イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果評価方法。
【課題】 犬腫瘍の治療薬に有効であると考えられるイヌＩＬ１２の投与による抗腫瘍効果を腫瘍塊の増減以外の方法、すなわち分子生物学的な方法で評価する方法を提供することが課題である。
【解決手段】イヌインターロイキン１２を投与された腫瘍罹患犬から採血し、その中から白血球を分離し、さらにサイトカイン遺伝子を抽出してイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の発現変動を検討することにより、抗腫瘍効果を評価する。具体的にはイヌインターフェロン−γの発現が見られるときは抗腫瘍効果が高く、逆にイヌインターロイキン１０の発現が見られるときは抗腫瘍効果が低いと判断して抗腫瘍効果を判断する。
【選択図なし】
【解決手段】イヌインターロイキン１２を投与された腫瘍罹患犬から採血し、その中から白血球を分離し、さらにサイトカイン遺伝子を抽出してイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の発現変動を検討することにより、抗腫瘍効果を評価する。具体的にはイヌインターフェロン−γの発現が見られるときは抗腫瘍効果が高く、逆にイヌインターロイキン１０の発現が見られるときは抗腫瘍効果が低いと判断して抗腫瘍効果を判断する。
【選択図なし】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、犬抗腫瘍効果を評価する方法およびその評価キットに関する。さらに詳しくはイヌインターロイキン１２を投与された犬から採取した犬血液中の白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することによりその抗腫瘍効果を評価する方法および評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン(IL)１２は、LAK細胞、NK細胞やＴ細胞を直接刺激して、それらの細胞からのサイトカイン放出を促し、またNK細胞やCTLの細胞傷害活性を増強する。また、Ｔ細胞を刺激・誘導し細胞性免疫を増強する。
【０００３】
遺伝子操作技術の進歩によりヒトのIL12のみならず、ウシ、ウマ、ネコ、イヌなどの動物のIL１２についてもその遺伝子が次々にクローニングされ、その結果、ウイルス病や腫瘍などの治療薬としての用途開発研究が行われているものもある（非特許文献１，２，３，４）。イヌIL１２は、犬の腫瘍に対して効果が期待されるものの、その抗腫瘍効果を評価する手段として、腫瘍塊の大きさの変動はもちろんであるが、明確な指標については報告がなく、抗腫瘍効果の有無の評価方法の確立が必要である。
【非特許文献１】ボルフ（Ｗｏｌｆ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４６，３０７４−３０８１（１９９１）．
【非特許文献２】シェンハウト（Ｓｈｏｅｎｈａｕｔ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４８，３４３３−３４４０（１９９２）．
【非特許文献３】ナスタラ（Ｎａｓｔａｌａ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１５３，１６９７−１７０６（１９９４）．
【非特許文献４】ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ） ２５，２３６−２６９（１９８３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
犬には、乳腺腫瘍など多数の腫瘍が知られている。外科手術による腫瘍病変部位の除去が第一選択となってはいるものの、飼い主の中には必ずしも手術を望まず、また医薬品による延命を望む場合が多い。こういった要望に対しては、ヒト用抗癌剤を使用する場合が多いが、副作用の面から使用頻度は低い。こういった現状に対して、犬用の抗腫瘍薬が希求される。そこで、これらの治療薬として、イヌＩＬ１２の投与が有効であると考えられる。しかし、腫瘍の種類によっては非奏功性の場合があり、その場合はいくら投薬しても効果は期待できないため、抗腫瘍効果を投与初期、投与中に評価する方法として、腫瘍塊の増減以外により分子生物学的アプローチを用いた評価法により明確にすることができれば、投薬初期に予め効果が期待できるか判定が可能になり、犬への投薬による負担軽減が期待できる。また抗腫瘍効果の確実性が向上することにより、イヌインターロイキン１２の動物用医薬品としての開発の途が開かれるととともに抗腫瘍効果評価キットの開発が期待される。従って本発明は、犬用の抗腫瘍薬として有望なイヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果を評価する方法の確立および評価キットの開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者はかかる状況に鑑み、イヌインターロイキン１２を腫瘍罹患犬に投与し、採血後、白血球を分離し、さらに遺伝子を抽出しサイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を検討することにより、抗腫瘍効果とそれら遺伝子の発現との間に相関がり、イヌインターフェロン−γの発現上昇およびイヌインターロイキン１０の発現減少の場合は、イヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は高く、逆にイヌインターフェロン−γの発現減少およびイヌインターロイキン１０の発現上昇の場合はイヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は低い可能性があることを見出した。また、投薬後数週のこれら遺伝子の発現パターンを検討することにより、イヌインターロイキン１２の腫瘍に対する奏功・非奏功の判定が可能になり、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、下記の構成を有する。
【０００７】
（１）犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することを特徴とする、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法。
【０００８】
（２）サイトカインが、イヌインターフェロンγおよび／またはイヌインターロイキン１０であり、イヌインターフェロンγ遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインタロイキン１０遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することを特徴とする上記（１）記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法。
【０００９】
（３）イヌインターロイキン１２を投与した犬から採取した犬白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定し、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価用キット。
【００１０】
（４）サイトカインがイヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０であることを特徴とする上記３記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、イヌIL１２を投与した犬血液中の白血球から遺伝子を抽出し、サイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を検討することにより、イヌIL１２の抗腫瘍効果を評価することができる。また、投与初期にこれら遺伝子の発現を評価することにより、効果的な治療の提供が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明に関し詳細に説明する。
【００１３】
１．サイトカインについて
サイトカインは免疫反応や感染時の応答、造血、ウイルス感染や腫瘍細胞の障害に重要な役割を果たしている細胞間シグナル伝達物質である。サイトカインは造血幹細胞からの構成的造血だけでなく、炎症時等の誘導的造血にも関与している。それらは、活性化Ｔ細胞やマクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、血管内皮細胞などあらゆる細胞から産生されている。蛋白質または糖蛋白質で、免疫系サイトカインには、インターロイキン類、インターフェロンなどが挙げられる。この中でインターロイキンとは、リンパ球間でシグナルを伝えあうサイトカインに付けられた名称である。
【００１４】
２．Th1およびTh2について
白血球の１種であるリンパ球には、様々な種類がありその中でもヘルパーＴ細胞は抗原提示細胞上の抗原を認識し、活性化され、様々なヘルパーファクターを産生する。これらのヘルパーファクターにより、エフェクターＴ細胞やＢ細胞が刺激を受け、分化・成熟をする。モスマン（Mosmann）とコフマン（Coffman）により、ヘルパーＴ細胞はIL2を分泌するがIL4を分泌しないもの、逆にIL2を分泌しないがIL4を分泌するものに分類し、前者はTh1,後者はTh2と呼ばれる。すなわち、１種類のヘルパーＴ細胞がエフェクターＴ細胞およびＢ細胞の両方を活性化しているわけではなく、主にTh1がエフェクターＴ細胞を、Th2がＢ細胞に作用するサイトカインを分泌する。Th1由来のサイトカインとしては、前述のIL2、IFN-γ、TNF-α、IL3などであり、Th2由来のサイトカインとしてはIL4,IL5,IL6,IL10などが挙げられる。
【００１５】
３．イヌインターロイキン(IL)１２について
イヌIL１２は、ヒトIL１２同様分子量約４０ｋＤタンパク質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤタンパク質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインである。
【００１６】
４．インターフェロン(IFN)−γについて
IFN-γは、ConAやPHA等のマイトジェンやIL１２によりＴ細胞あるいはNK細胞から産生誘導されることが知られている。その生物活性は、抗ウイルスタンパク質合成誘導による抗ウイルス作用以外に、NK細胞に作用しキラー活性を増強したり、マクロファージのIL-1やTNFの産生を増強し、貪食作用を増強する。さらに、好中球の活性化に関与し、遅延型過敏症反応を抑制する。また、Ｂ細胞の抗体産生には一般に抑制的に作用することが知られている。Ｔ細胞に対しては、キラーＴ細胞の誘導を促進し、IL２やIL２レセプターの発現増強を行うことが知られているサイトカインである。また、モスマン（Mosmann）らの提唱したTh1/Th2仮説では、Th1はTh2の増殖・活性を抑制すると考えられ、Th1から産生されるIFN-γは、Th2の増殖を抑制し、Th2の産生するサイトカインの作用を抑制する。
【００１７】
５．インターロイキン（IL）１０について
IL10は、ヘルパーＴ細胞のTh0とTh2サブセットにより産生され
また単核球やマクロファージも産生することが知られている。生物活性は、アクセサリー細胞依存性のTh1からのほとんどのサイトカイン産生およびTh1細胞株の増殖を抑制するものの、Th2からのサイトカイン産生は抑制しない。例えば、IL10によりTh1からのIFN-γ産生抑制は約90%であると言われている。また、種々の検討からTh1細胞のサイトカイン産生を刺激するマクロファージの作用を抑制するが、Ｂ細胞の作用には影響を及ぼさないことが知られている。すなわち、IL10は抗原提示細胞の存在下でのみその阻害作用を現すため、直接抗原提示細胞に作用していることが示唆されるサイトカインである。
【００１８】
６．イヌインターロイキン１２の製法
イヌＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってイヌＩＬ１２活性を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡとイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１９】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１２）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献１３），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）らの方法（文献１４），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１５）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００２０】
このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってイヌＩＬ１２活性を示すＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を大腸菌などの宿主に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、イヌＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００２１】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００２２】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），ジョン ウイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００２３】
産生されたイヌＩＬ１２は，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤである。
【００２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。
【００２５】
７．イヌインターロイキン１２の精製法
イヌＩＬ１２は、以下の実施例２で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、イヌ白血球からのインターフェロンγ（以下ＩＦＮγと略記する）の誘導能およびフィトヘムアグルチニン（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【００２６】
本発明においてイヌインターロイキン１２の精製には、カラムクロマトグラフィーによる方法を選択することが望ましい。カラムクロマトグラフィーでは、全ての工程で水溶液で展開可能であるため、インターロイキン１２のような固有の生物活性を有するタンパク質の精製に使用できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラム担体として、イオン交換担体、色素担体などが挙げられる。
【００２７】
まず、上記イオン交換担体としては、アガロース、セルロース、合成ポリマーゲルなどに、例えばジエチルアミノエチル（Diethylaminoethyl）、クオテナリアミノエチル（Quaternary aminoethyl）、クオテナリアンモニウム（Quaternary ammonium）、カルボキシメチル（Carboxymethyl）、スルホプロピル（Sulphopropyl）、メチルスルホネ−ト（Methyl sulphonate）などの官能基を導入したものが挙げられる。好ましくはスルホプロピルが導入された、ＳＰ セファロースハイパフォーマンス（アマシャム社製）やＳＰ セファロースファーストフロー（アマシャム社製）など（以下、ＳＰセファロース担体と略記する）が用いられる。ＳＰセファロース担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度などによって決定される。Ｐ４０とＰ３５の組合せから成るタンパク質はそれぞれ異なった電荷を有しており、それぞれの電荷の差により、本担体を用いて、それぞれを分画することができる。例えば、昆虫細胞中で生産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの場合、ｐＨ値７以下で、それぞれを分画することができる。
【００２８】
さらに、色素担体としては、ブルー色素を結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ましく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用される。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロンブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマシャム社製）、ブルーセファロース６ハイパフォーマンス（アマシャム社製）、マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲルブルー（バイオラット社製）などの商品名で市販されているブルーアガロースゲル、またはブルートリスアクリルーＭ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ社製）などの商品名で市販されているブルーセファロースゲルなどが適当であり、容易に入手することができる。ブルー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎水度などによって決定される。例えば、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの場合、中性付近のｐＨで、それぞれを分離溶出して、高純度で精製することができる。
【００２９】
上記したカラム担体を用いた精製操作はそれぞれ単独で行ってもイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞれを組合わせて行った方がより効果が高い。例えば、カイコ生体中で生産したイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーを含む溶液中には、非常に多くのカイコ由来の夾雑物と複数のイヌＰ４０とイヌＰ３５の組合わせが含まれるので、上記２つのカラム担体を組合わせることが好ましい。昆虫細胞中およびカイコ生体中で生産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの製造においては、初段精製にスルホプロピル担体を、２段目精製にブルー担体を用いることが好ましい。
【００３０】
なお、各カラム担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【００３１】
また、ＩＬ１２およびＰ４０ホモダイマーをそれぞれ同時に大量に製造するために、Ｐ４０をコードする遺伝子をより発現性が高いプロモーター下に接続し、Ｐ３５をコードする遺伝子をそれより発現性が低いプロモーター下に接続し、これらを同時に含む組換え体を作製し、それぞれの遺伝子を発現させることで、ＩＬ１２とＰ４０ホモダイマーを、同時に生産することができる。例えば、バキュロウイルス発現系において、ポリヘドリンプロモーターとＰ１０プロモーターの両方を含むベクターのポリヘドリンプロモーター下にイヌＰ４０をコードする遺伝子を、Ｐ１０プロモーター下にイヌＰ３５をコードする遺伝子をそれぞれ連結し、組換えウイルスを作製して、昆虫細胞で発現させることによって、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの両方を同時に大量に製造することができる。
【００３２】
８．イヌインターロイキン１２の製剤化法
インターロイキン１２の製剤化は、イヌIL１２及び種々の安定化剤を添加しても良い。有用タンパク質の安定化方法として知られているのは、他のタンパク質、例えばゼラチン、血清、アルブミン、コラーゲンなどと混合する方法（文献２〜５）、糖類、特に単糖類、二糖類およびデキストランやヒドロキシエチルデンプンのような多糖類と混合する方法（文献６〜９）、あるいはサイクロデキストリンや多糖類アルコールを安定化剤とする方法がある（文献１０，１１）。本発明の製造法で製造されるイヌIL１２以外に安定化剤を添加することで、さらに長期間の安定化効果が期待できる。添加される安定化剤としては特に限定はない。本薬に添加される成分は、主として、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬が固体として用いられる場合は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、本薬が液体として投与される場合は、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本発明の治療薬および予防薬の投与方法に特に限定はないが、注射投与することにより最も治療効果が期待できる。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定されない。
【００３３】
９．対象疾患となる犬腫瘍について
犬の腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門腫瘍が挙げられる。
【００３４】
１０．犬へのイヌIL12の投与方法について
投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すればよく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１００μｇ／ｋｇのイヌＩＬ１２の投与で十分な効果が得られる。
【００３５】
また、養子免疫療法では１ー１００ｍｌのイヌの血液から分離したリンパ球に対し、０．００１ｐｇから１μｇのイヌＩＬ１２で１２時間から６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分な効果が得られる。
【００３６】
１１．犬血液からの白血球の調製
犬血液中からの白血球調製は、まず血液凝固を防止するために採血直後に抗凝固剤を添加する。抗凝固剤としては、ヘパリン、エチレンジアミンテトラアセテートが使用される。得られた血液から細胞群を調製するには、主に比重遠心法が用いられる。すなわち、赤血球や顆粒球の比重よりも小さく、リンパ球や単球よりも大きい溶液に血液を重層し、遠心操作により細胞群を分画する方法である。分離液としてはフィコール−イソパック液が使用される。遠心操作後には、希釈血漿分画と分離液の間に目的となる白血球であるリンパ球と単球の分画が見られるので、この分画を分取する。さらにリンパ球のみを分離するためには、主にペトリ皿付着法が用いられる。その後得られたリンパ球分画は、ナイロンウールカラムを使用することによりＴ細胞のみを分離・濃縮することができる。本方法は、細胞群に激しい操作を加えることなく、雑多な細胞集団より比較的純粋なＴ細胞群が回収できる利点がある。
【００３７】
１２．白血球からの遺伝子調製
白血球からの遺伝子の調製は例えば次のようにして実施することができる。上記１１で調製したＴ細胞群からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって可能である。イヌＴ細胞などによりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジ・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。さらに、通常の方法、例えば塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献１４）、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１５）などによりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてインターフェロン−γやインターロイキン１０をコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってインターフェロン−γやインターロイキン１０をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
１３．犬抗腫瘍効果評価方法
イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法としては、犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定する方法であり、サイトカインとしては、イヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０である。判定は、イヌインターフェロンγの発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインターロイキン１０の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することにより行うことができる。
【００３９】
イヌインターロイキン１２を腫瘍罹患犬に投与し、採血後、白血球を分離し、さらに遺伝子を抽出しサイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を、遺伝子のアガロースゲル電気泳動による検討・評価を行う。投与開始直後からイヌインターフェロン−γの発現および投与期間内での発現上昇および投与開始時のインターロイキン１０の未発現または低発現および投与期間内での発現減少の場合は、イヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は高く、その逆に投与開始時および投与期間内のイヌインターフェロン−γの発現減少およびイヌインターロイキン１０の発現上昇の場合はイヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は低いと評価する。また、犬の腫瘍で症例の多い乳腺腫瘍など表出しているものについては、腫瘍の大きさの経時変化を記録し、サイトカイン遺伝子の発現変動と合わせて評価することもできる。
【００４０】
１４．犬抗腫瘍効果を評価する評価キット
