イネの低温発芽性に関する遺伝子とその利用
【課題】イネの低温発芽性に関する遺伝子とその利用を提供する。
【解決手段】イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）した低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、上記低温発芽性遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物、上記低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法、上記低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法、及び上記低温発芽性遺伝子の発現を利用して、イネの栽培品種の低温発芽性を解析する方法。
【解決手段】イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）した低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、上記低温発芽性遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物、上記低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法、上記低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法、及び上記低温発芽性遺伝子の発現を利用して、イネの栽培品種の低温発芽性を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温発芽性遺伝子とその利用技術に関するものであり、更に詳しくは、イネの低温発芽性を向上させる機能を有する単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、該低音発芽性遺伝子を利用した環境ストレス（低温、塩、浸透圧のストレス）下での発芽性向上方法、該遺伝子を導入して作出した形質転換植物及び植物の低温発芽性の検出方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
環境ストレスに対する耐性は、作物における重要な形質であり、これまで、量的形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）と呼ばれる複数の遺伝子により制御されている複雑形質であると考えられていた。これらのＱＴＬｓを同定することは、世界における安定な作物生産を達成するものとして重要であると思われる。これまでに、本発明者らは、特定の形質を有するイネ科植物の選抜方法と該方法に用いる遺伝子マーカーを提案している（特許文献１）。また、本発明者らは、イネ低温発芽性について研究を進める過程で、イネ発芽性遺伝子のＱＴＬ解析により、第３、４染色体に３個のＱＴＬ（ｑＬＴＧ−３−１、ｑＬＴＧ−３−２、ｑＬＴＧ−４）を見出した。そして、第３染色体短腕末端領域に見出された遺伝子座ｑＬＴＧ−３−１は、作用力が極めて大きく、イネの低温発芽性の改良において有用であることが示唆された（非特許文献１）。
【０００３】
また、本発明者らは、発芽ステージにおける低温耐性に作用する三つのＱＴＬｓのうち、ｑＬＴＧ−３−１について、高精度マッピングを行った（非特許文献２、４）。その結果、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域をマーカーＳＳＲ１２５４１１−４．１からマーカーＳＴＳ７３−２８間の約９６ｋｂに絞り込むことができた（非特許文献２）。しかし、これは、イネ低温発芽性ＱＴＬの高精度マッピングによりｑＬＴＧ−３−１の候補領域を推定し得た、というものである。
【０００４】
また、本発明者らは、ストレス下におけるイネ種子発芽性のＱＴＬ解析を行った。それにより、ｑＬＴＧ−３−１は、温度、塩（ＮａＣｌ）及び浸透圧（マンニトール）ストレスを含む多様のストレス応答に関与していることが示唆された。このＱＴＬにおいて、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型の遺伝子が発芽性を高くする作用を示すこと、第３染色体短腕末端領域には、塩及び浸透圧のいずれのストレスに対しても高い発芽性を示すＱＴＬが存在すること、が明らかとなった（非特許文献３）。
【０００５】
このように、低温は、世界における作物生産における主要な環境ストレスであり、これまでに、本発明者らは、高い低温発芽性を有する「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いたＱＴＬ分析により、低温発芽性に関与する三つのＱＴＬｓ（量的形質遺伝子座）を明らかにした。しかし、環境ストレスは、複数の遺伝子により制御されている複雑形質と考えられており、ｑＬＴＧ−３−１の表現型の遺伝的な機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の単離、同定及びクローニング等については未だ何も行われていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１８０３６２号公報
【非特許文献１】育種学研究５（別２），ｐ．２１２（２００３）
【非特許文献２】育種学研究８（別１），ｐ．１５３（２００６）
【非特許文献３】育種学研究５（別１），ｐ．１１７（２００７）
【非特許文献４】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０８：７９４−７９９（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ｑＬＴＧ−３−１の表現型の遺伝的な機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の単離、同定及び該遺伝子のクローニングによる形質転換体の作出等を目標として鋭意研究を積み重ねる過程で、上記のＱＴＬを分子レベルで解明するために、染色体地図に基づくクローニングにより、ｑＬＴＧ−３−１を同定し、未知の機能を持つ蛋白質をコード化していることを見出した。また、ｑＬＴＧ−３−１は、種子の発芽の時期に胚で強く発現され、ＧＵＳに融合させたｑＬＴＧ−３−１のプロモーターによる形質転換植物において、子葉鞘と種子根をカバーしている芽鱗、前鱗において、特異的なＧＵＳ染色が観察された。そして、更に研究を重ねて、ｑＬＴＧ−３−１の機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の塩基配列の決定、該遺伝子がコードするアミノ酸配列の決定、該遺伝子による形質転換体の作出及び該遺伝子の利用技術を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、イネの低温発芽性に関する遺伝子、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、該遺伝子を利用した環境ストレス（低温、塩、浸透圧のストレス）下での発芽性の向上方法、該遺伝子を導入して作出した形質転換体及び植物の低温発芽性の検出方法等を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子。
（２）上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等乃至類似の低温発芽性能を有する、前記（１）に記載の低温発芽性遺伝子。
（３）環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する、前記（１）に記載の低温発芽性遺伝子。
（４）前記（１）の低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするアミノ酸配列。
（５）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子を植物に組換えて低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物。
（６）植物が、イネである、前記（５）に記載の形質転換植物。
（７）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法。
（８）上記栽培品種が、イネである、前記（７）に記載の低温発芽性の分析方法。
（９）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とするものである。本発明では、上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等の低温発芽性能を有する低温発芽性遺伝子、上記遺伝子変異が、塩基配列の付加、欠失、置換によるものであること、環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する低温発芽性遺伝子であること、を好適な実施態様としている。
【００１１】
また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするものである。また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させた形質転換植物の点に特徴を有するものである。本発明の形質転換植物において、植物が、イネであること、ｑＬＴＧ−３−１プロモーター＋ｑＬＴＧ−３−１遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させたこと、また、３５Ｓプロモーター＋ｑＬＴＧ−３−１遺伝子を植物に導入して低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１を過剰発現させたこと、を好ましい実施の態様としている。
【００１２】
また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することからなる低温発芽性の分析方法の点に特徴を有するものである。本発明の分析方法では、上記栽培品種が、イネであること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に交雑あるいは遺伝子組換えて、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることからなるイネの低温発芽性の向上方法の点に特徴を有するものである。
【００１３】
次に、本発明の低温発芽性遺伝子の単離について詳しく説明する。植物材料として、ジャポニカイネ品種である日本由来のイネの「はやまさり」とイタリア由来のイネの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いた。ｑＬＴＧ−３−１に関する準同質遺伝子系統（Ｎｅａｒ Ｉｓｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｅ，ＮＩＬ）であるＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、「はやまさり」に「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１近傍の３６０−ｋｂの染色体領域を導入した。「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の交配から得た組換え自殖系統ＢＩＬｓから、低温発芽性の表現型と遺伝子型に基づいて、ＢＩＬ１１６を選抜した。ＢＩＬ１１６は、ＮＩＬを作製するために、マーカーアシスト選抜で「はやまさり」と戻し交配した。
【００１４】
異なったストレス条件下における発芽性を検討するために、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法に従って、発芽テストを行った。低温ストレスのために、種子をペトリ皿に入れてインキュベータに載置した。その際に、異なった濃度の植物ホルモン（ＡＢＡ及びＧＡ）、ＮａＣｌ及びマンニトールの溶液を、ペトリ皿に加え、インキュベータに載置した。
【００１５】
ｑＬＴＧ−３−１のポジショナルクローニングを行うために、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピング及び大規模マッピングを行った。そのために、後記する表１に記載した両親の間の分子マーカー及び多型を用いた。ＢＩＬ１１６を「はやまさり」と交配し、高精度マッピング及び大規模マッピングのために、戻し交配の後代を作出し、２５６個体からなるＦ２個体集団を高精度マッピングに用いた。
【００１６】
ｑＬＴＧ−３−１座における各組換えＦ２個体の遺伝子型を、Ｆ３後代の低温下での発芽テストによって決定した。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」ホモ接合体、「はやまさり」ホモ接合体、ヘテロ接合体の３つの遺伝子型は、明確に区別可能であった。これらのＦ２個体を、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マップに使用し、加えて、〜３２００個体からなるＢＣ１Ｆ２集団を、大規模マッピングに用いた。
【００１７】
ゲノムＤＮＡは、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法に従って、抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲに基づく分子マーカーを持つ表現型で共分離をするためにＰＣＲに用いた。これまでに開発した２つのＳＳＲマーカー（Ｆｕｊｉｎｏら ２００４年）に加えて、８つのＳＳＲマーカー（後記する表１参照）を、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告された方法に従って、「日本晴」ゲノムを用いて、高精度マッピングのために作製した。
【００１８】
大規模マッピングのために、６つの分子マーカーを「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の１４のゲノム配列の違いに基づいて作製した（後記する表１、２参照）。９６−ｋｂ領域の両親の間の多型を検出するシークエンシングのために、両親からのＰＣＲ産物の両鎖を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクルシークエンシングキッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、直接シークエンシングした。
【００１９】
アソシエーション解析のために、６９のジャポニカイネ品種をｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型によって分類した。「はやまさり」型対立遺伝子を検出するために、プライマーＳ１０３Ｕ及びＳ１０３Ｌ（後記する表４参照）を用いて、「はやまさり」に見出された欠失領域を増幅するＰＣＲを行った。「日本晴」型対立遺伝子を検出するために、上記のＰＣＲ産物を、ＢｓｅＲＩにより消化した。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子におけるＧＡＧＧＡＧは、ＢｓｅＲＩによって消化され、「日本晴」型対立遺伝子におけるＧＴＧＧＡＧは、ＢｓｅＲＩによっては消化されなかった。「はやまさり」、「日本晴」及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」遺伝子型は、各々、２８、２０及び２１のイネ品種で見出された。各遺伝子型の低温発芽性の平均は、分散分析で比較した。
【００２０】
遺伝子発現の分析を行うために、全ＲＮＡを、ＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、イネの種々の器官から抽出した。全ＲＮＡ（０．５μｇ）は、製造指針に従って、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを持つＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）によって逆転写した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。各ＰＣＲ反応（１０μＬ）は、５倍に希釈された０．５μＬのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。目標遺伝子に対する各プライマーの特異性を、ＰＣＲ産物のシークエンシングによって確認した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡ（４μｇ／試料）を、４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ、１ｍＭＥＤＴＡ、及び２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む２．０％（ｗ／ｖ）アガロース−変性ホルムアルデヒドゲル上で分離した。
【００２１】
ＲＮＡを、２０×ＳＳＣで正にチャージしたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移した。ハイブリダイゼーションとシグナルの検出は、各々、ＤＩＧシステム及びＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行った。プライマー１３−５Ｕ及び１３−５ＬからのＰＣＲフラグメントを、ノーザンブロット分析のプローブとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー及び増幅条件は、後記する表５に記載した。
【００２２】
プラスミドの構築及び形質転換を行うために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の３−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（後記する表４参照）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｑＬＴＧ−３−１プロモーターＧＵＳ遺伝子融合コンストラクトを作るために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の５’上流領域の２−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−１０Ｕ及びＡｎｏ１３−１０Ｌ（後記する表４参照）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。
【００２３】
真のｑＬＴＧ−３−１遺伝子を十分に発現させるプロモーター配列は、未同定であるため、ｑＬＴＧ−３−１の開始コドンから２ｋ−ｂｐの５’上流領域を、プロモーターとして用いた。これらのＰＣＲ産物は、各々、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。
【００２４】
次いで、これらのフラグメント及びＧＵＳ遺伝子を、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）に、クローニングした。過剰発現植物を作るために、３５Ｓプロモーターの下にｑＬＴＧ−３−１遺伝子を連結したコンストラクトを作製した。プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５ＬからのＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化された。このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈａ３ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）のＳａｃＩサイトに、クローニングした。
【００２５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介在した形質転換体を、「はやまさり」（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら２００６年）の形質転換に用いた。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生された植物は、隔離した温室で生育させた。Ｔ１形質転換体を、導入遺伝子上のＰＣＲによって選択、栽培し、採種（Ｔ２世代）を行い、発芽実験に供した。
【００２６】
ＧＵＳ発現の組織化学分析を行うために、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳを持った形質転換植物の種子を、３０℃でインキュベートした。この条件下で、発芽（子葉鞘の出現）は、処理後２日でわずかのパーセントの種子で起こり始めた。形質転換植物の種子は、処理後０日、１日及び２日で試料とした。形質転換イネの全種子及び縦にカットされた種子を、０．５ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、０．５ｍＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、０．５ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］及び０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）で真空浸透し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、７０％ＥｔＯＨを加えて、室温で酵素反応を停止した。
【００２７】
