ウイルスの細胞トロピズムの同定
本発明は、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、細胞に進入するために細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスによる細胞の感染の間、マイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡの発現が、細胞へのその進入のためにウイルスにより用いられる細胞共受容体に基づいて特に変更され、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルが調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルの変更が共受容体の使用に特有であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法に関する。
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルが調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルの変更が共受容体の使用に特有であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の細胞トロピズム、特に細胞に侵入するためのＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５受容体を用いるＨＩＶウイルスの能力を特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
細胞におけるＨＩＶウイルスの侵入は、エンベロープタンパク質ｇｐ４１及びｇｐ１２０を含むいくつかのウイルスタンパク質を伴う。ＨＩＶウイルスの複製サイクルの第一のステップは、ｇｐ１２０タンパク質とＣＤ４細胞タンパク質との相互作用による、ウイルスと補助のＴ４リンパ球との結合を伴う。さらに、ウイルスと細胞膜の融合が生じるために、ＨＩＶウイルスは、細胞共受容体と相互作用する必要がある。インビボにおける最も重要な共受容体は、ケモカインの受容体であるＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５である。様々な共受容体の使用は、従って感染への免疫不全症における時間依存的変化に関連する：感染の初期において、いわゆるＲ５ウイルスは、ＣＣＲ５共受容体と相互作用し、その後、後半のステージにおいて、特定のウイルス（いわゆるＸ４ウイルス）は、ＣＸＣＲ４共受容体を使用する。このステージでは、ウイルス集団は、Ｒ５及びＸ４ウイルスの混合物、又は二重Ｒ５／Ｘ４トロピズムを有するウイルスを含む。特定の場合では、ウイルスＲ５は、ＡＩＤＳの出現を直接的に誘導し得、しかしながら、それは、疾患の進行に一般的に関連するＸ４ウイルスの出現である。それ故、患者においてＸ４ウイルスの早期出現を検出することができることは極めて重要である。
【０００３】
従って、ＨＩＶウイルスの細胞トロピズムを決定する目的を有するいくつかの方法が開発されている。
【０００４】
例えば、ＴＲＯＦＩＬＥ試験（ＭＯＮＯＧＲＡＭ）は、Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＰｆｉｚｅｒにより提案されたＨＩＶウイルスの表現型試験である。最初に、患者のＨＩＶウイルスのエンベロープについてコードする領域を含むベクターのライブラリーが合成される。これらのベクターはその後増幅され、エンベロープについてコードする領域は、いずれのエンベロープタンパク質を含まないＨＩＶウイルスを発現し、且つルシフェラーゼの遺伝子を発現するベクターにクローン化される。最終的に、これらのベクターから得られる組み換えウイルスは、ＣＤ４及びＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４を発現する細胞を感染するために用いられる。これらの細胞を感染するウイルス能力は、ルシフェラーゼにより産生される発光を測定することにより、決定される。この試験は、Ａｆｓｓａｐｓ（フランス健康製品安全局）及びＨＡＳ（「Ｈａｕｔｅ Ａｕｔｏｒｉｔｅ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ」、フランス健康高等当局）に対して、ＴＲＴ−５により、２００７年１１月に通知されたように、いくつかの欠点を有する。第一に、それは大変高コストである。さらに、結果を受け取るための時間が４〜５週間であり、それは治療の変化の場合における迅速な意思決定に適合しない。さらに、ウイルストロピズムにおける変化が、そのような時間内で特定の患者に生じ得ることは、不可能なことではない。さらに、プロファイル試験は、ＨＩＶ−２型のウイルスについて利用することができない。
【０００５】
従って、ＨＩＶウイルスの細胞トロピズムの決定を可能にする、単純で、迅速で、信頼でき、且つ安価な代替の試験に対する深刻な要求が存在する。本発明の目的は、そのような試験を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＨＩＶウイルスにより感染した可能性のある細胞におけるｍｉＲＮＡの発現は、細胞に進入するためにＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体に依存して調節されるという、発明者らによる、 予期されない発見に由来する。
【０００７】
従って、本発明は、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、細胞に侵入するために細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより細胞の感染の間、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡの発現が細胞へのその侵入のためにウイルスにより用いられる細胞共受容体に従って特異的に調節され、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルについて調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルについての変更が共受容体の使用に特有であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、ウイルスにより感染した患者において、細胞に侵入するために細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）ウイルスを含み得る患者からのサンプルと、ウイルスの細胞受容体、及びのウイルスの少なくとも一つ細胞共受容体を発現する試験細胞とを接触させること；
ｉｉ）試験細胞において少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉｉ）発現レベルを所定の値と比較すること；
