ウイルスの増殖のための二段階温度プロフィール
本発明は、ウィルスの産生方法を提供する。方法は、ウィルスに感染した宿主細胞を提供するステップと、感染した宿主細胞を二つの異なる温度で培養するステップとを含む。培養ステップにより産生されたウィルスが、その後回収される。二重温度培養プロセスを用いて、高い力価および純度の向上が得られる。多くのウィルスで、二温度プロフィールを用いることにより、培養条件が大幅に改善されうることが分かった。高いほうの温度が、ウィルス増殖の第一段階に適用され、感染性ウィルス粒子の形成を加速する。第二段階においては、低いほうの温度が適用されて、高温増殖期間に得られた最初の高力価が維持され、免疫原性ワクチンのさらなる製造に使用できる安定した抗原の形成が可能となる。本発明の目標は、ワクチン接種目的で生成される抗原の品質に影響しない、改善された増殖条件を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ウィルス増殖の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物細胞培養におけるウィルス増殖が、ウィルスの特性と増殖のための宿主系に依存する温度条件下で、行われる。ある温度が細胞増殖のために（細胞培養または有胚卵育種において）選択された後、ウィルス増殖のための温度が選択される。ほとんどの場合、ウィルス増殖温度は、細胞増殖温度より低い。温度感受性のウィルスの増殖は、昆虫細胞培養（例えばバクロウィルス産生を伴う）で大体２０℃周辺の温度範囲内で、および哺乳類細胞培養におけるウィルス産生では最大約３７℃の温度で、ウィルス／宿主細胞組み合わせごとに特定の最適条件を伴って、ウィルス増殖速度および抗原の形成に影響を与えることに関する。高温は、感染キネティクスおよびウィルス安定性の両方に影響する。ウィルスを３７℃の温度で増殖させると、ウィルス複製後期に、ウィルス力価の低下およびウィルス抗原品質の低下が観察されることが多い。この影響は、ワクチン産生のためのラージスケールのウィルス増殖に有害な結果をもたらしうる。
【０００４】
本発明の目標は、ワクチン接種目的で生成される抗原の品質に影響しない、改善された増殖条件を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ウィルスの産生方法を提供し、一つ以上の宿主細胞がウィルスで感染された後、第一温度で培養され（例えば３１℃〜３７℃の温度で１〜４８時間）、その後、第一温度と比較して低下した（例えば１℃〜６℃）第二温度で、培養される。そして、これらの培養ステップにより生成されたウィルスが、回収される。
【０００６】
驚くべきことに、インフルエンザ（Ｏｒｔｈｏ−ｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ロスリバーウィルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）および西ナイルウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）を含む多くのウィルスで、二温度プロフィールを用いることにより、培養条件が大幅に改善されうることが現在分かった。高いほうの温度が、ウィルス増殖の第一段階に適用され、感染性ウィルス粒子の形成を加速する。第二段階においては、低いほうの温度が適用されて、高温増殖期間に得られた最初の高力価が維持され、免疫原性ワクチンのさらなる製造に使用できる安定した抗原の形成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ベロ細胞において（Ａ）３２℃および（Ｂ）３６℃で増殖させた、ニューカレドニアウィルスの抗原バンドパターン。
【図２】感染後の様々な時点での、３７℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図３】感染後の様々な時点での、３５℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図４】感染後の様々な時点での、３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図５】感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図６】３７℃および３５℃／３２℃での感染のロスリバーウィルス接種菌のウェスタンブロット。
【図７】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図８】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図９】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の一態様は、本明細書に記載の二段階温度プロフィールが、（１）宿主細胞の複数回感染のための活性ウィルスの形成、（２）複製の後段階で得られた高力価の維持、および（３）産生プロセスの後段階における抗原形成の、独立した最適化および制御を可能にするという認識である。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態においては、当該ウィルスは、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである。
【００１０】
ウィルスは、インフルエンザウィルスであるのが好ましく、ある実施形態では、インフルエンザＡ型およびＢ型、ロスリバーウィルスおよび西ナイルウィルスからなる群より選択される。本明細書に提供される実施例は、本発明の二温度方法を用いた、これらのウィルスでの改良された抗原産生を示すが、本発明により予定される他のウィルスの非限定的な例には、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＢｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＲＮＡウィルスファミリー、および、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＤＮＡウィルスファミリーの群より選択されるウィルスが含まれる。ある実施形態では、ウィルスは、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５、およびＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６からなる群より選択される。
【００１１】
ウィルスは、ウィルス産生に適切な任意の細胞において産生されうる。細胞は、動物細胞培養または細胞系統のものであるのが好ましい。このような細胞は、特定の組織または胚細胞からのものでありうる。動物は、哺乳類または鳥類であるのが好ましい。本発明の様々な実施形態は、イヌ細胞系統、齧歯目細胞系統、鳥類細胞系統または霊長類組織細胞系統を利用しうる。例えば、ある実施形態では、細胞は、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ｐｅｒＣ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはウィルス増殖において一般に使用される他の細胞でありうる。いくつかの特定の実施形態においては、細胞は、上皮細胞、特に腎臓上皮細胞、例えばアフリカミドリザルのベロ細胞などである。
【００１２】
本発明のある実施形態においては、細胞は、動物の血清タンパク質を含まない培地で培養される。このような培地は、例えば、ウシ血清またはその部分、例えば胎児ウシ血清を含まない。このような培地は、「無血清無タンパク質培地」と呼ばれる。ウィルス増殖期間中、トリプシン等、ウィルス増殖に必要とされるプロテアーゼが、培地に加えられうる。いくつかの実施形態においては、このようなプロテアーゼは、バクテリアまたは組換え源のような非動物源に由来し、または動物源に由来しうる。このような添加培地も、本明細書で用いられるところの用語の意義の範囲内の、無血清タンパク質培地であると考えられる。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明の方法は、工業規模で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、方法は、５０リットル以上の細胞培養、五十〜１００リットルの細胞培養、１００〜５００リットルの細胞培養、５００〜１０００リットルの細胞培養、または１０００リットルを上回る細胞培養（例えば６０００リットル、１０，０００リットル、またはさらに大きなバイオリアクター）で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の方法は、撹拌槽バイオリアクターで実施される。
【００１４】
