インターロイキン−２１の抗原性エピトープ、関連抗体及び医療分野におけるそれらの使用
本発明は、インターロイキン−２１の抗原性エピトープ、関連抗体、及び医療分野、特に、例えば慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、セリアック病及び乾癬などのＩＬ−２１の産生及び／又は活性の増加を特徴とする免疫炎症性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）の抗原性エピトープ及び関連するＩＬ−２１中和抗体、並びにＩＬ−２１の産生又は活性の増加を特徴とする免疫炎症性疾患、例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、セリアック病及び乾癬患者治療のためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年間に、ヒト及び動物モデルで実施されたいくつかの研究が、免疫媒介性疾患の病因についての我々の理解を進め、これらの疾患を有する患者に対する治療的介入を最適にするために貢献している。したがって、乾癬、関節リウマチ、気管支喘息、原発性胆汁性肝硬変、ＣＤ、ＵＣ、セリアック病、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈｐ））関連胃疾患、多発性硬化症（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ２００４、Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ２００４、Ｓｏｌｌｉｄ ２００２、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ２００２）などの疾患において、Ｔリンパ球が主要な病原的役割を果たすことが示された。炎症過程の基礎をなす事象の注意深い分子的分析により、Ｔリンパ球の病原作用は、いくつかの炎症性分子を合成するＴリンパ球の能力に最も関連していることを立証でき、そのサイトカイン（又はインターロイキン）としての適切な例は、単球、樹状細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞に作用して多くの炎症作用を行うことができるサイトカインである腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生によって示される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２００３）。
【０００３】
したがって、これらの炎症性疾患の自然経過及びそれらの病態生理学的メカニズムに関するより高い知識が治療選択の改善に寄与しているが、これらの疾患の各々に対する薬理学的介入はいずれも単に対症的であり、治癒的ではない。多くの患者で炎症性活性の消失及び臨床的緩解の誘導には、副腎皮質ステロイドによる治療を必要とする。しかしながら、そのような薬剤はほぼ５０％の患者で有効であり、これらの患者の半分は、臨床的緩解を維持するために、連続的な治療を必要とすることが広く知られている。残念ながらステロイドの有益な効果は、頻繁にかつしばしば重篤な副作用という代償で成り立っている（Ｓｐａｈｎ １９９７、Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ ２００４）。さらに、しばしば副腎皮質ステロイドを伴うか又はそれに取って代わる免疫抑制治療でさえも、炎症を制限し、症状を管理するのに必ずしも十分ではない。さらに免疫抑制治療は、著しい禁忌及び重篤な副作用という不利な点がある（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、２００２）。
【０００４】
１９９０年代に入手可能となった新しい世代の薬剤は、生物学的薬剤である。これらは組換え型ヒトタンパク質、モノクローナルキメラヒト化抗体及び融合タンパク質を用いる、特異的な炎症性「経路」を管理することを目的とした生物学的療法である。この意昧において、免疫炎症性過程の抑制に優れた効果を示す化合物は、モノクローナル抗ＴＮＦ−α抗体である（ｓｅｅｇｅｒｓら、２００２）。この薬剤は、約５０〜７０％の患者で炎症を抑制することができる。それにもかかわらず、副作用例えば不顕性の微生物感染の再活性化及び過敏性現象の発生率が反復治療と共に増加することが報告されている。後者の現象は、多くの生物学的機能を有するサイトカインを抗体が遮断するということに基づく可能性がある。実際に、ＴＮＦ−αはその炎症性作用以上に、免疫寛容の誘導と維持に関与するメカニズムにおいて役割を果たしている。したがって、ＴＮＦ−αの遮断は、逆に過剰な免疫反応を促進している可能性があると思われる。さらに、３分の１を超える治療患者が、薬剤の有効性を低下させると思われる化合物に対する抗体を産生する（Ｓａｎｄｂｏｒｎ、２００２）。全体としてこれらの知見は、上記の疾患を有する患者管理のための新規化合物の同定を目的とする今後の研究が必要であることを示唆している（Ｆｉｏｃｃｈｉ、２００１）。
【０００５】
インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、最近同定されたサイトカインであり、主として活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球で産生される（Ｈａｂｉｂ ２００３、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ ２００２）。ＩＬ−２１の生物学的効果は、ＩＬ−２１Ｒと名づけられた膜レセプターにより媒介されており、このレセプターはＩＬ−２レセプター及びＩＬ−１５レセプターのサブユニットと相同性を示し、レセプターサブユニットγ鎖と相互作用する（Ｃｏｌｌｉｎｓ ２００３、Ｚｈａｎｇ ２００３）。現在までにこのようなレセプターは、Ｔ及びＢ細胞、ナチュラルキラーリンパ球、単球並びに樹状細胞上で示された。
【０００６】
ＩＬ−２１とそのレセプターとの相互作用により誘導されるシグナル伝達カスケードの分析により、このサイトカインは一部の細胞内シグナルを誘発でき、分析した細胞型に厳密に依存する特異的免疫炎症性反応を可能にすることが示されている。特にＢ細胞で実施されたいくつかの研究で、ヒト又はマウス細胞のそれぞれでＩＬ−２１は細胞死のプログラムを促進できるか、若しくは抑制できることが示されている（Ｍｅｈｔａ ２００３、Ｊｉｎ ２００４）。同様に、ヒト末梢血Ｔリンパ球は、ＩＬ−２１刺激後に、Ｔｈ１応答を示す高濃度のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を産生するが、一部のマウスモデルでは、ＩＬ−２１がＴｈ２リンパ球でより高濃度に発現し、この細胞型の分化を促進するようであることが示された（Ｍａ ２００３、Ｗｕｒｓｔｅｌ ２００２）。発癌及び糖尿病の動物モデルで実施された実験はいずれも、Ｔリンパ球／ナチュラルキラー細胞の活性とサイトカイン産生とを調節するＩＬ−２１の能力が確認され、免疫炎症性過程の発症と永続化におけるこの分子の潜在的役割が強調された（Ｇａｌｌｅｇｏｓ ２００４）。したがって、ＩＬ−２１の生物学的作用を調節することは、変化したＩＬ−２１産生及び／又は活性によって特徴づけられる全ての免疫炎症性疾患に対する新規の有望な治療法になり得ることと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したようにＣＤの間、慢性炎症性疾患は、主として遠位回腸及び右結腸に局在し、腸管粘膜には多量のＴ細胞が浸潤している（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ２００２）。またＴ細胞は、粘膜のレベルでＴｈ１リンパ球に分化し、高濃度のＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αを産生する証拠が存在する。Ｔｈ１細胞への分化は、ＩＬ−１２のような局所的に産生されたサイトカインに依存しているように思われる（Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ １９９６、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ １９９７）。ＩＢＤのヒト及び動物モデルの両方で実施された研究では、ＩＬ−１２によるＴｈ１リンパ球の活性化は、組織損傷を引き起こす分子事象のカスケードを誘発することも示した（Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ １９９６、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ １９９９）。損傷の基本的な媒介物質は、細胞外基質のいくつかの成分を分解できるプロテアーゼのファミリーであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、１９９９）であり、したがって粘膜の分解と上皮構造の破壊を引き起こす。常に、ＭＭＰ−１（間質性コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメライシン）及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）を含む一部のＭＭＰの著しい増加が、胃潰瘍及び腸潰瘍並びにＨｐ感染、ＣＤ及びＵＣ患者の炎症を起こした粘膜領域で実証された（Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ ２０００、Ｓａａｒｉａｌｈｏ−Ｋｅｒｅ １９９６）。さらにＭＭＰの中和は、胎児の腸の外植片でＩＬ−２１で活性化されたＴｈ１細胞により誘発される粘膜分解を抑制するのに十分であることが示された（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、１９９９）。
【０００８】
免疫炎症性疾患の病因におけるＭＭＰの重要性は、ＣＤ及びＵＣに限定されない。これは乾癬、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症においてもＭＭＰの関与の証拠があるからである（Ｋａｎｅ ２００４、Ｗａｌｌ ２００３）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の著者はここで、ＣＤ患者の腸管粘膜に持続するＩＬ−２１産生が存在し（図１）、このような増加は活動的な病変領域に限定され、病変の種類に依存しない（図２）ことを示す。ＣＤでのＩＬ−２１発現の増加は、Ｔリンパ球の粘膜浸潤の増加を単に反映するものではない。実際に、対照と比較して、ＩＬ−２１合成の増加はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ患者由来のＣＤ４５ＲＯ＋リンパ球のタンパク質抽出物中でも実証される（図３）。
【００１０】
Ｔｈ１細胞の分極化及び安定化は、ＩＬ−１２活性を増強する分子の活性に厳密に依存していることは疑いない。ＩＬ−２１がこの応答の調節に含まれる可能性があるかどうか調べるために、本発明の著者はＩＬ−２１に対する６つの異なる抗体分子（抗血清）の有効性を、設計し、開発し、試験した。これらの抗体産生には、特異的ヒトＩＬ−２１配列で免疫感作したＮＺＷウサギを使用した。各抗血清のＩＬ−２１活性阻害を図４に示した。特にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−２１媒介Ｓｔａｔ３リン酸化（ｐ−Ｓｔａｔ３）誘導に及ぼすそれぞれの抗血清の効果が示されている。それぞれの抗血清の中和効果が、ジャーカット細胞（Ｔ細胞系）を用いても確認された（図示せず）。さらにＧＭ２抗血清（ＰＢＭＣ及びジャーカット細胞実験の間、ＧＭ２抗血清はＩＬ−２１活性を一貫して、同等に阻害した）を用いる、ＣＤ患者由来の腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）培養でのＩＬ−２１活性の中和は、Ｓｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔなどのＴｈ１細胞分化に必須な転写因子の発現の著しい減少並びにＩＦＮ−γ合成阻害を伴っていることが示された（図５）。
【００１１】
ＣＤ患者の炎症を起こした粘膜でのＴ細胞の顕著な蓄積は、アポトーシス刺激に対するこのような細胞の耐性に一部依存すると考えられている。またこのような現象は、粘膜の炎症性状態の維持において重要な役割を果たしている証拠があり、これは抗ＴＮＦ−αなどのアポトーシス刺激に対するＴ細胞の感受性を増すことができる薬剤が、進行中の組織炎症性過程の消失を促進するからである。ＩＢＤの間、アポトーシスに対するＴ細胞の耐性の基礎をなす正確なメカニズムは、局所的に放出されるサイトカインが関与していると考えられるとしてもまだ分かっていない。
【００１２】
本発明の著者は、本発明の対象である抗血清を用いるＩＬ−２１活性の遮断は、ＣＤ及びＵＣ患者から分離されたＬＰＭＣの培養物中で生存するＣＤ３＋Ｔ細胞の顕著でかつ有意な減少と関連性があることを示した（図６）。腸固有層ＣＤ３＋Ｔ細胞の培養物を用いた場合にも、同様なデータが得られた。実際に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の蛍光定量分析では、未処理の細胞（ＡＶ：１１±１；ＩＰ：１．５±０．１６；ＡＶ−ＩＰ：２０．８±５．７）又はコントロール血清で処理した細胞（ＡＶ：１１．６±０．６９；ＩＰ：２±０．７；ＡＶ−ＩＰ：２１±５．７７）との比較で、抗ＩＬ−２１抗血清ＧＭ２は、アネキシンＶ（ＡＶ）（２８．５±８）又はヨウ化プロピジウム（ＩＰ）（７±１．４）又はこれらの両方（４１±７．６）でのパーセンテージの有意な増加を生じたことを示した（Ｐ＜０．０１）。また抗ＩＬ−２１をＣＤ４＋Ｔ細胞培養物に加えた場合にも、同様の効果が認められた。このような効果は、ミトコンドリア膜電位の喪失と関連していた（図７）。
【００１３】
上述のように、ＩＬ−２１の発現増強が、ＵＣ患者の炎症を起こした領域でも示され（図１）、慢性炎症性疾患は、Ｔｈ１サブタイプに分極化しないＴ細胞の顕著な粘膜浸潤によって特徴づけられた。したがってこの知見は、ＩＬ−２１が、Ｔｈ１の分極化の制御以外の多様な炎症性経路を調節する可能性を示唆している。
【００１４】
新たなＩＬ−２１の生物学的機能を確かめるために、ヒト腸粘膜細胞でのＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）の発現を最初に特徴づけた。これらの実験のデータは、ＩＬ−２１Ｒの発現は免疫細胞に限定されないで、意外にもＩＬ−２１Ｒは腸内筋線維芽細胞などの非免疫性細胞でも発現していることを示している（図８）。このような発現は、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βなどの炎症性刺激により増強することができる（図９）。次にこのような細胞は、ＩＬ−２１刺激に応答性であることを確かめた。特に健常な対象（健常対照者）及びＩＢＤ患者から分離される腸内筋線維芽細胞の培養へのＩＬ−２１の添加により、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２のようなＭＭＰの組織阻害物質の分泌に影響を及ぼすことなく、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の大量分泌（図１０）をもたらした。ＭＭＰ産生に及ぼすＩＬ−２１の効果は、胎児腸線維芽細胞系（ＣＣＤ１８ＣＯ）でも見られ（データは示さず）、用量依存的であった（図１０）。さらにまたＩＬ−２１は、ＭＴ−ＭＭＰ−１（図１１）のような、その活性がＭＭＰ−２の活性化に必須である細胞膜ＭＭＰの発現を増強することが示された。最後に、ＭＭＰ合成に及ぼすＩＬ−２１の効果は、ＴＮＦ−αの同時刺激により増強され（図１２）、したがってこれらの２つのサイトカインは、ＭＭＰ産生の調節に協働することが示唆された。
【００１５】
ＣＤ ＬＰＭＣ由来のＩＬ−２１がＭＭＰ産生を調節できるかどうか検討するために、ＣＤ粘膜の検体から分離した腸管線維芽細胞を、ＣＤ ＬＰＭＣ上清（ＩＬ−２１を含む、図３）の存在下又は不在下で、抗ＩＬ−２１又は対照抗血清の添加の有り若しくはなしで、４８時間培養し、ＭＭＰ産生をウエスタンブロット法で評価した。図１３で示すように、筋線維芽細胞培養へのＣＤ ＬＰＭＣ上清の添加は、全てのＭＭＰの合成増強をもたらし、このような効果は抗ＩＬ−２１により阻害された。このことはＣＤ ＬＰＭＣにより産生されるＩＬ−２１は、生物学的に活性であり、ＭＭＰ合成を増強できることを示している。
【００１６】
さらに驚くことに、ＩＬ−２１Ｒは腸上皮細胞で発現し、このような発現はＩＢＤの間、特にＣＤで増強されることが示された（図１４）。これらのデータによれば、構成的なＩＬ−２１Ｒ発現が、いくつかの大腸癌上皮細胞系で実証された（図１４）。さらに腸上皮細胞は、ＩＬ−２１に応答性であることが示されている。実際にＩＬ−２１による上皮細胞系の刺激後、チロシンリン酸化細胞内タンパク質の内容に著しい変化が生じた（図１５、パネルＡ）。またＩＬ−２１が炎症誘発性の分子又は抗炎症性の分子の発現を変更するかどうか調べるために、ＩＬ−２１で非刺激の又はＩＬ−２１で刺激した同じ上皮細胞系の培養液上清を、１２０の異なるタンパク質の発現に関して分析した。ＩＬ−２１による刺激は、ＣＤ及びＵＣ並びに乾癬のような他の免疫炎症性疾患の間、上皮から過剰に産生されるタンパク質であるＭＩＰ−３αの分泌の増強と関連し（図１５、パネルＢ）、炎症を起こした組織へのリンパ球及び樹状細胞の漸増化を伴った（Ｋｗｏｎ ２００２、Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ ２０００）。次いでこれらのデータをＥＬＩＳＡにより確認した（図１５、パネルＣ）。
【００１７】
他の胃腸管系の免疫炎症性疾患の病因におけるＩＬ−２１の潜在的役割を確かめるために、また本発明の著者は、Ｈｐ感染関連胃炎患者の胃及びセリアック病患者の腸での、優勢な粘膜のＴｈ１細胞応答で特徴づけられる２つの症状で、ＩＬ−２１が過剰発現することを示した（図１６及び１７）。
【００１８】
ＩＬ−２１Ｒ発現は、Ｈｐ感染の有無にかかわらず患者から分離した胃上皮細胞及び胃癌上皮細胞系（ＡＧＳ及びＭＫＮ）でも実証された（図１８）。常にＩＬ−２１によるＡＧＳの刺激は、Ｈｐ感染患者胃で過剰に産生される２つのゼラチナーゼであるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９合成の増強と関連していた（図１９、パネルＡ）（Ｍｏｒｉ、２００４）。
【００１９】
ＭＭＰ２及びＭＭＰ９産生に及ぼすＩＬ−２１効果の基礎をなす分子メカニズムの分析により、ＡＧＳ細胞でＩＬ−２１がＮＦ−ｋＢを活性化し（図１９、パネルＢ）、市販製品（ＴＰＣＫ）を用いるＮＦ−ｋＢ阻害は、ＩＬ−２１媒介ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の著しい合成阻害と関連することが明らかとなった（図１９、パネルＣ）。
【００２０】
最後に、ＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒは乾癬患者の患部で強く誘導されることが示された（図２０）。
【００２１】
全体としてこれらのデータは、ＩＬ−２１の調節不全の合成／活性と関連した症状で進行中の炎症抑制に関して、このサイトカイン活性の中和が合理的な目標である可能性を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
したがって、本発明の１つの目的は、下記の配列：
１．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１４６〜１６２を含み、ＧＭ１と命名された、ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
