アンギオテンシン変換酵素含有薬剤
細胞膜のＧＰＩアンカーを特異的に切断するアンギオテンシン変換酵素もしくはそのペプチダーゼ活性不活性化変異型酵素を含有し、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とする、プリオン性疾患、細菌感染疾患または不妊症等の予防または治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この出願の発明は、アンギオテンシン変換酵素を含有する薬剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とし、プリオン性疾患や細菌感染疾患、精子異常による不妊症等の予防または治療に有用な薬剤に関するものである。
【背景技術】
アンギオテンシン変換酵素［ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＡＣＥ。酵素学的にはジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）］は、レニン・アンギオテンシン・アルドステロン血圧制御系の一員で、アンギオテンシンＩを活性化型のアンギオテンシンＩＩに変換するとともに、ブラディキニンを分解不活性化することによって様々な生理活性の変化（例えば、血圧上昇）を生じさせることが知られている（非特許文献１）。このため、ＡＣＥ阻害を薬理作用とする薬剤（例えば、血圧降下剤）やＡＣＥ阻害剤等の発明が数多く存在する（例えば、特許文献１−４）。
一方、細胞の表面を構成する細胞膜はタンパク質と脂質を主成分とし、エネルギーの生産、刺激の伝達、細胞間相互作用、分泌などの多彩な生命機能を営む場である。ＧＰＩアンカー型タンパク質はＧＰＩアンカーを介して細胞膜に結合するその主要な構成成分であり、上記の生命機能維持の一翼を担っている重要な分子群である。しかし他方で、細胞膜のＧＰＩアンカーには正常型プリオンタンパク質が結合しており、この正常型プリオンに異常型プリオンが結合するとクロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｒｅｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｅｌｅ症候群・クルー病等のいわゆる「プリオン性疾患」の原因となる。また、ＧＰＩアンカーに結合するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）受容体ＣＤ１４には菌体毒素ＬＰＳが結合し、細胞障害の原因となっている。
さらに、哺乳類の精子−卵子透明体の結合による受精成立時において、精子細胞膜のＧＰＩアンカーに結合したタンパク質（マウスの事例ではＰＨ−２０やＴＥＰＳ５等、非特許文献２および３）の遊離が必須であるが、ＧＰＩアンカーからそれらタンパク質の切り離しを行う機能が欠損した異常精子を持つ雄性不妊症が知られている。
従って、プリオン性疾患や細菌感染、精子異常による不妊症等に対する症状の緩和や治療においては、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることが有効である。ＧＰＩアンカー切断活性（ＧＰＩａｓｅ活性）を示すタンパク質としては、哺乳類においては、唯一ＧＰＩ−ＰＬＤが知られている。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＤは細胞内でＧＰＩ−ＰＬＤを発現する場合に限って、ＧＰＩａｓｅ活性を示すことが、培養細胞を用いた研究により報告されている（非特許文献４）。すなわちＧＰＩａｓｅ活性の医薬への利用という観点から、外来性のＧＰＩ−ＰＬＤは有効に作用した事例がない。
なお、ＡＣＥはアンギオテンシンＩおよびブラディキニン以外の基質、例えばエンケファリン、ならびにヘプタペプチドおよびオクタペプチドのエンケファリン前駆体を切断する。また、トリデカペプチド、ニューロテンシンをジペプチドおよびウンデカペプチドに加水分解し、さらにはサブスタンスＰを切断不活性化することが知られている（非特許文献５）。しかしながら、ＡＣＥがＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞表面からＧＰＩアンカータンパク質から切断遊離することは、従来、全く知られていない。
特許文献１：特開平１０−０３６３９１号公報
特許文献２：特開２００１−０６４２９９号公報
特許文献３：特開２００１−２３３７８９号公報
特許文献４：特開２００２−１３８１００号公報
非特許文献１：Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：６４１−６４７，１９９１
非特許文献２：Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６９７６−１６９８４，２００２
非特許文献３：Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５：１１５７−１１６３，１９９４
非特許文献４：Ｔｕｊｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：７３７−７４７，１９９８
非特許文献５：Ｓｋｉｄｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｔｕｒｎｅｒ ＡＪＥｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ，１９８９
【発明の開示】
この出願の発明者は、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を有する物質を探索し、この物質がアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）であることを見出した。
この発明は、発明者による以上のとおりの新規な知見に基づくものであり、有害なＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることによって各種疾患を予防または治療するための新規薬剤を提供することを課題としている。
さらに、従来ＡＣＥは既知の生理活性（たとえば血圧上昇などをおこすペプチダーゼ活性）が有害であることから、それを抑制するための研究が多様に行われてきていた。ＡＣＥを実用的薬剤として提供するにあたり、この出願の発明者は有害なペプチダーゼ活性を抑制し、目的とするＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性のみを有効に利用しうるＡＣＥを提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、アンギオテンシン変換酵素を含有し、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とするアンギオテンシン変換酵素含有薬剤を提供する。
この発明の薬剤は、好ましくは、プリオン性疾患、細菌感染疾患または精子異常による不妊症の予防または治療用としての薬剤である。
この発明の薬剤の一つの態様は、含まれるアンギオテンシン変換酵素が、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型酵素、好ましくはそのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異酵素、さらに好ましくはそのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異型酵素を含む薬剤である。
この出願はまた、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素を提供する。
この変異型酵素は、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基、好ましくはＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素である。
この発明において、「ＧＰＩアンカー型タンパク質」とは、細胞膜のＧＰＩアンカーに結合するタンパク質であり、例えば、プリオン性疾患に関係する正常型または異常型プリオン、菌体毒素ＬＰＳの受容体ＣＤ１４等である。
「ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させる」とは、細胞膜のＧＰＩアンカーに結合しているＧＰＩアンカー型タンパク質をＧＰＩアンカーから切断分離させて、不活性化させることを意味する。これによって、例えばＧＰＩアンカー型タンパク質である正常型プリオンが細胞膜から遊離され、正常型プリオンに結合してプリオン性疾患の原因となる異常型プリオンが細胞膜に結合することが防止される。また、菌体毒素ＬＰＳの受容体ＣＤ１４が細胞膜から遊離されるため、膜型ＣＤ１４−ＬＰＳ複合体の形成が阻害され、ＬＰＳによる細胞障害や炎症反応の拡大が防止または改善される。
「プリオン性疾患」は、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｒｅｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｅｌｅ症候群、クルー病等である。
「細菌感染疾患」は、例えば、グラム陰性菌（大腸菌、インフルエンザ桿菌、サルモネラ菌、髄膜炎菌、緑膿菌等）による感染症であり、またそれらの細胞毒によるエンドトキシンショック等の炎症性疾患等である。
「精子異常による不妊症」は、たとえばＴＥＰＳ５やＰＨ−２０等の精子細胞膜表面に存在するＧＰＩアンカー型タンパク質を、卵との会合時に遊離できないことによる受精不成立を特徴とする精子異常を示す雄性の不妊症である。
なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５）等に記載されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣における蛍光局在化を観察した顕微鏡像である。ＥＧＦＰ−ＧＰＩの生殖細胞（Ｇｃ）発現は第２系統（Ｌａｎｅ２）マウスに見られたが、第１（示さず）および第３系統マウスには見られなかった。Ｌｙはライディヒ細胞。倍率は２００倍。
図２は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の溶解度を調べた電気泳動像である。界面活性剤を添加した溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４＋）または界面活性剤非添加の溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４−）を用いて組織を可溶化し、溶解産物の一部をウエスタンブロット解析した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩが界面活性剤非存在下で積極的に可溶化したのは、第２系統マウスの精巣においてのみであった。水溶性タンパク質の大きさ（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４−）が界面活性剤可溶性の膜アンカータンパク質（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４＋）と同等であった点は特記すべきである。Ｆ９はＦ９トランスフェクタント、ＮＴｇは対照としての非トランスジェニックである。
図３は、連続液体クロマトグラフィーにより精製されたＧＰＩアンカータンパク質遊離活性を示す分子。ＴＳＫ ｇｅｌ ３０００ＳＷゲルろ過カラムから溶出したピーク分画（Ｆｒａｃ．）より、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって、１００ｋＤａの単一バンドとして単離された。
図４は、精製組換えＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）市販製品（ＡＣＥ−Ｓ）、ＰＩ−ＰＬＣおよびバッファーのみと反応させたＰＬＡＰのイムノブロッティング。Ｉｎｐｕｔは反応の基質である。
図５は、ＡＣＥ反応の用量依存性を測定した結果である。部分精製したＰＬＡＰを様々な濃度のＡＣＥ−Ｓと反応させ、水溶相のＰＬＡＰ活性を測定した。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。０ｍＵ／ｍｌを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．０５である。最下段は１０−３Ｍカプトプリルを添加した場合の反応である。
図６は、ＡＣＥと反応させたＰＬＡＰのイムノブロッティングによるＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性の測定結果である。Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性中心のＧｌｕ４１４をＡｓｐに置換した変異体ＡＣＥ、ＷＴは野生型のＡＣＥ−Ｔ。ＢｕｆｆｅｒはＰＬＡＰをバッファーのみと反応させた対照。活性のユニット数は表．１に示す方法で求めた。Ｉｎｐｕｔは反応の基質である。
図７は、ペプチダーゼ活性（Ｐａｓｅ）の測定結果。Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性中心のＧｌｕ４１４をＡｓｐに置換した変異体ＡＣＥ、ＷＴは野生型のＡＣＥ−Ｔ。活性測定手順はＫａｓａｈａｒａ ａｎｄ Ａｓｈｉｈａｒａ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２７：１９２２−１９２５に記載された測定方法に従った。
図８は、ｆｉｌｉｐｉｎ前処理（右）または非処理（左）条件下で、ＥＧＦＰ−ＧＰＩをトランスフェクションしたＦ９細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓにより処理し、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンの細胞表面発現をＦＡＣＳ分析した結果である。ｆｉｌｉｐｉｎ処理後にはＧＰＩアンカータンパク質の発現は減少していたが（細胞数の左シフト）、膜貫通型Ｅ−カドヘリンは減少していないことが分かり、またそれらの程度は異なっていた（遊離％：ＥＧＦＰ−ＧＰＩは５３％、Ｓｃａ−１は６７％、Ｔｈｙ−１は３４％）。ａはＡＣＥ（−）、ｂはＡＣＥ（＋）、ｃはＰＩ−ＰＬＣ処理を行ったもの。各ラインの数値は中央値（Ｍｅａｎ）である。
図９は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞へＡＣＥまたはＰＩ−ＰＬＣ処理を行った場合に観察されるＧＦＰ蛍光の顕微鏡写真。ＡＣＥはＥＧＦＰ−ＧＰＩを細胞表面から切断している。ゴルジ体のＧＦＰ蛍光は減衰していない。倍率２００倍。「ＰＢＳ」はＡＣＥおよびＰＩ−ＰＬＣＸ未処理の対照である。
図１０は、ＨｅＬａ細胞をｆｉｌｉｐｉｎ前処理（右）または非処理（左）で、１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＳ−Ｓまたは２．８Ｕ／ｍｌのＰＩ−ＰＬＣを用いて処理し、細胞表面のＣＤ５９およびＤＡＦの発現をＦＡＣＳ分析した結果である。ＡＣＥ処理によってタンパク質の発現は減少したが（細胞数の左シフト）、その程度は異なっていた（ＣＤ５９は６６％、ｆｉｌｉｐｉｎ処理後のＤＡＦは５８％）。
図１１上図は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）を結合したＨＥＫ２９３細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓにより処理し、プリオンタンパク質の遊離をＦＡＣＳ分析した結果である。下図は、対照としてＣＤ５９の遊離を分析した結果である。
図１２はｆｉｌｉｐｉｎ処理を行ったＨｅＬａ細胞を様々な濃度のＡＣＥ−Ｓ存在下でインキュベートし、ＣＤ５９の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析し、遊離％を算出した結果である。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。０Ｕ／ｍｌを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．００５、＊＊：ｐ＜０．０１である。
図１３はｆｉｌｉｐｉｎ処理したＨｅＬａ細胞を、表示されたカプトプリル用量の存在下、１０−７ＭのＡＣＥペプチドに相当する０．２Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓと共にインキュベートし、ＣＤ５９の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析した結果である。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。カプトリル０Ｍを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．０５である。
