イノシトールトリピロリン酸を使用して多剤耐性を低減する方法
イノシトール三リン酸（ＩＴＰＰ）は腫瘍血管系の正常化を生じさせ、及び部分的血管新生後に第２の化学療法剤を投与するとき、癌治療に特に有効である。ＩＴＰＰはまた、単独で、又は組み合わせで、多剤耐性癌も治療する。またＩＴＰＰを使用して、第２の化学療法薬の抗癌活性に必要な量を低減することもできる。さらに、ＩＴＰＰは免疫応答を促進し、過剰増殖性障害を治療する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年７月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２２３，５８３号の利益を主張し、その教示は全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国世界における主な死亡原因のうちの一つであり、米国だけでもその死者は毎年５０万人を超える。米国では毎年１００万人超が癌と診断され、総じて一生涯のうちに何らかの形の癌を発症する人は３人に１人より多いと推定される。癌死亡率の８５％超を固形腫瘍が占める。
【０００３】
血管形成は、数多くの異なるタイプの癌と関連付けられている。血管形成は血管形成刺激因子及び阻害因子の高度に制御された系によって調節される。特定の疾患状態では血管形成の調節が変化し、多くの場合、疾患に付随する病理学的な損傷は、調節されない血管形成に関連する。調節される血管形成及び調節されない血管形成の双方とも、同様の方法で進行すると考えられている。基底膜に取り囲まれている内皮細胞及び周皮細胞が毛細血管を形成する。血管形成は、内皮細胞及び白血球が放出する酵素による基底膜の浸食から始まる。血管管腔の内側を覆う内皮細胞は、次に基底膜から突き出る。内皮細胞が血管形成刺激物質により誘導され、浸食された基底膜を通って遊走する。遊走細胞は親血管から分かれ出て「出芽」を形成し、ここで内皮細胞は有糸分裂を受けて増殖する。内皮細胞出芽は互いに合流して毛細血管ループを形成し、新しい血管を作り出す。
【０００４】
多くの疾患状態、腫瘍転移、及び内皮細胞による異常成長では、持続的な制御されない血管形成が起こる。制御されない血管形成が存在する種々の病理学的疾患状態は、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患として分類されている。
【０００５】
腫瘍成長が血管形成依存性であるという仮説は、１９７１年に初めて提唱された。簡潔に言えば、この仮説は「腫瘍の「取り込み（take）」が起こると、腫瘍細胞集団が増加するごとに先行して腫瘍に集中した新しい毛細血管が増加しなければならない」と述べる。腫瘍「取り込み」は、現在のところ、数立方ミリメートルの容積を占め、且つ数百万細胞以下の腫瘍細胞の集団が既存の宿主微小血管で生き残ることができる腫瘍成長の前血管段階を示すものと理解されている。この段階を越えて腫瘍容積が拡大するには新毛細血管の誘導が必要となる。例えば、マウスにおける初期前血管段階の肺微小転移は、組織切片の高倍率顕微鏡検査による以外は検出不能と思われる。
【０００６】
血管形成は、固形腫瘍及び血液系腫瘍を含む数多くの異なるタイプの癌と関連付けられている。血管形成が関連付けられている固形腫瘍としては、限定はされないが、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、及び骨肉腫が含まれる。血管形成はまた、血液系腫瘍、例えば白血病など、白血球細胞の抑制のない増殖が起こり、通常は貧血症、血液凝固能の低下、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の腫脹を伴う骨髄の様々な急性又は慢性新生物疾患の任意のものとも関連付けられる。血管形成は、白血病腫瘍及び多発性骨髄腫疾患を引き起こす骨髄の異常において役割を果たすと考えられている。
【０００７】
上述のとおり、いくつかの種類の証拠から、血管形成が固形腫瘍の成長及び持続並びにその転移に不可欠であることが示される。血管形成が刺激されると、腫瘍は、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）及び血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）を含めた様々な血管形成因子の産生をアップレギュレーションする。
【０００８】
血管形成の制御におけるＶＥＧＦの役割は、重点的な研究対象となっている。ＶＥＧＦは生理学的血管形成における決定的な律速段階を表すが、腫瘍成長に関連する血管形成などの病理学的血管形成においても重要であるものと思われる。ＶＥＧＦは、血管漏出を生じさせる能力に基づき血管透過性因子としても知られる。いくつかの固形腫瘍は有り余る量のＶＥＧＦを産生し、それが内皮細胞の増殖及び遊走を刺激して、それにより新血管新生が誘導される。ＶＥＧＦ発現は種々のヒト癌の予後に大きい影響を与えることが示されている。ＶＥＧＦ遺伝子の発現の制御には腫瘍の酸素張力が重要な役割を担う。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現は、様々な病態生理学的状況下で低酸素張力に曝露されることで誘導される。
【０００９】
成長する腫瘍は低酸素により特徴付けられ、低酸素はＶＥＧＦの発現を誘導し、転移性疾患の発生の予測因子ともなり得る。また、通常の血管と異なり、腫瘍血管系は異常な組織化、構造、及び機能を有することも認識されている。腫瘍血管はまた漏出性が高いことも認められ、血流が不均一で、多くの場合に低下する。
【００１０】
癌細胞が成長及び転移するには血管を利用できる必要があるため、血管形成の阻害は癌及び腫瘍の治療に希望を与えるものと考えられる。しかしながら、現在まで抗血管形成戦略が探求されてきたものの、薬剤耐性を有する極めて侵攻性の高い転移性癌細胞の選択が起こるため、継続的な治療利益は提供されていない。腫瘍血管新生を破壊するそのような抗血管形成治療薬は、ある場合には転移性浸潤を促進させることが認められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、腫瘍血管系を制御することのできる実質的に非毒性の組成物及び方法が必要とされている。また、改良された癌治療も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
実施例に提供するデータは、化学療法と組み合わせた血管正常化が潜在的に有益な癌治療手法であることを示す。ヘモグロビンのアロステリックエフェクターであるイノシトール三リン酸（ＩＴＰＰ）は酸素放出を促進し、低酸素の作用に拮抗し、及びインビトロで血管形成を阻害する。マウスモデルでは、マウスメラノーマ細胞を静脈注射することにより誘導した肺転移が赤血球中ＩＴＰＰ（ＩＴＰＰ−ＲＢＣ）により低減する。ＩＴＰＰは、化学療法剤のシスプラチン及びパクリタキセルを伴うと、原発性メラノーマの成長及び肺転移を阻害した。膵臓腺癌のラットモデルでは、ＩＴＰＰはゲムシタビンとの併用で被験動物の生存率の大幅な上昇を引き起こし、強力な相加作用を示した。ＩＴＰＰは、腫瘍へのマクロファージ及びナチュラルキラー細胞の浸潤も大幅に促進する。
【００１３】
本発明は、癌の治療方法であって、その必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程と；腫瘍における部分的血管正常化後に対象に治療有効量の化学療法剤を投与する工程とを含む方法を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明は、イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と、パクリタキセル、シスプラチン及びゲムシタビンから選択されるものなどの化学療法剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、対象において癌を治療するための治療レジメンであって、治療有効量のＩＴＰＰと、パクリタキセル、シスプラチン及びゲムシタビンから選択されるものなどの化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む治療レジメンを提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、対象において癌を治療するための治療レジメン又は方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む治療レジメン又は方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量のＩＴＰＰを投与することによる、１つ又は複数の化学療法剤に耐性を有する癌の治療方法を提供する。特定の実施形態において、癌はパクリタキセル及び／又はシスプラチンに耐性を有する。
【００１９】
本発明はまた、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法も提供し、該過剰増殖性病態は癌ではなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない。
【００２０】
本発明はさらに、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む対象における免疫応答の促進方法を提供し、該対象は癌又は別の腫瘍に罹患していない。
【００２１】
さらに、本発明は、医学における本明細書に記載される組成物の使用、及び本明細書に記載される病態の治療用薬剤の製造における本明細書に記載される組成物の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】発症させた皮下メラノーマ腫瘍におけるＩＴＰＰ−赤血球（ＲＢＣ）により誘導された選択的酸素圧上昇を示す。（Ａ）１４日前に移植した未処置腫瘍と、１２日目及び１３日目にＩＴＰＰで処置した同じ腫瘍との比較。ＩＴＰＰ注射２４時間後のｐＯ２レベルに留意されたい。（Ｂ）ＩＴＰＰの腹腔内注射前及び注射後の皮下移植腫瘍におけるｐＯ２の経時記録。処置３０分後の酸素圧上昇に留意されたい。（Ｃ）ＩＴＰＰは筋肉内ｐＯ２には影響を及ぼさない。ＩＴＰＰの腹腔内注射により低酸素性皮下腫瘍におけるｐＯ２（下側の曲線）は上昇するが、健常な筋肉におけるｐＯ２（上側の曲線）は影響を示さない。データは群当たり１０匹のマウスで実施した１０例の実験うちの代表的な１つによるもの。
【図２】ＩＴＰＰ−ＲＢＣによる酸素供給が実験的メラノーマモデルにおいて肺転移を阻害し、低酸素により誘導された遺伝子カスケードを逆転させることを示す。メラノーマ接種後２７日目における健常対照（白色）と比較したメラノーマを有する未処置マウス（灰色）及びＩＴＰＰ処置マウス（黒色）の肺溶解物中のタンパク質及び酵素活性の計測値：（Ａ）ルシフェラーゼアッセイによる肺転移定量、（Ｂ）ＨＩＦ−１α発現；（Ｃ）ＶＥＧＦ発現、（Ｄ）Ｔｉｅ−２、及び（Ｅ）ＨＯ−１発現、メラノーマ細胞注射後１９日目のＥＬＩＳＡにより評価。（Ｆ）ｍＲＮＡ ＬＯＸ含量、評価。データは５例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり８〜１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。
【図３】皮下メラノーマを有するマウスにおいてＩＴＰＰ処置スケジュールが抗転移活性、血管正常化、及び多剤耐性細胞レベルの低減に影響を及ぼし得ることを示す。（Ａ）２０日目、２１日目における薬物適用前のＩＴＰＰ処置の開始時期及び処置期間の効果。７日目に開始した場合ＩＴＰＰにより転移が減少し、それより後になると効果が少なくなり、慢性処置時は転移が増加する。ルシフェラーゼ分析は２５日目であった。データは１０例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。（Ｂ）以下によって２０日目に評価した腫瘍血管正常化に対するＩＴＰＰ処置の効果：（ａ）ＩＴＰＰ処置マウスと比較した、皮下未処置腫瘍における血管構造の磁気共鳴イメージング。無処置腫瘍の組織化されていない不連続な血管（矢印）と比較して、ＩＴＰＰ処置（９日目、１４日目、１８日目、１９日目）後の十分に組織化された血管系（矢印）に留意されたい。（ｂ）対象と比較した、正常化した血管の周囲の周皮細胞の抗ＳＭＡ抗体による免疫染色。
【図４】低酸素時及び再酸素化時におけるマウスメラノーマ細胞及び肺内皮のマウスのインビトロでの化学感受性を示す。化学療法薬：（Ａ）パクリタキセル；（Ｂ）シスプラチンに対するメラノーマ細胞の感受性は低酸素により打ち消される。これは細胞を再酸素化すると戻る。（Ｃ）シスプラチンに対する内皮細胞感受性の評価。
【図５】腫瘍酸素化及び血管正常化によりメラノーマにおける化学療法が向上することを示す。（Ａ）ＩＴＰＰ、パクリタキセル及びシスプラチンの組み合わせにより、処置を経るに従い転移が減少する。薬物を再注射（２０日目及び２１日目）する前にＩＴＰＰを再注射すると（１８日目、１９日目）、肺転移の根絶が達成された。（ａ）＝未処置；（ｂ）＝ＩＴＰＰ ７日目、１２日目、１６日目；（ｃ）＝「ｂ」＋薬物 ７日目、１２日目、１６日目；（ｄ）＝「ｃ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目；（ｅ）＝ＩＴＰＰ ９日目、１４日目；（ｆ）＝「ｅ」＋薬物 ９日目、１４日目；（ｇ）＝「ｆ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目；（ｈ）＝ＩＴＰＰ １１、１６；（ｉ）＝「ｈ」＋薬物 １１日目、１６日目；（ｊ）＝「ｉ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目。ルシフェラーゼ活性は２５日目に分析した。データは１０例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。（Ｂ）ＩＴＰＰにより誘導される正常化の薬物化学治療活性に対するメトロノーム併用効果。２群のマウスをＩＴＰＰにより、９日目、１４日目又は９日目、１４日目、１８日目、１９日目のいずれかに処置した。２０日目、２１日目に、２群のＩＴＰＰ処置マウスにパクリタキセル及びシスプラチンを投与した。２５日目に腫瘍を染色した。（ａ）ａ２及びａ３におけるＩＴＰＰ及び薬物処置マウスと比較した、無処置腫瘍における（ａ１）ＣＤ３１による血管の免疫染色 ＣＤ３１＋染色は壊死部分に対応する。（ｂ）（ａ）のように処置したマウスの腫瘍のヘマトキシリン−エオシン染色。処置後の腫瘍の有効な壊死性破壊（ａ３、ｂ３）に留意されたい。データは群当たり１０匹のマウスに対して行われた実験についての代表である。
【図６】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、膵腫瘍ラットの生存に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。ＩＴＰＰ処置群では、膵腫瘍ラットを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回ＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、膵腫瘍ラットを１６日目、１８日目、及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図７】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ヘキサナトリウムミオイノシトールトリスピロリン酸（ＯＸＹ１１１Ａ）をゲムシタビンと併用した膵腫瘍ラットの生存に対する効果を示す。併用処置群では、膵腫瘍ラットを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、膵腫瘍ラットを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図８】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植ヌードマウスの生存に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。ＩＴＰＰ処置群では、腫瘍異種移植マウスを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回ＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、腫瘍異種移植マウスを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図９】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ＩＴＰＰをゲムシタビンと併用したヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植ヌードマウスの生存に対する効果を示す。併用処置群では、腫瘍異種移植マウスを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、腫瘍異種移植マウスを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図１０】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、膵腫瘍ラットにおけるＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、カスパーゼ−３及びβ−アクチンの発現に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。
【図１１】Ｂ１６腫瘍へのＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージ浸潤に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。７日目、８日目、１４日目、１５日目、２１日目、２２日目、２９日目及び３０日目にＯＸＹ１１１Ａを腹腔内注射した。３１日目にＢ１６腫瘍の分析を実施した。（ａ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｂ）及び（ｃ）ＩＴＰＰ処置腫瘍のＣＤ６８染色はＢ１６腫瘍へのＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージ浸潤を示す。
【図１２】ＣＤ４９ｂナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の浸潤及びＢ１６腫瘍中のＣＤ３１内皮（ＥＣ）細胞の存在に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。（ａ）〜（ｃ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｄ）〜（ｆ）ＩＴＰＰで処置したＢ１６腫瘍。緑色の矢印は浸潤しているＮＫ細胞を示す；赤色の矢印は血管壁を示す。