栽培イネの近縁野生イネとして、ＡＡゲノム野生イネ、Ｗ０１０６（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、Ｗ０６５２（Ｏ．ｂａｒｔｈｉｉ）、Ｗ１１６９（Ｏ．ｇｌｍａｅｐａｔｕｌａ）、Ｗ１４１３（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）及びＷ１５０８（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）のイネ種子を、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所から入手した。６２品種を含む栽培イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）のコアコレクションのイネ種子を、独立行政法人農業生物資源研究所から入手した。
【００２８】
このコレクションは、ジャポニカ、アウス及びインディカに相当するグループＡ、Ｂ及びＣの３つのグループからなっていた（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）。全ＤＮＡを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告された方法により、ＣＴＡＢを用いて、若葉から分離した。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子領域を、プライマー（後記する表４参照）を用いて増幅し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ ターミネータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのサイクルシークエンスを用いて、直接シークエンシングした。
【００２９】
シークエンシングは、Ｐｒｉｓｍ３７００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＤＮＡ配列は、ＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて整列化し、次いで、視覚的に確認した。全ての多型は、クロマトグラムから再照合した。
【００３０】
本発明者らの見出した配列では、ヘテロ接合体は観察されなかった。５’及び３’ＵＴＲを含んだ９３３−ｂｐの上流領域と２９６−ｂｐの下流領域を含んでいるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子領域１７８４−ｂｐ遺伝子は、−４３３から−３８４からの５０−ｂｐ領域のＴＡの繰り返しを除いて、栽培イネと野生種からシークエンシングした。
【００３１】
遺伝子多型により得られたユニークなＤＮＡ配列又は対立遺伝子間の系統関係を示す、ハプロタイプネットワークを、統計学における節約法を用いたコンピュータープログラムＴＣＳ（Ｃｒａｎｄａｌｌら ２０００年）により、構築した。
【００３２】
環境ストレス耐性の付与は、作物の安定生産において重要な育種目標である。特に、寒冷地におけるイネの栽培においては、低温が主要なストレスであるが、これまで、低温耐性は、量的形質（ＱＴＬｓ）と呼ばれる複数の遺伝子により制御されている複雑形質であると考えられていた。これに対して、本発明では、量的形質であるイネの低温発芽性に関わる遺伝子作用力の大きな遺伝子を単離し、その機能解析を行った。
【００３３】
低温発芽性遺伝子として、低温発芽性に極めて優れるイネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の有するｑＬＴＧ−３−１を単離した。本発明では、ポジショナルクローニング法により、このｑＬＴＧ−３−１を分子的に同定した。この遺伝子は、５５５ｂｐよりなり、機能未知の新規の遺伝子であった。機能消失型遺伝子を有するイネ品種「はやまさり」に、アグロバクテリウム法によって機能型の遺伝子の遺伝子導入を行ったところ、「はやまさり」よりも高い低温発芽性を示したことから、この５５５−ｂｐの配列が、目的とする低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１であることが明らかとなった。
【００３４】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の有する機能型ｑＬＴＧ−３−１を含む染色体領域を、ＤＮＡマーカー選抜・戻し交雑により、機能消失型遺伝子を有するイネ品種「はやまさり」に導入した準同質遺伝子系統は、低温だけではなく、塩（ＮａＣｌ）及び浸透圧（マンニトール）のストレス下においても、高い発芽性を示した。このことから、ｑＬＴＧ−３−１は、複数のストレスに対する耐性に関わる遺伝子であることが示唆された。
【００３５】
遺伝子の発現解析の結果、ｑＬＴＧ−３−１は、特に種子発芽時の胚において、高い発現が認められた。また、出穂前の穂においても、高い発現が認められた。そこで、開始コドンから５’側上流域の２−ｋｂにＧＵＳ遺伝子を連結し、このコンストラクトを、「はやまさり」へ、アグロバクテリウム法により、遺伝子導入した。その結果、発芽時の種子胚において、ＧＵＳ活性が認められた。これらのことから、ｑＬＴＧ−３−１は、発芽時の種子胚に特異的に発現し、その特異性は、少なくとも５’側上流域の２−ｋｂで制御されていることが明らかとなった。
【００３６】
低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子配列を比較したところ、高い低温発芽性を示す「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、機能型の遺伝子配列を持ち、「はやまさり」は、７１−ｂｐの欠失により機能を消失していた。一方、「日本晴」は、アミノ酸変異を生じる１個の塩基置換を有していた。そこで、イネ品種約７０系統について、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性に関するアソシエーション解析を行った。
【００３７】
その結果、低温発芽性は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型＞「日本晴」型＞「はやまさり」型、の順に明瞭な関係が認められた。このことから、遺伝子変異を判別することで、低温発芽性を推測できることが明らかとなった。また、「日本晴」に認められた変異アミノ酸は、遺伝子の機能に関係していると考えられた。この変異アミノ酸を含む領域は、植物におけるｑＬＴＧ−３−１の相同性遺伝子においても、高度に保存されていた。
【００３８】
本発明では、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域を絞り込むマーカーを作出のために、候補領域の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」８６−ｋｂと「はやまさり」９０−ｋｂを、「日本晴」配列をもとに、ＰＣＲ増幅し、シーケンス解析を行った。その結果、１４箇所の変異を同定し、６個をマーカー化して、大規模集団からの組換え個体の選抜に用いた。約３２００個体を供試したところ、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域をマーカーＤとＦの間の４．８−ｋｂに絞り込むことができた。ＲＡＰ−ＤＢにより、この領域には、１個の機能未知遺伝子の存在が予測された。
【００３９】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子と比較して、「はやまさり」では、７１−ｂｐの欠失が生じ、機能消失となっていることが明らかとなった。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子を「はやまさり」へ遺伝子導入したところ、形質転換体Ｔ２では、明らかに「はやまさり」よりも高い低温発芽性を示した。このことから、本遺伝子が、低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１の原因遺伝子であることが確認できた。
【００４０】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の発現には、高い組織特異性が認められた。特に、種子発芽時の胚において、強い発現があり、胚乳では、発現は認められなかった。該遺伝子は、３０℃及び１５℃条件のいずれの発芽時においても発現が認められることから、低温ストレスによって誘導される遺伝子ではない。また、登熟過程の胚部分でも発現は認められないこと及び発芽処理後の経過時間によって発現が上昇することから、ｑＬＴＧ−３−１は、発芽時に特異的な遺伝子発現を示すことが明らかとなった。
【００４１】
発芽過程におけるｑＬＴＧ−３−１合成系遺伝子（ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ２０ｏｘ２、ＯｓＧＡ３ｏｘ２）及びアミラーゼ遺伝子（Ｒａｍｙ １Ａ）の遺伝子発現を、ｑＬＴＧ−３−１機能型遺伝子を持つ「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いて解析した。ｑＬＴＧ−３−１は、３０℃では処理後６時間後に、１５℃では１２時間後に、遺伝子発現が認められた。３０℃では、同じく６時間後に、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ３ｏｘ２、Ｒａｍｙ １Ａの遺伝子発現が認められた。一方、１５℃では、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１は、ｑＬＴＧ−３−１と同じく、１２時間後に遺伝子発現が認められたが、ＯｓＧＡ３ｏｘ２、Ｒａｍｙ １Ａは、２４時間後となった。このことから、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子発現とほぼ同時に、これらの遺伝子発現が、開始することが明らかとなった。
【００４２】
このような遺伝子発現のパターンは、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１機能型遺伝子に関する「はやまさり」の準同質遺伝子系統ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１においても認められた。また、ｑＬＴＧ−３−１機能消失型遺伝子を持つ「はやまさり」では、これらのいずれの遺伝子の発現も遅くなっていた。このことから、ｑＬＴＧ−３−１によって、これらの遺伝子の発現が、早期に誘導され、そのことにより、高い低温発芽性が形質発現されると考えられた。
【００４３】
また、ｑＬＴＧ−３−１の低温以外の環境ストレスへの反応性について、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１を用いて解析した。その結果、ＮａＣｌ及びマンニトール下においても、発芽性の向上が認められた。また、ＡＢＡ下では、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」及び「はやまさり」は、発芽が遅延されたのに対し、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１では、発芽の阻害が認められた。
【００４４】
更に、本発明では、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子変異を明らかにした。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子ｑＬＴＧ−３−１に対し、「はやまさり」は、７１−ｂｐの欠失による機能消失型遺伝子であった。機能型遺伝子に対し、「日本晴」では、アミノ酸変異を伴う１個の塩基置換が生じていた。ｑＬＴＧ−３−１の塩基配列によるデータベース解析の結果、相同性遺伝子は、イネ科、ナス科、マメ科、ウリ科に存在していた。これらのアミノ酸配列を比較したところ、Ｎ末側に保存性の高い配列（８アミノ酸）が認められた。「日本晴」で生じているアミノ酸変異は、この保存された配列中にあった。
【００４５】
そこで、「日本晴」型のｑＬＴＧ−３−１遺伝子の機能を明らかにするために、北海道の在来種から現在の品種までの６９系統を用いて、アソシエーション解析を行った。その結果、これらｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性に、明瞭な差異が認められた。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型（２１系統）では、８０．８％、「日本晴」型（２０系統）では、６９．７％、「はやまさり」型（２８系統）では、３０．７％と、有意な差異が得られた。このことから、「日本晴」型で生じたアミノ酸変異は、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子機能をやや低下させることが明らかとなった。また、保存されているアミノ酸配列も、遺伝子機能に重要な役割を有していると考えられた。
【００４６】
栽培イネにおけるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型変異を探索するため、世界コアコレクション６２系統について、１７８４−ｂｐの遺伝子配列を比較した。その結果、構造遺伝子領域では、３箇所のｉｎ−ｆｒａｍｅな挿入・欠失は認められたが、アミノ酸置換は存在しなかった。これらの挿入・欠失は、反復配列領域における反復数の差異を生じるものであった。このことから、ｑＬＴＧ−３−１は、機能的に重要であり、そのために、保存性の高い遺伝子であると考えられた。また、これらの塩基置換により、コアコレクションは、１０ハプロタイプによる２ハプログループを構成した。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子及びその塩基配列を提供することができる。
（２）上記遺伝子によりコードされる低温発芽性向上作用を有するアミノ酸配列を提供することができる。
（３）上記低温発芽性遺伝子単独の機能（低温、塩、浸透圧のストレス下での発芽性向上特性）の解明により、該遺伝子の利用技術（低温発芽性の向上方法等）を提供することを実現した。
（４）組織特異的な遺伝子発現機構を解明したことで、例えば、植物の低温発芽性を効率よく、簡便に調査することが可能である。
（５）上記遺伝子を導入した形質転換イネを作出することで、低温発芽性を向上させたイネを開発し、提供することができる。
（６）イネ系統の遺伝子型を同定することにより、イネの低温発芽性のレベルを識別することができる。
（７）栽培品種の遺伝子型と低温発芽性との関係を、遺伝子型を同定することで確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝的評価を行った。植物材料として、ジャポニカイネ品種である日本由来のイネの「はやまさり」とイタリア由来のイネの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いた。「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を交配して得られた組換え自殖系統（ＢＩＬｓ）から、低温発芽性の表現型とｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型に基づいて、ＢＩＬ１１６を選抜した。図１に、ＢＩＬ１１６（Ａ）及びＮＩＬ（Ｂ）の遺伝子型をグラフで示す。
【００５０】
ＢＩＬ１１６は、ＮＩＬ作製のために、ＤＮＡマーカー選抜で「はやまさり」と戻し交配して、ＢＣ３Ｆ１個体集団を作出した。ＢＣ３Ｆ１の６６の植物の中で、ドナーの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１を含んでいる最小の区分を有している＃５９を選抜し、戻し交配した。また、＃５９の全ゲノム領域の遺伝子型を調査した。これに基づいて、ＢＣ３Ｆ１個体集団の＃５９の１１個体の中の、１つの個体である、＃５９−１１を選抜した。
【００５１】
ＢＣ３Ｆ１個体の、＃５９−１１の自殖より得られたＢＣ３Ｆ2後代のうち、ｑＬＴＧ−３−１領域の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子のホモ接合体を持つ個体を選抜した（図１のＢ）。ＮＩＬ断片は、マーカーＳＴＳ７３−２８（Ｉ）とＳＳＲ１０７２２４−２１．１の間で、ｑＬＴＧ−３−１の一方の側で遺伝子組換を有していた（表１、図２）。ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、「はやまさり」に、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」から移入されたｑＬＴＧ−３−１近傍の３６０−ｋｂの染色体領域を有している。
【００５２】
【表１】
【００５３】
これまでに、本発明者らは、低温発芽性のジャポニカ品種の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」と、普通の「はやまさり」の交配から得た組換え自殖系統（ＢＩＬｓ）の戻し交配により、低温発芽性を制御する三つのＱＴＬｓをマッピングしている（Ｆｕｊｉｏｎｏら ２００４年）。これらのうち、最も効果的と考えられるＱＴＬの、ｑＬＴＧ−３−１を、第３染色体上にマッピングした。ｑＬＴＧ−３−１の遺伝的根拠を決定するために、戻し交配の後代を用いて、低温発芽性の分離分析を行った。図３に、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の表現型を示す。
【００５４】
戻し交配集団における低温発芽性の頻度分布は、明瞭な単一因子の分離パターンであり（図３のＡ）、ｑＬＴＧ−３−１が、優性遺伝子であることを示した。ｑＬＴＧ−３−１の正確な遺伝的効果を解明するために、準同質遺伝子系統（ＮＩＬｓ）のＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１を、ＤＮＡマーカー選抜を用いて、「はやまさり」との戻し交配で作製した。ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、明らかに反復親の「はやまさり」と比べて、高い低温発芽性を示した（図３のＢ及びＣ）。
【実施例２】
【００５５】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の単離を行った。ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピング及び大規模マッピングのために、分子マーカーと表１に示した両親の間の多型を用いた。ＢＩＬ１１６を、「はやまさり」と交配し、高精度マッピング及び大規模マッピングのために、戻し交配後代を作出した。２５６個体からなるＦ２集団を高精度マッピングのために用いた。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子座における各遺伝子組換えＦ２植物の遺伝子型を、それらのＦ３後代との低温下での発芽テストによって、決定した。３つの遺伝子型の、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」ホモ接合体、「はやまさり」ホモ接合体及びヘテロ接合体が、明瞭に区分された。
【００５６】
これらの遺伝子組換えＦ２植物を、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピングに用いた。加えて、〜３２００植物からなるＢＣ１Ｆ２集団を、大規模マッピングのために用いた。ゲノムＤＮＡを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載の方法に従って、抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ分析に使用し、ＰＣＲに基づく分子マーカーで表現型を共分離した。
【００５７】
これまでに開発した２つのＳＳＲマーカー（Ｆｕｊｉｎｏら ２００４年）に加えて、８つのＳＳＲマーカー（表１）を、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載された方法に従って、「日本晴」のゲノムを用いて、高精度マッピングのために作製した。
【００５８】
大規模マッピングのために、６つの分子マーカーを、「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の１４のゲノム配列の違いに基づいて、作製した（表１、２）。９６−ｋｂ領域における両親の間の多型を見つけるシークエンシングのために、両親から得たＰＣＲ産物の両鎖を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ ｃｙｃｌｅシークエンスｋｉｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、直接シークエンシングした。
【００５９】
６９のジャポニカ品種を、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型によって分類した。「はやまさり」の対立形質を見つけるために、プライマーＳ１０３ａＵ及びＳ１０３ａＬを用いて、「はやまさり」で見出された欠失を増幅するためのＰＣＲを行った。「日本晴」の対立形質を見つけるために、上記のＰＣＲ産物を、ＢｓｅＲＩで消化した。
【００６０】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の対立形質におけるＧＡＧＧＡＧは、消化され、「日本晴」におけるＧＴＧＧＡＧの対立形質は、ＢｓｅＲＩでは消化されなかった。「はやまさり」、「日本晴」及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の遺伝子型が、２８、２０及び２１の米品種から各々見出された。各遺伝子型の低温発芽性の平均は、分析分散によって比べた。
【００６１】