２．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸９７〜１１１を含み、ＧＭ２と命名された、ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
３．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸２０〜３４を含み、ＧＭ３と命名された、ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
４．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１１０〜１２４を含み、ＧＭ４と命名された、ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
５．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１２５〜１３９を含み、ＧＭ５と命名された、ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＥＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
６．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸７８〜９３を含み、ＧＭ６と命名された、ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）、又はそれらの少なくとも５つのアミノ酸の部分を含むヒトＩＬ−２１配列に属する抗原性エピトープを提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、上記と同様に抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチドの配列によって表される。
【００２４】
さらにまた、本発明は抗ＩＬ−２１抗体の調製に関する上で定義されたエピトープの使用に関する。特に抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナルの抗体フラグメント、キメラ抗体又は単鎖抗体であり得る。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、ヒトＩＬ−２１中和のための本発明による抗原性エピトープの少なくとも１つに対する特異的及び選択的な抗体であって、ヒトＩＬ−２１タンパク質の下記ペプチド配列：
１．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１４６〜１６２を含み、ＧＭ１と命名された、ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
２．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸９７〜１１１を含み、ＧＭ２と命名された、ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
３．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸２０〜３４を含み、ＧＭ３と命名された、ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
４．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１１０〜１２４を含み、ＧＭ４と命名された、ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
５．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１２５〜１３９を含み、ＧＭ５と命名された、ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＥＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
６．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸７８〜９３を含み、ＧＭ６と命名された、ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）の１つに対する抗体である。
【００２６】
これらの抗体は、ポリクローナル（Ａｂ）若しくはモノクローナル（ｍａｂ）、又は抗体フラグメント（Ｆａｂ Ｆａｂ’、Ｆａｂ（ａｂ’）２）又はキメラ、ヒト化、若しくは単鎖（ｓｃＦｖ）抗体であってもよい。抗体は哺乳動物抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ由来の抗体が好ましい。分子の安定性の増強、分子の分解の阻止又は副作用のリスクの減少に必要な変形も本発明の範囲に含まれる。本発明による抗体は、蛍光色素、放射性同位元素又は薬剤で標識されてもよい。また抗体は、例えばＩＬ−２１発現の中和分析又は特性評価分析における実験分野での反応剤として使用することができる。
【００２７】
本発明による抗体は、医学分野で有利に使用することができる。さらに本発明は、例えば慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、セリアック病、乾癬などの、ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患の治療又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断用の薬剤調製のための本発明による抗体の使用に関する。特に慢性炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であってもよい。
【００２８】
本発明の他の目的は、当業者には周知の１つ若しくは複数の薬剤学的に許容し得るコアジュバント及び／又は賦形剤と共に、有効成分として上記規定の抗体の少なくとも１つを含む医薬組成物を提供することである。組成物は局所的、全身的又は経口経路で投与されるのが好ましい。
【００２９】
さらにまた本発明は、本発明による上記規定の抗体及び／又はエピトープの少なくとも１つを含む診断キットに関する。本発明による診断キットには、例えばＣＤ及びＵＣ、セリアック病、乾癬のような慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの、ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患診断用のＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫組織化学又は細胞蛍光測定法などの技術を用いるのが好ましい。このような診断キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−２１発現の中和又は特性評価のために有用である。
【００３０】
例示目的であって、限定することを意図せず、その好ましい実施態様に従って、同封の図面の図を特に参照して、次に本発明を説明する。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
ＣＤ、ＵＣ、Ｈｐ感染関連胃炎、及びセリアック病患者におけるＩＬ−２１発現の研究
材料と方法
患者と検体
粘膜の検体は、新たに入手した２９人のＣＤ患者標本から採取した。１８人の患者で疾患は末端回腸に限定されたが、残りの患者では病変は、回腸と大腸の両方に存在した。手術時に、１３人の患者はステロイド治療を受け、１０人の患者はステロイド＋免疫抑制剤で治療され、６人の患者はメサラジン＋抗生物質で治療された。１８人の患者は、線維性狭窄疾患を有する。回腸結腸の併発を有する患者から、粘膜検体を併発及び発病を免れた回腸及び結腸部位から採取した。
【００３２】
追加の粘膜検体を、以下の大腸から採取した。すなわち、ａ）結腸鏡検査を受けた２６人のＵＣ患者及びステロイド及び免疫抑制剤による薬物治療に不十分な応答しかしない慢性活動性経過の間に、結腸切除を受けた４人の患者、ｂ）６人の憩室性疾患患者、１０人の過敏性大腸症候群患者及び２６人の大腸癌患者。後者の場合、粘膜検体は肉眼でも顕微観察でも病変のない部分から採取した。これらの検体を正常対照とみなした。さらに粘膜検体を以下から採取した。すなわち、１）１３人のＨｐ感染関連胃炎患者及び肉眼でも顕微観察でも胃炎のない１４人の患者の胃、ｂ）１４人のセリアック病患者及び１４人の対照健常者の十二指腸。当施設の委員会で倫理的承認を得た。
【００３３】
腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の分離と培養
ＬＰＭＣは、ＤＴＴ−ＥＤＴＡ及びコラゲナーゼ手法により調製した。ＬＰＭＣのアリコートを、直ちに総タンパク質の抽出に用いたが、残りのＬＰＭＣは１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）補充ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｍｉｌａｎ）に再懸濁して培養するか又は固有層Ｔリンパ球（Ｔ−ＬＰＬ）の精製に用いた。この目的のために、ＬＰＭＣを抗ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｃａｌｄｅｒａｒａ ｄｉ Ｒｅｎｏ，Ｉｔａｌｙ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで磁気細胞選別システム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓ．ｒ．ｌ．）を用いて、Ｔ−ＬＰＬをネガティブセレクションにより採取した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ４５ＲＯ＋陽性のＴ−ＬＰＬを、これらの細胞サブタイプ特異的抗体を用いる同じ手順により精製した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓ．ｒ．ｌ．）。
【００３４】
タンパク質の抽出とウエスタンブロット分析
粘膜検体、ＬＰＭＣ又は精製した細胞をホモジナイズし、総タンパク質を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含む緩衝液Ａを用いて抽出した。緩衝液には、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニルを加えた（全ての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを使用）。
【００３５】
ＩＬ−２１タンパク質は、ヒトＩＬ−２１特異的ウサギ抗体を用いて分析した（０．５μｇ／ｍｌ、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｐｏｗａｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３６】
１次抗体結合を検出するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）を、最終希釈１：２０，０００で用い、化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により免疫反応性を可視化した。ＩＬ−２１の分析後、ブロットを剥離し、次いで添加した内部タンパク質対照として抗ヒトβ−アクチン抗体と共にインキュベートした（最終希釈１：５０００で、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００３７】
それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を、コンピュータ支援走査デンシトメトリーを用いて分析した（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ，Ｒｏｍｅ）。
【００３８】
結果
ＩＬ−２１は全ての分析した検体で検出されたが、その発現はＣＤ患者で強く増強されていた（図１）。さらに憩室性疾患を有する患者又は対照健常者に比べ、ＵＣ患者でＩＬ−２１の発現増加が見られた（図１）。ＣＤ患者で、ＩＬ−２１発現の増強は炎症部位で明らかであり（図２、上のブロット）、病変のタイプと関連していなかった（図２、下のブロット）。
【００３９】
ＣＤ患者で、分析をＬＰＭＣから抽出したタンパク質を用いて実施した場合にも、ＩＬ−２１の発現増加が見られた（図３Ａ）。ＣＤ又はＵＣ患者及び対照でのＩＬ−２１含有量の相違は、多数の粘膜Ｔリンパ球浸潤の反映であることを除外するために、患者及び対照の同数のＬＰＬから抽出したタンパク質に関しても分析を実施した。図３、パネルＢで示すように、ＣＤ患者のＴ−ＬＰＬ及びＵＣ患者のより少ない割合のＴ−ＬＰＬが、より高い量のＩＬ−２１を含んでいた。ＩＬ−２１含有量が、対照のＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬに比べＣＤ患者の大腸から分離したＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬでより顕著であるのと同様に（図３Ｂの右挿入図）、このＩＬ−２１の増加は、特にＣＤ４＋細胞サブタイプで顕著で（同じ図の左挿入図）、細胞活性化状態に依存していなかった。
【００４０】
また、ＩＬ−２１の発現増加がＨｐ関連胃炎患者（図１６）の胃及びセリアック病患者の十二指腸バイオプシー（図１７）で示された。
【００４１】
（実施例２）
ヒトＩＬ−２１中和抗体の開発
材料と方法
ＩＬ−２１抗原性性配列の分析と決定
可能性ある高抗原性性部位を同定するために、ＩＬ−２１タンパク質ヒト配列のコンピュータ処理分析を、ワシントンバイオテクノロジー社（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）で実施した。したがって、このような配列は、ＩＬ−２１に対する免疫及び抗体作成に最適なエピトープと考えられた。
【００４２】
ペプチド合成
ペプチド合成及び精製は、ワシントンバイオテクノロジー社で実施した。Ｆｍｏｃケミストリーを用いる「自動化固相ケミストリー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」技法によって、それぞれのペプチドを合成した。それぞれのペプチド配列で、それぞれのアミノ酸をペプチド結合で結合し、不必要な反応を避けるために保護基を使用した。合成完了時に、過剰な試薬を洗い流した後、完全なペプチドを支持体樹脂から取り出し、純度９０％以上の最終生産物を提供するために、クロマトグラフィー技法（逆相カラムクロマトグラフィー）により精製した。次いで、それぞれのペプチドをマススペクトル分析（ＭＡＬＤＩ）により分析して確認した。
【００４３】
ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギの免疫感作
ウサギＮＺＷ免疫感作は、ワシントンバイオテクノロジー社で実施した。免疫を誘発するために、それぞれのペプチドを巨大タンパク質キャリア（ＫＬＨ）に結合させ、アジュバントと共に２匹の特定病原体未感染のウサギ（ニュージランドホワイト種）の皮下に注射した。６週間にわたる３回のブースター注射の後、ＥＬＩＳＡで抗血清を分析するために試験採血を行った。ＥＬＩＳＡ測定で抗体価が１：５００００より高い場合にのみ、それぞれのウサギから採血した。初回免疫感作後、６又は８週時点で血液を採取した。次いで、ＥＬＩＳＡによりそれぞれの抗血清力価の特性を決定した。
【００４４】
それぞれの抗血清の中和効果の分析
それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清の中和活性を分析するために、健常ボランティアから採取した血液を用いてＰＢＭＣをフィコール層別化で分離し、最初にヒト組換え型ＩＬ−２１の添加（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）の有り又はなしで、それぞれ１：５００から１：５０００の範囲にわたる最終希釈で用いるそれぞれの抗ＩＬ−２１抗血清又は対照血清の存在又は非存在下で、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＲＰＭＩに再懸濁した。上述のように、リンパ球細胞系（ジャーカット細胞）を用いる実験を同時に実施した。３０分のＩＬ−２１刺激後、細胞を採取、上述のように総タンパク質の抽出に用いた。次いで、２００μｇのタンパク質／検体を電気泳動で分離し、ニトロセルロース上へブロットし、モノクローナル特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロット法によりリン酸化Ｓｔａｔ３及び総Ｓｔａｔ３含有量を分析した。次いでコンピュータ支援走査デンシトメトリー（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ）を用いて、それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を定量した。
【００４５】
結果
予想通り、ＩＬ−２１によるＰＢＭＣの刺激はＳｔａｔ３リン酸化の増強を伴っていた（図４）。このことはジャーカット細胞を用いた場合でも明らかであった（データは示さず）。それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清は、ＩＬ−２１に媒介されるリン酸化Ｓｔａｔ３の誘導阻害に対して有効であった（図４）。
【００４６】
（実施例３）
粘膜Ｔｈ１細胞応答の調節におけるＩＬ−２１の役割
材料と方法
細胞培養
ＣＤでＩＬ−２１がＴｈ１の細胞分化に関与するかどうかを検討するために、上述したように、腸切除を受けている６人のＣＤ患者の炎症部位から分離したＬＰＭＣを、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁した。次いでＬＰＭＣを抗ＩＬ−２１抗血清ＮＺＷ−ＧＭ２（最終希釈１：５００）又は対照血清（１：５００）の非存在又は存在下で１２時間培養後、抗ＣＤ３抗体（最終希釈１：５００）でさらに２４時間刺激した。
【００４７】
タンパク質の抽出とウエスタンブロット分析
これらのタンパク質に対する特異抗体（最終希釈１：５００のＴ−ｂｅｔ及び総Ｓｔａｔ４（両方とも Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製造）、濃度１．５μｇ／ｍｌのｐ−Ｓｔａｔ４（ミラノＨｉｓｔｏ−Ｌｉｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製造））を用いて、上述したようにＴ−ｂｅｔ、ｐ−Ｓｔａｔ４及びＳｔａｔ４の発現をウエスタンブロット法により分析した。
【００４８】
次いで、それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を、コンピュータ支援走査デンシトメトリー（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ）を用いて定量化した。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ
製造業者（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）の説明書に従い市販のＥＬＩＳＡキットで、ＬＰＭＣ培養液上清をＩＦＮ−γ含有量に関して分析した。
【００５０】
結果