【図１３】メラノーマＢ１６腫瘍のＮＫ細胞浸潤に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。Ｂ１６腫瘍細胞はＢ１６Ｆ１０ＤＡＰＩと命名した；ＮＫ細胞は抗ＣＤ４９ｂＦＩＴＣ１と命名した；及び血管内皮細胞は抗ＣＤ３１ＴＲＩＴＣと命名した。（ａ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｂ）及び（ｃ）ＩＴＰＰで処置したＢ１６腫瘍。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１）本発明の組成物
本発明において有用な組成物は、イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）の酸及び塩を含む；ＩＴＰＰは本明細書では陰イオンとして認識される。用語イノシトールトリスピロリン酸は、イノシトール六リン酸トリスピロリン酸としても知られ、３個の内部ピロリン酸環を含むイノシトール六リン酸を指す。ＩＴＰＰのカウンターパート種は本明細書では対イオンと称し、ＩＴＰＰの対イオンとの組み合わせを本明細書では酸又は塩と称する。本発明は、純粋なイオン性である対に限定されるものではない。実際、当該技術分野では、対を生成するイオンはしばしば、対の２つの成分間にある程度の共有結合又は配位結合の特徴を示すことが知られている。本発明の組成物のＩＴＰＰ酸及び塩は単一の種類の対イオンを含んでもよく、又は混成の対イオンを含有してもよく、及び任意選択によりＩＴＰＰがその一つである陰イオンの混合物を含有してもよい。組成物は、任意選択により、クラウンエーテル、クリプタンド、及び対イオンのキレート化又は他の錯化能を有するその他の種を含んでもよい。組成物は同様に、任意選択により、酸性大員環、又は水素結合若しくは他の分子引力を介してＩＴＰＰの錯化能を有するその他の種を含んでもよい。ＩＴＰＰの酸及び塩の作製方法は、Nicolau et al.に対し発行された米国特許第７，０８４，１１５号（この内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載される。
【００２４】
本発明における使用が企図される対イオンとしては、限定はされないが、以下のものが含まれる：プロトンならびに重水素及びトリチウムの対応するイオンを含む陽イオン性水素種；リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、及び銅（Ｉ）を含む一価の無機陽イオン；ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、マンガン（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、銅（ＩＩ）及び鉄（ＩＩ）を含む二価の無機陽イオン；鉄（ＩＩＩ）を含む多価の無機陽イオン；アンモニウム、シクロヘプチルアンモニウム、シクロオクチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロヘキシルアンモニウム、及び他の有機アンモニウム陽イオンを含む四級窒素種；トリエチルスルホニウム及び他の有機スルホニウム化合物を含むスルホニウム種；ピリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、キヌクリジニウム、ピロリウム、トリピペラジニウム、及び他の有機陽イオンを含む有機陽イオン；オリゴマー、ポリマー、ペプチド、タンパク質、正電荷イオノマー、及びポリマーのペンダント基、鎖末端、及び／又は骨格にスルホニウム、四級窒素、及び／又は荷電有機金属種を有する他の高分子種を含むポリマー性陽イオン。例示的なＩＴＰＰ塩は、ＩＴＰＰの一カルシウム四ナトリウム塩、又は１５〜２５ｍｏｌ％のカルシウムと７５〜８５ｍｏｌ％のナトリウムとを含有するＩＴＰＰナトリウムとＩＴＰＰカルシウムとの混合物である。
【００２５】
本発明で用いられるＩＴＰＰの好ましい異性体は、シス−１，２，３，５−トランス−４，６−シクロヘキサンヘキシルであるミオイノシトールである；しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。従って、本発明は、天然に存在するシロ−、カイロ−、ムコ−、及びネオ−イノシトール異性体のそれぞれのトリピロリン酸、並びにアロ−、エピ−、及びシス−イノシトール異性体のものを含む、ＩＴＰＰの任意のイノシトール異性体の使用を企図する。
【００２６】
ＩＴＰＰは、エステルの酵素切断によるか、又はトリルスルホニル基などの脱離基の置換によるなどしてプロドラッグからインビボで形成され得ることが企図される。
【００２７】
ＩＴＰＰは、抗血管形成特性及び抗腫瘍特性を呈し、血管形成又は増殖に関連する事象、病態又は物質の調節に有用である。本明細書で使用されるとき、血管形成又は増殖に関連する事象、病態、又は物質の調節とは、任意の種類の因子、病態、活性、指標、化学物質、又は化学物質、ｍＲＮＡ、受容体、マーカー、メディエーター、タンパク質、若しくは転写活性などの組み合わせにおける任意の定性的又は定量的な変化であって、血管形成又は増殖に関連し得るか又は関連すると考えられ、及び本発明の組成物の投与によりもたらされる変化を指す。
【００２８】
ＩＴＰＰはまた、腫瘍微小環境のｐＯ２を促進し、転移及び新生物性の血管新生を阻害する。低酸素性腫瘍細胞は、多くの場合に浸潤性がより高く、且つアポトーシス耐性を有する細胞であり、従来の化学療法に耐性を有する傾向がある。従って、特定の実施形態では、化学療法剤による治療の効力をＩＴＰＰとの併用治療により増加させる。さらに、いくつかの態様では、ＩＴＰＰ治療が腫瘍微小血管の「正常化（normalization)」を誘導する。
【００２９】
ＩＴＰＰはさらに、腫瘍における薬物排出ポンプの数を減少させ、従って特定の実施形態において、１つ又は複数の化学療法剤に耐性を有する癌を治療し、及び／又は腫瘍細胞に対する化学療法剤の効力を増加させる。
【００３０】
本発明は、ＩＴＰＰと化学療法剤とを含む新規医薬組成物を提供する。本発明に好適な化学療法剤としては、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
【００３１】
一実施形態において、化学療法剤はパクリタキセルなどの微小管標的薬剤である。別の実施形態において、化学療法剤は白金系薬剤（例えば、シスプラチン）又はドキソルビシンなどのＤＮＡ挿入剤である。さらなる実施形態において、化学療法剤はゲムシタビン又はカペシタビンなどのヌクレオシド代謝阻害薬である。
【００３２】
特定の実施形態において、組成物の化学療法剤は治療用量以下又は治療量以下である。用語「治療用量以下又は治療量以下」は、単独の物質として治療効果を実現するために投与が必要な薬理活性物質の用量又は量を下回る当該物質の用量又は量を意味する。そのような物質の治療用量以下とは、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて異なってもよく、当業者により容易に決定され得る。一実施形態において、治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は、化学療法剤の認可されている総用量、例えばその化学療法剤についてのU.S. Food & Drug Administration承認済みラベル情報に提供される用量の９０％未満である。他の実施形態において、治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は認可されている総用量の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又はさらには１０％未満、例えば、２０％〜９０％、３０％〜８０％、４０％〜７０％又は本明細書に提供される値の範囲内の別の範囲である。
【００３３】
本発明はまた、ＩＴＰＰと化学療法剤とを含む癌治療用キットも提供する。このキットは、以下で考察するとおりの、本発明の治療レジメン又は方法におけるＩＴＰＰ及び化学療法剤の使用についての指示書を提供し得る。このキットに好適な化学療法剤としては、上述のものが含まてもよい。本発明のキットには治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤が使用されてもよい。
【００３４】
本発明は、ＩＴＰＰの化合物若しくは薬物又はそのプロドラッグから構成されるインプラント又は他の装置も企図し、該薬物又はプロドラッグは、徐放用の生分解性又は非生分解性ポリマーに製剤化される。非生分解性ポリマーは、ポリマーそのものの分解はなしに、薬物を物理的又は機械的プロセスによって制御された形で放出する。生分解性ポリマーは、体内の自然の過程により徐々に加水分解又は可溶化されるように設計され、混和された薬物又はプロドラッグの漸進的な放出を可能にする。薬物又はプロドラッグはポリマーに化学的に連結されてもよく、又は混和によってポリマー中に組み込まれてもよい。生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーの双方、及び放出制御のため薬物をポリマーに組み込む方法は当業者に周知である。そのようなポリマーの例は、全体が参照により援用される、Brem et al., J. Neurosurg 74: pp. 441-446 (1991)などの多くの文献に見出すことができる。これらのインプラント又は装置は、送達が所望されるところに近接して、例えば腫瘍の部位に植え込むことができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、以上に参照される１つ又は複数の疾患状態において価値を有する１つ又は複数の薬理作用物質を含有してもよいし、又はそれと同時投与（同時に又は逐次的に）されてもよい。
【００３６】
製剤は、概してRemington's Pharmaceutical Sciences 17th editionなどの標準的なテキストに従い調製及び投与され得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、従来の方法で１つ又は複数の生理学的又は薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を使用して製剤化され得る。本発明の組成物及びその薬学的に許容可能な塩及び溶媒和物は、例えば、注射（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内）、吸入又は吹込（口又は鼻からのいずれか）又は経口、口腔、舌下、経皮、経鼻、非経口又は直腸投与による投与用に製剤化され得る。一実施形態において、組成物は、標的細胞が存在する部位に、すなわち特定の組織、臓器、又は体液（例えば、血液、脳脊髄液等）の中に局所投与され得る。成分、特に上述のものに加え、本発明の製剤は、当該の製剤タイプを考慮した当該技術分野で標準的な他の作用剤を含み得ることは理解されなければならず、例えば経口投与に好適なものとしては、香味剤又はその他の、口当たりを良くし、且つ嚥下を容易にする作用剤が含まれ得る。
【００３７】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、又は錠剤などの各々が所定量の有効成分を含む個別の単位として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油液体エマルジョン又は油中水エマルジョン等として提供され得る。錠剤は、任意選択により１つ又は複数の補助成分を伴い、圧縮又は成形により作製され得る。錠剤は任意選択によりコーティングされるか、又は割線が入れられてもよく、中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００３８】
口での局所投与に好適な製剤としては、風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に成分を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアの中に有効成分を含むトローチ；及び好適な液体担体中に投与成分を含む洗口剤が含まれる。
【００３９】
皮膚に対する局所投与に好適な製剤は、薬学的に許容可能な担体中に投与成分を含む軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとして提供され得る。別の局所送達系は、投与成分を含む経皮パッチである。
【００４０】
直腸投与用の製剤は、例えばカカオ脂及び／又はサリチル酸を含む好適な基剤を含む坐薬として提供され得る。
【００４１】
経鼻投与に好適な製剤としては、担体が固体の場合、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗末が含まれ、これは嗅ぎ薬を嗅ぐ方法で；すなわち、鼻を塞ぐように保持された粉末の容器から鼻道を介して急速吸入することにより投与される。担体が液体の場合、例えば鼻腔内スプレー又は点鼻液などの投与に好適な製剤は、有効成分の水性又は油性溶液を含む。
【００４２】
経膣投与に好適な製剤は、有効成分に加え、当該技術分野において適切であることが公知の担体などの成分を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤として提供され得る。
【００４３】
吸入に好適な製剤は、有効成分に加え、当該技術分野において適切であることが公知の担体などの成分を含有するミスト、ダスト、粉末又はスプレー製剤として提供され得る。
【００４４】
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を目的の被投与者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供されてもよく、及び例えば注射用水などの滅菌液体担体を使用直前に加えるだけで十分なフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保存されてもよい。即時調合注射溶液及び懸濁液は、先述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【００４５】
本発明の一部として企図される製剤には、本明細書によって全体として参照により援用される米国特許出願公開第２００４／００３３２６７号に開示される方法により作製されるナノ粒子製剤が含まれる。特定の実施形態において、本発明の化合物の粒子は、光散乱法、顕微鏡法、又は当業者に公知の他の適切な方法により計測したとき、約２ミクロン未満、約１５００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、又は約５０ｎｍ未満の有効平均粒度を有する。
【００４６】
（２）本発明の治療レジメン（treatment regimen)及び方法
ＩＴＰＰは腫瘍内血管正常化を誘導する。ＩＴＰＰにより誘導される血管正常化は、放射線及び細胞毒性薬物の双方に対する腫瘍細胞の耐性並びに腫瘍転移の主な理由である腫瘍低酸素に拮抗する。
【００４７】
一態様において、本発明は、対象における癌又は腫瘍を治療するための治療レジメン又は方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む方法を提供する。語句「治療有効量」は、典型的には治療レジメン又は方法との関連において妥当なベネフィット／リスク比で、何らかの所望の局所的な又は全身性の作用を生じるそのような物質、組成物、キット又は治療レジメンの全体としての量を意味する。そのような物質の治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて異なってもよく、当業者により容易に決定され得る。例えば、本明細書に記載される特定の組成物は、そのような治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で所望の作用を生じるのに十分な量で投与され得る。
【００４８】
本発明の方法における使用に適した好適な化学療法剤としては、上述のものが含まれ得る。特定の実施形態において、化学療法剤は、パクリタキセル、シスプラチン又はゲムシタビンである。
【００４９】
例示的な癌としては、限定はされないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫を含む血液新生物；腺癌及び扁平上皮癌を含む癌腫；メラノーマ並びに肉腫が含まれる。癌腫及び肉腫は、しばしば「固形腫瘍」とも称される。本発明の方法により治療され得るタイプの腫瘍は、好ましくは、限定はされないが、肉腫、癌腫を含む固形腫瘍、並びにその他の、限定はされないが、生殖細胞腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵癌、胃癌、肝癌、結腸癌、メラノーマ、腎癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、直腸癌、子宮内膜癌、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、神経芽細胞腫、中皮腫、副腎皮質癌、上皮癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、非横紋筋肉腫性軟部組織肉腫（non-rhabdomyosarcome soft tissue sarcoma）、骨肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍（peripheral primative neuroectodermal tumor）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、及びウィルムス腫瘍を含む固形腫瘍癌である。
【００５０】
一実施形態において、ＩＴＰＰと化学療法剤とが同時に投与される。特定の実施形態において、ＩＴＰＰと、化学療法剤であるゲムシタビンなどのヌクレオシド代謝阻害薬とが同時に投与される。別の具体的な実施形態において、癌は膵癌である。特定の実施形態において、癌はメラノーマである。
【００５１】