ｉｖ）ウイルスが試験細胞により発現された細胞共受容体を使用するかどうかそれらから推測すること、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５トロピズムを有する初期のＨＩＶ−１単離株、又は２重トロピズム（ｄｕａｌ）を有するウイルスによる感染に応答したｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現を示す。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、４つのＤＵＡＬ単離株（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、ｄｕａｌ ４）、４つのＣＸＣＲ４単離株（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、Ｘ４ ４）、及び３つのＣＣＲ５単離株（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、Ｒ５ ３）で感染された。感染から３日後、細胞は溶解され、ＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８に対するＲＴ−ｑＰＣＲにより分析された。感染した細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染のＪｕｒｋａｔ Ｒ５対照細胞（ＮＩ）の発現により標準化される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細
用語「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」とは、これらの遺伝子の転写から生じるｍＲＮＡの翻訳を分解する又は遮断することにより、ある特定の遺伝子の転写後制御に関与する、一般的に２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡの種類を意味する。ｍｉＲＮＡの「標的ｍＲＮＡ」とは、それについて知られている、又はそれについて分解されることが決定されている、又はそれについて翻訳が前記ｍｉＲＮＡにより遮断される、ｍＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡは、特に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ（（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：Ｄ１５４−Ｄ１５８）、及びｍｉＲＮＡに関するデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）に記述される。
【００１１】
語句「ウイルス」は、本明細書で用いられるように、ウイルスの全ての種類を含む。特に、ウイルスは、それらの変異体又は種がより高い又はより低い病原性であるウイルスの群、例えば、レトロウイルス、特にＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ハシカのウイルス、ヘルペスウイルス（ＥＢＶ、Ｓｉｍｐｌｅｘ、及び/又はＣＭＶウイルスを含む）、パピローマウイルスから選択され得る。好ましくは、ウイルスは、ヒトレトロウイルウイルス、特に、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、及びＸＭＲＶから選択される。さらにより好ましくは、ウイルスは、ＨＩＶ、及び特にＨＩＶ−１、及びＨＩＶ−２ウイルスである(ＨＩＶデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘに特に記述される）。本発明によるウイルスがＨＩＶである場合、感染を実行するために用いられるウイルスは、例えば、ＨＩＶ−１、ＮＬ４．３、ＨＩＶ−２ ＲＯＤ、若しくはＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８ウイルス、又は患者由来のウイルスなどの原型ウイルスでもよい。本発明によるＨＩＶウイルスはまた、標的細胞に侵入するための一つ又は複数の共受容体を用い得る。好ましくは、本発明によるマイクロＲＮＡを同定するための方法において、用いられるＨＩＶウイルスは、細胞に侵入するための共受容体の一つの種類のみを用いる。
【００１２】
用語「患者」とは、ウイルスにより感染したヒトを表す。好ましくは、ウイルスはＨＩＶである。患者は、その結果、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）を発症し得る。場合により、患者は、抗レトロウイルス治療下、例えば、HAART（高活性抗レトロウイルス療法）治療下にある。
【００１３】
本発明による用語「受容体」及び「細胞受容体」とは、ウイルスによる標的細胞の認識に関与し、一般的にこのウイルスと標的細胞との結合をもたらす細胞表層構造、一般的にタンパク質を表す。用語「共受容体」及び「細胞共受容体」は、ウイルスの侵入に関与する全ての細胞表面タンパク質を集合させ、細胞受容体は除外される。
【００１４】
ウイルスがＨＩＶである場合、用語「共受容体」及び「細胞共受容体」は、より具体的には、ウイルスと細胞受容体ＣＤ４との相互作用に加えて、ウイルスの侵入に関与する全ての細胞表面タンパク質を集める。宿主細胞におけるＨＩＶウイルスの侵入は、細胞とウイルス膜との融合を含む。特に、共受容体は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択され得る。好ましくは、共受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４である。
【００１５】
ＣＸＣＲ４はまた、Ｆｕｓｉｎ、ＬＥＳＴＲ、及びＮＰＹ３Ｒの名称で知られている。ＣＸＣＲ４遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子の配列をここで選択的に指定する。遺伝子ＣＸＣＲ４は、配列番号２により表される配列を有し得るＣＸＣＲ４タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１６】
ＣＣＲ５はまた、ＣＫＲ−５、及びＣＭＫＲＢ５の名称で知られている。遺伝子ＣＣＲ５は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ５遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ５遺伝子は、配列番号４により表される配列を有し得るＣＣＲ５タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１７】
ＣＣＲ３はまた、ＣＣ−ＣＫＲ−３、ＣＫＲ−３、及びＣＭＫＢＲ３の名称で知られている。ＣＣＲ３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ３遺伝子は、配列番号６により表される配列を有し得るＣＣＲ３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１８】
