アンサマイトシンの産生法
非常に生産性が高いアンサマイトシン産生株の大規模発酵法。未精製アンサマイトシンを単離するための方法。アンサマイトシンを精製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
［０１］本発明は、アンサマイトシンの産生法に関する。アンサマイトシンは、Ｃ−３エステル側鎖が異なる、アンサマイトシンの混合物を指す。アンサマイトシンは、Ｃ−３アルコール・メイタンシノールに変換可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０２］アンサマイトシンは、アクチノシネマ・プレチオスム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）などの微生物の発酵に由来する非常に細胞傷害性が高い化合物である。アンサマイトシンは、チオール含有メイタンシノイドに化学的に変換されてきており、細胞結合剤−メイタンシノイド・コンジュゲートの形でのその療法的使用が記載されてきている（米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，３３３，４１０号；および第６，４４１，１６３号）。
【０００３】
［０３］アクチノシネマ・プレチオスムなどのアクチノシネマ属種株を用いた発酵法は、Ｃ−３に異なるエステル置換基を所持するいくつかのアンサマイトシン種を産生する（図１）。産生される多様なＣ−３エステルには、Ｐ−３（イソ−ブチリル）、Ｐ−３’（ｎ−ブチリル）、Ｐ−２（プロピオニル）、Ｐ−４（イソ−バレリル）、Ｐ−４’（ｎ−バレリル）が含まれる。これらのエステルはすべて、還元的に切断されて、Ｃ−３アルコール・メイタンシノール（Ｐ−０）を生じることも可能であり、これは、チオール含有メイタンシノイドの合成のための前駆体である。さらに、Ｎ−デメチル、２０−Ｏ−デメチル、および１９−デクロロなどの、他の部位で修飾された、少量の望ましくないアンサマイトシンが産生される。還元的脱アシル化に際して、これらのアンサマイトシンはメイタンシノールを産生しない。
【０００４】
［０４］アクチノシネマ属種の発酵からアンサマイトシンを産生するための方法が記載されてきている（米国特許第４，１６２，９４０号；第４，４５０，２３４号；第４，２２８，２３９号；第４，３３１，５９８号；および第４，３５６，２６５号）。産生されるアンサマイトシンの収量は多様であり、力価は一般的に１２ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌの範囲である。アンサマイトシンは、典型的には、全発酵ブロスへのろ過助剤および有機溶媒の添加、その後の、有機層の濃縮および石油エーテルでの沈殿を伴う、多工程法によって回収され、そして精製される。沈殿物は、シリカクロマトグラフィーおよび結晶化、その後の再結晶化またはクロマトグラフィーによるさらなる精製を用いて、さらに精製された。
【０００５】
［０５］このように、方法は煩雑であり、そして非常に毒性が高い物質を扱わなければならない、いくつかの工程を伴う。このため、こうした方法のスケールアップは非常に困難である。さらに、多様なプロセシング工程の間中、操作する人の安全性が保証されなければならない。
【０００６】
［０６］最近の出願（ＵＳ ２００２／００１５９８４ Ａ１）は、アンサマイトシン産生法の特定の改善を主張する。発酵ブロス中のアンサマイトシン力価は、６５〜８６ｍｇ／ｌの範囲であったと報告される。主張される改善には、７５℃でのブロスの熱不活性化、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒中への抽出、開放シリカカラムを通じたクロマトグラフィー、その後の結晶化が含まれた。アンサマイトシン産生のコストを減らすため、先に記載されるものより有意により高い力価（発酵槽中、最高４００ｍｇ／ｌ）を生じる新規アクチノシネマ属種株が産生されている。アンサマイトシンの産生に関して、以前記載された方法には、いくつかの欠点があり、そしてしたがって、開発されてきている新規の高産生株には適応不能である。例えば、７５℃での熱不活性化は、アンサマイトシンのある程度の分解を生じ、そして収量が１０〜２０％損失する。アンサマイトシンは芳香族炭化水素溶媒中ではそれほど可溶性でないため、アンサマイトシンを高い含量で含有する発酵ブロスのこうした溶媒での抽出は不十分であり、そして不完全である。開放自己充填シリカカラム上でのアンサマイトシンの精製には、２つの欠点がある：１）純度および回収率のロット間変動、および２）安全性の懸念を生じる、人のかなりの曝露。したがって、非常に毒性が高い薬剤への作業者の曝露を最小限にしつつ、アンサマイトシンを高収率で生じ、そしてまたその単離および精製に効率的な方法を提供する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
［０７］本発明の１つの側面は、アンサマイトシン産生微生物の大規模発酵法であって、新規の非常に生産性が高いアンサマイトシン産生株に特に適用可能な方法である。
【０００８】
［０８］本発明の別の側面は、未精製アンサマイトシンを単離し、そして精製アンサマイトシンを調製するための方法であって、以下の工程：
１）例えば約５０℃〜５５℃の熱への曝露によるか、または体積１％のクロロホルムを添加することによる、場合による培養物の不活性化、２）非芳香族有機溶媒を用いた抽出、３）抽出物の濃縮、４）シリカまたはアルミナカラム、好ましくはあらかじめ充填されたシリカ・カートリッジカラム上での濃縮物の精製、および５）産物の結晶化
を含む、前記調製法である。
【０００９】
［０９］本発明の他の側面には、以下が含まれる：
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１０】
［１０］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１１】
［１１］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化によってアンサマイトシンを精製する工程
を含む、前記調製法。
【００１２】
［１２］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いた、培地からのアンサマイトシンの抽出工程；
３）固体を除去し、有機相の単離を可能にする、ろ過工程
４）有機相からのアンサマイトシンの濃縮工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１３】
［１３］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）多様な遠心分離技術を用い、非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１４】
［１４］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）１以上の水混和性有機溶媒の存在下で、ブロスを遠心分離して、溶液中にアンサマイトシンを保持しつつ、固体を除去する工程；
３）水非混和性非芳香族溶媒を添加して、有機層中へのアンサマイトシンの抽出を可能にする工程。場合によって抽出中に、多様な塩または他の構成要素もまた、有機相に添加してもよい。
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１５】
［１５］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）アンサマイトシンの抽出を促進するための、場合による培地の処理工程；
３）培地から樹脂上へのアンサマイトシンの固相抽出工程；
４）１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いた、樹脂からのアンサマイトシンの定組成溶離または勾配溶離工程；
５）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
６）場合によって、さらにａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１６】
［１６］これらの態様において、本発明は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；
（ｉｉ）工程２の前の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；または
（ｉｉｉ）沈殿の前または後のいずれかに、有機溶媒中のアンサマイトシンの未精製溶液を、水、水性塩溶液、水性酸または水性塩基の任意の連続した組み合わせで洗浄する、洗浄工程。この工程は、精製の多様な段階で行ってもよい；
を含んでもよい。
【００１７】
［１７］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）場合によって発酵ブロス中のアンサマイトシン産生微生物を不活性化する工程；および
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程
を含む、前記抽出法。
【００１８】
［１８］上記方法はまた、工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理も含んでもよい。
［１９］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）非芳香族水非混和性溶媒を用いた、発酵ブロスからのアンサマイトシンの抽出；および
２）固体を除去し、有機相の単離を可能にする、ろ過；
を含む、前記抽出法。上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）工程２の前の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００１９】
［２０］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：非芳香族水非混和性溶媒を用いた多様な遠心分離技術によって、培地からアンサマイトシンを抽出する工程を含む、前記抽出法。
【００２０】
［２１］上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００２１】
［２２］発酵ブロスから固形デブリを除去するための方法であって：
１）溶液中にアンサマイトシンを保持しながら、固体を除去するための、水混和性有機溶媒の存在下での発酵ブロスの遠心分離、
を含む、前記方法。
【００２２】
［２３］上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００２３】
［２４］上述の方法において、アンサマイトシン産生微生物は、アクチノシネマ属種であることが好ましく、より好ましくはアクチノシネマ・プレチオスムである。アンサマイトシン産生微生物はまた、アクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５またはそれから派生する株、あるいはアクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）またはそれから派生する株であってもよい。米国特許第４，４５０，２３４号に記載されるように、アクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５は、（ｉ）財団法人発酵研究所、〒５３２−８６８６ 大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５、日本に、寄託番号ＩＦＯ １３９６３の元、１９７９年８月２０日に寄託され；（ｉｉ）生命工学工業技術研究所（以前の微生物工業技術研究所）、産業技術総合研究所、経済産業省、〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１−１、日本に、寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ ＮＯ．５１８５の元、１９７９年８月２９日に寄託され；そして（ｉｉｉ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， 米国に、寄託番号ＡＴＣＣ ３１５６５の元、１９７９年９月１１日に寄託された。さらに、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４は、ブダペスト条約の規定の元に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， 米国に、２００１年１２月１１に寄託され、そして寄託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１を与えられた。
【００２４】
発明の詳細な説明
［２６］巨大発酵槽における液体培地中、アンサマイトシンに関して非常に生産性が高い微生物の培養法を提供する。アンサマイトシンが非常に可溶性である、非芳香族水非混和性有機溶媒中に培養ブロスおよび微生物からアンサマイトシンを抽出するための方法、ならびに必要な場合、シリカまたはアルミナカラムであって、好ましくはあらかじめ充填されたカートリッジである、前記カラムの通過、その後、産物の結晶化によってアンサマイトシンを精製するための方法もまた、提供する。必要な場合、抽出工程前の熱処理またはクロロホルム処理によって、微生物を不活性化してもよい。
【００２５】
［２７］アンサマイトシンＰ−３、Ｐ−３’、Ｐ−４、Ｐ−４’、Ｐ−２およびＰ−１（図１）などの多様なＣ−３エステルの混合物を含んでもよい精製アンサマイトシンを、還元剤で処理して、所望のＣ−３ヒドロキシル化合物、メイタンシノール（Ｐ−０）を生じてもよい。精製されたアンサマイトシンは、典型的には、Ｃ−３位以外の分子の部位に修飾を有する、望ましくないアンサマイトシンを少量しか含有しない。好ましくは、アンサマイトシン産生株は、アクチノシネマ属種である。より好ましくは、微生物はアクチノシネマ・プレチオスムである。微生物はまた、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）およびその派生株、ならびにアクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５およびその派生株であってもよい。本明細書に記載する特定の培地または当該技術分野に記載される他の任意の培地を用い、一般の当業者に知られる発酵培養技術によって、微生物を増殖させてもよい（米国特許第４，１６２，９４０号；第４，４５０，２３４号；第４，２２８，２３９号；第４，３３１，５９８号；および第４，３５６，２６５号）。
