インスリン受容体自己リン酸化不全に関連する遺伝子の検出法
【課題】
インスリン受容体自己リン酸化不全により発現量が変動する遺伝子を評価することのできるマイクロアレイの提供。
【解決手段】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ、該マイクロアレイを用いたインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法等を提供する。
インスリン受容体自己リン酸化不全により発現量が変動する遺伝子を評価することのできるマイクロアレイの提供。
【解決手段】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ、該マイクロアレイを用いたインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡプローブを基板上に固定化してなるマイクロアレイおよびこれを用いたインスリン受容体の変異による糖尿病状態の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はインスリンの作用不足によって慢性の高血糖状態により引き起こされる代謝疾患である。２型糖尿病の場合、環境的因子（例えば肥満、過食、運動不足、ストレス）の影響を受けるインスリン作用障害＝インスリン抵抗性と、遺伝的に規定された因子によるインスリン分泌不全は、高血糖の持続により糖毒性を形成して発症する。インスリンの受容体への結合から血糖低下作用への一連の情報伝達の過程で鍵となる機能タンパク質−インスリン受容体、インスリン受容体基質、ＰＩ−３キナーゼ、糖輸送担体などのどこかに重大な機能低下を引き起こすような遺伝子変異があれば、インスリンの作用障害があらわれ糖尿病が発症する。また、インスリン分泌細胞でもこれらの刺激伝達系の障害がインスリン分泌不全をもたらすことが報告されている。これらの検証に有用な疾患モデル動物は特開２００２−２７２３１８（特許文献１）に２型糖尿病モデルマウスとして開示されている。
【０００３】
従来、インスリン抵抗性に起因する糖尿病の影響を診断するには、血清中や尿中の糖および／またはケトン体の量を検査することにより診断されている。しかし、この検査方法ではインスリン抵抗性の原因の一つであるインスリン受容体自己リン酸化不全により発現が変動する関連遺伝子の評価を行うことはできなかった。
【０００４】
ハイブリダイゼーションをＤＮＡなどの塩基配列の同定に利用した研究は１９６０年代から始まり、ヒトゲノムプロジェクトにより飛躍的な技術革新がもたらされた。その中で、遺伝子発現解析、遺伝子変異検出等に利用される技術としてＤＮＡマイクロアレイが知られている。遺伝子発現解析では、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、発生の過程、生理的応答あるいは疾患の特徴を状況に応じて増減するｍＲＮＡ量を蛍光パターンとして視覚化することができる。遺伝子変異検出としては、１塩基の違いが病態の差、治療薬に対する反応の差として現れる一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰと略す）の解析にＤＮＡマイクロアレイが用いられている。
【０００５】
しかし、インスリン抵抗性の原因の一つであるインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることに起因する関連遺伝子の発現状態の変化を、マイクロアレイを用いて評価するような手法は確立されていない。
【特許文献１】特開２００２−２７２３１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述したような実状に鑑みてなされたものであり、インスリン受容体自己リン酸化不全により発現量が変動する遺伝子を評価することの出来るマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、以下に示すマイクロアレイ、マイクロアレイを用いた評価方法等を提供する。
（１）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
（２）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子群である、上記（１）に記載のマイクロアレイ。
（３）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃで特定される遺伝子からなる群から選択される、上記（１）または（２）に記載のマイクロアレイ。
（４）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４で特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
（５）マウスが２型糖尿病である、上記（２）から（４）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（６）インスリン受容体の自己リン酸化不全が変異インスリン受容体に起因する、上記（１）から（５）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（７）インスリン受容体の変異がインスリン受容体の１１９５番目のプロリンがロイシンに置換されたことに起因する上記（６）に記載のマイクロアレイ。
（８）基板上に固定化されるＤＮＡが遺伝子の部分長および／または全長である、上記（１）から（７）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（９）２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
（１０）上記（１）から（８）のいずれか、および（９）に記載のマイクロアレイを用いることを特徴とするインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法であって、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；
からなる評価方法。
（１１）対照組織または細胞が変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病ヒトの肝臓組織由来である、上記（１０）に記載の評価方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロアレイを用いることにより、インスリン受容体自己リン酸化不全が影響する遺伝子の発現を測定することができる。このようなマイクロアレイは２型糖尿病の診断に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを提供する。ここでＤＮＡとは基板に固定化されうるＤＮＡを含み、二本鎖ＤＮＡであっても一本鎖ＤＮＡであってもかまわない。
【００１０】
インスリンの結合によりインスリン受容体（配列番号：２９）に内在するチロシンキナーゼ活性が活性化されると、インスリン受容体の自己リン酸化が起き、インスリン受容体基質蛋白ファミリー（ＩＲＳｓ；ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３）がチロシンリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳｓはＰＩ−３キナーゼを活性化し、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ−４）の細胞質から細胞膜への輸送を促進し、グルコースの取込みが促進される。すなわち、インスリン受容体の自己リン酸化不全はその後の一連の反応を滞らせる原因となる。ここで、インスリン受容体の自己リン酸化不全とは、特開２００２−２７２３１８に示されるように、肝臓より抽出されたインスリン受容体を含む膜タンパクにインスリン刺激を加えた後に、リン酸化反応液による処理を行ってもインスリン受容体がリン酸化されない状態を意味する。このようなインスリン受容体の自己リン酸化不全は２型糖尿病に関与していることが知られている（特開２００２−２７２３１８）。
【００１１】
ここで、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群とは、インスリン受容体の自己リン酸化により惹起される一連の反応に関連する遺伝子をいう。具体的には、そのような遺伝子群はMus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus ATP-binding cassette 1, sub-family A, member 1 (Abca1) gene, complete cds."、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mus musculus 12 days embryo male wolffian duct includes surrounding region cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:6720473P21product:growth factor receptor bound protein 10, full insert sequence."、"Mus musculus ribosomal protein L36 (Rpl36), mRNA."、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus, sorbitol dehydrogenase 1"、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus alpha fetoprotein"、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine leukemia virus clone lymph-DD2, mRNA sequence"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus complement component 3 (C3), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-278I21 on chromosome 11,complete sequence."、"Mus musculus adult male small intestine cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2010004J23 product:ribosomal protein L4, cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus similar to dJ794I6.1.1 (l(3)mbt-like (Drosophila)(DKFZP434N061) variant 1 ) [Homo sapiens] (LOC228602), mRNA."、"Mus musculus DIF-3 mRNA for dioxin inducible factor 3, complete cds."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus, similar to Transcription factor BTF3 (RNA polymerase B transcription factor 3)"、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2 (mitochondrial)"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus LTRPC7 (Ltrpc7) mRNA, complete cds."、"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus adult male testis cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1700008C22 product: similar to SEX-REGULATED PROTEIN JANUS-A (CGI-202) [Homo sapiens], full insert sequence."、"Mus musculus Naip3 gene, exon 1; neuronal apoptosis inhibitory protein 1 (Naip1) and general transcription factor IIH polypeptide 2 (Gtf2h2) genes, complete cds."、"Mouse mRNA for thymosin beta-4."、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610005D09:cathepsin L, full insert sequence."、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."、"Mus musculus histocompatibility 2, D region locus 1 (H2-D1), mRNA."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus polytropic MLV-related provirus NJ2 integrase (pol)gene, partial cds; envelope polyprotein (env) gene, complete cds;and long terminal repeat, partial sequence"、"Mus musculus DNA polymerase gamma mRNA, nuclear gene encoding mitochondrial protein, complete cds"、"Mus musculus spinster-like protein mRNA, complete cds."、"Mus musculus eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 2,mRNA (cDNA clone IMAGE:5696921), partial cds."、"Mus musculus 10 day old male pancreas cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1810027O15 product:ribosomal protein L4,cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus adult male liver cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1300004I11:mannosidase 2, alpha B2, full insert sequence."があげられ、特に"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."を含む。本発明のマイクロアレイは、これらの遺伝子群の一部または全部を用いて作製することができる。
【００１２】
ここで遺伝子群の一部とは、上記の一群から選択される２種以上、好ましくは１０種以上、より好ましくは１５種以上、さらに好ましくは２０種以上、さらに好ましくは４０種以上をいう。
【００１３】
ＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイは、ＤＮＡチップとも呼ばれ、スライドガラスやシリコン等からなる基板と、この基板上に整列して固定化されたＤＮＡ断片とから構成されている。本明細書ではＤＮＡマイクロアレイを単にマイクロアレイと記載する。このマイクロアレイを用い、試料中に含まれる放射性同位元素または蛍光物質により標識されたＤＮＡをハイブリダイズすることにより、高感度に検出することができる。マイクロアレイの結合位置からＤＮＡの塩基配列の情報が、また蛍光強度等からＤＮＡ量の情報が得られる。
【００１４】
マイクロアレイは基板と、この基板上に整列して固定化されたＤＮＡ断片とから構成されている。基板は、紙、ナイロン、またはニトロセルロースなどの他の型の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、あるいは中空繊維などの他の型の固体支持体である。本発明では、マイクロアレイスキャナーによるマイクロアレイの放射線強度、または蛍光強度を測定する際、バックグラウンドやノイズによる障害が比較的少ない事、またマイクロアレイに固定化するＤＮＡ断片は、数塩基のものから遺伝子全体をカバーする長さまで対応
可能である、という理由から、ナイロン膜あるいはガラススライドが基板として好ましく用いられる。
【００１５】
マイクロアレイを製造する方法として、光リソグラフィー法とスポット法が知られている。光リソグラフィー法はアフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）の製造に利用されている方法であるが、基板上に合成されるオリゴヌクレオチドの長さが限定される欠点がある。一方、スポット法により基板上に固定化されるヌクレオチドには長さによる限定はない。すなわち、スポット法により数塩基のものから遺伝子全体をカバーする長さまで基板に固定化が可能である。
【００１６】
マイクロアレイは以下の手順で作製することができる。
基板へのＤＮＡの搭載方法としては、例えば特開平１１−０２１２９３（光リソグラフィー法）および特開２００２−２４３７３６（スポット法）等に開示される方法を用いることができる。本発明ではヌクレオチドの長さに限定されることなく、安価にマイクロアレイを作製できるので、スポット法を好ましく用いうる。具体的には、（１）搭載するＤＮＡを専用のスポット液に溶解し、（２）マイクロプレートに分注する。ここでマイクロプレートはＤＮＡ溶液の数にもよるが、好ましくは９６穴、さらに好ましくは３８４穴のものが用いられる。（３）マイクロプレートと基板をマイクロアレイスポッターにセットし、予め設計しておいたＤＮＡの配置情報をマイクロアレイスポッターに設定して、基板上へＤＮＡを搭載させる。
【００１７】
基板上にＤＮＡ断片を固定化する際には、基板１ｃｍ2あたり３０から３６スポット、好ましくは６０から６４スポット、より好ましくは１３０から１４４スポット、さらに好ましくは２３０から２５６スポット、最も好ましくは２９２から３２４スポットが用いられる。具体的に、本発明では基板１個あたり１２８スポット（６４スポット／ｃｍ2）が好ましく用いられる。
【００１８】
本発明はまた、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子である遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを提供する。
本発明のマイクロアレイに固定化できるＤＮＡはインスリン受容体の自己リン酸化不全を示す動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒト）に由来する遺伝子であればいずれの遺伝子でも用いうるが、研究対象として頻繁に用いられているという理由から、特にヒト、マウス、ラット、モルモット等が好ましく、本発明ではヒトが最も好ましく用いられる。
【００１９】
また、本発明のマイクロアレイはインスリン受容体の変異によるインスリン受容体自己リン酸化不全により発現が影響される遺伝子群の一部または全部および／または全部を含むものである。具体的に当該遺伝子としては、インスリン受容体の１１９５番目のプロリンをロイシンに置換した変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウス由来の遺伝子を挙げることができる。さらに組織および／または細胞として、インスリン受容体に変異を有する２型糖尿病モデルマウスの胎仔肝臓細胞で発現する遺伝子の一部または全部を使用することができる。
【００２０】
ここで、インスリン受容体変異によるインスリン受容体自己リン酸化不全によって発現量が変化するとは、自己リン酸化が不全な状態でｍＲＮＡ量の変化が１．２倍以上、より明確には１．５倍以上、あるいは０．８０倍以下、より明確には０．６７倍以下であるかを意味する。
【００２１】
本発明のマイクロアレイに固定化できる遺伝子ＤＮＡは、検出可能であれば、その遺伝子の部分長であっても、完全長であってもかまわない。部分長である場合、具体的には１５から３０ヌクレオチド、５０から７０ヌクレオチド、好ましくは８０から１００ヌクレオチド、より好ましくは１２０から１５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７０から１９０ヌクレオチド、最も好ましくは２００から２５０ヌクレオチドのＤＮＡを固定化できる。
【００２２】
また、部分長である場合、選択される領域は遺伝子を構成する領域であればいずれの領域でもかまわないが、その遺伝子に特異的な配列を含む領域が好ましく選択される。
【００２３】
各遺伝子に特異的なＤＮＡ断片を設計する場合、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーを設計するプログラムであるＰｒｉｍｅｒ３（Ｔｈｅ ＭＩＴ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計することができる。プログラムから得られるプライマー配列と、遺伝子全配列を照らし合わせ、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーではさまれている全配列中の配列をマイクロアレイに搭載する遺伝子断片として用いることができる。
【００２４】
マイクロアレイに搭載する遺伝子は、クローニング法によってプラスミド、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した形で保持されている遺伝子を使用することができる。挿入遺伝子配列の確認はまず、遺伝子挿入部位の前後のプラスミドに由来する配列に特異的なＰＣＲプライマーと、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して解析用サンプルを調製し、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００、アプライドバイオシステムズ社）での解析によって挿入遺伝子の約７００塩基の配列情報を取得する。次に、この塩基配列について、相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、ＤＮＡデータベース上のどの遺伝子と一致するかを調べる。
【００２５】
このように選択される遺伝子群として、具体的にはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃを含む遺伝子群、特に好ましくはＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４からなる遺伝子群が例示できる。
【００２６】
本発明のマイクロアレイを用いる場合、その対照として２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを用いることができる。これらの遺伝子は遺伝子の発現量を補正するために用いることができる。２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群としては例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０１０４９５のような癌関連遺伝子、Ｘ５７８００のような細胞増殖および／または分裂に関与する遺伝子、ＡＥ０００６６４のような受容体として機能するポリペプチドをコードする遺伝子、ＢＣ００８２３３のような転写関連遺伝子、Ｘ１６０５３のような細胞構造に関与する遺伝子、ＮＭ＿０１０６９９のような代謝関連遺伝子、ＡＫ０７５７０７のような分泌関連遺伝子、ＸＭ＿２８３４０８のような免疫関連遺伝子等があげられる。これらの遺伝子は上記と同様にマイクロアレイ化できる。
【００２７】
本発明はまた、上記のマイクロアレイを用いた、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の評価方法を提供する。すなわち、評価対象の組織または細胞におけるインスリン受容体自己リン酸化不全に影響を受ける遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２８】
本発明の評価方法は、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；
からなる。
【００２９】
具体的には、上記（ａ）の工程は以下の操作を含む。
（１）ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）の中に組織または細胞を入れ、ホモジナイザーで均質化する。
（２）クロロフォルムを添加し、撹拌した後、室温で放置する。
（３）遠心機を用いて遠心した後、上層液を別の容器に移し、イソプロパノールを加えて撹拌する。
（４）遠心機を用いて遠心し、上澄み液を除去した後、７５％ＥｔＯＨを添加し撹拌する。
（５）遠心機を用いて遠心し、上澄み液を完全に除去する。
（６）風乾した後、ＤＥＰＣ Ｄ２Ｗを加え、核酸試料を融解させる；（７）３２Ｐ標識ｄＣＴＰまたはＣｙａｎｉｎｅ３／５標識ｄＵＴＰを用いて、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識ｃＤＮＡサンプルを調製する。
【００３０】
上記（ｂ）の工程は、標識ｃＤＮＡ溶液をハイブリダイゼーション液（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ、東洋紡）中に添加した後に変性させ、マイクロアレイと共に、ハイブリダイゼーションチャンバー中において１６時間、６５℃の条件でインキュベートする過程である。
【００３１】
上記（ｃ）の工程は、（１）マイクロアレイをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、６５℃の２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ溶液での１５分間の振盪洗浄を２回行う；（２）マイクロアレイを軽く乾燥させた後に、ＦＬＡ−８０００（富士フィルム社）などのマイクロアレイスキャナーを用いてそれぞれの放射線強度、または蛍光強度を測定する；操作を含む。
【００３２】
上記（ｄ）の工程は、該組織または細胞と、対照組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度の補正は補正用外部標準遺伝子等の発現量で補正する過程である。ｎ番目の遺伝子の該組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度の補正値（Ｘｎ）と、対照組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度補正値（Ｙｎ）の比較値（Ｒａｔｉｏ）は、次の計算式によって算出される。
Ｒａｔｉｏ＝（Ｘｎ）／（Ｙｎ）
【００３３】
本発明において、評価対象の組織は特に限定されず、筋肉、肝臓、脳、胃、脂肪または血液等を使用することができる。さらに、あらゆる組織を使用することができる。評価対象動物のインスリン自己リン酸化不全の影響を受ける遺伝子の発現量を評価するには、先ず当該組織または血液から全量ｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡを抽出する際には、公知の手法を使用することができ、市販のｍＲＮＡ精製キット（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、商品名ＭＡＣＳ）を使用することができる。
【００３４】
次に、抽出したｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素（例えば、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）および標識ｄＮＴＰ（例えば、アマシャムファルマシアバイオテク社製、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）を用いてｃＤＮＡを作製し、評価対象のマウス組織内に発現している遺伝子量を反映したｃＤＮＡサンプルを調製する。これによりｃＤＮＡサンプル中には、標識されたｃＤＮＡが含まれることとなる。ここで、標識には、蛍光標識または放射線標識のいずれを用いても良い。
【００３５】
このように調製したｃＤＮＡサンプルを一本鎖に変性した状態で上述したマイクロアレイに作用させ、基板上に固定化された遺伝子とｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このとき、例えば、６５℃で１０〜２０時間インキュベートすることによりｃＤＮＡをハイブリダイズさせることができる。
【００３６】
その後、マイクロアレイのＤＮＡ断片とハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを蛍光標識した場合、例えば、蛍光レーザー顕微鏡とＣＣＤカメラとにより蛍光を検出し、コンピュータにより蛍光強度を解析する。なお、ハイブリダイズしたｃＤＮＡを放射線標識した場合も同様に、ＲＩイメージスキャナ等で検出し、コンピュータにより放射線強度を解析することができる。
【００３７】
評価対象の組織または血液において、上述した遺伝子の発現量をマイクロアレイで検出することによって、評価対象におけるインスリン受容体自己リン酸化不全の影響を受ける遺伝子の発現量を測定することができる。
【００３８】
具体的には、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスを用いる場合、この測定には、基板上に固定化したＤＮＡ断片に含まれる遺伝子の発現量の合計を、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスにおける当該遺伝子の発現量の合計に対する相対値として算出した評価値を用いる。すなわち、評価値は、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスの組織または血液における当該遺伝子の発現量の合計と、検定を行うマウスの組織または血液における当該遺伝子の総発現量の合計を等しいとしたときに、それぞれの遺伝子発現量の比の絶対値を合計した値として算出される。
【００３９】
以下、評価値の算出手順を説明する。ｎ番目の遺伝子の発現量Ｄｎは次のように定義できる。
Ｄｎ＝（Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値）
ただし、
Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値＝（Ｃｙ３／Ｃｙ５値）／（補正用遺伝子等のＣｙ３／Ｃｙ５値の平均値）
すなわち、Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値はそれぞれの遺伝子のＣｙ３／Ｃｙ５値を補正用遺伝子等の発現量で補正したものである。補正用遺伝子等は、発現量により合計２７の遺伝子を選定しているが、発現状態などにより変更することができる。
【００４０】