別の実施形態において、ＩＴＰＰと化学療法剤とは逐次的に投与される。例えば、ＩＴＰＰは化学療法剤の投与前に投与される。好ましい実施形態において、化学療法剤は腫瘍の部分的血管正常化の発生後に投与される。本明細書で使用されるとき「部分的血管正常化」は、その間に既存の腫瘍血管系が血管内皮及び基底膜の構造の改善を示し、従って漏出性、拡張及び／又は低酸素が低減した生理学的状態を指す。そのような部分的血管正常化は、ｐＯ２、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、ＶＥＧＦ、チロシンキナーゼＴｉｅ−２、及びヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）のうちの１つ以上のレベルの変化を検出及び／又はモニタすることにより、又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及び磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）を含む技術を使用して腫瘍血管の生理学的状態をモニタすることにより決定され得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、ＩＴＰＰは化学療法剤の投与の約２時間前〜５日前に投与される。別の好ましい実施形態において、ＩＴＰＰは化学療法剤（例えば、パクリタキセルなどの微小管標的薬剤又はシスプラチンなどのＤＮＡ挿入剤）の投与の約１〜４日前、例えば化学療法剤の投与の２〜３日前に投与される。
【００５３】
複数ラウンドのＩＴＰＰ及び化学療法剤を投与することができる。特定の実施形態では１ラウンドのみが投与される。他の実施形態では、２ラウンド以上（例えば、２、３、４ラウンド、又はそれ以上）のＩＴＰＰ及び化学療法剤が投与される。ラウンドは、１日〜６ケ月、例えば１日〜３ケ月、１週間〜２週間、２週間〜３週間、３週間〜１ケ月、１ケ月〜２ケ月、又は２ケ月〜３ケ月の間隔が置かれてもよい。
【００５４】
化学療法剤は、当該薬剤の単独の活性薬剤としての用量に基づき治療用量以下又は治療量以下で投与され得る。一実施形態において、投与される治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は、化学療法剤の認可されている総用量の９０％未満又は上記のとおりの別の用量である。
【００５５】
本発明は、薬剤耐性癌の治療方法も提供する。特定の実施形態において、薬剤耐性癌は、１つ又は複数の化学療法剤による治療が不可能な癌である。例えば薬剤耐性癌は、薬剤による治療後に認識可能な腫瘍サイズの減少を呈しないものであってよく、及び／又は腫瘍の進行（例えば、ステージＩＩからステージＩＩＩへの、又はステージＩＩＩからステージＩＶへの）を有意に阻害しないものである。特定の癌、特にメラノーマが耐性を有する化学療法剤の例としては、微小管標的薬剤（例えば、パクリタキセル）及びＤＮＡ挿入剤（例えば、シスプラチンなどの白金系薬剤）が含まれる。薬剤耐性アッセイについては、例えば、参照により本明細書に援用されるLowe et al. (1993) Cell 74:95 7-697に記載されている。他の実施形態において、薬剤耐性癌は、非耐性癌細胞と比較したとき著しく増加したレベルの胆管側多選択性有機陰イオン輸送体１及び／又はＰ−糖タンパク質薬物排出ポンプを有する癌である。
【００５６】
薬剤耐性癌の治療方法には、ＩＴＰＰの単独投与か、又は本明細書に記載されるものなどの別の化学療法剤との併用でのＩＴＰＰの投与のいずれかが関わり得る。
【００５７】
本発明はまた、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法を提供し、該過剰増殖性病態は癌でなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない。本発明の方法により治療され得る過剰増殖性病態としては、限定はされないが、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、肝硬変、胆道閉鎖症、うっ血性心不全、強皮症、放射線誘発線維症、肺線維症（特発性肺線維症、膠原血管病、サルコイドーシス、間質性肺疾患及び外因性肺障害）、乾癬、陰部疣贅及び過剰増殖性細胞増殖疾患、例えば、角質増殖症、魚鱗癬、角皮症又は扁平苔癬などの過剰増殖性ケラチノサイト疾患を含むものが含まれる。いくつかの実施形態において、過剰増殖性病態を示す組織又は臓器は低酸素状態である。さらなる実施形態において、過剰増殖性病態の治療方法は、さらなる抗過剰増殖剤（antihyperproliferative agent）を投与する工程をさらに含む。抗過剰増殖剤としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、シスプラチン、ＶＰ１６、エンジイン（enedyine）、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン、メルファラン（mellphalan）、シクロホスファミド（cyclophsophamide）、クロラムブシル、ブスルファン、ロムスチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ＢＣＮＵ、又はカンプトテシンが含まれる。
【００５８】
本発明は、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む対象における免疫応答の促進方法をさらに提供し、該対象は、癌又は別の腫瘍に罹患していない。一実施形態において、該対象は、望ましくない血管形成を受けていない。
【００５９】
（３）定義
本明細書で使用されるとき、以下の用語及び語句は下記のとおり定める意味を有するものとする。特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６０】
用語「薬剤（agent)」は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生体高分子（核酸、抗体、タンパク質又はその一部分、例えばペプチドなど）、又は細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織などの生物学的材料から得られる抽出物を指して使用される。そのような薬剤の活性によって薬剤は、対象体内で局所的又は全身的に作用する一つの生物学的、生理学的、又は薬理学的活性物質（又は複数の物質）である「治療剤」として好適となり得る。
【００６１】
用語「非経口投与」及び「非経口的に投与された」は当該技術分野で認知されており、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を指し、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。
【００６２】
「患者」、「対象」、「個体」又は「宿主」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれも参照する。
【００６３】
「細胞毒性薬物又は薬剤」は、細胞、好ましくは癌細胞を破壊する能力を有する任意の薬剤である。
【００６４】
用語「薬学的に許容可能な担体」は当該技術分野で認知されており、任意の対象組成物又はその構成成分の担持又は輸送に関わる薬学的に許容可能な材料、組成物又は媒体、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入材料を指す。各担体は、対象組成物及びその構成成分と適合性があり、且つ患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；及び（２１）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合物質が含まれる。
【００６５】
用語「治療剤」は当該技術分野で認知されており、対象体内で局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的、又は薬理学的活性物質である任意の化学的部分を指す。この用語はまた、疾患の診断、治癒、緩和、治療若しくは予防における使用、又は動物若しくはヒトにおける望ましい身体的若しくは精神的発達及び／又は状態の促進における使用が意図される任意の物質も意味する。
【００６６】
病体又は疾患を「治療する」とは、病態又は疾患の少なくとも１つの症状の治癒並びに改善を指す。治療は、組成物を投与されない対象と比べて、対象における医学的状態の症状の頻度を減少させるか、又はその発現を遅延させる組成物の投与を含む。従って、癌の治療は、例えば統計的及び／又は臨床的に有意な量だけ、治療を受ける患者集団において検出可能な癌性増殖の数及び／又はサイズを未治療の対照集団と比べて減少させること、及び／又は治療集団における検出可能な癌性増殖の出現を未治療の対照集団と比べて遅延させることを含む。
【実施例】
【００６７】
本発明は以上で概略的に説明したが、以下の例を参照することによりさらに容易に理解され得る。これらの例は、単に本発明の特定の態様及び実施形態を例示するために含まれるに過ぎず、いかなる形であっても本発明の限定を意図するものではない。
【００６８】
実施例１ Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系の産生
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ形質導入を、５’ＬＴＲプロモーターにより駆動されるホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ、次にＩＲＥＳ配列及びＥＧＦＰ ｃＤＮＡであるレトロウイルスベクターにより行った。ベクターは、ｐＢＭＮ−Ｌｕｃ−Ｉ−ＧＦＰプラスミド（Magnus Essand博士、Uppsala、スウェーデンから提供いただいた）と、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を安定的に発現するＰＴ６７パッケージング細胞系（Clontech）とを使用して作製した。さらに、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を提供するｐＭ１３プラスミド（Christine Brostjan博士、Vienna、オーストリアから提供いただいた）を使用して産生効率を高めた。パッケージング細胞は、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＤＭＥＭ ＨＧ培地（PAA Laboratories）中で培養し、SuperFect試薬（Qiagen）を製造者の指示に従い使用してｐＢＭＮ−Ｌｕｃ−Ｉ−ＥＧＦＰ及びｐＭ１３プラスミドと共トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３２℃で４８時間培養した。次にレトロウイルスベクターを含む培地を回収し、完全ＲＰＭＩ培地と１：１のｖ／ｖ比で混合してＢ１６Ｆ１０細胞の形質導入に使用した。３日後、蛍光顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ（約５％）の存在から形質導入効率を評価した。ＥＧＦＰ陽性コロニーを数代継代し、MoFloフローサイトメーター（Dako Cytomation）を使用して３セットに仕分けした後、９９％超の純度のＢ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系を得た。
【００６９】
実施例２ Ｏ２圧による細胞の化学療法に対する感受性
様々なｐＯ２％下で４８時間にわたるシスプラチン（シスジクロロジアミン白金）（Sigma-Aldrich）又はパクリタキセル（Calbiochem）に対する用量反応曲線を作成した。Alamar blue試験（Biosource）によって製造者の説明どおりに細胞生存度を評価した。
【００７０】
実施例３ 実験的転移アッセイ
Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰマウスメラノーマ細胞（０．１ｍｌの生理食塩水中１０５個の細胞）を尾静脈から静脈注射した後、マウス（Janvierからの８週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６）を５日毎の１．５ｇ／ｋｇのＩＴＰＰ腹腔内注射により処置した（各処置群につき１０匹のマウス）。処置は腫瘍細胞の接種後５日目に開始した。１９日後又は２７日後にマウスを安楽死させ、肺を別途回収した。肉眼的な肺病巣を計数し、組織中のメラノーマ細胞量を定量するため化学発光アッセイ（Promega）によりルシフェラーゼを測定した。全ての動物試験手順及び動物の使用は仏国Comite d'Ethique pour l'experimentation animale, Campus CNRS d'Orleansの承認を受けた。
【００７１】
実施例４ 皮下メラノーマモデル
Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞を、２５％Matrigel（商標）（OptiMEM中５０％）中の１０５個の細胞により構成される１００μ１プラグの注射後に皮下腫瘍として成長させた。MatrigelはBD Biosciencesから、及びOptiMEMはInvitrogenから得た。接種から２５日後にマウスを安楽死させ、腫瘍及び肺を切除した。シスプラチン（生理食塩水中１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）及びパクリタキセル（２ｍｇ／ｋｇ、５０％エタノール・５０％クレモフォールＥＬ中；Sigma-Aldrich、経口）との併用でのＩＴＰＰ（生理食塩水中１００μｇ／ｋｇ〜２．０ｇ／ｋｇ、腹腔内）の時間及び用量に従う様々な処置プロトコルを適用した。処置はメラノーマ細胞接種後７日目、９日目又は１１日目に開始した。
【００７２】
実施例５ 低酸素関連、血管形成関連、及びメラノーマ関連マーカーの生化学的定量化
肺を溶解緩衝液（Active motif）中にホモジナイズした。遠心後、清澄な上清を回収した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）により総タンパク質量を測定した。肺溶解物中のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ−２及びＨＯ−１を、比色サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて製造者の指示に従い定量化した。ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ及びＴｉｅ−２のＥＬＩＳＡキットはR&Dから得た。ＨＯ−１のＥＬＩＳＡキットはTakaraから得た。
【００７３】
実施例６ 半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応分析
ＬＯＸ用のTaqmanポリメラーゼ連鎖反応プライマー配列は５’−ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡ−３’（配列番号１）及び５’−ＡＧＴＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＡＴＣＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２）であった。β−アクチン（内部標準）については、プライマー配列は５’−ＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号４）であった。増幅したｃＤＮＡバンドをImageQuantソフトウェア（Becton and Dickinson）により定量した。ＬＯＸのｍＲＮＡレベルはβ−アクチンｍＲＮＡに対して正規化した。
【００７４】
実施例７ 免疫組織学的染色
腫瘍組織を組織凍結媒体Tissue-Tek（Sakura）に包埋し、液体窒素でスナップ凍結した。凍結切片を固定化し、ＰＢＳ中ＦＣＳ５％で１：２００希釈したeBiosciencesからのマウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１、血小板／内皮細胞接着分子）に対するラットモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体、ウサギＩｇＧ抗ＳＭＡ（平滑筋アクチン）抗体（AbCAM）、又はマウスＩｇＧ２ａ抗Ｐ−糖タンパク質（Ｃ２１９）（Calbiochem）を用いて染色した。それぞれヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗ラット免疫グロブリン、ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗ウサギ免疫グロブリン又はヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗マウス免疫グロブリン（ＰＢＳ中１：２００希釈）を二次抗体として使用した。細胞核を検出するため、切片をビスベンズイミドＨ３３２５８（Sigma-Aldrich）と共にＰＢＳ中１：１０００でインキュベートした。試料をVectashield（Vector）にマウントし、Zeiss 200M倒立蛍光顕微鏡で蛍光顕微鏡検出を実施した。腫瘍切片をヘマトキシリンエオシン染色した後、腫瘍壊死を分析した。
【００７５】
実施例８ 磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
９５０ｍＴ／ｍグラジエントセットを備えた小動物用の９．４Ｔ水平マグネット（94/21 USR Bruker Biospec）によりＭＲＩアッセイを実施した。直線状の同質コイル（内径：３５ｍｍ）にマウスを置いた。動物はガス（５０％Ｎ２Ｏ：０．７ｌ／分−５０％Ｏ２：０．７ｌ／分−イソフルラン１．５％）麻酔下に維持し、温度は３６℃で一定に保ち、取得中はマウス胸部に置いた空気バルーンを使用して呼吸数をモニタすることにより麻酔の吐出量を調整した。軸面及び前額面の双方において高速低角度ショット（ＦＬＡＳＨ）シーケンスを使用して、ＭＲ血管造影による腫瘍血管新生の計測を実施した。ＦＬＡＳＨパルスシーケンスを腫瘍の血管形成の進化の研究に適合させた。この技術により同じ動物に対する腫瘍の血管樹の３Ｄ構造を経時的に追うことが可能となる。
【００７６】
実施例９ Oxylite ｐＯ２計測
oxylite 2000E PO2システム（Oxford Optronics）は、２３０μｍ径の光ファイバープローブの先端に固定化された塩化ルテニウムのＯ２依存性の蛍光寿命を測定することによりｐＯ２を計測する。蛍光パルスの寿命は先端の酸素張力に反比例する。キシラジン／ケタミンの腹腔内注射によりマウスを麻酔した後、説明どおりにoxyliteプローブ先端を腫瘍内に取り付け、酸素圧を記録した。
【００７７】
実施例１０ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは腫瘍微小環境における低酸素に選択的に拮抗する