図１４は、各種の細胞におけるＡＣＥの各種タンパク質の遊離活性を比較した。図８、図１０および図１１の結果の要約となる。ＡＣＥは膜タンパク質であるＥ−カドヘリンを除き、様々な内在性ＧＰＩアンカー型タンパク質を切断放出する。ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞ではＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンを、ＨｅＬａ細胞ではＣＤ５９およびＤＡＦを、ＨＥＫ２９３細胞ではＣＤ５９とプリオンタンパク質（ＰｒＰ）をそれぞれＦＡＣＳ分析で解析した。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。ＮＤは未測定である。
図１５は、遊離タンパク質中に含まれるＧＰＩアンカー型断片の同定。ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞を３２Ｐリン酸もしくは３Ｈエタノールアミンで代謝ラベルし、フィリピンを処理を行った後に、ＡＣＥ−Ｓ、ＰＩ−ＰＬＣまたはｍＧＫ（マウス腺性カリクレイン）による処理を行った。遊離されたＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質を抗ＧＦＰ抗体で精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。遊離したＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の総量はＥＧＦＰイムノブロットによる検出バンドの強度により求めた。また放射線解析では矢印で示した部分で同一のバンドが確認された。タンパク質重量あたりの放射線強度を計算し、ＡＣＥ処理サンプルを１．０として遊離したタンパク質に含まれるそれぞれの標識化合物の相対量として表示した。ＡＣＥ処理サンプルではＲａｐｉｄ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｂａｎｄがいくつか認められるが、これはＦ９細胞中に存在する何らかの酵素による切断によるものである。
図１６は、ＧＰＩアンカー糖鎖骨格におけるリン酸およびエタノールアミンの結合部位、およびＰＩ−ＰＬＣ、ＧＰＩ−ＰＬＤ、ｍＧＫの切断部位を示した模式図である。Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮｃはグルコサミン、Ｉｎｏはイノシトール、黒い太線は脂肪鎖を示す。
図１７は、正常マウスおよびＡＣＥノックアウトマウス精巣上体由来の精子を、水溶性画分Ｘすなわちアクロソームのなどの水溶性成分（ＷＳ）と、細胞膜を構成するタンパク質などの界面活性剤可溶性（難水溶性）画分（ＤＳ）に分配し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、それぞれの抗体を用いてイムノブロットを行った。アクロシンおよびファーティリンβは、ともに精子Ｘに存在し、それぞれＷＳ、ＤＳの指標タンパク質として用いた。理由は不明だが、ＡＣＥノックアウトマウス精子ではファーティリンβの発現が正常マウス精子での発現にくらべて低くなっている。＋／＋は正常精子、−／−はＡＣＥノックアウト精子を示す。
図１８は、ＡＣＥノックアウトマウス精子に対して、様々な処理を行ったのちに精子を卵（透明体）へ結合させた顕微鏡写真。倍率は２００倍。前処理に使用した物質はそれぞれの写真に示した。ＡＣＥ−ＷＴは野生型ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性を不活性化させた変異体ＡＣＥ、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ＰはＰＩ−ＰＬＣの阻害剤である。Ｂｕｆｆｅｒは前処理にバッファーを用いる対照実験である。
図１９は、図１８における卵に結合した精子の数をグラフ化したものである。値は平均±ＳＥ（標準誤差）で、平均値をグラフ上に数値で示した。凡例は図１８に同じである。それぞれの実験を行った卵子の数はそれぞれ、Ｂｕｆｆｅｒが１８、ＡＣＥ−ＷＴが２０、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄが１７、ＰＩ−ＰＬＣが１８、ＰＩ−ＰＬＣ＋Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐは１８、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐが１７である。ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、対照実験（Ｂｕｆｆｅｒ）と比較して、＊：Ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１である。またＡＣＥ−ＷＴとＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄ間ではＰ＜０．３、ＡＣＥ−ＷＴとＰＩ−ＰＬＣ間ではＰ＜０．５、ＰＩ−ＰＬＣとＰＩ−ＰＬＣ＋Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐ間ではＰ＜０．０５であった。これとは別個に行った実験でも同様の結果を得た。
【発明を実施するための最良の形態】
この発明において使用するＡＣＥは、ヒトをはじめとする各種哺乳動物の細胞（体細胞や精巣細胞）から公知の方法によって単離することができる（体細胞型ＡＣＥ−Ｓ、精巣型ＡＣＥ−Ｔ）。また、市販品（例えば、ウサギ肺由来のＡＣＥ−Ｓ：Ｓｉｇｍａ Ａ−６７７８等）や、特表２００２−５２５１０８号公報に開示されているアンギオテンシン変換酵素相同物を使用することもできる。さらに、このＡＣＥは各種の動物から単離されたものがそれぞれのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ配列）と共に以下のとおりに知られている。すなわち、ヒトＡＣＥ−Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｊ０４１４４）、ヒトＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ２６６５７）、ヒトＡＣＥアイソフォーム３前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１５２８３１）、ヒトＡＣＥアイソフォーム２前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１５２８３０）、ヒトＡＣＥアイソフォーム１前駆体（ＮＭ＿０００７８９）、ヒトＡＣＥ様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０２１８０４）、マウスＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００９５９８）、マウスＡＣＥ−Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＸＭ＿１１０９３６）、ラットＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１２５４４）、ラット肺由来ＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１２５４４）、ラットＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ５３９４２５）、ウサギＡＣＥ−Ｔ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｐ２２９６８）、ウサギＡＣＥ−Ｓ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｐ１２８２２）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｑ１０７５１）、ウシＡＣＥ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／１９１９２４２Ａ）、イエバエＡＣＥ前駆体（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／１０７１５）、ショウジョウバエＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１６５０７０）等である。従って、この発明で使用するＡＣＥは、前記の公知アミノ酸配列に基づいて公知の固相ペプチド合成法により化学合成して作製することもできる。あるいは、ＡＣＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系や適当な宿主−ベクター系で発現させることによって、組換えＡＣＥとして取得することができる。ポリヌクレオチド（例えばＡＣＥ ｃＤＮＡ）は前記ＧｅｎＢａｎｋデータベースや特表２００２−５２５１０８号公報の塩基配列情報に基づき作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の方法により取得することができる。
例えば組換えＡＣＥをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳で作製する場合には、前記ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７ １８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。
組換えＡＣＥを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組換えた発現ベクターを作成し、培養物から融合ペプチドを単離する。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
また組換えＡＣＥを真核細胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、融合ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ＰＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、目的とするタンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。
発現ベクターを宿主細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
融合ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から組換えＡＣＥを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
またこの発明において使用するＡＣＥは、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性（血圧上昇等のペプチダーゼ活性）を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型ＡＣＥであってもよい。すなわち、ＡＣＥは血圧制御因子として働き、血圧上昇を引き起こす。そのためＡＣＥを投与した場合には、その主作用としてのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離とともに、副作用としての血圧上昇等を引き起こす危険性がある。この発明の変異型ＡＣＥは、１または複数のアミノ酸残基を欠失または付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換することによって、目的とする主作用を保持したまま、好ましくない副作用を低減または消失させることを可能とする。
変異型ＡＣＥは、公知のＡＣＥアミノ酸配列（例えば配列番号４）に基づき、公知の固相ペプチド合成法（例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｉｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）に従って様々な変異型ペプチドを作製し、あるいは変異導入型のＰＣＲ法や公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５およびＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５４：３６７，１９８７）に従って作製した変異型ポリヌクレオチドを適当な宿主ベクター系で発現させることによって様々な変異型ペプチドを作製し、後記の試験方法によってそのペプチダーゼ活性およびＧＰｌａｓｅを試験することによって、目的とする変異型を得ることができる。
従って、変異型ＡＣＥのアミノ酸変異導入部位は適宜に設計することができるが、この発明では、その一例として、ＡＣＥアミノ酸配列におけるＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列（配列番号４の４１３−４１７位）のいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型ＡＣＥを好ましいものとして例示する。すなわちこの配列領域は、ＡＣＥのペプチダーゼ活性に必須なＺｎの配位に深く関係する配列であり、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ）、鳥類（ニワトリ）、昆虫（ハエ）など、現在報告されているＡＣＥにおいて、ＡＣＥ−ＴおよびＡＣＥ−Ｓ問わず、ほぼ完全に保存されている。そしてこの発明においては、特に好ましい変異型ＡＣＥとして、Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異型ＡＣＥ（以下「ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）」と記載することがある）を提供する。
この発明の薬剤は、実施的にＡＣＥ単独であってもよいが、疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて、薬剤的に許容される担体と混合して調製することが好ましい。すなわち、この発明の薬剤は、非経口的または経口的な投与に適した剤型となるような担体と混合することができる。
非経口投与は、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注、直腸投与等であり、例えば注射剤としての製剤化する場合の担体としては、滅菌水、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物等を使用することができる。また緩衝剤ｐＨ調節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等））等の製薬補助剤を含有することもできる。このように製剤化した薬剤は、細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤、または懸濁剤やシロップ剤のような経口液体調製物等）に製剤化する。担体としては、常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を使用することができる。ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加することもできる。また錠剤は常法によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶液またはドライプロダクトにすることができる。そのような経口液剤は常用の添加剤、例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。
ＡＣＥの含有量は対象疾患やその投与形態に応じて適宜とすることができるが、通常は５〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。
この発明の薬剤の投与量は、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なるが、ＡＣＥ量として１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度とすることができる。なお、ＡＣＥは人体に存在するタンパク質であり、その安全性については問題がない。
【実施例】
以下、実施例としてＡＣＥ活性について試験した結果を記載し、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
１．材料と方法
１．１．組織学的分析
ＧＰＩアンカーＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＧＰＩ）遺伝子導入マウス（Ｋｏｎｄｏｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．４５８，２９９−３０３，１９９９）をフェノバルビタールにより麻酔し、左心室経由で４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒド−ＰＢＳを潅流させることにより固定した。切除した組織を４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で再度固定し、２０％スクロース−ＰＢＳ中で４℃で４８時間にわたりインキュベートした。次に組織断片をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に埋め込み、ドライアイスで急速冷凍し、低温槽上で５−１０μｍ厚に切断した。標本の調査は、ＧＦＰ特異的フィルタを用いた蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて行った。
１．２．破砕細胞サンプルの調製
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭ プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）存在下、氷冷状態のＴＮＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で細胞と組織を超音波破砕に続いてポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートは１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を収集した（水溶性分画）。沈殿はＴＮＥ緩衝液中で洗浄し、次に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（Ｎａｃａｌａｉｔａｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）−ＴＮＥ溶液中、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤の存在下でホモジナイズを行い、１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を収集した（界面活性剤可溶性分画）。精子サンプルは破砕前にＴＹＨ培地に１時間おいて受精能獲得処理を行った。
１．３．イムノブロット
各組織の両方の分画を非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に転写し、抗ＧＦＰ（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）、ＰＬＡＰ（Ｂｉｏｍｅｄａ）、抗ＴＥＰＳ５、および抗ＰＨ−２０それぞれのウサギポリクローナル抗体、および抗ファーティリンβマウスモノクローナル抗体によるプローブ処理を行い、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｔａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）を用いて染色の検出を行った。
１．４．ＰＬＡＰ変換アッセイ
非イオン化界面活性剤のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４が、３７℃の条件で水溶性分子と界面活性剤可溶性の疎水性分子を分配する性質を利用した。ＰＬＡＰ変換アッセイを用いて、精製途中におけるＧＰＩアンカータンパク質遊離活性のモニタリングを行った。ＰＬＡＰは、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡを発現させて緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤）により抽出することにより調製し、３７℃で分配した後で界面活性剤可溶性の相を収集した。次にＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（溶出バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配）、抗−ＰＬＡＰ抗体カラム（抗体：ウサギポリクロナール抗−ＰＬＡＰ抗体（Ｂｉｏｍｅｄａ）；カラム：Ｈｉｔｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；溶出バッファー：１００ｍＭ グリシンｐＨ２．８）でＰＬＡＰを精製した。界面活性剤可溶性のＰＬＡＰタンパク質を基質に用いてアッセイを行った。ＰＬＡＰ活性の測定は、アルカリホスファターゼ検出キット（Ｎａｃａｌａｉ ｔａｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ）を用いて製造元のプロトコルに従って行った。変換反応は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ＵのＰＬＡＰの条件で、９０分にわたり３７℃で実施した。反応停止はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を最終濃度２％となるように添加することで行い、試料を２５℃で微小遠心分離した。水溶相を収集し、ＰＬＡＰ活性を測定した。またこれはポリクローナル抗−ＰＬＡＰ抗体を用いたイムノブロッティングにも用いた（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）。
１．５．ＧＰＩアンカータンパク質遊離活性物質の精製
成熟したＩＣＲマウスの精巣５００個を莢から出し、カミソリを用いて〜１ｍｍ３の断片に切断した。生殖細胞の単離はピペット吸引の反復により行った。軽い遠心により輸精管を除去した後、上清を収集し、１５００×ｇで遠心分離することによりさらに沈降させた。沈殿は１０倍量の緩衝液（３ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤を含む）中で破砕および超音波処理を行い、ホモジネートを１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。その沈殿を１０倍量の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤を含む）中で可溶化した。溶解産物は超遠心（１００，０００×ｇ）で１時間にわたり分離を行い、上清を収集した。この試料を以下の連続液体クロマトグラフィーにより精製した。
（１）ＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｅｉｋａｇａｋｕｋｏｇｙｏ，Ｔｏｋｙｏ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配）で溶出。
（２）フェニルセファロースＸ ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）：緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で溶出。
（３）ＣｏｎＡ−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕｋｏｇｙｏ，Ｔｏｋｙｏ）で溶出。
（４）ＴＳＫゲル３０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出。
１．６．プロテオミクス分析
精製ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲル中でトリプシンまたは０．１Ｍ臭化シアンを含む７０％ホルマリン溶液で消化し、キャピラリーＨＰＬＣ（Ｍａｇｉｃ）およびイオン捕集マススペクトル分析（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）に供した。それぞれの得られたシグナルに対してＳｅｑｕｅｓｔおよびＭａｓｃｏｔ検索を行った。Ｓマススペクトルで識別されたペプチドはトリプシン消化逆相ＨＰＬＣで分離後、ある程度の量を供出してオートマチックペプチドシーケンサーで同定した。
１．７．細胞培養とトランスフェクション
Ｆ９、ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞を、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地中で培養した。ＤＮＡトランスフェクションにはリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）を製造元のプロトコルに従って使用した。
１．７．ＡＣＥ試料
ＡＣＥ ｃＤＮＡを、マウス精巣ｃＤＮＡをテンプレートとして、’５−ｔｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃａａｇｇｔｔｇｇｇｃｔａｃｔｃｃａｇｇ−’３（配列番号１）および’５−ｇａａｔｔｃｇｃａｃｔｔａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃｃｔｔａｔａａｔｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｔａｃａｇｇｃ−’３（配列番号２）のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにより調製した。このＰＣＲ産物は、ＦＬＡＧを付加した可溶性精巣ＡＣＥのアイソフォームをコードしている。グルタミン酸４１４をアスパラギン酸へアミノ酸置換によりペプチダーゼ活性を不活性化した変異タンパク質のｃＤＮＡは、変異導入プライマーとして、’５−ｃｔｔｇｇｔｇａｔａｇｃｇｃａｃｃａｃｇａｔａｔｇｇｇｃｃａｃａｔｃｃａｇｔａｔｔｔｃａｔｇｃａ−’３（配列番号３）を用いた部位特異的変異誘発により合成した。ｃＤＮＡの発現にはＣＡＡＧベクターを利用した。このＡＣＥ ｃＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養上清を収集し、組換えＡＣＥを抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アガロースアフィニティカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて精製した。また、ウサギ肺由来ＡＣＥの体細胞アイソフォーム（ＡＣＥ−Ｓ）（ＳｉｇｍａＡ−６７７８）を、製造業者の支持する活性単位で使用した。ＡＣＥのペプチダーゼ活性は公知の方法（Ｋａｓａｈａｒａ ａｎｄ Ａｓｈｉｈａｒａ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２７：１９２２−１９２５，１９８１）で行った。
１．９．ＦＡＣＳ分析
０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて細胞を培養皿から剥離させ、１％ＢＳＡを含むＨａｎｋ’ｓ調整塩溶液に数回浸した。懸濁した細胞を、適切な時点で１０μｇ／ｍｌのフィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ）／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて０℃で１時間にわたり処理した。ＰＢＳに浸した後、細胞をＡＣＥまたは１．０ＩＵ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣ（ＧＬＹＫＯ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ）またはＰＢＳのみで、カプトプリル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の存在下または非存在下の条件で、３７℃で１時間にわたり処理を行った。次に細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに繰り返し浸し、ヒトＣＤ５９、ヒトＤＡＦ、マウスＳｃａ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）、マウスＴｈｙ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）、マウスＥ−カドヘリン（宝酒造）、ヒトプリオンタンパク質（３Ｆ４，ＳｉｇｎｅｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するビオチン共役抗体を用いて染色し、次にフィコエリトリン共役ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて染色した。
また、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）の遊離活性は、ヒト胎児由来線維芽細胞（ＨＥＫ２９３細胞）および抗ヒトプリオンモノクローナル抗体３Ｆ４（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用し、前記と同様に染色した。
染色した細胞をＦＡＣＳｃａｎセルソーターに供した。ソートされた細胞の生存度を、ＦＳＣおよびＳＳＣチャンネルにより評価した。Ｆ９細胞内で発現したＥＧＦＰ−ＧＰＩは直接検出した。切断の定量はそれぞれの細胞における平均の蛍光発光強度より次式によって切断放出（％）を算出した。
切断放出（％）＝（ＡＣＥ（−）−ＡＣＥ（＋））／（ＡＣＥ（−）−ＰＩ−ＰＬＣ）
すなわち、ＰＩ−ＰＬＣ処理時の蛍光強度を最大値、ＡＣＥ（−）での蛍光強度を切断がないものとした。
１．１０．放射性標識分析
ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞を０．２ｍＣｉ／ｍｌの［３２Ｐ］−オルトリン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）もしくは０．１ｍＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−エタノールアミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１６時間処理し代謝による標識を行った。フィリピン処理を行った細胞を、０．５μＭ ＡＣＥ、１．０ＩＵ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣ、マウス腺性カリクレイン（ｍＧＫ：ＥＧＦＰをＣ末端近傍で切断する酵素）を含む顎下腺の１０％ライセートのいずれかで１時間３７℃で処理した。遊離したＥＧＦＰを抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の量は、デンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でのＥＧＦＰイムノブロットで検出されたＥＧＦＰ−ＧＰＩのバンド強度の測定、および同じバンドについて液体シンチレーションカウンタでの放射能測定により行った。
１．１１．精子−卵結合能測定
全ての生殖細胞ＴＹＨ培地中で取扱いおよび静置をおこなった。同腹の正常マウスおよびＡＣＥ欠損マウスから精巣上体を摘出し、２５０μｌの培地を加え刻んだ。精子を１５分間泳がせた後に、１．５ｍｌ培地に移し変え、すくなくとも１時間以上培養した。卵細胞は過排卵されたＣ５７ＢＬ／６マウスの卵管から採取し、ＴＨＹ培地で積層細胞を除去するために１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。培養した精子（約２．０×１０ ６個／ｍｌ）次の試薬で９０分、それぞれ処理した。野生型ＡＣＥ（ＡＣＥ−ＷＴ）０．２Ｕ／ｍｌ、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄ ０．２Ｕ／ｍｌ、ＰＩ−ＰＬＣ １．０ＩＵ／ｍｌ、４ｍＭイノシトールモノリン酸（Ｓｉｇｍａ）をふくむＰＩ−ＰＬＣ １．０ｍｌ、４ｍＭイノシトールモノリン酸のみ、またはＰＢＳバッファーのみ。生殖細胞はミネラルオイルで表面を覆ったＴＹＨ培地中で１時間インキュベートし、ＰＢＳで穏やかに４％洗浄後、パらホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、卵−精子結合能測定に供した。卵細胞は２００倍の光学顕微鏡（オリンパス）で観察し、卵子に集合してきた精子の数は、卵子の直径がもっとも大きく見える焦点にあわせてカウントした。
２．結果と考察
２．１．遺伝子導入マウスとそのＧＰＩタンパク質
図１は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣の蛍光シグナルを撮影した写真像である。生殖細胞（Ｇｃ）におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩの発現は第２系統（Ｌｉｎｅ２）に見られたが、第１および第３系統には見られなかった。