戻し交配の後代を用いて、遺伝子の高精度マッピングを行った。ｑＬＴＧ−３−１は、マーカーＳＳＲ１２５４１１−４．１（Ａ）とＳＴＳ７３−２８（Ｉ）の間の９６−ｋｂ領域に位置していた。図４に、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子のポジショナルクローニングを示す。ｑＬＴＧ−３−１をクローニングするために、〜３，２００個体で詳細な染色体地図を作成した。両親は、遺伝的に近い関係にあるので、目標の領域には、適用できるＳＳＲマーカーはなかった。そこで、「はやまさり」の目標領域（〜９０ｋｂ）と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の目標領域（〜８６ｋｂ）をシークエンシングした。ＳＳＲ、ＳＮＰ及び挿入／欠失を含む１４の多型が検出された（表２）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
それらのうちの６つを大規模マッピングに用いた。その結果、ｑＬＴＧ−３−１は、Ｓ１０３ａ（Ｅ）と共分離し、マーカーＳＳＲ１１８６７３−１３．１（Ｄ）及びＳ１０７（Ｆ）の間の４．８−ｋｂ領域に定めた。この領域では、唯一つの遺伝子、Ｏｓ０３ｇ０１０３３００が、ＲＡＰ−ＤＢで予測されている（ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００６４】
図５に、ｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列を示す。図６及び７に、ｑＬＴＧ−３−１のヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列を示す。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の配列は、５５５−ｂｐ長の一つのエクソンを有している。ｑＬＴＧ−３−１は、「日本晴」のイネゲノムでは、単一遺伝子である。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子は、１８４アミノ酸の新規蛋白質をコード化している（図５、６、７）。バイオインフォマティク分析により、ｑＬＴＧ−３−１蛋白質は、２つの保存されたドメイン（ＧＲＰ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １ ｔｏ １００ ａｎｄ Ｔｒｙｐ＿ａｌｐｈａ＿ａｍｙｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ／ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ／ ＬＴＰ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ ｔｏ １８２ ｂｙ Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｔｉｆ．ｇｅｎｏｍｏ．ｊｐ））を有することが示された。
【００６５】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の配列と比べて、コード領域の７１−ｂｐの欠失が、「はやまさり」で検出された。それは、ストップコドンをもたらすフレームシフトを起こした。この事実は、「はやまさり」のｑＬＴＧ−３−１の対立形質は遺伝子の機能を失うことを示している。「日本晴」では、コード領域の＋５０位置におけるＴのＡへの変異は、ＬｅｕをＨｉｓに変えることが予測される。
【００６６】
データベース調査により、植物でのみｑＬＴＧ−３−１に著しい相同を有する２１の遺伝子が見出された。ｑＬＴＧ−３−１を含むこれらの蛋白質の系統発生分析により、これらの蛋白質は、２つの主要なクラスに分けられることが分かった。図８に、ｑＬＴＧ−３−１及び関連の蛋白質の系統樹を示す。クラスＩは、ｑＬＴＧ−３−１を含み、単子葉植物、双子葉植物の２つのサブクラスからなっていた。クラスＩＩは、単子葉植物の３つの蛋白質のみを含んでいた。ＧＲＲ及びＬＴＰドメインに加えて、Ｎ末端領域に、アミノ酸、ＡｘｘＬＡＬＮＬＬＦＦｘｘｘｘＡＣが高度に保存されていた。図９に、ｑＬＴＧ−３−１及び関連蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す。
【００６７】
「日本晴」の配列において、変換されたアミノ酸の９番位置のＬｅｕ残基は、Ｈｉｓに変異された。変換されたアミノ酸の機能を決定するために、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性の表現型の間のアソシエーション解析を行った。６９のイネ品種をｑＬＴＧ−３−１の３つの遺伝子型に分類した（表３、図１０）。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子を持った品種（８０．０％）は、「はやまさり」型対立遺伝子を持った品種（３０．７％）より高い低温発芽性を示した。「日本晴」型対立遺伝子を持った品種（６９．７％）は、わずかに低下した低温発芽性を示した（ｐ＝０．０４３４）。「日本晴」型対立遺伝子で置換されたアミノ酸は、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子機能において、重要な役割をはたし、置換されたアミノ酸は、遺伝子の機能を減らすことを示唆した。
【００６８】
【表３】
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、相補性検定を行った。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の３−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（表４）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに、クローニングした。次いで、このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）に、クローニングした。図１１に、ｑＬＴＧ−３−１の相補性検定のための導入遺伝子コンストラクトを示す。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」の形質転換に用いた（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
ハイグロマイシン抵抗性カルス（Ｔ０植物）から再生された植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物の自殖からＴ１植物を得た。Ｔ１形質転換体を、導入遺伝子のＲＣＲによって選抜し、Ｔ２種子を発芽実験を行うために集めた。
【００７２】
相補性検定のために、ｑＬＴＧ−３−１プロモーター領域及び遺伝子領域を含む「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の３−ｋｂのフラグメントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体によって、「はやまさり」に導入した。ベクターを持った形質転換系統は、「はやまさり」と同様の低温発芽性を示した。形質転換遺伝子のホモ接合体を有する全ての５つの形質転換体は、「はやまさり」より高い低温発芽性を有している（図１２）。これらの各系統の中で、至適発芽温度２５℃では、発芽性に違いは見られなかった。この結果より、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の３−ｋｂのフラグメントにおける遺伝子は、低温発芽を向上させることが確認された。
【実施例４】
【００７３】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の発現を調べた。ＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、全ＲＮＡを、イネの各器官から抽出して、ＤＮａｓｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡ（４μｇ／試料）を、４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ酢酸Ｎａ及び２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む２．０％（ｗ／ｖ）アガロース−変性ホルムアルデヒドゲル上で分離した。
【００７４】
ＲＮＡは、２０ＸＳＳＣで正にチャージしたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にブロッティングした。ハイブリダイゼーションとシグナルの検出は、製造指針に従って、ＤＩＧシステムとＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって、行った。プライマー１３−５Ｕ及び１３−５Ｌから得たＰＣＲフラグメントを、ノーザンブロット分析のプローブとして、用いた（表５）。
【００７５】
【表５】
【００７６】
ノーザンブロット分析により、ｑＬＴＧ−３−１は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」及びＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で各々３０℃及び１５℃で発芽処理後、１２時間及び１日目に発現し、発現は、発芽開始により増加した（図１３のＡ及びＢ）。３０℃及び１５℃における発現レベルを増加させるパターンは、同じであった。この事実により、ｑＬＴＧ−３−１は、低温のストレスによって誘導されないことを示した。「はやまさり」の発現レベルは、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬｑＬＴＧ−３−１のそれよりも低かった。また、発現の誘導は、「はやまさり」では遅れた。３つの品種における発現のパターンは、低温発芽性の表現型によく相当した。ｑＬＴＧ−３−１は、組織特異的に発現した（図１３のＣ）。発現は、胚乳と葉で検出されなかった。低いレベルの発現は、根で検出された。強い発現は、発芽時の種子胚、幼苗の地上部及び幼穂で検出された。
【実施例５】
【００７７】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の生理学的な評価を行った。発芽テストを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法によって、行った。低温ストレスのために、ペトリ皿の種子を、インキュベータに設置した。その際に、異なる濃度の植物ホルモン（ＡＢＡ及びＧＡ）及びマンにトールの溶液をペトリ皿に加え、インキュベータに設置した。
【００７８】
内在性のＡＢＡ及びＧＡは、種子の休眠と発芽を促進する主要な役割をはたす（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｇｉｒａｎｄａｔ １９９８年）。ｑＬＴＧ−３−１は、発芽期間におけるＡＢＡ及びＧＡに対する応答に影響するかどうか、を検討した。図１４に、異なったストレス条件下でのｑＬＴＧ−３−１の発芽反応を示す。また、図１５に、異なったストレス条件下での「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の発芽反応を示す。
【００７９】
至適温度（２５℃）下では、「はやまさり」、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で、発芽性に非常にわずかの違いが観察された（図１４のＡ）。ＡＢＡ処理においては、両親で発芽の遅れが観察されたが、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、より低い発芽性を示した。３００ｍＭ ＡＢＡより低濃度では、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、両親と同様に発芽の遅れを示した（図１５）。５００ｍＭ ＡＢＡで、両親よりもＡＢＡに対してより感受性であった（図１４）。
【００８０】
２５０ｍＭマンニトール及び１５０ｍＭ ＮａＣｌより低濃度では、全ての品種は、発芽の遅れを示した（図１５））。しかし、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、３００ｍＭ ＮａＣｌ下、５００ｍＭマンニトール及び１３℃下で、「はやまさり」に比べて、発芽性の向上を示した（図１４）。これらの結果より、ｑＬＴＧ−３−１は、低温、塩、浸透圧を含む多様のストレスに対する応答に関連していることが示された。また、外因性のＧＡは、どの遺伝子型でも種子の発芽を促進しない（図１６）。
【実施例６】
【００８１】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の発現と種子の発芽の関係を調べた。全ＲＮＡ（０．５μｇ）を、製造指針に従って、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０ プライマーを持つＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）によって逆転写した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、行った。各ＰＣＲ反応（１０μＬ）は、５倍に希釈された０．５μＬのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。目標遺伝子に対する各プライマーの特異性は、ＰＣＲ産物をシークエンシングすることにより確認した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー及び増幅条件は、表５に示した。
【００８２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析による「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」、「はやまさり」及びＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１の種子発芽時の胚におけるｑＬＴＧ−３−１の発現を決定した。図１７に示されるように、ｑＬＴＧ−３−１の発現は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で各々３０℃及び１５℃の処理の後、６及び１２時間で検出され、発芽開始が促進された。開花後の種子の登熟の間、ｑＬＴＧ−３−１の発現は、胚では非常に低いレベルであった（図１８）。
【００８３】
ｑＬＴＧ−３−１の発現パターンを、ＡＢＡ（５００ｍＭ）、ＮａＣｌ（２５０ｍＭ）及びマンニトール（５００ｍＭ）によって処理された胚において、調べた。全てのストレス条件下で、ｑＬＴＧ−３−１発現の遅れと抑制が観察された（図１９）。これらの現象は、これらのストレス条件下で、発芽の阻害及び遅れの表現型に良く関連した。
【実施例７】
【００８４】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１発現の組織化学的分析を行った。ｑＬＴＧ−３−１プロモーターＧＵＳ遺伝子融合構造物を作製するために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の５’上流領域の２−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−１０Ｕ及びＡｎｏ１３−１０Ｌ（表４）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００８５】
真のｑＬＴＧ−３−１遺伝子を十分に発現するプロモーター配列が不明であるので、ｑＬＴＧ−３−１の開始コドンから５’上流領域の２−ｋｂを、プロモーターとして用いた。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトへ、クローニングした。次いで、このフラグメント及びＧＵＳ遺伝子を、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄ ベクター（Ｆｕｓｅら、２００１年）に、クローニングした。図２０に、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳのコンストラクトを示す。
【００８６】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」の形質転換のために用いた（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生した植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物（Ｔ１）の自殖種子をこの実験に用いた。Ｔ０形質転換体を、導入遺伝子についてのＰＣＲによって選抜した。
【００８７】
ＧＵＳ発現の組織化学分析のために、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳを持った形質転換植物の種子を、３０℃で培養した。この条件下で、発芽、子葉鞘の発現が処理の１日後で種子のわずかの割合で起き始めた。形質転換植物の種子を、処理後０．１及び２日の時間で供試した。
【００８８】
形質転換体の全種子及び縦方向にカットした種子を０．５ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、０．５ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、０．５ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］及び０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）で真空浸透させ、３７℃で６時間培養した。次いで、７０％ＥｔＯＨを加えて、酵素反応を温度で停止した。
【００８９】
ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳ（ベーターグルクロニダーゼ）リポーター遺伝子融合を持った形質転換イネ植物におけるｑＬＴＧ−３−１プロモーター活性を分析した。ＧＵＳの発現は、芽根を囲う芽鱗、及び前鱗で強く検出された（図２１）。形質転換体でない「はやまさり」植物では、シグナルは検出されなかった。ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びＧＵＳリポーター発現と合わせて、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子は、種子発芽時の胚において、強く発現された。
【実施例８】
【００９０】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１によるＧＡ生合成遺伝子及びＲａｍｙ１Ａ発現の誘導を調べた。種子発芽時の胚で強く発現されるｑＬＴＧ−３−１が、多様のストレス条件下で高い発芽性を発揮するかどうかは明らかでない。ｑＬＴＧ−３−１の機能を評価するために、種子の発芽性に重要であることが知られている、６つのＧＡ生合成遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、Ｒａｍｙ１Ａの発現プロファイルを、種子の発芽期間の胚における半定量的なＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＯｓＧＡ２０ｏｘ３、ＯｓＧＡ２０ｏｘ４及びＯｓＧＡ３ｏｘ１の発現は、この実験では検出されなかった。
【００９１】
ｑＬＴＧ−３−１は、明瞭に、ｑＬＴＧ−３−１の発現パターンと同様の、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ２０ｏｘ２、ＯｓＧＡ３ｏｘ２及びＲａｍｙ１Ａの発現を誘導した（図１７）。ＯｓＧＡ２０ｏｘ１とＯｓＧＡ３ｏｘ２の発現は、各々、３０℃及び１５℃で処理した後、６及び１２時間で検出された。この時間は、ｑＬＴＧ−３−１のそれと同じであった。ＯｓＧＡ２０ｏｘ２の発現は、他の遺伝子のそれより遅れた（図１７）。次いで、Ｒａｍｙ１Ａの発現が観察された。
【００９２】
全てのテストされた遺伝子における発現の遅れは、「はやまさり」で観察された。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、同じ発現パターンを示したが、これは、ｑＬＴＧ−３−１によって、ＧＡ生合成及びＲａｍｙ１Ａにおけるそれらの遺伝子の発現を誘導することを示唆している。加えて、ＧＡ生合成及びアミラーゼに関する８つの遺伝子の発現が決定された（表５、図２２）。それらのうちの６つの発現は、ｑＬＴＧ−３−１で高く制御され、このことは、ｑＬＴＧ−３−１が、ＧＡ生合成を誘導していることを示唆している。
【実施例９】
【００９３】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現を行った。過剰発現植物を作るために、ｑＬＴＧ−３−１を作動する３５Ｓプロモーターのコンストラクトを作製した。プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５ＵとＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（表４）を用いて増幅させたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化した。このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈａ３ Ｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）のＳａｃＩサイトに、クローニングした。図２３に、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現のためのコンストラクトを示す。