また、この方法では評価対象とする組織や血液から採取された試料を用いることによって、様々な医薬品またはその候補物質のインスリン受容体自己リン酸化不全に関連する遺伝子の発現に対する効果を評価することができる。また、本発明のマイクロアレイに固定化された遺伝子は、２型糖尿病に関与した遺伝子であるから、対象者の組織や血液から採取された試料を本発明のマイクロアレイで評価することによって、どのような疾病に罹患しているか、あるいは罹患する可能性が高いかの診断に応用できる。
【００４１】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA (GenBank Accession No. NM_010233)の４８０４番目から４９９７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNA polymerase delta auxiliary protein) (GenBank Accession No. X57800)の２１９１番目から２８０９番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence (GenBank Accession No. AE000664)の２０３８番目から２２６５番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product:Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence (GenBank Accession No. AK002956)の１０５番目から３３３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8 (GenBank Accession No. AB042809)の１３０番目から３６８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA (GenBank Accession No. NM_010699)の９７１番目から１１２６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：７］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone IMAGE:5356723, mRNA (GenBank Accession No. BC029003)の３０６番目から５１９番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：８］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene (2700084L22Rik), mRNA (GenBank Accession No. NM_026024)の６４１番目から７９１番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：９］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus similar to hypothetical protein [Macaca fascicularis] (LOC231380), mRNA (GenBank Accession No. XM_132182)の１８５番目から３８０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１０］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus growth factor receptor bound protein 10 (Grb10), mRNA (GenBank Accession No. NM_010345)の１１０７番目から１３１０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 4 days neonate male adipose cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:B430216F19 product:SYNAPTOJANIN 1 (EC3.1.3.56) (SYNAPTIC INOSITOL-1,4,5-TRISPHOSPHATE 5- PHOSPHATASE 1) (GenBank Accession No. AK080946)の１４６１番目から１６９７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male lung cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1200014H15 product:procollagen, type I, alpha 2,full insert sequence (GenBank Accession No. AK075707)の３２５１番目から３４３６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA (GenBank Accession No. NM_019829)の１３２０番目から１５１３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 2 days neonate thymus thymic cells cDNA, RIKENfull-length enriched library, clone:C920003J06 product:TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence (GenBank Accession No. AK083312)の４８３番目から７０３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds (GenBank Accession No. BC005460)の３４１番目から５０３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product:beta-2 microglobulin, full insert sequence (GenBank Accession No. AK019389)の７６番目から２３７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１７］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene, 3'UTR (GenBank Accession No. U66575)の１７１９番目から１８５７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１８］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4 (GenBank Accession No. AL627077)の１７４１０４番目から１７４３０２番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１９］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence (GenBank Accession No. AK010495)の５４１番目から７５１番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２０］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence (GenBank Accession No. AC122417)の１１４９２５番目から１１５１３４番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds (GenBank Accession No. BC018485)の６２０番目から７８４番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds (GenBank Accession No. AF525300)の２１７０番目から２３６６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product:ribosomal protein L24, full insert sequence (GenBank Accession No. AK018731)の１１８番目から３１８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence (GenBank Accession No. AK012684)の１５５番目から３６８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA (GenBank Accession No. XM_128337)の４３８番目から６１０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 0 day neonate eyeball cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:E130315B21 product:hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein, full insert sequence (GenBank Accession No. AK053856)の１０６０番目から１２８５番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２７］
実施例で用いたＭ１３Ｆプライマーを示す。
［配列番号：２８］
実施例で用いたＭ１３Ｒプライマーを示す。
［配列番号：２９］
マウス由来インスリン受容体のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
実施例
以下、本発明に係るマイクロアレイを用いて変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体胎仔におけるインスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子を検出した例を実施例として説明する。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
マイクロアレイメンブランに搭載する遺伝子ＤＮＡ断片の調製
マイクロアレイに搭載する遺伝子は、クローニング法によってプラスミド（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した形で保持されているものを使用した。挿入遺伝子配列の確認はまず、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋における遺伝子挿入部位の前後の配列に特異的なＰＣＲプライマーであるＭ１３Ｆプライマー（配列番号：２７）または、Ｍ１３Ｒプライマー（配列番号：２８）と、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して解析用サンプルを調製し、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００、アプライドバイオシステムズ社）での解析によって挿入遺伝子の約７００塩基の配列情報を取得した。次に、取得した塩基配列について、相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、ＤＮＡデータベース上のどの遺伝子と一致するかを調べた。
【００４４】
各遺伝子に特異的なＤＮＡ断片の設計は、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーを設計するプログラムであるＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて行った。各遺伝子の全配列をプログラムに入力後、以下の条件のみを変更し、その他はプログラムの初期設定のままプライマー設計を行った。
Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｉｚｅ Ｒａｎｇｅｓ： １５０−２００
Ｍａｘ ３’Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ： ８．０
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｍｉｎ： ２１
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｏｐｔ： ２３
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｍａｘ： ２６
Ｐｒｉｍｅｒ ＧＣ Ｍａｘ： ５０．０
得られたプライマー配列と、遺伝子全配列を照らし合わせ、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーではさまれている全配列中の配列を、マイクロアレイに搭載する遺伝子断片とした。
【実施例２】
【００４５】
ｃＤＮＡ放射線標識法とメンブレンマイクロアレイを利用した、インスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子の検出
（１）ＤＮＡサンプルの調製
本例では、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体である１８．５日齢のマウス胎仔、および野生型マウスの肝臓からトリゾル試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて抽出したそれぞれのｍＲＮＡを鋳型として、32Ｐ標識ｄＣＴＰを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により放射性標識ｃＤＮＡサンプルを調製した。
【００４６】
（２）メンブレンマイクロアレイを用いた発現量の測定