図２は、遺伝子導入動物の精巣におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の溶解度を解析した結果である。界面活性剤を添加した溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４＋）または界面活性剤非添加の溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４−）を用いて組織を可溶化し、溶解産物の一部をウエスタンブロッティングに供した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩが界面活性剤非存在下で積極的に可溶化したのは、第２系統の精巣においてのみであった。水溶性タンパク質の大きさ（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４−）が界面活性剤可溶性の膜アンカータンパク質（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４＋）と同等であった点は特記すべきである。
２．２．ＧＰＩアンカータンパク質放出因子の特定
ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスを用いて、ＧＰＩアンカー膜結合型タンパク質放出因子の同定を行い、目的の活性を有する１００ｋＤａタンパク質を精製した。すなわち、マウス精巣に由来する生殖細胞の膜リッチ分画を１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中で可溶化し、遠心分離を行って上清を取り、連続液体クロマトグラフィーによる分画に供した。溶出分画に対してＰＬＡＰ変換アッセイを行い、その最大値を表１に示す。なお、全ての反応はＰＩ−ＰＬＣ（１．０Ｕ／ｍｌ）処理を付随して行い、その値を最大反応として定義した。図３は、銀染色によるこの１００ｋＤａタンパク質の単一バンドを示す。
この精製タンパク質は、プロテオミクス分析によりＡＣＥであることを確認した。
さらにこの精製タンパク質活性を、組換えＡＣＥおよび市販品ＡＣＥと比較した。すなわち、組換えタンパク質および市販品ＡＣＥはＰＬＡＰを水溶性形態に変換するかを確かめるため、部分精製したＰＬＡＰを、精製組換えＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）または市販製品（ＡＣＥ−Ｓ）と反応させた。ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による分配後、水溶性相の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＬＡＰを免疫ブロッティングにより検出した。結果は図４に示した通りである。可溶性ＰＬＡＰに相当するバンドはＰＩ−ＰＬＣ処理を行った試料よりわずかに小さいが、ＡＣＥ−ＴおよびＡＣＥ−Ｓ処理サンプルの両方に見ることができる。
また、ＡＣＥ反応の用量依存性を。部分精製したＰＬＡＰを様々な濃度のＡＣＥ−Ｓと反応させ、水溶相のＰＬＡＰ活性を測定した。結果は図５に示したとおりである。この図５に示したとおり、市販品ＡＣＥにおいてもその活性は用量依存的であり、しかもこの活性は特異的なＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルによって阻害された。
ＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性の活性中心について、既知であるペプチダーゼ活性中心のＡｓｐ４１４をＧｌｕに置換した組替え体ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）を作成し、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性およびペプチダーゼ活性について測定を行った（図６、図７）。その結果、ペプチダーゼ活性は１／１０００以下に下がったの対して、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性は野生型とほとんど変わらなかった。このことよりＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を担当する活性中心は、ペプチダーゼ活性を示す部位とは別の場所に局在することが示唆された。
２．３．ＧＰＩアンカー型タンパク質に対するＡＣＥの作用
ＧＰＩアンカータンパク質に対するＡＣＥの活性を精査するため、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを細胞表面で安定に発現するＦ９細胞を使用し解析を行った。フィリピン前処理済みのおよび未処理のＥＧＦＰ−ＧＰＩ発現Ｆ９細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓまたは２．８Ｕ／ｍＩのＰＩ−ＰＬＣにより処理し、ＥＧＦＰ−ＧＰＩの動態をＧＦＰ蛍光の観察により、またＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンの細胞表面発現をＦＡＣＳ分析によりそれぞれ解析した。ＡＣＥはＥＧＦＰ−ＧＰＩの発現にほとんど影響しないが、フィリピン処理を行った細胞については、ＡＣＥ処理により細胞表面からＥＧＦＰ−ＧＰＩのほとんど全てを遊離させた（図８、９）。実際、ＧＰＩアンカー型タンパク質は細胞膜の脂質ラフトに局在化して包含されており、外来性のＡＣＥは脂質ラフトにより基質分子への会合が阻害されているように思われる。他のＧＰＩアンカー型タンパク質、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１も細胞のＡＣＥ処理によって同様に切断放出されることが確認された。これより、ＡＣＥおよびＰＩ−ＰＬＣは、膜貫通型タンパク質であるＥ−カドヘリンには何ら作用を及ぼさないいっぽうで、ＧＰＩアンカー型タンパク質に特異的に切断酵素活性を示すことが確認された。
さらに、ＨｅＬａ細胞上でＣＤ５９および解離促進因子（ＤＡＦ）の２種類のＧＰＩアンカー型タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞でプリオンタンパク質をそれぞれ分析対象とし、ＡＣＥによる切断活性を同様なＦＡＣＳ分析により調査した（図１０、１１）。その結果、これらＧＰＩアンカー型タンパク質がいずれも細胞膜上から切断放出されたことが確認された。さらに、ＨｅＬａ細胞でのＣＤ５９のＡＣＥの切断活性は、コレステロールブロッキング剤であるフィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ）を用いて膜脂質ラフトを崩壊させた場合により明確化し（図１０）、ＡＣＥ用量依存的であり（図１１）、またカプトプリルによる阻害された（図１２）。Ｆ９細胞の事例とは対照的に、ＡＣＥはヒト細胞上でＡＣＥは、フィリピン処理を行わずとも容易に細胞表面からＧＰＩアンカー型タンパク質を遊離させることが確認された（図１４）。
２．４．ＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性における基質切断部位の同定
ＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞をＰＬＡＰとともにＡＣＥ処理し、抗ＧＦＰ抗体カラムで遊離したＥＧＦＰ−ＧＰＩを精製し、トリプシン、臭化シアンもしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼを用いたＨＰＬＣ−マススペクトル解析でＣ末端の構造決定を何度か試みたところ、いずれもターゲットペプチドの捕集に失敗し構造決定が不可能であった。これより、遊離したＧＦＰ−ＧＰＩはＣ末端にＧＰＩアンカーの一部が繋がったままの構造であることが推測された。
そこで、ＧＰＩアンカーの特定部位を放射ラベルする［３２Ｐ］−リン酸、または［３Ｈ］−エタノールアミンを用いて、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞に代謝ラベルを行い、ＡＣＥ、ＰＩ−ＰＬＣ、ｍＧＫでそれぞれ処理したのちに遊離したタンパク質を、ＥＧＦＰイムノブロットにより検出し、検出されたバンドについてそれぞれの放射線強度を測定した（図１５）。分析は少なくとも４回行い、ほぼ同一の結果が得られた。ｍＧＫ処理では３２Ｐまたは３Ｈで放射ラベルされた遊離ＥＧＦＰ−ＧＰＩはどちらも検出されなかったが、ＡＣＥ処理およびＰＩ−ＰＬＣ処理ではどちらの放射ラベルも検出された。これよりＡＣＥ処理産物にはＧＰＩアンカー型タンパク質の構造の一部でも存在していることが示された。また、ＡＣＥ処理で遊離したタンパク質の放射線強度は、ＰＩ−ＰＬＣ処理の場合と比較してリン酸ラベルの場合で約１／３、エタノールアミンラベルの場合で約１／２の検出強度だった。図１６に示したように、ＧＰＩアンカー上ではラベルに用いた放射性同位元素は局在化しており、先の検出強度の差分よりＡＣＥの切断部位は既知のＰＩ−ＰＬＣの切断部位よりＧＰＩアンカー型タンパク質に近く、ＧＰＩアンカー骨格のアンカー型タンパク質が付加する末端に３つ連なっているマンノース付近であることが示唆された。
２．５．卵結合能を欠失した精子へのＡＣＥの作用の解析
ＡＣＥノックアウトマウスでは雄性不妊が認められる。ＡＣＥノックアウトマウスの精子は正常の精子と比較して、透明体（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）における精子−卵結合能が欠失していることが、ＸＫｒｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７５：１４６−１４８，１９９５で、報告されている。
受精時に精子から遊離される事が知られているＧＰＩタンパク質、ＴＥＳＰ５とＰＨ−２０（非特許文献３および４）を対象として、正常マウスおよびＡＣＥノックアウトマウス精巣上体由来の精子について、それぞれ水溶性成分（ＷＳ）および界面活性剤可溶性画分（ＤＳ）に分配し、イムノブロットで分析した（図１７）。精子から遊離した水タンパク質は可溶性画分に分配されるが、正常な精子の水溶性画分（ＷＳ）からはＴＥＳＰ５とＰＨ−２０の両タンパク質が検出され、ＡＣＥノックアウトマウスの精子では水溶性画分からはどちらも検出されなかった。この結果から、ＡＣＥはＧＰＩアンカー型タンパク質の放出に必須である可能性が示された。
さらに精子−卵結合におけるＡＣＥの影響の同定を試みた。前記の正常マウス、およびＡＣＥノックアウトマウス、それぞれの精巣上体由来の精子を、野生型ＡＣＥ、ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）、ＰＩ−ＰＬＣでそれぞれ処理し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの未受精卵に接種した。正常マウスの精子ではこの処理により受精能に何ら影響が見られなかったが、対照的に卵結合能を欠くＡＣＥノックアウトマウスの精子では、野生型ＡＣＥ、ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥのどちらのＡＣＥ処理においても、精子結合能が大きく回復した（図１８、図１９）。さらに、ＰＩ−ＰＬＣ処理の場合においても、ＸＰＩ−ＰＬＣに特異的な阻害剤イノシトールモノリン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐ）で（ＰＩ−ＰＬＣ処理を）阻害した場合を比較することによって、ＡＣＥノックアウト精子の卵結合能が回復することが明らかとなった。以上より、ＡＣＥのもつＧＰＩａｓｅ活性が、受精時における精子の卵結合能に決定的な形で関与していることが結論付けられた。
２．６．ＡＣＥのＧＰＩａｓｅ活性の特徴と利用
ＧＰＩアンカー切断活性（ＧＰＩａｓｅ活性）を示すタンパク質としては、哺乳類においては、唯一ＧＰＩ−ＰＬＤが知られている。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＤは細胞内でＧＰＩ−ＰＬＤを発現する場合に限って、ＧＰＩａｓｅ活性を示すことが、培養細胞を用いた研究により報告されている（Ｔｕｊｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：７３７−７４７，１９９８）。すなわちＧＰＩａｓｅ活性の医薬への利用という観点から、外来性のＧＰＩ−ＰＬＤは有効に作用した事例がない。一方で、ＡＣＥはヒトの培養細胞や組織に添加するだけで、細胞膜の構造を薬剤処理等で破壊することなく、容易にＧＰＩアンカー型タンパク質を能率的に遊離することができるという優れた特性をもつ。
ＡＣＥのＧＰＩａｓｅ活性の優れたもうひとつの特性は、そのＧＰＩアンカー切断部位である。図１６の模式図に示したＧＰＩアンカーの構造における切断部位は、成熟ＧＰＩアンカーにおいては、イノシトールのヒドロキシル基への脂肪酸付加（アシル化）がよく起こる。ＧＰＩ−ＰＬＤの切断部位はイノシトールの直近であるため（図１６およびＨａｇａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：２５５２−２５５７，１９９８）Ｘ切断できない。実際、アシル化が顕著な健全赤血球では、ＧＰＩ−ＰＬＤによって解離促進因子（ＤＡＦ）の切断ができない（Ｄａｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１３７６０−１３７６４，１９８９）。一方、ＡＣＥはＧＰＩ−ＰＬＤとは対照的にＧＰＩアンカーのアンカー型タンパク質結合末端側を切断するため、ＨｅＬａ細胞においてＤＡＦの遊離させたことからもイノシトールへの脂肪鎖付加による阻害を受けにくいことは明らかである。
さらに、ＧＰＩａｓｅ活性を示すタンパク質としてはバクテリア由来のＰＩ−ＰＬＣが知られているが、ＧＰＩａｓｅ活性をヒトに対する薬剤として使用する場合に、ＡＣＥはヒト体内に通常広く分布していることから、きわめて安全性が高いと考えられる。
またＡＣＥは血圧制御因子として働き、血圧上昇を引き起こす。そのためＡＣＥを阻害する薬理作用を持つ医薬品（血圧降下剤）やペプチダーゼ活性の阻害についての研究がすすめられてきた。ウサギ体細胞由来ＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｓ）およびマウス精巣由来ＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）の変異型ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）の試験結果は、ＡＣＥの副作用を制圧して、目的とする活性のみを利用することが可能であることを明確に示した。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることによって、プリオン性疾患、炎症性疾患、細菌感染性疾患、精子の卵結合能不足による雄性不妊症等を効果的に予防または治療することのできる薬剤が提供される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【技術分野】
この出願の発明は、アンギオテンシン変換酵素を含有する薬剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とし、プリオン性疾患や細菌感染疾患、精子異常による不妊症等の予防または治療に有用な薬剤に関するものである。
【背景技術】
アンギオテンシン変換酵素［ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＡＣＥ。酵素学的にはジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）］は、レニン・アンギオテンシン・アルドステロン血圧制御系の一員で、アンギオテンシンＩを活性化型のアンギオテンシンＩＩに変換するとともに、ブラディキニンを分解不活性化することによって様々な生理活性の変化（例えば、血圧上昇）を生じさせることが知られている（非特許文献１）。このため、ＡＣＥ阻害を薬理作用とする薬剤（例えば、血圧降下剤）やＡＣＥ阻害剤等の発明が数多く存在する（例えば、特許文献１−４）。
一方、細胞の表面を構成する細胞膜はタンパク質と脂質を主成分とし、エネルギーの生産、刺激の伝達、細胞間相互作用、分泌などの多彩な生命機能を営む場である。ＧＰＩアンカー型タンパク質はＧＰＩアンカーを介して細胞膜に結合するその主要な構成成分であり、上記の生命機能維持の一翼を担っている重要な分子群である。しかし他方で、細胞膜のＧＰＩアンカーには正常型プリオンタンパク質が結合しており、この正常型プリオンに異常型プリオンが結合するとクロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｒｅｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｅｌｅ症候群・クルー病等のいわゆる「プリオン性疾患」の原因となる。また、ＧＰＩアンカーに結合するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）受容体ＣＤ１４には菌体毒素ＬＰＳが結合し、細胞障害の原因となっている。
