンに対しＣ−末端を切断する特異性をもつ、請求項１のプロセス。
【請求項５】
タンパク質分解酵素が、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、ウシキモトリプシン、もしくは植物プロテアーゼから選ばれる真菌プロテアーゼ、またはショウガ（Zingiber officinale）からのプロテアーゼ、または上記の組み合せである、請求項５のプロセス。
【請求項６】
前記ポリペプチド分画がアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤としての使用である、請求項１のポリペプチド分画の使用。
【請求項７】
分画２、３および４のＡＣＥ阻害活性が、各々６６、８１および７５％である、請求項９の使用。
【請求項８】
インビトロのＡＣＥ阻害のＩＣ５０値が、５〜３９μｇＮ２当量の範囲内である、請求項９の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５１３７１６（Ｐ２００６−５１３７１６Ａ）
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６９９０２（Ｐ２００４−５６９９０２）
【出願日】平成１５年１２月３０日（２００３．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／０００４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６６４
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月３０日（２００３．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／０００４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６６４
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
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