【００９４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）の形質転換に用いた。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生した植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物（Ｔ１）の自殖植物を生育させた。Ｔ１形質転換体を導入遺伝子について、ＰＣＲにより選抜し、養成してＴ２を得て、発芽実験を行うために集めた。
【００９５】
ｑＬＴＧ−３−１は、組織特異的な発現を有している。発現パターン、組織特異性及び量が、植物における発芽性又はストレス応答の調節の効果を検討するために、３５ＳプロモーターでｑＬＴＧ−３−１をドライブする過剰発現植物を作出した。形質転換植物において、ｑＬＴＧ−３−１は、強く葉及び穂で発現され、発現は、非形質転換植物では検出されなかった（図２４）。この過剰発現植物は、高い低温発芽性を発揮した（図２５）。３つの独立したＴ１個体集団における導入遺伝子の有無で、低温発芽性の分離分析を行った。導入遺伝子を持った植物は、それを持たない植物と比べて、高い低温発芽性を示した。これらの結果は、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現は、低温発芽性を高めることを示した。
【実施例１０】
【００９６】
本実施例では、栽培イネと野生種の中のｑＬＴＧ−３−１遺伝子におけるＤＮＡ多型を調べた。６２品種を含む栽培イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）のコアコレクションの種子（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）を独立行政法人農業生物資源研究所から得た。このコアコレクションは、３つのグループからなっていた。グループＡ、Ｂ及びＣは、広い地域からのジャポニカ、アウス及びインディカに各々相当した（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年；Ｇａｒｒｉｓら ２００５年）。
【００９７】
ＡＡゲノム野生種、Ｗ０１０６（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、Ｗ０６５２（Ｏ．ｂａｒｔｈｉｉ）、Ｗ１１６９（Ｏ．ｇｌｕｍａｅｐａｔｕｌａ）、Ｗ１４１３（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）及びＷ１５０８（Ｏ．ｌｏｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）のイネ種子を大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所から得た。Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載されたＣＴＡＢ法を用いて、全ＤＮＡを若葉から分離した。
【００９８】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子をプライマー（表４）を用いて、増幅させ、ＢｉｇＤｙｅターミネータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるサイクルシークエンシングを用いて、直接シークエンシングした。シークエンシングは、Ｐｒｉｓｍ３７００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｉｔｅｍｓ）で行った。ＤＮＡ配列は、Ｂｉｏ Ｅｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて、一列に並べ、次いで、視覚で確認した。全ての多型を低頻度の多型に特に注意して、クロマトグラムから再照合した。
【００９９】
本発明者らの配列では、ヘテロ接合性は観察されなかった。完全な５‘及び３’ＵＴＲを含んでいる９３３−ｂｐの上流領域及び２９６−ｂｐの下流領域を含むｑＬＴＧ−３−１の１７８４−ｂｐ遺伝子を、ＴＡの繰り返しの−４３３から−３８４の５０ｂｐの領域を除いて、栽培イネ及び野生種でシークエンシングした。ユニークＤＮＡ配列又は変異ステップで分離された対立形質を表す、最少の範囲（ハプロタイプ）を、統計の節約法を用いたコンピュータープログラムＴＣＳ（Ｃｒａｎｄａｌｌら ２０００年）を使用して、構築した。
【０１００】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の全１７８４ヌクレオチドの配列を決定した。機能的対立遺伝子としての「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の配列と比べて、挿入、欠失及び置換を含む３２の変異が検出された（表６）、これらの変異に基づいて、１０の違ったハプロタイプが、イネのコアコレクションにおける６２品種の中で、見つかった（表７、ＤＮＡ配列：図２６−３４、アミノ酸配列：図３５−３７）。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
遺伝子コード領域において、２つの欠失、一つの挿入及び一つの同義でない置換が起こった。暗号領域の全ての欠失及び挿入は、３ｎｂｐのｉｎ−ｆｒａｍｅ変異として起こった。一つの同義でない置換は、「日本晴」のみで検出された。ハプロタイプ９及び１０は、ハプログループＩ及びＩＩの間における遺伝子内組み換えから得られた、と見られる。
【０１０４】
ハプロタイプネットワークを全ｑＬＴＧ−３−１における遺伝子変異から構築した。２つのハプロタイプは、遺伝子内の組み換えから生じたので、ネットワークに含めなかった。ネットワークは、２つのハプログループＩ及びＩＩからなっていた（図３８）。このネットワークは、遺伝子配列系統樹の結果から強く支持された。
【０１０５】
これらのハプログループは、１８の変異のステップで相互に分離された。５つのハプロタイプを含むハプログループＩは、３１の品種からなり、そのほとんどは、イネのコアコレクションのグループＡ及びＢからであった。３つのハプロタイプを含むハプログループＩＩは、２５の品種からなり、そのほとんどは、グループＢ及びＣからであった。
【０１０６】
ＡＡゲノムにおける近縁イネのｑＬＴＧ−３−１の配列を、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の機能型対立遺伝子（ハプロタイプＩ）と比べた。挿入、欠失及び置換を含む、多くのヌクレオチドの変化が検出され、それらは、栽培イネでは、検出されなかった。これらのほとんどのヌクレオチドの変化は、Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ（Ｗ１４１３及びＷ１５０８）で起こっており、他の系統と明らかに異なっていた。
【０１０７】
遺伝子コード領域において、１３の同義置換、６つの欠失及び１１の挿入が検出された。全ての欠失、挿入は、ＧＲＰの領域でｉｎ−ｆｒａｍｅとして起こった（図２６−３４）。トランスポゾンと遺伝子コード領域を除く全ｑＬＴＧ−３−１において、２６の挿入及び欠失が検出された。それらのうちの１０は、３ｎで、残りは３ｎではなかった。栽培イネにおけるｑＬＴＧ−３−１の保存に加えて、これらの野生イネの結果により、ｑＬＴＧ−３−１蛋白質配列は、イネにおける機能の重要性により、完全に保存されていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
以上詳述したように、本発明は、イネの低温発芽性に関する遺伝子とその利用方法に係るものであり、本発明により、イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子及びその塩基配列を提供することができる。本発明は、上記低温発芽性遺伝子単独の機能、例えば、低温、塩、浸透圧のストレス下での発芽性向上特性を利用した該遺伝子の利用技術を提供すること、上記遺伝子を導入して低温発芽性を向上させた形質転換植物を提供すること、また、本発明の低温発芽性遺伝子の配列に基づいて遺伝子変異を同定することにより、栽培品種の低温発芽性のレベルを識別すること、を可能とするものである。従来、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」に認められる高度の低温発芽性は、ＱＴＬ解析から複数の遺伝子が関与している量的形質と考えられていたが、本発明は、物質として単離した単独の低温発芽性遺伝子及びその塩基配列及びその利用技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＢＩＬ１１６（Ａ）及びＮＩＬ（Ｂ）の遺伝子型をグラフで示す。黒、白及び斜線は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」、「はやまさり」及びヘテロ接合体由来の染色体断片を表わす。マッピングしたマーカーは、高密度ＲＦＬＰ連鎖マーカー（Ｈａｒｕｓｈｉｍａら １９９８年）で割り当てられた染色体位置に対応させた。
【図２】ｑＬＴＧ−３−１近傍のＮＩＬの遺伝子型を示す。白と斜線は、各々、「はやまさり」とヘテロ接合体由来の染色体断片を表わす。
【図３】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の表現型を示す。 （Ａ）は、戻し交配された後代における低温発芽性の頻度分布を表わす。 矢頭は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（ＩＬ）及び「はやまさり」（ＨＹ）を示す。マーカーＧＢＲ３００１で評価された、これらの分類された遺伝子型の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」対立遺伝子のホモ接合体（黒）、ヘテロ接合体（斜線）及び「はやまさり」対立遺伝子のホモ接合体（白）が示された。 （Ｂ）は、１５℃の低温下での「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒マル）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白三角）の発芽反応を表わす。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。 （Ｃ）は、２５℃で３日及び１５℃で７日間発芽した「はやまさり」（上）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（中）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（下）の発芽の表現型を表わす。バーは１ｃｍである。
【図４】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子のポジショナルクローニングを示す。第３染色体（中）のｑＬＴＧ−３−１の９６−ｋｂ領域の範囲を定めた高精度マッピングを示す。大規模マッピング（下）は、ｑＬＴＧ−３−１はマーカーＤ及びＦの間の４．８−ｋｂ領域に位置しており、マーカーＥと共分離していることを示した。マーカー間の数値は、マーカーの間の組換え個体数を示す。
【図５】ｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列を示す。 「はやまさり」と「日本晴」型対立遺伝子で示された変異は、配列により示される。Ｐｆａｍにより、規定された２つのドメイン（ＧＲＰ及びＬＴＰ）は、アンダーラインを付した。ＬＴＰドメインにおける保存された８つのＣ残基はドットで示した。
【図６】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１のヌクレオチド配列「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」「はやまさり」「日本晴」を示す。
【図７】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」「はやまさり」「日本晴」を示す。
【図８】ｑＬＴＧ−３−１及び関連の蛋白質の系統樹を示す。 この系統樹は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを用いて構築した。ブートストラップ分析値を、中心点の枝で示す。示したスケールは、サイト当たり０．０５のアミノ酸置換を示す。登録番号及び植物品種を示す。
【図９】ｑＬＴＧ−３−１及び関連蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す。共通アミノ酸残基はドットで示す。
【図１０】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性の間の関係を示す。 イネ品種は、３つのｑＬＴＧ−３−１、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」タイプ（黒マル）、「日本晴」タイプ（白三角）及び「はやまさり」タイプ（白マル）に分類した。
【図１１】ｑＬＴＧ−３−１の相補性検定のための導入遺伝子コンストラクトを示す。
【図１２】「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からの機能性ｑＬＴＧ−３−１の「はやまさり」への導入において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換によって得られたホモ接合形質転換体の発芽を示す。１５℃の低温下における「はやまさり」（白三角）及び５つの独立した形質転換体（黒の符号）の発芽反応、１５℃の低温下での「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒マル）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白三角）の発芽反応を表わす。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【図１３】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子発現を示す。 ノーザンブロット分析を、「はやまさり」（ＨＹ）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（ＮＩＬ）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（ＩＬ）の異なる組織から抽出された全ＲＮＡにおけるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子発現レベルを測定するために用いた。 エチジウムプロマイド染色ｒＲＮＡをコントロールとして用いた。（Ａ）は３０℃での発芽、（Ｂ）は１５℃での発芽、（Ｃ）は組織特異性、である。
【図１４】異なったストレス条件下でのｑＬＴＧ−３−１の発芽反応を示す。 （Ａ）は２５℃の至適温度での発芽、（Ｂ）は１３℃での発芽、（Ｃ）はＮａＣｌ（３００ｍＭ）、（Ｄ）はマンニトール（５００ｍＭ）、（Ｅ）はＡＢＡ（５００ｍＭ）感受性、である。 「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒三角）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白マル）の例を示す。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【図１５】異なったストレス条件下での「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の発芽反応を示す。（Ａ）では種子を、２５，１５，１３，１０℃で水でインキュベートした。（Ｂ）では、１５℃でＧＡ（１００，２００，５００μＭ）を加えて、２５℃で（Ｃ）ＡＢＡ（２００，３００，５００ｍＭ）、（Ｄ）ＮａＣｌ（１５０，２５０，３００ｍＭ）及び（Ｅ）マンニトール（２５０，５００，６００ｍＭ）を加えて、インキュベートした。 白マルはコントロールを表わす。低濃度〜高濃度を、開いたマル、三角及び四角で示した。
【図１６】１５℃での発芽反応におけるＧＡ（５００ｍＭ）の効果を示す。 白又は黒の符号は、各々、ＧＡ有り又は無しを示す。「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、各々、マル、三角及び四角で示す。
【図１７】ＲＴ−ＰＣＲ分析による３０℃及び１５℃下での発現の期間のｑＬＴＧ−３−１、ＧＡ生合成及びアミラーゼ遺伝子の発現を示す。 Ｕｂｉ２を、ＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図１８】種子発芽の間の胚及びＲＴ−ＰＣＲ分析による発芽の間の胚乳におけるｑＬＴＧ−３−１の発芽を示す。 Ｕｂｉ２をＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図１９】ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＢＡ（５００ｍＭ）、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）及びマンニトール（５００ｍＭ）処理における、発芽の期間のｑＬＴＧ−３−１の発現を示す。 Ｕｂｉ２をＲＴ−ＰＣＲ実験でコントロールとして用いた。
【図２０】ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳのコンストラクトを示す。
【図２１】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子プロモーターの制御下でのＧＵＳ発現を示す。プロモーターとしてのｑＬＴＧ−３−１の２−ｋｂ上流領域の制御下でＧＵＳを発現している形質転換植物をＧＵＳ活性のために染色した。形質転換していない植物の「はやまさり」はバックグラウンドのＧＵＳ活性を示さなかった。バーは１ｍｍである。
【図２２】ＲＴ−ＰＣＲ分析による３０℃及び１５℃での発芽の期間におけるｑＬＴＧ−３−１、ＧＡ生合成及びアミラーゼ遺伝子の発現を示す。 Ｕｂｉ２はＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図２３】ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現のためのコンストラクトを示す。
【図２４】ＲＴ−ＰＣＲ分析による過剰発現の形質転換植物におけるｑＬＴＧ−３−１の発現を示す。 Ｕｂｉ２はＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図２５】過剰発現の形質転換植物の低温発芽性を示す。 ３つの独立したＴ１個体集団における低温発芽性の頻度分布を示す。 黒及び白のバーは導入遺伝子の有無を示す。
【図２６】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２７】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２８】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３０】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３１】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３２】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３３】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３４】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３５】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３６】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３７】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３８】ｑＬＴＧ−３−１のハプロタイプのネットワークを示す。マルのサイズは、所定のハプロタイプ内での系統数に比例している。黒マルの間の白マルは未同定のハプロタイプを表わす。ハプロタイプの間の線は、各ハプロタイプの間の変異のステップを表わす。ハプロタイプ組成は、系統数のパーセントとして示される。青、赤及びオレンジは、各々、イネのコアコレクションのグループＡ、Ｂ及びＣを表わす。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温発芽性遺伝子とその利用技術に関するものであり、更に詳しくは、イネの低温発芽性を向上させる機能を有する単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、該低音発芽性遺伝子を利用した環境ストレス（低温、塩、浸透圧のストレス）下での発芽性向上方法、該遺伝子を導入して作出した形質転換植物及び植物の低温発芽性の検出方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