さらに、哺乳類の精子−卵子透明体の結合による受精成立時において、精子細胞膜のＧＰＩアンカーに結合したタンパク質（マウスの事例ではＰＨ−２０やＴＥＰＳ５等、非特許文献２および３）の遊離が必須であるが、ＧＰＩアンカーからそれらタンパク質の切り離しを行う機能が欠損した異常精子を持つ雄性不妊症が知られている。
従って、プリオン性疾患や細菌感染、精子異常による不妊症等に対する症状の緩和や治療においては、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることが有効である。ＧＰＩアンカー切断活性（ＧＰＩａｓｅ活性）を示すタンパク質としては、哺乳類においては、唯一ＧＰＩ−ＰＬＤが知られている。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＤは細胞内でＧＰＩ−ＰＬＤを発現する場合に限って、ＧＰＩａｓｅ活性を示すことが、培養細胞を用いた研究により報告されている（非特許文献４）。すなわちＧＰＩａｓｅ活性の医薬への利用という観点から、外来性のＧＰＩ−ＰＬＤは有効に作用した事例がない。
なお、ＡＣＥはアンギオテンシンＩおよびブラディキニン以外の基質、例えばエンケファリン、ならびにヘプタペプチドおよびオクタペプチドのエンケファリン前駆体を切断する。また、トリデカペプチド、ニューロテンシンをジペプチドおよびウンデカペプチドに加水分解し、さらにはサブスタンスＰを切断不活性化することが知られている（非特許文献５）。しかしながら、ＡＣＥがＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞表面からＧＰＩアンカータンパク質から切断遊離することは、従来、全く知られていない。
特許文献１：特開平１０−０３６３９１号公報
特許文献２：特開２００１−０６４２９９号公報
特許文献３：特開２００１−２３３７８９号公報
特許文献４：特開２００２−１３８１００号公報
非特許文献１：Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：６４１−６４７，１９９１
非特許文献２：Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６９７６−１６９８４，２００２
非特許文献３：Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５：１１５７−１１６３，１９９４
非特許文献４：Ｔｕｊｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：７３７−７４７，１９９８
非特許文献５：Ｓｋｉｄｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｔｕｒｎｅｒ ＡＪＥｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ，１９８９
【発明の開示】
この出願の発明者は、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を有する物質を探索し、この物質がアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）であることを見出した。
この発明は、発明者による以上のとおりの新規な知見に基づくものであり、有害なＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることによって各種疾患を予防または治療するための新規薬剤を提供することを課題としている。
さらに、従来ＡＣＥは既知の生理活性（たとえば血圧上昇などをおこすペプチダーゼ活性）が有害であることから、それを抑制するための研究が多様に行われてきていた。ＡＣＥを実用的薬剤として提供するにあたり、この出願の発明者は有害なペプチダーゼ活性を抑制し、目的とするＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性のみを有効に利用しうるＡＣＥを提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、アンギオテンシン変換酵素を含有し、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とするアンギオテンシン変換酵素含有薬剤を提供する。
この発明の薬剤は、好ましくは、プリオン性疾患、細菌感染疾患または精子異常による不妊症の予防または治療用としての薬剤である。
この発明の薬剤の一つの態様は、含まれるアンギオテンシン変換酵素が、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型酵素、好ましくはそのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異酵素、さらに好ましくはそのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異型酵素を含む薬剤である。
この出願はまた、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素を提供する。
この変異型酵素は、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基、好ましくはＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素である。
この発明において、「ＧＰＩアンカー型タンパク質」とは、細胞膜のＧＰＩアンカーに結合するタンパク質であり、例えば、プリオン性疾患に関係する正常型または異常型プリオン、菌体毒素ＬＰＳの受容体ＣＤ１４等である。
「ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させる」とは、細胞膜のＧＰＩアンカーに結合しているＧＰＩアンカー型タンパク質をＧＰＩアンカーから切断分離させて、不活性化させることを意味する。これによって、例えばＧＰＩアンカー型タンパク質である正常型プリオンが細胞膜から遊離され、正常型プリオンに結合してプリオン性疾患の原因となる異常型プリオンが細胞膜に結合することが防止される。また、菌体毒素ＬＰＳの受容体ＣＤ１４が細胞膜から遊離されるため、膜型ＣＤ１４−ＬＰＳ複合体の形成が阻害され、ＬＰＳによる細胞障害や炎症反応の拡大が防止または改善される。
「プリオン性疾患」は、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｒｅｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｅｌｅ症候群、クルー病等である。
「細菌感染疾患」は、例えば、グラム陰性菌（大腸菌、インフルエンザ桿菌、サルモネラ菌、髄膜炎菌、緑膿菌等）による感染症であり、またそれらの細胞毒によるエンドトキシンショック等の炎症性疾患等である。
「精子異常による不妊症」は、たとえばＴＥＰＳ５やＰＨ−２０等の精子細胞膜表面に存在するＧＰＩアンカー型タンパク質を、卵との会合時に遊離できないことによる受精不成立を特徴とする精子異常を示す雄性の不妊症である。
なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５）等に記載されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣における蛍光局在化を観察した顕微鏡像である。ＥＧＦＰ−ＧＰＩの生殖細胞（Ｇｃ）発現は第２系統（Ｌａｎｅ２）マウスに見られたが、第１（示さず）および第３系統マウスには見られなかった。Ｌｙはライディヒ細胞。倍率は２００倍。
図２は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の溶解度を調べた電気泳動像である。界面活性剤を添加した溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４＋）または界面活性剤非添加の溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４−）を用いて組織を可溶化し、溶解産物の一部をウエスタンブロット解析した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩが界面活性剤非存在下で積極的に可溶化したのは、第２系統マウスの精巣においてのみであった。水溶性タンパク質の大きさ（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４−）が界面活性剤可溶性の膜アンカータンパク質（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４＋）と同等であった点は特記すべきである。Ｆ９はＦ９トランスフェクタント、ＮＴｇは対照としての非トランスジェニックである。
図３は、連続液体クロマトグラフィーにより精製されたＧＰＩアンカータンパク質遊離活性を示す分子。ＴＳＫ ｇｅｌ ３０００ＳＷゲルろ過カラムから溶出したピーク分画（Ｆｒａｃ．）より、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって、１００ｋＤａの単一バンドとして単離された。
図４は、精製組換えＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）市販製品（ＡＣＥ−Ｓ）、ＰＩ−ＰＬＣおよびバッファーのみと反応させたＰＬＡＰのイムノブロッティング。Ｉｎｐｕｔは反応の基質である。
図５は、ＡＣＥ反応の用量依存性を測定した結果である。部分精製したＰＬＡＰを様々な濃度のＡＣＥ−Ｓと反応させ、水溶相のＰＬＡＰ活性を測定した。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。０ｍＵ／ｍｌを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．０５である。最下段は１０−３Ｍカプトプリルを添加した場合の反応である。
図６は、ＡＣＥと反応させたＰＬＡＰのイムノブロッティングによるＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性の測定結果である。Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性中心のＧｌｕ４１４をＡｓｐに置換した変異体ＡＣＥ、ＷＴは野生型のＡＣＥ−Ｔ。ＢｕｆｆｅｒはＰＬＡＰをバッファーのみと反応させた対照。活性のユニット数は表．１に示す方法で求めた。Ｉｎｐｕｔは反応の基質である。
図７は、ペプチダーゼ活性（Ｐａｓｅ）の測定結果。Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性中心のＧｌｕ４１４をＡｓｐに置換した変異体ＡＣＥ、ＷＴは野生型のＡＣＥ−Ｔ。活性測定手順はＫａｓａｈａｒａ ａｎｄ Ａｓｈｉｈａｒａ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２７：１９２２−１９２５に記載された測定方法に従った。
図８は、ｆｉｌｉｐｉｎ前処理（右）または非処理（左）条件下で、ＥＧＦＰ−ＧＰＩをトランスフェクションしたＦ９細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓにより処理し、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンの細胞表面発現をＦＡＣＳ分析した結果である。ｆｉｌｉｐｉｎ処理後にはＧＰＩアンカータンパク質の発現は減少していたが（細胞数の左シフト）、膜貫通型Ｅ−カドヘリンは減少していないことが分かり、またそれらの程度は異なっていた（遊離％：ＥＧＦＰ−ＧＰＩは５３％、Ｓｃａ−１は６７％、Ｔｈｙ−１は３４％）。ａはＡＣＥ（−）、ｂはＡＣＥ（＋）、ｃはＰＩ−ＰＬＣ処理を行ったもの。各ラインの数値は中央値（Ｍｅａｎ）である。
図９は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞へＡＣＥまたはＰＩ−ＰＬＣ処理を行った場合に観察されるＧＦＰ蛍光の顕微鏡写真。ＡＣＥはＥＧＦＰ−ＧＰＩを細胞表面から切断している。ゴルジ体のＧＦＰ蛍光は減衰していない。倍率２００倍。「ＰＢＳ」はＡＣＥおよびＰＩ−ＰＬＣＸ未処理の対照である。
図１０は、ＨｅＬａ細胞をｆｉｌｉｐｉｎ前処理（右）または非処理（左）で、１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＳ−Ｓまたは２．８Ｕ／ｍｌのＰＩ−ＰＬＣを用いて処理し、細胞表面のＣＤ５９およびＤＡＦの発現をＦＡＣＳ分析した結果である。ＡＣＥ処理によってタンパク質の発現は減少したが（細胞数の左シフト）、その程度は異なっていた（ＣＤ５９は６６％、ｆｉｌｉｐｉｎ処理後のＤＡＦは５８％）。
図１１上図は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）を結合したＨＥＫ２９３細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓにより処理し、プリオンタンパク質の遊離をＦＡＣＳ分析した結果である。下図は、対照としてＣＤ５９の遊離を分析した結果である。
図１２はｆｉｌｉｐｉｎ処理を行ったＨｅＬａ細胞を様々な濃度のＡＣＥ−Ｓ存在下でインキュベートし、ＣＤ５９の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析し、遊離％を算出した結果である。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。０Ｕ／ｍｌを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．００５、＊＊：ｐ＜０．０１である。
図１３はｆｉｌｉｐｉｎ処理したＨｅＬａ細胞を、表示されたカプトプリル用量の存在下、１０−７ＭのＡＣＥペプチドに相当する０．２Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓと共にインキュベートし、ＣＤ５９の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析した結果である。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。カプトリル０Ｍを対照とした。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．０５である。
図１４は、各種の細胞におけるＡＣＥの各種タンパク質の遊離活性を比較した。図８、図１０および図１１の結果の要約となる。ＡＣＥは膜タンパク質であるＥ−カドヘリンを除き、様々な内在性ＧＰＩアンカー型タンパク質を切断放出する。ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞ではＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンを、ＨｅＬａ細胞ではＣＤ５９およびＤＡＦを、ＨＥＫ２９３細胞ではＣＤ５９とプリオンタンパク質（ＰｒＰ）をそれぞれＦＡＣＳ分析で解析した。値は平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。ＮＤは未測定である。
図１５は、遊離タンパク質中に含まれるＧＰＩアンカー型断片の同定。ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞を３２Ｐリン酸もしくは３Ｈエタノールアミンで代謝ラベルし、フィリピンを処理を行った後に、ＡＣＥ−Ｓ、ＰＩ−ＰＬＣまたはｍＧＫ（マウス腺性カリクレイン）による処理を行った。遊離されたＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質を抗ＧＦＰ抗体で精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。遊離したＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の総量はＥＧＦＰイムノブロットによる検出バンドの強度により求めた。また放射線解析では矢印で示した部分で同一のバンドが確認された。タンパク質重量あたりの放射線強度を計算し、ＡＣＥ処理サンプルを１．０として遊離したタンパク質に含まれるそれぞれの標識化合物の相対量として表示した。ＡＣＥ処理サンプルではＲａｐｉｄ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｂａｎｄがいくつか認められるが、これはＦ９細胞中に存在する何らかの酵素による切断によるものである。