ＩＴＰＰ−ＲＢＣが生体内で低酸素に拮抗することを確認するため、ＩＴＰＰ処置マウス及び未処置マウスにおける左脚の上に皮下移植したメラノーマ腫瘍内部の酸素張力の値の比較を実施した。酸素圧（ｐＯ２）は、光ファイバープローブの先端にある塩化ルテニウムのＯ２依存性の蛍光寿命を決定することにより計算した。蛍光パルスの寿命は、プローブの先端の酸素張力に反比例する。無処置動物の腫瘍は酸素圧値が２ｍｍＨｇを下回り（図１）、極めて低酸素性であったが、ＩＴＰＰ処置マウスの腫瘍ではｐＯ２は４０ｍｍＨｇの範囲に達した（図１Ａ）。このｐＯ２の増加はＩＴＰＰの腹腔内注射後３０分経った直後に起こり（図１Ｂ、図１Ｃ）、注射後２４時間に示されるとおり（図１Ａ）最大４０ｍｍＨｇの高レベルで少なくとも４８時間維持された。さらに、同じ動物の対応する非腫瘍性の（右）脚の筋肉において示されるとおり、平行同時測定（図１Ｃ）ではｐＯ２に対する何らの変化も、又はいかなる影響も検出されなかった一方、腫瘍ではｐＯ２レベルはＩＴＰＰ注射から３０分後に増加したことから、ＩＴＰＰ−ＲＢＣは低酸素性腫瘍を特異的に標的化した。
【００７８】
実施例１１ ＩＴＰＰ−ＲＢＣはＢ１６メラノーマ細胞による肺転移形成を妨げる
抗転移剤としてのＩＴＰＰを検証するため、マウスにメラノーマ細胞を静脈内注射することによる肺転移の「人工」モデルを使用した。Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系を使用し、これはＧＦＰ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子により形質導入されたメラノーマＢ１６Ｆ１０系であり、組織中のルシフェラーゼ活性を分析することによりメラノーマ細胞の追跡及び定量が可能である。増殖血管形成の促進及び転移発生に関してＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞系の生物学的挙動をＢ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞と比較する実験では、有意な差も、ルシフェラーゼの低酸素感受性も示されず、従ってその使用の妥当性が確認された。
【００７９】
生体内実験をメラノーマ細胞接種後２７日目まで追跡した。ＩＴＰＰ処置をＢ１６細胞注射後５日目から開始したとき、転移性結節は極めて大きく減少した。この効果は、肺におけるルシフェラーゼ活性を計測することにより（図２Ａ）定量することができた。これにより目視検査では検出不可能な微小転移の生化学的定量化が可能となった。ＩＴＰＰの作用が結節における酸素分圧の変化と関連したかどうかを調べるため、低酸素誘導因子−αサブユニットのＨＩＦ−１αアイソフォームの発現を分析した。ＨＩＦ−１αは哺乳動物細胞の酸素レベルに対する応答に決定的に重要であり、細胞のＯ２センサと見なされる。ＨＩＦ−１αが低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）に結合すると、低酸素関連遺伝子のカスケードがオンになる。図２ＢはＨＩＦ−１αレベルを示し、これは未処置メラノーマを有するマウスの肺では明確にアップレギュレーションされ、ＩＴＰＰ処置したマウスの肺では劇的に低下した。
【００８０】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルはＨＩＦ−１αに依存するとともに抗血管形成治療の主な標的であり、ＥＬＩＳＡによりアッセイしたとき、ＩＴＰＰ−ＲＢＣの影響下では対照レベルまで低下した（図２Ｃ）。これらの結果はＴｉｅ−２発現を調べることにより確認された。Ｔｉｅ−２は特異的な内皮チロシンキナーゼ受容体であり、低酸素を減少させる正常な血管の成熟化に必須である。低酸素の肺で著しく減少するこのマーカーがＩＴＰＰ処置により再誘導されたことから（図２Ｄ）、転移性結節における血管が組織化されない血管形成を受け、及び血管形成がＩＴＰＰ−ＲＢＣにより制御されたとき、より成熟した血管がＴｉｅ−２マーカーを再発現したことが示される。ＩＴＰＰ処置後、ＨＩＦ−１αにより誘導される細胞保護酵素であるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）も無処置マウスと比較して著しく減少した（図２Ｅ）。ＨＯ−１の過剰発現により、メラノーマ細胞の生存能力、細胞増殖及び血管形成能が高くなり、転移が増加し、及び対照の腫瘍を有するマウスの生存率が低下する。癌細胞の浸潤過程に関わり、且つ低酸素により制御される酵素であるリシルオキシダーゼの半定量的ＰＣＲ ｍＲＮＡ分析に関するさらなる研究（図２Ｆ）により、「低いＯ２親和性ＲＢＣ」をもたらすＩＴＰＰ処置の有益な作用も実証された。
【００８１】
実施例１２ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは同所性メラノーマ肺転移を根絶する
原発腫瘍皮下移植後のＩＴＰＰ−ＲＢＣの転移に対する効果を評価した。腫瘍接種後７日目に開始した短期処置（３回のＩＴＰＰ注射、５日間隔）では、ＩＴＰＰは肺転移を大幅に減少させた（図３Ａ）。ＩＴＰＰ処置の７日目での開始が、短期投与プロトコル及び慢性投与プロトコル（７日目、１２日目、１６日目、１８日目、１９日目）の双方で最適であった。９日目又は１１日目の開始はそれより有効性が低く、慢性投与では肺転移の促進さえ生じた（図３Ａ）。この観察結果の理由については不明であるものの、血管形成の完全な阻害をもたらす慢性投与によってさらに腫瘍の表現型が変わり、侵襲性及び転移が増加した可能性がある。
【００８２】
実施例１３ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは腫瘍内血管正常化を誘導する
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のＭＲＡ（磁気共鳴血管造影）を腫瘍血管樹の３Ｄ構造追跡用に適応させることにより、腫瘍における微小循環の構造的な変化を評価した。
【００８３】
メラノーマ発症の２１日後、腫瘍は典型的な無秩序な血管構造を示した（図３Ｂａ）。９日目及び１４日目にＩＴＰＰで処置したマウスでは、１８日目及び１９日目におけるさらなる反復処置後に血管系は密度が低くなり、顕著に正常化した。腫瘍内を調べると、末梢に多数の血管が明らかとなった；抗平滑筋抗原抗体により標識された、血管を取り囲む周皮細胞の動員により正常化が示された一方（図３Ｂｂ）、無処置腫瘍（図３Ｂａ、図３Ｂｂ）ではそのような秩序化は認められなかった。この「正常化」に向かう傾向は、腫瘍サイズの著しい低減を伴った（図３Ｂａ）。
【００８４】
同じ移植原発腫瘍において、薬剤耐性の原因である多剤排出ポンプに対するＩＴＰＰ処置の効果について調べた。ＩＴＰＰはＰ−糖タンパク質薬物排出ポンプを下方制御する。この効果が、薬物の有効細胞内濃度の低下に起因する化学的耐性及び薬物−標的相互作用の障害に拮抗し得る。従って、ＩＴＰＰの誘導による血管の正常化は腫瘍における薬物排出ポンプの低下と相関を有し、従って薬物の腫瘍細胞に対する効力を増加させ得る。
【００８５】
実施例１４ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは同所性メラノーマ肺転移を根絶し、化学療法にメトロノーム的相乗作用を及ぼす
ＩＴＰＰがＲＢＣによる低酸素組織への酸素送達を向上させる能力を有することから、パクリタキセル及びシスプラチンなどの薬物によるメラノーマ処置の効力に対するその効果について調べた。酸素正常状態、低酸素状態及び再酸素化後のＢ１６メラノーマ細胞に対する薬物の効果を、初めにインビトロで試験した。図４は、Ｂ１６細胞に対する薬物の細胞毒性が、酸素張力の低下に伴い低下することを示している（１％又は１１％）。しかしながら、細胞を再酸素化すると（１％から１１％及び２０％へ）、薬物の細胞毒性はｐＯ２レベルに依存してある程度まで再び確立された（図４Ａ、図４Ｂ）。腫瘍細胞におけるｐ−糖タンパク質の生体内調節と比較したこれらのデータは、低酸素により誘導されるＭＤＲ促進によって調節される対薬物感受性が、ＩＴＰＰにより誘導される腫瘍再酸素化によって逆転し得ることを示唆している。
【００８６】
ＩＴＰＰ処置をインビボでパクリタキセル及びシスプラチンと組み合わせた。ＩＴＰＰ、パクリタキセル及びシスプラチンによる同時処置後、肺転移は劇的に増加し（図５Ａ）、プロファイルはＩＴＰＰ単独による慢性処置で観察されるもの（上記を参照）と同様であった。パクリタキセル及びシスプラチンはそれ自体が内皮細胞の成長を阻害し（図４Ｃ）、これらの化合物のインビボでの抗血管形成作用が裏付けられる。腫瘍血管新生を破壊するそのような抗血管形成治療は、低酸素耐性腫瘍細胞の選択により転移性浸潤を促進することが認められており、従って図３に示されるデータが実証され、及び腫瘍血管新生の破壊又は除去よりむしろ血管正常化が、より適切且つ潜在的に有益な癌治療手法と考えられることを示している。
【００８７】
発症した固形腫瘍（図５Ｂ）及び肺転移（図５Ａ）の双方の処置に対するＩＴＰＰ及び薬物の注射スケジュールの影響を試験した。１４日目までＩＴＰＰ単独で処置したマウスを、１８日目及び１９日目にＩＴＰＰ単独に再び曝露して血管の正常化を試み、続いて２０日目及び２１日目にシスプラチン＋パクリタキセルで処置した後、２５日目に分析した。結果は目覚しいものであった：同時処置と正反対に肺転移が根絶されたが（図５Ａ）、特定の癌療法用のプロトコル設定におけるメトロノーム式パラメータの重要性が確認された。実際、特異的内皮マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）染色による腫瘍微小血管の分析は、対照における不規則な形状及び内皮細胞の顕著なＣＤ３１染色を伴う構造化が不十分な多量の微小血管（図５Ｂａ）と比較して、化学療法薬による処置後、ＩＴＰＰ処置動物における腫瘍内微小血管は密度の低下を示した。さらに図５Ｂには、ＩＴＰＰによる定期的治療を１８日目及び１９日目に延長し、従って２０日目及び２１日目の薬物処置前における血管及び酸素張力の正常化を目標とすることにより、細胞毒性が強力に促進したことが示され、これは、拡散したＣＤ３１陽性に対応し（図５Ｂａ３）、かつ、Ｈ＆Ｅ染色（図５Ｂａ３及び図５Ｂｂ３）により表され、且つ腫瘍サイズの低下及び壊死誘導により確認される壊死範囲を示す２５日目の壊死によって示されるとおりである。これは化学療法と併用したＩＴＰＰ治療の強力な効果を示している。
【００８８】
実施例１５ ＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用治療は動物モデルにおいて強力な相加作用を示す
ラット膵腫瘍モデル及びヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植マウスモデルの双方において、ＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用処置は強力な相加作用を示した。初めに双方のモデルにおいて、ゲムシタビン及びプラセボの効果と比較したＩＴＰＰ処置単独での効果を調べた（図６及び図８）。次に、ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、双方のモデルにおけるＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用処置の効果を調べた。
【００８９】
ラット膵腫瘍モデルでは、併用処置群のラットは、１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。ゲムシタビン処置群のラットは、１６日目、１８日目、及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）単独の投与を受けた。対照群のラットは処置しなかった。被験動物の生存率は併用処置群において大幅に亢進した。動物生存プロファイルはまた、ゲムシタビンに対する用量依存性も実証した（図７）。
【００９０】
異種移植腫瘍モデルでは、併用処置群のマウスは、１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。ゲムシタビン処置群のマウスは、１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。対照群のマウスは処置しなかった。併用処置はゲムシタビン処置単独と比較したとき動物生存指数を亢進することを示したが、しかしゲムシタビンに対する用量依存性はなかった（図９）。
【００９１】
ＯＸＹ１１１Ａ及び／又はゲムシタビンで処置した膵管腺癌動物の生存期間中央値を追跡し、以下の表１に要約した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
ラット膵腫瘍モデルにおいて、ＩＴＰＰ、ゲムシタビン又はプラセボの処置後のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、カスパーゼ−３及びβ−アクチンの発現をさらに調べた（図１０）。
【００９４】
実施例１６ ＩＴＰＰ治療は免疫細胞の腫瘍への浸潤及び腫瘍侵襲を促進する
Ｂ１６腫瘍モデルにおいて、ＯＸＹ１１１Ａを７日目、８日目、１４日目、１５日目、２１日目、２２日目、２９日目及び３０日目に腹腔内注射した後、ＯＸＹ１１１Ａ処置によりＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージのＢ１６腫瘍への浸潤が大幅に促進したことが実証された（図１１）。
【００９５】
同じモデルにおいて、ＩＴＰＰ処置によりＣＤ４９ｂ ＮＫ細胞の浸潤、Ｂ１６腫瘍中のＣＤ３１ ＥＣ細胞の存在量、及びメラノーマＢ１６腫瘍におけるＮＫ細胞の侵襲も大幅に促進された（図１２及び図１３）。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年７月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２２３，５８３号の利益を主張し、その教示は全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国世界における主な死亡原因のうちの一つであり、米国だけでもその死者は毎年５０万人を超える。米国では毎年１００万人超が癌と診断され、総じて一生涯のうちに何らかの形の癌を発症する人は３人に１人より多いと推定される。癌死亡率の８５％超を固形腫瘍が占める。
【０００３】
血管形成は、数多くの異なるタイプの癌と関連付けられている。血管形成は血管形成刺激因子及び阻害因子の高度に制御された系によって調節される。特定の疾患状態では血管形成の調節が変化し、多くの場合、疾患に付随する病理学的な損傷は、調節されない血管形成に関連する。調節される血管形成及び調節されない血管形成の双方とも、同様の方法で進行すると考えられている。基底膜に取り囲まれている内皮細胞及び周皮細胞が毛細血管を形成する。血管形成は、内皮細胞及び白血球が放出する酵素による基底膜の浸食から始まる。血管管腔の内側を覆う内皮細胞は、次に基底膜から突き出る。内皮細胞が血管形成刺激物質により誘導され、浸食された基底膜を通って遊走する。遊走細胞は親血管から分かれ出て「出芽」を形成し、ここで内皮細胞は有糸分裂を受けて増殖する。内皮細胞出芽は互いに合流して毛細血管ループを形成し、新しい血管を作り出す。
【０００４】
多くの疾患状態、腫瘍転移、及び内皮細胞による異常成長では、持続的な制御されない血管形成が起こる。制御されない血管形成が存在する種々の病理学的疾患状態は、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患として分類されている。
【０００５】
腫瘍成長が血管形成依存性であるという仮説は、１９７１年に初めて提唱された。簡潔に言えば、この仮説は「腫瘍の「取り込み（take）」が起こると、腫瘍細胞集団が増加するごとに先行して腫瘍に集中した新しい毛細血管が増加しなければならない」と述べる。腫瘍「取り込み」は、現在のところ、数立方ミリメートルの容積を占め、且つ数百万細胞以下の腫瘍細胞の集団が既存の宿主微小血管で生き残ることができる腫瘍成長の前血管段階を示すものと理解されている。この段階を越えて腫瘍容積が拡大するには新毛細血管の誘導が必要となる。例えば、マウスにおける初期前血管段階の肺微小転移は、組織切片の高倍率顕微鏡検査による以外は検出不能と思われる。
【０００６】
血管形成は、固形腫瘍及び血液系腫瘍を含む数多くの異なるタイプの癌と関連付けられている。血管形成が関連付けられている固形腫瘍としては、限定はされないが、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、及び骨肉腫が含まれる。血管形成はまた、血液系腫瘍、例えば白血病など、白血球細胞の抑制のない増殖が起こり、通常は貧血症、血液凝固能の低下、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の腫脹を伴う骨髄の様々な急性又は慢性新生物疾患の任意のものとも関連付けられる。血管形成は、白血病腫瘍及び多発性骨髄腫疾患を引き起こす骨髄の異常において役割を果たすと考えられている。
【０００７】
上述のとおり、いくつかの種類の証拠から、血管形成が固形腫瘍の成長及び持続並びにその転移に不可欠であることが示される。血管形成が刺激されると、腫瘍は、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）及び血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）を含めた様々な血管形成因子の産生をアップレギュレーションする。
【０００８】
血管形成の制御におけるＶＥＧＦの役割は、重点的な研究対象となっている。ＶＥＧＦは生理学的血管形成における決定的な律速段階を表すが、腫瘍成長に関連する血管形成などの病理学的血管形成においても重要であるものと思われる。ＶＥＧＦは、血管漏出を生じさせる能力に基づき血管透過性因子としても知られる。いくつかの固形腫瘍は有り余る量のＶＥＧＦを産生し、それが内皮細胞の増殖及び遊走を刺激して、それにより新血管新生が誘導される。ＶＥＧＦ発現は種々のヒト癌の予後に大きい影響を与えることが示されている。ＶＥＧＦ遺伝子の発現の制御には腫瘍の酸素張力が重要な役割を担う。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現は、様々な病態生理学的状況下で低酸素張力に曝露されることで誘導される。
【０００９】
成長する腫瘍は低酸素により特徴付けられ、低酸素はＶＥＧＦの発現を誘導し、転移性疾患の発生の予測因子ともなり得る。また、通常の血管と異なり、腫瘍血管系は異常な組織化、構造、及び機能を有することも認識されている。腫瘍血管はまた漏出性が高いことも認められ、血流が不均一で、多くの場合に低下する。
【００１０】
癌細胞が成長及び転移するには血管を利用できる必要があるため、血管形成の阻害は癌及び腫瘍の治療に希望を与えるものと考えられる。しかしながら、現在まで抗血管形成戦略が探求されてきたものの、薬剤耐性を有する極めて侵攻性の高い転移性癌細胞の選択が起こるため、継続的な治療利益は提供されていない。腫瘍血管新生を破壊するそのような抗血管形成治療薬は、ある場合には転移性浸潤を促進させることが認められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、腫瘍血管系を制御することのできる実質的に非毒性の組成物及び方法が必要とされている。また、改良された癌治療も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