本発明の好ましい方法においては、第一ウィルス増殖温度は、所与の宿主細胞型のための細胞培養増殖温度より低い。いくつかの実施形態においては、第一温度は、３２℃〜３７℃の間であり、好ましくは３３℃〜３６℃の間、より好ましくは３４℃〜３５．５℃の間、特に３５℃である。他の実施態様においては、第一温度は、３０℃〜３６℃の間であり、好ましくは３０℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３３．５℃の間、より好ましくは３３℃および３４℃の間、最も好ましくは３３．５℃であり、または、いくつかの実施形態においては、３３℃である。特に、大きな細胞培養体積（１０００リットル以上）では、第一温度範囲が低めであるのが好まれうる。第一温度は、少なくとも３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、または３６℃、または３８℃、３７．５℃、３７℃、３６℃、３５．５℃、または３５℃未満でありうる。第一温度での細胞培養は、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０時間を上回り、または、６０、５８、５６、５４、５２、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４または１２時間未満でありうる。
【００１５】
追加的な実施形態においては、第二温度は、第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下し、好ましくは２℃〜４℃低下し、より好ましくは２．５℃〜３．５℃、最も好ましくは３℃低下する。低下は、少なくとも１℃、２℃、２．５℃、３℃、または４℃、または６℃、５℃、４℃、３．５℃、３℃、２．５℃、または２℃未満でありうる。
【００１６】
他の実施形態においては、第二温度は、２９℃〜３５℃の範囲であり、好ましくは３０℃〜３４℃、より好ましくは３１℃〜３３℃、より好ましくは３１．５℃〜３２．５℃、最も好ましくは３２℃である。第二温度は、２８℃、２９℃、３０℃、または３１℃を上回り、または３５℃、３４℃、３３℃、または３２℃を下回りうる。
【００１７】
この方法は、ウィルス抗原の産生のためにも用いられうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法を提供し、ウィルスが本明細書に記載のように産生され、ウィルスまたはウィルス抗原が単離される。細胞を分解し、または細胞上清を採取した後、抗原を単離することにより単離し、選択的に精製するための標準的方法（例えば遠心分離またはクロマトグラフィ）を用いて、単離が実行されうる。
【００１８】
さらなる実施形態においては、ウィルスが、（例えば国際公開第０５／１１８００号に示される方法に従って）精製の前または後に断片化または不活性化される。さらに、ウィルスのワクチンが調製されうる。ワクチンは、抗原物質の免疫原性組成物であり、抗原物質は、非感染性ウィルス、その外皮、粒子またはその抗原でありうる。ワクチンが投与されると、宿主（例えばヒト等の哺乳類または鳥類）における免疫化が生じる。ワクチン接種はワクチンに対する特異反応および軽微な炎症を引き起こしうるが、一般に、ワクチン接種に対する反応は、完全に成育可能なウィルスによる感染に対する反応と比較して大きく減少される。
【００１９】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、それらは単に例示であり、本発明をいかなる形でも制限するものではない。
【実施例】
【００２０】
多くのウィルス膜タンパク質は、複製能のあるウィルスを産生するために、翻訳後修飾を必要とする。インフルエンザウィルスにおいては、ＨＡ２のアミノ末端領域で融合ドメインを生成する、前駆体ヘマグルチニン（ＨＡ）分子（ＨＡ０）のＨＡ１およびＨＡ２サブユニットへのタンパク質分解的切断が、細胞へのウィルスの侵入のために必須である。したがって、細胞培養における感染サイクルの開始は、プロテアーゼの添加により触媒されねばならない。ワクチン製造プロセスでは、ブタ起源のγ線を照射したトリプシンが使用される。
【００２１】
ベロ細胞等の細胞培養におけるインフルエンザ増殖のための従来の温度プロフィールは、温度が例えば３３℃（Ｂ−菌種）〜３７℃（Ａ−菌種）で一定であるものである。［例えば、Ｇｏｖｏｒｋａｖａ Ｅ Ａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｒ．８，Ａｕｇ．１９９６，ｐ．５５１９−５５２４を参照］。本発明の態様は、１０Ｌバイオリアクターシステムにおけるスモールスケール実験による、最初の感染段階中の温度プロフィールの上昇が、インフルエンザ産生プロセスの全体的サイクル時間にプラスの効果を有しうるという認識である。さらに、ベロタンパク質／ＳＲＤ比として測定される抗原の純度に対するプラスの効果も、得られた。このコンセプトを証明するために、本明細書に記載のように、１００Ｌスケール実験が行われた。
【００２２】
（実施例１）
３２℃および３６℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
３２℃および３６℃でのバイオリアクター運転のベロ培養を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。ｐＨ、ｐＯ２、細胞密度および培養に加えられるトリプシン量の設定パラメータは同等であり、インフルエンザ抗原の製造のためのラージスケール条件を反映した。ウィルス収量およびサイクル時間に対する温度上昇の効果が、表１において比較される。
【００２３】
【表１】
２日後に、３６℃培養で２０％の残留酸素吸収速度が観察され、それは３日目までに５％より下に低下した。３６℃でのインフルエンザウィルスの増殖は、３２℃条件と比較して高い感染性、したがって全培養時間の減少をもたらした。反対に、３２℃培養は、２日目および３日目に、それぞれ８０％および５０％の、より高い残余ＯＵＲを生じた。最終的ＨＡ力価は、同等だった。しかし、ＮａＢｒ勾配を用いた超遠心分離による抗原分離実験から、３６℃条件下で培養３日目に、抗原バンドパターンのシフトが生じ（図１Ｂ）、一方で、ＵＶ２５４ｎｍ検出器により測定された溶出プロフィールは、３２℃培養で同等に高いが、より相称のピークを生じた（図１Ａ）。したがって、産物収量および特に純度に関しては、３６℃条件がいくつかの不都合を有しうる。
【００２４】
本産生プロセスでは、蔗糖密度勾配からウィルス抗原が採取される。したがって、３６℃実験では、抗原の一部が、低密度画分にシフトしていると結論づけられうる（図１Ｂ）。
【００２５】
（実施例２）
３２℃、３３℃、および３４℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
パナマウィルス収量およびサイクル時間に対する培養温度上昇の効果を調査するために、三つの１０Ｌバイオリアクターシステムが同時に、温度をそれぞれ３２℃、３３℃および３４℃に設定して運転された。他の全てのパラメータ設定点は、実施例１の下に記載される実験と同等だった。
【００２６】
表２には、三つのバイオリアクターシステムのプロセスサイクル時間が与えられる。２０％残留酸素吸収速度（代謝性酸素消費の８０％減少）に達した後に培養が終了され、感染サイクルのキネティクスが比較された。３４℃実験では、２１時間のサイクル時間減少が達成できた。
【００２７】
【表２】
培養上清が遠心分離され、標準的プロトコルに従ってＢｅｎｚｏｎａｓｅおよびホルマリンで処理された。不活性化された採取物（ＭＶＨ）が、蔗糖密度勾配超遠心分離により精製された（表３を参照）。
【００２８】
【表３】
表２から、温度条件上昇により、サイクル時間の減少がもたらされたと結論できる。しかし、表３に示すように、温度条件上昇（例えば３３℃および３４℃）は、全体的なウィルス抗原収量および精製ウィルスの品質に負の影響を有することが、ＳＲＤ／タンパク質比率およびベロタンパク質／ＳＲＤ比率の両方により明らかにされた。したがって、より高温で、ウィルス抗原の純度低下が観察された。
【００２９】
（実施例３）
３５℃での初期ウィルス増幅を伴うＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
本実施例は、インフルエンザウィルス産生プロセスの最初の２４時間の温度設定を上昇させた、培養実験に関する。ベロ細胞培養を、１００リットルスケールでＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。
【００３０】
従来の温度プロフィール（すなわち発酵プロセス全体で３２℃の温度設定点）と、初期ウィルス増幅を３５℃とした改変プロセスとの比較が行われた。この新しいプロセスは、感染後（ｐ．ｉ．）２４時間の初期ウィルス複製を３５℃で行った後、ｐ．ｉ．９１時間まで３２℃でインキュベートすることを特徴とする。表４では、１００リットルスケール運転からの、蔗糖密度勾配精製ウィルスの、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度の比較が与えられる。