上記反応を含むイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の発現変動を測定するために用いるキットは、それ自体既知の方法により調製可能である。これらのキットに供する試薬等は、上記方法により得られる被測定サンプルとしてのイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の他、アガロースゲル電気泳動液、電気泳動装置、UV照射ゲル撮影装置が含まれる。また、任意の要素として分子量マーカー、DNA溶液に電荷を持たせるローディング緩衝液なども含まれる。
【実施例】
【００４１】
以下、参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００４２】
参考例１ イヌＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０７ ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球よりアイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ を２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのギブコ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）社製スーパースクリプトII ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４３】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、アマシャム社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
【００４４】
（３）イヌＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献１）をもとに、配列番号３および４の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でパーキンエルマーセータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１６）に従って調製した。
【００４５】
このＤＮＡ断片をＴ−ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）（ノバジェン社）に宝酒造（株）のＤＮＡ ライゲーションキット Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００ ＤＮＡ分析システム（ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）（デュポン社製）を用いて、ダイデオキシ法（文献１７）でイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号１に示す。
【００４６】
また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のランダムプライマー ＤＮＡ ラベリングキットを用いて３２Ｐを標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。
【００４７】
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（エチレンジアミン四酢酸塩−リン酸ナトリウム−食塩緩衝液）（０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０６ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム−食塩緩衝液）（３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素エコアールＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ ライゲーションキット Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（エコアールＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示す。
【００４８】
（４）イヌＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号５および６の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号２に示す。
【００４９】
また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ノットＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ(ストラタジーン社製)のノット（Ｎｏｔ）Ｉサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。
【００５０】
参考例２ イヌＩＬ１２の生産
（１）イヌＩＬ１２発現ベクターの調製
発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献１８）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ ＤＮＡ断片は配列番号７および８の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１３および１４の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、イヌＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。
【００５１】
また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。イヌＩＬ１２Ｐ３５ ＤＮＡ断片は配列番号９、１０の２種類のプスト（Ｐｓｔ）Ｉ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１５、１６の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、イヌＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。
【００５２】
さらに、作製したこれら４つの発現プラスミド中のイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００５３】
（２）サルＣＯＳ細胞でのイヌＩＬ１２の生産
上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（アマシャム社製）および１００μＭのクロロキン（シグマ社製）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で４日間培養し、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００５４】
（３）イヌＩＬ１２産生組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０およびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作製した。
【００５５】
（４）昆虫細胞でのイヌＩＬ１２の生産
上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファーミンジェン社のバキュロゴールドプロテインフリーインセクトメディウムで７５ｃｍ２のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ Ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養した後、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００５６】
参考例３ イヌＩＬ１２の抗腫瘍効果
参考例２（２）、（４）で生産されたイヌＩＬ１２の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のヒトＩＬ２を２５０Ｕ、６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとして水泡性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ），感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１９のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０５ 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、上記（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０７希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を３日間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００５７】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに、１０５個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心した。これに、ストラタジーン社のラット抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体を１０μｌ添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳｆ２１で産生させたイヌＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上昇させた。これらのことから、イヌＩＬ１２はイヌリンパ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明した。
【００５８】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これらをさらに５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で３日間培養後、文献１４のＭＴＴアッセイ法により、イヌＩＬ１２の芽球化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（バイオラット社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産生したイヌＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上の芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。
【００５９】
さらに、イヌＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレート１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌを加え、さらにイヌＩＬ１２を発現している上記（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障害性を次の式にて算出した。
％細胞障害性＝（１−ＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００
【００６０】
ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。
【００６１】
その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したイヌＩＬ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロールが２２％であったのに対し、イヌＩＬ１２は約８３％の細胞障害性を示した。イヌＩＬ１２はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【００６２】
参考例４ イヌＩＬ１２の精製
参考例２（４）で得られた細胞培養上清を用いてスルホプロピル担体によるイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの分画を検討した。精製はｐＨ：７で行った。培養上清を、スルホプロピル担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄した。溶出はＮａＣｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻みで行った。その結果、イヌＩＬ１２は、３５０〜５５０ｍＭで、イヌＰ４０ホモダイマーは、６００〜７５０ｍＭの各ＮａＣｌ濃度の溶出画分で検出された（ウエスタンブロッティング）。なおその他の溶出画分およびアルカリ洗浄画分にはイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーは検出されなかった。