【００２６】
［２８］本発明の方法の１つの態様は、液体培地中での微生物の培養である。管理された条件下で、細菌株ＰＦ４−４の増殖を行い、そして増殖は、非常に多様な培地および条件を使用してもよい。例えば、発行された米国特許第４，１３７，２３０号；第４，１６２，９４０号；第４，３３１，５９８号；第４，３５６，２６５号；および第４，４５０，２３４号において、ＡＴＣＣ ３１５６５またはＡＴＣＣ ３１２８１に関して記載されるものと類似の条件下で、そして類似の培地を用いて；そしてＨａｔａｎｏら， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４８， １７２１−１７２９， １９８４に記載されるように、ＰＦ４−４を増殖させてもよい。したがって、ＰＦ４−４株は、やはりアンサマイトシンの発酵産生を支援する、非常に多様な炭素供給源を許容する。例示的な増殖培地を表１および２に示す。表１は、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４などのアンサマイトシン産生微生物によるアンサマイトシンの産生を支援する培地を示し、そして表２は、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４、および他のアンサマイトシン産生微生物の増殖および／または成長に適したさらなる培地を示す。
表１．産生培地組成（記入は％ｗ／ｖである）。
【００２７】
【表１】
【００２８】
滅菌は１２１℃で２０分間であった。1最後に添加した。
表２．関連培地
【００２９】
【表２】
【００３０】
ＰＦ４−４株からのアンサマイトシンの発酵産生に好ましい方法を、以下の実施例１および２にさらに記載する。
発酵：
［２９］静置、振盪、有酸素液内などの培養条件または任意の他の培養条件によって、培養を行ってもよい。巨大タンク発酵槽における優れた培養増殖およびアンサマイトシンの高産生のため、有酸素液内培養が好ましい。発酵中に栄養分を供給することによって、アンサマイトシン産生をさらに増進してもよい。例えば、ＦＭ４−６培地中で生物を培養する際、発酵期間中にグルコースをさらに供給するか、あるいは最初の約２４〜７２時間の間、好ましくは最初の約４８時間の間、グルコースを供給し、その後、発酵終了時にアンサマイトシン産生の倍増を生じうるまで、グルコースおよびワタ（ｃｏｔｔｏｎ）種子粉（例えばＴｒａｄｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ、テネシー州メンフィスのＰｒｏｆｌｏまたはＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ）または大豆粉などのタンパク質栄養分、ならびにイソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、イソバレルアルデヒドなどの、Ｃ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドを供給する。培養条件は、用いた培地および産生規模に応じるが、通常、約５〜９のｐＨ範囲で、好ましくは約６．５〜８．０の出発ｐＨで、発酵を行うことが好ましい。より好ましくは、ｐＨ範囲は約７〜８であり、さらにより好ましくは、約７〜７．４である。最も好ましいｐＨは約７．２である。温度は、約１５℃〜３５℃の範囲であってもよく、好ましい範囲は約２５℃〜３０℃である。より好ましくは、温度は約２８℃である。最大アンサマイトシン集積が達成されるまで、発酵を続ける。培養時間は多様であることも可能であり、そして培養法、培地組成、および温度を含むいくつかの要因に応じうる。典型的には、発酵時間は、９６〜３３６時間の範囲である。
【００３１】
アンサマイトシンの分析：
［３０］米国特許第４，３３１，５９８号および第４，４５０，２３４号において、親株ＡＴＣＣ ３１５６５は、Ｃ−１４でのメチル基またはヒドロキシメチル基の存在によって区別される２つのクラスのアンサマイトシンを産生すると開示される（図１を参照されたい）。どちらのクラスに関しても、Ｃ−３酸素原子に結合したそれぞれのアシル側鎖が異なり、そしてＣ−１４がメチル基またはヒドロキシメチル基（または続く研究では、Ｎ−デメチル）を所持するかどうかに関して異なる、いくつかの異なるアンサマイトシンが産生される。順序が変わった化合物に関して、本明細書に用いる命名法は、図１に準拠して、上に定義される。
【００３２】
［３１］アンサマイトシンＰ−３は、特定の増殖条件下で、ＰＦ４−４および親株ＡＴＣＣ ３１５６５の主要な産物である。細菌をバリンまたはイソ酪酸（米国特許第４，２２８，２３９号）、あるいはイソブチルアルコールまたはイソブチルアルデヒド（米国特許第４，３５６，２６５号）の存在下で増殖させると、他のアンサマイトシン化合物は、少量しか存在しない。すべてイソブチルアルコールを含有する、異なる発酵培地（表１中でＦＭと称される）中でＰＦ４−４株を増殖させると、アンサマイトシンＰ−３が、産生される主なアンサマイトシンである。アンサマイトシンの量をアッセイする１つの方法において、発酵ブロスの試料をエタノールまたはアセトニトリルで希釈し、次いで強く振盪し、そして最後に遠心分離する。次いで、アンサマイトシンＰ−３含量に関して、上清をアッセイする。
【００３３】
［３２］好ましくは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、アンサマイトシンを分画し、そして分析するが、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは薄層クロマトグラフィーなどの任意の適切な技術が使用可能である。１つの方法において、酢酸エチル、塩化メチレンまたはクロロホルムなどの有機溶媒を用いて発酵ブロスを抽出し、そして有機溶媒中のＰ−３の含量を、逆相Ｃ１８またはＣ８カラムを用いたＨＰＬＣによって決定する。
【００３４】
アンサマイトシンの抽出：
［３３］二次代謝産物の回収に一般的に使用される方法によって、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出してもよい。アンサマイトシンは、非芳香族溶媒に容易に可溶性であるため、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトンおよびハロゲン化溶媒などの非芳香族水非混和性溶媒と攪拌することによって、容易に抽出可能である。適切な酢酸アルキルの例には、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルが含まれる。適切なジアルキルケトンの例はメチルイソブチルケトンである。適切なハロゲン化溶媒の例は、ジクロロメタンである。酢酸ｎ−ブチルでの抽出が好ましい。好ましくは、発酵ブロス対非芳香族水非混和性溶媒の体積比は、１：１である。
【００３５】
［３４］また、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手可能なアンバーライトＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、三菱化成工業から商業的に入手可能なＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０、ＨＰ２１、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ７０、ＳＰ７００などの多様な樹脂上に、発酵ブロスからアンサマイトシンを吸着させてもよい。これらの例は、範囲を限定せず、一般の当業者に知られる他の樹脂もまた、上記目的のために使用可能である。磁気的にまたは膨張層クロマトグラフィーなどの吸着剤密度に頼る方法によって、ブロスからポリマーを回収可能であるように、磁石または高密度物質などの二次構造上のコーティングとしてもまた、樹脂を使用可能である。アンサマイトシンが樹脂上に吸着されたならば、定組成溶離または勾配溶離によって、１以上の有機溶媒を用いて、これらを溶離させることも可能である。１つの態様において、樹脂をブロスに直接添加して、アンサマイトシンを抽出してもよい。
【００３６】
［３５］いくつかの手段によって、樹脂からアンサマイトシンを回収可能である。１つの態様において、ろ過によって樹脂を回収してもよい。第二の態様において、遠心分離によって樹脂を回収し、そして次いで、１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いて、ペレットを溶離させてもよい。第三の態様において、膨張層クロマトグラフィーによって、樹脂から、水性相および固体破片を除去してもよい。次いで、膨張層カラム中で樹脂を圧縮して、そして定組成溶離または勾配溶離によって、１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いて、溶離させてもよい。第四の態様において、樹脂を、部分的に浸透可能な膜によって、発酵ブロスから分離しながら、アンサマイトシンを抽出することも可能である。例えば、樹脂を充填した透析膜を、発酵ブロスとともに攪拌してもよく、水および低分子量構成要素が膜を通過することも可能であり、アンサマイトシンが樹脂に結合することが可能になる。次いで、透析バッグをブロスから取り除き、そして次いで、上述のように、回収された樹脂を溶離させてもよい。
【００３７】
［３６］望ましい場合、約５０℃〜５５℃で約３０分間〜２時間、穏やかな加熱に曝露することによって、または１％（ｖ／ｖ）クロロホルムを添加することによって、抽出前に、発酵ブロス中の微生物を不活性化してもよい（Ｔｏｒｕ Ｈａｓｅｇａｗａら １９８３， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３３：３１４−３２０）。
【００３８】
［３７］また、抽出前または抽出中、方法には、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための培地の処理が含まれてもよい。処理には、限定されるわけではないが、加熱、ｐＨの調整、あるいは酵素処理または化学薬品処理、例えばポリ硫酸鉄、脱乳化剤、ヒュームド・シリカ、またはアセトンもしくはメタノールなどのアルコールなどの共溶媒の添加が含まれてもよい。
【００３９】
［３８］有機相抽出の場合、２．０〜１３．０の間のｐＨで、しかし好ましくは約６．０〜７．０のｐＨで、そしてより好ましくは約６．５〜７．０のｐＨで、そして好ましくは酢酸ｎ−ブチルを用いて、抽出を行う。抽出効率を改善するため、抽出プロセス中、約５℃〜８０℃の間、好ましくは３０℃〜４５℃の間の温度に、ブロスを維持してもよい。
【００４０】
［３９］抽出時間は、ブロス組成、ブロスおよび抽出溶媒の温度、ブロスおよび溶媒を混合する方法、ならびに抽出に用いる溶媒を含む、いくつかの要因に応じる。抽出時間は、抽出法に応じて、１時間〜１２０時間の範囲である。例えば、迅速抽出およびろ過法を選択する場合、抽出時間は、１〜１２時間の間の範囲であってもよい。
【００４１】
［４０］ろ過中にろ過助剤を用いてもよい。こうした助剤には、限定されるわけではないが、Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ１０００、Ｃｅｌａｔｏｍ ＦＷ−８０、Ｈｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ ＣｅｌおよびＣｅｌｉｔｅが含まれる。場合によって、ろ過中に、ろ過助剤を直接、ブロスに添加してもよい。場合によって、また、フィルターをろ過助剤であらかじめコーティングしてもよい。この方法で使用可能なろ過法には、限定されるわけではないが、接線流ろ過、ろ過助剤でコーティングした擦過ドラムろ過（ｓｃｒａｐｉｎｇ ｄｒｕｍ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはバッチろ過が含まれる。
【００４２】
［４１］ｐＨ１〜ｐＨ５またはｐＨ８〜ｐＨ１３などの極端なｐＨで、あるいは６０℃〜９０℃などの非常に上昇した温度で、抽出を行う場合、アンサマイトシンの過剰な分解を回避する速度で、抽出を完了しなければならない。必要な場合は、また、連続遠心分離によって、抽出を非常に迅速に行ってもよい。こうした場合、厳しい条件への長時間の曝露が回避されるように、ブロスが遠心分離装置に入る際に、発酵ブロスのｐＨまたは温度を調整する。発酵プロセシングに用いられてきており、そしてアンサマイトシンを抽出するのに使用可能である遠心分離装置の例には、限定されるわけではないが、遠心分離デカンターおよび積層型ディスク遠心分離装置が含まれる。次いで、保持された有機溶媒抽出物を減圧下で濃縮して、アンサマイトシンを含有する残渣を生じてもよい。あるいは、水混和性溶媒を発酵ブロスと混合し、そして遠心分離して、固体を除去し、単相の固体不含溶液を生じてもよい。次いで、例えば水非混和性溶媒を添加して、有機相および水相の分離を生じ、その後、有機相を濃縮することによって、溶液をプロセシングしてもよい。
【００４３】
溶液中のアンサマイトシンの水性洗浄。