【００３１】
【表４】
このデータは、発酵プロセスの最初の２４時間を３５℃とする温度設定が、ＳＲＤ／タンパク質比率に対してだけでなく、ベロタンパク質不純度に対してもプラスの効果を有したことをはっきりと示す。同等の感染時間で、不純度プロフィールの大きな改善を伴って、同等の収量が得られた。
【００３２】
（実施例４）
初期ウィルス増幅を３５℃とするＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
二温度プロセスにつき実施例３で観察された反応を確認するために、同じ温度プロフィールを用いて、１００リットルのベロ培養においてＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ウィルスを増殖させた。他の全ての条件およびパラメータは、実施例３にしたがって設定された。
【００３３】
表５において、１００リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロタンパク質不純度が比較される。
【００３４】
【表５】
ウィルス複製の最初の２４時間を３５℃とした後に、３２℃へ温度を低下させた、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ウィルスの産生は、３２℃の一定温度での従来のプロセスを上回るいくつかの利点を有する。一般に、ＳＲＤ／タンパク質およびベロタンパク質／ＳＲＤの比率から明らかなように、インフルエンザウィルス抗原の品質が改善されうる。大幅に減少した感染時間で、収量はやや低いが、特にベロ細胞タンパク質の相対量についての不純度プロフィールは、はるかに優良だった。
【００３５】
インフルエンザウィルス抗原の純度は、インフルエンザワクチンの製造における要因である。ベロ細胞におけるインフルエンザウィルスの複製では、前駆体ヘマグルチニンの切断のためのタンパク質分解条件および適切な温度条件が、重要な要因の一部であることが一般に認められている。本明細書に提示される例示的な実験においては、ウィルス複製の初期段階の間に高い温度を有する温度プロフィールが、蔗糖密度勾配ステップで抗原の改善をもたらすことが示された。さらに、最初の２４時間を３５℃とするインフルエンザウィルスの産生は、サイクル時間に関して、より良好なプロセス性能に対応した。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９およびＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９が、モデル系として用いられて、二温度ウィルス増殖の有用性が証明された。したがって、１０および１００リットルスケールで実行された培養実験からの結果は、ウィルス増殖プロセスの最初の約２４時間を、３２℃から３５℃に変更することによる利益を示す。
【００３６】
（実施例５）
初期ウィルス増幅を３５℃でｐ．ｉ．１８時間対ｐ．ｉ．３６時間行った後、ウィルス増殖終了まで３２℃とする、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５ウィルスで感染させた５０Ｌベロ培養において、抗原収量、ＳＲＤ／タンパク質比率、およびベロタンパク質／ＳＲＩ比率に対する、高温サイクル継続時間の変更による影響を示す。二つの別々の試料で、３５℃の温度を、それぞれｐ．ｉ．１８時間およびｐ．ｉ．３６時間維持した後、温度を３２℃に低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００３７】
表６において、５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロ−タンパク質不純度が、比較される。
【００３８】
【表６】
１８時間およびｐ．ｉ．３６時間それぞれの３５℃での、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５ウィルスの産生は、同等の収量および純度プロフィールを生じた（表６）。これらの結果から、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇継続時間および採取までの温度低下継続時間が広く変動されうると結論できる。
【００３９】
（実施例６）
ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３４℃、３５℃および３６℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３１℃、３２℃および３３℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウィルスで感染させた３２リットル〜８０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる二重温度プロフィールの使用に関する。３４℃、３５℃および３６℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３１℃、３２℃および３３℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００４０】
表７では、３２リットル〜８０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が、異なる温度プロフィールにつき比較される。
【００４１】
【表７】
ｐ．ｉ．１８時間を３４℃〜３６℃とした後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウィルスの産生は、同等収量および純度プロフィールを生じた（表７）。これらの結果から、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇範囲および採取時までの温度低下範囲が広く変動されうると結論できる。
【００４２】
（実施例７）
ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３３．５℃、３５℃および３６．５℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３０．５℃、３２℃および３３．５℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６ウィルスで感染させた３２リットル〜５０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる温度プロフィールの使用に関する。３３．５℃、３５℃および３６．５℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３０．５℃、３２℃および３３．５℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００４３】
表８において、３２リットル〜５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が比較される。
【００４４】
【表８】
ｐ．ｉ．１８時間を３３．５℃、３５℃および３６．５℃とした後、ウィルス増殖終了までそれぞれ３℃低下させたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６ウィルスの産生は、同等の収量および純度プロフィールを生じた（表８）。高温でのより高い収量は、純度低下ももたらしたが、これらの不純度は、ウィルス増殖終了時に３℃の低下によって比較的低いレベルにとどまる。温度低下（例えば３３．５℃／３０．５℃）を有する二重温度プロフィールにより、同等の収量が達成できるが、これらの同等の収量に達するために、より長いウィルス増殖のサイクル時間（なお７０時間より短い）が必要である。特に宿主細胞特異的ベロタンパク質の、純度プロフィールは、３℃の温度シフトを含む低い温度範囲により、典型的に改善される（３４℃／３１℃でのＢ／マレーシアの表７も参照）。これらの結果から、インフルエンザＡ型およびＢ型菌種の両方で、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇範囲および採取時までの温度低下範囲が広く変動されうると結論できる。
【００４５】
（実施例８）
ロスリバーウィルスの産生