【００６３】
イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーが溶出された各画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにそれぞれアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を５００ｍＭから２Ｍまで５ｍＭ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＩＬ１２は１．１〜１．２Ｍで、イヌＰ４０ホモダイマーは、１．５〜２Ｍの各ＮａＣｌ濃度の溶出画分で検出された（ウエスタンブロッティング）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、イヌＩＬ１２が溶出されたブルーセファロース担体での各画分中のイヌＩＬ１２の純度は９８％以上であった。
【００６４】
参考例５ 精製イヌＩＬ１２の検出および生物活性
参考例４で得られた精製イヌＩＬ１２のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および活性測定は以下のようにして行った。まず検出は、参考例２（４）で得られた昆虫細胞の培養上清中のイヌＩＬ１２をウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、上記（１）で得られた抗イヌＰ４０ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約７５ｋＤのバンドが検出された。さらに、抗イヌＰ３５ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を用いて、同様にして、参考例２で得られた昆虫細胞の培養上清を解析した結果、約７５ｋＤのバンドのみが検出された。このことから、約７５ｋＤのバンドは、イヌＰ４０とＰ３５のヘテロダイマーから成るイヌＩＬ１２であることが判明した。精製イヌＩＬ１２のイヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性を測定した。イヌ末梢血からリンパ球を分離し、９６穴マイクロプレート中、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で１穴あたり１００μｌ添加し、各穴にゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のリコンビナントヒトＩＬ２を２５０μｇ加え、これに精製イヌＩＬ１２（１〜１０３ｐｇ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で７２時間培養した。培養後の各培養上清１００μｌ中の抗ウイルス活性を測定した。ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＦＣＢＲ１を用い、文献１６のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、精製イヌＩＬ１２（１〜１０３ｐｇ／ｍｌ）単独添加した培養上清で、２ｘ１０３〜１０５ 単位／ｍｌの抗ウイルス活性が確認された。
【００６５】
参考例６ イヌＩＬ１２製剤の製造
参考例４で得られた精製イヌＩＬ１２の各溶液（０．０１重量％のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を含む）を透析によって脱塩した溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン（株）製）、ソルビトールを加えて、ゼラチンの終濃度０．５％、ソルビトールの終濃度３０％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株）製）で処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１ｐｇから５μｇのイヌＩＬ１２を含むイヌＩＬ１２製剤を得た。この製剤は、室温条件下で安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解した。
【００６６】
参考例７ イヌＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果検討
参考例６のイヌＩＬ１２製剤の活性測定は、参考例３の場合と同様の方法で以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のヒトＩＬ２を２５０Ｕ、６ｃｍディッシュに添加した。これに参考例６で得られた製剤１ｍｌとヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１９のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０５ 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０７希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、イヌIL１２を含まない製剤（コントロール）では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００６７】
実施例１ イヌIL12の腫瘍罹患犬への投与
（１）イヌIL１２の投与方法
腫瘍罹患犬としては、乳腺腫瘍を始めとして、線維肉腫、皮膚リンパ腫、メラノーマなど１９症例に投与した。イヌIL１２の投与に先だって一般血液学的検査のため採血及び体重、体温等の測定も行った。次に表１に示す計画に従ってイヌIＬ１２を投与する。すなわち、第１週は静注により0.1μg/kgを週２回、第２〜４週は静注及び局注により４μg/kgを週２回投与した。第５週目は休薬とし、さらに第６〜８週は静注及び局注により４μg/kgを週２回投与した。局注の場合は複数の腫瘍が存在しても、一つの腫瘍にのみ投与し、期間を通じて同じ腫瘍にのみ投与した。また、局注は、腫瘍実質およびその周辺に投与した。また、他の薬剤は基本的には併用しなかった。ただし、抗腫瘍効果と無関係な薬剤の投与は限定しなかった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（２）観察検査の項目、時期および結果
イヌIL１２投与日での臨床症状の観察検査は、表２に示す通りである。また、週一回イヌIL１２投与に先立って実施した。すなわち、観察検査項目は臨床症状（脱水状態、呼吸様式、元気、食欲、飲水欲、下痢、嘔吐）、体温、体重、血液学的検査（血球系（白血球数、ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌｂ，Ｇｌｏｂ，ＡＬＰ）、とした。全ての項目について検査を実施したが、重篤な症状はなく、検査値に異常は見られなかった。
【００７０】
【表２】
【００７１】
（３）イヌ血液からイヌ白血球の調製
採血により得られたイヌ全血を、予めHistopaq-1077を入れた遠心管に混合しないように重層する。400gで30分遠心し、白血球画分をパスツールピペットを用いて得た。次にERDF-10%FBS培地を添加して再度遠心し、沈殿画分を再びERDF-10%FBS培地を加え、10cmシャーレに入れ、37℃、CO2インキュベーター内にて培養を行った。１時間後、シャーレの培養上清を回収し、遠心操作後、沈殿画分をERDF-10%FBS培地により懸濁し、イヌ白血球とした。調製した白血球1×107cellsを１０ｍＬシリンジ（テルモ社製）に詰めたナイロンウール中に処し、３７度下１５分静置した。次に、リン酸塩バッファー（PBS）で押し出し、Ｔ細胞画分を調製した。Ｔ細胞画分をmRNAマイクロプレップクイックプーリフィケーションキット（アマシャム社）によりmRNAを調製した。cDNA合成は、Rever Tra -ACE-(TOYOBO社製)を用いて、Oligo dTプライマーにより合成した。PCRは、premix taq（宝酒造（株）社製）を用いて行った。PCRの条件は、熱変性：94℃、１分、アニーリング：56℃、30秒、伸長反応：72℃、１分で、30 cycleで行った。プライマー配列は、β−actinが配列番号17、18、IFN-γが配列番号19、20 、IL10が配列番号21、22である。
【００７２】
得られたPCR産物は1%アガロースゲルにより電気泳動を行った。また、電気泳動したサンプルをジーンクリーン（geneclean）IIkit(フナコシ社製)を用いてゲルから抽出し、T-vector（Novagen社）にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)(Applied Biosystems)により、ビッグダイ ターミネーター サイクル シーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法で各サイトカインのDNAの塩基配列を確認したところ、イヌIFN-γまたはイヌIL10であることが確認できた。
【００７３】
実施例２ 犬血液中のサイトカイン発現と腫瘍退縮効果の相関性検討
実施例１でイヌIL12を投与した１９症例の内、８症例で腫瘍の退縮が見られた。全症例の犬血液中のIFN-γおよびIL10遺伝子解析を実施したところ、表３に示すように有効８症例全ての症例でIFN-γの発現増大、IL１０の発現減少を確認することができた。なお、各遺伝子の発現量について、発現を検討した期間８週において、発現が見られる期間が８〜６週に渡って見られる場合は＋＋＋、５〜３週に渡って見られる場合は＋
＋、２〜１週の場合は＋、全く検出できない場合を−とした。
【００７４】
【表３】
【００７５】
参考文献：
・ ボルフ（Ｗｏｌｆ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４６，３０７４−３０８１（１９９１）．
・ 特開平２−２６４７２８５号公報
・ 特開平２−４９７３４号公報
・ 特開昭５４−８０４０６号公報
・ 特開昭５６ー６８６０７号公報
・ 特開昭５９−１８１２２３号公報
・ 特公平６−５１６４１号公報
・ 特開昭６１−４４８２６号公報
・ 特開昭６０−１５５１３６号公報
・ 特開昭５８−９２６９１号公報
・ 特公平３−５００８８２号公報
１２．チルイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８，５２９４（１９７９）．
１３．バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８，５１４３（１９７９）．
１４．ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ） ２５，２３６−２６９（１９８３）．
１５．岡山（Ｏｋａｙａｍａ）ら：モレキュラー セル バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ）．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，（１９８３）．
１６．モレキュラークローニング コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２．
１７．プロバー（Ｐｒｏｂｅｒ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３８，３３６−３４１（１９８７）．
１８．Ｆ．Ｌ．（グラバム）Ｇｒａｂａｍら：バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ５４，５３６（１９７３）．
１９．フェッテサイド（Ｗｈｅｔｅｓｉｄｅ）ら ：ジャーナル オブ イムノロジカル メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ９０，２２１−２２３（１９８６）．
２０．シード（Ｓｅｅｄ）ら：プロセジャー ナショナル オブ
アカデミック サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ）８４，３３６５−３３６９（１９８６）．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、犬抗腫瘍効果を評価する方法およびその評価キットに関する。さらに詳しくはイヌインターロイキン１２を投与された犬から採取した犬血液中の白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することによりその抗腫瘍効果を評価する方法および評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン(IL)１２は、LAK細胞、NK細胞やＴ細胞を直接刺激して、それらの細胞からのサイトカイン放出を促し、またNK細胞やCTLの細胞傷害活性を増強する。また、Ｔ細胞を刺激・誘導し細胞性免疫を増強する。
【０００３】