［４２］水非混和性有機溶媒の溶液中のアンサマイトシンを、水、水性酸、水性塩基、部分的にまたは完全に塩飽和された水、あるいは記載される任意の水性洗浄液の組み合わせで洗浄してもよい。水性酸の例には、限定されるわけではないが、１〜６．９の間のｐＨの塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸、およびリン酸の水溶液が含まれる。本発明の前後関係において、水性酸にはまた、酸性水性緩衝系が含まれる。酸性緩衝系の例には、限定されるわけではないが、各々、それぞれの酸性緩衝範囲で使用するために調整されたｐＨである、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸アンモニウム、およびギ酸アンモニウムが含まれる。水性塩基の例には、限定されるわけではないが、７．１〜１３の間のｐＨの、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、およびリン酸ナトリウムの水溶液が含まれる。本発明の前後関係において、水性塩基にはまた、塩基性水性緩衝系も含まれる。塩基性緩衝系の例には、限定されるわけではないが、各々、それぞれの塩基性緩衝範囲で使用するために調整されたｐＨである、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、および炭酸アンモニウムが含まれる。
【００４４】
［４３］酸性または塩基性洗浄は、アンサマイトシンの認識可能な分解がｐＨとともに変化することのないように、完了しなければならない。必要であれば、遠心分離技術によって、非常に迅速な抽出を行ってもよい。部分的にまたは完全に塩飽和された水の例には、限定されるわけではないが、多様な飽和レベルの水性塩化ナトリウム、多様な飽和レベルの水性硫酸ナトリウム、および多様な飽和レベルの水性塩化カリウムが含まれる。完全にまたは部分的に飽和された水性塩溶液の混合物を、水性塩基または水性酸と混合する、水性洗浄もまた行ってもよい。
【００４５】
抽出前のろ過：
［４４］あるいは、抽出前に、ろ過または遠心分離によって、アンサマイトシン含有発酵ブロス中の固体を分離してもよい。エタノール、水性エタノール、あるいは他の有機溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタンまたはアセトンなどの溶媒での洗浄によって、固体細胞塊中のアンサマイトシンを回収してもよく、そしてこうした洗浄は一般の当業者に周知である。本出願の他の箇所に記載するように、既知の芳香族有機溶媒を用いた抽出によって、ろ液中のアンサマイトシンを回収してもよい。
【００４６】
アンサマイトシンの精製：
［４５］未精製産物を、シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーなどの精製法に供してもよく、その後、必要であれば再結晶化に供してもよい。好ましくは、Ｂｉｏｔａｇｅクロマトグラフィーシステムを用いた、Ｂｉｏｔａｇｅシリカゲル・カートリッジなどの、あらかじめ充填されたカラム上で、クロマトグラフィーを行う。酢酸エチルおよびヘキサンの混合物で出発し、そして増加する量のメタノールを添加する、溶媒勾配を用いて、カラムから所望のアンサマイトシンを溶出してもよい。所望のアンサマイトシンを含有する分画をプールし、そして濃縮してもよい。所望の場合、産物を溶解するため、酢酸エチルなどの溶媒を用い、そして次いで、ヘプタンまたはヘキサンなどの非極性溶媒を添加して、純粋な産物を結晶化させる、結晶化によって、アンサマイトシンをさらに精製してもよい。用語、結晶化は、溶液から形成される固体が、無定形または規定の構造のいずれを有してもよいという点で、本明細書において、用語、沈殿もまた含む。
【００４７】
細胞結合剤／メイタンシノイド複合体：
［４６］本発明の方法を用いて、腫瘍が活性化するプロドラッグとして有用である、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体を作製してもよい。本発明の方法によって調製されるアンサマイトシンは、還元性切断を経て、メイタンシノールを生じることも可能であり、該物質は、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン含有メイタンシノイド誘導体を産生するために、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，３３３，４１０号および第６，４４１，１６３号に記載されるように使用可能である。次いで、ジスルフィド含有リンカーなどの多様なリンカーを介して、これらの誘導体を、細胞結合剤、好ましくは抗体にコンジュゲート化させる。
【実施例】
【００４８】
実施例
［４７］本発明はここで、限定されない実施例を参照することによって、例示される。
実施例１．アンサマイトシンの産生：
［４８］一次播種：２％可溶性デンプン、１％グルコース、１％大豆ミール、０．５％コーンスティープリカー、（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）０．５％Ｓｏｙｔｏｎｅ、０．３％塩化ナトリウム、および０．５％炭酸カルシウムを含む、播種培地ＶＭ４−１’（４００ｍｌ／フラスコ）を、最大容積２ｌの三角フラスコ１１個に注いだ。滅菌後、各フラスコにＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）培養物を接種した。軌道振盪装置上、２３０ｒｐｍで４８時間、２８℃でフラスコをインキュベーションした。
【００４９】
［４９］二次播種：次いで、一次播種フラスコの内容物をプールした。３００ｌの発酵槽に１００ｌのＶＭ４−１’播種培地を満たした。滅菌後、発酵槽に４ｌのプールした一次播種培養物を接種した。発酵槽を８０ｒｐｍで攪拌しながら２８℃に維持した。必要であれば通気および攪拌増加によって、溶解酸素レベルを３０％飽和より高く維持した。２４時間インキュベーションした後、二次播種培養物は、産生容器中に移す準備ができた。
【００５０】
［５０］産生：２つの３００ｌ産生発酵槽に、各々、２５０ｌの産生培地ＦＭ４−６（表１を参照されたい）を満たした。滅菌後、発酵槽に、各々、１５ｌの二次播種培養物を接種した。１０７±５ｒｐｍでの攪拌および０．４ｖｖｍでの通気を伴い、発酵槽を２８℃に維持した。第２日以降、攪拌速度を最大１７０±５ｒｐｍに、そして通気速度を最大１ｖｖｍに増加させることによって、溶解酸素含量を３０％より高く維持した。発酵ブロスの試料を抜き取って、そしてエタノール中に希釈し、その後、ＨＰＬＣ分析によって定量化することによって、アンサマイトシン力価を毎日測定した。第１０日まで発酵を続け、この時点で、アンサマイトシン増加は横ばい状態となった。２つの発酵槽中の第１０日のアンサマイトシン力価は、それぞれ、２５１ｍｇ／ｌおよび２４４ｍｇ／ｌであった。リン酸を添加することによって、発酵ブロスのｐＨを６．５に調整した。発酵槽を５５℃に加熱して、そしてこの温度で１時間維持して、微生物を不活性化した。次いで、有機溶媒を用いた抽出のため、発酵槽を周囲温度に冷却した。
【００５１】
実施例２：フィード・バッチ法を用いたアンサマイトシンの産生。
［５１］１５００ｌの産生発酵槽に９００ｌの産生培地ＦＭ４−６（表１を参照されたい）を満たした。滅菌後、発酵槽に、上述のように調製した５４ｌの二次播種培養物を接種した。１０７±５ｒｐｍでの攪拌および０．４ｖｖｍでの通気を伴い、発酵槽を２８℃に維持した。０〜４８時間に、０．３９ｍｌ／ｌ／時間の速度で、２８．５％グルコースの水溶液を供給した。４８〜２８８時間に、０．５１ｍｌ／ｌ／時間の速度で供給される、２１．５％グルコース、７．１％Ｐｒｏｆｌｏおよび７．１％イソブタノールを含むストック溶液に、供給をスイッチした。第２日以降、攪拌速度を最大１７０±５ｒｐｍに、そして通気速度を最大１ｖｖｍに増加させることによって、溶解酸素含量を２０％より高く維持した。発酵ブロスの試料を抜き取って、そしてエタノール中に希釈し、その後、ＨＰＬＣにより定量分析することによって、アンサマイトシン力価を毎日測定した。第１３日まで発酵を続け、この時点で、アンサマイトシン増加は横ばい状態となった。発酵槽中の第１３日のアンサマイトシン力価は、３０４ｍｇ／ｌであった。リン酸を添加することによって、発酵ブロスのｐＨを６．５に調整した。
【００５２】
［５２］熱不活性化。発酵槽を５５℃に加熱し、そしてこの温度で１時間維持して、微生物を不活性化した。次いで、有機溶媒を用いた抽出のため、発酵槽を３０〜４０℃の間に冷却した。
【００５３】
実施例３．アンサマイトシンの抽出およびクロマトグラフィー精製。
［５３］実施例２由来の発酵ブロスを等体積の酢酸ｎ−ブチルと混合した。混合物を３０および４０℃〜４５℃の間に維持し、そして２つの相の混合が溶媒界面でのみ起こるように、穏やかに攪拌した。抽出を最大５日間続けるか、または有機層のＨＰＬＣ分析が、＞８０％のアンサマイトシンが抽出されたことを示すまで、続けた。次いで、有機層を分離し、そして流下膜式蒸発装置を用いて蒸発させ、２０〜５０ｌの間の最終体積にした。濃縮抽出物を２．２ｋｇのシリカゲルを含有するフラスコに移した。回転蒸発装置を用いて、減圧下で操作し、乾燥するまで溶媒を蒸発させることによって、未精製アンサマイトシンでシリカゲル上をコーティングした。次いで、コーティングされたシリカを、Ｂｉｏｔａｇｅ， Ｉｎｃ．、バージニア州シャーロッツビルから得た、試料注入モジュール（ＳＩＭ）に移した。ＳＩＭを、シクロヘキサンおよびヘキサン（２：１ ｖ／ｖ）の混合物で洗浄し、そして次いでシリカ・カートリッジを装備したＢｉｏｔａｇｅ １５０Ｍシステムに連結した。酢酸エチル：ヘキサン：メタノール（２９．４：６８．６：２．０、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を用いて、所望の産物をカラムから溶離させた。アンサマイトシンを含有する分画をプールし、そして減圧下で溶媒を蒸発させた。高真空下で２４時間、産物をさらに乾燥させた。
【００５４】
実施例４．アンサマイトシンの再結晶化。
［５４］上記工程からの乾燥産物を熱酢酸エチル（２３ｍｌ／ｇ残渣）中に溶解した。アンサマイトシンの完全な溶解が達成されるまで、混合物を６０〜７５℃の間に維持した。バッチの温度を６０〜７５℃の間に維持しつつ、ヘプタン（８０ｍｌ／ｇ残渣）をゆっくりと添加した。ヘプタンをすべて添加した後、バッチを室温に冷却させた。ろ過によって結晶を回収し、そして次いで、高真空下で乾燥させて、２２１グラムの純粋なアンサマイトシンを生じた。
【００５５】
実施例５：ろ過を用いた発酵ブロスの抽出。
［５５］実施例２に記載するように調製した発酵ブロス（２００ｍｌ）を、２００ｍｌの酢酸ｎ−ブチル（２００ｍｌ）と、５分間、激しく混合し、エマルジョンを生じた。Ｃｅｌｌａｔｏｍ ＦＷ−８０ろ過助剤（２０ｇ）を添加し、そしてＣｅｌｌａｔｏｍ ＦＷ−８０ろ過助剤であらかじめコーティングしたブフナー漏斗を通じて、混合物を真空ろ過した。ろ過ケーキを４０ｍｌの酢酸ｎ−ブチルで洗浄した。ここで固体混入物を含まず、透明な有機および水性層を含むろ液を分液漏斗に移した。水性層を排出した。アンサマイトシンを含有する有機層は保持された。
【００５６】
実施例６：水非混和性溶媒を用いた遠心分離での発酵ブロスの抽出。
［５６］実施例２に記載するように調製した発酵ブロスの一部分を、酢酸ｎ−ブチルの一部分と、２分間、激しく混合した。生じたエマルジョンを１分間遠心分離し、そして固体混入物質を含まず、アンサマイトシンを含有する有機層を抜き取った。
【００５７】
実施例７：水混和性溶媒を用いた遠心分離での発酵ブロスの抽出。
［５７］実施例２に記載するように調製した発酵ブロスの一部分を、アセトンの一部分と、激しく混合した。混合物を１分間遠心分離して、固体をペレットにした。上清を抜き取り、そして半分の部分のヘキサンと混合した。水性層が分離し、アンサマイトシンを含有する透明な有機層が残った。
【００５８】
実施例８．ＸＡＤ−１６疎水性ビーズを用いた、アンサマイトシンの固相抽出。
［５８］実施例２に記載するように調製した発酵ブロス１ｌを、１０グラムのＸＡＤ−１６ビーズとともに、６時間、攪拌した。次いで、混合物を遠心分離し、そして上清を除去した。ペレットを小さいカラムに移し、そして脱イオン水、その後、９０：１０の脱イオン水：アセトニトリルで溶離させた。アンサマイトシンを含有する分画を合わせ、そして溶媒を蒸発させて１１２ｍｇの濃縮抽出物を得た。ＨＰＬＣ分析は、抽出物が５０ｍｇのアンサマイトシンを含有することを示した。
【００５９】
［５９］本発明は詳細に、そしてその特定の態様に関連して記載されてきているが、一般の当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変化および修飾を本発明に作成可能であることが明らかであろう。
【００６０】
［６０］本明細書に言及されるすべての刊行物は、明確に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】［２５］図１は、発酵によって作製可能な多様なアンサマイトシンＣ−３エステル、ならびにＣ−３アルコール、メイタンシノール（Ｐ−０）の構造を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
［０１］本発明は、アンサマイトシンの産生法に関する。アンサマイトシンは、Ｃ−３エステル側鎖が異なる、アンサマイトシンの混合物を指す。アンサマイトシンは、Ｃ−３アルコール・メイタンシノールに変換可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０２］アンサマイトシンは、アクチノシネマ・プレチオスム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）などの微生物の発酵に由来する非常に細胞傷害性が高い化合物である。アンサマイトシンは、チオール含有メイタンシノイドに化学的に変換されてきており、細胞結合剤−メイタンシノイド・コンジュゲートの形でのその療法的使用が記載されてきている（米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，３３３，４１０号；および第６，４４１，１６３号）。
【０００３】
［０３］アクチノシネマ・プレチオスムなどのアクチノシネマ属種株を用いた発酵法は、Ｃ−３に異なるエステル置換基を所持するいくつかのアンサマイトシン種を産生する（図１）。産生される多様なＣ−３エステルには、Ｐ−３（イソ−ブチリル）、Ｐ−３’（ｎ−ブチリル）、Ｐ−２（プロピオニル）、Ｐ−４（イソ−バレリル）、Ｐ−４’（ｎ−バレリル）が含まれる。これらのエステルはすべて、還元的に切断されて、Ｃ−３アルコール・メイタンシノール（Ｐ−０）を生じることも可能であり、これは、チオール含有メイタンシノイドの合成のための前駆体である。さらに、Ｎ−デメチル、２０−Ｏ−デメチル、および１９−デクロロなどの、他の部位で修飾された、少量の望ましくないアンサマイトシンが産生される。還元的脱アシル化に際して、これらのアンサマイトシンはメイタンシノールを産生しない。