図１６は、ＧＰＩアンカー糖鎖骨格におけるリン酸およびエタノールアミンの結合部位、およびＰＩ−ＰＬＣ、ＧＰＩ−ＰＬＤ、ｍＧＫの切断部位を示した模式図である。Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮｃはグルコサミン、Ｉｎｏはイノシトール、黒い太線は脂肪鎖を示す。
図１７は、正常マウスおよびＡＣＥノックアウトマウス精巣上体由来の精子を、水溶性画分Ｘすなわちアクロソームのなどの水溶性成分（ＷＳ）と、細胞膜を構成するタンパク質などの界面活性剤可溶性（難水溶性）画分（ＤＳ）に分配し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、それぞれの抗体を用いてイムノブロットを行った。アクロシンおよびファーティリンβは、ともに精子Ｘに存在し、それぞれＷＳ、ＤＳの指標タンパク質として用いた。理由は不明だが、ＡＣＥノックアウトマウス精子ではファーティリンβの発現が正常マウス精子での発現にくらべて低くなっている。＋／＋は正常精子、−／−はＡＣＥノックアウト精子を示す。
図１８は、ＡＣＥノックアウトマウス精子に対して、様々な処理を行ったのちに精子を卵（透明体）へ結合させた顕微鏡写真。倍率は２００倍。前処理に使用した物質はそれぞれの写真に示した。ＡＣＥ−ＷＴは野生型ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄはペプチダーゼ活性を不活性化させた変異体ＡＣＥ、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ＰはＰＩ−ＰＬＣの阻害剤である。Ｂｕｆｆｅｒは前処理にバッファーを用いる対照実験である。
図１９は、図１８における卵に結合した精子の数をグラフ化したものである。値は平均±ＳＥ（標準誤差）で、平均値をグラフ上に数値で示した。凡例は図１８に同じである。それぞれの実験を行った卵子の数はそれぞれ、Ｂｕｆｆｅｒが１８、ＡＣＥ−ＷＴが２０、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄが１７、ＰＩ−ＰＬＣが１８、ＰＩ−ＰＬＣ＋Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐは１８、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐが１７である。ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定による有意差水準は、対照実験（Ｂｕｆｆｅｒ）と比較して、＊：Ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１である。またＡＣＥ−ＷＴとＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄ間ではＰ＜０．３、ＡＣＥ−ＷＴとＰＩ−ＰＬＣ間ではＰ＜０．５、ＰＩ−ＰＬＣとＰＩ−ＰＬＣ＋Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐ間ではＰ＜０．０５であった。これとは別個に行った実験でも同様の結果を得た。
【発明を実施するための最良の形態】
この発明において使用するＡＣＥは、ヒトをはじめとする各種哺乳動物の細胞（体細胞や精巣細胞）から公知の方法によって単離することができる（体細胞型ＡＣＥ−Ｓ、精巣型ＡＣＥ−Ｔ）。また、市販品（例えば、ウサギ肺由来のＡＣＥ−Ｓ：Ｓｉｇｍａ Ａ−６７７８等）や、特表２００２−５２５１０８号公報に開示されているアンギオテンシン変換酵素相同物を使用することもできる。さらに、このＡＣＥは各種の動物から単離されたものがそれぞれのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ配列）と共に以下のとおりに知られている。すなわち、ヒトＡＣＥ−Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｊ０４１４４）、ヒトＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ２６６５７）、ヒトＡＣＥアイソフォーム３前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１５２８３１）、ヒトＡＣＥアイソフォーム２前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１５２８３０）、ヒトＡＣＥアイソフォーム１前駆体（ＮＭ＿０００７８９）、ヒトＡＣＥ様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０２１８０４）、マウスＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００９５９８）、マウスＡＣＥ−Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＸＭ＿１１０９３６）、ラットＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１２５４４）、ラット肺由来ＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１２５４４）、ラットＡＣＥ−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ５３９４２５）、ウサギＡＣＥ−Ｔ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｐ２２９６８）、ウサギＡＣＥ−Ｓ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｐ１２８２２）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｑ１０７５１）、ウシＡＣＥ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／１９１９２４２Ａ）、イエバエＡＣＥ前駆体（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／１０７１５）、ショウジョウバエＡＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１６５０７０）等である。従って、この発明で使用するＡＣＥは、前記の公知アミノ酸配列に基づいて公知の固相ペプチド合成法により化学合成して作製することもできる。あるいは、ＡＣＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系や適当な宿主−ベクター系で発現させることによって、組換えＡＣＥとして取得することができる。ポリヌクレオチド（例えばＡＣＥ ｃＤＮＡ）は前記ＧｅｎＢａｎｋデータベースや特表２００２−５２５１０８号公報の塩基配列情報に基づき作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の方法により取得することができる。
例えば組換えＡＣＥをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳で作製する場合には、前記ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７ １８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。
組換えＡＣＥを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組換えた発現ベクターを作成し、培養物から融合ペプチドを単離する。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
また組換えＡＣＥを真核細胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、融合ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ＰＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、目的とするタンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。
発現ベクターを宿主細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
融合ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から組換えＡＣＥを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
またこの発明において使用するＡＣＥは、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性（血圧上昇等のペプチダーゼ活性）を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型ＡＣＥであってもよい。すなわち、ＡＣＥは血圧制御因子として働き、血圧上昇を引き起こす。そのためＡＣＥを投与した場合には、その主作用としてのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離とともに、副作用としての血圧上昇等を引き起こす危険性がある。この発明の変異型ＡＣＥは、１または複数のアミノ酸残基を欠失または付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換することによって、目的とする主作用を保持したまま、好ましくない副作用を低減または消失させることを可能とする。
変異型ＡＣＥは、公知のＡＣＥアミノ酸配列（例えば配列番号４）に基づき、公知の固相ペプチド合成法（例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｉｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）に従って様々な変異型ペプチドを作製し、あるいは変異導入型のＰＣＲ法や公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５およびＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５４：３６７，１９８７）に従って作製した変異型ポリヌクレオチドを適当な宿主ベクター系で発現させることによって様々な変異型ペプチドを作製し、後記の試験方法によってそのペプチダーゼ活性およびＧＰｌａｓｅを試験することによって、目的とする変異型を得ることができる。
従って、変異型ＡＣＥのアミノ酸変異導入部位は適宜に設計することができるが、この発明では、その一例として、ＡＣＥアミノ酸配列におけるＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列（配列番号４の４１３−４１７位）のいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型ＡＣＥを好ましいものとして例示する。すなわちこの配列領域は、ＡＣＥのペプチダーゼ活性に必須なＺｎの配位に深く関係する配列であり、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ）、鳥類（ニワトリ）、昆虫（ハエ）など、現在報告されているＡＣＥにおいて、ＡＣＥ−ＴおよびＡＣＥ−Ｓ問わず、ほぼ完全に保存されている。そしてこの発明においては、特に好ましい変異型ＡＣＥとして、Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異型ＡＣＥ（以下「ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）」と記載することがある）を提供する。
この発明の薬剤は、実施的にＡＣＥ単独であってもよいが、疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて、薬剤的に許容される担体と混合して調製することが好ましい。すなわち、この発明の薬剤は、非経口的または経口的な投与に適した剤型となるような担体と混合することができる。
非経口投与は、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注、直腸投与等であり、例えば注射剤としての製剤化する場合の担体としては、滅菌水、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物等を使用することができる。また緩衝剤ｐＨ調節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等））等の製薬補助剤を含有することもできる。このように製剤化した薬剤は、細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤、または懸濁剤やシロップ剤のような経口液体調製物等）に製剤化する。担体としては、常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を使用することができる。ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加することもできる。また錠剤は常法によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶液またはドライプロダクトにすることができる。そのような経口液剤は常用の添加剤、例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。
ＡＣＥの含有量は対象疾患やその投与形態に応じて適宜とすることができるが、通常は５〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。
この発明の薬剤の投与量は、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なるが、ＡＣＥ量として１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度とすることができる。なお、ＡＣＥは人体に存在するタンパク質であり、その安全性については問題がない。
【実施例】
以下、実施例としてＡＣＥ活性について試験した結果を記載し、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
１．材料と方法
１．１．組織学的分析
ＧＰＩアンカーＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＧＰＩ）遺伝子導入マウス（Ｋｏｎｄｏｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．４５８，２９９−３０３，１９９９）をフェノバルビタールにより麻酔し、左心室経由で４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒド−ＰＢＳを潅流させることにより固定した。切除した組織を４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で再度固定し、２０％スクロース−ＰＢＳ中で４℃で４８時間にわたりインキュベートした。次に組織断片をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に埋め込み、ドライアイスで急速冷凍し、低温槽上で５−１０μｍ厚に切断した。標本の調査は、ＧＦＰ特異的フィルタを用いた蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて行った。
１．２．破砕細胞サンプルの調製
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭ プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）存在下、氷冷状態のＴＮＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で細胞と組織を超音波破砕に続いてポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートは１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を収集した（水溶性分画）。沈殿はＴＮＥ緩衝液中で洗浄し、次に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（Ｎａｃａｌａｉｔａｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）−ＴＮＥ溶液中、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤の存在下でホモジナイズを行い、１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を収集した（界面活性剤可溶性分画）。精子サンプルは破砕前にＴＹＨ培地に１時間おいて受精能獲得処理を行った。