遺伝子操作技術の進歩によりヒトのIL12のみならず、ウシ、ウマ、ネコ、イヌなどの動物のIL１２についてもその遺伝子が次々にクローニングされ、その結果、ウイルス病や腫瘍などの治療薬としての用途開発研究が行われているものもある（非特許文献１，２，３，４）。イヌIL１２は、犬の腫瘍に対して効果が期待されるものの、その抗腫瘍効果を評価する手段として、腫瘍塊の大きさの変動はもちろんであるが、明確な指標については報告がなく、抗腫瘍効果の有無の評価方法の確立が必要である。
【非特許文献１】ボルフ（Ｗｏｌｆ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４６，３０７４−３０８１（１９９１）．
【非特許文献２】シェンハウト（Ｓｈｏｅｎｈａｕｔ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４８，３４３３−３４４０（１９９２）．
【非特許文献３】ナスタラ（Ｎａｓｔａｌａ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１５３，１６９７−１７０６（１９９４）．
【非特許文献４】ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ） ２５，２３６−２６９（１９８３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
犬には、乳腺腫瘍など多数の腫瘍が知られている。外科手術による腫瘍病変部位の除去が第一選択となってはいるものの、飼い主の中には必ずしも手術を望まず、また医薬品による延命を望む場合が多い。こういった要望に対しては、ヒト用抗癌剤を使用する場合が多いが、副作用の面から使用頻度は低い。こういった現状に対して、犬用の抗腫瘍薬が希求される。そこで、これらの治療薬として、イヌＩＬ１２の投与が有効であると考えられる。しかし、腫瘍の種類によっては非奏功性の場合があり、その場合はいくら投薬しても効果は期待できないため、抗腫瘍効果を投与初期、投与中に評価する方法として、腫瘍塊の増減以外により分子生物学的アプローチを用いた評価法により明確にすることができれば、投薬初期に予め効果が期待できるか判定が可能になり、犬への投薬による負担軽減が期待できる。また抗腫瘍効果の確実性が向上することにより、イヌインターロイキン１２の動物用医薬品としての開発の途が開かれるととともに抗腫瘍効果評価キットの開発が期待される。従って本発明は、犬用の抗腫瘍薬として有望なイヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果を評価する方法の確立および評価キットの開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者はかかる状況に鑑み、イヌインターロイキン１２を腫瘍罹患犬に投与し、採血後、白血球を分離し、さらに遺伝子を抽出しサイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を検討することにより、抗腫瘍効果とそれら遺伝子の発現との間に相関がり、イヌインターフェロン−γの発現上昇およびイヌインターロイキン１０の発現減少の場合は、イヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は高く、逆にイヌインターフェロン−γの発現減少およびイヌインターロイキン１０の発現上昇の場合はイヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は低い可能性があることを見出した。また、投薬後数週のこれら遺伝子の発現パターンを検討することにより、イヌインターロイキン１２の腫瘍に対する奏功・非奏功の判定が可能になり、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、下記の構成を有する。
【０００７】
（１）犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することを特徴とする、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法。
【０００８】
（２）サイトカインが、イヌインターフェロンγおよび／またはイヌインターロイキン１０であり、イヌインターフェロンγ遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインタロイキン１０遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することを特徴とする上記（１）記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法。
【０００９】
（３）イヌインターロイキン１２を投与した犬から採取した犬白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定し、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価用キット。
【００１０】
（４）サイトカインがイヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０であることを特徴とする上記３記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、イヌIL１２を投与した犬血液中の白血球から遺伝子を抽出し、サイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を検討することにより、イヌIL１２の抗腫瘍効果を評価することができる。また、投与初期にこれら遺伝子の発現を評価することにより、効果的な治療の提供が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明に関し詳細に説明する。
【００１３】
１．サイトカインについて
サイトカインは免疫反応や感染時の応答、造血、ウイルス感染や腫瘍細胞の障害に重要な役割を果たしている細胞間シグナル伝達物質である。サイトカインは造血幹細胞からの構成的造血だけでなく、炎症時等の誘導的造血にも関与している。それらは、活性化Ｔ細胞やマクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、血管内皮細胞などあらゆる細胞から産生されている。蛋白質または糖蛋白質で、免疫系サイトカインには、インターロイキン類、インターフェロンなどが挙げられる。この中でインターロイキンとは、リンパ球間でシグナルを伝えあうサイトカインに付けられた名称である。
【００１４】
２．Th1およびTh2について
白血球の１種であるリンパ球には、様々な種類がありその中でもヘルパーＴ細胞は抗原提示細胞上の抗原を認識し、活性化され、様々なヘルパーファクターを産生する。これらのヘルパーファクターにより、エフェクターＴ細胞やＢ細胞が刺激を受け、分化・成熟をする。モスマン（Mosmann）とコフマン（Coffman）により、ヘルパーＴ細胞はIL2を分泌するがIL4を分泌しないもの、逆にIL2を分泌しないがIL4を分泌するものに分類し、前者はTh1,後者はTh2と呼ばれる。すなわち、１種類のヘルパーＴ細胞がエフェクターＴ細胞およびＢ細胞の両方を活性化しているわけではなく、主にTh1がエフェクターＴ細胞を、Th2がＢ細胞に作用するサイトカインを分泌する。Th1由来のサイトカインとしては、前述のIL2、IFN-γ、TNF-α、IL3などであり、Th2由来のサイトカインとしてはIL4,IL5,IL6,IL10などが挙げられる。
【００１５】
３．イヌインターロイキン(IL)１２について
イヌIL１２は、ヒトIL１２同様分子量約４０ｋＤタンパク質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤタンパク質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインである。
【００１６】
４．インターフェロン(IFN)−γについて
IFN-γは、ConAやPHA等のマイトジェンやIL１２によりＴ細胞あるいはNK細胞から産生誘導されることが知られている。その生物活性は、抗ウイルスタンパク質合成誘導による抗ウイルス作用以外に、NK細胞に作用しキラー活性を増強したり、マクロファージのIL-1やTNFの産生を増強し、貪食作用を増強する。さらに、好中球の活性化に関与し、遅延型過敏症反応を抑制する。また、Ｂ細胞の抗体産生には一般に抑制的に作用することが知られている。Ｔ細胞に対しては、キラーＴ細胞の誘導を促進し、IL２やIL２レセプターの発現増強を行うことが知られているサイトカインである。また、モスマン（Mosmann）らの提唱したTh1/Th2仮説では、Th1はTh2の増殖・活性を抑制すると考えられ、Th1から産生されるIFN-γは、Th2の増殖を抑制し、Th2の産生するサイトカインの作用を抑制する。
【００１７】
５．インターロイキン（IL）１０について
IL10は、ヘルパーＴ細胞のTh0とTh2サブセットにより産生され
また単核球やマクロファージも産生することが知られている。生物活性は、アクセサリー細胞依存性のTh1からのほとんどのサイトカイン産生およびTh1細胞株の増殖を抑制するものの、Th2からのサイトカイン産生は抑制しない。例えば、IL10によりTh1からのIFN-γ産生抑制は約90%であると言われている。また、種々の検討からTh1細胞のサイトカイン産生を刺激するマクロファージの作用を抑制するが、Ｂ細胞の作用には影響を及ぼさないことが知られている。すなわち、IL10は抗原提示細胞の存在下でのみその阻害作用を現すため、直接抗原提示細胞に作用していることが示唆されるサイトカインである。
【００１８】
６．イヌインターロイキン１２の製法
イヌＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってイヌＩＬ１２活性を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡとイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１９】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１２）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献１３），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）らの方法（文献１４），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１５）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００２０】
このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってイヌＩＬ１２活性を示すＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を大腸菌などの宿主に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、イヌＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００２１】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００２２】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），ジョン ウイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００２３】
産生されたイヌＩＬ１２は，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤである。
【００２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。
【００２５】
７．イヌインターロイキン１２の精製法
イヌＩＬ１２は、以下の実施例２で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、イヌ白血球からのインターフェロンγ（以下ＩＦＮγと略記する）の誘導能およびフィトヘムアグルチニン（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【００２６】
本発明においてイヌインターロイキン１２の精製には、カラムクロマトグラフィーによる方法を選択することが望ましい。カラムクロマトグラフィーでは、全ての工程で水溶液で展開可能であるため、インターロイキン１２のような固有の生物活性を有するタンパク質の精製に使用できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラム担体として、イオン交換担体、色素担体などが挙げられる。
【００２７】