【０００４】
［０４］アクチノシネマ属種の発酵からアンサマイトシンを産生するための方法が記載されてきている（米国特許第４，１６２，９４０号；第４，４５０，２３４号；第４，２２８，２３９号；第４，３３１，５９８号；および第４，３５６，２６５号）。産生されるアンサマイトシンの収量は多様であり、力価は一般的に１２ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌの範囲である。アンサマイトシンは、典型的には、全発酵ブロスへのろ過助剤および有機溶媒の添加、その後の、有機層の濃縮および石油エーテルでの沈殿を伴う、多工程法によって回収され、そして精製される。沈殿物は、シリカクロマトグラフィーおよび結晶化、その後の再結晶化またはクロマトグラフィーによるさらなる精製を用いて、さらに精製された。
【０００５】
［０５］このように、方法は煩雑であり、そして非常に毒性が高い物質を扱わなければならない、いくつかの工程を伴う。このため、こうした方法のスケールアップは非常に困難である。さらに、多様なプロセシング工程の間中、操作する人の安全性が保証されなければならない。
【０００６】
［０６］最近の出願（ＵＳ ２００２／００１５９８４ Ａ１）は、アンサマイトシン産生法の特定の改善を主張する。発酵ブロス中のアンサマイトシン力価は、６５〜８６ｍｇ／ｌの範囲であったと報告される。主張される改善には、７５℃でのブロスの熱不活性化、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒中への抽出、開放シリカカラムを通じたクロマトグラフィー、その後の結晶化が含まれた。アンサマイトシン産生のコストを減らすため、先に記載されるものより有意により高い力価（発酵槽中、最高４００ｍｇ／ｌ）を生じる新規アクチノシネマ属種株が産生されている。アンサマイトシンの産生に関して、以前記載された方法には、いくつかの欠点があり、そしてしたがって、開発されてきている新規の高産生株には適応不能である。例えば、７５℃での熱不活性化は、アンサマイトシンのある程度の分解を生じ、そして収量が１０〜２０％損失する。アンサマイトシンは芳香族炭化水素溶媒中ではそれほど可溶性でないため、アンサマイトシンを高い含量で含有する発酵ブロスのこうした溶媒での抽出は不十分であり、そして不完全である。開放自己充填シリカカラム上でのアンサマイトシンの精製には、２つの欠点がある：１）純度および回収率のロット間変動、および２）安全性の懸念を生じる、人のかなりの曝露。したがって、非常に毒性が高い薬剤への作業者の曝露を最小限にしつつ、アンサマイトシンを高収率で生じ、そしてまたその単離および精製に効率的な方法を提供する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
［０７］本発明の１つの側面は、アンサマイトシン産生微生物の大規模発酵法であって、新規の非常に生産性が高いアンサマイトシン産生株に特に適用可能な方法である。
【０００８】
［０８］本発明の別の側面は、未精製アンサマイトシンを単離し、そして精製アンサマイトシンを調製するための方法であって、以下の工程：
１）例えば約５０℃〜５５℃の熱への曝露によるか、または体積１％のクロロホルムを添加することによる、場合による培養物の不活性化、２）非芳香族有機溶媒を用いた抽出、３）抽出物の濃縮、４）シリカまたはアルミナカラム、好ましくはあらかじめ充填されたシリカ・カートリッジカラム上での濃縮物の精製、および５）産物の結晶化
を含む、前記調製法である。
【０００９】
［０９］本発明の他の側面には、以下が含まれる：
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１０】
［１０］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１１】
［１１］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化によってアンサマイトシンを精製する工程
を含む、前記調製法。
【００１２】
［１２］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いた、培地からのアンサマイトシンの抽出工程；
３）固体を除去し、有機相の単離を可能にする、ろ過工程
４）有機相からのアンサマイトシンの濃縮工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１３】
［１３］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）多様な遠心分離技術を用い、非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１４】
［１４］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）１以上の水混和性有機溶媒の存在下で、ブロスを遠心分離して、溶液中にアンサマイトシンを保持しつつ、固体を除去する工程；
３）水非混和性非芳香族溶媒を添加して、有機層中へのアンサマイトシンの抽出を可能にする工程。場合によって抽出中に、多様な塩または他の構成要素もまた、有機相に添加してもよい。
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１５】
［１５］精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）アンサマイトシンの抽出を促進するための、場合による培地の処理工程；
３）培地から樹脂上へのアンサマイトシンの固相抽出工程；
４）１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いた、樹脂からのアンサマイトシンの定組成溶離または勾配溶離工程；
５）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
６）場合によって、さらにａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【００１６】
［１６］これらの態様において、本発明は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；
（ｉｉ）工程２の前の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；または
（ｉｉｉ）沈殿の前または後のいずれかに、有機溶媒中のアンサマイトシンの未精製溶液を、水、水性塩溶液、水性酸または水性塩基の任意の連続した組み合わせで洗浄する、洗浄工程。この工程は、精製の多様な段階で行ってもよい；
を含んでもよい。
【００１７】
［１７］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）場合によって発酵ブロス中のアンサマイトシン産生微生物を不活性化する工程；および
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程
を含む、前記抽出法。
【００１８】
［１８］上記方法はまた、工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理も含んでもよい。
［１９］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）非芳香族水非混和性溶媒を用いた、発酵ブロスからのアンサマイトシンの抽出；および
２）固体を除去し、有機相の単離を可能にする、ろ過；
を含む、前記抽出法。上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）工程２の前の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００１９】
［２０］発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：非芳香族水非混和性溶媒を用いた多様な遠心分離技術によって、培地からアンサマイトシンを抽出する工程を含む、前記抽出法。
【００２０】
［２１］上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００２１】
［２２］発酵ブロスから固形デブリを除去するための方法であって：
１）溶液中にアンサマイトシンを保持しながら、固体を除去するための、水混和性有機溶媒の存在下での発酵ブロスの遠心分離、
を含む、前記方法。
【００２２】
［２３］上記方法は、場合によって：
（ｉ）発酵ブロス中の微生物の化学薬品または熱不活性化；および／または
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中の、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための、培地の処理；
を含んでもよい。
【００２３】
［２４］上述の方法において、アンサマイトシン産生微生物は、アクチノシネマ属種であることが好ましく、より好ましくはアクチノシネマ・プレチオスムである。アンサマイトシン産生微生物はまた、アクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５またはそれから派生する株、あるいはアクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）またはそれから派生する株であってもよい。米国特許第４，４５０，２３４号に記載されるように、アクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５は、（ｉ）財団法人発酵研究所、〒５３２−８６８６ 大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５、日本に、寄託番号ＩＦＯ １３９６３の元、１９７９年８月２０日に寄託され；（ｉｉ）生命工学工業技術研究所（以前の微生物工業技術研究所）、産業技術総合研究所、経済産業省、〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１−１、日本に、寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ ＮＯ．５１８５の元、１９７９年８月２９日に寄託され；そして（ｉｉｉ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， 米国に、寄託番号ＡＴＣＣ ３１５６５の元、１９７９年９月１１日に寄託された。さらに、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４は、ブダペスト条約の規定の元に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， 米国に、２００１年１２月１１に寄託され、そして寄託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１を与えられた。
【００２４】
発明の詳細な説明
［２６］巨大発酵槽における液体培地中、アンサマイトシンに関して非常に生産性が高い微生物の培養法を提供する。アンサマイトシンが非常に可溶性である、非芳香族水非混和性有機溶媒中に培養ブロスおよび微生物からアンサマイトシンを抽出するための方法、ならびに必要な場合、シリカまたはアルミナカラムであって、好ましくはあらかじめ充填されたカートリッジである、前記カラムの通過、その後、産物の結晶化によってアンサマイトシンを精製するための方法もまた、提供する。必要な場合、抽出工程前の熱処理またはクロロホルム処理によって、微生物を不活性化してもよい。
【００２５】
［２７］アンサマイトシンＰ−３、Ｐ−３’、Ｐ−４、Ｐ−４’、Ｐ−２およびＰ−１（図１）などの多様なＣ−３エステルの混合物を含んでもよい精製アンサマイトシンを、還元剤で処理して、所望のＣ−３ヒドロキシル化合物、メイタンシノール（Ｐ−０）を生じてもよい。精製されたアンサマイトシンは、典型的には、Ｃ−３位以外の分子の部位に修飾を有する、望ましくないアンサマイトシンを少量しか含有しない。好ましくは、アンサマイトシン産生株は、アクチノシネマ属種である。より好ましくは、微生物はアクチノシネマ・プレチオスムである。微生物はまた、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）およびその派生株、ならびにアクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５およびその派生株であってもよい。本明細書に記載する特定の培地または当該技術分野に記載される他の任意の培地を用い、一般の当業者に知られる発酵培養技術によって、微生物を増殖させてもよい（米国特許第４，１６２，９４０号；第４，４５０，２３４号；第４，２２８，２３９号；第４，３３１，５９８号；および第４，３５６，２６５号）。
【００２６】
［２８］本発明の方法の１つの態様は、液体培地中での微生物の培養である。管理された条件下で、細菌株ＰＦ４−４の増殖を行い、そして増殖は、非常に多様な培地および条件を使用してもよい。例えば、発行された米国特許第４，１３７，２３０号；第４，１６２，９４０号；第４，３３１，５９８号；第４，３５６，２６５号；および第４，４５０，２３４号において、ＡＴＣＣ ３１５６５またはＡＴＣＣ ３１２８１に関して記載されるものと類似の条件下で、そして類似の培地を用いて；そしてＨａｔａｎｏら， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４８， １７２１−１７２９， １９８４に記載されるように、ＰＦ４−４を増殖させてもよい。したがって、ＰＦ４−４株は、やはりアンサマイトシンの発酵産生を支援する、非常に多様な炭素供給源を許容する。例示的な増殖培地を表１および２に示す。表１は、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４などのアンサマイトシン産生微生物によるアンサマイトシンの産生を支援する培地を示し、そして表２は、アクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４、および他のアンサマイトシン産生微生物の増殖および／または成長に適したさらなる培地を示す。