ロスリバーウィルス（「ＲＲＶ」）が、２Ｌリアクターで、異なる温度で産生された。調査温度は、３０時間３７℃、３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降はｐ．ｉ．９０時間の感染終了まで３２℃とした。動力学的パラメータが決定され、試料が以下の時間間隔で集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５４、Ｉ−６６、Ｉ−７６およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料が、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。感染細胞の代謝活性をモニタするために、ウィルス増殖の間に残留酸素吸収速度（ＯＵＲ）が測定された。細胞剥離率が、微粒子担体培養の顕微鏡画像により定量された。ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）も、決定された。
【００４６】
条件は、ｐＨ７．１のＰＢＳおよび２０％ｐＯ２、感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で１．０ｇ／Ｌグルコースが加えられ、灌流が停止された。Ｉ−４２以降は、グルコースが１．０ｇ／Ｌ未満に減少した場合には、グルコースが加えられた。結果が表９に示される。
【００４７】
遠心分離条件：Ｉ−１８： ５０００ｇ
Ｉ−４２〜Ｉ−６６： １００００ｇ
Ｉ−７８〜Ｉ−９０： １５０００ｇ
【００４８】
【表９−１】
【００４９】
【表９−２】
四つ全てのインキュベーションのＮａＢｒプロットが、４つの間隔（Ａ：５４ｈ、Ｂ：６６ｈ、Ｃ：７８ｈ、Ｄ：９０ｈ）で図２〜５に与えられる。
【００５０】
ウェスタンブロットが、以下の抗体で実行された：（１）ＲＲ（ＡＴＣＣＶＲ３７３）、Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｆｌｕｉｄ、Ｍｏｕｓｅ；Ｎ．Ｉ．Ｈ．（１：１０００）、および（２）抗マウスＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃：Ａ−４６５６、Ｌｏｔ＃：６３Ｈ８８３０（１：５０００）。結果は、表１０のとおりに図６に与えられる。
【００５１】
【表１０】
両方の高温接種（３７℃および３５℃）で、感染キネティクスが相当に増加し、細胞剥離率は４２時間後に１００％であり、５３時間後の残留Ｏ２が約５０％であった。より低い温度（３２℃および３５℃／３２℃）でのアプローチは、比較的遅かった。これは、Ｉ−１８での力価分析でも明白である。しかし、Ｉ−４２の後、全てのアプローチが、約１Ｅ０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに達した。より低い温度でのアプローチは、感染終了付近で、より安定した力価を示した（Ｉ−７６まで＞１Ｅ０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。Ｉ−７６まで、両方のアプローチにおいて２０％の残留ＯＵＲが測定できた。全ての実験でＩ−５３の後に、ＮａＢｒ勾配において最大ピーク高さに達したが、３５℃接種の全てのＩ−６６試料ならびにＩ−９０で、より低いピークが測定された。温度上昇のために、グルコースレベルが、３７℃および３５℃実験の間に、より速く下落した。感染キネティクスの増加のために、その後は代謝活性が測定できない。全ての実験において、グルコースレベルは最終的に同様だった。
【００５２】
二相温度実験（Ｉ−３０まで３５℃、その後３２℃）の間だけ、開始時の速やかなウィルス増殖、および感染終了までの安定した力価が確立された。これらの条件下では、ＮａＢｒ勾配実験において、Ｉ−７８まで安定した、最大ピークが測定された。ウェスタンブロットでも、３５℃／３２℃実験において、より安定したバンドが検出された。
【００５３】
（実施例９）
西ナイルウィルス実験
２Ｌリアクターにおいて、異なる温度で西ナイルウィルスが産生された。調査温度は、３０時間３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降感染終了まで３２℃とした。９０ｈの動力学的パラメータが、集められた。以下の時間的間隔で試料が集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−３０、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５２、Ｉ−６６、Ｉ−７４およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料は、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。条件は、ｐＨ７．１、２０％ｐＯ２、および感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で、１．０ｇ／Ｌのグルコースが加えられ、灌流が停止された。結果は表１１に与えられ、図７〜９は、ＮａＢｒプロットおよび顕微鏡画像を示す。微粒子担体培養のこれらの顕微鏡画像により、細胞剥離率が定量された。
【００５４】
【表１１−１】
【００５５】
【表１１−２】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ウィルス増殖の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物細胞培養におけるウィルス増殖が、ウィルスの特性と増殖のための宿主系に依存する温度条件下で、行われる。ある温度が細胞増殖のために（細胞培養または有胚卵育種において）選択された後、ウィルス増殖のための温度が選択される。ほとんどの場合、ウィルス増殖温度は、細胞増殖温度より低い。温度感受性のウィルスの増殖は、昆虫細胞培養（例えばバクロウィルス産生を伴う）で大体２０℃周辺の温度範囲内で、および哺乳類細胞培養におけるウィルス産生では最大約３７℃の温度で、ウィルス／宿主細胞組み合わせごとに特定の最適条件を伴って、ウィルス増殖速度および抗原の形成に影響を与えることに関する。高温は、感染キネティクスおよびウィルス安定性の両方に影響する。ウィルスを３７℃の温度で増殖させると、ウィルス複製後期に、ウィルス力価の低下およびウィルス抗原品質の低下が観察されることが多い。この影響は、ワクチン産生のためのラージスケールのウィルス増殖に有害な結果をもたらしうる。
【０００４】
本発明の目標は、ワクチン接種目的で生成される抗原の品質に影響しない、改善された増殖条件を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ウィルスの産生方法を提供し、一つ以上の宿主細胞がウィルスで感染された後、第一温度で培養され（例えば３１℃〜３７℃の温度で１〜４８時間）、その後、第一温度と比較して低下した（例えば１℃〜６℃）第二温度で、培養される。そして、これらの培養ステップにより生成されたウィルスが、回収される。
【０００６】
驚くべきことに、インフルエンザ（Ｏｒｔｈｏ−ｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ロスリバーウィルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）および西ナイルウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）を含む多くのウィルスで、二温度プロフィールを用いることにより、培養条件が大幅に改善されうることが現在分かった。高いほうの温度が、ウィルス増殖の第一段階に適用され、感染性ウィルス粒子の形成を加速する。第二段階においては、低いほうの温度が適用されて、高温増殖期間に得られた最初の高力価が維持され、免疫原性ワクチンのさらなる製造に使用できる安定した抗原の形成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ベロ細胞において（Ａ）３２℃および（Ｂ）３６℃で増殖させた、ニューカレドニアウィルスの抗原バンドパターン。
【図２】感染後の様々な時点での、３７℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図３】感染後の様々な時点での、３５℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図４】感染後の様々な時点での、３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図５】感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図６】３７℃および３５℃／３２℃での感染のロスリバーウィルス接種菌のウェスタンブロット。
【図７】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図８】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図９】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の一態様は、本明細書に記載の二段階温度プロフィールが、（１）宿主細胞の複数回感染のための活性ウィルスの形成、（２）複製の後段階で得られた高力価の維持、および（３）産生プロセスの後段階における抗原形成の、独立した最適化および制御を可能にするという認識である。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態においては、当該ウィルスは、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである。