まず、上記イオン交換担体としては、アガロース、セルロース、合成ポリマーゲルなどに、例えばジエチルアミノエチル（Diethylaminoethyl）、クオテナリアミノエチル（Quaternary aminoethyl）、クオテナリアンモニウム（Quaternary ammonium）、カルボキシメチル（Carboxymethyl）、スルホプロピル（Sulphopropyl）、メチルスルホネ−ト（Methyl sulphonate）などの官能基を導入したものが挙げられる。好ましくはスルホプロピルが導入された、ＳＰ セファロースハイパフォーマンス（アマシャム社製）やＳＰ セファロースファーストフロー（アマシャム社製）など（以下、ＳＰセファロース担体と略記する）が用いられる。ＳＰセファロース担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度などによって決定される。Ｐ４０とＰ３５の組合せから成るタンパク質はそれぞれ異なった電荷を有しており、それぞれの電荷の差により、本担体を用いて、それぞれを分画することができる。例えば、昆虫細胞中で生産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの場合、ｐＨ値７以下で、それぞれを分画することができる。
【００２８】
さらに、色素担体としては、ブルー色素を結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ましく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用される。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロンブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマシャム社製）、ブルーセファロース６ハイパフォーマンス（アマシャム社製）、マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲルブルー（バイオラット社製）などの商品名で市販されているブルーアガロースゲル、またはブルートリスアクリルーＭ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ社製）などの商品名で市販されているブルーセファロースゲルなどが適当であり、容易に入手することができる。ブルー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎水度などによって決定される。例えば、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの場合、中性付近のｐＨで、それぞれを分離溶出して、高純度で精製することができる。
【００２９】
上記したカラム担体を用いた精製操作はそれぞれ単独で行ってもイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞれを組合わせて行った方がより効果が高い。例えば、カイコ生体中で生産したイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーを含む溶液中には、非常に多くのカイコ由来の夾雑物と複数のイヌＰ４０とイヌＰ３５の組合わせが含まれるので、上記２つのカラム担体を組合わせることが好ましい。昆虫細胞中およびカイコ生体中で生産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの製造においては、初段精製にスルホプロピル担体を、２段目精製にブルー担体を用いることが好ましい。
【００３０】
なお、各カラム担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【００３１】
また、ＩＬ１２およびＰ４０ホモダイマーをそれぞれ同時に大量に製造するために、Ｐ４０をコードする遺伝子をより発現性が高いプロモーター下に接続し、Ｐ３５をコードする遺伝子をそれより発現性が低いプロモーター下に接続し、これらを同時に含む組換え体を作製し、それぞれの遺伝子を発現させることで、ＩＬ１２とＰ４０ホモダイマーを、同時に生産することができる。例えば、バキュロウイルス発現系において、ポリヘドリンプロモーターとＰ１０プロモーターの両方を含むベクターのポリヘドリンプロモーター下にイヌＰ４０をコードする遺伝子を、Ｐ１０プロモーター下にイヌＰ３５をコードする遺伝子をそれぞれ連結し、組換えウイルスを作製して、昆虫細胞で発現させることによって、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの両方を同時に大量に製造することができる。
【００３２】
８．イヌインターロイキン１２の製剤化法
インターロイキン１２の製剤化は、イヌIL１２及び種々の安定化剤を添加しても良い。有用タンパク質の安定化方法として知られているのは、他のタンパク質、例えばゼラチン、血清、アルブミン、コラーゲンなどと混合する方法（文献２〜５）、糖類、特に単糖類、二糖類およびデキストランやヒドロキシエチルデンプンのような多糖類と混合する方法（文献６〜９）、あるいはサイクロデキストリンや多糖類アルコールを安定化剤とする方法がある（文献１０，１１）。本発明の製造法で製造されるイヌIL１２以外に安定化剤を添加することで、さらに長期間の安定化効果が期待できる。添加される安定化剤としては特に限定はない。本薬に添加される成分は、主として、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬が固体として用いられる場合は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、本薬が液体として投与される場合は、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本発明の治療薬および予防薬の投与方法に特に限定はないが、注射投与することにより最も治療効果が期待できる。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定されない。
【００３３】
９．対象疾患となる犬腫瘍について
犬の腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門腫瘍が挙げられる。
【００３４】
１０．犬へのイヌIL12の投与方法について
投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すればよく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１００μｇ／ｋｇのイヌＩＬ１２の投与で十分な効果が得られる。
【００３５】
また、養子免疫療法では１ー１００ｍｌのイヌの血液から分離したリンパ球に対し、０．００１ｐｇから１μｇのイヌＩＬ１２で１２時間から６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分な効果が得られる。
【００３６】
１１．犬血液からの白血球の調製
犬血液中からの白血球調製は、まず血液凝固を防止するために採血直後に抗凝固剤を添加する。抗凝固剤としては、ヘパリン、エチレンジアミンテトラアセテートが使用される。得られた血液から細胞群を調製するには、主に比重遠心法が用いられる。すなわち、赤血球や顆粒球の比重よりも小さく、リンパ球や単球よりも大きい溶液に血液を重層し、遠心操作により細胞群を分画する方法である。分離液としてはフィコール−イソパック液が使用される。遠心操作後には、希釈血漿分画と分離液の間に目的となる白血球であるリンパ球と単球の分画が見られるので、この分画を分取する。さらにリンパ球のみを分離するためには、主にペトリ皿付着法が用いられる。その後得られたリンパ球分画は、ナイロンウールカラムを使用することによりＴ細胞のみを分離・濃縮することができる。本方法は、細胞群に激しい操作を加えることなく、雑多な細胞集団より比較的純粋なＴ細胞群が回収できる利点がある。
【００３７】
１２．白血球からの遺伝子調製
白血球からの遺伝子の調製は例えば次のようにして実施することができる。上記１１で調製したＴ細胞群からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって可能である。イヌＴ細胞などによりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジ・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。さらに、通常の方法、例えば塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献１４）、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１５）などによりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてインターフェロン−γやインターロイキン１０をコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってインターフェロン−γやインターロイキン１０をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
１３．犬抗腫瘍効果評価方法
イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する方法としては、犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定する方法であり、サイトカインとしては、イヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０である。判定は、イヌインターフェロンγの発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインターロイキン１０の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することにより行うことができる。
【００３９】
イヌインターロイキン１２を腫瘍罹患犬に投与し、採血後、白血球を分離し、さらに遺伝子を抽出しサイトカインであるイヌインターフェロン−γやイヌインターロイキン１０の発現変動を、遺伝子のアガロースゲル電気泳動による検討・評価を行う。投与開始直後からイヌインターフェロン−γの発現および投与期間内での発現上昇および投与開始時のインターロイキン１０の未発現または低発現および投与期間内での発現減少の場合は、イヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は高く、その逆に投与開始時および投与期間内のイヌインターフェロン−γの発現減少およびイヌインターロイキン１０の発現上昇の場合はイヌインターロイキン１２の抗腫瘍効果は低いと評価する。また、犬の腫瘍で症例の多い乳腺腫瘍など表出しているものについては、腫瘍の大きさの経時変化を記録し、サイトカイン遺伝子の発現変動と合わせて評価することもできる。
【００４０】
１４．犬抗腫瘍効果を評価する評価キット
上記反応を含むイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の発現変動を測定するために用いるキットは、それ自体既知の方法により調製可能である。これらのキットに供する試薬等は、上記方法により得られる被測定サンプルとしてのイヌインターフェロン−γ遺伝子やイヌインターロイキン１０遺伝子の他、アガロースゲル電気泳動液、電気泳動装置、UV照射ゲル撮影装置が含まれる。また、任意の要素として分子量マーカー、DNA溶液に電荷を持たせるローディング緩衝液なども含まれる。
【実施例】
【００４１】
以下、参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００４２】
参考例１ イヌＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０７ ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球よりアイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ を２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのギブコ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）社製スーパースクリプトII ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４３】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、アマシャム社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
【００４４】
（３）イヌＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献１）をもとに、配列番号３および４の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でパーキンエルマーセータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１６）に従って調製した。
【００４５】