表１．産生培地組成（記入は％ｗ／ｖである）。
【００２７】
【表１】
【００２８】
滅菌は１２１℃で２０分間であった。1最後に添加した。
表２．関連培地
【００２９】
【表２】
【００３０】
ＰＦ４−４株からのアンサマイトシンの発酵産生に好ましい方法を、以下の実施例１および２にさらに記載する。
発酵：
［２９］静置、振盪、有酸素液内などの培養条件または任意の他の培養条件によって、培養を行ってもよい。巨大タンク発酵槽における優れた培養増殖およびアンサマイトシンの高産生のため、有酸素液内培養が好ましい。発酵中に栄養分を供給することによって、アンサマイトシン産生をさらに増進してもよい。例えば、ＦＭ４−６培地中で生物を培養する際、発酵期間中にグルコースをさらに供給するか、あるいは最初の約２４〜７２時間の間、好ましくは最初の約４８時間の間、グルコースを供給し、その後、発酵終了時にアンサマイトシン産生の倍増を生じうるまで、グルコースおよびワタ（ｃｏｔｔｏｎ）種子粉（例えばＴｒａｄｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ、テネシー州メンフィスのＰｒｏｆｌｏまたはＰｈａｒｍａｍｅｄｉａ）または大豆粉などのタンパク質栄養分、ならびにイソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、イソバレルアルデヒドなどの、Ｃ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドを供給する。培養条件は、用いた培地および産生規模に応じるが、通常、約５〜９のｐＨ範囲で、好ましくは約６．５〜８．０の出発ｐＨで、発酵を行うことが好ましい。より好ましくは、ｐＨ範囲は約７〜８であり、さらにより好ましくは、約７〜７．４である。最も好ましいｐＨは約７．２である。温度は、約１５℃〜３５℃の範囲であってもよく、好ましい範囲は約２５℃〜３０℃である。より好ましくは、温度は約２８℃である。最大アンサマイトシン集積が達成されるまで、発酵を続ける。培養時間は多様であることも可能であり、そして培養法、培地組成、および温度を含むいくつかの要因に応じうる。典型的には、発酵時間は、９６〜３３６時間の範囲である。
【００３１】
アンサマイトシンの分析：
［３０］米国特許第４，３３１，５９８号および第４，４５０，２３４号において、親株ＡＴＣＣ ３１５６５は、Ｃ−１４でのメチル基またはヒドロキシメチル基の存在によって区別される２つのクラスのアンサマイトシンを産生すると開示される（図１を参照されたい）。どちらのクラスに関しても、Ｃ−３酸素原子に結合したそれぞれのアシル側鎖が異なり、そしてＣ−１４がメチル基またはヒドロキシメチル基（または続く研究では、Ｎ−デメチル）を所持するかどうかに関して異なる、いくつかの異なるアンサマイトシンが産生される。順序が変わった化合物に関して、本明細書に用いる命名法は、図１に準拠して、上に定義される。
【００３２】
［３１］アンサマイトシンＰ−３は、特定の増殖条件下で、ＰＦ４−４および親株ＡＴＣＣ ３１５６５の主要な産物である。細菌をバリンまたはイソ酪酸（米国特許第４，２２８，２３９号）、あるいはイソブチルアルコールまたはイソブチルアルデヒド（米国特許第４，３５６，２６５号）の存在下で増殖させると、他のアンサマイトシン化合物は、少量しか存在しない。すべてイソブチルアルコールを含有する、異なる発酵培地（表１中でＦＭと称される）中でＰＦ４−４株を増殖させると、アンサマイトシンＰ−３が、産生される主なアンサマイトシンである。アンサマイトシンの量をアッセイする１つの方法において、発酵ブロスの試料をエタノールまたはアセトニトリルで希釈し、次いで強く振盪し、そして最後に遠心分離する。次いで、アンサマイトシンＰ−３含量に関して、上清をアッセイする。
【００３３】
［３２］好ましくは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、アンサマイトシンを分画し、そして分析するが、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは薄層クロマトグラフィーなどの任意の適切な技術が使用可能である。１つの方法において、酢酸エチル、塩化メチレンまたはクロロホルムなどの有機溶媒を用いて発酵ブロスを抽出し、そして有機溶媒中のＰ−３の含量を、逆相Ｃ１８またはＣ８カラムを用いたＨＰＬＣによって決定する。
【００３４】
アンサマイトシンの抽出：
［３３］二次代謝産物の回収に一般的に使用される方法によって、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出してもよい。アンサマイトシンは、非芳香族溶媒に容易に可溶性であるため、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトンおよびハロゲン化溶媒などの非芳香族水非混和性溶媒と攪拌することによって、容易に抽出可能である。適切な酢酸アルキルの例には、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルが含まれる。適切なジアルキルケトンの例はメチルイソブチルケトンである。適切なハロゲン化溶媒の例は、ジクロロメタンである。酢酸ｎ−ブチルでの抽出が好ましい。好ましくは、発酵ブロス対非芳香族水非混和性溶媒の体積比は、１：１である。
【００３５】
［３４］また、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手可能なアンバーライトＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、三菱化成工業から商業的に入手可能なＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０、ＨＰ２１、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ７０、ＳＰ７００などの多様な樹脂上に、発酵ブロスからアンサマイトシンを吸着させてもよい。これらの例は、範囲を限定せず、一般の当業者に知られる他の樹脂もまた、上記目的のために使用可能である。磁気的にまたは膨張層クロマトグラフィーなどの吸着剤密度に頼る方法によって、ブロスからポリマーを回収可能であるように、磁石または高密度物質などの二次構造上のコーティングとしてもまた、樹脂を使用可能である。アンサマイトシンが樹脂上に吸着されたならば、定組成溶離または勾配溶離によって、１以上の有機溶媒を用いて、これらを溶離させることも可能である。１つの態様において、樹脂をブロスに直接添加して、アンサマイトシンを抽出してもよい。
【００３６】
［３５］いくつかの手段によって、樹脂からアンサマイトシンを回収可能である。１つの態様において、ろ過によって樹脂を回収してもよい。第二の態様において、遠心分離によって樹脂を回収し、そして次いで、１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いて、ペレットを溶離させてもよい。第三の態様において、膨張層クロマトグラフィーによって、樹脂から、水性相および固体破片を除去してもよい。次いで、膨張層カラム中で樹脂を圧縮して、そして定組成溶離または勾配溶離によって、１以上の有機溶媒または水と混合した１以上の有機溶媒を用いて、溶離させてもよい。第四の態様において、樹脂を、部分的に浸透可能な膜によって、発酵ブロスから分離しながら、アンサマイトシンを抽出することも可能である。例えば、樹脂を充填した透析膜を、発酵ブロスとともに攪拌してもよく、水および低分子量構成要素が膜を通過することも可能であり、アンサマイトシンが樹脂に結合することが可能になる。次いで、透析バッグをブロスから取り除き、そして次いで、上述のように、回収された樹脂を溶離させてもよい。
【００３７】
［３６］望ましい場合、約５０℃〜５５℃で約３０分間〜２時間、穏やかな加熱に曝露することによって、または１％（ｖ／ｖ）クロロホルムを添加することによって、抽出前に、発酵ブロス中の微生物を不活性化してもよい（Ｔｏｒｕ Ｈａｓｅｇａｗａら １９８３， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３３：３１４−３２０）。
【００３８】
［３７］また、抽出前または抽出中、方法には、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するための培地の処理が含まれてもよい。処理には、限定されるわけではないが、加熱、ｐＨの調整、あるいは酵素処理または化学薬品処理、例えばポリ硫酸鉄、脱乳化剤、ヒュームド・シリカ、またはアセトンもしくはメタノールなどのアルコールなどの共溶媒の添加が含まれてもよい。
【００３９】
［３８］有機相抽出の場合、２．０〜１３．０の間のｐＨで、しかし好ましくは約６．０〜７．０のｐＨで、そしてより好ましくは約６．５〜７．０のｐＨで、そして好ましくは酢酸ｎ−ブチルを用いて、抽出を行う。抽出効率を改善するため、抽出プロセス中、約５℃〜８０℃の間、好ましくは３０℃〜４５℃の間の温度に、ブロスを維持してもよい。
【００４０】
［３９］抽出時間は、ブロス組成、ブロスおよび抽出溶媒の温度、ブロスおよび溶媒を混合する方法、ならびに抽出に用いる溶媒を含む、いくつかの要因に応じる。抽出時間は、抽出法に応じて、１時間〜１２０時間の範囲である。例えば、迅速抽出およびろ過法を選択する場合、抽出時間は、１〜１２時間の間の範囲であってもよい。
【００４１】
［４０］ろ過中にろ過助剤を用いてもよい。こうした助剤には、限定されるわけではないが、Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ１０００、Ｃｅｌａｔｏｍ ＦＷ−８０、Ｈｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ ＣｅｌおよびＣｅｌｉｔｅが含まれる。場合によって、ろ過中に、ろ過助剤を直接、ブロスに添加してもよい。場合によって、また、フィルターをろ過助剤であらかじめコーティングしてもよい。この方法で使用可能なろ過法には、限定されるわけではないが、接線流ろ過、ろ過助剤でコーティングした擦過ドラムろ過（ｓｃｒａｐｉｎｇ ｄｒｕｍ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはバッチろ過が含まれる。
【００４２】
［４１］ｐＨ１〜ｐＨ５またはｐＨ８〜ｐＨ１３などの極端なｐＨで、あるいは６０℃〜９０℃などの非常に上昇した温度で、抽出を行う場合、アンサマイトシンの過剰な分解を回避する速度で、抽出を完了しなければならない。必要な場合は、また、連続遠心分離によって、抽出を非常に迅速に行ってもよい。こうした場合、厳しい条件への長時間の曝露が回避されるように、ブロスが遠心分離装置に入る際に、発酵ブロスのｐＨまたは温度を調整する。発酵プロセシングに用いられてきており、そしてアンサマイトシンを抽出するのに使用可能である遠心分離装置の例には、限定されるわけではないが、遠心分離デカンターおよび積層型ディスク遠心分離装置が含まれる。次いで、保持された有機溶媒抽出物を減圧下で濃縮して、アンサマイトシンを含有する残渣を生じてもよい。あるいは、水混和性溶媒を発酵ブロスと混合し、そして遠心分離して、固体を除去し、単相の固体不含溶液を生じてもよい。次いで、例えば水非混和性溶媒を添加して、有機相および水相の分離を生じ、その後、有機相を濃縮することによって、溶液をプロセシングしてもよい。
【００４３】
溶液中のアンサマイトシンの水性洗浄。
［４２］水非混和性有機溶媒の溶液中のアンサマイトシンを、水、水性酸、水性塩基、部分的にまたは完全に塩飽和された水、あるいは記載される任意の水性洗浄液の組み合わせで洗浄してもよい。水性酸の例には、限定されるわけではないが、１〜６．９の間のｐＨの塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸、およびリン酸の水溶液が含まれる。本発明の前後関係において、水性酸にはまた、酸性水性緩衝系が含まれる。酸性緩衝系の例には、限定されるわけではないが、各々、それぞれの酸性緩衝範囲で使用するために調整されたｐＨである、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸アンモニウム、およびギ酸アンモニウムが含まれる。水性塩基の例には、限定されるわけではないが、７．１〜１３の間のｐＨの、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、およびリン酸ナトリウムの水溶液が含まれる。本発明の前後関係において、水性塩基にはまた、塩基性水性緩衝系も含まれる。塩基性緩衝系の例には、限定されるわけではないが、各々、それぞれの塩基性緩衝範囲で使用するために調整されたｐＨである、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、および炭酸アンモニウムが含まれる。
【００４４】
［４３］酸性または塩基性洗浄は、アンサマイトシンの認識可能な分解がｐＨとともに変化することのないように、完了しなければならない。必要であれば、遠心分離技術によって、非常に迅速な抽出を行ってもよい。部分的にまたは完全に塩飽和された水の例には、限定されるわけではないが、多様な飽和レベルの水性塩化ナトリウム、多様な飽和レベルの水性硫酸ナトリウム、および多様な飽和レベルの水性塩化カリウムが含まれる。完全にまたは部分的に飽和された水性塩溶液の混合物を、水性塩基または水性酸と混合する、水性洗浄もまた行ってもよい。
【００４５】
抽出前のろ過：