環境ストレスに対する耐性は、作物における重要な形質であり、これまで、量的形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）と呼ばれる複数の遺伝子により制御されている複雑形質であると考えられていた。これらのＱＴＬｓを同定することは、世界における安定な作物生産を達成するものとして重要であると思われる。これまでに、本発明者らは、特定の形質を有するイネ科植物の選抜方法と該方法に用いる遺伝子マーカーを提案している（特許文献１）。また、本発明者らは、イネ低温発芽性について研究を進める過程で、イネ発芽性遺伝子のＱＴＬ解析により、第３、４染色体に３個のＱＴＬ（ｑＬＴＧ−３−１、ｑＬＴＧ−３−２、ｑＬＴＧ−４）を見出した。そして、第３染色体短腕末端領域に見出された遺伝子座ｑＬＴＧ−３−１は、作用力が極めて大きく、イネの低温発芽性の改良において有用であることが示唆された（非特許文献１）。
【０００３】
また、本発明者らは、発芽ステージにおける低温耐性に作用する三つのＱＴＬｓのうち、ｑＬＴＧ−３−１について、高精度マッピングを行った（非特許文献２、４）。その結果、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域をマーカーＳＳＲ１２５４１１−４．１からマーカーＳＴＳ７３−２８間の約９６ｋｂに絞り込むことができた（非特許文献２）。しかし、これは、イネ低温発芽性ＱＴＬの高精度マッピングによりｑＬＴＧ−３−１の候補領域を推定し得た、というものである。
【０００４】
また、本発明者らは、ストレス下におけるイネ種子発芽性のＱＴＬ解析を行った。それにより、ｑＬＴＧ−３−１は、温度、塩（ＮａＣｌ）及び浸透圧（マンニトール）ストレスを含む多様のストレス応答に関与していることが示唆された。このＱＴＬにおいて、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型の遺伝子が発芽性を高くする作用を示すこと、第３染色体短腕末端領域には、塩及び浸透圧のいずれのストレスに対しても高い発芽性を示すＱＴＬが存在すること、が明らかとなった（非特許文献３）。
【０００５】
このように、低温は、世界における作物生産における主要な環境ストレスであり、これまでに、本発明者らは、高い低温発芽性を有する「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いたＱＴＬ分析により、低温発芽性に関与する三つのＱＴＬｓ（量的形質遺伝子座）を明らかにした。しかし、環境ストレスは、複数の遺伝子により制御されている複雑形質と考えられており、ｑＬＴＧ−３−１の表現型の遺伝的な機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の単離、同定及びクローニング等については未だ何も行われていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１８０３６２号公報
【非特許文献１】育種学研究５（別２），ｐ．２１２（２００３）
【非特許文献２】育種学研究８（別１），ｐ．１５３（２００６）
【非特許文献３】育種学研究５（別１），ｐ．１１７（２００７）
【非特許文献４】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０８：７９４−７９９（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ｑＬＴＧ−３−１の表現型の遺伝的な機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の単離、同定及び該遺伝子のクローニングによる形質転換体の作出等を目標として鋭意研究を積み重ねる過程で、上記のＱＴＬを分子レベルで解明するために、染色体地図に基づくクローニングにより、ｑＬＴＧ−３−１を同定し、未知の機能を持つ蛋白質をコード化していることを見出した。また、ｑＬＴＧ−３−１は、種子の発芽の時期に胚で強く発現され、ＧＵＳに融合させたｑＬＴＧ−３−１のプロモーターによる形質転換植物において、子葉鞘と種子根をカバーしている芽鱗、前鱗において、特異的なＧＵＳ染色が観察された。そして、更に研究を重ねて、ｑＬＴＧ−３−１の機能の解明、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の塩基配列の決定、該遺伝子がコードするアミノ酸配列の決定、該遺伝子による形質転換体の作出及び該遺伝子の利用技術を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、イネの低温発芽性に関する遺伝子、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、該遺伝子を利用した環境ストレス（低温、塩、浸透圧のストレス）下での発芽性の向上方法、該遺伝子を導入して作出した形質転換体及び植物の低温発芽性の検出方法等を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子。
（２）上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等乃至類似の低温発芽性能を有する、前記（１）に記載の低温発芽性遺伝子。
（３）環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する、前記（１）に記載の低温発芽性遺伝子。
（４）前記（１）の低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするアミノ酸配列。
（５）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子を植物に組換えて低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物。
（６）植物が、イネである、前記（５）に記載の形質転換植物。
（７）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法。
（８）上記栽培品種が、イネである、前記（７）に記載の低温発芽性の分析方法。
（９）前記（１）又は（２）に記載の低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とするものである。本発明では、上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等の低温発芽性能を有する低温発芽性遺伝子、上記遺伝子変異が、塩基配列の付加、欠失、置換によるものであること、環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する低温発芽性遺伝子であること、を好適な実施態様としている。
【００１１】
また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするものである。また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させた形質転換植物の点に特徴を有するものである。本発明の形質転換植物において、植物が、イネであること、ｑＬＴＧ−３−１プロモーター＋ｑＬＴＧ−３−１遺伝子を植物に導入して低温発芽性を向上させたこと、また、３５Ｓプロモーター＋ｑＬＴＧ−３−１遺伝子を植物に導入して低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１を過剰発現させたこと、を好ましい実施の態様としている。
【００１２】
また、本発明は、上記低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することからなる低温発芽性の分析方法の点に特徴を有するものである。本発明の分析方法では、上記栽培品種が、イネであること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に交雑あるいは遺伝子組換えて、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることからなるイネの低温発芽性の向上方法の点に特徴を有するものである。
【００１３】
次に、本発明の低温発芽性遺伝子の単離について詳しく説明する。植物材料として、ジャポニカイネ品種である日本由来のイネの「はやまさり」とイタリア由来のイネの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いた。ｑＬＴＧ−３−１に関する準同質遺伝子系統（Ｎｅａｒ Ｉｓｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｅ，ＮＩＬ）であるＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、「はやまさり」に「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１近傍の３６０−ｋｂの染色体領域を導入した。「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の交配から得た組換え自殖系統ＢＩＬｓから、低温発芽性の表現型と遺伝子型に基づいて、ＢＩＬ１１６を選抜した。ＢＩＬ１１６は、ＮＩＬを作製するために、マーカーアシスト選抜で「はやまさり」と戻し交配した。
【００１４】
異なったストレス条件下における発芽性を検討するために、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法に従って、発芽テストを行った。低温ストレスのために、種子をペトリ皿に入れてインキュベータに載置した。その際に、異なった濃度の植物ホルモン（ＡＢＡ及びＧＡ）、ＮａＣｌ及びマンニトールの溶液を、ペトリ皿に加え、インキュベータに載置した。
【００１５】
ｑＬＴＧ−３−１のポジショナルクローニングを行うために、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピング及び大規模マッピングを行った。そのために、後記する表１に記載した両親の間の分子マーカー及び多型を用いた。ＢＩＬ１１６を「はやまさり」と交配し、高精度マッピング及び大規模マッピングのために、戻し交配の後代を作出し、２５６個体からなるＦ２個体集団を高精度マッピングに用いた。
【００１６】
ｑＬＴＧ−３−１座における各組換えＦ２個体の遺伝子型を、Ｆ３後代の低温下での発芽テストによって決定した。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」ホモ接合体、「はやまさり」ホモ接合体、ヘテロ接合体の３つの遺伝子型は、明確に区別可能であった。これらのＦ２個体を、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マップに使用し、加えて、〜３２００個体からなるＢＣ１Ｆ２集団を、大規模マッピングに用いた。
【００１７】
ゲノムＤＮＡは、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法に従って、抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲに基づく分子マーカーを持つ表現型で共分離をするためにＰＣＲに用いた。これまでに開発した２つのＳＳＲマーカー（Ｆｕｊｉｎｏら ２００４年）に加えて、８つのＳＳＲマーカー（後記する表１参照）を、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告された方法に従って、「日本晴」ゲノムを用いて、高精度マッピングのために作製した。
【００１８】
大規模マッピングのために、６つの分子マーカーを「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の１４のゲノム配列の違いに基づいて作製した（後記する表１、２参照）。９６−ｋｂ領域の両親の間の多型を検出するシークエンシングのために、両親からのＰＣＲ産物の両鎖を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクルシークエンシングキッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、直接シークエンシングした。
【００１９】
アソシエーション解析のために、６９のジャポニカイネ品種をｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型によって分類した。「はやまさり」型対立遺伝子を検出するために、プライマーＳ１０３Ｕ及びＳ１０３Ｌ（後記する表４参照）を用いて、「はやまさり」に見出された欠失領域を増幅するＰＣＲを行った。「日本晴」型対立遺伝子を検出するために、上記のＰＣＲ産物を、ＢｓｅＲＩにより消化した。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子におけるＧＡＧＧＡＧは、ＢｓｅＲＩによって消化され、「日本晴」型対立遺伝子におけるＧＴＧＧＡＧは、ＢｓｅＲＩによっては消化されなかった。「はやまさり」、「日本晴」及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」遺伝子型は、各々、２８、２０及び２１のイネ品種で見出された。各遺伝子型の低温発芽性の平均は、分散分析で比較した。
【００２０】
遺伝子発現の分析を行うために、全ＲＮＡを、ＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、イネの種々の器官から抽出した。全ＲＮＡ（０．５μｇ）は、製造指針に従って、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを持つＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）によって逆転写した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。各ＰＣＲ反応（１０μＬ）は、５倍に希釈された０．５μＬのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。目標遺伝子に対する各プライマーの特異性を、ＰＣＲ産物のシークエンシングによって確認した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡ（４μｇ／試料）を、４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ、１ｍＭＥＤＴＡ、及び２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む２．０％（ｗ／ｖ）アガロース−変性ホルムアルデヒドゲル上で分離した。
【００２１】
ＲＮＡを、２０×ＳＳＣで正にチャージしたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移した。ハイブリダイゼーションとシグナルの検出は、各々、ＤＩＧシステム及びＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行った。プライマー１３−５Ｕ及び１３−５ＬからのＰＣＲフラグメントを、ノーザンブロット分析のプローブとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー及び増幅条件は、後記する表５に記載した。
【００２２】
プラスミドの構築及び形質転換を行うために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の３−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（後記する表４参照）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｑＬＴＧ−３−１プロモーターＧＵＳ遺伝子融合コンストラクトを作るために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の５’上流領域の２−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−１０Ｕ及びＡｎｏ１３−１０Ｌ（後記する表４参照）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。
【００２３】
真のｑＬＴＧ−３−１遺伝子を十分に発現させるプロモーター配列は、未同定であるため、ｑＬＴＧ−３−１の開始コドンから２ｋ−ｂｐの５’上流領域を、プロモーターとして用いた。これらのＰＣＲ産物は、各々、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。
【００２４】
次いで、これらのフラグメント及びＧＵＳ遺伝子を、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）に、クローニングした。過剰発現植物を作るために、３５Ｓプロモーターの下にｑＬＴＧ−３−１遺伝子を連結したコンストラクトを作製した。プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５ＬからのＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化された。このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈａ３ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）のＳａｃＩサイトに、クローニングした。
【００２５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介在した形質転換体を、「はやまさり」（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら２００６年）の形質転換に用いた。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生された植物は、隔離した温室で生育させた。Ｔ１形質転換体を、導入遺伝子上のＰＣＲによって選択、栽培し、採種（Ｔ２世代）を行い、発芽実験に供した。
【００２６】
ＧＵＳ発現の組織化学分析を行うために、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳを持った形質転換植物の種子を、３０℃でインキュベートした。この条件下で、発芽（子葉鞘の出現）は、処理後２日でわずかのパーセントの種子で起こり始めた。形質転換植物の種子は、処理後０日、１日及び２日で試料とした。形質転換イネの全種子及び縦にカットされた種子を、０．５ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、０．５ｍＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、０．５ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］及び０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）で真空浸透し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、７０％ＥｔＯＨを加えて、室温で酵素反応を停止した。
【００２７】
栽培イネの近縁野生イネとして、ＡＡゲノム野生イネ、Ｗ０１０６（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、Ｗ０６５２（Ｏ．ｂａｒｔｈｉｉ）、Ｗ１１６９（Ｏ．ｇｌｍａｅｐａｔｕｌａ）、Ｗ１４１３（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）及びＷ１５０８（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）のイネ種子を、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所から入手した。６２品種を含む栽培イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）のコアコレクションのイネ種子を、独立行政法人農業生物資源研究所から入手した。
【００２８】
このコレクションは、ジャポニカ、アウス及びインディカに相当するグループＡ、Ｂ及びＣの３つのグループからなっていた（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）。全ＤＮＡを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告された方法により、ＣＴＡＢを用いて、若葉から分離した。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子領域を、プライマー（後記する表４参照）を用いて増幅し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ ターミネータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのサイクルシークエンスを用いて、直接シークエンシングした。
【００２９】
シークエンシングは、Ｐｒｉｓｍ３７００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＤＮＡ配列は、ＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて整列化し、次いで、視覚的に確認した。全ての多型は、クロマトグラムから再照合した。
【００３０】
本発明者らの見出した配列では、ヘテロ接合体は観察されなかった。５’及び３’ＵＴＲを含んだ９３３−ｂｐの上流領域と２９６−ｂｐの下流領域を含んでいるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子領域１７８４−ｂｐ遺伝子は、−４３３から−３８４からの５０−ｂｐ領域のＴＡの繰り返しを除いて、栽培イネと野生種からシークエンシングした。
【００３１】