【００１０】
ウィルスは、インフルエンザウィルスであるのが好ましく、ある実施形態では、インフルエンザＡ型およびＢ型、ロスリバーウィルスおよび西ナイルウィルスからなる群より選択される。本明細書に提供される実施例は、本発明の二温度方法を用いた、これらのウィルスでの改良された抗原産生を示すが、本発明により予定される他のウィルスの非限定的な例には、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＢｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＲＮＡウィルスファミリー、および、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＤＮＡウィルスファミリーの群より選択されるウィルスが含まれる。ある実施形態では、ウィルスは、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５、およびＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６からなる群より選択される。
【００１１】
ウィルスは、ウィルス産生に適切な任意の細胞において産生されうる。細胞は、動物細胞培養または細胞系統のものであるのが好ましい。このような細胞は、特定の組織または胚細胞からのものでありうる。動物は、哺乳類または鳥類であるのが好ましい。本発明の様々な実施形態は、イヌ細胞系統、齧歯目細胞系統、鳥類細胞系統または霊長類組織細胞系統を利用しうる。例えば、ある実施形態では、細胞は、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ｐｅｒＣ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはウィルス増殖において一般に使用される他の細胞でありうる。いくつかの特定の実施形態においては、細胞は、上皮細胞、特に腎臓上皮細胞、例えばアフリカミドリザルのベロ細胞などである。
【００１２】
本発明のある実施形態においては、細胞は、動物の血清タンパク質を含まない培地で培養される。このような培地は、例えば、ウシ血清またはその部分、例えば胎児ウシ血清を含まない。このような培地は、「無血清無タンパク質培地」と呼ばれる。ウィルス増殖期間中、トリプシン等、ウィルス増殖に必要とされるプロテアーゼが、培地に加えられうる。いくつかの実施形態においては、このようなプロテアーゼは、バクテリアまたは組換え源のような非動物源に由来し、または動物源に由来しうる。このような添加培地も、本明細書で用いられるところの用語の意義の範囲内の、無血清タンパク質培地であると考えられる。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明の方法は、工業規模で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、方法は、５０リットル以上の細胞培養、五十〜１００リットルの細胞培養、１００〜５００リットルの細胞培養、５００〜１０００リットルの細胞培養、または１０００リットルを上回る細胞培養（例えば６０００リットル、１０，０００リットル、またはさらに大きなバイオリアクター）で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の方法は、撹拌槽バイオリアクターで実施される。
【００１４】
本発明の好ましい方法においては、第一ウィルス増殖温度は、所与の宿主細胞型のための細胞培養増殖温度より低い。いくつかの実施形態においては、第一温度は、３２℃〜３７℃の間であり、好ましくは３３℃〜３６℃の間、より好ましくは３４℃〜３５．５℃の間、特に３５℃である。他の実施態様においては、第一温度は、３０℃〜３６℃の間であり、好ましくは３０℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３３．５℃の間、より好ましくは３３℃および３４℃の間、最も好ましくは３３．５℃であり、または、いくつかの実施形態においては、３３℃である。特に、大きな細胞培養体積（１０００リットル以上）では、第一温度範囲が低めであるのが好まれうる。第一温度は、少なくとも３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、または３６℃、または３８℃、３７．５℃、３７℃、３６℃、３５．５℃、または３５℃未満でありうる。第一温度での細胞培養は、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０時間を上回り、または、６０、５８、５６、５４、５２、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４または１２時間未満でありうる。
【００１５】
追加的な実施形態においては、第二温度は、第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下し、好ましくは２℃〜４℃低下し、より好ましくは２．５℃〜３．５℃、最も好ましくは３℃低下する。低下は、少なくとも１℃、２℃、２．５℃、３℃、または４℃、または６℃、５℃、４℃、３．５℃、３℃、２．５℃、または２℃未満でありうる。
【００１６】
他の実施形態においては、第二温度は、２９℃〜３５℃の範囲であり、好ましくは３０℃〜３４℃、より好ましくは３１℃〜３３℃、より好ましくは３１．５℃〜３２．５℃、最も好ましくは３２℃である。第二温度は、２８℃、２９℃、３０℃、または３１℃を上回り、または３５℃、３４℃、３３℃、または３２℃を下回りうる。
【００１７】
この方法は、ウィルス抗原の産生のためにも用いられうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法を提供し、ウィルスが本明細書に記載のように産生され、ウィルスまたはウィルス抗原が単離される。細胞を分解し、または細胞上清を採取した後、抗原を単離することにより単離し、選択的に精製するための標準的方法（例えば遠心分離またはクロマトグラフィ）を用いて、単離が実行されうる。
【００１８】
さらなる実施形態においては、ウィルスが、（例えば国際公開第０５／１１８００号に示される方法に従って）精製の前または後に断片化または不活性化される。さらに、ウィルスのワクチンが調製されうる。ワクチンは、抗原物質の免疫原性組成物であり、抗原物質は、非感染性ウィルス、その外皮、粒子またはその抗原でありうる。ワクチンが投与されると、宿主（例えばヒト等の哺乳類または鳥類）における免疫化が生じる。ワクチン接種はワクチンに対する特異反応および軽微な炎症を引き起こしうるが、一般に、ワクチン接種に対する反応は、完全に成育可能なウィルスによる感染に対する反応と比較して大きく減少される。
【００１９】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、それらは単に例示であり、本発明をいかなる形でも制限するものではない。
【実施例】
【００２０】
多くのウィルス膜タンパク質は、複製能のあるウィルスを産生するために、翻訳後修飾を必要とする。インフルエンザウィルスにおいては、ＨＡ２のアミノ末端領域で融合ドメインを生成する、前駆体ヘマグルチニン（ＨＡ）分子（ＨＡ０）のＨＡ１およびＨＡ２サブユニットへのタンパク質分解的切断が、細胞へのウィルスの侵入のために必須である。したがって、細胞培養における感染サイクルの開始は、プロテアーゼの添加により触媒されねばならない。ワクチン製造プロセスでは、ブタ起源のγ線を照射したトリプシンが使用される。
【００２１】
ベロ細胞等の細胞培養におけるインフルエンザ増殖のための従来の温度プロフィールは、温度が例えば３３℃（Ｂ−菌種）〜３７℃（Ａ−菌種）で一定であるものである。［例えば、Ｇｏｖｏｒｋａｖａ Ｅ Ａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｒ．８，Ａｕｇ．１９９６，ｐ．５５１９−５５２４を参照］。本発明の態様は、１０Ｌバイオリアクターシステムにおけるスモールスケール実験による、最初の感染段階中の温度プロフィールの上昇が、インフルエンザ産生プロセスの全体的サイクル時間にプラスの効果を有しうるという認識である。さらに、ベロタンパク質／ＳＲＤ比として測定される抗原の純度に対するプラスの効果も、得られた。このコンセプトを証明するために、本明細書に記載のように、１００Ｌスケール実験が行われた。
【００２２】
（実施例１）