［４４］あるいは、抽出前に、ろ過または遠心分離によって、アンサマイトシン含有発酵ブロス中の固体を分離してもよい。エタノール、水性エタノール、あるいは他の有機溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタンまたはアセトンなどの溶媒での洗浄によって、固体細胞塊中のアンサマイトシンを回収してもよく、そしてこうした洗浄は一般の当業者に周知である。本出願の他の箇所に記載するように、既知の芳香族有機溶媒を用いた抽出によって、ろ液中のアンサマイトシンを回収してもよい。
【００４６】
アンサマイトシンの精製：
［４５］未精製産物を、シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーなどの精製法に供してもよく、その後、必要であれば再結晶化に供してもよい。好ましくは、Ｂｉｏｔａｇｅクロマトグラフィーシステムを用いた、Ｂｉｏｔａｇｅシリカゲル・カートリッジなどの、あらかじめ充填されたカラム上で、クロマトグラフィーを行う。酢酸エチルおよびヘキサンの混合物で出発し、そして増加する量のメタノールを添加する、溶媒勾配を用いて、カラムから所望のアンサマイトシンを溶出してもよい。所望のアンサマイトシンを含有する分画をプールし、そして濃縮してもよい。所望の場合、産物を溶解するため、酢酸エチルなどの溶媒を用い、そして次いで、ヘプタンまたはヘキサンなどの非極性溶媒を添加して、純粋な産物を結晶化させる、結晶化によって、アンサマイトシンをさらに精製してもよい。用語、結晶化は、溶液から形成される固体が、無定形または規定の構造のいずれを有してもよいという点で、本明細書において、用語、沈殿もまた含む。
【００４７】
細胞結合剤／メイタンシノイド複合体：
［４６］本発明の方法を用いて、腫瘍が活性化するプロドラッグとして有用である、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体を作製してもよい。本発明の方法によって調製されるアンサマイトシンは、還元性切断を経て、メイタンシノールを生じることも可能であり、該物質は、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン含有メイタンシノイド誘導体を産生するために、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，３３３，４１０号および第６，４４１，１６３号に記載されるように使用可能である。次いで、ジスルフィド含有リンカーなどの多様なリンカーを介して、これらの誘導体を、細胞結合剤、好ましくは抗体にコンジュゲート化させる。
【実施例】
【００４８】
実施例
［４７］本発明はここで、限定されない実施例を参照することによって、例示される。
実施例１．アンサマイトシンの産生：
［４８］一次播種：２％可溶性デンプン、１％グルコース、１％大豆ミール、０．５％コーンスティープリカー、（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）０．５％Ｓｏｙｔｏｎｅ、０．３％塩化ナトリウム、および０．５％炭酸カルシウムを含む、播種培地ＶＭ４−１’（４００ｍｌ／フラスコ）を、最大容積２ｌの三角フラスコ１１個に注いだ。滅菌後、各フラスコにＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）培養物を接種した。軌道振盪装置上、２３０ｒｐｍで４８時間、２８℃でフラスコをインキュベーションした。
【００４９】
［４９］二次播種：次いで、一次播種フラスコの内容物をプールした。３００ｌの発酵槽に１００ｌのＶＭ４−１’播種培地を満たした。滅菌後、発酵槽に４ｌのプールした一次播種培養物を接種した。発酵槽を８０ｒｐｍで攪拌しながら２８℃に維持した。必要であれば通気および攪拌増加によって、溶解酸素レベルを３０％飽和より高く維持した。２４時間インキュベーションした後、二次播種培養物は、産生容器中に移す準備ができた。
【００５０】
［５０］産生：２つの３００ｌ産生発酵槽に、各々、２５０ｌの産生培地ＦＭ４−６（表１を参照されたい）を満たした。滅菌後、発酵槽に、各々、１５ｌの二次播種培養物を接種した。１０７±５ｒｐｍでの攪拌および０．４ｖｖｍでの通気を伴い、発酵槽を２８℃に維持した。第２日以降、攪拌速度を最大１７０±５ｒｐｍに、そして通気速度を最大１ｖｖｍに増加させることによって、溶解酸素含量を３０％より高く維持した。発酵ブロスの試料を抜き取って、そしてエタノール中に希釈し、その後、ＨＰＬＣ分析によって定量化することによって、アンサマイトシン力価を毎日測定した。第１０日まで発酵を続け、この時点で、アンサマイトシン増加は横ばい状態となった。２つの発酵槽中の第１０日のアンサマイトシン力価は、それぞれ、２５１ｍｇ／ｌおよび２４４ｍｇ／ｌであった。リン酸を添加することによって、発酵ブロスのｐＨを６．５に調整した。発酵槽を５５℃に加熱して、そしてこの温度で１時間維持して、微生物を不活性化した。次いで、有機溶媒を用いた抽出のため、発酵槽を周囲温度に冷却した。
【００５１】
実施例２：フィード・バッチ法を用いたアンサマイトシンの産生。
［５１］１５００ｌの産生発酵槽に９００ｌの産生培地ＦＭ４−６（表１を参照されたい）を満たした。滅菌後、発酵槽に、上述のように調製した５４ｌの二次播種培養物を接種した。１０７±５ｒｐｍでの攪拌および０．４ｖｖｍでの通気を伴い、発酵槽を２８℃に維持した。０〜４８時間に、０．３９ｍｌ／ｌ／時間の速度で、２８．５％グルコースの水溶液を供給した。４８〜２８８時間に、０．５１ｍｌ／ｌ／時間の速度で供給される、２１．５％グルコース、７．１％Ｐｒｏｆｌｏおよび７．１％イソブタノールを含むストック溶液に、供給をスイッチした。第２日以降、攪拌速度を最大１７０±５ｒｐｍに、そして通気速度を最大１ｖｖｍに増加させることによって、溶解酸素含量を２０％より高く維持した。発酵ブロスの試料を抜き取って、そしてエタノール中に希釈し、その後、ＨＰＬＣにより定量分析することによって、アンサマイトシン力価を毎日測定した。第１３日まで発酵を続け、この時点で、アンサマイトシン増加は横ばい状態となった。発酵槽中の第１３日のアンサマイトシン力価は、３０４ｍｇ／ｌであった。リン酸を添加することによって、発酵ブロスのｐＨを６．５に調整した。
【００５２】
［５２］熱不活性化。発酵槽を５５℃に加熱し、そしてこの温度で１時間維持して、微生物を不活性化した。次いで、有機溶媒を用いた抽出のため、発酵槽を３０〜４０℃の間に冷却した。
【００５３】
実施例３．アンサマイトシンの抽出およびクロマトグラフィー精製。
［５３］実施例２由来の発酵ブロスを等体積の酢酸ｎ−ブチルと混合した。混合物を３０および４０℃〜４５℃の間に維持し、そして２つの相の混合が溶媒界面でのみ起こるように、穏やかに攪拌した。抽出を最大５日間続けるか、または有機層のＨＰＬＣ分析が、＞８０％のアンサマイトシンが抽出されたことを示すまで、続けた。次いで、有機層を分離し、そして流下膜式蒸発装置を用いて蒸発させ、２０〜５０ｌの間の最終体積にした。濃縮抽出物を２．２ｋｇのシリカゲルを含有するフラスコに移した。回転蒸発装置を用いて、減圧下で操作し、乾燥するまで溶媒を蒸発させることによって、未精製アンサマイトシンでシリカゲル上をコーティングした。次いで、コーティングされたシリカを、Ｂｉｏｔａｇｅ， Ｉｎｃ．、バージニア州シャーロッツビルから得た、試料注入モジュール（ＳＩＭ）に移した。ＳＩＭを、シクロヘキサンおよびヘキサン（２：１ ｖ／ｖ）の混合物で洗浄し、そして次いでシリカ・カートリッジを装備したＢｉｏｔａｇｅ １５０Ｍシステムに連結した。酢酸エチル：ヘキサン：メタノール（２９．４：６８．６：２．０、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を用いて、所望の産物をカラムから溶離させた。アンサマイトシンを含有する分画をプールし、そして減圧下で溶媒を蒸発させた。高真空下で２４時間、産物をさらに乾燥させた。
【００５４】
実施例４．アンサマイトシンの再結晶化。
［５４］上記工程からの乾燥産物を熱酢酸エチル（２３ｍｌ／ｇ残渣）中に溶解した。アンサマイトシンの完全な溶解が達成されるまで、混合物を６０〜７５℃の間に維持した。バッチの温度を６０〜７５℃の間に維持しつつ、ヘプタン（８０ｍｌ／ｇ残渣）をゆっくりと添加した。ヘプタンをすべて添加した後、バッチを室温に冷却させた。ろ過によって結晶を回収し、そして次いで、高真空下で乾燥させて、２２１グラムの純粋なアンサマイトシンを生じた。
【００５５】
実施例５：ろ過を用いた発酵ブロスの抽出。
［５５］実施例２に記載するように調製した発酵ブロス（２００ｍｌ）を、２００ｍｌの酢酸ｎ−ブチル（２００ｍｌ）と、５分間、激しく混合し、エマルジョンを生じた。Ｃｅｌｌａｔｏｍ ＦＷ−８０ろ過助剤（２０ｇ）を添加し、そしてＣｅｌｌａｔｏｍ ＦＷ−８０ろ過助剤であらかじめコーティングしたブフナー漏斗を通じて、混合物を真空ろ過した。ろ過ケーキを４０ｍｌの酢酸ｎ−ブチルで洗浄した。ここで固体混入物を含まず、透明な有機および水性層を含むろ液を分液漏斗に移した。水性層を排出した。アンサマイトシンを含有する有機層は保持された。
【００５６】
実施例６：水非混和性溶媒を用いた遠心分離での発酵ブロスの抽出。
［５６］実施例２に記載するように調製した発酵ブロスの一部分を、酢酸ｎ−ブチルの一部分と、２分間、激しく混合した。生じたエマルジョンを１分間遠心分離し、そして固体混入物質を含まず、アンサマイトシンを含有する有機層を抜き取った。
【００５７】
実施例７：水混和性溶媒を用いた遠心分離での発酵ブロスの抽出。
［５７］実施例２に記載するように調製した発酵ブロスの一部分を、アセトンの一部分と、激しく混合した。混合物を１分間遠心分離して、固体をペレットにした。上清を抜き取り、そして半分の部分のヘキサンと混合した。水性層が分離し、アンサマイトシンを含有する透明な有機層が残った。
【００５８】
実施例８．ＸＡＤ−１６疎水性ビーズを用いた、アンサマイトシンの固相抽出。
［５８］実施例２に記載するように調製した発酵ブロス１ｌを、１０グラムのＸＡＤ−１６ビーズとともに、６時間、攪拌した。次いで、混合物を遠心分離し、そして上清を除去した。ペレットを小さいカラムに移し、そして脱イオン水、その後、９０：１０の脱イオン水：アセトニトリルで溶離させた。アンサマイトシンを含有する分画を合わせ、そして溶媒を蒸発させて１１２ｍｇの濃縮抽出物を得た。ＨＰＬＣ分析は、抽出物が５０ｍｇのアンサマイトシンを含有することを示した。
【００５９】
［５９］本発明は詳細に、そしてその特定の態様に関連して記載されてきているが、一般の当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変化および修飾を本発明に作成可能であることが明らかであろう。
【００６０】
［６０］本明細書に言及されるすべての刊行物は、明確に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】［２５］図１は、発酵によって作製可能な多様なアンサマイトシンＣ−３エステル、ならびにＣ−３アルコール、メイタンシノール（Ｐ−０）の構造を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）およびｂ）のいずれか一方によってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）結晶化、および
ｂ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項２】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、培地を処理する工程；
３）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）およびｂ）のいずれか一方によってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）結晶化、および
ｂ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項３】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）ろ過して固体を除去し、有機相の単離を可能にする工程；
４）有機相からアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項４】
ろ過中にろ過助剤の使用をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）遠心分離技術を用い、非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項６】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）水混和性有機溶媒の存在下で、培地を遠心分離して、固体を除去する工程；
３）水非混和性非芳香族溶媒を添加して、そしてアンサマイトシンを有機層中に抽出する工程；
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項７】
抽出中に有機相に塩を添加する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）樹脂上への固相抽出によって、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）有機溶媒または水と混合した有機溶媒を用いた定組成溶離または勾配溶離によって、樹脂からアンサマイトシンを溶離させる工程；
４）溶離したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）場合によって、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項９】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ属（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）種である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５またはそれから派生する株である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）またはそれから派生する株である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