１．３．イムノブロット
各組織の両方の分画を非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に転写し、抗ＧＦＰ（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）、ＰＬＡＰ（Ｂｉｏｍｅｄａ）、抗ＴＥＰＳ５、および抗ＰＨ−２０それぞれのウサギポリクローナル抗体、および抗ファーティリンβマウスモノクローナル抗体によるプローブ処理を行い、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｔａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）を用いて染色の検出を行った。
１．４．ＰＬＡＰ変換アッセイ
非イオン化界面活性剤のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４が、３７℃の条件で水溶性分子と界面活性剤可溶性の疎水性分子を分配する性質を利用した。ＰＬＡＰ変換アッセイを用いて、精製途中におけるＧＰＩアンカータンパク質遊離活性のモニタリングを行った。ＰＬＡＰは、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡを発現させて緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤）により抽出することにより調製し、３７℃で分配した後で界面活性剤可溶性の相を収集した。次にＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（溶出バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配）、抗−ＰＬＡＰ抗体カラム（抗体：ウサギポリクロナール抗−ＰＬＡＰ抗体（Ｂｉｏｍｅｄａ）；カラム：Ｈｉｔｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；溶出バッファー：１００ｍＭ グリシンｐＨ２．８）でＰＬＡＰを精製した。界面活性剤可溶性のＰＬＡＰタンパク質を基質に用いてアッセイを行った。ＰＬＡＰ活性の測定は、アルカリホスファターゼ検出キット（Ｎａｃａｌａｉ ｔａｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ）を用いて製造元のプロトコルに従って行った。変換反応は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ＵのＰＬＡＰの条件で、９０分にわたり３７℃で実施した。反応停止はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を最終濃度２％となるように添加することで行い、試料を２５℃で微小遠心分離した。水溶相を収集し、ＰＬＡＰ活性を測定した。またこれはポリクローナル抗−ＰＬＡＰ抗体を用いたイムノブロッティングにも用いた（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）。
１．５．ＧＰＩアンカータンパク質遊離活性物質の精製
成熟したＩＣＲマウスの精巣５００個を莢から出し、カミソリを用いて〜１ｍｍ３の断片に切断した。生殖細胞の単離はピペット吸引の反復により行った。軽い遠心により輸精管を除去した後、上清を収集し、１５００×ｇで遠心分離することによりさらに沈降させた。沈殿は１０倍量の緩衝液（３ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤を含む）中で破砕および超音波処理を行い、ホモジネートを１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。その沈殿を１０倍量の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭプロテアーゼ阻害剤を含む）中で可溶化した。溶解産物は超遠心（１００，０００×ｇ）で１時間にわたり分離を行い、上清を収集した。この試料を以下の連続液体クロマトグラフィーにより精製した。
（１）ＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｅｉｋａｇａｋｕｋｏｇｙｏ，Ｔｏｋｙｏ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配）で溶出。
（２）フェニルセファロースＸ ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）：緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で溶出。
（３）ＣｏｎＡ−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕｋｏｇｙｏ，Ｔｏｋｙｏ）で溶出。
（４）ＴＳＫゲル３０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ）；緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出。
１．６．プロテオミクス分析
精製ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲル中でトリプシンまたは０．１Ｍ臭化シアンを含む７０％ホルマリン溶液で消化し、キャピラリーＨＰＬＣ（Ｍａｇｉｃ）およびイオン捕集マススペクトル分析（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）に供した。それぞれの得られたシグナルに対してＳｅｑｕｅｓｔおよびＭａｓｃｏｔ検索を行った。Ｓマススペクトルで識別されたペプチドはトリプシン消化逆相ＨＰＬＣで分離後、ある程度の量を供出してオートマチックペプチドシーケンサーで同定した。
１．７．細胞培養とトランスフェクション
Ｆ９、ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞を、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地中で培養した。ＤＮＡトランスフェクションにはリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）を製造元のプロトコルに従って使用した。
１．７．ＡＣＥ試料
ＡＣＥ ｃＤＮＡを、マウス精巣ｃＤＮＡをテンプレートとして、’５−ｔｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃａａｇｇｔｔｇｇｇｃｔａｃｔｃｃａｇｇ−’３（配列番号１）および’５−ｇａａｔｔｃｇｃａｃｔｔａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃｃｔｔａｔａａｔｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｔａｃａｇｇｃ−’３（配列番号２）のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにより調製した。このＰＣＲ産物は、ＦＬＡＧを付加した可溶性精巣ＡＣＥのアイソフォームをコードしている。グルタミン酸４１４をアスパラギン酸へアミノ酸置換によりペプチダーゼ活性を不活性化した変異タンパク質のｃＤＮＡは、変異導入プライマーとして、’５−ｃｔｔｇｇｔｇａｔａｇｃｇｃａｃｃａｃｇａｔａｔｇｇｇｃｃａｃａｔｃｃａｇｔａｔｔｔｃａｔｇｃａ−’３（配列番号３）を用いた部位特異的変異誘発により合成した。ｃＤＮＡの発現にはＣＡＡＧベクターを利用した。このＡＣＥ ｃＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養上清を収集し、組換えＡＣＥを抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アガロースアフィニティカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて精製した。また、ウサギ肺由来ＡＣＥの体細胞アイソフォーム（ＡＣＥ−Ｓ）（ＳｉｇｍａＡ−６７７８）を、製造業者の支持する活性単位で使用した。ＡＣＥのペプチダーゼ活性は公知の方法（Ｋａｓａｈａｒａ ａｎｄ Ａｓｈｉｈａｒａ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２７：１９２２−１９２５，１９８１）で行った。
１．９．ＦＡＣＳ分析
０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて細胞を培養皿から剥離させ、１％ＢＳＡを含むＨａｎｋ’ｓ調整塩溶液に数回浸した。懸濁した細胞を、適切な時点で１０μｇ／ｍｌのフィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ）／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて０℃で１時間にわたり処理した。ＰＢＳに浸した後、細胞をＡＣＥまたは１．０ＩＵ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣ（ＧＬＹＫＯ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ）またはＰＢＳのみで、カプトプリル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の存在下または非存在下の条件で、３７℃で１時間にわたり処理を行った。次に細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに繰り返し浸し、ヒトＣＤ５９、ヒトＤＡＦ、マウスＳｃａ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）、マウスＴｈｙ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）、マウスＥ−カドヘリン（宝酒造）、ヒトプリオンタンパク質（３Ｆ４，ＳｉｇｎｅｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するビオチン共役抗体を用いて染色し、次にフィコエリトリン共役ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて染色した。
また、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）の遊離活性は、ヒト胎児由来線維芽細胞（ＨＥＫ２９３細胞）および抗ヒトプリオンモノクローナル抗体３Ｆ４（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用し、前記と同様に染色した。
染色した細胞をＦＡＣＳｃａｎセルソーターに供した。ソートされた細胞の生存度を、ＦＳＣおよびＳＳＣチャンネルにより評価した。Ｆ９細胞内で発現したＥＧＦＰ−ＧＰＩは直接検出した。切断の定量はそれぞれの細胞における平均の蛍光発光強度より次式によって切断放出（％）を算出した。
切断放出（％）＝（ＡＣＥ（−）−ＡＣＥ（＋））／（ＡＣＥ（−）−ＰＩ−ＰＬＣ）
すなわち、ＰＩ−ＰＬＣ処理時の蛍光強度を最大値、ＡＣＥ（−）での蛍光強度を切断がないものとした。
１．１０．放射性標識分析
ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞を０．２ｍＣｉ／ｍｌの［３２Ｐ］−オルトリン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）もしくは０．１ｍＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−エタノールアミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１６時間処理し代謝による標識を行った。フィリピン処理を行った細胞を、０．５μＭ ＡＣＥ、１．０ＩＵ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣ、マウス腺性カリクレイン（ｍＧＫ：ＥＧＦＰをＣ末端近傍で切断する酵素）を含む顎下腺の１０％ライセートのいずれかで１時間３７℃で処理した。遊離したＥＧＦＰを抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の量は、デンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でのＥＧＦＰイムノブロットで検出されたＥＧＦＰ−ＧＰＩのバンド強度の測定、および同じバンドについて液体シンチレーションカウンタでの放射能測定により行った。
１．１１．精子−卵結合能測定
全ての生殖細胞ＴＹＨ培地中で取扱いおよび静置をおこなった。同腹の正常マウスおよびＡＣＥ欠損マウスから精巣上体を摘出し、２５０μｌの培地を加え刻んだ。精子を１５分間泳がせた後に、１．５ｍｌ培地に移し変え、すくなくとも１時間以上培養した。卵細胞は過排卵されたＣ５７ＢＬ／６マウスの卵管から採取し、ＴＨＹ培地で積層細胞を除去するために１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。培養した精子（約２．０×１０ ６個／ｍｌ）次の試薬で９０分、それぞれ処理した。野生型ＡＣＥ（ＡＣＥ−ＷＴ）０．２Ｕ／ｍｌ、ＡＣＥ−Ｅ４１４Ｄ ０．２Ｕ／ｍｌ、ＰＩ−ＰＬＣ １．０ＩＵ／ｍｌ、４ｍＭイノシトールモノリン酸（Ｓｉｇｍａ）をふくむＰＩ−ＰＬＣ １．０ｍｌ、４ｍＭイノシトールモノリン酸のみ、またはＰＢＳバッファーのみ。生殖細胞はミネラルオイルで表面を覆ったＴＹＨ培地中で１時間インキュベートし、ＰＢＳで穏やかに４％洗浄後、パらホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、卵−精子結合能測定に供した。卵細胞は２００倍の光学顕微鏡（オリンパス）で観察し、卵子に集合してきた精子の数は、卵子の直径がもっとも大きく見える焦点にあわせてカウントした。
２．結果と考察
２．１．遺伝子導入マウスとそのＧＰＩタンパク質
図１は、ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスの精巣の蛍光シグナルを撮影した写真像である。生殖細胞（Ｇｃ）におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩの発現は第２系統（Ｌｉｎｅ２）に見られたが、第１および第３系統には見られなかった。
図２は、遺伝子導入動物の精巣におけるＥＧＦＰ−ＧＰＩタンパク質の溶解度を解析した結果である。界面活性剤を添加した溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４＋）または界面活性剤非添加の溶解緩衝液（Ｔｘ−１１４−）を用いて組織を可溶化し、溶解産物の一部をウエスタンブロッティングに供した。ＥＧＦＰ−ＧＰＩが界面活性剤非存在下で積極的に可溶化したのは、第２系統の精巣においてのみであった。水溶性タンパク質の大きさ（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４−）が界面活性剤可溶性の膜アンカータンパク質（Ｌｎ．２，Ｔｘ−１１４＋）と同等であった点は特記すべきである。
２．２．ＧＰＩアンカータンパク質放出因子の特定
ＥＧＦＰ−ＧＰＩ遺伝子導入マウスを用いて、ＧＰＩアンカー膜結合型タンパク質放出因子の同定を行い、目的の活性を有する１００ｋＤａタンパク質を精製した。すなわち、マウス精巣に由来する生殖細胞の膜リッチ分画を１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中で可溶化し、遠心分離を行って上清を取り、連続液体クロマトグラフィーによる分画に供した。溶出分画に対してＰＬＡＰ変換アッセイを行い、その最大値を表１に示す。なお、全ての反応はＰＩ−ＰＬＣ（１．０Ｕ／ｍｌ）処理を付随して行い、その値を最大反応として定義した。図３は、銀染色によるこの１００ｋＤａタンパク質の単一バンドを示す。
この精製タンパク質は、プロテオミクス分析によりＡＣＥであることを確認した。
さらにこの精製タンパク質活性を、組換えＡＣＥおよび市販品ＡＣＥと比較した。すなわち、組換えタンパク質および市販品ＡＣＥはＰＬＡＰを水溶性形態に変換するかを確かめるため、部分精製したＰＬＡＰを、精製組換えＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）または市販製品（ＡＣＥ−Ｓ）と反応させた。ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による分配後、水溶性相の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＬＡＰを免疫ブロッティングにより検出した。結果は図４に示した通りである。可溶性ＰＬＡＰに相当するバンドはＰＩ−ＰＬＣ処理を行った試料よりわずかに小さいが、ＡＣＥ−ＴおよびＡＣＥ−Ｓ処理サンプルの両方に見ることができる。