ＩＦＮ−γは測定可能であり、ｐ−Ｓｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔは刺激されていないＬＰＭＣ培養で発現した（図５）。抗ＣＤ３によるＬＰＭＣ刺激作用は、活性なＳｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔの著しい増加を伴い、そしてこれはＩＦＮ−γ分泌の増強を伴った。重要なことは、ＧＭ２抗血清を用いるＩＬ−２１活性の中和により、抗ＣＤ３により誘導された活性なＳｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔの発現が阻害され、したがって結果としてＩＦＮ−γの有意な阻害を生じたことであった（ｐ＝０．０２）（図５）。
【００５１】
（実施例４）
ＩＢＤ腸管Ｔリンパ球の生存度に及ぼす抗ＩＬ−２１抗血清の効果
材料と方法
患者と検体
粘膜検体は、疾患が末端回腸及び上行結腸に限定している８人のＣＤ患者の手術標本から採取した。手術の時点で、全ての患者はステロイド及び免疫抑制療法を受け、線維性狭窄疾患を有している。また粘膜検体は、以下の結腸から採取した。すなわち、ａ）ステロイド及び免疫抑制剤による薬理学的治療に不十分な応答しかしない疾患に対して結腸切除を受けている４人のＵＣ患者、ｂ）６人の大腸癌患者。この後者の場合、粘膜検体は肉眼でも顕微観察でも病変のない部分から採取した。これらの検体は正常対照とみなした。当施設の委員会で倫理的承認を得た。
【００５２】
腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の分離と培養
ＬＰＭＣは、ＤＴＴ−ＥＤＴＡ−コラゲナーゼ手法により調製した。上述したように、ＬＰＭＣのアリコートを直ちにＣＤ４＋Ｔリンパ球の精製に用いたが、残りのＬＰＭＣは１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）補充ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｍｉｌａｎ）に再懸濁して培養した。
【００５３】
未分画のＬＰＭＣ及びＣＤ４＋Ｔリンパ球の両方を、希釈度の異なるＧＭ２抗ｌＬ−２１抗血清又は対照血清の存在又は非存在下で、２時間から２０時間にわたって培養した。
【００５４】
細胞死及びミトコンドリアの膜内外電位差の細胞蛍光測定分析
細胞死の割合は、細胞をヨウ化プロピジウム５μｇ／ｍＬ（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２０分間インキュベートし、続いてフィコエリトリン（ＦＩＴＣ）標識したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡＶ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｉｌａｎｏ）の市販溶液を用いて染色して分析した。同様にＡＶパーセンテージは、抗ＣＤ３ヒトモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて後者を同定することによりＣＤ３＋Ｔリンパ球で評価した。次いで細胞蛍光を、細胞蛍光計ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ−１及びＦＬ−２チャネル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。ミトコンドリアの膜内外電位差分析のために、細胞を培養の最後の２０分間、２０μＭの３，３’−ヨウ化ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ６（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．ｒ．Ｌ．，Ｍｉｌａｎｏ）と共にインキュベートした後、蛍光を細胞蛍光測定によって評価した。
【００５５】
結果
２０時間培養後、ＬＰＭＣ培養への抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）の添加により、生存ＣＤ３＋リンパ球が非常に減少した。細胞蛍光測定分析は、非刺激細胞（ＡＶ：１１±１；ｐＩ：１．５±０．１６；ＡＶ／ＰＩ／：２０．８±５．７）又は対照血清で処理した非刺激細胞（ＡＶ：１１．６±０．６９；ｐＩ：２±０．７；ＡＶ−ＰＩ：２１±５．７７）に比べて、抗ＩＬ−２１はＡＶ陽性細胞（２８．５±８）、ｐＩ（７±１．４）及びＡＶ／ＰＩ（４１±７．６）の割合を有意に高めていることを示している（Ｐ＜０．０１）（図６）。
【００５６】
抗ＩＬ−２１は、陽性のＡＶ及びＰＩＣＤ４＋Ｔリンパ球の割合を増強し（データは示さず）、したがって抗ＩＬ−２１効果は、抗体媒介性細胞障害反応のメカニズムを介して生じる可能性を除外した。これらの抗ＩＬ−２１の効果は、ミトコンドリアの膜内外電位差の著しい減少を伴っていた（図７）。
【００５７】
（実施例５）
筋線維芽細胞及び粘膜上皮細胞でのＩＬ−２１レセプター発現並びにＭＭＰ及びＭＩＰ−３αの誘導でのＩＬ−２１の役割
材料と方法
腸管筋線維芽細胞の分離
上述したように、ＣＤ患者（Ｎ＝８）及びＵＣ患者（Ｎ＝８）並びに対照健常者（Ｎ＝８）からの分離したＬＰＭＣを、１％非必須アミノ酸及び１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ １×に再懸濁し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いでプレートに付着していない細胞を除去し、付着した細胞を上述の培地の存在下でインキュベートした。３回継代後、得られた筋線維芽細胞集団を、特異的モノクローナル抗体を用いて形態学的に及び表現型的に特徴づけた。
【００５８】
胃及び腸管上皮細胞の分離
８人のＨｐ胃炎患者及び胃炎を有しない８人の患者（対照健常者）の幽門洞、並びに８人のＣＤ患者、８人のＵＣ患者及び８人の対照健常者の結腸から採取した内視鏡バイオプシーから、胃及び腸管上皮細胞を分離した。バイオプシー検体は、ハンクス液で直ちに洗浄後、１ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液中で３０分間インキュベートした。最後に得られた細胞集団を、パーコール勾配層別化により大規模に精製した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００５９】
腸管筋線維芽細胞培養及び胎児腸管線維芽細胞系
ＣＤ患者、ＵＣ患者及び正常対照被験者の筋線維芽細胞並びに胎児腸管線維芽細胞系、ＣＣＤ１８ＣＯを、集密になるまで１％非必須アミノ酸及び１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ １×中で維持した。次いで細胞をＦＢＳ不存在下で、ＭＥＭ １×で２４時間維持し、最後に様々なＩＬ−２１の用量で４８時間刺激するか又は刺激しなかった。同様に、筋線維芽細胞を２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの存在下で、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１で刺激した。ＣＤ ＬＰＭＣにより産生されたＩＬ−２１がＭＭＰ合成を調節できたかどうかを検討するため、３人のＣＤ患者の腸から分離したＬＰＭＣを上述のように培養して、４８時間後に上清を採取し、使用するまで−８０℃で凍結した。次いでこのような上清を希釈１：２０で、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）（最終希釈１：５００）又は対照血清を最初に添加又は無添加で、ＣＤ患者の腸管筋線維芽細胞培養に加えた。４８時間培養後、筋線維芽細胞上清を採取してＭＭＰ含有量について分析した。
【００６０】
ＩＬ−２１Ｒ発現が調節できるかどうかを検討するために、正常被験者の腸から分離した筋線維芽細胞を、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、ＩＬ−２１Ｒ含有量をウエスタンブロット法により評価した。
【００６１】
ＡＧＳ培養
ＡＧＳを集密になるまで、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。次いで細胞を２４時間、ＦＢＳの不存在下でＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持し、最終的に様々なＩＬ−２１の投与量で、５分から４８時間にわたって刺激するか又は刺激しなかった。これと平行して、ＩＬ−２１（５０ ｎｇ／ｍｌ）でさらに４８時間刺激する前に、ＡＧＳ培養をＴＰＣＫ、ＮＦ−ｋＢ活性阻害剤（１〜１０μＭ）で６０分間処理した。
【００６２】
ＥＭＳＡ
上述したように刺激及び非刺激のＡＧＳをホモジナイズし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含む緩衝液Ａを用いて細胞質の抽出物を採取した。核抽出物は、残存している核を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ及び１０％グリセリンを含む緩衝液Ｃ中で可溶化して調製した。両方の緩衝液に、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（Ｓｉｇｍａ）を補充した。核タンパク質のＤＮＡ結合試験を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２．５％のグリセリン、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｇのＰｏｌｙ（ｄｌ−ｄＣ）、ビオチン標識オリゴヌクレオチド及び５μｇの核タンパク質を含む５０ｆｍｏｌの（Ｓｉｇｍａ）プローブを含む２０μｌの反応容量で、室温で２０分間実施した。
【００６３】
ＤＮＡプローブは、市販キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてビオチン３’標識された、２つのコンセンサスオリゴヌクレオチド（ＦＷＤ、５’：−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号７）、ＲＥＶ、５’：−ＣＧＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号８））を用いて調製した。結合特異性は、核タンパク質試料を、結合を飽和させるために１００倍モル過剰の、非標識のＮＦ−ｋＢプローブ又はＩＬ遺伝子（ＩＬ２Ｇ）、（５’：ＡＣＡＡＣＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号９））の非標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることにより確認した。
【００６４】
中和実験で、プローブを添加する前に、抗ＮＦ−ｋＢ／ｐ６５ヒトモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は対照抗体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）（両方とも濃度２．５μｇ／２０μｌで用いた）を、核タンパク質と共に４５分インキュベートした。６％未変性ポリアクリルアミドゲルを、電気泳動分離に使用した。メンブラン上へブロット後に、標識オリゴヌクレオチドをＥＭＳＡ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。
【００６５】
ＤＬＤ−１培養
ＤＬＤ−１は、集密になるまで１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で維持した。次いで細胞を２４時間ＦＢＳの不存在下で、ＲＰＭＩ１６４０中で維持し、最後に１５分〜４８時間様々なＩＬ−２１の投与量で刺激するか又は刺激しなかった。
【００６６】
ＩＬ−２１Ｒ免疫組織化学
ＩＬ−２１Ｒ発現は、ＣＤ患者及び対照健常者の腸切除検体で評価した。組織切片を切断し、次いでキシレン及びエタノール処理により、脱パラフィン化し、脱水した後、スライドをクエン酸緩衝液（０．０１Ｍ）、ｐＨ ６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、電子レンジで２０分間インキュベートした。希釈１：２０で用いた抗ＩＬ−２１Ｒヒトモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は対照抗体と共にインキュベーションを４℃で一夜実施した。染色特異性は、ブロッキングペプチドを用いて確認した。ＴＢＳ洗浄（Ｓｉｇｍａ）後、スライドをＨＲＰパーオキシダーゼ結合２次抗体（希釈１：５０、Ｄａｋｏ ＳｐＡ，Ｍｉｌａｎ）と共に室温で３０分間インキュベートした。
【００６７】
基質としてジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ヘマトキシリンでコントラスト処理により、免疫反応性細胞が認められた。対照切片は、前述のとおり１次抗体を対照抗体（Ｄａｋｏ）と置換して、同じ免疫組織化学的な条件下で調製した。キシレン及びエタノール処理に続く脱水後に、スライドを光学顕微鏡で解析した。
【００６８】
ＩＬ−２１Ｒのウエスタンブロット
ＩＬ−２１Ｒに関するウエスタンブロット分析を、抽出した総タンパク質を用いて実施した。抽出物は、腸筋線維芽細胞細胞系、ＣＣＤ１８ＣＯ、胃及び腸管上皮細胞、並びに胃癌上皮細胞（ＡＧＳ）及び腸癌上皮細胞（ＨＴ−２９、ＨＴ−１１５、Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ−１、Ｔ８４、Ｃａｃｏ−２）から調製した。タンパク質抽出及びＩＬ−２１Ｒ分析は、上述のように実施した。ＩＬ−２１Ｒの検討には、市販のモノクローナル抗体（最終濃度１μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００６９】
ＭＭＰウエスタンブロット
インキュベーションに続いて、ＩＬ−２１でまだ非刺激であるか又は刺激した筋線維芽細胞及びＡＧＳの培養上清を採取し遠心分離して、特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるウエスタンブロット法による、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の分析に用いた。さらにタンパク質抽出物を、ＩＬ−２１で刺激した細胞及び非刺激の細胞から調製し、次いで特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるウエスタンブロット法によるＭＴ−ＭＭＰ−１の分析に用いた。
【００７０】
タンパク質アレイシステム
腸管上皮細胞のＩＬ−２１刺激作用がタンパク質／サイトカイン／ケモカインの含有量の変更を伴ったかどうかを分析するために、ＩＬ−２１で刺激したか又は非刺激のＤＬＤ−１培養上清を、同時に１２０個のタンパク質が分析可能な市販のタンパク質アレイシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）キット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）を用いるタンパク質分析に付した。それぞれの上清１ｍｌを、１２０個のタンパク質に対する抗体を含むメンブラン上で一夜インキュベートした。数回の洗浄後、ブロットをビオチン標識２次抗体とインキュベートし、次いでストレプトアビジン及び基質と共にインキュベートした。それぞれのバンドの強度をコンピュータ支援分析により評価した。
【００７１】
ＭＩＰ−３αＥＬＩＳＡ
上述したようにＩＬ−２１で刺激したか又は非刺激のＤＬＤ−１培養上清で、市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｃｅ Ｉｍｐｏｒｔ−Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｒｌ，Ｍｉｌａｎ）によりＭＩＰ−３αを分析した。光学密度は、ＥＬＩＳＡリーダーＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００により波長４５０ｎｍで測定した。結果はｐｇ／ｍｌで示した。
【００７２】
結果
ＩＬ−２１Ｒは、腸管の初代筋線維芽細胞及び胎児腸管線維芽細胞（ＣＣＤ１８ＣＯ）で構成的に発現していることが分かった（図８）。また同じ細胞型が、機能性を有するＩＬ−２１Ｒの必須成分である共通のγ鎖レセプターを発現した（図８）。ＩＬ−２１Ｒ発現は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βを含む炎症性刺激によりさらに増強された（図９）。
【００７３】
重要なことに、ＩＬ−２１による腸管筋線維芽細胞の刺激により、ＴＩＭＰではなくＭＭＰの分泌が増強された。このことは初代筋線維芽細胞及びＣＣＤ１８ＣＯの両方において確認された（図１０）。またＩＬ−２１は細胞膜ＭＭＰの発現、例えばその活性がＭＭＰ−２の活性化に必須であるＭＴ−ＭＭＰ−１の発現を増強した（図１１）。さらにＭＭＰ合成の刺激に関して、ＩＬ−２１はＴＮＦ−αと協働した（図１２）。ＭＭＰの誘導に関して、ＩＬ−２１の生物学的役割を確かめるために、ＣＤ ＬＰＭＣ上清は、腸管筋線維芽細胞によるＭＭＰ合成を促進し、このような効果は、抗ＩＬ−２１抗血清ＧＭ２の添加により阻害されることが示された（図１３）。ＩＬ−２１Ｒの構成的な発現は、腸管初代上皮細胞及び大腸癌上皮系でも見られた（図１４）。重要なことは、免疫組織化学（図１４、パネルＡ）及びウエスタンブロット（図１４、パネルＢ）分析が、ＩＢＤ患者、特にＣＤ患者の上皮細胞で、ＩＬ−２１Ｒの発現増強を示したことである。腸管上皮細胞の生物活性に及ぼすＩＬ−２１の効果を検討するために、ＤＬＤ−１細胞はＩＬ−２１Ｒを発現するので、これらの細胞系を選択した。ＩＬ−２１によるこれらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すると、様々なリン酸化タンパク質の含有量の変化を伴っていた（図１５、パネルＡ）。ＩＬ−２１に対する細胞応答は、ＩＬ−２１刺激に応答してＤＬＤ−１がＭＩＰ−３αを高度に分泌するという証拠により裏づけられた（図１４、パネルＢ及びＣ）。胃の初代上皮細胞並びにＡＧＳ及びＭＫＮなどの胃癌上皮細胞系は、構成的にレセプターを発現したので、ＩＬ−２１Ｒの発現は腸管上皮に限定されていなかった（図１８）。ＩＬ−２１によるＡＧＳの刺激は、Ｈｐ感染患者の上皮で過剰に産生された２つのゼラチナーゼであるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（図１９、パネルＡ）の分泌増強を常にもたらした。ＩＬ−２１がＮＦ−ｋＢ活性化を増強し（図１９、パネルＢ）、ＴＰＣＫによるＮＦ−ｋＢの阻害は、ＩＬ−２１の媒介するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９合成を減少させた（図１９、パネルＣ）と想定するならば、この効果はＮＦ−ｋＢの活性化を調節するＩＬ−２１の機能に依存しているようである。
【００７４】
（実施例６）
乾癬患者でのＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒの発現の検討
材料と方法
患者と検体
皮膚バイオプシー検体は、９人の乾癬患者の病変部及び非病変部から採取した。募集時には患者は治療を受けていなかった。バイオプシー検体は液体窒素で直ちに凍結し、使用するまで−８０℃で保持した。
【００７５】
ＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒのウエスタンブロット
各検体からの総タンパク質抽出物を、上述の方法を用いてＩＬ−２１及びそのレセプターに関して分析した。
【００７６】
参考文献
−Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＢＪら Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００４；１１３：１６６４−７５。
−Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００４；１１４：４７１−４。
−Ｓｏｌｌｉｄ ＬＭ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；２：６４７−５５。
−Ｐｏｄｏｌｓｋｙ Ｄ．Ｋ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００２；．３４７：４１７−２９。
−Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＫら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３；８１：３５４−６６。
−Ｓｐａｈｎ ＪＤら Ｊ Ａｓｔｈｍａ．１９９７；３４：１７７−９４。
−Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ Ｊ．Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２００４；２０補遺４：６６−７４。
−Ｓｅｅｇｅｒｓ Ｄら Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００２；１６：５３−５８。
−Ｓａｎｄｂｏｒｎ Ｊら Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００２；．１２２：１５９２−６０８。
−Ｆｉｏｃｃｈｉ Ｃ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００１；１０８：５２３−２６。
−Ｈａｂｉｂ Ｔら Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１１２：１０３３−４５。
−Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊら Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００２；７２：８５６−６３。
−Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｍら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００３；２８：１３１−４０。
−Ｚｈａｎｇ ＪＬら Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３；３００：２９１−６。
−Ｍｅｈｔａ ＤＳら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０：４１１１−８。
−Ｊｉｎ Ｈら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：６５７−６５。
−Ｍａ ＨＬら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７：６０８−１５。
−Ｗｕｒｓｔｅｒ ＡＬら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２；１９６：９６９−７７。
−Ｇａｌｌｅｇｏｓ ＡＭら Ｃｅｌｌ ２００４；１１７：１４９−５１。
−Ｎｅｕｒａｔｈ Ｍ Ｆら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：２６０５−２６１６。
−Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１２：１１６９−７８。
−Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９９；１１７：１０６９−７７。
−Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ ＲＢら Ｇｕｔ ２０００；４７：５７−６２。
−Ｓａａｒｉａｌｈｏ−Ｋｅｒｅ ＵＫら Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９６；１４８：５１９−２６。
−Ｋａｎｅ Ｄら Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００４；３１：１２７４−８０．
−Ｗａｌｌ ＳＪら Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３；１４９：１３−６。
−Ｋｗｏｎ ＪＨら Ｇｕｔ．２００２；５１：８１８−２６。
−Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ ＭＣら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００；１９２：７０５−１８。
−Ｍｏｒｉ Ｎら Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００３；１２４：９８３−９２。
−ＥＰ １４４３ ０５５。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１、パネルＡは、ウエスタンブロット法で測定される、３人のＣＤ患者、３人のＵＣ患者及び３人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの総タンパク質抽出物中の、ＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現を示す。下のパネルは、任意の濃度測定単位で発現したそれぞれの対象者でのＩＬ−２１／β−アクチンタンパク質比率を示す（グラフの中でそれぞれの場所で示されている）。水平バーは、それぞれの群の中央値を示す。
【図２】図２、パネルＡは、ウエスタンブロット法で評価される、３人のＣＤ患者及び２人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの、総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現の分析を示す。それぞれのＣＤ患者に関しては、検体を炎症（病変部）及び非炎症部位から取り出した。右のパネルは、異なる患者及び対照健常者で測定し、任意の濃度測定単位の平均±標準偏差として示したＩＬ−２１／β−アクチンタンパク質含有比率を示す。図２のパネルＢは、３人の炎症性ＣＤ患者、３人の線維性狭窄ＣＤ患者及び２人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１タンパク質量（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す。右のパネルは、異なる患者及び対照健常者で評価し、任意の濃度測定単位の平均±標準偏差として示したｌＬ−２１／β−アクチンタンパク質比率を示す。
【図３】図３、パネルＡは、ウエスタンブロット法で測定される、２人のＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者由来の腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現を示す。パネルＢは、２人のＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者の腸固有層（ＬＰＬ）Ｔ細胞から分離した総タンパク質抽出物のＩＬ−２１及びβ−アクチンの典型的なウエスタンブロットを示す。左の挿入図は、１人のＣＤ患者、１人のＵＣ患者及び１人の対照健常者から分離したＣＤ４＋ＬＰＬ又はＣＤ８＋ＬＰＬｓでのＩＬ−２１の発現を示す。右の挿入図は、２人ＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者の腸から精製したＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬでのＩＬ−２１タンパク質量を示す。
【図４】図４は、ヒト組換え型ＩＬ−２１で刺激したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、転写因子Ｓｔａｔ３（ｐＳｔａｔ３）のリン酸化誘導に及ぼす、それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清（配列ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＭ５、ＧＭ６）の阻害効果を示す。下のブロットは、同じ検体における総Ｓｔａｔ３の量を示す。ＰＳｔａｔ３及び総Ｓｔａｔ３はどちらも、ウエスタンブロット法により評価した。
【図５】図５は、ＣＤ患者の腸から分離したＬＰＭＣにおける、Ｔｈ１応答（Ｔ−ｂｅｔ及びＳｔａｔ４）並びにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）合成を伴う転写因子の発現に及ぼすＧＭ２抗血清の阻害効果を示す。Ｔ−ｂｅｔ（Ａ）並びにリン酸化Ｓｔａｔ４及び総Ｓｔａｔ４（Ｂ）の量を、総タンパク質抽出物のウエスタンブロット法により分析し、一方、培養上清のＩＦＮ−γ分泌（Ｃ）は、市販キットを用いてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図６】図６は、正常被験者並びにＣＤ及びＵＣ患者の腸から分離し、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）又は対照血清の存在又は非存在下で２０時間培養したＬＰＭＣ検体に関して、細胞蛍光測定法で測定したＣＤ３＋細胞及び／又はアネキシンＶ（ＡＶ）のパーセンテージを示す。
【図７】図７は、ＣＤ患者の腸から分離し、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）又は対照血清の存在、非存在下で４時間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、細胞蛍光測定法で測定したＤＩＯＣ６量を示す。
【図８】図８は、１人の正常被験者（対照）、１人のＣＤ患者及び１人のＵＣ患者の結腸、胎児腸線維芽細胞細胞系（ＣＣＤ１８ＣＯ）並びにＣＤ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から分離した筋線維芽細胞からの総タンパク質抽出物での、ＩＬ−２１Ｒ及びγ−鎖レセプターサブユニットに関する典型的なウエスタンブロットを示す。図のパネルＢは、８人のＣＤ患者、８人のＵＣ患者及び８人の対照健常者由来の腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中の、ＩＬ−２１Ｒ／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、全ての実験の平均±標準偏差を示す。
【図９】図９は、１人の正常被験者の結腸から分離し、培地のみでの培養（非刺激）又はＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を２４時間行った初代筋線維芽細胞からの総タンパク質抽出物での、ＩＬ−２１Ｒに関する典型的なウエスタンブロットを示す。図のパネルＢは、上述したように刺激した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中のＩＬ−２１Ｒ／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、３つの独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ患者から分離した腸管筋線維芽細胞での、ＭＭＰ（ＭＭＰ−１、２、３及び９）の合成に及ぼすＩＬ−２１の刺激効果を示す。ＭＭＰに及ぼすＩＬ−２１効果は用量依存的で、ＭＭＰ（ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２）の組織阻害物質の産生に関し、いかなる変化とも関連していない。同様の結果がＵＣ患者の腸から分離した筋線維芽細胞で得られた。Ｖｅ＋＝ＣＤ患者の大腸からのタンパク質抽出物を陽性対照として用いた。
【図１１】図１１は、ＣＤ患者から分離し、培地のみ又はＩＬ−２１の段階的な投与量で培養した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物でのＭＴ−ＭＭＰ１の合成に及ぼすＩＬ−２１の効果を示す。ＭＴ−ＭＭＰ１に及ぼすＩＬ−２１の効果は用量依存的である。Ｖｅ＋＝ＣＤ患者の大腸からのタンパク質抽出物を陽性対照として用いた。図のパネルＢは、上述したように、刺激した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中のＭＴ−ＭＭＰ１／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、３つの独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、ＣＤ患者から分離した腸管筋線維芽細胞で、ＩＬ−２１及びＴＮＦ−αがＭＭＰ−１、２、３及び９の合成の増強に協働するが、ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２に及ぼす誘導効果をもたないことを示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ筋線維芽細胞の培養へＣＤ ＬＰＭＣ上清を添加すると、ＭＭＰ合成が増強し、このような効果は抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）により阻害され得るが、対照抗血清では阻害されないことを示す。
【図１４】図１４は、腸管上皮細胞でのＩＬ−２１Ｒの発現を示す。パネルＡは、免疫組織化学により評価した、対照健常者及びＣＤ患者からの大腸検体でのＩＬ−２１Ｒの発現を示す。パネルＢは、１人の正常被験者（対照）、１人のＣＤ患者及び１人のＵＣ患者の上皮細胞から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒ及びβ−アクチンを示す典型的なウエスタンブロットを図示する。パネルＣは、７人のＣＤ患者、７人のＵＣ患者及び７人の対照健常者の大腸から分離した上皮細胞から調製したタンパク質抽出物での、ｌＬ−２１Ｒ／β−アクチンタンパク質の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位（ａ．ｕ．）で表し、全ての実験の平均値±ＳＤを示す。パネルＤは、６つの異なる大腸癌上皮細胞系から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１を示す典型的なウエスタンブロットを図示する。
【図１５】図１５（パネルＡ）は、ＤＬＤ−１細胞でいくつかのリン酸化タンパク質の発現に及ぼすＩＬ−２１の効果を示す。リン酸化タンパク質（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。パネルＢは、４８時間培養後のＤＬＤ−１細胞でのタンパク質分泌に及ぼすＩＬ−２１効果を示す。分析は同時に１２０の異なるタンパク質を評価することができる市販キットを用いて実施した。ＩＬ−２１に刺激された細胞で、ＭＩＰ−３αの分泌の増強（円はタンパク質を示す）が認められた。次いでＥＬＩＳＡにより、非刺激及びＩＬ−２１で刺激したＤＬＤ−１の上清で、このような増加がＭＩＰ−３αの分析により確認された（パネルＣ）。
【図１６】図１６は、３人のＨｐ感染患者及び３人の対照健常者の胃粘膜の検体から調製した総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１７】図１７は、３人のセリアック病患者（ｃｅｌｉａｃｓ）及び３人の対照健常者の十二指腸粘膜検体から調製した総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１８】図１７は、２人のＨｐ関連胃炎患者及び２人の正常被験者（対照）の胃から分離した上皮細胞から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒを示す典型的なウエスタンブロットを示す。パネルＢは、胃癌上皮細胞系（ＡＧＳ及びＭＫＮ）から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒ及びγ−鎖を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１９】図１９、パネルＡは、上皮胃細胞（ＡＧＳ）でＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌に及ぼすＩＬ−２１の用量依存的な効果を示す。パネルＢは、ＡＧＳ細胞でＮＦ−ｋＢ活性化を増強するＩＬ−２１の機能を示す。３つの典型的なＥＭＳＡの１つを示す。パネルＣは、ＴＰＣＫによるＮＦ−ｋＢ活性化阻害がＩＬ−２１に媒介されるＭＭＰ２及びＭＭＰ９の合成を如何に減少させるかを示す。
【図２０】図２０は、４人の乾癬患者の病変部及び非病変部から採取した皮膚のバイオプシーにより調製した総タンパク質抽出物のＩＬ−２１（上のブロット）、ＩＬ−２１Ｒ（中央のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）に関する典型的なウエスタンブロットを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）の抗原性エピトープ及び関連するＩＬ−２１中和抗体、並びにＩＬ−２１の産生又は活性の増加を特徴とする免疫炎症性疾患、例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、セリアック病及び乾癬患者治療のためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年間に、ヒト及び動物モデルで実施されたいくつかの研究が、免疫媒介性疾患の病因についての我々の理解を進め、これらの疾患を有する患者に対する治療的介入を最適にするために貢献している。したがって、乾癬、関節リウマチ、気管支喘息、原発性胆汁性肝硬変、ＣＤ、ＵＣ、セリアック病、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈｐ））関連胃疾患、多発性硬化症（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ２００４、Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ２００４、Ｓｏｌｌｉｄ ２００２、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ２００２）などの疾患において、Ｔリンパ球が主要な病原的役割を果たすことが示された。炎症過程の基礎をなす事象の注意深い分子的分析により、Ｔリンパ球の病原作用は、いくつかの炎症性分子を合成するＴリンパ球の能力に最も関連していることを立証でき、そのサイトカイン（又はインターロイキン）としての適切な例は、単球、樹状細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞に作用して多くの炎症作用を行うことができるサイトカインである腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生によって示される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２００３）。
【０００３】