（１）で調製したそれぞれの放射線標識ｃＤＮＡ溶液を３５０μｌのハイブリダイゼーション液（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ、東洋紡）中に置換した後に変性させた。下記表１中ＩＤ１から５１がメンブラン上に固定した遺伝子を表し、それぞれ"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus ATP-binding cassette 1, sub-family A, member 1 (Abca1) gene, complete cds."、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mus musculus 12 days embryo male wolffian duct includes surrounding region cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:6720473P21product:growth factor receptor bound protein 10, full insert sequence."、"Mus musculus ribosomal protein L36 (Rpl36), mRNA."、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus, sorbitol dehydrogenase 1"、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus alpha fetoprotein"、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine leukemia virus clone lymph-DD2, mRNA sequence"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus complement component 3 (C3), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-278I21 on chromosome 11,complete sequence."、"Mus musculus adult male small intestine cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2010004J23 product:ribosomal protein L4, cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus similar to dJ794I6.1.1 (l(3)mbt-like (Drosophila)(DKFZP434N061) variant 1 ) [Homo sapiens] (LOC228602), mRNA."、"Mus musculus DIF-3 mRNA for dioxin inducible factor 3, complete cds."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus, similar to Transcription factor BTF3 (RNA polymerase B transcription factor 3)"、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2 (mitochondrial)"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus LTRPC7 (Ltrpc7) mRNA, complete cds."、"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus adult male testis cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1700008C22 product: similar to SEX-REGULATED PROTEIN JANUS-A (CGI-202) [Homo sapiens], full insert sequence."、"Mus musculus Naip3 gene, exon 1; neuronal apoptosis inhibitory protein 1 (Naip1) and general transcription factor IIH polypeptide 2 (Gtf2h2) genes, complete cds."、"Mouse mRNA for thymosin beta-4."、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610005D09:cathepsin L, full insert sequence."、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."、"Mus musculus histocompatibility 2, D region locus 1 (H2-D1), mRNA."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus polytropic MLV-related provirus NJ2 integrase (pol)gene, partial cds; envelope polyprotein (env) gene, complete cds;and long terminal repeat, partial sequence"、"Mus musculus DNA polymerase gamma mRNA, nuclear gene encoding mitochondrial protein, complete cds"、"Mus musculus spinster-like protein mRNA, complete cds."、"Mus musculus eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 2,mRNA (cDNA clone IMAGE:5696921), partial cds."、"Mus musculus 10 day old male pancreas cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1810027O15 product:ribosomal protein L4,cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus adult male liver cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1300004I11:mannosidase 2, alpha B2, full insert sequence."に相当する。これらの遺伝子および／またはＥＳＴの一部又は全部を含むＤＮＡ断片をメンブレン上に固定したマイクロアレイメンブレンと共に、ハイブリダイゼーションチャンバー中でそれぞれ１６時間、６５℃でインキュベートした。その後、マイクロアレイメンブレンをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、６５℃の２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ溶液での１５分間の振盪洗浄を２回行った。この振盪洗浄を更に１回行った。マイクロアレイメンブレンを軽く乾燥させた後に、ＦＬＡ−８０００（富士フィルム社）を用いてそれぞれの放射線強度を測定し、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体由来のｃＤＮＡをハイブリダイズさせた場合の放射性強度を表１中の「Ｄｅｎｓ（ＤＭ）」に、野生型マウスのｃＤＮＡをハイブリダイズさせた場合の放射性強度を表１中の「Ｄｅｎｓ（ＷＴ）」に示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１中の「Ｒａｔｉｏ」に変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体におけるマイクロアレイメンブレン上に固定化されたそれぞれ遺伝子の、野生型マウスに対する発現量の比を示した。このように、インスリン受容体自己リン酸化不全を示す２型糖尿病モデルマウスホモ接合体において上記遺伝子は有意に高い値を示した。従って、この結果から、上述したマイクロアレイによりインスリン受容体自己リン酸化不全に影響する遺伝子の発現状態を評価できることが示される。
【実施例３】
【００４９】
ｃＤＮＡ蛍光標識法とスライドガラスマイクロアレイを利用したインスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子の検出
上述した方法と同様に野生型マウスと、変異インスリン受容体を発現している２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体の胎仔肝臓細胞からｃＤＮＡを調製した。それぞれのｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて蛍光色素Ｃｙａｎｉｎｅ３ （Ｃｙ３）−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で標識した。これらの標識ｃＤＮＡを４５℃のアルカリ条件下で変性した後、上述したインスリン受容体自己リン酸化不全状態に関連する遺伝子をスライドグラス上に固定化したマイクロアレイに滴下した。これらを６５℃のハブリダイゼーション液（東洋紡）中で１６時間インキュベートした後に、５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳと０．１％ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで５分間の振盪洗浄を２回行った。蛍光量の測定はＦＬＡ−８０００を用いて測定した。その結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２中、ＩＤ１から２６は用いた遺伝子を表し、それぞれ"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."に相当する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によりインスリン自己リン酸化不全に関与する遺伝子の発現を測定可能なマイクロアレイを提供することができる。このようなマイクロアレイは２型糖尿病の診断に応用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号：２７は実施例で用いたＭ１３Ｆプライマーを示す。
配列番号：２８は実施例で用いたＭ１３Ｒプライマーを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡプローブを基板上に固定化してなるマイクロアレイおよびこれを用いたインスリン受容体の変異による糖尿病状態の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はインスリンの作用不足によって慢性の高血糖状態により引き起こされる代謝疾患である。２型糖尿病の場合、環境的因子（例えば肥満、過食、運動不足、ストレス）の影響を受けるインスリン作用障害＝インスリン抵抗性と、遺伝的に規定された因子によるインスリン分泌不全は、高血糖の持続により糖毒性を形成して発症する。インスリンの受容体への結合から血糖低下作用への一連の情報伝達の過程で鍵となる機能タンパク質−インスリン受容体、インスリン受容体基質、ＰＩ−３キナーゼ、糖輸送担体などのどこかに重大な機能低下を引き起こすような遺伝子変異があれば、インスリンの作用障害があらわれ糖尿病が発症する。また、インスリン分泌細胞でもこれらの刺激伝達系の障害がインスリン分泌不全をもたらすことが報告されている。これらの検証に有用な疾患モデル動物は特開２００２−２７２３１８（特許文献１）に２型糖尿病モデルマウスとして開示されている。
【０００３】
従来、インスリン抵抗性に起因する糖尿病の影響を診断するには、血清中や尿中の糖および／またはケトン体の量を検査することにより診断されている。しかし、この検査方法ではインスリン抵抗性の原因の一つであるインスリン受容体自己リン酸化不全により発現が変動する関連遺伝子の評価を行うことはできなかった。
【０００４】
ハイブリダイゼーションをＤＮＡなどの塩基配列の同定に利用した研究は１９６０年代から始まり、ヒトゲノムプロジェクトにより飛躍的な技術革新がもたらされた。その中で、遺伝子発現解析、遺伝子変異検出等に利用される技術としてＤＮＡマイクロアレイが知られている。遺伝子発現解析では、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、発生の過程、生理的応答あるいは疾患の特徴を状況に応じて増減するｍＲＮＡ量を蛍光パターンとして視覚化することができる。遺伝子変異検出としては、１塩基の違いが病態の差、治療薬に対する反応の差として現れる一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰと略す）の解析にＤＮＡマイクロアレイが用いられている。
【０００５】
しかし、インスリン抵抗性の原因の一つであるインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることに起因する関連遺伝子の発現状態の変化を、マイクロアレイを用いて評価するような手法は確立されていない。
【特許文献１】特開２００２−２７２３１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述したような実状に鑑みてなされたものであり、インスリン受容体自己リン酸化不全により発現量が変動する遺伝子を評価することの出来るマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、以下に示すマイクロアレイ、マイクロアレイを用いた評価方法等を提供する。
（１）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
（２）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子群である、上記（１）に記載のマイクロアレイ。
（３）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃで特定される遺伝子からなる群から選択される、上記（１）または（２）に記載のマイクロアレイ。
（４）インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４で特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
（５）マウスが２型糖尿病である、上記（２）から（４）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（６）インスリン受容体の自己リン酸化不全が変異インスリン受容体に起因する、上記（１）から（５）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（７）インスリン受容体の変異がインスリン受容体の１１９５番目のプロリンがロイシンに置換されたことに起因する上記（６）に記載のマイクロアレイ。
（８）基板上に固定化されるＤＮＡが遺伝子の部分長および／または全長である、上記（１）から（７）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（９）２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
（１０）上記（１）から（８）のいずれか、および（９）に記載のマイクロアレイを用いることを特徴とするインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法であって、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；
からなる評価方法。
（１１）対照組織または細胞が変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病ヒトの肝臓組織由来である、上記（１０）に記載の評価方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロアレイを用いることにより、インスリン受容体自己リン酸化不全が影響する遺伝子の発現を測定することができる。このようなマイクロアレイは２型糖尿病の診断に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを提供する。ここでＤＮＡとは基板に固定化されうるＤＮＡを含み、二本鎖ＤＮＡであっても一本鎖ＤＮＡであってもかまわない。
【００１０】