実施例に提供するデータは、化学療法と組み合わせた血管正常化が潜在的に有益な癌治療手法であることを示す。ヘモグロビンのアロステリックエフェクターであるイノシトール三リン酸（ＩＴＰＰ）は酸素放出を促進し、低酸素の作用に拮抗し、及びインビトロで血管形成を阻害する。マウスモデルでは、マウスメラノーマ細胞を静脈注射することにより誘導した肺転移が赤血球中ＩＴＰＰ（ＩＴＰＰ−ＲＢＣ）により低減する。ＩＴＰＰは、化学療法剤のシスプラチン及びパクリタキセルを伴うと、原発性メラノーマの成長及び肺転移を阻害した。膵臓腺癌のラットモデルでは、ＩＴＰＰはゲムシタビンとの併用で被験動物の生存率の大幅な上昇を引き起こし、強力な相加作用を示した。ＩＴＰＰは、腫瘍へのマクロファージ及びナチュラルキラー細胞の浸潤も大幅に促進する。
【００１３】
本発明は、癌の治療方法であって、その必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程と；腫瘍における部分的血管正常化後に対象に治療有効量の化学療法剤を投与する工程とを含む方法を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明は、イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と、パクリタキセル、シスプラチン及びゲムシタビンから選択されるものなどの化学療法剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、対象において癌を治療するための治療レジメンであって、治療有効量のＩＴＰＰと、パクリタキセル、シスプラチン及びゲムシタビンから選択されるものなどの化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む治療レジメンを提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、対象において癌を治療するための治療レジメン又は方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む治療レジメン又は方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量のＩＴＰＰを投与することによる、１つ又は複数の化学療法剤に耐性を有する癌の治療方法を提供する。特定の実施形態において、癌はパクリタキセル及び／又はシスプラチンに耐性を有する。
【００１９】
本発明はまた、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法も提供し、該過剰増殖性病態は癌ではなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない。
【００２０】
本発明はさらに、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む対象における免疫応答の促進方法を提供し、該対象は癌又は別の腫瘍に罹患していない。
【００２１】
さらに、本発明は、医学における本明細書に記載される組成物の使用、及び本明細書に記載される病態の治療用薬剤の製造における本明細書に記載される組成物の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】発症させた皮下メラノーマ腫瘍におけるＩＴＰＰ−赤血球（ＲＢＣ）により誘導された選択的酸素圧上昇を示す。（Ａ）１４日前に移植した未処置腫瘍と、１２日目及び１３日目にＩＴＰＰで処置した同じ腫瘍との比較。ＩＴＰＰ注射２４時間後のｐＯ２レベルに留意されたい。（Ｂ）ＩＴＰＰの腹腔内注射前及び注射後の皮下移植腫瘍におけるｐＯ２の経時記録。処置３０分後の酸素圧上昇に留意されたい。（Ｃ）ＩＴＰＰは筋肉内ｐＯ２には影響を及ぼさない。ＩＴＰＰの腹腔内注射により低酸素性皮下腫瘍におけるｐＯ２（下側の曲線）は上昇するが、健常な筋肉におけるｐＯ２（上側の曲線）は影響を示さない。データは群当たり１０匹のマウスで実施した１０例の実験うちの代表的な１つによるもの。
【図２】ＩＴＰＰ−ＲＢＣによる酸素供給が実験的メラノーマモデルにおいて肺転移を阻害し、低酸素により誘導された遺伝子カスケードを逆転させることを示す。メラノーマ接種後２７日目における健常対照（白色）と比較したメラノーマを有する未処置マウス（灰色）及びＩＴＰＰ処置マウス（黒色）の肺溶解物中のタンパク質及び酵素活性の計測値：（Ａ）ルシフェラーゼアッセイによる肺転移定量、（Ｂ）ＨＩＦ−１α発現；（Ｃ）ＶＥＧＦ発現、（Ｄ）Ｔｉｅ−２、及び（Ｅ）ＨＯ−１発現、メラノーマ細胞注射後１９日目のＥＬＩＳＡにより評価。（Ｆ）ｍＲＮＡ ＬＯＸ含量、評価。データは５例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり８〜１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。
【図３】皮下メラノーマを有するマウスにおいてＩＴＰＰ処置スケジュールが抗転移活性、血管正常化、及び多剤耐性細胞レベルの低減に影響を及ぼし得ることを示す。（Ａ）２０日目、２１日目における薬物適用前のＩＴＰＰ処置の開始時期及び処置期間の効果。７日目に開始した場合ＩＴＰＰにより転移が減少し、それより後になると効果が少なくなり、慢性処置時は転移が増加する。ルシフェラーゼ分析は２５日目であった。データは１０例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。（Ｂ）以下によって２０日目に評価した腫瘍血管正常化に対するＩＴＰＰ処置の効果：（ａ）ＩＴＰＰ処置マウスと比較した、皮下未処置腫瘍における血管構造の磁気共鳴イメージング。無処置腫瘍の組織化されていない不連続な血管（矢印）と比較して、ＩＴＰＰ処置（９日目、１４日目、１８日目、１９日目）後の十分に組織化された血管系（矢印）に留意されたい。（ｂ）対象と比較した、正常化した血管の周囲の周皮細胞の抗ＳＭＡ抗体による免疫染色。
【図４】低酸素時及び再酸素化時におけるマウスメラノーマ細胞及び肺内皮のマウスのインビトロでの化学感受性を示す。化学療法薬：（Ａ）パクリタキセル；（Ｂ）シスプラチンに対するメラノーマ細胞の感受性は低酸素により打ち消される。これは細胞を再酸素化すると戻る。（Ｃ）シスプラチンに対する内皮細胞感受性の評価。
【図５】腫瘍酸素化及び血管正常化によりメラノーマにおける化学療法が向上することを示す。（Ａ）ＩＴＰＰ、パクリタキセル及びシスプラチンの組み合わせにより、処置を経るに従い転移が減少する。薬物を再注射（２０日目及び２１日目）する前にＩＴＰＰを再注射すると（１８日目、１９日目）、肺転移の根絶が達成された。（ａ）＝未処置；（ｂ）＝ＩＴＰＰ ７日目、１２日目、１６日目；（ｃ）＝「ｂ」＋薬物 ７日目、１２日目、１６日目；（ｄ）＝「ｃ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目；（ｅ）＝ＩＴＰＰ ９日目、１４日目；（ｆ）＝「ｅ」＋薬物 ９日目、１４日目；（ｇ）＝「ｆ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目；（ｈ）＝ＩＴＰＰ １１、１６；（ｉ）＝「ｈ」＋薬物 １１日目、１６日目；（ｊ）＝「ｉ」＋ＩＴＰＰ １８日目、１９日目＋薬物 ２０日目、２１日目。ルシフェラーゼ活性は２５日目に分析した。データは１０例の実験のうちの代表的な１つによる群当たり１０匹の別個のマウスから計算した平均値である。（Ｂ）ＩＴＰＰにより誘導される正常化の薬物化学治療活性に対するメトロノーム併用効果。２群のマウスをＩＴＰＰにより、９日目、１４日目又は９日目、１４日目、１８日目、１９日目のいずれかに処置した。２０日目、２１日目に、２群のＩＴＰＰ処置マウスにパクリタキセル及びシスプラチンを投与した。２５日目に腫瘍を染色した。（ａ）ａ２及びａ３におけるＩＴＰＰ及び薬物処置マウスと比較した、無処置腫瘍における（ａ１）ＣＤ３１による血管の免疫染色 ＣＤ３１＋染色は壊死部分に対応する。（ｂ）（ａ）のように処置したマウスの腫瘍のヘマトキシリン−エオシン染色。処置後の腫瘍の有効な壊死性破壊（ａ３、ｂ３）に留意されたい。データは群当たり１０匹のマウスに対して行われた実験についての代表である。
【図６】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、膵腫瘍ラットの生存に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。ＩＴＰＰ処置群では、膵腫瘍ラットを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回ＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、膵腫瘍ラットを１６日目、１８日目、及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図７】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ヘキサナトリウムミオイノシトールトリスピロリン酸（ＯＸＹ１１１Ａ）をゲムシタビンと併用した膵腫瘍ラットの生存に対する効果を示す。併用処置群では、膵腫瘍ラットを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、膵腫瘍ラットを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図８】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植ヌードマウスの生存に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。ＩＴＰＰ処置群では、腫瘍異種移植マウスを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回ＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、腫瘍異種移植マウスを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図９】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、ＩＴＰＰをゲムシタビンと併用したヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植ヌードマウスの生存に対する効果を示す。併用処置群では、腫瘍異種移植マウスを１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ゲムシタビン処置群では、腫瘍異種移植マウスを１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照群の動物は処置しなかった。
【図１０】ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、膵腫瘍ラットにおけるＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、カスパーゼ−３及びβ−アクチンの発現に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。
【図１１】Ｂ１６腫瘍へのＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージ浸潤に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。７日目、８日目、１４日目、１５日目、２１日目、２２日目、２９日目及び３０日目にＯＸＹ１１１Ａを腹腔内注射した。３１日目にＢ１６腫瘍の分析を実施した。（ａ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｂ）及び（ｃ）ＩＴＰＰ処置腫瘍のＣＤ６８染色はＢ１６腫瘍へのＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージ浸潤を示す。
【図１２】ＣＤ４９ｂナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の浸潤及びＢ１６腫瘍中のＣＤ３１内皮（ＥＣ）細胞の存在に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。（ａ）〜（ｃ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｄ）〜（ｆ）ＩＴＰＰで処置したＢ１６腫瘍。緑色の矢印は浸潤しているＮＫ細胞を示す；赤色の矢印は血管壁を示す。
【図１３】メラノーマＢ１６腫瘍のＮＫ細胞浸潤に対するＩＴＰＰ処置の効果を示す。Ｂ１６腫瘍細胞はＢ１６Ｆ１０ＤＡＰＩと命名した；ＮＫ細胞は抗ＣＤ４９ｂＦＩＴＣ１と命名した；及び血管内皮細胞は抗ＣＤ３１ＴＲＩＴＣと命名した。（ａ）未処置Ｂ１６腫瘍；（ｂ）及び（ｃ）ＩＴＰＰで処置したＢ１６腫瘍。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１）本発明の組成物
本発明において有用な組成物は、イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）の酸及び塩を含む；ＩＴＰＰは本明細書では陰イオンとして認識される。用語イノシトールトリスピロリン酸は、イノシトール六リン酸トリスピロリン酸としても知られ、３個の内部ピロリン酸環を含むイノシトール六リン酸を指す。ＩＴＰＰのカウンターパート種は本明細書では対イオンと称し、ＩＴＰＰの対イオンとの組み合わせを本明細書では酸又は塩と称する。本発明は、純粋なイオン性である対に限定されるものではない。実際、当該技術分野では、対を生成するイオンはしばしば、対の２つの成分間にある程度の共有結合又は配位結合の特徴を示すことが知られている。本発明の組成物のＩＴＰＰ酸及び塩は単一の種類の対イオンを含んでもよく、又は混成の対イオンを含有してもよく、及び任意選択によりＩＴＰＰがその一つである陰イオンの混合物を含有してもよい。組成物は、任意選択により、クラウンエーテル、クリプタンド、及び対イオンのキレート化又は他の錯化能を有するその他の種を含んでもよい。組成物は同様に、任意選択により、酸性大員環、又は水素結合若しくは他の分子引力を介してＩＴＰＰの錯化能を有するその他の種を含んでもよい。ＩＴＰＰの酸及び塩の作製方法は、Nicolau et al.に対し発行された米国特許第７，０８４，１１５号（この内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載される。
【００２４】
本発明における使用が企図される対イオンとしては、限定はされないが、以下のものが含まれる：プロトンならびに重水素及びトリチウムの対応するイオンを含む陽イオン性水素種；リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、及び銅（Ｉ）を含む一価の無機陽イオン；ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、マンガン（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、銅（ＩＩ）及び鉄（ＩＩ）を含む二価の無機陽イオン；鉄（ＩＩＩ）を含む多価の無機陽イオン；アンモニウム、シクロヘプチルアンモニウム、シクロオクチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロヘキシルアンモニウム、及び他の有機アンモニウム陽イオンを含む四級窒素種；トリエチルスルホニウム及び他の有機スルホニウム化合物を含むスルホニウム種；ピリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、キヌクリジニウム、ピロリウム、トリピペラジニウム、及び他の有機陽イオンを含む有機陽イオン；オリゴマー、ポリマー、ペプチド、タンパク質、正電荷イオノマー、及びポリマーのペンダント基、鎖末端、及び／又は骨格にスルホニウム、四級窒素、及び／又は荷電有機金属種を有する他の高分子種を含むポリマー性陽イオン。例示的なＩＴＰＰ塩は、ＩＴＰＰの一カルシウム四ナトリウム塩、又は１５〜２５ｍｏｌ％のカルシウムと７５〜８５ｍｏｌ％のナトリウムとを含有するＩＴＰＰナトリウムとＩＴＰＰカルシウムとの混合物である。
【００２５】
本発明で用いられるＩＴＰＰの好ましい異性体は、シス−１，２，３，５−トランス−４，６−シクロヘキサンヘキシルであるミオイノシトールである；しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。従って、本発明は、天然に存在するシロ−、カイロ−、ムコ−、及びネオ−イノシトール異性体のそれぞれのトリピロリン酸、並びにアロ−、エピ−、及びシス−イノシトール異性体のものを含む、ＩＴＰＰの任意のイノシトール異性体の使用を企図する。
【００２６】
ＩＴＰＰは、エステルの酵素切断によるか、又はトリルスルホニル基などの脱離基の置換によるなどしてプロドラッグからインビボで形成され得ることが企図される。
【００２７】
ＩＴＰＰは、抗血管形成特性及び抗腫瘍特性を呈し、血管形成又は増殖に関連する事象、病態又は物質の調節に有用である。本明細書で使用されるとき、血管形成又は増殖に関連する事象、病態、又は物質の調節とは、任意の種類の因子、病態、活性、指標、化学物質、又は化学物質、ｍＲＮＡ、受容体、マーカー、メディエーター、タンパク質、若しくは転写活性などの組み合わせにおける任意の定性的又は定量的な変化であって、血管形成又は増殖に関連し得るか又は関連すると考えられ、及び本発明の組成物の投与によりもたらされる変化を指す。
【００２８】
ＩＴＰＰはまた、腫瘍微小環境のｐＯ２を促進し、転移及び新生物性の血管新生を阻害する。低酸素性腫瘍細胞は、多くの場合に浸潤性がより高く、且つアポトーシス耐性を有する細胞であり、従来の化学療法に耐性を有する傾向がある。従って、特定の実施形態では、化学療法剤による治療の効力をＩＴＰＰとの併用治療により増加させる。さらに、いくつかの態様では、ＩＴＰＰ治療が腫瘍微小血管の「正常化（normalization)」を誘導する。
【００２９】
ＩＴＰＰはさらに、腫瘍における薬物排出ポンプの数を減少させ、従って特定の実施形態において、１つ又は複数の化学療法剤に耐性を有する癌を治療し、及び／又は腫瘍細胞に対する化学療法剤の効力を増加させる。
【００３０】
本発明は、ＩＴＰＰと化学療法剤とを含む新規医薬組成物を提供する。本発明に好適な化学療法剤としては、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
【００３１】