遺伝子多型により得られたユニークなＤＮＡ配列又は対立遺伝子間の系統関係を示す、ハプロタイプネットワークを、統計学における節約法を用いたコンピュータープログラムＴＣＳ（Ｃｒａｎｄａｌｌら ２０００年）により、構築した。
【００３２】
環境ストレス耐性の付与は、作物の安定生産において重要な育種目標である。特に、寒冷地におけるイネの栽培においては、低温が主要なストレスであるが、これまで、低温耐性は、量的形質（ＱＴＬｓ）と呼ばれる複数の遺伝子により制御されている複雑形質であると考えられていた。これに対して、本発明では、量的形質であるイネの低温発芽性に関わる遺伝子作用力の大きな遺伝子を単離し、その機能解析を行った。
【００３３】
低温発芽性遺伝子として、低温発芽性に極めて優れるイネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の有するｑＬＴＧ−３−１を単離した。本発明では、ポジショナルクローニング法により、このｑＬＴＧ−３−１を分子的に同定した。この遺伝子は、５５５ｂｐよりなり、機能未知の新規の遺伝子であった。機能消失型遺伝子を有するイネ品種「はやまさり」に、アグロバクテリウム法によって機能型の遺伝子の遺伝子導入を行ったところ、「はやまさり」よりも高い低温発芽性を示したことから、この５５５−ｂｐの配列が、目的とする低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１であることが明らかとなった。
【００３４】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の有する機能型ｑＬＴＧ−３−１を含む染色体領域を、ＤＮＡマーカー選抜・戻し交雑により、機能消失型遺伝子を有するイネ品種「はやまさり」に導入した準同質遺伝子系統は、低温だけではなく、塩（ＮａＣｌ）及び浸透圧（マンニトール）のストレス下においても、高い発芽性を示した。このことから、ｑＬＴＧ−３−１は、複数のストレスに対する耐性に関わる遺伝子であることが示唆された。
【００３５】
遺伝子の発現解析の結果、ｑＬＴＧ−３−１は、特に種子発芽時の胚において、高い発現が認められた。また、出穂前の穂においても、高い発現が認められた。そこで、開始コドンから５’側上流域の２−ｋｂにＧＵＳ遺伝子を連結し、このコンストラクトを、「はやまさり」へ、アグロバクテリウム法により、遺伝子導入した。その結果、発芽時の種子胚において、ＧＵＳ活性が認められた。これらのことから、ｑＬＴＧ−３−１は、発芽時の種子胚に特異的に発現し、その特異性は、少なくとも５’側上流域の２−ｋｂで制御されていることが明らかとなった。
【００３６】
低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子配列を比較したところ、高い低温発芽性を示す「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、機能型の遺伝子配列を持ち、「はやまさり」は、７１−ｂｐの欠失により機能を消失していた。一方、「日本晴」は、アミノ酸変異を生じる１個の塩基置換を有していた。そこで、イネ品種約７０系統について、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性に関するアソシエーション解析を行った。
【００３７】
その結果、低温発芽性は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型＞「日本晴」型＞「はやまさり」型、の順に明瞭な関係が認められた。このことから、遺伝子変異を判別することで、低温発芽性を推測できることが明らかとなった。また、「日本晴」に認められた変異アミノ酸は、遺伝子の機能に関係していると考えられた。この変異アミノ酸を含む領域は、植物におけるｑＬＴＧ−３−１の相同性遺伝子においても、高度に保存されていた。
【００３８】
本発明では、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域を絞り込むマーカーを作出のために、候補領域の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」８６−ｋｂと「はやまさり」９０−ｋｂを、「日本晴」配列をもとに、ＰＣＲ増幅し、シーケンス解析を行った。その結果、１４箇所の変異を同定し、６個をマーカー化して、大規模集団からの組換え個体の選抜に用いた。約３２００個体を供試したところ、ｑＬＴＧ−３−１の候補領域をマーカーＤとＦの間の４．８−ｋｂに絞り込むことができた。ＲＡＰ−ＤＢにより、この領域には、１個の機能未知遺伝子の存在が予測された。
【００３９】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子と比較して、「はやまさり」では、７１−ｂｐの欠失が生じ、機能消失となっていることが明らかとなった。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子を「はやまさり」へ遺伝子導入したところ、形質転換体Ｔ２では、明らかに「はやまさり」よりも高い低温発芽性を示した。このことから、本遺伝子が、低温発芽性遺伝子ｑＬＴＧ−３−１の原因遺伝子であることが確認できた。
【００４０】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の発現には、高い組織特異性が認められた。特に、種子発芽時の胚において、強い発現があり、胚乳では、発現は認められなかった。該遺伝子は、３０℃及び１５℃条件のいずれの発芽時においても発現が認められることから、低温ストレスによって誘導される遺伝子ではない。また、登熟過程の胚部分でも発現は認められないこと及び発芽処理後の経過時間によって発現が上昇することから、ｑＬＴＧ−３−１は、発芽時に特異的な遺伝子発現を示すことが明らかとなった。
【００４１】
発芽過程におけるｑＬＴＧ−３−１合成系遺伝子（ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ２０ｏｘ２、ＯｓＧＡ３ｏｘ２）及びアミラーゼ遺伝子（Ｒａｍｙ １Ａ）の遺伝子発現を、ｑＬＴＧ−３−１機能型遺伝子を持つ「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いて解析した。ｑＬＴＧ−３−１は、３０℃では処理後６時間後に、１５℃では１２時間後に、遺伝子発現が認められた。３０℃では、同じく６時間後に、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ３ｏｘ２、Ｒａｍｙ １Ａの遺伝子発現が認められた。一方、１５℃では、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１は、ｑＬＴＧ−３−１と同じく、１２時間後に遺伝子発現が認められたが、ＯｓＧＡ３ｏｘ２、Ｒａｍｙ １Ａは、２４時間後となった。このことから、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子発現とほぼ同時に、これらの遺伝子発現が、開始することが明らかとなった。
【００４２】
このような遺伝子発現のパターンは、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１機能型遺伝子に関する「はやまさり」の準同質遺伝子系統ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１においても認められた。また、ｑＬＴＧ−３−１機能消失型遺伝子を持つ「はやまさり」では、これらのいずれの遺伝子の発現も遅くなっていた。このことから、ｑＬＴＧ−３−１によって、これらの遺伝子の発現が、早期に誘導され、そのことにより、高い低温発芽性が形質発現されると考えられた。
【００４３】
また、ｑＬＴＧ−３−１の低温以外の環境ストレスへの反応性について、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１を用いて解析した。その結果、ＮａＣｌ及びマンニトール下においても、発芽性の向上が認められた。また、ＡＢＡ下では、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」及び「はやまさり」は、発芽が遅延されたのに対し、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１では、発芽の阻害が認められた。
【００４４】
更に、本発明では、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子変異を明らかにした。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の機能型遺伝子ｑＬＴＧ−３−１に対し、「はやまさり」は、７１−ｂｐの欠失による機能消失型遺伝子であった。機能型遺伝子に対し、「日本晴」では、アミノ酸変異を伴う１個の塩基置換が生じていた。ｑＬＴＧ−３−１の塩基配列によるデータベース解析の結果、相同性遺伝子は、イネ科、ナス科、マメ科、ウリ科に存在していた。これらのアミノ酸配列を比較したところ、Ｎ末側に保存性の高い配列（８アミノ酸）が認められた。「日本晴」で生じているアミノ酸変異は、この保存された配列中にあった。
【００４５】
そこで、「日本晴」型のｑＬＴＧ−３−１遺伝子の機能を明らかにするために、北海道の在来種から現在の品種までの６９系統を用いて、アソシエーション解析を行った。その結果、これらｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性に、明瞭な差異が認められた。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型（２１系統）では、８０．８％、「日本晴」型（２０系統）では、６９．７％、「はやまさり」型（２８系統）では、３０．７％と、有意な差異が得られた。このことから、「日本晴」型で生じたアミノ酸変異は、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子機能をやや低下させることが明らかとなった。また、保存されているアミノ酸配列も、遺伝子機能に重要な役割を有していると考えられた。
【００４６】
栽培イネにおけるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型変異を探索するため、世界コアコレクション６２系統について、１７８４−ｂｐの遺伝子配列を比較した。その結果、構造遺伝子領域では、３箇所のｉｎ−ｆｒａｍｅな挿入・欠失は認められたが、アミノ酸置換は存在しなかった。これらの挿入・欠失は、反復配列領域における反復数の差異を生じるものであった。このことから、ｑＬＴＧ−３−１は、機能的に重要であり、そのために、保存性の高い遺伝子であると考えられた。また、これらの塩基置換により、コアコレクションは、１０ハプロタイプによる２ハプログループを構成した。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子及びその塩基配列を提供することができる。
（２）上記遺伝子によりコードされる低温発芽性向上作用を有するアミノ酸配列を提供することができる。
（３）上記低温発芽性遺伝子単独の機能（低温、塩、浸透圧のストレス下での発芽性向上特性）の解明により、該遺伝子の利用技術（低温発芽性の向上方法等）を提供することを実現した。
（４）組織特異的な遺伝子発現機構を解明したことで、例えば、植物の低温発芽性を効率よく、簡便に調査することが可能である。
（５）上記遺伝子を導入した形質転換イネを作出することで、低温発芽性を向上させたイネを開発し、提供することができる。
（６）イネ系統の遺伝子型を同定することにより、イネの低温発芽性のレベルを識別することができる。
（７）栽培品種の遺伝子型と低温発芽性との関係を、遺伝子型を同定することで確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝的評価を行った。植物材料として、ジャポニカイネ品種である日本由来のイネの「はやまさり」とイタリア由来のイネの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を用いた。「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」を交配して得られた組換え自殖系統（ＢＩＬｓ）から、低温発芽性の表現型とｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型に基づいて、ＢＩＬ１１６を選抜した。図１に、ＢＩＬ１１６（Ａ）及びＮＩＬ（Ｂ）の遺伝子型をグラフで示す。
【００５０】
ＢＩＬ１１６は、ＮＩＬ作製のために、ＤＮＡマーカー選抜で「はやまさり」と戻し交配して、ＢＣ３Ｆ１個体集団を作出した。ＢＣ３Ｆ１の６６の植物の中で、ドナーの「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来のｑＬＴＧ−３−１を含んでいる最小の区分を有している＃５９を選抜し、戻し交配した。また、＃５９の全ゲノム領域の遺伝子型を調査した。これに基づいて、ＢＣ３Ｆ１個体集団の＃５９の１１個体の中の、１つの個体である、＃５９−１１を選抜した。
【００５１】
ＢＣ３Ｆ１個体の、＃５９−１１の自殖より得られたＢＣ３Ｆ2後代のうち、ｑＬＴＧ−３−１領域の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子のホモ接合体を持つ個体を選抜した（図１のＢ）。ＮＩＬ断片は、マーカーＳＴＳ７３−２８（Ｉ）とＳＳＲ１０７２２４−２１．１の間で、ｑＬＴＧ−３−１の一方の側で遺伝子組換を有していた（表１、図２）。ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、「はやまさり」に、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」から移入されたｑＬＴＧ−３−１近傍の３６０−ｋｂの染色体領域を有している。
【００５２】
【表１】
【００５３】
これまでに、本発明者らは、低温発芽性のジャポニカ品種の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」と、普通の「はやまさり」の交配から得た組換え自殖系統（ＢＩＬｓ）の戻し交配により、低温発芽性を制御する三つのＱＴＬｓをマッピングしている（Ｆｕｊｉｏｎｏら ２００４年）。これらのうち、最も効果的と考えられるＱＴＬの、ｑＬＴＧ−３−１を、第３染色体上にマッピングした。ｑＬＴＧ−３−１の遺伝的根拠を決定するために、戻し交配の後代を用いて、低温発芽性の分離分析を行った。図３に、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の表現型を示す。
【００５４】
戻し交配集団における低温発芽性の頻度分布は、明瞭な単一因子の分離パターンであり（図３のＡ）、ｑＬＴＧ−３−１が、優性遺伝子であることを示した。ｑＬＴＧ−３−１の正確な遺伝的効果を解明するために、準同質遺伝子系統（ＮＩＬｓ）のＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１を、ＤＮＡマーカー選抜を用いて、「はやまさり」との戻し交配で作製した。ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、明らかに反復親の「はやまさり」と比べて、高い低温発芽性を示した（図３のＢ及びＣ）。
【実施例２】
【００５５】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の単離を行った。ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピング及び大規模マッピングのために、分子マーカーと表１に示した両親の間の多型を用いた。ＢＩＬ１１６を、「はやまさり」と交配し、高精度マッピング及び大規模マッピングのために、戻し交配後代を作出した。２５６個体からなるＦ２集団を高精度マッピングのために用いた。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子座における各遺伝子組換えＦ２植物の遺伝子型を、それらのＦ３後代との低温下での発芽テストによって、決定した。３つの遺伝子型の、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」ホモ接合体、「はやまさり」ホモ接合体及びヘテロ接合体が、明瞭に区分された。
【００５６】
これらの遺伝子組換えＦ２植物を、ｑＬＴＧ−３−１の高精度マッピングに用いた。加えて、〜３２００植物からなるＢＣ１Ｆ２集団を、大規模マッピングのために用いた。ゲノムＤＮＡを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載の方法に従って、抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ分析に使用し、ＰＣＲに基づく分子マーカーで表現型を共分離した。
【００５７】
これまでに開発した２つのＳＳＲマーカー（Ｆｕｊｉｎｏら ２００４年）に加えて、８つのＳＳＲマーカー（表１）を、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載された方法に従って、「日本晴」のゲノムを用いて、高精度マッピングのために作製した。
【００５８】
大規模マッピングのために、６つの分子マーカーを、「はやまさり」と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の１４のゲノム配列の違いに基づいて、作製した（表１、２）。９６−ｋｂ領域における両親の間の多型を見つけるシークエンシングのために、両親から得たＰＣＲ産物の両鎖を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ ｃｙｃｌｅシークエンスｋｉｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、直接シークエンシングした。
【００５９】
６９のジャポニカ品種を、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型によって分類した。「はやまさり」の対立形質を見つけるために、プライマーＳ１０３ａＵ及びＳ１０３ａＬを用いて、「はやまさり」で見出された欠失を増幅するためのＰＣＲを行った。「日本晴」の対立形質を見つけるために、上記のＰＣＲ産物を、ＢｓｅＲＩで消化した。
【００６０】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の対立形質におけるＧＡＧＧＡＧは、消化され、「日本晴」におけるＧＴＧＧＡＧの対立形質は、ＢｓｅＲＩでは消化されなかった。「はやまさり」、「日本晴」及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の遺伝子型が、２８、２０及び２１の米品種から各々見出された。各遺伝子型の低温発芽性の平均は、分析分散によって比べた。
【００６１】
戻し交配の後代を用いて、遺伝子の高精度マッピングを行った。ｑＬＴＧ−３−１は、マーカーＳＳＲ１２５４１１−４．１（Ａ）とＳＴＳ７３−２８（Ｉ）の間の９６−ｋｂ領域に位置していた。図４に、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子のポジショナルクローニングを示す。ｑＬＴＧ−３−１をクローニングするために、〜３，２００個体で詳細な染色体地図を作成した。両親は、遺伝的に近い関係にあるので、目標の領域には、適用できるＳＳＲマーカーはなかった。そこで、「はやまさり」の目標領域（〜９０ｋｂ）と「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の目標領域（〜８６ｋｂ）をシークエンシングした。ＳＳＲ、ＳＮＰ及び挿入／欠失を含む１４の多型が検出された（表２）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
それらのうちの６つを大規模マッピングに用いた。その結果、ｑＬＴＧ−３−１は、Ｓ１０３ａ（Ｅ）と共分離し、マーカーＳＳＲ１１８６７３−１３．１（Ｄ）及びＳ１０７（Ｆ）の間の４．８−ｋｂ領域に定めた。この領域では、唯一つの遺伝子、Ｏｓ０３ｇ０１０３３００が、ＲＡＰ−ＤＢで予測されている（ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００６４】
図５に、ｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列を示す。図６及び７に、ｑＬＴＧ−３−１のヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列を示す。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の配列は、５５５−ｂｐ長の一つのエクソンを有している。ｑＬＴＧ−３−１は、「日本晴」のイネゲノムでは、単一遺伝子である。ｑＬＴＧ−３−１遺伝子は、１８４アミノ酸の新規蛋白質をコード化している（図５、６、７）。バイオインフォマティク分析により、ｑＬＴＧ−３−１蛋白質は、２つの保存されたドメイン（ＧＲＰ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １ ｔｏ １００ ａｎｄ Ｔｒｙｐ＿ａｌｐｈａ＿ａｍｙｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ／ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ／ ＬＴＰ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １００ ｔｏ １８２ ｂｙ Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｔｉｆ．ｇｅｎｏｍｏ．ｊｐ））を有することが示された。