インスリンの結合によりインスリン受容体（配列番号：２９）に内在するチロシンキナーゼ活性が活性化されると、インスリン受容体の自己リン酸化が起き、インスリン受容体基質蛋白ファミリー（ＩＲＳｓ；ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３）がチロシンリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳｓはＰＩ−３キナーゼを活性化し、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ−４）の細胞質から細胞膜への輸送を促進し、グルコースの取込みが促進される。すなわち、インスリン受容体の自己リン酸化不全はその後の一連の反応を滞らせる原因となる。ここで、インスリン受容体の自己リン酸化不全とは、特開２００２−２７２３１８に示されるように、肝臓より抽出されたインスリン受容体を含む膜タンパクにインスリン刺激を加えた後に、リン酸化反応液による処理を行ってもインスリン受容体がリン酸化されない状態を意味する。このようなインスリン受容体の自己リン酸化不全は２型糖尿病に関与していることが知られている（特開２００２−２７２３１８）。
【００１１】
ここで、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群とは、インスリン受容体の自己リン酸化により惹起される一連の反応に関連する遺伝子をいう。具体的には、そのような遺伝子群はMus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus ATP-binding cassette 1, sub-family A, member 1 (Abca1) gene, complete cds."、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mus musculus 12 days embryo male wolffian duct includes surrounding region cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:6720473P21product:growth factor receptor bound protein 10, full insert sequence."、"Mus musculus ribosomal protein L36 (Rpl36), mRNA."、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus, sorbitol dehydrogenase 1"、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus alpha fetoprotein"、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine leukemia virus clone lymph-DD2, mRNA sequence"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus complement component 3 (C3), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-278I21 on chromosome 11,complete sequence."、"Mus musculus adult male small intestine cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2010004J23 product:ribosomal protein L4, cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus similar to dJ794I6.1.1 (l(3)mbt-like (Drosophila)(DKFZP434N061) variant 1 ) [Homo sapiens] (LOC228602), mRNA."、"Mus musculus DIF-3 mRNA for dioxin inducible factor 3, complete cds."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus, similar to Transcription factor BTF3 (RNA polymerase B transcription factor 3)"、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2 (mitochondrial)"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus LTRPC7 (Ltrpc7) mRNA, complete cds."、"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus adult male testis cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1700008C22 product: similar to SEX-REGULATED PROTEIN JANUS-A (CGI-202) [Homo sapiens], full insert sequence."、"Mus musculus Naip3 gene, exon 1; neuronal apoptosis inhibitory protein 1 (Naip1) and general transcription factor IIH polypeptide 2 (Gtf2h2) genes, complete cds."、"Mouse mRNA for thymosin beta-4."、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610005D09:cathepsin L, full insert sequence."、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."、"Mus musculus histocompatibility 2, D region locus 1 (H2-D1), mRNA."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus polytropic MLV-related provirus NJ2 integrase (pol)gene, partial cds; envelope polyprotein (env) gene, complete cds;and long terminal repeat, partial sequence"、"Mus musculus DNA polymerase gamma mRNA, nuclear gene encoding mitochondrial protein, complete cds"、"Mus musculus spinster-like protein mRNA, complete cds."、"Mus musculus eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 2,mRNA (cDNA clone IMAGE:5696921), partial cds."、"Mus musculus 10 day old male pancreas cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1810027O15 product:ribosomal protein L4,cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus adult male liver cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1300004I11:mannosidase 2, alpha B2, full insert sequence."があげられ、特に"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."を含む。本発明のマイクロアレイは、これらの遺伝子群の一部または全部を用いて作製することができる。
【００１２】
ここで遺伝子群の一部とは、上記の一群から選択される２種以上、好ましくは１０種以上、より好ましくは１５種以上、さらに好ましくは２０種以上、さらに好ましくは４０種以上をいう。
【００１３】
ＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイは、ＤＮＡチップとも呼ばれ、スライドガラスやシリコン等からなる基板と、この基板上に整列して固定化されたＤＮＡ断片とから構成されている。本明細書ではＤＮＡマイクロアレイを単にマイクロアレイと記載する。このマイクロアレイを用い、試料中に含まれる放射性同位元素または蛍光物質により標識されたＤＮＡをハイブリダイズすることにより、高感度に検出することができる。マイクロアレイの結合位置からＤＮＡの塩基配列の情報が、また蛍光強度等からＤＮＡ量の情報が得られる。
【００１４】
マイクロアレイは基板と、この基板上に整列して固定化されたＤＮＡ断片とから構成されている。基板は、紙、ナイロン、またはニトロセルロースなどの他の型の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、あるいは中空繊維などの他の型の固体支持体である。本発明では、マイクロアレイスキャナーによるマイクロアレイの放射線強度、または蛍光強度を測定する際、バックグラウンドやノイズによる障害が比較的少ない事、またマイクロアレイに固定化するＤＮＡ断片は、数塩基のものから遺伝子全体をカバーする長さまで対応
可能である、という理由から、ナイロン膜あるいはガラススライドが基板として好ましく用いられる。
【００１５】
マイクロアレイを製造する方法として、光リソグラフィー法とスポット法が知られている。光リソグラフィー法はアフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）の製造に利用されている方法であるが、基板上に合成されるオリゴヌクレオチドの長さが限定される欠点がある。一方、スポット法により基板上に固定化されるヌクレオチドには長さによる限定はない。すなわち、スポット法により数塩基のものから遺伝子全体をカバーする長さまで基板に固定化が可能である。
【００１６】
マイクロアレイは以下の手順で作製することができる。
基板へのＤＮＡの搭載方法としては、例えば特開平１１−０２１２９３（光リソグラフィー法）および特開２００２−２４３７３６（スポット法）等に開示される方法を用いることができる。本発明ではヌクレオチドの長さに限定されることなく、安価にマイクロアレイを作製できるので、スポット法を好ましく用いうる。具体的には、（１）搭載するＤＮＡを専用のスポット液に溶解し、（２）マイクロプレートに分注する。ここでマイクロプレートはＤＮＡ溶液の数にもよるが、好ましくは９６穴、さらに好ましくは３８４穴のものが用いられる。（３）マイクロプレートと基板をマイクロアレイスポッターにセットし、予め設計しておいたＤＮＡの配置情報をマイクロアレイスポッターに設定して、基板上へＤＮＡを搭載させる。
【００１７】
基板上にＤＮＡ断片を固定化する際には、基板１ｃｍ2あたり３０から３６スポット、好ましくは６０から６４スポット、より好ましくは１３０から１４４スポット、さらに好ましくは２３０から２５６スポット、最も好ましくは２９２から３２４スポットが用いられる。具体的に、本発明では基板１個あたり１２８スポット（６４スポット／ｃｍ2）が好ましく用いられる。
【００１８】
本発明はまた、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子である遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを提供する。
本発明のマイクロアレイに固定化できるＤＮＡはインスリン受容体の自己リン酸化不全を示す動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒト）に由来する遺伝子であればいずれの遺伝子でも用いうるが、研究対象として頻繁に用いられているという理由から、特にヒト、マウス、ラット、モルモット等が好ましく、本発明ではヒトが最も好ましく用いられる。
【００１９】
また、本発明のマイクロアレイはインスリン受容体の変異によるインスリン受容体自己リン酸化不全により発現が影響される遺伝子群の一部または全部および／または全部を含むものである。具体的に当該遺伝子としては、インスリン受容体の１１９５番目のプロリンをロイシンに置換した変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウス由来の遺伝子を挙げることができる。さらに組織および／または細胞として、インスリン受容体に変異を有する２型糖尿病モデルマウスの胎仔肝臓細胞で発現する遺伝子の一部または全部を使用することができる。
【００２０】
ここで、インスリン受容体変異によるインスリン受容体自己リン酸化不全によって発現量が変化するとは、自己リン酸化が不全な状態でｍＲＮＡ量の変化が１．２倍以上、より明確には１．５倍以上、あるいは０．８０倍以下、より明確には０．６７倍以下であるかを意味する。
【００２１】
本発明のマイクロアレイに固定化できる遺伝子ＤＮＡは、検出可能であれば、その遺伝子の部分長であっても、完全長であってもかまわない。部分長である場合、具体的には１５から３０ヌクレオチド、５０から７０ヌクレオチド、好ましくは８０から１００ヌクレオチド、より好ましくは１２０から１５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７０から１９０ヌクレオチド、最も好ましくは２００から２５０ヌクレオチドのＤＮＡを固定化できる。
【００２２】
また、部分長である場合、選択される領域は遺伝子を構成する領域であればいずれの領域でもかまわないが、その遺伝子に特異的な配列を含む領域が好ましく選択される。
【００２３】
各遺伝子に特異的なＤＮＡ断片を設計する場合、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーを設計するプログラムであるＰｒｉｍｅｒ３（Ｔｈｅ ＭＩＴ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計することができる。プログラムから得られるプライマー配列と、遺伝子全配列を照らし合わせ、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーではさまれている全配列中の配列をマイクロアレイに搭載する遺伝子断片として用いることができる。
【００２４】
マイクロアレイに搭載する遺伝子は、クローニング法によってプラスミド、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した形で保持されている遺伝子を使用することができる。挿入遺伝子配列の確認はまず、遺伝子挿入部位の前後のプラスミドに由来する配列に特異的なＰＣＲプライマーと、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して解析用サンプルを調製し、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００、アプライドバイオシステムズ社）での解析によって挿入遺伝子の約７００塩基の配列情報を取得する。次に、この塩基配列について、相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、ＤＮＡデータベース上のどの遺伝子と一致するかを調べる。
【００２５】