ＣＣＲ２はまた、ＣＣＲ２ｂ、及びＣＭＫＢＲ２の名称で知られている。ＣＣＲ２遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ２遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ２遺伝子は、配列番号８により表される配列を有し得るＣＣＲ２タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１９】
ＣＣＲ１はまた、ＣＫＲ１、及びＣＭＫＢＲ１の名称で知られている。ＣＣＲ１遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ１遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ１遺伝子は、配列番号１０により表される配列を有し得るＣＣＲ１タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２０】
ＣＣＲ４はまた、ＣＫＲ−４の名称で知られている。ＣＣＲ４遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ４遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ４遺伝子は、配列番号１２により表される配列を有し得るＣＣＲ４タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２１】
ＣＣＲ８はまた、ＣｈｅｍＲ１、ＴＥＲ１、及びＣＭＫＢＲ８の名称で知られている。ＣＣＲ８遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ８遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ８遺伝子は、配列番号１４により表される配列を有し得るＣＣＲ８タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２２】
ＣＣＲ９はまた、Ｄ６の名称で知られている。ＣＣＲ９遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ９遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ９遺伝子は、配列番号１６により表される配列を有し得るＣＣＲ９タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２３】
ＣＸＣＲ２はまた、ＩＬ−８ＲＢの名称で知られている。ＣＸＣＲ２遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＸＣＲ２遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＸＣＲ２遺伝子は、配列番号１８により表される配列を有し得るＣＸＣＲ２タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２４】
ＳＴＲＬ３３はまた、Ｂｏｎｚｏ、ＣＸＣＲ６、及びＴＹＭＳＴＲの名称で知られている。ＳＴＲＬ３３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＳＴＲＬ３３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＳＴＲＬ３３遺伝子は、配列番号２０により表される配列を有し得るＳＴＲＬ３３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２５】
Ｖ２８はまた、ＣＭＫＢＲＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、及びＧＰＲ１３の名称で知られている。Ｖ２８遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＶ２８遺伝子の配列をここで選択的に指定する。Ｖ２８遺伝子は、配列番号２２により表される配列を有し得るＶ２８タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２６】
ｇｐｒ１又はＧＰＲ１遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトｇｐｒ１遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ｇｐｒ１遺伝子は、配列番号２４により表される配列を有し得るｇｐｒ１タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２７】
ｇｐｒ１５又はＧＰＲ１５はまた、ＢＯＢの名称で知られている。ｇｐｒ１５遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトｇｐｒ１５遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ｇｐｒ１５遺伝子は、配列番号２６により表される配列を有し得るｇｐｒ１５タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２８】
Ａｐｊはアンジオテンシン受容体様アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）及びＡＧＴＲＬ１の名称で知られている。Ａｐｊ遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＡｐｊ遺伝子の配列をここで選択的に指定する。Ａｐｊ遺伝子は、配列番号２８により表される配列を有し得るＡｐｊタンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２９】
ＣｈｅｍＲ２３はまた、ＣＭＫＬＲ１、及びＤＥＺの名称で知られている。ＣｈｅｍＲ２３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣｈｅｍＲ２３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣｈｅｍＲ２３遺伝子は、配列番号３０により表される配列を有し得るＣｈｅｍＲ２３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００３０】