【００６５】
「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の配列と比べて、コード領域の７１−ｂｐの欠失が、「はやまさり」で検出された。それは、ストップコドンをもたらすフレームシフトを起こした。この事実は、「はやまさり」のｑＬＴＧ−３−１の対立形質は遺伝子の機能を失うことを示している。「日本晴」では、コード領域の＋５０位置におけるＴのＡへの変異は、ＬｅｕをＨｉｓに変えることが予測される。
【００６６】
データベース調査により、植物でのみｑＬＴＧ−３−１に著しい相同を有する２１の遺伝子が見出された。ｑＬＴＧ−３−１を含むこれらの蛋白質の系統発生分析により、これらの蛋白質は、２つの主要なクラスに分けられることが分かった。図８に、ｑＬＴＧ−３−１及び関連の蛋白質の系統樹を示す。クラスＩは、ｑＬＴＧ−３−１を含み、単子葉植物、双子葉植物の２つのサブクラスからなっていた。クラスＩＩは、単子葉植物の３つの蛋白質のみを含んでいた。ＧＲＲ及びＬＴＰドメインに加えて、Ｎ末端領域に、アミノ酸、ＡｘｘＬＡＬＮＬＬＦＦｘｘｘｘＡＣが高度に保存されていた。図９に、ｑＬＴＧ−３−１及び関連蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す。
【００６７】
「日本晴」の配列において、変換されたアミノ酸の９番位置のＬｅｕ残基は、Ｈｉｓに変異された。変換されたアミノ酸の機能を決定するために、ｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性の表現型の間のアソシエーション解析を行った。６９のイネ品種をｑＬＴＧ−３−１の３つの遺伝子型に分類した（表３、図１０）。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」型対立遺伝子を持った品種（８０．０％）は、「はやまさり」型対立遺伝子を持った品種（３０．７％）より高い低温発芽性を示した。「日本晴」型対立遺伝子を持った品種（６９．７％）は、わずかに低下した低温発芽性を示した（ｐ＝０．０４３４）。「日本晴」型対立遺伝子で置換されたアミノ酸は、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子機能において、重要な役割をはたし、置換されたアミノ酸は、遺伝子の機能を減らすことを示唆した。
【００６８】
【表３】
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、相補性検定を行った。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の３−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｕ及びＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（表４）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに、クローニングした。次いで、このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）に、クローニングした。図１１に、ｑＬＴＧ−３−１の相補性検定のための導入遺伝子コンストラクトを示す。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」の形質転換に用いた（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
ハイグロマイシン抵抗性カルス（Ｔ０植物）から再生された植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物の自殖からＴ１植物を得た。Ｔ１形質転換体を、導入遺伝子のＲＣＲによって選抜し、Ｔ２種子を発芽実験を行うために集めた。
【００７２】
相補性検定のために、ｑＬＴＧ−３−１プロモーター領域及び遺伝子領域を含む「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の３−ｋｂのフラグメントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体によって、「はやまさり」に導入した。ベクターを持った形質転換系統は、「はやまさり」と同様の低温発芽性を示した。形質転換遺伝子のホモ接合体を有する全ての５つの形質転換体は、「はやまさり」より高い低温発芽性を有している（図１２）。これらの各系統の中で、至適発芽温度２５℃では、発芽性に違いは見られなかった。この結果より、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の３−ｋｂのフラグメントにおける遺伝子は、低温発芽を向上させることが確認された。
【実施例４】
【００７３】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の発現を調べた。ＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、全ＲＮＡを、イネの各器官から抽出して、ＤＮａｓｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡ（４μｇ／試料）を、４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ酢酸Ｎａ及び２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む２．０％（ｗ／ｖ）アガロース−変性ホルムアルデヒドゲル上で分離した。
【００７４】
ＲＮＡは、２０ＸＳＳＣで正にチャージしたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にブロッティングした。ハイブリダイゼーションとシグナルの検出は、製造指針に従って、ＤＩＧシステムとＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって、行った。プライマー１３−５Ｕ及び１３−５Ｌから得たＰＣＲフラグメントを、ノーザンブロット分析のプローブとして、用いた（表５）。
【００７５】
【表５】
【００７６】
ノーザンブロット分析により、ｑＬＴＧ−３−１は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」及びＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で各々３０℃及び１５℃で発芽処理後、１２時間及び１日目に発現し、発現は、発芽開始により増加した（図１３のＡ及びＢ）。３０℃及び１５℃における発現レベルを増加させるパターンは、同じであった。この事実により、ｑＬＴＧ−３−１は、低温のストレスによって誘導されないことを示した。「はやまさり」の発現レベルは、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬｑＬＴＧ−３−１のそれよりも低かった。また、発現の誘導は、「はやまさり」では遅れた。３つの品種における発現のパターンは、低温発芽性の表現型によく相当した。ｑＬＴＧ−３−１は、組織特異的に発現した（図１３のＣ）。発現は、胚乳と葉で検出されなかった。低いレベルの発現は、根で検出された。強い発現は、発芽時の種子胚、幼苗の地上部及び幼穂で検出された。
【実施例５】
【００７７】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の生理学的な評価を行った。発芽テストを、Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）によって報告されている方法によって、行った。低温ストレスのために、ペトリ皿の種子を、インキュベータに設置した。その際に、異なる濃度の植物ホルモン（ＡＢＡ及びＧＡ）及びマンにトールの溶液をペトリ皿に加え、インキュベータに設置した。
【００７８】
内在性のＡＢＡ及びＧＡは、種子の休眠と発芽を促進する主要な役割をはたす（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｇｉｒａｎｄａｔ １９９８年）。ｑＬＴＧ−３−１は、発芽期間におけるＡＢＡ及びＧＡに対する応答に影響するかどうか、を検討した。図１４に、異なったストレス条件下でのｑＬＴＧ−３−１の発芽反応を示す。また、図１５に、異なったストレス条件下での「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の発芽反応を示す。
【００７９】
至適温度（２５℃）下では、「はやまさり」、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で、発芽性に非常にわずかの違いが観察された（図１４のＡ）。ＡＢＡ処理においては、両親で発芽の遅れが観察されたが、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、より低い発芽性を示した。３００ｍＭ ＡＢＡより低濃度では、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、両親と同様に発芽の遅れを示した（図１５）。５００ｍＭ ＡＢＡで、両親よりもＡＢＡに対してより感受性であった（図１４）。
【００８０】
２５０ｍＭマンニトール及び１５０ｍＭ ＮａＣｌより低濃度では、全ての品種は、発芽の遅れを示した（図１５））。しかし、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、３００ｍＭ ＮａＣｌ下、５００ｍＭマンニトール及び１３℃下で、「はやまさり」に比べて、発芽性の向上を示した（図１４）。これらの結果より、ｑＬＴＧ−３−１は、低温、塩、浸透圧を含む多様のストレスに対する応答に関連していることが示された。また、外因性のＧＡは、どの遺伝子型でも種子の発芽を促進しない（図１６）。
【実施例６】
【００８１】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の発現と種子の発芽の関係を調べた。全ＲＮＡ（０．５μｇ）を、製造指針に従って、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０ プライマーを持つＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）によって逆転写した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、行った。各ＰＣＲ反応（１０μＬ）は、５倍に希釈された０．５μＬのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。目標遺伝子に対する各プライマーの特異性は、ＰＣＲ産物をシークエンシングすることにより確認した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー及び増幅条件は、表５に示した。
【００８２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析による「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」、「はやまさり」及びＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１の種子発芽時の胚におけるｑＬＴＧ−３−１の発現を決定した。図１７に示されるように、ｑＬＴＧ−３−１の発現は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１で各々３０℃及び１５℃の処理の後、６及び１２時間で検出され、発芽開始が促進された。開花後の種子の登熟の間、ｑＬＴＧ−３−１の発現は、胚では非常に低いレベルであった（図１８）。
【００８３】
ｑＬＴＧ−３−１の発現パターンを、ＡＢＡ（５００ｍＭ）、ＮａＣｌ（２５０ｍＭ）及びマンニトール（５００ｍＭ）によって処理された胚において、調べた。全てのストレス条件下で、ｑＬＴＧ−３−１発現の遅れと抑制が観察された（図１９）。これらの現象は、これらのストレス条件下で、発芽の阻害及び遅れの表現型に良く関連した。
【実施例７】
【００８４】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１発現の組織化学的分析を行った。ｑＬＴＧ−３−１プロモーターＧＵＳ遺伝子融合構造物を作製するために、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からのｑＬＴＧ−３−１の５’上流領域の２−ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｎｏ１３−１０Ｕ及びＡｎｏ１３−１０Ｌ（表４）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００８５】
真のｑＬＴＧ−３−１遺伝子を十分に発現するプロモーター配列が不明であるので、ｑＬＴＧ−３−１の開始コドンから５’上流領域の２−ｋｂを、プロモーターとして用いた。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトへ、クローニングした。次いで、このフラグメント及びＧＵＳ遺伝子を、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄ ベクター（Ｆｕｓｅら、２００１年）に、クローニングした。図２０に、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳのコンストラクトを示す。
【００８６】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」の形質転換のために用いた（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生した植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物（Ｔ１）の自殖種子をこの実験に用いた。Ｔ０形質転換体を、導入遺伝子についてのＰＣＲによって選抜した。
【００８７】
ＧＵＳ発現の組織化学分析のために、ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳを持った形質転換植物の種子を、３０℃で培養した。この条件下で、発芽、子葉鞘の発現が処理の１日後で種子のわずかの割合で起き始めた。形質転換植物の種子を、処理後０．１及び２日の時間で供試した。
【００８８】
形質転換体の全種子及び縦方向にカットした種子を０．５ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、０．５ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、０．５ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］及び０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）で真空浸透させ、３７℃で６時間培養した。次いで、７０％ＥｔＯＨを加えて、酵素反応を温度で停止した。
【００８９】
ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳ（ベーターグルクロニダーゼ）リポーター遺伝子融合を持った形質転換イネ植物におけるｑＬＴＧ−３−１プロモーター活性を分析した。ＧＵＳの発現は、芽根を囲う芽鱗、及び前鱗で強く検出された（図２１）。形質転換体でない「はやまさり」植物では、シグナルは検出されなかった。ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びＧＵＳリポーター発現と合わせて、ｑＬＴＧ−３−１遺伝子は、種子発芽時の胚において、強く発現された。
【実施例８】
【００９０】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１によるＧＡ生合成遺伝子及びＲａｍｙ１Ａ発現の誘導を調べた。種子発芽時の胚で強く発現されるｑＬＴＧ−３−１が、多様のストレス条件下で高い発芽性を発揮するかどうかは明らかでない。ｑＬＴＧ−３−１の機能を評価するために、種子の発芽性に重要であることが知られている、６つのＧＡ生合成遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、Ｒａｍｙ１Ａの発現プロファイルを、種子の発芽期間の胚における半定量的なＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＯｓＧＡ２０ｏｘ３、ＯｓＧＡ２０ｏｘ４及びＯｓＧＡ３ｏｘ１の発現は、この実験では検出されなかった。
【００９１】
ｑＬＴＧ−３−１は、明瞭に、ｑＬＴＧ−３−１の発現パターンと同様の、ＯｓＧＡ２０ｏｘ１、ＯｓＧＡ２０ｏｘ２、ＯｓＧＡ３ｏｘ２及びＲａｍｙ１Ａの発現を誘導した（図１７）。ＯｓＧＡ２０ｏｘ１とＯｓＧＡ３ｏｘ２の発現は、各々、３０℃及び１５℃で処理した後、６及び１２時間で検出された。この時間は、ｑＬＴＧ−３−１のそれと同じであった。ＯｓＧＡ２０ｏｘ２の発現は、他の遺伝子のそれより遅れた（図１７）。次いで、Ｒａｍｙ１Ａの発現が観察された。
【００９２】
全てのテストされた遺伝子における発現の遅れは、「はやまさり」で観察された。「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」とＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１は、同じ発現パターンを示したが、これは、ｑＬＴＧ−３−１によって、ＧＡ生合成及びＲａｍｙ１Ａにおけるそれらの遺伝子の発現を誘導することを示唆している。加えて、ＧＡ生合成及びアミラーゼに関する８つの遺伝子の発現が決定された（表５、図２２）。それらのうちの６つの発現は、ｑＬＴＧ−３−１で高く制御され、このことは、ｑＬＴＧ−３−１が、ＧＡ生合成を誘導していることを示唆している。
【実施例９】
【００９３】
本実施例では、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現を行った。過剰発現植物を作るために、ｑＬＴＧ−３−１を作動する３５Ｓプロモーターのコンストラクトを作製した。プライマーＡｎｏ１３−ＬＡ５ＵとＡｎｏ１３−ＬＡ５Ｌ（表４）を用いて増幅させたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化した。このフラグメントを、ｐＰＺＰ２Ｈａ３ Ｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄベクター（Ｆｕｓｅら ２００１年）のＳａｃＩサイトに、クローニングした。図２３に、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現のためのコンストラクトを示す。
【００９４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換体を、「はやまさり」（Ｔｏｋｉ １９９７年；Ｔｏｋｉら ２００６年）の形質転換に用いた。ハイグロマイシン耐性カルス（Ｔ０植物）から再生した植物を、隔離した温室で生育させた。各Ｔ０植物（Ｔ１）の自殖植物を生育させた。Ｔ１形質転換体を導入遺伝子について、ＰＣＲにより選抜し、養成してＴ２を得て、発芽実験を行うために集めた。
【００９５】
ｑＬＴＧ−３−１は、組織特異的な発現を有している。発現パターン、組織特異性及び量が、植物における発芽性又はストレス応答の調節の効果を検討するために、３５ＳプロモーターでｑＬＴＧ−３−１をドライブする過剰発現植物を作出した。形質転換植物において、ｑＬＴＧ−３−１は、強く葉及び穂で発現され、発現は、非形質転換植物では検出されなかった（図２４）。この過剰発現植物は、高い低温発芽性を発揮した（図２５）。３つの独立したＴ１個体集団における導入遺伝子の有無で、低温発芽性の分離分析を行った。導入遺伝子を持った植物は、それを持たない植物と比べて、高い低温発芽性を示した。これらの結果は、ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現は、低温発芽性を高めることを示した。
【実施例１０】
【００９６】
本実施例では、栽培イネと野生種の中のｑＬＴＧ−３−１遺伝子におけるＤＮＡ多型を調べた。６２品種を含む栽培イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）のコアコレクションの種子（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年）を独立行政法人農業生物資源研究所から得た。このコアコレクションは、３つのグループからなっていた。グループＡ、Ｂ及びＣは、広い地域からのジャポニカ、アウス及びインディカに各々相当した（Ｋｏｊｉｍａら ２００５年；Ｇａｒｒｉｓら ２００５年）。
【００９７】
ＡＡゲノム野生種、Ｗ０１０６（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、Ｗ０６５２（Ｏ．ｂａｒｔｈｉｉ）、Ｗ１１６９（Ｏ．ｇｌｕｍａｅｐａｔｕｌａ）、Ｗ１４１３（Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）及びＷ１５０８（Ｏ．ｌｏｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ）のイネ種子を大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所から得た。Ｆｕｊｉｎｏら（２００４年）に記載されたＣＴＡＢ法を用いて、全ＤＮＡを若葉から分離した。