このように選択される遺伝子群として、具体的にはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃを含む遺伝子群、特に好ましくはＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４からなる遺伝子群が例示できる。
【００２６】
本発明のマイクロアレイを用いる場合、その対照として２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイを用いることができる。これらの遺伝子は遺伝子の発現量を補正するために用いることができる。２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群としては例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０１０４９５のような癌関連遺伝子、Ｘ５７８００のような細胞増殖および／または分裂に関与する遺伝子、ＡＥ０００６６４のような受容体として機能するポリペプチドをコードする遺伝子、ＢＣ００８２３３のような転写関連遺伝子、Ｘ１６０５３のような細胞構造に関与する遺伝子、ＮＭ＿０１０６９９のような代謝関連遺伝子、ＡＫ０７５７０７のような分泌関連遺伝子、ＸＭ＿２８３４０８のような免疫関連遺伝子等があげられる。これらの遺伝子は上記と同様にマイクロアレイ化できる。
【００２７】
本発明はまた、上記のマイクロアレイを用いた、インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の評価方法を提供する。すなわち、評価対象の組織または細胞におけるインスリン受容体自己リン酸化不全に影響を受ける遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２８】
本発明の評価方法は、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；
からなる。
【００２９】
具体的には、上記（ａ）の工程は以下の操作を含む。
（１）ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）の中に組織または細胞を入れ、ホモジナイザーで均質化する。
（２）クロロフォルムを添加し、撹拌した後、室温で放置する。
（３）遠心機を用いて遠心した後、上層液を別の容器に移し、イソプロパノールを加えて撹拌する。
（４）遠心機を用いて遠心し、上澄み液を除去した後、７５％ＥｔＯＨを添加し撹拌する。
（５）遠心機を用いて遠心し、上澄み液を完全に除去する。
（６）風乾した後、ＤＥＰＣ Ｄ２Ｗを加え、核酸試料を融解させる；（７）３２Ｐ標識ｄＣＴＰまたはＣｙａｎｉｎｅ３／５標識ｄＵＴＰを用いて、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識ｃＤＮＡサンプルを調製する。
【００３０】
上記（ｂ）の工程は、標識ｃＤＮＡ溶液をハイブリダイゼーション液（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ、東洋紡）中に添加した後に変性させ、マイクロアレイと共に、ハイブリダイゼーションチャンバー中において１６時間、６５℃の条件でインキュベートする過程である。
【００３１】
上記（ｃ）の工程は、（１）マイクロアレイをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、６５℃の２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ溶液での１５分間の振盪洗浄を２回行う；（２）マイクロアレイを軽く乾燥させた後に、ＦＬＡ−８０００（富士フィルム社）などのマイクロアレイスキャナーを用いてそれぞれの放射線強度、または蛍光強度を測定する；操作を含む。
【００３２】
上記（ｄ）の工程は、該組織または細胞と、対照組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度の補正は補正用外部標準遺伝子等の発現量で補正する過程である。ｎ番目の遺伝子の該組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度の補正値（Ｘｎ）と、対照組織または細胞の放射線強度、または蛍光強度補正値（Ｙｎ）の比較値（Ｒａｔｉｏ）は、次の計算式によって算出される。
Ｒａｔｉｏ＝（Ｘｎ）／（Ｙｎ）
【００３３】
本発明において、評価対象の組織は特に限定されず、筋肉、肝臓、脳、胃、脂肪または血液等を使用することができる。さらに、あらゆる組織を使用することができる。評価対象動物のインスリン自己リン酸化不全の影響を受ける遺伝子の発現量を評価するには、先ず当該組織または血液から全量ｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡを抽出する際には、公知の手法を使用することができ、市販のｍＲＮＡ精製キット（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、商品名ＭＡＣＳ）を使用することができる。
【００３４】
次に、抽出したｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素（例えば、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）および標識ｄＮＴＰ（例えば、アマシャムファルマシアバイオテク社製、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）を用いてｃＤＮＡを作製し、評価対象のマウス組織内に発現している遺伝子量を反映したｃＤＮＡサンプルを調製する。これによりｃＤＮＡサンプル中には、標識されたｃＤＮＡが含まれることとなる。ここで、標識には、蛍光標識または放射線標識のいずれを用いても良い。
【００３５】
このように調製したｃＤＮＡサンプルを一本鎖に変性した状態で上述したマイクロアレイに作用させ、基板上に固定化された遺伝子とｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このとき、例えば、６５℃で１０〜２０時間インキュベートすることによりｃＤＮＡをハイブリダイズさせることができる。
【００３６】
その後、マイクロアレイのＤＮＡ断片とハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを蛍光標識した場合、例えば、蛍光レーザー顕微鏡とＣＣＤカメラとにより蛍光を検出し、コンピュータにより蛍光強度を解析する。なお、ハイブリダイズしたｃＤＮＡを放射線標識した場合も同様に、ＲＩイメージスキャナ等で検出し、コンピュータにより放射線強度を解析することができる。
【００３７】
評価対象の組織または血液において、上述した遺伝子の発現量をマイクロアレイで検出することによって、評価対象におけるインスリン受容体自己リン酸化不全の影響を受ける遺伝子の発現量を測定することができる。
【００３８】
具体的には、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスを用いる場合、この測定には、基板上に固定化したＤＮＡ断片に含まれる遺伝子の発現量の合計を、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスにおける当該遺伝子の発現量の合計に対する相対値として算出した評価値を用いる。すなわち、評価値は、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスの組織または血液における当該遺伝子の発現量の合計と、検定を行うマウスの組織または血液における当該遺伝子の総発現量の合計を等しいとしたときに、それぞれの遺伝子発現量の比の絶対値を合計した値として算出される。
【００３９】
以下、評価値の算出手順を説明する。ｎ番目の遺伝子の発現量Ｄｎは次のように定義できる。
Ｄｎ＝（Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値）
ただし、
Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値＝（Ｃｙ３／Ｃｙ５値）／（補正用遺伝子等のＣｙ３／Ｃｙ５値の平均値）
すなわち、Ｃｙ３／Ｃｙ５補正値はそれぞれの遺伝子のＣｙ３／Ｃｙ５値を補正用遺伝子等の発現量で補正したものである。補正用遺伝子等は、発現量により合計２７の遺伝子を選定しているが、発現状態などにより変更することができる。
【００４０】
また、この方法では評価対象とする組織や血液から採取された試料を用いることによって、様々な医薬品またはその候補物質のインスリン受容体自己リン酸化不全に関連する遺伝子の発現に対する効果を評価することができる。また、本発明のマイクロアレイに固定化された遺伝子は、２型糖尿病に関与した遺伝子であるから、対象者の組織や血液から採取された試料を本発明のマイクロアレイで評価することによって、どのような疾病に罹患しているか、あるいは罹患する可能性が高いかの診断に応用できる。
【００４１】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA (GenBank Accession No. NM_010233)の４８０４番目から４９９７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNA polymerase delta auxiliary protein) (GenBank Accession No. X57800)の２１９１番目から２８０９番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence (GenBank Accession No. AE000664)の２０３８番目から２２６５番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product:Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence (GenBank Accession No. AK002956)の１０５番目から３３３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8 (GenBank Accession No. AB042809)の１３０番目から３６８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA (GenBank Accession No. NM_010699)の９７１番目から１１２６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：７］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone IMAGE:5356723, mRNA (GenBank Accession No. BC029003)の３０６番目から５１９番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：８］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene (2700084L22Rik), mRNA (GenBank Accession No. NM_026024)の６４１番目から７９１番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：９］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus similar to hypothetical protein [Macaca fascicularis] (LOC231380), mRNA (GenBank Accession No. XM_132182)の１８５番目から３８０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１０］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus growth factor receptor bound protein 10 (Grb10), mRNA (GenBank Accession No. NM_010345)の１１０７番目から１３１０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 4 days neonate male adipose cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:B430216F19 product:SYNAPTOJANIN 1 (EC3.1.3.56) (SYNAPTIC INOSITOL-1,4,5-TRISPHOSPHATE 5- PHOSPHATASE 1) (GenBank Accession No. AK080946)の１４６１番目から１６９７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male lung cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1200014H15 product:procollagen, type I, alpha 2,full insert sequence (GenBank Accession No. AK075707)の３２５１番目から３４３６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA (GenBank Accession No. NM_019829)の１３２０番目から１５１３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 2 days neonate thymus thymic cells cDNA, RIKENfull-length enriched library, clone:C920003J06 product:TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence (GenBank Accession No. AK083312)の４８３番目から７０３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds (GenBank Accession No. BC005460)の３４１番目から５０３番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product:beta-2 microglobulin, full insert sequence (GenBank Accession No. AK019389)の７６番目から２３７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１７］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene, 3'UTR (GenBank Accession No. U66575)の１７１９番目から１８５７番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１８］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4 (GenBank Accession No. AL627077)の１７４１０４番目から１７４３０２番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：１９］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence (GenBank Accession No. AK010495)の５４１番目から７５１番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２０］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence (GenBank Accession No. AC122417)の１１４９２５番目から１１５１３４番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２１］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds (GenBank Accession No. BC018485)の６２０番目から７８４番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２２］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds (GenBank Accession No. AF525300)の２１７０番目から２３６６番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２３］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product:ribosomal protein L24, full insert sequence (GenBank Accession No. AK018731)の１１８番目から３１８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２４］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence (GenBank Accession No. AK012684)の１５５番目から３６８番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２５］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA (GenBank Accession No. XM_128337)の４３８番目から６１０番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２６］