このＤＮＡ断片をＴ−ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）（ノバジェン社）に宝酒造（株）のＤＮＡ ライゲーションキット Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００ ＤＮＡ分析システム（ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）（デュポン社製）を用いて、ダイデオキシ法（文献１７）でイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号１に示す。
【００４６】
また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のランダムプライマー ＤＮＡ ラベリングキットを用いて３２Ｐを標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。
【００４７】
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（エチレンジアミン四酢酸塩−リン酸ナトリウム−食塩緩衝液）（０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０６ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム−食塩緩衝液）（３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素エコアールＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ ライゲーションキット Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（エコアールＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示す。
【００４８】
（４）イヌＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号５および６の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号２に示す。
【００４９】
また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ノットＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ(ストラタジーン社製)のノット（Ｎｏｔ）Ｉサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。
【００５０】
参考例２ イヌＩＬ１２の生産
（１）イヌＩＬ１２発現ベクターの調製
発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献１８）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ ＤＮＡ断片は配列番号７および８の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１３および１４の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、イヌＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。
【００５１】
また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。イヌＩＬ１２Ｐ３５ ＤＮＡ断片は配列番号９、１０の２種類のプスト（Ｐｓｔ）Ｉ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１５、１６の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、参考例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、イヌＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。
【００５２】
さらに、作製したこれら４つの発現プラスミド中のイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００５３】
（２）サルＣＯＳ細胞でのイヌＩＬ１２の生産
上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（アマシャム社製）および１００μＭのクロロキン（シグマ社製）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で４日間培養し、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００５４】
（３）イヌＩＬ１２産生組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０およびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作製した。
【００５５】
（４）昆虫細胞でのイヌＩＬ１２の生産
上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファーミンジェン社のバキュロゴールドプロテインフリーインセクトメディウムで７５ｃｍ２のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ Ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養した後、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００５６】
参考例３ イヌＩＬ１２の抗腫瘍効果
参考例２（２）、（４）で生産されたイヌＩＬ１２の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のヒトＩＬ２を２５０Ｕ、６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとして水泡性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ），感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１９のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０５ 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、上記（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０７希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を３日間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００５７】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに、１０５個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心した。これに、ストラタジーン社のラット抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体を１０μｌ添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳｆ２１で産生させたイヌＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上昇させた。これらのことから、イヌＩＬ１２はイヌリンパ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明した。
【００５８】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これらをさらに５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で３日間培養後、文献１４のＭＴＴアッセイ法により、イヌＩＬ１２の芽球化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（バイオラット社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産生したイヌＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上の芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。
【００５９】
さらに、イヌＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレート１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌを加え、さらにイヌＩＬ１２を発現している上記（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障害性を次の式にて算出した。
％細胞障害性＝（１−ＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００
【００６０】
ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。
【００６１】
その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したイヌＩＬ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロールが２２％であったのに対し、イヌＩＬ１２は約８３％の細胞障害性を示した。イヌＩＬ１２はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【００６２】
参考例４ イヌＩＬ１２の精製
参考例２（４）で得られた細胞培養上清を用いてスルホプロピル担体によるイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの分画を検討した。精製はｐＨ：７で行った。培養上清を、スルホプロピル担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄した。溶出はＮａＣｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻みで行った。その結果、イヌＩＬ１２は、３５０〜５５０ｍＭで、イヌＰ４０ホモダイマーは、６００〜７５０ｍＭの各ＮａＣｌ濃度の溶出画分で検出された（ウエスタンブロッティング）。なおその他の溶出画分およびアルカリ洗浄画分にはイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーは検出されなかった。
【００６３】
イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーが溶出された各画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにそれぞれアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を５００ｍＭから２Ｍまで５ｍＭ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＩＬ１２は１．１〜１．２Ｍで、イヌＰ４０ホモダイマーは、１．５〜２Ｍの各ＮａＣｌ濃度の溶出画分で検出された（ウエスタンブロッティング）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、イヌＩＬ１２が溶出されたブルーセファロース担体での各画分中のイヌＩＬ１２の純度は９８％以上であった。
【００６４】
参考例５ 精製イヌＩＬ１２の検出および生物活性
参考例４で得られた精製イヌＩＬ１２のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および活性測定は以下のようにして行った。まず検出は、参考例２（４）で得られた昆虫細胞の培養上清中のイヌＩＬ１２をウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、上記（１）で得られた抗イヌＰ４０ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約７５ｋＤのバンドが検出された。さらに、抗イヌＰ３５ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を用いて、同様にして、参考例２で得られた昆虫細胞の培養上清を解析した結果、約７５ｋＤのバンドのみが検出された。このことから、約７５ｋＤのバンドは、イヌＰ４０とＰ３５のヘテロダイマーから成るイヌＩＬ１２であることが判明した。精製イヌＩＬ１２のイヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性を測定した。イヌ末梢血からリンパ球を分離し、９６穴マイクロプレート中、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で１穴あたり１００μｌ添加し、各穴にゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のリコンビナントヒトＩＬ２を２５０μｇ加え、これに精製イヌＩＬ１２（１〜１０３ｐｇ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で７２時間培養した。培養後の各培養上清１００μｌ中の抗ウイルス活性を測定した。ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＦＣＢＲ１を用い、文献１６のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、精製イヌＩＬ１２（１〜１０３ｐｇ／ｍｌ）単独添加した培養上清で、２ｘ１０３〜１０５ 単位／ｍｌの抗ウイルス活性が確認された。