【００９８】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子をプライマー（表４）を用いて、増幅させ、ＢｉｇＤｙｅターミネータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるサイクルシークエンシングを用いて、直接シークエンシングした。シークエンシングは、Ｐｒｉｓｍ３７００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｉｔｅｍｓ）で行った。ＤＮＡ配列は、Ｂｉｏ Ｅｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて、一列に並べ、次いで、視覚で確認した。全ての多型を低頻度の多型に特に注意して、クロマトグラムから再照合した。
【００９９】
本発明者らの配列では、ヘテロ接合性は観察されなかった。完全な５‘及び３’ＵＴＲを含んでいる９３３−ｂｐの上流領域及び２９６−ｂｐの下流領域を含むｑＬＴＧ−３−１の１７８４−ｂｐ遺伝子を、ＴＡの繰り返しの−４３３から−３８４の５０ｂｐの領域を除いて、栽培イネ及び野生種でシークエンシングした。ユニークＤＮＡ配列又は変異ステップで分離された対立形質を表す、最少の範囲（ハプロタイプ）を、統計の節約法を用いたコンピュータープログラムＴＣＳ（Ｃｒａｎｄａｌｌら ２０００年）を使用して、構築した。
【０１００】
ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の全１７８４ヌクレオチドの配列を決定した。機能的対立遺伝子としての「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の配列と比べて、挿入、欠失及び置換を含む３２の変異が検出された（表６）、これらの変異に基づいて、１０の違ったハプロタイプが、イネのコアコレクションにおける６２品種の中で、見つかった（表７、ＤＮＡ配列：図２６−３４、アミノ酸配列：図３５−３７）。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
遺伝子コード領域において、２つの欠失、一つの挿入及び一つの同義でない置換が起こった。暗号領域の全ての欠失及び挿入は、３ｎｂｐのｉｎ−ｆｒａｍｅ変異として起こった。一つの同義でない置換は、「日本晴」のみで検出された。ハプロタイプ９及び１０は、ハプログループＩ及びＩＩの間における遺伝子内組み換えから得られた、と見られる。
【０１０４】
ハプロタイプネットワークを全ｑＬＴＧ−３−１における遺伝子変異から構築した。２つのハプロタイプは、遺伝子内の組み換えから生じたので、ネットワークに含めなかった。ネットワークは、２つのハプログループＩ及びＩＩからなっていた（図３８）。このネットワークは、遺伝子配列系統樹の結果から強く支持された。
【０１０５】
これらのハプログループは、１８の変異のステップで相互に分離された。５つのハプロタイプを含むハプログループＩは、３１の品種からなり、そのほとんどは、イネのコアコレクションのグループＡ及びＢからであった。３つのハプロタイプを含むハプログループＩＩは、２５の品種からなり、そのほとんどは、グループＢ及びＣからであった。
【０１０６】
ＡＡゲノムにおける近縁イネのｑＬＴＧ−３−１の配列を、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」のｑＬＴＧ−３−１の機能型対立遺伝子（ハプロタイプＩ）と比べた。挿入、欠失及び置換を含む、多くのヌクレオチドの変化が検出され、それらは、栽培イネでは、検出されなかった。これらのほとんどのヌクレオチドの変化は、Ｏ．ｌｏｎｇｉｓｔａｍｉｎａｔａ（Ｗ１４１３及びＷ１５０８）で起こっており、他の系統と明らかに異なっていた。
【０１０７】
遺伝子コード領域において、１３の同義置換、６つの欠失及び１１の挿入が検出された。全ての欠失、挿入は、ＧＲＰの領域でｉｎ−ｆｒａｍｅとして起こった（図２６−３４）。トランスポゾンと遺伝子コード領域を除く全ｑＬＴＧ−３−１において、２６の挿入及び欠失が検出された。それらのうちの１０は、３ｎで、残りは３ｎではなかった。栽培イネにおけるｑＬＴＧ−３−１の保存に加えて、これらの野生イネの結果により、ｑＬＴＧ−３−１蛋白質配列は、イネにおける機能の重要性により、完全に保存されていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
以上詳述したように、本発明は、イネの低温発芽性に関する遺伝子とその利用方法に係るものであり、本発明により、イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性遺伝子及びその塩基配列を提供することができる。本発明は、上記低温発芽性遺伝子単独の機能、例えば、低温、塩、浸透圧のストレス下での発芽性向上特性を利用した該遺伝子の利用技術を提供すること、上記遺伝子を導入して低温発芽性を向上させた形質転換植物を提供すること、また、本発明の低温発芽性遺伝子の配列に基づいて遺伝子変異を同定することにより、栽培品種の低温発芽性のレベルを識別すること、を可能とするものである。従来、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」に認められる高度の低温発芽性は、ＱＴＬ解析から複数の遺伝子が関与している量的形質と考えられていたが、本発明は、物質として単離した単独の低温発芽性遺伝子及びその塩基配列及びその利用技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＢＩＬ１１６（Ａ）及びＮＩＬ（Ｂ）の遺伝子型をグラフで示す。黒、白及び斜線は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」、「はやまさり」及びヘテロ接合体由来の染色体断片を表わす。マッピングしたマーカーは、高密度ＲＦＬＰ連鎖マーカー（Ｈａｒｕｓｈｉｍａら １９９８年）で割り当てられた染色体位置に対応させた。
【図２】ｑＬＴＧ−３−１近傍のＮＩＬの遺伝子型を示す。白と斜線は、各々、「はやまさり」とヘテロ接合体由来の染色体断片を表わす。
【図３】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子の表現型を示す。 （Ａ）は、戻し交配された後代における低温発芽性の頻度分布を表わす。 矢頭は、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（ＩＬ）及び「はやまさり」（ＨＹ）を示す。マーカーＧＢＲ３００１で評価された、これらの分類された遺伝子型の「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」対立遺伝子のホモ接合体（黒）、ヘテロ接合体（斜線）及び「はやまさり」対立遺伝子のホモ接合体（白）が示された。 （Ｂ）は、１５℃の低温下での「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒マル）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白三角）の発芽反応を表わす。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。 （Ｃ）は、２５℃で３日及び１５℃で７日間発芽した「はやまさり」（上）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（中）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（下）の発芽の表現型を表わす。バーは１ｃｍである。
【図４】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子のポジショナルクローニングを示す。第３染色体（中）のｑＬＴＧ−３−１の９６−ｋｂ領域の範囲を定めた高精度マッピングを示す。大規模マッピング（下）は、ｑＬＴＧ−３−１はマーカーＤ及びＦの間の４．８−ｋｂ領域に位置しており、マーカーＥと共分離していることを示した。マーカー間の数値は、マーカーの間の組換え個体数を示す。
【図５】ｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列を示す。 「はやまさり」と「日本晴」型対立遺伝子で示された変異は、配列により示される。Ｐｆａｍにより、規定された２つのドメイン（ＧＲＰ及びＬＴＰ）は、アンダーラインを付した。ＬＴＰドメインにおける保存された８つのＣ残基はドットで示した。
【図６】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１のヌクレオチド配列「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」「はやまさり」「日本晴」を示す。
【図７】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１のアミノ酸配列「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」「はやまさり」「日本晴」を示す。
【図８】ｑＬＴＧ−３−１及び関連の蛋白質の系統樹を示す。 この系統樹は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを用いて構築した。ブートストラップ分析値を、中心点の枝で示す。示したスケールは、サイト当たり０．０５のアミノ酸置換を示す。登録番号及び植物品種を示す。
【図９】ｑＬＴＧ−３−１及び関連蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す。共通アミノ酸残基はドットで示す。
【図１０】イネ品種のｑＬＴＧ−３−１の遺伝子型と低温発芽性の間の関係を示す。 イネ品種は、３つのｑＬＴＧ−３−１、「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」タイプ（黒マル）、「日本晴」タイプ（白三角）及び「はやまさり」タイプ（白マル）に分類した。
【図１１】ｑＬＴＧ−３−１の相補性検定のための導入遺伝子コンストラクトを示す。
【図１２】「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」からの機能性ｑＬＴＧ−３−１の「はやまさり」への導入において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換によって得られたホモ接合形質転換体の発芽を示す。１５℃の低温下における「はやまさり」（白三角）及び５つの独立した形質転換体（黒の符号）の発芽反応、１５℃の低温下での「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒マル）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白三角）の発芽反応を表わす。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【図１３】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子発現を示す。 ノーザンブロット分析を、「はやまさり」（ＨＹ）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（ＮＩＬ）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（ＩＬ）の異なる組織から抽出された全ＲＮＡにおけるｑＬＴＧ−３−１の遺伝子発現レベルを測定するために用いた。 エチジウムプロマイド染色ｒＲＮＡをコントロールとして用いた。（Ａ）は３０℃での発芽、（Ｂ）は１５℃での発芽、（Ｃ）は組織特異性、である。
【図１４】異なったストレス条件下でのｑＬＴＧ−３−１の発芽反応を示す。 （Ａ）は２５℃の至適温度での発芽、（Ｂ）は１３℃での発芽、（Ｃ）はＮａＣｌ（３００ｍＭ）、（Ｄ）はマンニトール（５００ｍＭ）、（Ｅ）はＡＢＡ（５００ｍＭ）感受性、である。 「はやまさり」（白マル）、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１（黒三角）及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」（白マル）の例を示す。数値は、３反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【図１５】異なったストレス条件下での「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」の発芽反応を示す。（Ａ）では種子を、２５，１５，１３，１０℃で水でインキュベートした。（Ｂ）では、１５℃でＧＡ（１００，２００，５００μＭ）を加えて、２５℃で（Ｃ）ＡＢＡ（２００，３００，５００ｍＭ）、（Ｄ）ＮａＣｌ（１５０，２５０，３００ｍＭ）及び（Ｅ）マンニトール（２５０，５００，６００ｍＭ）を加えて、インキュベートした。 白マルはコントロールを表わす。低濃度〜高濃度を、開いたマル、三角及び四角で示した。
【図１６】１５℃での発芽反応におけるＧＡ（５００ｍＭ）の効果を示す。 白又は黒の符号は、各々、ＧＡ有り又は無しを示す。「はやまさり」、ＮＩＬＨＹｑＬＴＧ−３−１及び「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、各々、マル、三角及び四角で示す。
【図１７】ＲＴ−ＰＣＲ分析による３０℃及び１５℃下での発現の期間のｑＬＴＧ−３−１、ＧＡ生合成及びアミラーゼ遺伝子の発現を示す。 Ｕｂｉ２を、ＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図１８】種子発芽の間の胚及びＲＴ−ＰＣＲ分析による発芽の間の胚乳におけるｑＬＴＧ−３−１の発芽を示す。 Ｕｂｉ２をＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図１９】ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＡＢＡ（５００ｍＭ）、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）及びマンニトール（５００ｍＭ）処理における、発芽の期間のｑＬＴＧ−３−１の発現を示す。 Ｕｂｉ２をＲＴ−ＰＣＲ実験でコントロールとして用いた。
【図２０】ｑＬＴＧ−３−１：：ＧＵＳのコンストラクトを示す。
【図２１】ｑＬＴＧ−３−１遺伝子プロモーターの制御下でのＧＵＳ発現を示す。プロモーターとしてのｑＬＴＧ−３−１の２−ｋｂ上流領域の制御下でＧＵＳを発現している形質転換植物をＧＵＳ活性のために染色した。形質転換していない植物の「はやまさり」はバックグラウンドのＧＵＳ活性を示さなかった。バーは１ｍｍである。
【図２２】ＲＴ−ＰＣＲ分析による３０℃及び１５℃での発芽の期間におけるｑＬＴＧ−３−１、ＧＡ生合成及びアミラーゼ遺伝子の発現を示す。 Ｕｂｉ２はＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図２３】ｑＬＴＧ−３−１の過剰発現のためのコンストラクトを示す。
【図２４】ＲＴ−ＰＣＲ分析による過剰発現の形質転換植物におけるｑＬＴＧ−３−１の発現を示す。 Ｕｂｉ２はＲＴ−ＰＣＲ実験におけるコントロールとして用いた。
【図２５】過剰発現の形質転換植物の低温発芽性を示す。 ３つの独立したＴ１個体集団における低温発芽性の頻度分布を示す。 黒及び白のバーは導入遺伝子の有無を示す。
【図２６】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２７】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２８】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３０】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３１】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３２】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３３】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３４】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のヌクレオチド配列を示す。
【図３５】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３６】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３７】イネのコアコレクションとその野生種におけるｑＬＴＧ−３−１等のアミノ酸配列を示す。
【図３８】ｑＬＴＧ−３−１のハプロタイプのネットワークを示す。マルのサイズは、所定のハプロタイプ内での系統数に比例している。黒マルの間の白マルは未同定のハプロタイプを表わす。ハプロタイプの間の線は、各ハプロタイプの間の変異のステップを表わす。ハプロタイプ組成は、系統数のパーセントとして示される。青、赤及びオレンジは、各々、イネのコアコレクションのグループＡ、Ｂ及びＣを表わす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子。
【請求項２】
上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等乃至類似の低温発芽性能を有する、請求項１に記載の低温発芽性遺伝子。
【請求項３】
環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する、請求項１に記載の低温発芽性遺伝子。
【請求項４】
請求項１の低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子を植物に組換えて低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項６】
植物が、イネである、請求項５に記載の形質転換植物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法。
【請求項８】
上記栽培品種が、イネである、請求項７に記載の低温発芽性の分析方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法。
【請求項１】
イネ系統「Ｉｔａｌｉｃａ Ｌｉｖｏｒｎｏ」由来の単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）された低温発芽性能を有するｑＬＴＧ−３−１遺伝子であって、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする低温発芽性遺伝子。
【請求項２】
上記配列番号１の塩基配列において、該塩基配列の１部に遺伝子変異が存在しており、かつ配列番号１の塩基配列と同等乃至類似の低温発芽性能を有する、請求項１に記載の低温発芽性遺伝子。
【請求項３】
環境ストレスである低温、塩（ＮａＣｌ）、浸透圧（マンニトール）のストレス下での発芽性向上機能を有する、請求項１に記載の低温発芽性遺伝子。
【請求項４】
請求項１の低温発芽性遺伝子によりコードされる低温発芽性を向上させる作用を有するアミノ酸配列であって、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を有することを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子を植物に組換えて低温発芽性を向上させたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項６】
植物が、イネである、請求項５に記載の形質転換植物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子の塩基配列と栽培品種の遺伝子型とを対比して、栽培品種の低温発芽性を分析することを特徴とする低温発芽性の分析方法。
【請求項８】
上記栽培品種が、イネである、請求項７に記載の低温発芽性の分析方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の低温発芽性遺伝子をイネの栽培品種に導入して、該品種の低温条件下での低温発芽性を向上させることを特徴とするイネの低温発芽性の向上方法。
【図２】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図３８】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図３８】
【公開番号】特開２００９−６０８７４（Ｐ２００９−６０８７４Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３３４６１（Ｐ２００７−２３３４６１）
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、農林水産省、「アグリ・ゲノム研究の総合的な推進」委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９００２２９５４）ホクレン農業協同組合連合会 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、農林水産省、「アグリ・ゲノム研究の総合的な推進」委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９００２２９５４）ホクレン農業協同組合連合会 (14)
【Ｆターム（参考）】
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