本発明に従って、「試験細胞」は、本発明に従ってウイルスにより感染され得る任意の細胞を意味する。好ましくは、ウイルスがＨＩＶである場合、本発明による試験細胞は、上記で定義されたように、ＨＩＶウイルスのＣＤ４、第一の及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する。さらに好ましくは、本発明による試験細胞は、ＣＸＣＲ４、及びＣＣＲ５を発現する。本発明による試験細胞は、これらの受容体を自然に発現し得、またはこれらの受容体を発現するために、遺伝子的に操作され得る。本発明による試験細胞は、例えば、樹枝状細胞、リンパ球系由来の細胞（好ましくは、Ｔリンパ球）、又は骨髄系（好ましくは、マクロファージ）、上皮細胞、又は線維芽細胞でもよい。好ましくは、本発明による試験細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）１９（５）：６２１−６に特に記述される）、例えば、細胞クローンＪｕｒｋａｔ Ｅ６−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＴＩＢ−１５２）、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（Ａｌｋｈａｔｉｂ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９５５−１９５８ ａｎｄ ｔｈｅ ＡＩＤＳ ｒｅａｇｅｎｔ ＮＩＢＳＣ，ＵＫに特に記述される）からなる群から選択される。よりさらに好ましくは、本発明による試験細胞は、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞である。
【００３１】
本発明によるＨＩＶウイルスを用いて試験細胞を感染させることを可能にする技術は、当業者によく知られており、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０（４５９９）：８６８−７１）に特に記述される。
【００３２】
試験細胞におけるマイクロＲＮＡ発現レベル又は標的ｍＲＮＡ発現レベルは、当業者に知られている任意の技術により測定され得る。ＲＮＡの定量を可能にする多くの方法、例えば、ＲＮＡ配列の特異的なオリゴヌクレオチドを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に基づく方法、又はこれらのＲＮＡ、二倍又は三倍のこれらのＲＮＡと、プローブとのハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で許容する方法は知られている。標的ｍＲＮＡの発現レベルが測定された場合、それは、ＲＴ−ＰＣＲを行うこと、又は全てのｍＲＮＡの逆転写を可能にするシングルプローブを用いた特異的なｃＤＮＡチップを作ることを可能にする。本発明によるプローブは、好ましくは、マイクロアレイに配置される。ストリンジェントな条件は、当業者により容易に決定され得る。例えば、本発明によるストリンジェントな条件は、１０〜２０時間、好ましくは１６時間、４０〜５０℃、好ましくは５０℃の温度で、５００ｍＭ〜２ＭのＮａＣｌ、好ましくは１ＭのＮａＣｌの濃度により誘導されるのと同等のイオン強度の存在下でのハイブリダイゼーションステップを含み得る。他の生成物はまた、バッファ溶液、例えばＴｒｉｓ又はＭＥＳ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ、及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）として添加され得る。
【００３３】
第一の共受容体を用いる第一のウイルス、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスでそれぞれ感染された試験細胞におけるマイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡのそれによって測定された発現レベルは、未感染の細胞と比較してそれぞれのウイルスでの感染の間、その発現が調節されるマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡの同定を、可能にし得る。それぞれのウイルスでの感染の間、その発現が調節されるマイクロＲＮＡ及びそれらの標的ｍＲＮＡの同定は、ｍｉＲＮＡ又はそれらの標的ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較することにより達成され得、それぞれのウイルスでの感染後、未感染細胞における前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現レベルと共に測定され得る。好ましくは、マイクロＲＮＡ又はそれの標的ｍＲＮＡは、ウイルスでの試験細胞の感染の間、調節された発現を有すると考えられるため、この発現は、未感染の試験細胞における発現と比較して、それぞれ０．５超、又は０．５未満のｌｏｇ２の割合（感染した細胞における前記ｍｉＲＮＡの発現／未感染の細胞における前記ｍｉＲＮＡの発現）で増加又は減少する。
【００３４】
それぞれのウイルスでの感染の間、調節される発現を有するとして同定されたマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡは、従って、その発現がウイルスによる共受容体の使用により特異的に調節されるｍｉＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを選択するために、比較され得る。
【００３５】
本発明による「共受容体の使用の特異的な発現レベルの調節」とは、ウイルスにより用いられる共受容体の同定を可能にするのに十分な発現の調節、増加、又は減少を意味する。
【００３６】
「未感染の試験細胞」又は「患者由来のウイルスにより未感染の細胞」とは、本発明による方法において、その細胞共受容体が、試験細胞により提示されるが、試験細胞に侵入するためにウイルスにより用いられる第一の共受容体又は少なくとも一つの他の共受容体とは異なる、ウイルスと何らの接触をさせられていないが、ウイルス、特にレトロウイルスにより感染された細胞を意味する。例えば、このウイルスは、ＶＳＶ型又はＰＦＶ−１ウイルスの両種性エンベロープによる偽型化したＨＩＶウイルスでもよい。
【００３７】
例えば、未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるｍｉＲＮＡ又はその標的ｍＲＮＡの発現と比較して、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５を発現する）におけるＣＸＣＲ４共受容体を用いる第一のＨＩＶウイルスでの感染の間、ｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現が増加する場合、その上未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現と比較して、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるＣＣＲ共受容体を用いる第二のＨＩＶウイルスでの感染の間、ｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現が増加しない場合、その結果、前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現は、ＨＩＶウイルスによるＣＸＣＲ４受容体の使用に特異的である。
【００３８】