したがって、これらの炎症性疾患の自然経過及びそれらの病態生理学的メカニズムに関するより高い知識が治療選択の改善に寄与しているが、これらの疾患の各々に対する薬理学的介入はいずれも単に対症的であり、治癒的ではない。多くの患者で炎症性活性の消失及び臨床的緩解の誘導には、副腎皮質ステロイドによる治療を必要とする。しかしながら、そのような薬剤はほぼ５０％の患者で有効であり、これらの患者の半分は、臨床的緩解を維持するために、連続的な治療を必要とすることが広く知られている。残念ながらステロイドの有益な効果は、頻繁にかつしばしば重篤な副作用という代償で成り立っている（Ｓｐａｈｎ １９９７、Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ ２００４）。さらに、しばしば副腎皮質ステロイドを伴うか又はそれに取って代わる免疫抑制治療でさえも、炎症を制限し、症状を管理するのに必ずしも十分ではない。さらに免疫抑制治療は、著しい禁忌及び重篤な副作用という不利な点がある（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、２００２）。
【０００４】
１９９０年代に入手可能となった新しい世代の薬剤は、生物学的薬剤である。これらは組換え型ヒトタンパク質、モノクローナルキメラヒト化抗体及び融合タンパク質を用いる、特異的な炎症性「経路」を管理することを目的とした生物学的療法である。この意昧において、免疫炎症性過程の抑制に優れた効果を示す化合物は、モノクローナル抗ＴＮＦ−α抗体である（ｓｅｅｇｅｒｓら、２００２）。この薬剤は、約５０〜７０％の患者で炎症を抑制することができる。それにもかかわらず、副作用例えば不顕性の微生物感染の再活性化及び過敏性現象の発生率が反復治療と共に増加することが報告されている。後者の現象は、多くの生物学的機能を有するサイトカインを抗体が遮断するということに基づく可能性がある。実際に、ＴＮＦ−αはその炎症性作用以上に、免疫寛容の誘導と維持に関与するメカニズムにおいて役割を果たしている。したがって、ＴＮＦ−αの遮断は、逆に過剰な免疫反応を促進している可能性があると思われる。さらに、３分の１を超える治療患者が、薬剤の有効性を低下させると思われる化合物に対する抗体を産生する（Ｓａｎｄｂｏｒｎ、２００２）。全体としてこれらの知見は、上記の疾患を有する患者管理のための新規化合物の同定を目的とする今後の研究が必要であることを示唆している（Ｆｉｏｃｃｈｉ、２００１）。
【０００５】
インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、最近同定されたサイトカインであり、主として活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球で産生される（Ｈａｂｉｂ ２００３、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ ２００２）。ＩＬ−２１の生物学的効果は、ＩＬ−２１Ｒと名づけられた膜レセプターにより媒介されており、このレセプターはＩＬ−２レセプター及びＩＬ−１５レセプターのサブユニットと相同性を示し、レセプターサブユニットγ鎖と相互作用する（Ｃｏｌｌｉｎｓ ２００３、Ｚｈａｎｇ ２００３）。現在までにこのようなレセプターは、Ｔ及びＢ細胞、ナチュラルキラーリンパ球、単球並びに樹状細胞上で示された。
【０００６】
ＩＬ−２１とそのレセプターとの相互作用により誘導されるシグナル伝達カスケードの分析により、このサイトカインは一部の細胞内シグナルを誘発でき、分析した細胞型に厳密に依存する特異的免疫炎症性反応を可能にすることが示されている。特にＢ細胞で実施されたいくつかの研究で、ヒト又はマウス細胞のそれぞれでＩＬ−２１は細胞死のプログラムを促進できるか、若しくは抑制できることが示されている（Ｍｅｈｔａ ２００３、Ｊｉｎ ２００４）。同様に、ヒト末梢血Ｔリンパ球は、ＩＬ−２１刺激後に、Ｔｈ１応答を示す高濃度のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を産生するが、一部のマウスモデルでは、ＩＬ−２１がＴｈ２リンパ球でより高濃度に発現し、この細胞型の分化を促進するようであることが示された（Ｍａ ２００３、Ｗｕｒｓｔｅｌ ２００２）。発癌及び糖尿病の動物モデルで実施された実験はいずれも、Ｔリンパ球／ナチュラルキラー細胞の活性とサイトカイン産生とを調節するＩＬ−２１の能力が確認され、免疫炎症性過程の発症と永続化におけるこの分子の潜在的役割が強調された（Ｇａｌｌｅｇｏｓ ２００４）。したがって、ＩＬ−２１の生物学的作用を調節することは、変化したＩＬ−２１産生及び／又は活性によって特徴づけられる全ての免疫炎症性疾患に対する新規の有望な治療法になり得ることと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したようにＣＤの間、慢性炎症性疾患は、主として遠位回腸及び右結腸に局在し、腸管粘膜には多量のＴ細胞が浸潤している（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ２００２）。またＴ細胞は、粘膜のレベルでＴｈ１リンパ球に分化し、高濃度のＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αを産生する証拠が存在する。Ｔｈ１細胞への分化は、ＩＬ−１２のような局所的に産生されたサイトカインに依存しているように思われる（Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ １９９６、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ １９９７）。ＩＢＤのヒト及び動物モデルの両方で実施された研究では、ＩＬ−１２によるＴｈ１リンパ球の活性化は、組織損傷を引き起こす分子事象のカスケードを誘発することも示した（Ｎｅｕｒａｔｈ ＭＦ １９９６、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ １９９９）。損傷の基本的な媒介物質は、細胞外基質のいくつかの成分を分解できるプロテアーゼのファミリーであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、１９９９）であり、したがって粘膜の分解と上皮構造の破壊を引き起こす。常に、ＭＭＰ−１（間質性コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメライシン）及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）を含む一部のＭＭＰの著しい増加が、胃潰瘍及び腸潰瘍並びにＨｐ感染、ＣＤ及びＵＣ患者の炎症を起こした粘膜領域で実証された（Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ ２０００、Ｓａａｒｉａｌｈｏ−Ｋｅｒｅ １９９６）。さらにＭＭＰの中和は、胎児の腸の外植片でＩＬ−２１で活性化されたＴｈ１細胞により誘発される粘膜分解を抑制するのに十分であることが示された（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ、１９９９）。
【０００８】
免疫炎症性疾患の病因におけるＭＭＰの重要性は、ＣＤ及びＵＣに限定されない。これは乾癬、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症においてもＭＭＰの関与の証拠があるからである（Ｋａｎｅ ２００４、Ｗａｌｌ ２００３）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の著者はここで、ＣＤ患者の腸管粘膜に持続するＩＬ−２１産生が存在し（図１）、このような増加は活動的な病変領域に限定され、病変の種類に依存しない（図２）ことを示す。ＣＤでのＩＬ−２１発現の増加は、Ｔリンパ球の粘膜浸潤の増加を単に反映するものではない。実際に、対照と比較して、ＩＬ−２１合成の増加はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ患者由来のＣＤ４５ＲＯ＋リンパ球のタンパク質抽出物中でも実証される（図３）。
【００１０】
Ｔｈ１細胞の分極化及び安定化は、ＩＬ−１２活性を増強する分子の活性に厳密に依存していることは疑いない。ＩＬ−２１がこの応答の調節に含まれる可能性があるかどうか調べるために、本発明の著者はＩＬ−２１に対する６つの異なる抗体分子（抗血清）の有効性を、設計し、開発し、試験した。これらの抗体産生には、特異的ヒトＩＬ−２１配列で免疫感作したＮＺＷウサギを使用した。各抗血清のＩＬ−２１活性阻害を図４に示した。特にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−２１媒介Ｓｔａｔ３リン酸化（ｐ−Ｓｔａｔ３）誘導に及ぼすそれぞれの抗血清の効果が示されている。それぞれの抗血清の中和効果が、ジャーカット細胞（Ｔ細胞系）を用いても確認された（図示せず）。さらにＧＭ２抗血清（ＰＢＭＣ及びジャーカット細胞実験の間、ＧＭ２抗血清はＩＬ−２１活性を一貫して、同等に阻害した）を用いる、ＣＤ患者由来の腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）培養でのＩＬ−２１活性の中和は、Ｓｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔなどのＴｈ１細胞分化に必須な転写因子の発現の著しい減少並びにＩＦＮ−γ合成阻害を伴っていることが示された（図５）。
【００１１】
ＣＤ患者の炎症を起こした粘膜でのＴ細胞の顕著な蓄積は、アポトーシス刺激に対するこのような細胞の耐性に一部依存すると考えられている。またこのような現象は、粘膜の炎症性状態の維持において重要な役割を果たしている証拠があり、これは抗ＴＮＦ−αなどのアポトーシス刺激に対するＴ細胞の感受性を増すことができる薬剤が、進行中の組織炎症性過程の消失を促進するからである。ＩＢＤの間、アポトーシスに対するＴ細胞の耐性の基礎をなす正確なメカニズムは、局所的に放出されるサイトカインが関与していると考えられるとしてもまだ分かっていない。
【００１２】
本発明の著者は、本発明の対象である抗血清を用いるＩＬ−２１活性の遮断は、ＣＤ及びＵＣ患者から分離されたＬＰＭＣの培養物中で生存するＣＤ３＋Ｔ細胞の顕著でかつ有意な減少と関連性があることを示した（図６）。腸固有層ＣＤ３＋Ｔ細胞の培養物を用いた場合にも、同様なデータが得られた。実際に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の蛍光定量分析では、未処理の細胞（ＡＶ：１１±１；ＩＰ：１．５±０．１６；ＡＶ−ＩＰ：２０．８±５．７）又はコントロール血清で処理した細胞（ＡＶ：１１．６±０．６９；ＩＰ：２±０．７；ＡＶ−ＩＰ：２１±５．７７）との比較で、抗ＩＬ−２１抗血清ＧＭ２は、アネキシンＶ（ＡＶ）（２８．５±８）又はヨウ化プロピジウム（ＩＰ）（７±１．４）又はこれらの両方（４１±７．６）でのパーセンテージの有意な増加を生じたことを示した（Ｐ＜０．０１）。また抗ＩＬ−２１をＣＤ４＋Ｔ細胞培養物に加えた場合にも、同様の効果が認められた。このような効果は、ミトコンドリア膜電位の喪失と関連していた（図７）。
【００１３】
上述のように、ＩＬ−２１の発現増強が、ＵＣ患者の炎症を起こした領域でも示され（図１）、慢性炎症性疾患は、Ｔｈ１サブタイプに分極化しないＴ細胞の顕著な粘膜浸潤によって特徴づけられた。したがってこの知見は、ＩＬ−２１が、Ｔｈ１の分極化の制御以外の多様な炎症性経路を調節する可能性を示唆している。
【００１４】
新たなＩＬ−２１の生物学的機能を確かめるために、ヒト腸粘膜細胞でのＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）の発現を最初に特徴づけた。これらの実験のデータは、ＩＬ−２１Ｒの発現は免疫細胞に限定されないで、意外にもＩＬ−２１Ｒは腸内筋線維芽細胞などの非免疫性細胞でも発現していることを示している（図８）。このような発現は、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βなどの炎症性刺激により増強することができる（図９）。次にこのような細胞は、ＩＬ−２１刺激に応答性であることを確かめた。特に健常な対象（健常対照者）及びＩＢＤ患者から分離される腸内筋線維芽細胞の培養へのＩＬ−２１の添加により、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２のようなＭＭＰの組織阻害物質の分泌に影響を及ぼすことなく、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の大量分泌（図１０）をもたらした。ＭＭＰ産生に及ぼすＩＬ−２１の効果は、胎児腸線維芽細胞系（ＣＣＤ１８ＣＯ）でも見られ（データは示さず）、用量依存的であった（図１０）。さらにまたＩＬ−２１は、ＭＴ−ＭＭＰ−１（図１１）のような、その活性がＭＭＰ−２の活性化に必須である細胞膜ＭＭＰの発現を増強することが示された。最後に、ＭＭＰ合成に及ぼすＩＬ−２１の効果は、ＴＮＦ−αの同時刺激により増強され（図１２）、したがってこれらの２つのサイトカインは、ＭＭＰ産生の調節に協働することが示唆された。
【００１５】
ＣＤ ＬＰＭＣ由来のＩＬ−２１がＭＭＰ産生を調節できるかどうか検討するために、ＣＤ粘膜の検体から分離した腸管線維芽細胞を、ＣＤ ＬＰＭＣ上清（ＩＬ−２１を含む、図３）の存在下又は不在下で、抗ＩＬ−２１又は対照抗血清の添加の有り若しくはなしで、４８時間培養し、ＭＭＰ産生をウエスタンブロット法で評価した。図１３で示すように、筋線維芽細胞培養へのＣＤ ＬＰＭＣ上清の添加は、全てのＭＭＰの合成増強をもたらし、このような効果は抗ＩＬ−２１により阻害された。このことはＣＤ ＬＰＭＣにより産生されるＩＬ−２１は、生物学的に活性であり、ＭＭＰ合成を増強できることを示している。
【００１６】
さらに驚くことに、ＩＬ−２１Ｒは腸上皮細胞で発現し、このような発現はＩＢＤの間、特にＣＤで増強されることが示された（図１４）。これらのデータによれば、構成的なＩＬ−２１Ｒ発現が、いくつかの大腸癌上皮細胞系で実証された（図１４）。さらに腸上皮細胞は、ＩＬ−２１に応答性であることが示されている。実際にＩＬ−２１による上皮細胞系の刺激後、チロシンリン酸化細胞内タンパク質の内容に著しい変化が生じた（図１５、パネルＡ）。またＩＬ−２１が炎症誘発性の分子又は抗炎症性の分子の発現を変更するかどうか調べるために、ＩＬ−２１で非刺激の又はＩＬ−２１で刺激した同じ上皮細胞系の培養液上清を、１２０の異なるタンパク質の発現に関して分析した。ＩＬ−２１による刺激は、ＣＤ及びＵＣ並びに乾癬のような他の免疫炎症性疾患の間、上皮から過剰に産生されるタンパク質であるＭＩＰ−３αの分泌の増強と関連し（図１５、パネルＢ）、炎症を起こした組織へのリンパ球及び樹状細胞の漸増化を伴った（Ｋｗｏｎ ２００２、Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ ２０００）。次いでこれらのデータをＥＬＩＳＡにより確認した（図１５、パネルＣ）。
【００１７】
他の胃腸管系の免疫炎症性疾患の病因におけるＩＬ−２１の潜在的役割を確かめるために、また本発明の著者は、Ｈｐ感染関連胃炎患者の胃及びセリアック病患者の腸での、優勢な粘膜のＴｈ１細胞応答で特徴づけられる２つの症状で、ＩＬ−２１が過剰発現することを示した（図１６及び１７）。
【００１８】
ＩＬ−２１Ｒ発現は、Ｈｐ感染の有無にかかわらず患者から分離した胃上皮細胞及び胃癌上皮細胞系（ＡＧＳ及びＭＫＮ）でも実証された（図１８）。常にＩＬ−２１によるＡＧＳの刺激は、Ｈｐ感染患者胃で過剰に産生される２つのゼラチナーゼであるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９合成の増強と関連していた（図１９、パネルＡ）（Ｍｏｒｉ、２００４）。
【００１９】
ＭＭＰ２及びＭＭＰ９産生に及ぼすＩＬ−２１効果の基礎をなす分子メカニズムの分析により、ＡＧＳ細胞でＩＬ−２１がＮＦ−ｋＢを活性化し（図１９、パネルＢ）、市販製品（ＴＰＣＫ）を用いるＮＦ−ｋＢ阻害は、ＩＬ−２１媒介ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の著しい合成阻害と関連することが明らかとなった（図１９、パネルＣ）。
【００２０】
最後に、ＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒは乾癬患者の患部で強く誘導されることが示された（図２０）。
【００２１】
全体としてこれらのデータは、ＩＬ−２１の調節不全の合成／活性と関連した症状で進行中の炎症抑制に関して、このサイトカイン活性の中和が合理的な目標である可能性を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
したがって、本発明の１つの目的は、下記の配列：
１．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１４６〜１６２を含み、ＧＭ１と命名された、ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
２．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸９７〜１１１を含み、ＧＭ２と命名された、ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
３．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸２０〜３４を含み、ＧＭ３と命名された、ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
４．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１１０〜１２４を含み、ＧＭ４と命名された、ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
５．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１２５〜１３９を含み、ＧＭ５と命名された、ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＥＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
６．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸７８〜９３を含み、ＧＭ６と命名された、ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）、又はそれらの少なくとも５つのアミノ酸の部分を含むヒトＩＬ−２１配列に属する抗原性エピトープを提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、上記と同様に抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチドの配列によって表される。
【００２４】
さらにまた、本発明は抗ＩＬ−２１抗体の調製に関する上で定義されたエピトープの使用に関する。特に抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナルの抗体フラグメント、キメラ抗体又は単鎖抗体であり得る。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、ヒトＩＬ−２１中和のための本発明による抗原性エピトープの少なくとも１つに対する特異的及び選択的な抗体であって、ヒトＩＬ−２１タンパク質の下記ペプチド配列：
１．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１４６〜１６２を含み、ＧＭ１と命名された、ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
２．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸９７〜１１１を含み、ＧＭ２と命名された、ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