３２℃および３６℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
３２℃および３６℃でのバイオリアクター運転のベロ培養を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。ｐＨ、ｐＯ２、細胞密度および培養に加えられるトリプシン量の設定パラメータは同等であり、インフルエンザ抗原の製造のためのラージスケール条件を反映した。ウィルス収量およびサイクル時間に対する温度上昇の効果が、表１において比較される。
【００２３】
【表１】
２日後に、３６℃培養で２０％の残留酸素吸収速度が観察され、それは３日目までに５％より下に低下した。３６℃でのインフルエンザウィルスの増殖は、３２℃条件と比較して高い感染性、したがって全培養時間の減少をもたらした。反対に、３２℃培養は、２日目および３日目に、それぞれ８０％および５０％の、より高い残余ＯＵＲを生じた。最終的ＨＡ力価は、同等だった。しかし、ＮａＢｒ勾配を用いた超遠心分離による抗原分離実験から、３６℃条件下で培養３日目に、抗原バンドパターンのシフトが生じ（図１Ｂ）、一方で、ＵＶ２５４ｎｍ検出器により測定された溶出プロフィールは、３２℃培養で同等に高いが、より相称のピークを生じた（図１Ａ）。したがって、産物収量および特に純度に関しては、３６℃条件がいくつかの不都合を有しうる。
【００２４】
本産生プロセスでは、蔗糖密度勾配からウィルス抗原が採取される。したがって、３６℃実験では、抗原の一部が、低密度画分にシフトしていると結論づけられうる（図１Ｂ）。
【００２５】
（実施例２）
３２℃、３３℃、および３４℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
パナマウィルス収量およびサイクル時間に対する培養温度上昇の効果を調査するために、三つの１０Ｌバイオリアクターシステムが同時に、温度をそれぞれ３２℃、３３℃および３４℃に設定して運転された。他の全てのパラメータ設定点は、実施例１の下に記載される実験と同等だった。
【００２６】
表２には、三つのバイオリアクターシステムのプロセスサイクル時間が与えられる。２０％残留酸素吸収速度（代謝性酸素消費の８０％減少）に達した後に培養が終了され、感染サイクルのキネティクスが比較された。３４℃実験では、２１時間のサイクル時間減少が達成できた。
【００２７】
【表２】
培養上清が遠心分離され、標準的プロトコルに従ってＢｅｎｚｏｎａｓｅおよびホルマリンで処理された。不活性化された採取物（ＭＶＨ）が、蔗糖密度勾配超遠心分離により精製された（表３を参照）。
【００２８】
【表３】
表２から、温度条件上昇により、サイクル時間の減少がもたらされたと結論できる。しかし、表３に示すように、温度条件上昇（例えば３３℃および３４℃）は、全体的なウィルス抗原収量および精製ウィルスの品質に負の影響を有することが、ＳＲＤ／タンパク質比率およびベロタンパク質／ＳＲＤ比率の両方により明らかにされた。したがって、より高温で、ウィルス抗原の純度低下が観察された。
【００２９】
（実施例３）
３５℃での初期ウィルス増幅を伴うＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
本実施例は、インフルエンザウィルス産生プロセスの最初の２４時間の温度設定を上昇させた、培養実験に関する。ベロ細胞培養を、１００リットルスケールでＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。
【００３０】
従来の温度プロフィール（すなわち発酵プロセス全体で３２℃の温度設定点）と、初期ウィルス増幅を３５℃とした改変プロセスとの比較が行われた。この新しいプロセスは、感染後（ｐ．ｉ．）２４時間の初期ウィルス複製を３５℃で行った後、ｐ．ｉ．９１時間まで３２℃でインキュベートすることを特徴とする。表４では、１００リットルスケール運転からの、蔗糖密度勾配精製ウィルスの、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度の比較が与えられる。
【００３１】
【表４】
このデータは、発酵プロセスの最初の２４時間を３５℃とする温度設定が、ＳＲＤ／タンパク質比率に対してだけでなく、ベロタンパク質不純度に対してもプラスの効果を有したことをはっきりと示す。同等の感染時間で、不純度プロフィールの大きな改善を伴って、同等の収量が得られた。
【００３２】
（実施例４）
初期ウィルス増幅を３５℃とするＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
二温度プロセスにつき実施例３で観察された反応を確認するために、同じ温度プロフィールを用いて、１００リットルのベロ培養においてＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ウィルスを増殖させた。他の全ての条件およびパラメータは、実施例３にしたがって設定された。
【００３３】
表５において、１００リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロタンパク質不純度が比較される。
【００３４】
【表５】
ウィルス複製の最初の２４時間を３５℃とした後に、３２℃へ温度を低下させた、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ウィルスの産生は、３２℃の一定温度での従来のプロセスを上回るいくつかの利点を有する。一般に、ＳＲＤ／タンパク質およびベロタンパク質／ＳＲＤの比率から明らかなように、インフルエンザウィルス抗原の品質が改善されうる。大幅に減少した感染時間で、収量はやや低いが、特にベロ細胞タンパク質の相対量についての不純度プロフィールは、はるかに優良だった。
【００３５】
インフルエンザウィルス抗原の純度は、インフルエンザワクチンの製造における要因である。ベロ細胞におけるインフルエンザウィルスの複製では、前駆体ヘマグルチニンの切断のためのタンパク質分解条件および適切な温度条件が、重要な要因の一部であることが一般に認められている。本明細書に提示される例示的な実験においては、ウィルス複製の初期段階の間に高い温度を有する温度プロフィールが、蔗糖密度勾配ステップで抗原の改善をもたらすことが示された。さらに、最初の２４時間を３５℃とするインフルエンザウィルスの産生は、サイクル時間に関して、より良好なプロセス性能に対応した。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９およびＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９が、モデル系として用いられて、二温度ウィルス増殖の有用性が証明された。したがって、１０および１００リットルスケールで実行された培養実験からの結果は、ウィルス増殖プロセスの最初の約２４時間を、３２℃から３５℃に変更することによる利益を示す。
【００３６】
（実施例５）
初期ウィルス増幅を３５℃でｐ．ｉ．１８時間対ｐ．ｉ．３６時間行った後、ウィルス増殖終了まで３２℃とする、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５ウィルスで感染させた５０Ｌベロ培養において、抗原収量、ＳＲＤ／タンパク質比率、およびベロタンパク質／ＳＲＩ比率に対する、高温サイクル継続時間の変更による影響を示す。二つの別々の試料で、３５℃の温度を、それぞれｐ．ｉ．１８時間およびｐ．ｉ．３６時間維持した後、温度を３２℃に低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００３７】
表６において、５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロ−タンパク質不純度が、比較される。
【００３８】
【表６】
１８時間およびｐ．ｉ．３６時間それぞれの３５℃での、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５ウィルスの産生は、同等の収量および純度プロフィールを生じた（表６）。これらの結果から、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇継続時間および採取までの温度低下継続時間が広く変動されうると結論できる。
【００３９】
（実施例６）
ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３４℃、３５℃および３６℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３１℃、３２℃および３３℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウィルスで感染させた３２リットル〜８０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる二重温度プロフィールの使用に関する。３４℃、３５℃および３６℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３１℃、３２℃および３３℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００４０】