処理する工程が、発酵ブロスを加熱することによって、または発酵ブロスにクロロホルムを添加することによって、微生物を不活性化する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
処理する工程が、加熱、ｐＨの調整、酵素処理または化学薬品処理を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
化学薬品処理が、ポリ硫酸鉄、脱乳化剤、ヒュームド・シリカまたは共溶媒の添加を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
約５０℃〜約５５℃での加熱によって微生物を不活性化する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
約６〜約７のｐＨで、抽出する工程を行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
約３０℃〜約４５℃の温度で、抽出する工程を行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトン、およびハロゲン化溶媒からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
非芳香族水非混和性溶媒がメチルイソブチルケトンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
非芳香族水非混和性溶媒がジクロロメタンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
約３０℃〜約４５℃の温度で抽出を行い、そして非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
培地対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
培地対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
前記の培養する工程が、約６．５〜約８の範囲のｐＨの産生培地中である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ｐＨが約７〜約７．４の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ｐＨが約７．２である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
温度が約１５℃〜約３５℃の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
温度が約２５℃〜約３０℃の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
温度が約２８℃である、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
温度が約２８℃であり、そしてｐＨが約７．２である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記の培養する工程中に、少なくとも１つのさらなる栄養分を提供する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
さらなる栄養分が炭素供給源である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
さらなる栄養分が、炭素供給源、その後に続いて、炭素供給源およびタンパク質栄養分である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
炭素供給源がグルコースである、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
炭素供給源がグルコースである、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質栄養分がワタ（ｃｏｔｔｏｎ）種子粉または大豆粉である、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
アルデヒドまたはアルコールが、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、およびイソバレルアルデヒドからなる群より選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
アルデヒドまたはアルコールが、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、およびイソバレルアルデヒドからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
培養する工程が約６．５〜約８のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４６】
培養する工程が約７〜約７．４のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
培養する工程が約７．２のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４８】
培養する工程が約１５℃〜約３５℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項４９】
培養する工程が約２５℃〜約３０℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項５０】
培養する工程が約２８℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項５１】
培養する工程が約２８℃の温度であり、そして約７．２のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項５２】
（ｉ）化学薬品または熱不活性化によって、培地中の微生物を不活性化させる工程；
（ｉｉ）工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、培地を処理する工程；および
（ｉｉｉ）精製工程中に実行可能な沈殿の前または後に、有機溶媒中のアンサマイトシンの未精製溶液を、水、水性塩溶液、水性酸または水性塩基の任意の連続した組み合わせで洗浄する、洗浄工程；
の１以上をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法によって調製されたアンサマイトシン由来のメイタンシノイドを細胞結合剤に連結することによって調製される、細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項５４】
細胞結合剤が抗体である、請求項５３記載の細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項５５】
発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）発酵ブロス中のアンサマイトシン産生微生物を不活性化する工程；および
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程；
を含む、前記抽出法。
【請求項５６】
不活性化する工程が、発酵ブロスを加熱することによるか、または発酵ブロスにクロロホルムを添加することによる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
不活性化する工程が、発酵ブロスを約５０℃〜約５５℃に加熱することによる、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
約６〜約７のｐＨで、抽出する工程を行う、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
約３０℃〜約４５℃の温度で抽出を行う、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトン、およびハロゲン化溶媒からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルからなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
非芳香族水非混和性溶媒がメチルイソブチルケトンである、請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
非芳香族水非混和性溶媒がジクロロメタンである、請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項５５記載の方法。
【請求項６５】
約３０℃〜約４５℃の温度で、抽出する工程を行い、そして非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項５５記載の方法。
【請求項６６】
発酵ブロス対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項５５記載の方法。
【請求項６７】
工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６８】
発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程；および
２）ろ過して固体を除去し、有機相の単離を可能にする工程；
を含む、前記抽出法。
【請求項６９】
（ｉ）化学薬品または加熱によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）工程１の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
非芳香族水非混和性溶媒を用いた遠心分離によって、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程を含む、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法。
【請求項７１】
（ｉ）化学薬品または加熱手段によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
水混和性有機溶媒の存在下で発酵ブロスを遠心分離して、溶液中にアンサマイトシンを保持しながら、固体を除去する工程
を含む、発酵ブロスから固体デブリを除去するための方法。
【請求項７３】
発酵ブロスから固体デブリを除去するための方法が：
（ｉ）化学薬品または加熱によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項７２記載の方法。
【請求項１】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）およびｂ）のいずれか一方によってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）結晶化、および
ｂ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項２】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、培地を処理する工程；
３）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）およびｂ）のいずれか一方によってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）結晶化、および
ｂ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項３】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）ろ過して固体を除去し、有機相の単離を可能にする工程；
４）有機相からアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項４】
ろ過中にろ過助剤の使用をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）遠心分離技術を用い、非芳香族水非混和性溶媒を用いて、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
４）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項６】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）水混和性有機溶媒の存在下で、培地を遠心分離して、固体を除去する工程；
３）水非混和性非芳香族溶媒を添加して、そしてアンサマイトシンを有機層中に抽出する工程；
４）抽出したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項７】
抽出中に有機相に塩を添加する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
精製アンサマイトシンを調製するための方法であって：
１）液体培地においてアンサマイトシン産生微生物を培養する工程；
２）樹脂上への固相抽出によって、培地からアンサマイトシンを抽出する工程；
３）有機溶媒または水と混合した有機溶媒を用いた定組成溶離または勾配溶離によって、樹脂からアンサマイトシンを溶離させる工程；
４）溶離したアンサマイトシンを濃縮する工程；ならびに