３．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸２０〜３４を含み、ＧＭ３と命名された、ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
４．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１１０〜１２４を含み、ＧＭ４と命名された、ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
５．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸１２５〜１３９を含み、ＧＭ５と命名された、ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＥＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
６．ヒトＩＬ−２１のアミノ酸７８〜９３を含み、ＧＭ６と命名された、ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）の１つに対する抗体である。
【００２６】
これらの抗体は、ポリクローナル（Ａｂ）若しくはモノクローナル（ｍａｂ）、又は抗体フラグメント（Ｆａｂ Ｆａｂ’、Ｆａｂ（ａｂ’）２）又はキメラ、ヒト化、若しくは単鎖（ｓｃＦｖ）抗体であってもよい。抗体は哺乳動物抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ由来の抗体が好ましい。分子の安定性の増強、分子の分解の阻止又は副作用のリスクの減少に必要な変形も本発明の範囲に含まれる。本発明による抗体は、蛍光色素、放射性同位元素又は薬剤で標識されてもよい。また抗体は、例えばＩＬ−２１発現の中和分析又は特性評価分析における実験分野での反応剤として使用することができる。
【００２７】
本発明による抗体は、医学分野で有利に使用することができる。さらに本発明は、例えば慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、セリアック病、乾癬などの、ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患の治療又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断用の薬剤調製のための本発明による抗体の使用に関する。特に慢性炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であってもよい。
【００２８】
本発明の他の目的は、当業者には周知の１つ若しくは複数の薬剤学的に許容し得るコアジュバント及び／又は賦形剤と共に、有効成分として上記規定の抗体の少なくとも１つを含む医薬組成物を提供することである。組成物は局所的、全身的又は経口経路で投与されるのが好ましい。
【００２９】
さらにまた本発明は、本発明による上記規定の抗体及び／又はエピトープの少なくとも１つを含む診断キットに関する。本発明による診断キットには、例えばＣＤ及びＵＣ、セリアック病、乾癬のような慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの、ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患診断用のＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫組織化学又は細胞蛍光測定法などの技術を用いるのが好ましい。このような診断キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−２１発現の中和又は特性評価のために有用である。
【００３０】
例示目的であって、限定することを意図せず、その好ましい実施態様に従って、同封の図面の図を特に参照して、次に本発明を説明する。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
ＣＤ、ＵＣ、Ｈｐ感染関連胃炎、及びセリアック病患者におけるＩＬ−２１発現の研究
材料と方法
患者と検体
粘膜の検体は、新たに入手した２９人のＣＤ患者標本から採取した。１８人の患者で疾患は末端回腸に限定されたが、残りの患者では病変は、回腸と大腸の両方に存在した。手術時に、１３人の患者はステロイド治療を受け、１０人の患者はステロイド＋免疫抑制剤で治療され、６人の患者はメサラジン＋抗生物質で治療された。１８人の患者は、線維性狭窄疾患を有する。回腸結腸の併発を有する患者から、粘膜検体を併発及び発病を免れた回腸及び結腸部位から採取した。
【００３２】
追加の粘膜検体を、以下の大腸から採取した。すなわち、ａ）結腸鏡検査を受けた２６人のＵＣ患者及びステロイド及び免疫抑制剤による薬物治療に不十分な応答しかしない慢性活動性経過の間に、結腸切除を受けた４人の患者、ｂ）６人の憩室性疾患患者、１０人の過敏性大腸症候群患者及び２６人の大腸癌患者。後者の場合、粘膜検体は肉眼でも顕微観察でも病変のない部分から採取した。これらの検体を正常対照とみなした。さらに粘膜検体を以下から採取した。すなわち、１）１３人のＨｐ感染関連胃炎患者及び肉眼でも顕微観察でも胃炎のない１４人の患者の胃、ｂ）１４人のセリアック病患者及び１４人の対照健常者の十二指腸。当施設の委員会で倫理的承認を得た。
【００３３】
腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の分離と培養
ＬＰＭＣは、ＤＴＴ−ＥＤＴＡ及びコラゲナーゼ手法により調製した。ＬＰＭＣのアリコートを、直ちに総タンパク質の抽出に用いたが、残りのＬＰＭＣは１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）補充ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｍｉｌａｎ）に再懸濁して培養するか又は固有層Ｔリンパ球（Ｔ−ＬＰＬ）の精製に用いた。この目的のために、ＬＰＭＣを抗ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｃａｌｄｅｒａｒａ ｄｉ Ｒｅｎｏ，Ｉｔａｌｙ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで磁気細胞選別システム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓ．ｒ．ｌ．）を用いて、Ｔ−ＬＰＬをネガティブセレクションにより採取した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ４５ＲＯ＋陽性のＴ−ＬＰＬを、これらの細胞サブタイプ特異的抗体を用いる同じ手順により精製した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓ．ｒ．ｌ．）。
【００３４】
タンパク質の抽出とウエスタンブロット分析
粘膜検体、ＬＰＭＣ又は精製した細胞をホモジナイズし、総タンパク質を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含む緩衝液Ａを用いて抽出した。緩衝液には、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニルを加えた（全ての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを使用）。
【００３５】
ＩＬ−２１タンパク質は、ヒトＩＬ−２１特異的ウサギ抗体を用いて分析した（０．５μｇ／ｍｌ、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｐｏｗａｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３６】
１次抗体結合を検出するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）を、最終希釈１：２０，０００で用い、化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により免疫反応性を可視化した。ＩＬ−２１の分析後、ブロットを剥離し、次いで添加した内部タンパク質対照として抗ヒトβ−アクチン抗体と共にインキュベートした（最終希釈１：５０００で、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００３７】
それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を、コンピュータ支援走査デンシトメトリーを用いて分析した（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ，Ｒｏｍｅ）。
【００３８】
結果
ＩＬ−２１は全ての分析した検体で検出されたが、その発現はＣＤ患者で強く増強されていた（図１）。さらに憩室性疾患を有する患者又は対照健常者に比べ、ＵＣ患者でＩＬ−２１の発現増加が見られた（図１）。ＣＤ患者で、ＩＬ−２１発現の増強は炎症部位で明らかであり（図２、上のブロット）、病変のタイプと関連していなかった（図２、下のブロット）。
【００３９】
ＣＤ患者で、分析をＬＰＭＣから抽出したタンパク質を用いて実施した場合にも、ＩＬ−２１の発現増加が見られた（図３Ａ）。ＣＤ又はＵＣ患者及び対照でのＩＬ−２１含有量の相違は、多数の粘膜Ｔリンパ球浸潤の反映であることを除外するために、患者及び対照の同数のＬＰＬから抽出したタンパク質に関しても分析を実施した。図３、パネルＢで示すように、ＣＤ患者のＴ−ＬＰＬ及びＵＣ患者のより少ない割合のＴ−ＬＰＬが、より高い量のＩＬ−２１を含んでいた。ＩＬ−２１含有量が、対照のＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬに比べＣＤ患者の大腸から分離したＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬでより顕著であるのと同様に（図３Ｂの右挿入図）、このＩＬ−２１の増加は、特にＣＤ４＋細胞サブタイプで顕著で（同じ図の左挿入図）、細胞活性化状態に依存していなかった。
【００４０】
また、ＩＬ−２１の発現増加がＨｐ関連胃炎患者（図１６）の胃及びセリアック病患者の十二指腸バイオプシー（図１７）で示された。
【００４１】
（実施例２）
ヒトＩＬ−２１中和抗体の開発
材料と方法
ＩＬ−２１抗原性性配列の分析と決定
可能性ある高抗原性性部位を同定するために、ＩＬ−２１タンパク質ヒト配列のコンピュータ処理分析を、ワシントンバイオテクノロジー社（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）で実施した。したがって、このような配列は、ＩＬ−２１に対する免疫及び抗体作成に最適なエピトープと考えられた。
【００４２】
ペプチド合成
ペプチド合成及び精製は、ワシントンバイオテクノロジー社で実施した。Ｆｍｏｃケミストリーを用いる「自動化固相ケミストリー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」技法によって、それぞれのペプチドを合成した。それぞれのペプチド配列で、それぞれのアミノ酸をペプチド結合で結合し、不必要な反応を避けるために保護基を使用した。合成完了時に、過剰な試薬を洗い流した後、完全なペプチドを支持体樹脂から取り出し、純度９０％以上の最終生産物を提供するために、クロマトグラフィー技法（逆相カラムクロマトグラフィー）により精製した。次いで、それぞれのペプチドをマススペクトル分析（ＭＡＬＤＩ）により分析して確認した。
【００４３】
ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギの免疫感作
ウサギＮＺＷ免疫感作は、ワシントンバイオテクノロジー社で実施した。免疫を誘発するために、それぞれのペプチドを巨大タンパク質キャリア（ＫＬＨ）に結合させ、アジュバントと共に２匹の特定病原体未感染のウサギ（ニュージランドホワイト種）の皮下に注射した。６週間にわたる３回のブースター注射の後、ＥＬＩＳＡで抗血清を分析するために試験採血を行った。ＥＬＩＳＡ測定で抗体価が１：５００００より高い場合にのみ、それぞれのウサギから採血した。初回免疫感作後、６又は８週時点で血液を採取した。次いで、ＥＬＩＳＡによりそれぞれの抗血清力価の特性を決定した。
【００４４】
それぞれの抗血清の中和効果の分析
それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清の中和活性を分析するために、健常ボランティアから採取した血液を用いてＰＢＭＣをフィコール層別化で分離し、最初にヒト組換え型ＩＬ−２１の添加（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）の有り又はなしで、それぞれ１：５００から１：５０００の範囲にわたる最終希釈で用いるそれぞれの抗ＩＬ−２１抗血清又は対照血清の存在又は非存在下で、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＲＰＭＩに再懸濁した。上述のように、リンパ球細胞系（ジャーカット細胞）を用いる実験を同時に実施した。３０分のＩＬ−２１刺激後、細胞を採取、上述のように総タンパク質の抽出に用いた。次いで、２００μｇのタンパク質／検体を電気泳動で分離し、ニトロセルロース上へブロットし、モノクローナル特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロット法によりリン酸化Ｓｔａｔ３及び総Ｓｔａｔ３含有量を分析した。次いでコンピュータ支援走査デンシトメトリー（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ）を用いて、それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を定量した。
【００４５】
結果
予想通り、ＩＬ−２１によるＰＢＭＣの刺激はＳｔａｔ３リン酸化の増強を伴っていた（図４）。このことはジャーカット細胞を用いた場合でも明らかであった（データは示さず）。それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清は、ＩＬ−２１に媒介されるリン酸化Ｓｔａｔ３の誘導阻害に対して有効であった（図４）。
【００４６】
（実施例３）
粘膜Ｔｈ１細胞応答の調節におけるＩＬ−２１の役割
材料と方法
細胞培養
ＣＤでＩＬ−２１がＴｈ１の細胞分化に関与するかどうかを検討するために、上述したように、腸切除を受けている６人のＣＤ患者の炎症部位から分離したＬＰＭＣを、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁した。次いでＬＰＭＣを抗ＩＬ−２１抗血清ＮＺＷ−ＧＭ２（最終希釈１：５００）又は対照血清（１：５００）の非存在又は存在下で１２時間培養後、抗ＣＤ３抗体（最終希釈１：５００）でさらに２４時間刺激した。
【００４７】
タンパク質の抽出とウエスタンブロット分析
これらのタンパク質に対する特異抗体（最終希釈１：５００のＴ−ｂｅｔ及び総Ｓｔａｔ４（両方とも Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製造）、濃度１．５μｇ／ｍｌのｐ−Ｓｔａｔ４（ミラノＨｉｓｔｏ−Ｌｉｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製造））を用いて、上述したようにＴ−ｂｅｔ、ｐ−Ｓｔａｔ４及びＳｔａｔ４の発現をウエスタンブロット法により分析した。
【００４８】
次いで、それぞれのウエスタンブロットバンドの強度を、コンピュータ支援走査デンシトメトリー（Ｔｏｔａｌ ｌａｂ，ＡＢ．ＥＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｗａｒｅ Ｓｒｌ）を用いて定量化した。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ
製造業者（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）の説明書に従い市販のＥＬＩＳＡキットで、ＬＰＭＣ培養液上清をＩＦＮ−γ含有量に関して分析した。
【００５０】
結果
ＩＦＮ−γは測定可能であり、ｐ−Ｓｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔは刺激されていないＬＰＭＣ培養で発現した（図５）。抗ＣＤ３によるＬＰＭＣ刺激作用は、活性なＳｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔの著しい増加を伴い、そしてこれはＩＦＮ−γ分泌の増強を伴った。重要なことは、ＧＭ２抗血清を用いるＩＬ−２１活性の中和により、抗ＣＤ３により誘導された活性なＳｔａｔ４及びＴ−ｂｅｔの発現が阻害され、したがって結果としてＩＦＮ−γの有意な阻害を生じたことであった（ｐ＝０．０２）（図５）。
【００５１】
（実施例４）
ＩＢＤ腸管Ｔリンパ球の生存度に及ぼす抗ＩＬ−２１抗血清の効果
材料と方法
患者と検体
粘膜検体は、疾患が末端回腸及び上行結腸に限定している８人のＣＤ患者の手術標本から採取した。手術の時点で、全ての患者はステロイド及び免疫抑制療法を受け、線維性狭窄疾患を有している。また粘膜検体は、以下の結腸から採取した。すなわち、ａ）ステロイド及び免疫抑制剤による薬理学的治療に不十分な応答しかしない疾患に対して結腸切除を受けている４人のＵＣ患者、ｂ）６人の大腸癌患者。この後者の場合、粘膜検体は肉眼でも顕微観察でも病変のない部分から採取した。これらの検体は正常対照とみなした。当施設の委員会で倫理的承認を得た。
【００５２】
腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の分離と培養
ＬＰＭＣは、ＤＴＴ−ＥＤＴＡ−コラゲナーゼ手法により調製した。上述したように、ＬＰＭＣのアリコートを直ちにＣＤ４＋Ｔリンパ球の精製に用いたが、残りのＬＰＭＣは１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）補充ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｍｉｌａｎ）に再懸濁して培養した。
【００５３】
未分画のＬＰＭＣ及びＣＤ４＋Ｔリンパ球の両方を、希釈度の異なるＧＭ２抗ｌＬ−２１抗血清又は対照血清の存在又は非存在下で、２時間から２０時間にわたって培養した。
【００５４】
細胞死及びミトコンドリアの膜内外電位差の細胞蛍光測定分析
細胞死の割合は、細胞をヨウ化プロピジウム５μｇ／ｍＬ（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２０分間インキュベートし、続いてフィコエリトリン（ＦＩＴＣ）標識したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡＶ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｉｌａｎｏ）の市販溶液を用いて染色して分析した。同様にＡＶパーセンテージは、抗ＣＤ３ヒトモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて後者を同定することによりＣＤ３＋Ｔリンパ球で評価した。次いで細胞蛍光を、細胞蛍光計ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ−１及びＦＬ−２チャネル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。ミトコンドリアの膜内外電位差分析のために、細胞を培養の最後の２０分間、２０μＭの３，３’−ヨウ化ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ６（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．ｒ．Ｌ．，Ｍｉｌａｎｏ）と共にインキュベートした後、蛍光を細胞蛍光測定によって評価した。