表７では、３２リットル〜８０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が、異なる温度プロフィールにつき比較される。
【００４１】
【表７】
ｐ．ｉ．１８時間を３４℃〜３６℃とした後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウィルスの産生は、同等収量および純度プロフィールを生じた（表７）。これらの結果から、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇範囲および採取時までの温度低下範囲が広く変動されうると結論できる。
【００４２】
（実施例７）
ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３３．５℃、３５℃および３６．５℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３０．５℃、３２℃および３３．５℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６ウィルスで感染させた３２リットル〜５０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる温度プロフィールの使用に関する。３３．５℃、３５℃および３６．５℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３０．５℃、３２℃および３３．５℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【００４３】
表８において、３２リットル〜５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が比較される。
【００４４】
【表８】
ｐ．ｉ．１８時間を３３．５℃、３５℃および３６．５℃とした後、ウィルス増殖終了までそれぞれ３℃低下させたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６ウィルスの産生は、同等の収量および純度プロフィールを生じた（表８）。高温でのより高い収量は、純度低下ももたらしたが、これらの不純度は、ウィルス増殖終了時に３℃の低下によって比較的低いレベルにとどまる。温度低下（例えば３３．５℃／３０．５℃）を有する二重温度プロフィールにより、同等の収量が達成できるが、これらの同等の収量に達するために、より長いウィルス増殖のサイクル時間（なお７０時間より短い）が必要である。特に宿主細胞特異的ベロタンパク質の、純度プロフィールは、３℃の温度シフトを含む低い温度範囲により、典型的に改善される（３４℃／３１℃でのＢ／マレーシアの表７も参照）。これらの結果から、インフルエンザＡ型およびＢ型菌種の両方で、二重温度プロフィールにおいて、初期ウィルス増殖の間の温度上昇範囲および採取時までの温度低下範囲が広く変動されうると結論できる。
【００４５】
（実施例８）
ロスリバーウィルスの産生
ロスリバーウィルス（「ＲＲＶ」）が、２Ｌリアクターで、異なる温度で産生された。調査温度は、３０時間３７℃、３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降はｐ．ｉ．９０時間の感染終了まで３２℃とした。動力学的パラメータが決定され、試料が以下の時間間隔で集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５４、Ｉ−６６、Ｉ−７６およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料が、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。感染細胞の代謝活性をモニタするために、ウィルス増殖の間に残留酸素吸収速度（ＯＵＲ）が測定された。細胞剥離率が、微粒子担体培養の顕微鏡画像により定量された。ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）も、決定された。
【００４６】
条件は、ｐＨ７．１のＰＢＳおよび２０％ｐＯ２、感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で１．０ｇ／Ｌグルコースが加えられ、灌流が停止された。Ｉ−４２以降は、グルコースが１．０ｇ／Ｌ未満に減少した場合には、グルコースが加えられた。結果が表９に示される。
【００４７】
遠心分離条件：Ｉ−１８： ５０００ｇ
Ｉ−４２〜Ｉ−６６： １００００ｇ
Ｉ−７８〜Ｉ−９０： １５０００ｇ
【００４８】
【表９−１】
【００４９】
【表９−２】
四つ全てのインキュベーションのＮａＢｒプロットが、４つの間隔（Ａ：５４ｈ、Ｂ：６６ｈ、Ｃ：７８ｈ、Ｄ：９０ｈ）で図２〜５に与えられる。
【００５０】
ウェスタンブロットが、以下の抗体で実行された：（１）ＲＲ（ＡＴＣＣＶＲ３７３）、Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｆｌｕｉｄ、Ｍｏｕｓｅ；Ｎ．Ｉ．Ｈ．（１：１０００）、および（２）抗マウスＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃：Ａ−４６５６、Ｌｏｔ＃：６３Ｈ８８３０（１：５０００）。結果は、表１０のとおりに図６に与えられる。
【００５１】
【表１０】
両方の高温接種（３７℃および３５℃）で、感染キネティクスが相当に増加し、細胞剥離率は４２時間後に１００％であり、５３時間後の残留Ｏ２が約５０％であった。より低い温度（３２℃および３５℃／３２℃）でのアプローチは、比較的遅かった。これは、Ｉ−１８での力価分析でも明白である。しかし、Ｉ−４２の後、全てのアプローチが、約１Ｅ０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに達した。より低い温度でのアプローチは、感染終了付近で、より安定した力価を示した（Ｉ−７６まで＞１Ｅ０９ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。Ｉ−７６まで、両方のアプローチにおいて２０％の残留ＯＵＲが測定できた。全ての実験でＩ−５３の後に、ＮａＢｒ勾配において最大ピーク高さに達したが、３５℃接種の全てのＩ−６６試料ならびにＩ−９０で、より低いピークが測定された。温度上昇のために、グルコースレベルが、３７℃および３５℃実験の間に、より速く下落した。感染キネティクスの増加のために、その後は代謝活性が測定できない。全ての実験において、グルコースレベルは最終的に同様だった。
【００５２】
二相温度実験（Ｉ−３０まで３５℃、その後３２℃）の間だけ、開始時の速やかなウィルス増殖、および感染終了までの安定した力価が確立された。これらの条件下では、ＮａＢｒ勾配実験において、Ｉ−７８まで安定した、最大ピークが測定された。ウェスタンブロットでも、３５℃／３２℃実験において、より安定したバンドが検出された。
【００５３】
（実施例９）
西ナイルウィルス実験
２Ｌリアクターにおいて、異なる温度で西ナイルウィルスが産生された。調査温度は、３０時間３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降感染終了まで３２℃とした。９０ｈの動力学的パラメータが、集められた。以下の時間的間隔で試料が集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−３０、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５２、Ｉ−６６、Ｉ−７４およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料は、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。条件は、ｐＨ７．１、２０％ｐＯ２、および感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で、１．０ｇ／Ｌのグルコースが加えられ、灌流が停止された。結果は表１１に与えられ、図７〜９は、ＮａＢｒプロットおよび顕微鏡画像を示す。微粒子担体培養のこれらの顕微鏡画像により、細胞剥離率が定量された。
【００５４】
【表１１−１】
【００５５】
【表１１−２】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスの産生方法であり、前記方法が、