一実施形態において、化学療法剤はパクリタキセルなどの微小管標的薬剤である。別の実施形態において、化学療法剤は白金系薬剤（例えば、シスプラチン）又はドキソルビシンなどのＤＮＡ挿入剤である。さらなる実施形態において、化学療法剤はゲムシタビン又はカペシタビンなどのヌクレオシド代謝阻害薬である。
【００３２】
特定の実施形態において、組成物の化学療法剤は治療用量以下又は治療量以下である。用語「治療用量以下又は治療量以下」は、単独の物質として治療効果を実現するために投与が必要な薬理活性物質の用量又は量を下回る当該物質の用量又は量を意味する。そのような物質の治療用量以下とは、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて異なってもよく、当業者により容易に決定され得る。一実施形態において、治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は、化学療法剤の認可されている総用量、例えばその化学療法剤についてのU.S. Food & Drug Administration承認済みラベル情報に提供される用量の９０％未満である。他の実施形態において、治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は認可されている総用量の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又はさらには１０％未満、例えば、２０％〜９０％、３０％〜８０％、４０％〜７０％又は本明細書に提供される値の範囲内の別の範囲である。
【００３３】
本発明はまた、ＩＴＰＰと化学療法剤とを含む癌治療用キットも提供する。このキットは、以下で考察するとおりの、本発明の治療レジメン又は方法におけるＩＴＰＰ及び化学療法剤の使用についての指示書を提供し得る。このキットに好適な化学療法剤としては、上述のものが含まてもよい。本発明のキットには治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤が使用されてもよい。
【００３４】
本発明は、ＩＴＰＰの化合物若しくは薬物又はそのプロドラッグから構成されるインプラント又は他の装置も企図し、該薬物又はプロドラッグは、徐放用の生分解性又は非生分解性ポリマーに製剤化される。非生分解性ポリマーは、ポリマーそのものの分解はなしに、薬物を物理的又は機械的プロセスによって制御された形で放出する。生分解性ポリマーは、体内の自然の過程により徐々に加水分解又は可溶化されるように設計され、混和された薬物又はプロドラッグの漸進的な放出を可能にする。薬物又はプロドラッグはポリマーに化学的に連結されてもよく、又は混和によってポリマー中に組み込まれてもよい。生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーの双方、及び放出制御のため薬物をポリマーに組み込む方法は当業者に周知である。そのようなポリマーの例は、全体が参照により援用される、Brem et al., J. Neurosurg 74: pp. 441-446 (1991)などの多くの文献に見出すことができる。これらのインプラント又は装置は、送達が所望されるところに近接して、例えば腫瘍の部位に植え込むことができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、以上に参照される１つ又は複数の疾患状態において価値を有する１つ又は複数の薬理作用物質を含有してもよいし、又はそれと同時投与（同時に又は逐次的に）されてもよい。
【００３６】
製剤は、概してRemington's Pharmaceutical Sciences 17th editionなどの標準的なテキストに従い調製及び投与され得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、従来の方法で１つ又は複数の生理学的又は薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を使用して製剤化され得る。本発明の組成物及びその薬学的に許容可能な塩及び溶媒和物は、例えば、注射（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内）、吸入又は吹込（口又は鼻からのいずれか）又は経口、口腔、舌下、経皮、経鼻、非経口又は直腸投与による投与用に製剤化され得る。一実施形態において、組成物は、標的細胞が存在する部位に、すなわち特定の組織、臓器、又は体液（例えば、血液、脳脊髄液等）の中に局所投与され得る。成分、特に上述のものに加え、本発明の製剤は、当該の製剤タイプを考慮した当該技術分野で標準的な他の作用剤を含み得ることは理解されなければならず、例えば経口投与に好適なものとしては、香味剤又はその他の、口当たりを良くし、且つ嚥下を容易にする作用剤が含まれ得る。
【００３７】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、又は錠剤などの各々が所定量の有効成分を含む個別の単位として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油液体エマルジョン又は油中水エマルジョン等として提供され得る。錠剤は、任意選択により１つ又は複数の補助成分を伴い、圧縮又は成形により作製され得る。錠剤は任意選択によりコーティングされるか、又は割線が入れられてもよく、中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００３８】
口での局所投与に好適な製剤としては、風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に成分を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアの中に有効成分を含むトローチ；及び好適な液体担体中に投与成分を含む洗口剤が含まれる。
【００３９】
皮膚に対する局所投与に好適な製剤は、薬学的に許容可能な担体中に投与成分を含む軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとして提供され得る。別の局所送達系は、投与成分を含む経皮パッチである。
【００４０】
直腸投与用の製剤は、例えばカカオ脂及び／又はサリチル酸を含む好適な基剤を含む坐薬として提供され得る。
【００４１】
経鼻投与に好適な製剤としては、担体が固体の場合、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗末が含まれ、これは嗅ぎ薬を嗅ぐ方法で；すなわち、鼻を塞ぐように保持された粉末の容器から鼻道を介して急速吸入することにより投与される。担体が液体の場合、例えば鼻腔内スプレー又は点鼻液などの投与に好適な製剤は、有効成分の水性又は油性溶液を含む。
【００４２】
経膣投与に好適な製剤は、有効成分に加え、当該技術分野において適切であることが公知の担体などの成分を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤として提供され得る。
【００４３】
吸入に好適な製剤は、有効成分に加え、当該技術分野において適切であることが公知の担体などの成分を含有するミスト、ダスト、粉末又はスプレー製剤として提供され得る。
【００４４】
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を目的の被投与者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供されてもよく、及び例えば注射用水などの滅菌液体担体を使用直前に加えるだけで十分なフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保存されてもよい。即時調合注射溶液及び懸濁液は、先述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【００４５】
本発明の一部として企図される製剤には、本明細書によって全体として参照により援用される米国特許出願公開第２００４／００３３２６７号に開示される方法により作製されるナノ粒子製剤が含まれる。特定の実施形態において、本発明の化合物の粒子は、光散乱法、顕微鏡法、又は当業者に公知の他の適切な方法により計測したとき、約２ミクロン未満、約１５００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、又は約５０ｎｍ未満の有効平均粒度を有する。
【００４６】
（２）本発明の治療レジメン（treatment regimen)及び方法
ＩＴＰＰは腫瘍内血管正常化を誘導する。ＩＴＰＰにより誘導される血管正常化は、放射線及び細胞毒性薬物の双方に対する腫瘍細胞の耐性並びに腫瘍転移の主な理由である腫瘍低酸素に拮抗する。
【００４７】
一態様において、本発明は、対象における癌又は腫瘍を治療するための治療レジメン又は方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む方法を提供する。語句「治療有効量」は、典型的には治療レジメン又は方法との関連において妥当なベネフィット／リスク比で、何らかの所望の局所的な又は全身性の作用を生じるそのような物質、組成物、キット又は治療レジメンの全体としての量を意味する。そのような物質の治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて異なってもよく、当業者により容易に決定され得る。例えば、本明細書に記載される特定の組成物は、そのような治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で所望の作用を生じるのに十分な量で投与され得る。
【００４８】
本発明の方法における使用に適した好適な化学療法剤としては、上述のものが含まれ得る。特定の実施形態において、化学療法剤は、パクリタキセル、シスプラチン又はゲムシタビンである。
【００４９】
例示的な癌としては、限定はされないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫を含む血液新生物；腺癌及び扁平上皮癌を含む癌腫；メラノーマ並びに肉腫が含まれる。癌腫及び肉腫は、しばしば「固形腫瘍」とも称される。本発明の方法により治療され得るタイプの腫瘍は、好ましくは、限定はされないが、肉腫、癌腫を含む固形腫瘍、並びにその他の、限定はされないが、生殖細胞腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵癌、胃癌、肝癌、結腸癌、メラノーマ、腎癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、直腸癌、子宮内膜癌、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、神経芽細胞腫、中皮腫、副腎皮質癌、上皮癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、非横紋筋肉腫性軟部組織肉腫（non-rhabdomyosarcome soft tissue sarcoma）、骨肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍（peripheral primative neuroectodermal tumor）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、及びウィルムス腫瘍を含む固形腫瘍癌である。
【００５０】
一実施形態において、ＩＴＰＰと化学療法剤とが同時に投与される。特定の実施形態において、ＩＴＰＰと、化学療法剤であるゲムシタビンなどのヌクレオシド代謝阻害薬とが同時に投与される。別の具体的な実施形態において、癌は膵癌である。特定の実施形態において、癌はメラノーマである。
【００５１】
別の実施形態において、ＩＴＰＰと化学療法剤とは逐次的に投与される。例えば、ＩＴＰＰは化学療法剤の投与前に投与される。好ましい実施形態において、化学療法剤は腫瘍の部分的血管正常化の発生後に投与される。本明細書で使用されるとき「部分的血管正常化」は、その間に既存の腫瘍血管系が血管内皮及び基底膜の構造の改善を示し、従って漏出性、拡張及び／又は低酸素が低減した生理学的状態を指す。そのような部分的血管正常化は、ｐＯ２、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、ＶＥＧＦ、チロシンキナーゼＴｉｅ−２、及びヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）のうちの１つ以上のレベルの変化を検出及び／又はモニタすることにより、又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及び磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）を含む技術を使用して腫瘍血管の生理学的状態をモニタすることにより決定され得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、ＩＴＰＰは化学療法剤の投与の約２時間前〜５日前に投与される。別の好ましい実施形態において、ＩＴＰＰは化学療法剤（例えば、パクリタキセルなどの微小管標的薬剤又はシスプラチンなどのＤＮＡ挿入剤）の投与の約１〜４日前、例えば化学療法剤の投与の２〜３日前に投与される。
【００５３】
複数ラウンドのＩＴＰＰ及び化学療法剤を投与することができる。特定の実施形態では１ラウンドのみが投与される。他の実施形態では、２ラウンド以上（例えば、２、３、４ラウンド、又はそれ以上）のＩＴＰＰ及び化学療法剤が投与される。ラウンドは、１日〜６ケ月、例えば１日〜３ケ月、１週間〜２週間、２週間〜３週間、３週間〜１ケ月、１ケ月〜２ケ月、又は２ケ月〜３ケ月の間隔が置かれてもよい。
【００５４】
化学療法剤は、当該薬剤の単独の活性薬剤としての用量に基づき治療用量以下又は治療量以下で投与され得る。一実施形態において、投与される治療用量以下又は治療量以下の化学療法剤は、化学療法剤の認可されている総用量の９０％未満又は上記のとおりの別の用量である。
【００５５】
本発明は、薬剤耐性癌の治療方法も提供する。特定の実施形態において、薬剤耐性癌は、１つ又は複数の化学療法剤による治療が不可能な癌である。例えば薬剤耐性癌は、薬剤による治療後に認識可能な腫瘍サイズの減少を呈しないものであってよく、及び／又は腫瘍の進行（例えば、ステージＩＩからステージＩＩＩへの、又はステージＩＩＩからステージＩＶへの）を有意に阻害しないものである。特定の癌、特にメラノーマが耐性を有する化学療法剤の例としては、微小管標的薬剤（例えば、パクリタキセル）及びＤＮＡ挿入剤（例えば、シスプラチンなどの白金系薬剤）が含まれる。薬剤耐性アッセイについては、例えば、参照により本明細書に援用されるLowe et al. (1993) Cell 74:95 7-697に記載されている。他の実施形態において、薬剤耐性癌は、非耐性癌細胞と比較したとき著しく増加したレベルの胆管側多選択性有機陰イオン輸送体１及び／又はＰ−糖タンパク質薬物排出ポンプを有する癌である。
【００５６】
薬剤耐性癌の治療方法には、ＩＴＰＰの単独投与か、又は本明細書に記載されるものなどの別の化学療法剤との併用でのＩＴＰＰの投与のいずれかが関わり得る。
【００５７】
本発明はまた、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法を提供し、該過剰増殖性病態は癌でなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない。本発明の方法により治療され得る過剰増殖性病態としては、限定はされないが、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、肝硬変、胆道閉鎖症、うっ血性心不全、強皮症、放射線誘発線維症、肺線維症（特発性肺線維症、膠原血管病、サルコイドーシス、間質性肺疾患及び外因性肺障害）、乾癬、陰部疣贅及び過剰増殖性細胞増殖疾患、例えば、角質増殖症、魚鱗癬、角皮症又は扁平苔癬などの過剰増殖性ケラチノサイト疾患を含むものが含まれる。いくつかの実施形態において、過剰増殖性病態を示す組織又は臓器は低酸素状態である。さらなる実施形態において、過剰増殖性病態の治療方法は、さらなる抗過剰増殖剤（antihyperproliferative agent）を投与する工程をさらに含む。抗過剰増殖剤としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、シスプラチン、ＶＰ１６、エンジイン（enedyine）、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン、メルファラン（mellphalan）、シクロホスファミド（cyclophsophamide）、クロラムブシル、ブスルファン、ロムスチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ＢＣＮＵ、又はカンプトテシンが含まれる。
【００５８】
本発明は、必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む対象における免疫応答の促進方法をさらに提供し、該対象は、癌又は別の腫瘍に罹患していない。一実施形態において、該対象は、望ましくない血管形成を受けていない。
【００５９】
（３）定義
本明細書で使用されるとき、以下の用語及び語句は下記のとおり定める意味を有するものとする。特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６０】
用語「薬剤（agent)」は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生体高分子（核酸、抗体、タンパク質又はその一部分、例えばペプチドなど）、又は細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織などの生物学的材料から得られる抽出物を指して使用される。そのような薬剤の活性によって薬剤は、対象体内で局所的又は全身的に作用する一つの生物学的、生理学的、又は薬理学的活性物質（又は複数の物質）である「治療剤」として好適となり得る。
【００６１】
用語「非経口投与」及び「非経口的に投与された」は当該技術分野で認知されており、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を指し、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。
【００６２】
「患者」、「対象」、「個体」又は「宿主」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれも参照する。
【００６３】
「細胞毒性薬物又は薬剤」は、細胞、好ましくは癌細胞を破壊する能力を有する任意の薬剤である。