【００６５】
参考例６ イヌＩＬ１２製剤の製造
参考例４で得られた精製イヌＩＬ１２の各溶液（０．０１重量％のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を含む）を透析によって脱塩した溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン（株）製）、ソルビトールを加えて、ゼラチンの終濃度０．５％、ソルビトールの終濃度３０％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株）製）で処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１ｐｇから５μｇのイヌＩＬ１２を含むイヌＩＬ１２製剤を得た。この製剤は、室温条件下で安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解した。
【００６６】
参考例７ イヌＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果検討
参考例６のイヌＩＬ１２製剤の活性測定は、参考例３の場合と同様の方法で以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のヒトＩＬ２を２５０Ｕ、６ｃｍディッシュに添加した。これに参考例６で得られた製剤１ｍｌとヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ２ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１９のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０５ 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０７希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、イヌIL１２を含まない製剤（コントロール）では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００６７】
実施例１ イヌIL12の腫瘍罹患犬への投与
（１）イヌIL１２の投与方法
腫瘍罹患犬としては、乳腺腫瘍を始めとして、線維肉腫、皮膚リンパ腫、メラノーマなど１９症例に投与した。イヌIL１２の投与に先だって一般血液学的検査のため採血及び体重、体温等の測定も行った。次に表１に示す計画に従ってイヌIＬ１２を投与する。すなわち、第１週は静注により0.1μg/kgを週２回、第２〜４週は静注及び局注により４μg/kgを週２回投与した。第５週目は休薬とし、さらに第６〜８週は静注及び局注により４μg/kgを週２回投与した。局注の場合は複数の腫瘍が存在しても、一つの腫瘍にのみ投与し、期間を通じて同じ腫瘍にのみ投与した。また、局注は、腫瘍実質およびその周辺に投与した。また、他の薬剤は基本的には併用しなかった。ただし、抗腫瘍効果と無関係な薬剤の投与は限定しなかった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（２）観察検査の項目、時期および結果
イヌIL１２投与日での臨床症状の観察検査は、表２に示す通りである。また、週一回イヌIL１２投与に先立って実施した。すなわち、観察検査項目は臨床症状（脱水状態、呼吸様式、元気、食欲、飲水欲、下痢、嘔吐）、体温、体重、血液学的検査（血球系（白血球数、ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌｂ，Ｇｌｏｂ，ＡＬＰ）、とした。全ての項目について検査を実施したが、重篤な症状はなく、検査値に異常は見られなかった。
【００７０】
【表２】
【００７１】
（３）イヌ血液からイヌ白血球の調製
採血により得られたイヌ全血を、予めHistopaq-1077を入れた遠心管に混合しないように重層する。400gで30分遠心し、白血球画分をパスツールピペットを用いて得た。次にERDF-10%FBS培地を添加して再度遠心し、沈殿画分を再びERDF-10%FBS培地を加え、10cmシャーレに入れ、37℃、CO2インキュベーター内にて培養を行った。１時間後、シャーレの培養上清を回収し、遠心操作後、沈殿画分をERDF-10%FBS培地により懸濁し、イヌ白血球とした。調製した白血球1×107cellsを１０ｍＬシリンジ（テルモ社製）に詰めたナイロンウール中に処し、３７度下１５分静置した。次に、リン酸塩バッファー（PBS）で押し出し、Ｔ細胞画分を調製した。Ｔ細胞画分をmRNAマイクロプレップクイックプーリフィケーションキット（アマシャム社）によりmRNAを調製した。cDNA合成は、Rever Tra -ACE-(TOYOBO社製)を用いて、Oligo dTプライマーにより合成した。PCRは、premix taq（宝酒造（株）社製）を用いて行った。PCRの条件は、熱変性：94℃、１分、アニーリング：56℃、30秒、伸長反応：72℃、１分で、30 cycleで行った。プライマー配列は、β−actinが配列番号17、18、IFN-γが配列番号19、20 、IL10が配列番号21、22である。
【００７２】
得られたPCR産物は1%アガロースゲルにより電気泳動を行った。また、電気泳動したサンプルをジーンクリーン（geneclean）IIkit(フナコシ社製)を用いてゲルから抽出し、T-vector（Novagen社）にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)(Applied Biosystems)により、ビッグダイ ターミネーター サイクル シーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法で各サイトカインのDNAの塩基配列を確認したところ、イヌIFN-γまたはイヌIL10であることが確認できた。
【００７３】
実施例２ 犬血液中のサイトカイン発現と腫瘍退縮効果の相関性検討
実施例１でイヌIL12を投与した１９症例の内、８症例で腫瘍の退縮が見られた。全症例の犬血液中のIFN-γおよびIL10遺伝子解析を実施したところ、表３に示すように有効８症例全ての症例でIFN-γの発現増大、IL１０の発現減少を確認することができた。なお、各遺伝子の発現量について、発現を検討した期間８週において、発現が見られる期間が８〜６週に渡って見られる場合は＋＋＋、５〜３週に渡って見られる場合は＋
＋、２〜１週の場合は＋、全く検出できない場合を−とした。
【００７４】
【表３】
【００７５】
参考文献：
・ ボルフ（Ｗｏｌｆ）ら：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．１４６，３０７４−３０８１（１９９１）．
・ 特開平２−２６４７２８５号公報
・ 特開平２−４９７３４号公報
・ 特開昭５４−８０４０６号公報
・ 特開昭５６ー６８６０７号公報
・ 特開昭５９−１８１２２３号公報
・ 特公平６−５１６４１号公報
・ 特開昭６１−４４８２６号公報
・ 特開昭６０−１５５１３６号公報
・ 特開昭５８−９２６９１号公報
・ 特公平３−５００８８２号公報
１２．チルイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８，５２９４（１９７９）．
１３．バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８，５１４３（１９７９）．
１４．ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ） ２５，２３６−２６９（１９８３）．
１５．岡山（Ｏｋａｙａｍａ）ら：モレキュラー セル バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ）．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，（１９８３）．
１６．モレキュラークローニング コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２．
１７．プロバー（Ｐｒｏｂｅｒ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３８，３３６−３４１（１９８７）．
１８．Ｆ．Ｌ．（グラバム）Ｇｒａｂａｍら：バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ５４，５３６（１９７３）．
１９．フェッテサイド（Ｗｈｅｔｅｓｉｄｅ）ら ：ジャーナル オブ イムノロジカル メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ９０，２２１−２２３（１９８６）．
２０．シード（Ｓｅｅｄ）ら：プロセジャー ナショナル オブ
アカデミック サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ）８４，３３６５−３３６９（１９８６）．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することを特徴とする、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果評価方法。
【請求項２】
サイトカインが、イヌインターフェロンγおよび／またはイヌインターロイキン１０であり、イヌインターフェロンγ遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインタロイキン１０遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することを特徴とする請求項１記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果評価方法。
【請求項３】
イヌインターロイキン１２を投与された犬から採取した犬白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定し、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価用キット。
【請求項４】
サイトカインがイヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０であることを特徴とする請求項３記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価キット。
【請求項１】
犬血液中白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定することを特徴とする、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果評価方法。
【請求項２】
サイトカインが、イヌインターフェロンγおよび／またはイヌインターロイキン１０であり、イヌインターフェロンγ遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果があると判断し、イヌインタロイキン１０遺伝子の発現が見られる時イヌインターロイキン１２による抗腫瘍効果がないと判断することを特徴とする請求項１記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果評価方法。
【請求項３】
イヌインターロイキン１２を投与された犬から採取した犬白血球のサイトカイン遺伝子の発現変動を測定し、イヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価用キット。
【請求項４】
サイトカインがイヌインターフェロンγおよびイヌインターロイキン１０であることを特徴とする請求項３記載のイヌインターロイキン１２による犬抗腫瘍効果を評価する評価キット。
【公開番号】特開２００７−２０２４３１（Ｐ２００７−２０２４３１Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２７２８（Ｐ２００６−２２７２８）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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