前記ウィルスに感染させた宿主細胞を提供するステップと、
前記感染した宿主細胞を、３１℃〜３７℃の範囲の第一温度で、１〜４８時間培養するステップと、
その後、前記感染した宿主細胞を、前記第一温度より１℃〜６℃低い第二温度で培養するステップと、
前記培養ステップにより生成される前記ウィルスの複製を集めるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ウィルスが、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウィルスが、インフルエンザウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウィルスが、インフルエンザＡ型およびＢ型より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウィルスが、ロスリバーウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ウィルスが、西ナイルウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、動物細胞培養または細胞系統である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、上皮細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、腎臓上皮細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、ベロ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一温度が、３２℃〜３７℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一温度が、３３℃〜３６℃の範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一温度が、３４℃〜３５．５℃の範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二温度が、前記第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二温度が、前記第一温度に対して２℃〜４℃低下される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二温度が、２９℃〜３５℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二温度が、３０℃〜３４℃の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二温度が、３１℃〜３３℃の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、接種後直接培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法であり、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、請求項１により産生されるウィルスから得られ、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、単離される、方法。
【請求項２１】
前記ウィルスが、断片化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウィルスが、不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウィルスのワクチンを調製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一温度での培養が、少なくとも二時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ウィルスの産生方法であり、前記方法が、
前記ウィルスに感染させた宿主細胞を提供するステップと、
前記感染した宿主細胞を、３１℃〜３７℃の範囲の第一温度で、１〜４８時間培養するステップと、
その後、前記感染した宿主細胞を、前記第一温度より１℃〜６℃低い第二温度で培養するステップと、
前記培養ステップにより生成される前記ウィルスの複製を集めるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ウィルスが、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウィルスが、インフルエンザウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウィルスが、インフルエンザＡ型およびＢ型より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウィルスが、ロスリバーウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ウィルスが、西ナイルウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、動物細胞培養または細胞系統である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、上皮細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、腎臓上皮細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、ベロ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一温度が、３２℃〜３７℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一温度が、３３℃〜３６℃の範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一温度が、３４℃〜３５．５℃の範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二温度が、前記第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二温度が、前記第一温度に対して２℃〜４℃低下される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二温度が、２９℃〜３５℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二温度が、３０℃〜３４℃の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二温度が、３１℃〜３３℃の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、接種後直接培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法であり、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、請求項１により産生されるウィルスから得られ、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、単離される、方法。
【請求項２１】
前記ウィルスが、断片化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウィルスが、不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウィルスのワクチンを調製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一温度での培養が、少なくとも二時間である、請求項１に記載の方法。
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５２５７９９（Ｐ２０１０−５２５７９９Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４５７８（Ｐ２０１０−５０４５７８）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３５３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５２３０
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３５３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５２３０
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]