【００６４】
用語「薬学的に許容可能な担体」は当該技術分野で認知されており、任意の対象組成物又はその構成成分の担持又は輸送に関わる薬学的に許容可能な材料、組成物又は媒体、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入材料を指す。各担体は、対象組成物及びその構成成分と適合性があり、且つ患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；及び（２１）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合物質が含まれる。
【００６５】
用語「治療剤」は当該技術分野で認知されており、対象体内で局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的、又は薬理学的活性物質である任意の化学的部分を指す。この用語はまた、疾患の診断、治癒、緩和、治療若しくは予防における使用、又は動物若しくはヒトにおける望ましい身体的若しくは精神的発達及び／又は状態の促進における使用が意図される任意の物質も意味する。
【００６６】
病体又は疾患を「治療する」とは、病態又は疾患の少なくとも１つの症状の治癒並びに改善を指す。治療は、組成物を投与されない対象と比べて、対象における医学的状態の症状の頻度を減少させるか、又はその発現を遅延させる組成物の投与を含む。従って、癌の治療は、例えば統計的及び／又は臨床的に有意な量だけ、治療を受ける患者集団において検出可能な癌性増殖の数及び／又はサイズを未治療の対照集団と比べて減少させること、及び／又は治療集団における検出可能な癌性増殖の出現を未治療の対照集団と比べて遅延させることを含む。
【実施例】
【００６７】
本発明は以上で概略的に説明したが、以下の例を参照することによりさらに容易に理解され得る。これらの例は、単に本発明の特定の態様及び実施形態を例示するために含まれるに過ぎず、いかなる形であっても本発明の限定を意図するものではない。
【００６８】
実施例１ Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系の産生
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ形質導入を、５’ＬＴＲプロモーターにより駆動されるホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ、次にＩＲＥＳ配列及びＥＧＦＰ ｃＤＮＡであるレトロウイルスベクターにより行った。ベクターは、ｐＢＭＮ−Ｌｕｃ−Ｉ−ＧＦＰプラスミド（Magnus Essand博士、Uppsala、スウェーデンから提供いただいた）と、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を安定的に発現するＰＴ６７パッケージング細胞系（Clontech）とを使用して作製した。さらに、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を提供するｐＭ１３プラスミド（Christine Brostjan博士、Vienna、オーストリアから提供いただいた）を使用して産生効率を高めた。パッケージング細胞は、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＤＭＥＭ ＨＧ培地（PAA Laboratories）中で培養し、SuperFect試薬（Qiagen）を製造者の指示に従い使用してｐＢＭＮ−Ｌｕｃ−Ｉ−ＥＧＦＰ及びｐＭ１３プラスミドと共トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３２℃で４８時間培養した。次にレトロウイルスベクターを含む培地を回収し、完全ＲＰＭＩ培地と１：１のｖ／ｖ比で混合してＢ１６Ｆ１０細胞の形質導入に使用した。３日後、蛍光顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ（約５％）の存在から形質導入効率を評価した。ＥＧＦＰ陽性コロニーを数代継代し、MoFloフローサイトメーター（Dako Cytomation）を使用して３セットに仕分けした後、９９％超の純度のＢ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系を得た。
【００６９】
実施例２ Ｏ２圧による細胞の化学療法に対する感受性
様々なｐＯ２％下で４８時間にわたるシスプラチン（シスジクロロジアミン白金）（Sigma-Aldrich）又はパクリタキセル（Calbiochem）に対する用量反応曲線を作成した。Alamar blue試験（Biosource）によって製造者の説明どおりに細胞生存度を評価した。
【００７０】
実施例３ 実験的転移アッセイ
Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰマウスメラノーマ細胞（０．１ｍｌの生理食塩水中１０５個の細胞）を尾静脈から静脈注射した後、マウス（Janvierからの８週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６）を５日毎の１．５ｇ／ｋｇのＩＴＰＰ腹腔内注射により処置した（各処置群につき１０匹のマウス）。処置は腫瘍細胞の接種後５日目に開始した。１９日後又は２７日後にマウスを安楽死させ、肺を別途回収した。肉眼的な肺病巣を計数し、組織中のメラノーマ細胞量を定量するため化学発光アッセイ（Promega）によりルシフェラーゼを測定した。全ての動物試験手順及び動物の使用は仏国Comite d'Ethique pour l'experimentation animale, Campus CNRS d'Orleansの承認を受けた。
【００７１】
実施例４ 皮下メラノーマモデル
Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞を、２５％Matrigel（商標）（OptiMEM中５０％）中の１０５個の細胞により構成される１００μ１プラグの注射後に皮下腫瘍として成長させた。MatrigelはBD Biosciencesから、及びOptiMEMはInvitrogenから得た。接種から２５日後にマウスを安楽死させ、腫瘍及び肺を切除した。シスプラチン（生理食塩水中１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）及びパクリタキセル（２ｍｇ／ｋｇ、５０％エタノール・５０％クレモフォールＥＬ中；Sigma-Aldrich、経口）との併用でのＩＴＰＰ（生理食塩水中１００μｇ／ｋｇ〜２．０ｇ／ｋｇ、腹腔内）の時間及び用量に従う様々な処置プロトコルを適用した。処置はメラノーマ細胞接種後７日目、９日目又は１１日目に開始した。
【００７２】
実施例５ 低酸素関連、血管形成関連、及びメラノーマ関連マーカーの生化学的定量化
肺を溶解緩衝液（Active motif）中にホモジナイズした。遠心後、清澄な上清を回収した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）により総タンパク質量を測定した。肺溶解物中のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ−２及びＨＯ−１を、比色サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて製造者の指示に従い定量化した。ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ及びＴｉｅ−２のＥＬＩＳＡキットはR&Dから得た。ＨＯ−１のＥＬＩＳＡキットはTakaraから得た。
【００７３】
実施例６ 半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応分析
ＬＯＸ用のTaqmanポリメラーゼ連鎖反応プライマー配列は５’−ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡ−３’（配列番号１）及び５’−ＡＧＴＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＡＴＣＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２）であった。β−アクチン（内部標準）については、プライマー配列は５’−ＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号４）であった。増幅したｃＤＮＡバンドをImageQuantソフトウェア（Becton and Dickinson）により定量した。ＬＯＸのｍＲＮＡレベルはβ−アクチンｍＲＮＡに対して正規化した。
【００７４】
実施例７ 免疫組織学的染色
腫瘍組織を組織凍結媒体Tissue-Tek（Sakura）に包埋し、液体窒素でスナップ凍結した。凍結切片を固定化し、ＰＢＳ中ＦＣＳ５％で１：２００希釈したeBiosciencesからのマウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１、血小板／内皮細胞接着分子）に対するラットモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体、ウサギＩｇＧ抗ＳＭＡ（平滑筋アクチン）抗体（AbCAM）、又はマウスＩｇＧ２ａ抗Ｐ−糖タンパク質（Ｃ２１９）（Calbiochem）を用いて染色した。それぞれヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗ラット免疫グロブリン、ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗ウサギ免疫グロブリン又はヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ標識抗マウス免疫グロブリン（ＰＢＳ中１：２００希釈）を二次抗体として使用した。細胞核を検出するため、切片をビスベンズイミドＨ３３２５８（Sigma-Aldrich）と共にＰＢＳ中１：１０００でインキュベートした。試料をVectashield（Vector）にマウントし、Zeiss 200M倒立蛍光顕微鏡で蛍光顕微鏡検出を実施した。腫瘍切片をヘマトキシリンエオシン染色した後、腫瘍壊死を分析した。
【００７５】
実施例８ 磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
９５０ｍＴ／ｍグラジエントセットを備えた小動物用の９．４Ｔ水平マグネット（94/21 USR Bruker Biospec）によりＭＲＩアッセイを実施した。直線状の同質コイル（内径：３５ｍｍ）にマウスを置いた。動物はガス（５０％Ｎ２Ｏ：０．７ｌ／分−５０％Ｏ２：０．７ｌ／分−イソフルラン１．５％）麻酔下に維持し、温度は３６℃で一定に保ち、取得中はマウス胸部に置いた空気バルーンを使用して呼吸数をモニタすることにより麻酔の吐出量を調整した。軸面及び前額面の双方において高速低角度ショット（ＦＬＡＳＨ）シーケンスを使用して、ＭＲ血管造影による腫瘍血管新生の計測を実施した。ＦＬＡＳＨパルスシーケンスを腫瘍の血管形成の進化の研究に適合させた。この技術により同じ動物に対する腫瘍の血管樹の３Ｄ構造を経時的に追うことが可能となる。
【００７６】
実施例９ Oxylite ｐＯ２計測
oxylite 2000E PO2システム（Oxford Optronics）は、２３０μｍ径の光ファイバープローブの先端に固定化された塩化ルテニウムのＯ２依存性の蛍光寿命を測定することによりｐＯ２を計測する。蛍光パルスの寿命は先端の酸素張力に反比例する。キシラジン／ケタミンの腹腔内注射によりマウスを麻酔した後、説明どおりにoxyliteプローブ先端を腫瘍内に取り付け、酸素圧を記録した。
【００７７】
実施例１０ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは腫瘍微小環境における低酸素に選択的に拮抗する
ＩＴＰＰ−ＲＢＣが生体内で低酸素に拮抗することを確認するため、ＩＴＰＰ処置マウス及び未処置マウスにおける左脚の上に皮下移植したメラノーマ腫瘍内部の酸素張力の値の比較を実施した。酸素圧（ｐＯ２）は、光ファイバープローブの先端にある塩化ルテニウムのＯ２依存性の蛍光寿命を決定することにより計算した。蛍光パルスの寿命は、プローブの先端の酸素張力に反比例する。無処置動物の腫瘍は酸素圧値が２ｍｍＨｇを下回り（図１）、極めて低酸素性であったが、ＩＴＰＰ処置マウスの腫瘍ではｐＯ２は４０ｍｍＨｇの範囲に達した（図１Ａ）。このｐＯ２の増加はＩＴＰＰの腹腔内注射後３０分経った直後に起こり（図１Ｂ、図１Ｃ）、注射後２４時間に示されるとおり（図１Ａ）最大４０ｍｍＨｇの高レベルで少なくとも４８時間維持された。さらに、同じ動物の対応する非腫瘍性の（右）脚の筋肉において示されるとおり、平行同時測定（図１Ｃ）ではｐＯ２に対する何らの変化も、又はいかなる影響も検出されなかった一方、腫瘍ではｐＯ２レベルはＩＴＰＰ注射から３０分後に増加したことから、ＩＴＰＰ−ＲＢＣは低酸素性腫瘍を特異的に標的化した。
【００７８】
実施例１１ ＩＴＰＰ−ＲＢＣはＢ１６メラノーマ細胞による肺転移形成を妨げる
抗転移剤としてのＩＴＰＰを検証するため、マウスにメラノーマ細胞を静脈内注射することによる肺転移の「人工」モデルを使用した。Ｂ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞系を使用し、これはＧＦＰ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子により形質導入されたメラノーマＢ１６Ｆ１０系であり、組織中のルシフェラーゼ活性を分析することによりメラノーマ細胞の追跡及び定量が可能である。増殖血管形成の促進及び転移発生に関してＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞系の生物学的挙動をＢ１６Ｆ１０ＬｕｃＧＦＰ細胞と比較する実験では、有意な差も、ルシフェラーゼの低酸素感受性も示されず、従ってその使用の妥当性が確認された。
【００７９】
生体内実験をメラノーマ細胞接種後２７日目まで追跡した。ＩＴＰＰ処置をＢ１６細胞注射後５日目から開始したとき、転移性結節は極めて大きく減少した。この効果は、肺におけるルシフェラーゼ活性を計測することにより（図２Ａ）定量することができた。これにより目視検査では検出不可能な微小転移の生化学的定量化が可能となった。ＩＴＰＰの作用が結節における酸素分圧の変化と関連したかどうかを調べるため、低酸素誘導因子−αサブユニットのＨＩＦ−１αアイソフォームの発現を分析した。ＨＩＦ−１αは哺乳動物細胞の酸素レベルに対する応答に決定的に重要であり、細胞のＯ２センサと見なされる。ＨＩＦ−１αが低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）に結合すると、低酸素関連遺伝子のカスケードがオンになる。図２ＢはＨＩＦ−１αレベルを示し、これは未処置メラノーマを有するマウスの肺では明確にアップレギュレーションされ、ＩＴＰＰ処置したマウスの肺では劇的に低下した。
【００８０】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルはＨＩＦ−１αに依存するとともに抗血管形成治療の主な標的であり、ＥＬＩＳＡによりアッセイしたとき、ＩＴＰＰ−ＲＢＣの影響下では対照レベルまで低下した（図２Ｃ）。これらの結果はＴｉｅ−２発現を調べることにより確認された。Ｔｉｅ−２は特異的な内皮チロシンキナーゼ受容体であり、低酸素を減少させる正常な血管の成熟化に必須である。低酸素の肺で著しく減少するこのマーカーがＩＴＰＰ処置により再誘導されたことから（図２Ｄ）、転移性結節における血管が組織化されない血管形成を受け、及び血管形成がＩＴＰＰ−ＲＢＣにより制御されたとき、より成熟した血管がＴｉｅ−２マーカーを再発現したことが示される。ＩＴＰＰ処置後、ＨＩＦ−１αにより誘導される細胞保護酵素であるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）も無処置マウスと比較して著しく減少した（図２Ｅ）。ＨＯ−１の過剰発現により、メラノーマ細胞の生存能力、細胞増殖及び血管形成能が高くなり、転移が増加し、及び対照の腫瘍を有するマウスの生存率が低下する。癌細胞の浸潤過程に関わり、且つ低酸素により制御される酵素であるリシルオキシダーゼの半定量的ＰＣＲ ｍＲＮＡ分析に関するさらなる研究（図２Ｆ）により、「低いＯ２親和性ＲＢＣ」をもたらすＩＴＰＰ処置の有益な作用も実証された。
【００８１】
実施例１２ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは同所性メラノーマ肺転移を根絶する
原発腫瘍皮下移植後のＩＴＰＰ−ＲＢＣの転移に対する効果を評価した。腫瘍接種後７日目に開始した短期処置（３回のＩＴＰＰ注射、５日間隔）では、ＩＴＰＰは肺転移を大幅に減少させた（図３Ａ）。ＩＴＰＰ処置の７日目での開始が、短期投与プロトコル及び慢性投与プロトコル（７日目、１２日目、１６日目、１８日目、１９日目）の双方で最適であった。９日目又は１１日目の開始はそれより有効性が低く、慢性投与では肺転移の促進さえ生じた（図３Ａ）。この観察結果の理由については不明であるものの、血管形成の完全な阻害をもたらす慢性投与によってさらに腫瘍の表現型が変わり、侵襲性及び転移が増加した可能性がある。
【００８２】
実施例１３ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは腫瘍内血管正常化を誘導する
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のＭＲＡ（磁気共鳴血管造影）を腫瘍血管樹の３Ｄ構造追跡用に適応させることにより、腫瘍における微小循環の構造的な変化を評価した。
【００８３】
メラノーマ発症の２１日後、腫瘍は典型的な無秩序な血管構造を示した（図３Ｂａ）。９日目及び１４日目にＩＴＰＰで処置したマウスでは、１８日目及び１９日目におけるさらなる反復処置後に血管系は密度が低くなり、顕著に正常化した。腫瘍内を調べると、末梢に多数の血管が明らかとなった；抗平滑筋抗原抗体により標識された、血管を取り囲む周皮細胞の動員により正常化が示された一方（図３Ｂｂ）、無処置腫瘍（図３Ｂａ、図３Ｂｂ）ではそのような秩序化は認められなかった。この「正常化」に向かう傾向は、腫瘍サイズの著しい低減を伴った（図３Ｂａ）。
【００８４】
同じ移植原発腫瘍において、薬剤耐性の原因である多剤排出ポンプに対するＩＴＰＰ処置の効果について調べた。ＩＴＰＰはＰ−糖タンパク質薬物排出ポンプを下方制御する。この効果が、薬物の有効細胞内濃度の低下に起因する化学的耐性及び薬物−標的相互作用の障害に拮抗し得る。従って、ＩＴＰＰの誘導による血管の正常化は腫瘍における薬物排出ポンプの低下と相関を有し、従って薬物の腫瘍細胞に対する効力を増加させ得る。
【００８５】