５）場合によって、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれか１つによってアンサマイトシンを精製する工程：
ａ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー、
ｂ）結晶化、
ｃ）シリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィーと、その後に続く結晶化、および
ｄ）結晶化と、その後に続くシリカゲルまたはアルミナ上の吸着クロマトグラフィー
を含む、前記調製法。
【請求項９】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ属（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）種である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスムＡＴＣＣ ３１５６５またはそれから派生する株である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アンサマイトシン産生微生物がアクチノシネマ・プレチオスムＰＦ４−４（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２１）またはそれから派生する株である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
処理する工程が、発酵ブロスを加熱することによって、または発酵ブロスにクロロホルムを添加することによって、微生物を不活性化する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
処理する工程が、加熱、ｐＨの調整、酵素処理または化学薬品処理を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
化学薬品処理が、ポリ硫酸鉄、脱乳化剤、ヒュームド・シリカまたは共溶媒の添加を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
約５０℃〜約５５℃での加熱によって微生物を不活性化する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
約６〜約７のｐＨで、抽出する工程を行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
約３０℃〜約４５℃の温度で、抽出する工程を行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトン、およびハロゲン化溶媒からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
非芳香族水非混和性溶媒がメチルイソブチルケトンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
非芳香族水非混和性溶媒がジクロロメタンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
約３０℃〜約４５℃の温度で抽出を行い、そして非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
培地対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
培地対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
前記の培養する工程が、約６．５〜約８の範囲のｐＨの産生培地中である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ｐＨが約７〜約７．４の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ｐＨが約７．２である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
温度が約１５℃〜約３５℃の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
温度が約２５℃〜約３０℃の範囲である、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
温度が約２８℃である、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
温度が約２８℃であり、そしてｐＨが約７．２である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記の培養する工程中に、少なくとも１つのさらなる栄養分を提供する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
さらなる栄養分が炭素供給源である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
さらなる栄養分が、炭素供給源、その後に続いて、炭素供給源およびタンパク質栄養分である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
培養する工程中に、アンサマイトシンのＣ−３エステル側鎖の形成を促進するアルコールまたはアルデヒドをさらに提供する、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
炭素供給源がグルコースである、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
炭素供給源がグルコースである、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質栄養分がワタ（ｃｏｔｔｏｎ）種子粉または大豆粉である、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
アルデヒドまたはアルコールが、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、およびイソバレルアルデヒドからなる群より選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
アルデヒドまたはアルコールが、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−プロパノール、ｎ−プロピオンアルデヒド、イソプロパノール、イソプロピオンアルデヒド、ペンタノール、バレルアルデヒド、イソペンタノール、およびイソバレルアルデヒドからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
培養する工程が約６．５〜約８のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４６】
培養する工程が約７〜約７．４のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
培養する工程が約７．２のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項４８】
培養する工程が約１５℃〜約３５℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項４９】
培養する工程が約２５℃〜約３０℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項５０】
培養する工程が約２８℃の温度である、請求項３４記載の方法。
【請求項５１】
培養する工程が約２８℃の温度であり、そして約７．２のｐＨである、請求項３４記載の方法。
【請求項５２】
（ｉ）化学薬品または熱不活性化によって、培地中の微生物を不活性化させる工程；
（ｉｉ）工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、培地を処理する工程；および
（ｉｉｉ）精製工程中に実行可能な沈殿の前または後に、有機溶媒中のアンサマイトシンの未精製溶液を、水、水性塩溶液、水性酸または水性塩基の任意の連続した組み合わせで洗浄する、洗浄工程；
の１以上をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法によって調製されたアンサマイトシン由来のメイタンシノイドを細胞結合剤に連結することによって調製される、細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項５４】
細胞結合剤が抗体である、請求項５３記載の細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項５５】
発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）発酵ブロス中のアンサマイトシン産生微生物を不活性化する工程；および
２）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程；
を含む、前記抽出法。
【請求項５６】
不活性化する工程が、発酵ブロスを加熱することによるか、または発酵ブロスにクロロホルムを添加することによる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
不活性化する工程が、発酵ブロスを約５０℃〜約５５℃に加熱することによる、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
約６〜約７のｐＨで、抽出する工程を行う、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
約３０℃〜約４５℃の温度で抽出を行う、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸アルキルであって、アルキル鎖が直鎖または分枝鎖であり、そして１〜５炭素原子を有する、酢酸アルキル、ジアルキルケトン、およびハロゲン化溶媒からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
非芳香族水非混和性溶媒が、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル、および酢酸メチルからなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
非芳香族水非混和性溶媒がメチルイソブチルケトンである、請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
非芳香族水非混和性溶媒がジクロロメタンである、請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項５５記載の方法。
【請求項６５】
約３０℃〜約４５℃の温度で、抽出する工程を行い、そして非芳香族水非混和性溶媒が酢酸ｎ−ブチルである、請求項５５記載の方法。
【請求項６６】
発酵ブロス対非芳香族水非混和性溶媒の体積比が１：１である、請求項５５記載の方法。
【請求項６７】
工程２の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６８】
発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法であって：
１）非芳香族水非混和性溶媒を用いて、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程；および
２）ろ過して固体を除去し、有機相の単離を可能にする工程；
を含む、前記抽出法。
【請求項６９】
（ｉ）化学薬品または加熱によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）工程１の前に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
非芳香族水非混和性溶媒を用いた遠心分離によって、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出する工程を含む、発酵ブロスからアンサマイトシンを抽出するための方法。
【請求項７１】
（ｉ）化学薬品または加熱手段によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
水混和性有機溶媒の存在下で発酵ブロスを遠心分離して、溶液中にアンサマイトシンを保持しながら、固体を除去する工程
を含む、発酵ブロスから固体デブリを除去するための方法。
【請求項７３】
発酵ブロスから固体デブリを除去するための方法が：
（ｉ）化学薬品または加熱によって、発酵ブロス中の微生物を不活性化させる工程；および
（ｉｉ）遠心分離前または遠心分離中に、アンサマイトシンの溶媒抽出を促進するため、発酵ブロスを処理する工程；
の一方または両方をさらに含む、請求項７２記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５２６２６７（Ｐ２００８−５２６２６７Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２１２６（Ｐ２００７−５５２１２６）
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８３６８
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０４０３９１５５）イミュノジェン・インコーポレーテッド (36)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８３６８
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０４０３９１５５）イミュノジェン・インコーポレーテッド (36)
【Ｆターム（参考）】
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