実施例で用いたマイクロアレイに搭載した遺伝子断片の塩基配列を示す。Mus musculus 0 day neonate eyeball cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:E130315B21 product:hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein, full insert sequence (GenBank Accession No. AK053856)の１０６０番目から１２８５番目の塩基配列に相当する。
［配列番号：２７］
実施例で用いたＭ１３Ｆプライマーを示す。
［配列番号：２８］
実施例で用いたＭ１３Ｒプライマーを示す。
［配列番号：２９］
マウス由来インスリン受容体のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
実施例
以下、本発明に係るマイクロアレイを用いて変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体胎仔におけるインスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子を検出した例を実施例として説明する。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
マイクロアレイメンブランに搭載する遺伝子ＤＮＡ断片の調製
マイクロアレイに搭載する遺伝子は、クローニング法によってプラスミド（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した形で保持されているものを使用した。挿入遺伝子配列の確認はまず、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋における遺伝子挿入部位の前後の配列に特異的なＰＣＲプライマーであるＭ１３Ｆプライマー（配列番号：２７）または、Ｍ１３Ｒプライマー（配列番号：２８）と、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して解析用サンプルを調製し、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００、アプライドバイオシステムズ社）での解析によって挿入遺伝子の約７００塩基の配列情報を取得した。次に、取得した塩基配列について、相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、ＤＮＡデータベース上のどの遺伝子と一致するかを調べた。
【００４４】
各遺伝子に特異的なＤＮＡ断片の設計は、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーを設計するプログラムであるＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて行った。各遺伝子の全配列をプログラムに入力後、以下の条件のみを変更し、その他はプログラムの初期設定のままプライマー設計を行った。
Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｉｚｅ Ｒａｎｇｅｓ： １５０−２００
Ｍａｘ ３’Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ： ８．０
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｍｉｎ： ２１
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｏｐｔ： ２３
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｉｚｅ Ｍａｘ： ２６
Ｐｒｉｍｅｒ ＧＣ Ｍａｘ： ５０．０
得られたプライマー配列と、遺伝子全配列を照らし合わせ、ＰＣＲ法で増幅したいＤＮＡ配列に特異的な両端プライマーではさまれている全配列中の配列を、マイクロアレイに搭載する遺伝子断片とした。
【実施例２】
【００４５】
ｃＤＮＡ放射線標識法とメンブレンマイクロアレイを利用した、インスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子の検出
（１）ＤＮＡサンプルの調製
本例では、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体である１８．５日齢のマウス胎仔、および野生型マウスの肝臓からトリゾル試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて抽出したそれぞれのｍＲＮＡを鋳型として、32Ｐ標識ｄＣＴＰを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により放射性標識ｃＤＮＡサンプルを調製した。
【００４６】
（２）メンブレンマイクロアレイを用いた発現量の測定
（１）で調製したそれぞれの放射線標識ｃＤＮＡ溶液を３５０μｌのハイブリダイゼーション液（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ、東洋紡）中に置換した後に変性させた。下記表１中ＩＤ１から５１がメンブラン上に固定した遺伝子を表し、それぞれ"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus ATP-binding cassette 1, sub-family A, member 1 (Abca1) gene, complete cds."、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mus musculus 12 days embryo male wolffian duct includes surrounding region cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:6720473P21product:growth factor receptor bound protein 10, full insert sequence."、"Mus musculus ribosomal protein L36 (Rpl36), mRNA."、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus, sorbitol dehydrogenase 1"、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus alpha fetoprotein"、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine leukemia virus clone lymph-DD2, mRNA sequence"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus complement component 3 (C3), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-278I21 on chromosome 11,complete sequence."、"Mus musculus adult male small intestine cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2010004J23 product:ribosomal protein L4, cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus similar to dJ794I6.1.1 (l(3)mbt-like (Drosophila)(DKFZP434N061) variant 1 ) [Homo sapiens] (LOC228602), mRNA."、"Mus musculus DIF-3 mRNA for dioxin inducible factor 3, complete cds."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus, similar to Transcription factor BTF3 (RNA polymerase B transcription factor 3)"、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2 (mitochondrial)"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus LTRPC7 (Ltrpc7) mRNA, complete cds."、"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus adult male testis cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1700008C22 product: similar to SEX-REGULATED PROTEIN JANUS-A (CGI-202) [Homo sapiens], full insert sequence."、"Mus musculus Naip3 gene, exon 1; neuronal apoptosis inhibitory protein 1 (Naip1) and general transcription factor IIH polypeptide 2 (Gtf2h2) genes, complete cds."、"Mouse mRNA for thymosin beta-4."、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610005D09:cathepsin L, full insert sequence."、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."、"Mus musculus histocompatibility 2, D region locus 1 (H2-D1), mRNA."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus polytropic MLV-related provirus NJ2 integrase (pol)gene, partial cds; envelope polyprotein (env) gene, complete cds;and long terminal repeat, partial sequence"、"Mus musculus DNA polymerase gamma mRNA, nuclear gene encoding mitochondrial protein, complete cds"、"Mus musculus spinster-like protein mRNA, complete cds."、"Mus musculus eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 2,mRNA (cDNA clone IMAGE:5696921), partial cds."、"Mus musculus 10 day old male pancreas cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1810027O15 product:ribosomal protein L4,cytosolic homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence."、"Mus musculus adult male liver cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:1300004I11:mannosidase 2, alpha B2, full insert sequence."に相当する。これらの遺伝子および／またはＥＳＴの一部又は全部を含むＤＮＡ断片をメンブレン上に固定したマイクロアレイメンブレンと共に、ハイブリダイゼーションチャンバー中でそれぞれ１６時間、６５℃でインキュベートした。その後、マイクロアレイメンブレンをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、６５℃の２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ溶液での１５分間の振盪洗浄を２回行った。この振盪洗浄を更に１回行った。マイクロアレイメンブレンを軽く乾燥させた後に、ＦＬＡ−８０００（富士フィルム社）を用いてそれぞれの放射線強度を測定し、変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体由来のｃＤＮＡをハイブリダイズさせた場合の放射性強度を表１中の「Ｄｅｎｓ（ＤＭ）」に、野生型マウスのｃＤＮＡをハイブリダイズさせた場合の放射性強度を表１中の「Ｄｅｎｓ（ＷＴ）」に示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１中の「Ｒａｔｉｏ」に変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体におけるマイクロアレイメンブレン上に固定化されたそれぞれ遺伝子の、野生型マウスに対する発現量の比を示した。このように、インスリン受容体自己リン酸化不全を示す２型糖尿病モデルマウスホモ接合体において上記遺伝子は有意に高い値を示した。従って、この結果から、上述したマイクロアレイによりインスリン受容体自己リン酸化不全に影響する遺伝子の発現状態を評価できることが示される。