実施例１４ ＩＴＰＰ−ＲＢＣは同所性メラノーマ肺転移を根絶し、化学療法にメトロノーム的相乗作用を及ぼす
ＩＴＰＰがＲＢＣによる低酸素組織への酸素送達を向上させる能力を有することから、パクリタキセル及びシスプラチンなどの薬物によるメラノーマ処置の効力に対するその効果について調べた。酸素正常状態、低酸素状態及び再酸素化後のＢ１６メラノーマ細胞に対する薬物の効果を、初めにインビトロで試験した。図４は、Ｂ１６細胞に対する薬物の細胞毒性が、酸素張力の低下に伴い低下することを示している（１％又は１１％）。しかしながら、細胞を再酸素化すると（１％から１１％及び２０％へ）、薬物の細胞毒性はｐＯ２レベルに依存してある程度まで再び確立された（図４Ａ、図４Ｂ）。腫瘍細胞におけるｐ−糖タンパク質の生体内調節と比較したこれらのデータは、低酸素により誘導されるＭＤＲ促進によって調節される対薬物感受性が、ＩＴＰＰにより誘導される腫瘍再酸素化によって逆転し得ることを示唆している。
【００８６】
ＩＴＰＰ処置をインビボでパクリタキセル及びシスプラチンと組み合わせた。ＩＴＰＰ、パクリタキセル及びシスプラチンによる同時処置後、肺転移は劇的に増加し（図５Ａ）、プロファイルはＩＴＰＰ単独による慢性処置で観察されるもの（上記を参照）と同様であった。パクリタキセル及びシスプラチンはそれ自体が内皮細胞の成長を阻害し（図４Ｃ）、これらの化合物のインビボでの抗血管形成作用が裏付けられる。腫瘍血管新生を破壊するそのような抗血管形成治療は、低酸素耐性腫瘍細胞の選択により転移性浸潤を促進することが認められており、従って図３に示されるデータが実証され、及び腫瘍血管新生の破壊又は除去よりむしろ血管正常化が、より適切且つ潜在的に有益な癌治療手法と考えられることを示している。
【００８７】
発症した固形腫瘍（図５Ｂ）及び肺転移（図５Ａ）の双方の処置に対するＩＴＰＰ及び薬物の注射スケジュールの影響を試験した。１４日目までＩＴＰＰ単独で処置したマウスを、１８日目及び１９日目にＩＴＰＰ単独に再び曝露して血管の正常化を試み、続いて２０日目及び２１日目にシスプラチン＋パクリタキセルで処置した後、２５日目に分析した。結果は目覚しいものであった：同時処置と正反対に肺転移が根絶されたが（図５Ａ）、特定の癌療法用のプロトコル設定におけるメトロノーム式パラメータの重要性が確認された。実際、特異的内皮マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）染色による腫瘍微小血管の分析は、対照における不規則な形状及び内皮細胞の顕著なＣＤ３１染色を伴う構造化が不十分な多量の微小血管（図５Ｂａ）と比較して、化学療法薬による処置後、ＩＴＰＰ処置動物における腫瘍内微小血管は密度の低下を示した。さらに図５Ｂには、ＩＴＰＰによる定期的治療を１８日目及び１９日目に延長し、従って２０日目及び２１日目の薬物処置前における血管及び酸素張力の正常化を目標とすることにより、細胞毒性が強力に促進したことが示され、これは、拡散したＣＤ３１陽性に対応し（図５Ｂａ３）、かつ、Ｈ＆Ｅ染色（図５Ｂａ３及び図５Ｂｂ３）により表され、且つ腫瘍サイズの低下及び壊死誘導により確認される壊死範囲を示す２５日目の壊死によって示されるとおりである。これは化学療法と併用したＩＴＰＰ治療の強力な効果を示している。
【００８８】
実施例１５ ＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用治療は動物モデルにおいて強力な相加作用を示す
ラット膵腫瘍モデル及びヒトＰａｎｃ−１膵腫瘍異種移植マウスモデルの双方において、ＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用処置は強力な相加作用を示した。初めに双方のモデルにおいて、ゲムシタビン及びプラセボの効果と比較したＩＴＰＰ処置単独での効果を調べた（図６及び図８）。次に、ゲムシタビン処置単独及びプラセボの効果と比較した、双方のモデルにおけるＩＴＰＰのゲムシタビンとの併用処置の効果を調べた。
【００８９】
ラット膵腫瘍モデルでは、併用処置群のラットは、１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。ゲムシタビン処置群のラットは、１６日目、１８日目、及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）単独の投与を受けた。対照群のラットは処置しなかった。被験動物の生存率は併用処置群において大幅に亢進した。動物生存プロファイルはまた、ゲムシタビンに対する用量依存性も実証した（図７）。
【００９０】
異種移植腫瘍モデルでは、併用処置群のマウスは、１４日目から４９日目までの期間にわたり週１回、ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＩＴＰＰ（２ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。ゲムシタビン処置群のマウスは、１６日目、１８日目及び２０日目にゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。対照群のマウスは処置しなかった。併用処置はゲムシタビン処置単独と比較したとき動物生存指数を亢進することを示したが、しかしゲムシタビンに対する用量依存性はなかった（図９）。
【００９１】
ＯＸＹ１１１Ａ及び／又はゲムシタビンで処置した膵管腺癌動物の生存期間中央値を追跡し、以下の表１に要約した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
ラット膵腫瘍モデルにおいて、ＩＴＰＰ、ゲムシタビン又はプラセボの処置後のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、カスパーゼ−３及びβ−アクチンの発現をさらに調べた（図１０）。
【００９４】
実施例１６ ＩＴＰＰ治療は免疫細胞の腫瘍への浸潤及び腫瘍侵襲を促進する
Ｂ１６腫瘍モデルにおいて、ＯＸＹ１１１Ａを７日目、８日目、１４日目、１５日目、２１日目、２２日目、２９日目及び３０日目に腹腔内注射した後、ＯＸＹ１１１Ａ処置によりＣＤ６８（Ｍ２型）マクロファージのＢ１６腫瘍への浸潤が大幅に促進したことが実証された（図１１）。
【００９５】
同じモデルにおいて、ＩＴＰＰ処置によりＣＤ４９ｂ ＮＫ細胞の浸潤、Ｂ１６腫瘍中のＣＤ３１ ＥＣ細胞の存在量、及びメラノーマＢ１６腫瘍におけるＮＫ細胞の侵襲も大幅に促進された（図１２及び図１３）。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療方法であって、
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程と；
腫瘍における部分的血管正常化後に前記対象に治療有効量の化学療法剤を投与する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍における部分的血管正常化の発生を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部分的血管正常化の発生が、前記腫瘍の酸素分圧（ｐＯ２）レベルを計測することにより検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法剤が治療用量以下で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と、パクリタキセル及びシスプラチンから選択される化学療法剤とを含む医薬組成物。
【請求項７】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療有効量のＩＴＰＰと、パクリタキセル及びシスプラチンから選択される化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む、対象において癌を治療するための治療レジメン。
【請求項１０】
前記ＩＴＰＰと前記化学療法剤とが同時に投与される、請求項９に記載の治療レジメン。
【請求項１１】
前記ＩＴＰＰと前記化学療法剤とが逐次的に投与される、請求項９に記載の治療レジメン。
【請求項１２】
前記ＩＴＰＰが、前記化学療法剤を投与する前に投与される、請求項１１に記載の治療レジメン。
【請求項１３】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項１４】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項１５】
イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と治療量以下の化学療法剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンから選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記化学療法剤がパクリタキセル及びシスプラチンから選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む、対象において癌を治療するための治療レジメン。
【請求項２２】
前記化学療法剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンから選択される、請求項２１に記載の治療レジメン。
【請求項２３】
前記化学療法剤がパクリタキセル及びシスプラチンから選択される、請求項２２に記載の治療レジメン。
【請求項２４】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項２３に記載の治療レジメン。
【請求項２５】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項２３に記載の治療レジメン。
【請求項２６】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項２１に記載の治療レジメン。
【請求項２７】
対象における癌の治療方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
対象における多剤耐性癌の治療方法であって、治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記癌がパクリタキセル及びシスプラチンの１つ又は複数に耐性を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法であって、前記過剰増殖性病態が癌でなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない、方法。
【請求項３１】
前記過剰増殖性病態が、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、肝硬変、胆道閉鎖症、うっ血性心不全、強皮症、放射線誘発線維症、肺線維症、乾癬、陰部疣贅及び過剰増殖性細胞増殖疾患から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記過剰増殖性病態を示す組織又は臓器が低酸素状態である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
さらなる抗過剰増殖剤を投与する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む、対象における免疫応答の促進方法であって、前記対象が癌又は別の腫瘍に罹患していない、方法。
【請求項３５】
前記対象が望ましくない血管形成を受けていない、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
癌の治療方法であって、
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程と；
腫瘍における部分的血管正常化後に前記対象に治療有効量の化学療法剤を投与する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍における部分的血管正常化の発生を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部分的血管正常化の発生が、前記腫瘍の酸素分圧（ｐＯ２）レベルを計測することにより検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法剤が治療用量以下で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と、パクリタキセル及びシスプラチンから選択される化学療法剤とを含む医薬組成物。
【請求項７】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療有効量のＩＴＰＰと、パクリタキセル及びシスプラチンから選択される化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む、対象において癌を治療するための治療レジメン。
【請求項１０】
前記ＩＴＰＰと前記化学療法剤とが同時に投与される、請求項９に記載の治療レジメン。
【請求項１１】
前記ＩＴＰＰと前記化学療法剤とが逐次的に投与される、請求項９に記載の治療レジメン。
【請求項１２】
前記ＩＴＰＰが、前記化学療法剤を投与する前に投与される、請求項１１に記載の治療レジメン。
【請求項１３】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項１４】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の治療レジメン。
【請求項１５】
イノシトールトリスピロリン酸（ＩＴＰＰ）と治療量以下の化学療法剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンから選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記化学療法剤がパクリタキセル及びシスプラチンから選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む、対象において癌を治療するための治療レジメン。
【請求項２２】
前記化学療法剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンから選択される、請求項２１に記載の治療レジメン。
【請求項２３】
前記化学療法剤がパクリタキセル及びシスプラチンから選択される、請求項２２に記載の治療レジメン。
【請求項２４】
前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項２３に記載の治療レジメン。
【請求項２５】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項２３に記載の治療レジメン。
【請求項２６】
前記化学療法剤の前記治療用量以下が、承認済みラベル用量の７０％未満である、請求項２１に記載の治療レジメン。
【請求項２７】
対象における癌の治療方法であって、治療有効量のＩＴＰＰと治療量以下の化学療法剤とを同時に又は逐次的に投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
対象における多剤耐性癌の治療方法であって、治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記癌がパクリタキセル及びシスプラチンの１つ又は複数に耐性を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む過剰増殖性病態の治療方法であって、前記過剰増殖性病態が癌でなく、又は望ましくない血管形成により特徴付けられるものではない、方法。
【請求項３１】
前記過剰増殖性病態が、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、肝硬変、胆道閉鎖症、うっ血性心不全、強皮症、放射線誘発線維症、肺線維症、乾癬、陰部疣贅及び過剰増殖性細胞増殖疾患から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記過剰増殖性病態を示す組織又は臓器が低酸素状態である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
さらなる抗過剰増殖剤を投与する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
必要性のある対象に治療有効量のＩＴＰＰを投与する工程を含む、対象における免疫応答の促進方法であって、前記対象が癌又は別の腫瘍に罹患していない、方法。
【請求項３５】
前記対象が望ましくない血管形成を受けていない、請求項３４に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１（ａ）】
【図１１（ｂ）】
【図１１（ｃ）】
【図１２】
【図１３（ａ）】
【図１３（ｂ）】
【図１３（ｃ）】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１（ａ）】
【図１１（ｂ）】
【図１１（ｃ）】
【図１２】
【図１３（ａ）】
【図１３（ｂ）】
【図１３（ｃ）】
【公表番号】特表２０１２−５３２８７９（Ｐ２０１２−５３２８７９Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９７０３（Ｐ２０１２−５１９７０３）
【出願日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４１２５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００５８８６
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００５５８６）ノームオキシーズ，インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５００２６２１２０）ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４１２５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００５８８６
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００５５８６）ノームオキシーズ，インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５００２６２１２０）ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ
【Ｆターム（参考）】
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