【００５５】
結果
２０時間培養後、ＬＰＭＣ培養への抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）の添加により、生存ＣＤ３＋リンパ球が非常に減少した。細胞蛍光測定分析は、非刺激細胞（ＡＶ：１１±１；ｐＩ：１．５±０．１６；ＡＶ／ＰＩ／：２０．８±５．７）又は対照血清で処理した非刺激細胞（ＡＶ：１１．６±０．６９；ｐＩ：２±０．７；ＡＶ−ＰＩ：２１±５．７７）に比べて、抗ＩＬ−２１はＡＶ陽性細胞（２８．５±８）、ｐＩ（７±１．４）及びＡＶ／ＰＩ（４１±７．６）の割合を有意に高めていることを示している（Ｐ＜０．０１）（図６）。
【００５６】
抗ＩＬ−２１は、陽性のＡＶ及びＰＩＣＤ４＋Ｔリンパ球の割合を増強し（データは示さず）、したがって抗ＩＬ−２１効果は、抗体媒介性細胞障害反応のメカニズムを介して生じる可能性を除外した。これらの抗ＩＬ−２１の効果は、ミトコンドリアの膜内外電位差の著しい減少を伴っていた（図７）。
【００５７】
（実施例５）
筋線維芽細胞及び粘膜上皮細胞でのＩＬ−２１レセプター発現並びにＭＭＰ及びＭＩＰ−３αの誘導でのＩＬ−２１の役割
材料と方法
腸管筋線維芽細胞の分離
上述したように、ＣＤ患者（Ｎ＝８）及びＵＣ患者（Ｎ＝８）並びに対照健常者（Ｎ＝８）からの分離したＬＰＭＣを、１％非必須アミノ酸及び１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ １×に再懸濁し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いでプレートに付着していない細胞を除去し、付着した細胞を上述の培地の存在下でインキュベートした。３回継代後、得られた筋線維芽細胞集団を、特異的モノクローナル抗体を用いて形態学的に及び表現型的に特徴づけた。
【００５８】
胃及び腸管上皮細胞の分離
８人のＨｐ胃炎患者及び胃炎を有しない８人の患者（対照健常者）の幽門洞、並びに８人のＣＤ患者、８人のＵＣ患者及び８人の対照健常者の結腸から採取した内視鏡バイオプシーから、胃及び腸管上皮細胞を分離した。バイオプシー検体は、ハンクス液で直ちに洗浄後、１ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液中で３０分間インキュベートした。最後に得られた細胞集団を、パーコール勾配層別化により大規模に精製した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００５９】
腸管筋線維芽細胞培養及び胎児腸管線維芽細胞系
ＣＤ患者、ＵＣ患者及び正常対照被験者の筋線維芽細胞並びに胎児腸管線維芽細胞系、ＣＣＤ１８ＣＯを、集密になるまで１％非必須アミノ酸及び１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ １×中で維持した。次いで細胞をＦＢＳ不存在下で、ＭＥＭ １×で２４時間維持し、最後に様々なＩＬ−２１の用量で４８時間刺激するか又は刺激しなかった。同様に、筋線維芽細胞を２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの存在下で、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１で刺激した。ＣＤ ＬＰＭＣにより産生されたＩＬ−２１がＭＭＰ合成を調節できたかどうかを検討するため、３人のＣＤ患者の腸から分離したＬＰＭＣを上述のように培養して、４８時間後に上清を採取し、使用するまで−８０℃で凍結した。次いでこのような上清を希釈１：２０で、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）（最終希釈１：５００）又は対照血清を最初に添加又は無添加で、ＣＤ患者の腸管筋線維芽細胞培養に加えた。４８時間培養後、筋線維芽細胞上清を採取してＭＭＰ含有量について分析した。
【００６０】
ＩＬ−２１Ｒ発現が調節できるかどうかを検討するために、正常被験者の腸から分離した筋線維芽細胞を、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、ＩＬ−２１Ｒ含有量をウエスタンブロット法により評価した。
【００６１】
ＡＧＳ培養
ＡＧＳを集密になるまで、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。次いで細胞を２４時間、ＦＢＳの不存在下でＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持し、最終的に様々なＩＬ−２１の投与量で、５分から４８時間にわたって刺激するか又は刺激しなかった。これと平行して、ＩＬ−２１（５０ ｎｇ／ｍｌ）でさらに４８時間刺激する前に、ＡＧＳ培養をＴＰＣＫ、ＮＦ−ｋＢ活性阻害剤（１〜１０μＭ）で６０分間処理した。
【００６２】
ＥＭＳＡ
上述したように刺激及び非刺激のＡＧＳをホモジナイズし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含む緩衝液Ａを用いて細胞質の抽出物を採取した。核抽出物は、残存している核を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ及び１０％グリセリンを含む緩衝液Ｃ中で可溶化して調製した。両方の緩衝液に、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（Ｓｉｇｍａ）を補充した。核タンパク質のＤＮＡ結合試験を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２．５％のグリセリン、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｇのＰｏｌｙ（ｄｌ−ｄＣ）、ビオチン標識オリゴヌクレオチド及び５μｇの核タンパク質を含む５０ｆｍｏｌの（Ｓｉｇｍａ）プローブを含む２０μｌの反応容量で、室温で２０分間実施した。
【００６３】
ＤＮＡプローブは、市販キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてビオチン３’標識された、２つのコンセンサスオリゴヌクレオチド（ＦＷＤ、５’：−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号７）、ＲＥＶ、５’：−ＣＧＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号８））を用いて調製した。結合特異性は、核タンパク質試料を、結合を飽和させるために１００倍モル過剰の、非標識のＮＦ−ｋＢプローブ又はＩＬ遺伝子（ＩＬ２Ｇ）、（５’：ＡＣＡＡＣＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号９））の非標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることにより確認した。
【００６４】
中和実験で、プローブを添加する前に、抗ＮＦ−ｋＢ／ｐ６５ヒトモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は対照抗体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）（両方とも濃度２．５μｇ／２０μｌで用いた）を、核タンパク質と共に４５分インキュベートした。６％未変性ポリアクリルアミドゲルを、電気泳動分離に使用した。メンブラン上へブロット後に、標識オリゴヌクレオチドをＥＭＳＡ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。
【００６５】
ＤＬＤ−１培養
ＤＬＤ−１は、集密になるまで１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で維持した。次いで細胞を２４時間ＦＢＳの不存在下で、ＲＰＭＩ１６４０中で維持し、最後に１５分〜４８時間様々なＩＬ−２１の投与量で刺激するか又は刺激しなかった。
【００６６】
ＩＬ−２１Ｒ免疫組織化学
ＩＬ−２１Ｒ発現は、ＣＤ患者及び対照健常者の腸切除検体で評価した。組織切片を切断し、次いでキシレン及びエタノール処理により、脱パラフィン化し、脱水した後、スライドをクエン酸緩衝液（０．０１Ｍ）、ｐＨ ６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、電子レンジで２０分間インキュベートした。希釈１：２０で用いた抗ＩＬ−２１Ｒヒトモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は対照抗体と共にインキュベーションを４℃で一夜実施した。染色特異性は、ブロッキングペプチドを用いて確認した。ＴＢＳ洗浄（Ｓｉｇｍａ）後、スライドをＨＲＰパーオキシダーゼ結合２次抗体（希釈１：５０、Ｄａｋｏ ＳｐＡ，Ｍｉｌａｎ）と共に室温で３０分間インキュベートした。
【００６７】
基質としてジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ヘマトキシリンでコントラスト処理により、免疫反応性細胞が認められた。対照切片は、前述のとおり１次抗体を対照抗体（Ｄａｋｏ）と置換して、同じ免疫組織化学的な条件下で調製した。キシレン及びエタノール処理に続く脱水後に、スライドを光学顕微鏡で解析した。
【００６８】
ＩＬ−２１Ｒのウエスタンブロット
ＩＬ−２１Ｒに関するウエスタンブロット分析を、抽出した総タンパク質を用いて実施した。抽出物は、腸筋線維芽細胞細胞系、ＣＣＤ１８ＣＯ、胃及び腸管上皮細胞、並びに胃癌上皮細胞（ＡＧＳ）及び腸癌上皮細胞（ＨＴ−２９、ＨＴ−１１５、Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ−１、Ｔ８４、Ｃａｃｏ−２）から調製した。タンパク質抽出及びＩＬ−２１Ｒ分析は、上述のように実施した。ＩＬ−２１Ｒの検討には、市販のモノクローナル抗体（最終濃度１μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００６９】
ＭＭＰウエスタンブロット
インキュベーションに続いて、ＩＬ−２１でまだ非刺激であるか又は刺激した筋線維芽細胞及びＡＧＳの培養上清を採取し遠心分離して、特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるウエスタンブロット法による、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の分析に用いた。さらにタンパク質抽出物を、ＩＬ−２１で刺激した細胞及び非刺激の細胞から調製し、次いで特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるウエスタンブロット法によるＭＴ−ＭＭＰ−１の分析に用いた。
【００７０】
タンパク質アレイシステム
腸管上皮細胞のＩＬ−２１刺激作用がタンパク質／サイトカイン／ケモカインの含有量の変更を伴ったかどうかを分析するために、ＩＬ−２１で刺激したか又は非刺激のＤＬＤ−１培養上清を、同時に１２０個のタンパク質が分析可能な市販のタンパク質アレイシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）キット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）を用いるタンパク質分析に付した。それぞれの上清１ｍｌを、１２０個のタンパク質に対する抗体を含むメンブラン上で一夜インキュベートした。数回の洗浄後、ブロットをビオチン標識２次抗体とインキュベートし、次いでストレプトアビジン及び基質と共にインキュベートした。それぞれのバンドの強度をコンピュータ支援分析により評価した。
【００７１】
ＭＩＰ−３αＥＬＩＳＡ
上述したようにＩＬ−２１で刺激したか又は非刺激のＤＬＤ−１培養上清で、市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｃｅ Ｉｍｐｏｒｔ−Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｒｌ，Ｍｉｌａｎ）によりＭＩＰ−３αを分析した。光学密度は、ＥＬＩＳＡリーダーＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００により波長４５０ｎｍで測定した。結果はｐｇ／ｍｌで示した。
【００７２】
結果
ＩＬ−２１Ｒは、腸管の初代筋線維芽細胞及び胎児腸管線維芽細胞（ＣＣＤ１８ＣＯ）で構成的に発現していることが分かった（図８）。また同じ細胞型が、機能性を有するＩＬ−２１Ｒの必須成分である共通のγ鎖レセプターを発現した（図８）。ＩＬ−２１Ｒ発現は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βを含む炎症性刺激によりさらに増強された（図９）。
【００７３】
重要なことに、ＩＬ−２１による腸管筋線維芽細胞の刺激により、ＴＩＭＰではなくＭＭＰの分泌が増強された。このことは初代筋線維芽細胞及びＣＣＤ１８ＣＯの両方において確認された（図１０）。またＩＬ−２１は細胞膜ＭＭＰの発現、例えばその活性がＭＭＰ−２の活性化に必須であるＭＴ−ＭＭＰ−１の発現を増強した（図１１）。さらにＭＭＰ合成の刺激に関して、ＩＬ−２１はＴＮＦ−αと協働した（図１２）。ＭＭＰの誘導に関して、ＩＬ−２１の生物学的役割を確かめるために、ＣＤ ＬＰＭＣ上清は、腸管筋線維芽細胞によるＭＭＰ合成を促進し、このような効果は、抗ＩＬ−２１抗血清ＧＭ２の添加により阻害されることが示された（図１３）。ＩＬ−２１Ｒの構成的な発現は、腸管初代上皮細胞及び大腸癌上皮系でも見られた（図１４）。重要なことは、免疫組織化学（図１４、パネルＡ）及びウエスタンブロット（図１４、パネルＢ）分析が、ＩＢＤ患者、特にＣＤ患者の上皮細胞で、ＩＬ−２１Ｒの発現増強を示したことである。腸管上皮細胞の生物活性に及ぼすＩＬ−２１の効果を検討するために、ＤＬＤ−１細胞はＩＬ−２１Ｒを発現するので、これらの細胞系を選択した。ＩＬ−２１によるこれらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すると、様々なリン酸化タンパク質の含有量の変化を伴っていた（図１５、パネルＡ）。ＩＬ−２１に対する細胞応答は、ＩＬ−２１刺激に応答してＤＬＤ−１がＭＩＰ−３αを高度に分泌するという証拠により裏づけられた（図１４、パネルＢ及びＣ）。胃の初代上皮細胞並びにＡＧＳ及びＭＫＮなどの胃癌上皮細胞系は、構成的にレセプターを発現したので、ＩＬ−２１Ｒの発現は腸管上皮に限定されていなかった（図１８）。ＩＬ−２１によるＡＧＳの刺激は、Ｈｐ感染患者の上皮で過剰に産生された２つのゼラチナーゼであるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（図１９、パネルＡ）の分泌増強を常にもたらした。ＩＬ−２１がＮＦ−ｋＢ活性化を増強し（図１９、パネルＢ）、ＴＰＣＫによるＮＦ−ｋＢの阻害は、ＩＬ−２１の媒介するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９合成を減少させた（図１９、パネルＣ）と想定するならば、この効果はＮＦ−ｋＢの活性化を調節するＩＬ−２１の機能に依存しているようである。
【００７４】
（実施例６）
乾癬患者でのＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒの発現の検討
材料と方法
患者と検体
皮膚バイオプシー検体は、９人の乾癬患者の病変部及び非病変部から採取した。募集時には患者は治療を受けていなかった。バイオプシー検体は液体窒素で直ちに凍結し、使用するまで−８０℃で保持した。
【００７５】
ＩＬ−２１及びＩＬ−２１Ｒのウエスタンブロット
各検体からの総タンパク質抽出物を、上述の方法を用いてＩＬ−２１及びそのレセプターに関して分析した。
【００７６】
参考文献
−Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＢＪら Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００４；１１３：１６６４−７５。
−Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００４；１１４：４７１−４。
−Ｓｏｌｌｉｄ ＬＭ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；２：６４７−５５。
−Ｐｏｄｏｌｓｋｙ Ｄ．Ｋ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００２；．３４７：４１７−２９。
−Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＫら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３；８１：３５４−６６。
−Ｓｐａｈｎ ＪＤら Ｊ Ａｓｔｈｍａ．１９９７；３４：１７７−９４。
−Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ Ｊ．Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２００４；２０補遺４：６６−７４。
−Ｓｅｅｇｅｒｓ Ｄら Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００２；１６：５３−５８。
−Ｓａｎｄｂｏｒｎ Ｊら Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００２；．１２２：１５９２−６０８。
−Ｆｉｏｃｃｈｉ Ｃ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００１；１０８：５２３−２６。
−Ｈａｂｉｂ Ｔら Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１１２：１０３３−４５。
−Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊら Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００２；７２：８５６−６３。
−Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｍら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００３；２８：１３１−４０。
−Ｚｈａｎｇ ＪＬら Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３；３００：２９１−６。
−Ｍｅｈｔａ ＤＳら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０：４１１１−８。
−Ｊｉｎ Ｈら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：６５７−６５。
−Ｍａ ＨＬら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７：６０８−１５。
−Ｗｕｒｓｔｅｒ ＡＬら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２；１９６：９６９−７７。
−Ｇａｌｌｅｇｏｓ ＡＭら Ｃｅｌｌ ２００４；１１７：１４９−５１。
−Ｎｅｕｒａｔｈ Ｍ Ｆら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：２６０５−２６１６。
−Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９７；１１２：１１６９−７８。
−Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９９；１１７：１０６９−７７。
−Ｈｅｕｓｃｈｋｅｌ ＲＢら Ｇｕｔ ２０００；４７：５７−６２。
−Ｓａａｒｉａｌｈｏ−Ｋｅｒｅ ＵＫら Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９６；１４８：５１９−２６。
−Ｋａｎｅ Ｄら Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００４；３１：１２７４−８０．
−Ｗａｌｌ ＳＪら Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３；１４９：１３−６。
−Ｋｗｏｎ ＪＨら Ｇｕｔ．２００２；５１：８１８−２６。
−Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ ＭＣら Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００；１９２：７０５−１８。
−Ｍｏｒｉ Ｎら Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００３；１２４：９８３−９２。
−ＥＰ １４４３ ０５５。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１、パネルＡは、ウエスタンブロット法で測定される、３人のＣＤ患者、３人のＵＣ患者及び３人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの総タンパク質抽出物中の、ＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現を示す。下のパネルは、任意の濃度測定単位で発現したそれぞれの対象者でのＩＬ−２１／β−アクチンタンパク質比率を示す（グラフの中でそれぞれの場所で示されている）。水平バーは、それぞれの群の中央値を示す。
【図２】図２、パネルＡは、ウエスタンブロット法で評価される、３人のＣＤ患者及び２人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの、総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現の分析を示す。それぞれのＣＤ患者に関しては、検体を炎症（病変部）及び非炎症部位から取り出した。右のパネルは、異なる患者及び対照健常者で測定し、任意の濃度測定単位の平均±標準偏差として示したＩＬ−２１／β−アクチンタンパク質含有比率を示す。図２のパネルＢは、３人の炎症性ＣＤ患者、３人の線維性狭窄ＣＤ患者及び２人の対照健常者由来の腸管粘膜検体からの総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１タンパク質量（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す。右のパネルは、異なる患者及び対照健常者で評価し、任意の濃度測定単位の平均±標準偏差として示したｌＬ−２１／β−アクチンタンパク質比率を示す。
【図３】図３、パネルＡは、ウエスタンブロット法で測定される、２人のＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者由来の腸固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）の発現を示す。パネルＢは、２人のＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者の腸固有層（ＬＰＬ）Ｔ細胞から分離した総タンパク質抽出物のＩＬ−２１及びβ−アクチンの典型的なウエスタンブロットを示す。左の挿入図は、１人のＣＤ患者、１人のＵＣ患者及び１人の対照健常者から分離したＣＤ４＋ＬＰＬ又はＣＤ８＋ＬＰＬｓでのＩＬ−２１の発現を示す。右の挿入図は、２人ＣＤ患者、２人のＵＣ患者及び２人の対照健常者の腸から精製したＣＤ４５ＲＯ＋ＬＰＬでのＩＬ−２１タンパク質量を示す。
【図４】図４は、ヒト組換え型ＩＬ−２１で刺激したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、転写因子Ｓｔａｔ３（ｐＳｔａｔ３）のリン酸化誘導に及ぼす、それぞれの抗ＩＬ−２１抗血清（配列ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＭ５、ＧＭ６）の阻害効果を示す。下のブロットは、同じ検体における総Ｓｔａｔ３の量を示す。ＰＳｔａｔ３及び総Ｓｔａｔ３はどちらも、ウエスタンブロット法により評価した。
【図５】図５は、ＣＤ患者の腸から分離したＬＰＭＣにおける、Ｔｈ１応答（Ｔ−ｂｅｔ及びＳｔａｔ４）並びにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）合成を伴う転写因子の発現に及ぼすＧＭ２抗血清の阻害効果を示す。Ｔ−ｂｅｔ（Ａ）並びにリン酸化Ｓｔａｔ４及び総Ｓｔａｔ４（Ｂ）の量を、総タンパク質抽出物のウエスタンブロット法により分析し、一方、培養上清のＩＦＮ−γ分泌（Ｃ）は、市販キットを用いてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図６】図６は、正常被験者並びにＣＤ及びＵＣ患者の腸から分離し、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）又は対照血清の存在又は非存在下で２０時間培養したＬＰＭＣ検体に関して、細胞蛍光測定法で測定したＣＤ３＋細胞及び／又はアネキシンＶ（ＡＶ）のパーセンテージを示す。
【図７】図７は、ＣＤ患者の腸から分離し、抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）又は対照血清の存在、非存在下で４時間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、細胞蛍光測定法で測定したＤＩＯＣ６量を示す。
【図８】図８は、１人の正常被験者（対照）、１人のＣＤ患者及び１人のＵＣ患者の結腸、胎児腸線維芽細胞細胞系（ＣＣＤ１８ＣＯ）並びにＣＤ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から分離した筋線維芽細胞からの総タンパク質抽出物での、ＩＬ−２１Ｒ及びγ−鎖レセプターサブユニットに関する典型的なウエスタンブロットを示す。図のパネルＢは、８人のＣＤ患者、８人のＵＣ患者及び８人の対照健常者由来の腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中の、ＩＬ−２１Ｒ／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、全ての実験の平均±標準偏差を示す。
【図９】図９は、１人の正常被験者の結腸から分離し、培地のみでの培養（非刺激）又はＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を２４時間行った初代筋線維芽細胞からの総タンパク質抽出物での、ＩＬ−２１Ｒに関する典型的なウエスタンブロットを示す。図のパネルＢは、上述したように刺激した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中のＩＬ−２１Ｒ／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、３つの独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ患者から分離した腸管筋線維芽細胞での、ＭＭＰ（ＭＭＰ−１、２、３及び９）の合成に及ぼすＩＬ−２１の刺激効果を示す。ＭＭＰに及ぼすＩＬ−２１効果は用量依存的で、ＭＭＰ（ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２）の組織阻害物質の産生に関し、いかなる変化とも関連していない。同様の結果がＵＣ患者の腸から分離した筋線維芽細胞で得られた。Ｖｅ＋＝ＣＤ患者の大腸からのタンパク質抽出物を陽性対照として用いた。
【図１１】図１１は、ＣＤ患者から分離し、培地のみ又はＩＬ−２１の段階的な投与量で培養した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物でのＭＴ−ＭＭＰ１の合成に及ぼすＩＬ−２１の効果を示す。ＭＴ−ＭＭＰ１に及ぼすＩＬ−２１の効果は用量依存的である。Ｖｅ＋＝ＣＤ患者の大腸からのタンパク質抽出物を陽性対照として用いた。図のパネルＢは、上述したように、刺激した腸管筋線維芽細胞から調製したタンパク質抽出物中のＭＴ−ＭＭＰ１／β−アクチン量の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位で表し、３つの独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、ＣＤ患者から分離した腸管筋線維芽細胞で、ＩＬ−２１及びＴＮＦ−αがＭＭＰ−１、２、３及び９の合成の増強に協働するが、ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２に及ぼす誘導効果をもたないことを示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ筋線維芽細胞の培養へＣＤ ＬＰＭＣ上清を添加すると、ＭＭＰ合成が増強し、このような効果は抗ＩＬ−２１抗血清（ＧＭ２）により阻害され得るが、対照抗血清では阻害されないことを示す。
【図１４】図１４は、腸管上皮細胞でのＩＬ−２１Ｒの発現を示す。パネルＡは、免疫組織化学により評価した、対照健常者及びＣＤ患者からの大腸検体でのＩＬ−２１Ｒの発現を示す。パネルＢは、１人の正常被験者（対照）、１人のＣＤ患者及び１人のＵＣ患者の上皮細胞から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒ及びβ−アクチンを示す典型的なウエスタンブロットを図示する。パネルＣは、７人のＣＤ患者、７人のＵＣ患者及び７人の対照健常者の大腸から分離した上皮細胞から調製したタンパク質抽出物での、ｌＬ−２１Ｒ／β−アクチンタンパク質の比率を示す。数値は任意の濃度測定単位（ａ．ｕ．）で表し、全ての実験の平均値±ＳＤを示す。パネルＤは、６つの異なる大腸癌上皮細胞系から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１を示す典型的なウエスタンブロットを図示する。
【図１５】図１５（パネルＡ）は、ＤＬＤ−１細胞でいくつかのリン酸化タンパク質の発現に及ぼすＩＬ−２１の効果を示す。リン酸化タンパク質（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。パネルＢは、４８時間培養後のＤＬＤ−１細胞でのタンパク質分泌に及ぼすＩＬ−２１効果を示す。分析は同時に１２０の異なるタンパク質を評価することができる市販キットを用いて実施した。ＩＬ−２１に刺激された細胞で、ＭＩＰ−３αの分泌の増強（円はタンパク質を示す）が認められた。次いでＥＬＩＳＡにより、非刺激及びＩＬ−２１で刺激したＤＬＤ−１の上清で、このような増加がＭＩＰ−３αの分析により確認された（パネルＣ）。
【図１６】図１６は、３人のＨｐ感染患者及び３人の対照健常者の胃粘膜の検体から調製した総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１７】図１７は、３人のセリアック病患者（ｃｅｌｉａｃｓ）及び３人の対照健常者の十二指腸粘膜検体から調製した総タンパク質抽出物中のＩＬ−２１（上のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１８】図１７は、２人のＨｐ関連胃炎患者及び２人の正常被験者（対照）の胃から分離した上皮細胞から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒを示す典型的なウエスタンブロットを示す。パネルＢは、胃癌上皮細胞系（ＡＧＳ及びＭＫＮ）から抽出した総タンパク質中のＩＬ−２１Ｒ及びγ−鎖を示す典型的なウエスタンブロットを示す。
【図１９】図１９、パネルＡは、上皮胃細胞（ＡＧＳ）でＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌に及ぼすＩＬ−２１の用量依存的な効果を示す。パネルＢは、ＡＧＳ細胞でＮＦ−ｋＢ活性化を増強するＩＬ−２１の機能を示す。３つの典型的なＥＭＳＡの１つを示す。パネルＣは、ＴＰＣＫによるＮＦ−ｋＢ活性化阻害がＩＬ−２１に媒介されるＭＭＰ２及びＭＭＰ９の合成を如何に減少させるかを示す。
【図２０】図２０は、４人の乾癬患者の病変部及び非病変部から採取した皮膚のバイオプシーにより調製した総タンパク質抽出物のＩＬ−２１（上のブロット）、ＩＬ−２１Ｒ（中央のブロット）及びβ−アクチン（下のブロット）に関する典型的なウエスタンブロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＦＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）、
又はそれらの少なくとも５つのアミノ酸の部分
を含むヒトＩＬ−２１配列に属する抗原性エピトープ。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
ヒトＩＬ−２１に対する抗体を調製するための請求項１に記載のエピトープの使用。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナル、抗体フラグメント、キメラ抗体又は単鎖抗体である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の抗原性エピトープの少なくとも１つに特異的及び選択的な中和抗体。
【請求項６】
蛍光色素、放射性同位元素又は薬剤で標識された請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
医療分野における使用のための請求項５又は６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患の治療に対する薬剤を調製するための請求項５から７までに記載の抗体の使用。
【請求項９】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のための請求項５から７までに記載の抗体の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う前記免疫炎症性疾患が、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、乾癬である請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記慢性炎症性腸疾患が、クローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
薬剤学的に許容し得る１つ若しくは複数のコアジュバント及び／又は賦形剤と共に有効成分として請求項５から７までに記載の少なくとも１つの抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項５及び／又は６に記載の抗体及び／又は請求項１に記載のエピトープの少なくとも１つを含む診断キット。
【請求項１】
以下の配列：
ＫＭＩ ＨＱＨ ＬＳＳ ＲＴＨ ＧＳＥ ＤＳ（配列番号１）、
ＮＶＳ ＩＫＫ ＬＫＲ ＫＰＰ ＳＴＮ（配列番号２）、
ＬＧＴ ＬＶＨ ＫＳＳ ＳＱＧ ＱＤＲ（配列番号３）、
ＴＮＡ ＧＲＲ ＱＫＨ ＲＬＴ ＣＰＳ（配列番号４）、
ＣＤＳ ＹＥＫ ＫＰＰ ＫＦＦ ＬＥＲ（配列番号５）、
ＣＦＱ ＫＡＱ ＬＫＳ ＡＮＴ ＧＮＮ Ｅ（配列番号６）、
又はそれらの少なくとも５つのアミノ酸の部分
を含むヒトＩＬ−２１配列に属する抗原性エピトープ。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
ヒトＩＬ−２１に対する抗体を調製するための請求項１に記載のエピトープの使用。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナル、抗体フラグメント、キメラ抗体又は単鎖抗体である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の抗原性エピトープの少なくとも１つに特異的及び選択的な中和抗体。
【請求項６】
蛍光色素、放射性同位元素又は薬剤で標識された請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
医療分野における使用のための請求項５又は６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患の治療に対する薬剤を調製するための請求項５から７までに記載の抗体の使用。
【請求項９】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う免疫炎症性疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のための請求項５から７までに記載の抗体の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−２１発現の変化を伴う前記免疫炎症性疾患が、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、乾癬である請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記慢性炎症性腸疾患が、クローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
薬剤学的に許容し得る１つ若しくは複数のコアジュバント及び／又は賦形剤と共に有効成分として請求項５から７までに記載の少なくとも１つの抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項５及び／又は６に記載の抗体及び／又は請求項１に記載のエピトープの少なくとも１つを含む診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５２１７９７（Ｐ２００８−５２１７９７Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４２５２２（Ｐ２００７−５４２５２２）
【出願日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００５／０００６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７０２７
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５３６７０１７）ジュリアーニ インターナショナル リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００５／０００６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７０２７
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５３６７０１７）ジュリアーニ インターナショナル リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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