【実施例３】
【００４９】
ｃＤＮＡ蛍光標識法とスライドガラスマイクロアレイを利用したインスリン受容体自己リン酸化不全関連遺伝子の検出
上述した方法と同様に野生型マウスと、変異インスリン受容体を発現している２型糖尿病モデルマウスのホモ接合体の胎仔肝臓細胞からｃＤＮＡを調製した。それぞれのｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて蛍光色素Ｃｙａｎｉｎｅ３ （Ｃｙ３）−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で標識した。これらの標識ｃＤＮＡを４５℃のアルカリ条件下で変性した後、上述したインスリン受容体自己リン酸化不全状態に関連する遺伝子をスライドグラス上に固定化したマイクロアレイに滴下した。これらを６５℃のハブリダイゼーション液（東洋紡）中で１６時間インキュベートした後に、５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳと０．１％ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで５分間の振盪洗浄を２回行った。蛍光量の測定はＦＬＡ−８０００を用いて測定した。その結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２中、ＩＤ１から２６は用いた遺伝子を表し、それぞれ"Mus musculus chromosome 7 clone RP24-159C12, complete sequence."、"Mus musculus mitochondrial DNA, complete genome, strain:SAMP8."、"Mus musculus adult male brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0710001G21 product: Mouse endogenous murine leukemia virus modified polytropic provirus DNA, complete cds., full insert sequence."、"Mus musculus 12 days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:3010025M23 product: beta-2 microglobulin, full insert sequence."、"Mus musculus fibronectin 1 (Fn1), mRNA"、"Mus musculus TCR beta locus from bases 250554 to 501917 (section 2 of 3) of the complete sequence."、"Mus musculus similar to hypothetical protein"、"Mus musculus, eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, clone MGC:27859 IMAGE:3491827, mRNA, complete cds."、"Mus musculus syntaxin 5A (Stx5a), mRNA."、"Mus musculus nucleolin, mRNA (cDNA clone MGC:6363 IMAGE:3495665),complete cds."、"Mus musculus STAT6 (Stat6) gene, partial cds and NAB2 (Nab2) gene,3'UTR."、"Mus musculus growth factor receptor bound protein 10, mRNA (cDNA clone MGC:28740 IMAGE:4481345), complete cds. BC016111"、"Murine PCNA gene for proliferating cell nuclear antigen (DNApolymerase delta auxiliary protein)."、"Mus musculus superoxide dismutase 1, soluble (Sod1), mRNA."、"Mus musculus TAR DNA BINDING PROTEIN homolog [Homo sapiens], full insert sequence"、"Mus musculus, Similar to eukaryotic initiation factor 5 (eIF-5), clone BC023074"、"Mus musculus adult male kidney cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:0610008L05 product: ribosomal protein L24, full insert sequence."、"Mus musculus hypothetical P-loop containing nucleotide triphosphate hydrolases structure containing protein"、"Mus musculus polyglutamine-containing protein mRNA, complete cds"、"Mus musculus procollagen, type I"、"Mus musculus RIKEN cDNA 2700084L22 gene"、"Mus musculus ES cells cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2410015H04:RAB5A, member RAS oncogene family, full insert sequence."、"Mus musculus lactate dehydrogenase 1, A chain (Ldh1), mRNA"、"Mouse DNA sequence from clone RP23-384D6 on chromosome 4"、"Mus musculus SYNAPTOJANIN 1"、"Mus musculus 10, 11 days embryo whole body cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:2810007F20:hemoglobin Z, beta-like embryonic chain, full insert sequence."に相当する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によりインスリン自己リン酸化不全に関与する遺伝子の発現を測定可能なマイクロアレイを提供することができる。このようなマイクロアレイは２型糖尿病の診断に応用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号：２７は実施例で用いたＭ１３Ｆプライマーを示す。
配列番号：２８は実施例で用いたＭ１３Ｒプライマーを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
【請求項２】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子群である、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃで特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４で特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
マウスが２型糖尿病である、請求項２から４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
インスリン受容体の自己リン酸化不全が変異インスリン受容体に起因する、請求項１から５のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
インスリン受容体の変異がインスリン受容体の１１９５番目のプロリンがロイシンに置換されたことに起因する請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
基板上に固定化されるＤＮＡが遺伝子の部分長および／または全長である、請求項１から７のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか、および請求項９に記載のマイクロアレイを用いることを特徴とするインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法であって、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；からなる評価方法。
【請求項１１】
対照組織または細胞が変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病ヒトの肝臓組織由来である、請求項１０に記載の評価方法。
【請求項１】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
【請求項２】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がマウス由来の遺伝子群である、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０２３３；Ｘ５７８００；ＡＦ２８７２６３；ＡＥ０００６６４；ＡＫ００２９５６；ＡＢ０４２８０９；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＫ０３２９２７；ＮＭ＿０１８７３０；ＢＣ０２９００３；ＮＭ＿０２６０２４；ＢＣ０２４１２４；ＸＭ＿１３２１８２；ＮＭ＿００７４２３；ＮＭ＿０１０３４５；ＡＦ３９５０１１；ＡＫ０８０９４６；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０１９８２９；ＡＫ０８３３１２；ＮＭ＿００９７７８；ＢＣ００５４６０；ＡＬ５９６２１５；ＡＫ００８０９８；ＡＫ０１９３８９；ＸＭ＿２０３８７３；ＡＢ０６４５４３；ＡＫ０５３８５６；ＢＣ００８２３３；Ｕ６６５７５；ＡＬ６２７０７７；ＮＭ＿１７７４７０；ＡＫ０１０４９５；ＡＹ０３２９５１；ＡＣ１２２４１７；ＢＣ０１８４８５；ＡＫ００５７５６；ＡＦ２４２４３２；Ｘ１６０５３；ＡＦ５２５３００；ＡＫ００２２２１；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０１２６８４；ＸＭ＿２８３４０８；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＹ２１９５６０；Ｕ５３５８４；ＡＦ２１２３７２；ＢＣ０４３０３４；ＡＫ００７６２５；ＡＫ００４９００；ＡＫ００７２７３＿ｓｒｃ；ＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃ；ＢＣ０１４７７２＿ｓｒｃ；ＡＦ１０９１７４＿ｓｒｃ；ＢＣ００２０８８＿ｓｒｃ；ＡＫ００２７８７＿ｓｒｃ；ＡＫ０１０６８９＿ｓｒｃ；ＢＣ０１８４８５＿ｓｒｃ；ＡＫ００２９７０＿ｓｒｃ；ＢＣ０１２３１４＿ｓｒｃ；およびＡＪ０１１４１３＿ｓｒｃで特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
インスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子群がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ１２２４１７；ＡＢ０４２８０９；ＡＫ００２９５６；ＡＫ０１９３８９；ＮＭ＿０１０２３３；ＡＥ０００６６４；ＸＭ＿１３２１８２；ＢＣ０１８４８５；ＮＭ＿０１９８２９；ＢＣ００５４６０；Ｕ６６５７５；ＮＭ＿０１０３４５；Ｘ５７８００；ＸＭ＿１２８３３７；ＡＫ０８３３１２；ＢＣ０２９００３；ＡＫ０１８７３１；ＡＫ０５３８５６；ＡＦ５２５３００；ＡＫ０７５７０７；ＮＭ＿０２６０２４；ＡＫ０１０４９５；ＮＭ＿０１０６９９；ＡＬ６２７０７７；ＡＫ０８０９４６；およびＡＫ０１２６８４で特定される遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
マウスが２型糖尿病である、請求項２から４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
インスリン受容体の自己リン酸化不全が変異インスリン受容体に起因する、請求項１から５のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
インスリン受容体の変異がインスリン受容体の１１９５番目のプロリンがロイシンに置換されたことに起因する請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
基板上に固定化されるＤＮＡが遺伝子の部分長および／または全長である、請求項１から７のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
２型糖尿病マウスにおいて定常的に発現する遺伝子群の一部および／または全部のＤＮＡを基板上に固定化したマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか、および請求項９に記載のマイクロアレイを用いることを特徴とするインスリン受容体の自己リン酸化が不全であることにより発現量が変動する遺伝子の評価方法であって、
（ａ）インスリン受容体自己リン酸化不全に起因する遺伝子の発現変動を評価したい所望の組織または細胞から核酸試料を調製する工程；
（ｂ）該核酸試料を請求項１から６のいずれか、および請求項７に記載のマイクロアレイに接触させる工程；
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程；
（ｄ）（ｃ）の検出結果を、対照組織または細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程；からなる評価方法。
【請求項１１】
対照組織または細胞が変異インスリン受容体を発現する２型糖尿病ヒトの肝臓組織由来である、請求項１０に記載の評価方法。
【公開番号】特開２００６−１０９７４２（Ｐ２００６−１０９７４２Ａ）
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９９５５２（Ｐ２００４−２９９５５２）
【出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９３０６２４０７）株式会社サイメディア (5)
【出願人】（５０１１１５６１２）
【出願人】（５０４３８３９４４）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９３０６２４０７）株式会社サイメディア (5)
【出願人】（５０１１１５６１２）
【出願人】（５０４３８３９４４）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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