また、ＡＣＥ反応の用量依存性を。部分精製したＰＬＡＰを様々な濃度のＡＣＥ−Ｓと反応させ、水溶相のＰＬＡＰ活性を測定した。結果は図５に示したとおりである。この図５に示したとおり、市販品ＡＣＥにおいてもその活性は用量依存的であり、しかもこの活性は特異的なＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルによって阻害された。
ＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性の活性中心について、既知であるペプチダーゼ活性中心のＡｓｐ４１４をＧｌｕに置換した組替え体ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）を作成し、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性およびペプチダーゼ活性について測定を行った（図６、図７）。その結果、ペプチダーゼ活性は１／１０００以下に下がったの対して、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性は野生型とほとんど変わらなかった。このことよりＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を担当する活性中心は、ペプチダーゼ活性を示す部位とは別の場所に局在することが示唆された。
２．３．ＧＰＩアンカー型タンパク質に対するＡＣＥの作用
ＧＰＩアンカータンパク質に対するＡＣＥの活性を精査するため、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを細胞表面で安定に発現するＦ９細胞を使用し解析を行った。フィリピン前処理済みのおよび未処理のＥＧＦＰ−ＧＰＩ発現Ｆ９細胞を１．０Ｕ／ｍｌのＡＣＥ−Ｓまたは２．８Ｕ／ｍＩのＰＩ−ＰＬＣにより処理し、ＥＧＦＰ−ＧＰＩの動態をＧＦＰ蛍光の観察により、またＥＧＦＰ−ＧＰＩ、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１およびＥ−カドヘリンの細胞表面発現をＦＡＣＳ分析によりそれぞれ解析した。ＡＣＥはＥＧＦＰ−ＧＰＩの発現にほとんど影響しないが、フィリピン処理を行った細胞については、ＡＣＥ処理により細胞表面からＥＧＦＰ−ＧＰＩのほとんど全てを遊離させた（図８、９）。実際、ＧＰＩアンカー型タンパク質は細胞膜の脂質ラフトに局在化して包含されており、外来性のＡＣＥは脂質ラフトにより基質分子への会合が阻害されているように思われる。他のＧＰＩアンカー型タンパク質、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１も細胞のＡＣＥ処理によって同様に切断放出されることが確認された。これより、ＡＣＥおよびＰＩ−ＰＬＣは、膜貫通型タンパク質であるＥ−カドヘリンには何ら作用を及ぼさないいっぽうで、ＧＰＩアンカー型タンパク質に特異的に切断酵素活性を示すことが確認された。
さらに、ＨｅＬａ細胞上でＣＤ５９および解離促進因子（ＤＡＦ）の２種類のＧＰＩアンカー型タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞でプリオンタンパク質をそれぞれ分析対象とし、ＡＣＥによる切断活性を同様なＦＡＣＳ分析により調査した（図１０、１１）。その結果、これらＧＰＩアンカー型タンパク質がいずれも細胞膜上から切断放出されたことが確認された。さらに、ＨｅＬａ細胞でのＣＤ５９のＡＣＥの切断活性は、コレステロールブロッキング剤であるフィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ）を用いて膜脂質ラフトを崩壊させた場合により明確化し（図１０）、ＡＣＥ用量依存的であり（図１１）、またカプトプリルによる阻害された（図１２）。Ｆ９細胞の事例とは対照的に、ＡＣＥはヒト細胞上でＡＣＥは、フィリピン処理を行わずとも容易に細胞表面からＧＰＩアンカー型タンパク質を遊離させることが確認された（図１４）。
２．４．ＡＣＥのＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性における基質切断部位の同定
ＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞をＰＬＡＰとともにＡＣＥ処理し、抗ＧＦＰ抗体カラムで遊離したＥＧＦＰ−ＧＰＩを精製し、トリプシン、臭化シアンもしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼを用いたＨＰＬＣ−マススペクトル解析でＣ末端の構造決定を何度か試みたところ、いずれもターゲットペプチドの捕集に失敗し構造決定が不可能であった。これより、遊離したＧＦＰ−ＧＰＩはＣ末端にＧＰＩアンカーの一部が繋がったままの構造であることが推測された。
そこで、ＧＰＩアンカーの特定部位を放射ラベルする［３２Ｐ］−リン酸、または［３Ｈ］−エタノールアミンを用いて、ＥＧＦＰ−ＧＰＩを発現するＦ９細胞に代謝ラベルを行い、ＡＣＥ、ＰＩ−ＰＬＣ、ｍＧＫでそれぞれ処理したのちに遊離したタンパク質を、ＥＧＦＰイムノブロットにより検出し、検出されたバンドについてそれぞれの放射線強度を測定した（図１５）。分析は少なくとも４回行い、ほぼ同一の結果が得られた。ｍＧＫ処理では３２Ｐまたは３Ｈで放射ラベルされた遊離ＥＧＦＰ−ＧＰＩはどちらも検出されなかったが、ＡＣＥ処理およびＰＩ−ＰＬＣ処理ではどちらの放射ラベルも検出された。これよりＡＣＥ処理産物にはＧＰＩアンカー型タンパク質の構造の一部でも存在していることが示された。また、ＡＣＥ処理で遊離したタンパク質の放射線強度は、ＰＩ−ＰＬＣ処理の場合と比較してリン酸ラベルの場合で約１／３、エタノールアミンラベルの場合で約１／２の検出強度だった。図１６に示したように、ＧＰＩアンカー上ではラベルに用いた放射性同位元素は局在化しており、先の検出強度の差分よりＡＣＥの切断部位は既知のＰＩ−ＰＬＣの切断部位よりＧＰＩアンカー型タンパク質に近く、ＧＰＩアンカー骨格のアンカー型タンパク質が付加する末端に３つ連なっているマンノース付近であることが示唆された。
２．５．卵結合能を欠失した精子へのＡＣＥの作用の解析
ＡＣＥノックアウトマウスでは雄性不妊が認められる。ＡＣＥノックアウトマウスの精子は正常の精子と比較して、透明体（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）における精子−卵結合能が欠失していることが、ＸＫｒｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７５：１４６−１４８，１９９５で、報告されている。
受精時に精子から遊離される事が知られているＧＰＩタンパク質、ＴＥＳＰ５とＰＨ−２０（非特許文献３および４）を対象として、正常マウスおよびＡＣＥノックアウトマウス精巣上体由来の精子について、それぞれ水溶性成分（ＷＳ）および界面活性剤可溶性画分（ＤＳ）に分配し、イムノブロットで分析した（図１７）。精子から遊離した水タンパク質は可溶性画分に分配されるが、正常な精子の水溶性画分（ＷＳ）からはＴＥＳＰ５とＰＨ−２０の両タンパク質が検出され、ＡＣＥノックアウトマウスの精子では水溶性画分からはどちらも検出されなかった。この結果から、ＡＣＥはＧＰＩアンカー型タンパク質の放出に必須である可能性が示された。
さらに精子−卵結合におけるＡＣＥの影響の同定を試みた。前記の正常マウス、およびＡＣＥノックアウトマウス、それぞれの精巣上体由来の精子を、野生型ＡＣＥ、ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）、ＰＩ−ＰＬＣでそれぞれ処理し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの未受精卵に接種した。正常マウスの精子ではこの処理により受精能に何ら影響が見られなかったが、対照的に卵結合能を欠くＡＣＥノックアウトマウスの精子では、野生型ＡＣＥ、ペプチダーゼ活性欠損ＡＣＥのどちらのＡＣＥ処理においても、精子結合能が大きく回復した（図１８、図１９）。さらに、ＰＩ−ＰＬＣ処理の場合においても、ＸＰＩ−ＰＬＣに特異的な阻害剤イノシトールモノリン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐ）で（ＰＩ−ＰＬＣ処理を）阻害した場合を比較することによって、ＡＣＥノックアウト精子の卵結合能が回復することが明らかとなった。以上より、ＡＣＥのもつＧＰＩａｓｅ活性が、受精時における精子の卵結合能に決定的な形で関与していることが結論付けられた。
２．６．ＡＣＥのＧＰＩａｓｅ活性の特徴と利用
ＧＰＩアンカー切断活性（ＧＰＩａｓｅ活性）を示すタンパク質としては、哺乳類においては、唯一ＧＰＩ−ＰＬＤが知られている。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＤは細胞内でＧＰＩ−ＰＬＤを発現する場合に限って、ＧＰＩａｓｅ活性を示すことが、培養細胞を用いた研究により報告されている（Ｔｕｊｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：７３７−７４７，１９９８）。すなわちＧＰＩａｓｅ活性の医薬への利用という観点から、外来性のＧＰＩ−ＰＬＤは有効に作用した事例がない。一方で、ＡＣＥはヒトの培養細胞や組織に添加するだけで、細胞膜の構造を薬剤処理等で破壊することなく、容易にＧＰＩアンカー型タンパク質を能率的に遊離することができるという優れた特性をもつ。
ＡＣＥのＧＰＩａｓｅ活性の優れたもうひとつの特性は、そのＧＰＩアンカー切断部位である。図１６の模式図に示したＧＰＩアンカーの構造における切断部位は、成熟ＧＰＩアンカーにおいては、イノシトールのヒドロキシル基への脂肪酸付加（アシル化）がよく起こる。ＧＰＩ−ＰＬＤの切断部位はイノシトールの直近であるため（図１６およびＨａｇａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：２５５２−２５５７，１９９８）Ｘ切断できない。実際、アシル化が顕著な健全赤血球では、ＧＰＩ−ＰＬＤによって解離促進因子（ＤＡＦ）の切断ができない（Ｄａｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１３７６０−１３７６４，１９８９）。一方、ＡＣＥはＧＰＩ−ＰＬＤとは対照的にＧＰＩアンカーのアンカー型タンパク質結合末端側を切断するため、ＨｅＬａ細胞においてＤＡＦの遊離させたことからもイノシトールへの脂肪鎖付加による阻害を受けにくいことは明らかである。
さらに、ＧＰＩａｓｅ活性を示すタンパク質としてはバクテリア由来のＰＩ−ＰＬＣが知られているが、ＧＰＩａｓｅ活性をヒトに対する薬剤として使用する場合に、ＡＣＥはヒト体内に通常広く分布していることから、きわめて安全性が高いと考えられる。
またＡＣＥは血圧制御因子として働き、血圧上昇を引き起こす。そのためＡＣＥを阻害する薬理作用を持つ医薬品（血圧降下剤）やペプチダーゼ活性の阻害についての研究がすすめられてきた。ウサギ体細胞由来ＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｓ）およびマウス精巣由来ＡＣＥ（ＡＣＥ−Ｔ）の変異型ＡＣＥ（Ｅ４１４Ｄ）の試験結果は、ＡＣＥの副作用を制圧して、目的とする活性のみを利用することが可能であることを明確に示した。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることによって、プリオン性疾患、炎症性疾患、細菌感染性疾患、精子の卵結合能不足による雄性不妊症等を効果的に予防または治療することのできる薬剤が提供される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオテンシン変換酵素を含有し、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とするアンギオテンシン変換酵素含有薬剤。
【請求項２】
プリオン性疾患の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項３】
細菌感染疾患の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項４】
精子異常による不妊症の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項５】
アンギオテンシン変換酵素が、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素である請求項１から４のいずれかの薬剤。
【請求項６】
変異型アンギオテンシン変換酵素が、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異酵素である請求項５の薬剤。
【請求項７】
変異型アンギオテンシン変換酵素が、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異酵素である請求項６の薬剤。
【請求項８】
ペプチダーゼ活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素。
【請求項９】
そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した請求項８の変異型アンギオテンシン変換酵素。
【請求項１０】
そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した請求項９の変異型アンギオテンシン変換酵素。
【請求項１】
アンギオテンシン変換酵素を含有し、ＧＰＩアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させることを作用機序とするアンギオテンシン変換酵素含有薬剤。
【請求項２】
プリオン性疾患の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項３】
細菌感染疾患の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項４】
精子異常による不妊症の予防または治療用である請求項１の薬剤。
【請求項５】
アンギオテンシン変換酵素が、ＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を保持させたまま、アンギオテンシン変換酵素活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素である請求項１から４のいずれかの薬剤。
【請求項６】
変異型アンギオテンシン変換酵素が、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異酵素である請求項５の薬剤。
【請求項７】
変異型アンギオテンシン変換酵素が、そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した変異酵素である請求項６の薬剤。
【請求項８】
ペプチダーゼ活性を失活させるアミノ酸変異を導入した変異型アンギオテンシン変換酵素。
【請求項９】
そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるいずれか１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した請求項８の変異型アンギオテンシン変換酵素。
【請求項１０】
そのアミノ酸配列中のＨｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｈｉｓ配列におけるＧｌｕをＡｓｐに置換した請求項９の変異型アンギオテンシン変換酵素。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９３９６
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８０７０（Ｐ２００４−５４８０７０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３８５１
【国際出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【出願人】（５０２３９２２４９）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３８５１
【国際出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【出願人】（５０２３９２２４９）
【Ｆターム（参考）】
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