本発明はまた、細胞に進入するための受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスによる細胞の感染の間、その発現が、細胞へのその進入のために用いられるウイルスにより用いられる細胞共受容体に応じて特に変更される、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞中のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）このようにして決定されたマイクロＲＮＡの発現レベルを比較すること；
ｉｉｉ）その発現レベルについての変更が共受容体の使用に特異的であるマイクロＲＮＡを同定すること、
を含む、方法に関する。
【００３９】
第一の共受容体を用いるウイルス、及び別の共受容体を用いる他のウイルスによるそれぞれの感染後、試験細胞中のマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡのそれに関して測定された発現レベルは、その後、互いに直接的に比較され得る。この比較は、その後、それの発現についての変更が、ウイルスによる第一の共受容体、又は少なくとも一つの他の共受容体の使用に特異的である、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定することが可能である。
【００４０】
本発明による方法はまた、その発現レベルについての変更が、細胞に侵入するためのウイルスによる共受容体の使用に特異的である、そのようにして同定された、特徴的なマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを同定することを可能にするさらなるステップを含み得る。ｍｉＲＮＡの標的は、データベース、特にｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／、及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２に特に記述される）、及びＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／、及びＬｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２０：１５−２０、Ｇｒｉｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２７：９１−１０５、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：９２−１０５に特に記述される）で確認され得る。
【００４１】
語句「ＨＩＶウイルスを含み得る患者由来のサンプル」は、ウイルスを含み得る、患者由来の全ての生物学的液体、又は組織、例えば、末梢血、生殖器粘膜、リンパ系組織、脳脊髄液、胎盤、又は母乳を含む。サンプルは、試験細胞と直接接触し得る。好ましくは、ウイルスは、宿主細胞と接触前に、サンプルから抽出される。例えば、患者のウイルスは、生物学的サンプルからの第一の単離体由来であり得、当業者により知られている任意の方法により得ることができ、例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ（（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０（４５９９）：８６８−７１により記述される技術に特に従って、ＨＩＶウイルスの単離は、ＨＩＶで感染された患者由来のリンパ球と、ＨＩＶについて血清反応陰性ドナーのリンパ球との共培養により実行され得る。ＨＩＶウイルスにより感染された患者の末梢血はまた、（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２１１０−４により特に記述されるように）細胞から血漿を分離するために処理され得る。
【００４２】
患者において細胞に侵入するための細胞受容体及び少なくとも一つの共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するための方法を適用するために、少なくとも一つのｍｉＲＮＡ、及び/又は少なくとも一つのこのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡは、測定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、共受容体のウイルスによる使用に特異的な発現レベルの変更を有するとして同定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、本発明による方法により同定される。
【００４３】
特に、本発明による患者においてウイルスを同定するための方法は、ＣＸＣＲ４及び／又はＣＣＲ５を用いるウイルスを同定するために用いられ得る。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び／又はその標的ｍＲＮＡは、その結果、ＣＸＣＲ４、及び／又はＣＣＲ５受容体のＨＩＶウイルスによる使用に特異的な発現レベルの変更を有するとして同定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、本発明によるｍｉＲＮＡを同定するための方法により同定される。
【００４４】
好ましくは、本発明による方法は、患者におけるＣＸＣＲ４共受容体を用いるウイルスの存在又は不在を同定するために適用される。本発明による方法はまた、ＣＸＣＲ４受容体を用いるウイルスの出現を同定するために、及び従って、患者における疾患の進行を観察するために、時間をかけて様々な期間において、サンプルされた同じ患者に由来するサンプルに関して数回実行され得る。
【００４５】
所定の値は、単一の値、例えば、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現レベル、又は発現レベルの平均でもよい。
【００４６】
例えば、所定の共受容体を用いるウイルスを同定するために、所定の値は、この受容体を発現し、細胞に侵入するためにこの共受容体を用いることについて知られている参照ウイルスで感染された細胞中における所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値であってもよい。例えば、患者において、ＣＸＣＲ４及び／又はＣＣＲ５を用いるウイルスを同定するために、所定の値は、細胞に侵入するために、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を用いる参照ＨＩＶウイルスでの感染後、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を発現する細胞における、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値であってもよい。
【００４７】
得られる発現レベルと所定の値との比較は、試験されるウイルスが、細胞に侵入するための参照ウイルスと同じ共受容体を用いるかどうかを決定することを可能にする。例えば、得られる値が所定の値に近い場合、試験されるウイルスにより用いられる共受容体が、細胞に侵入するための参照ウイルスにより用いられるそれと同一であることを推測することが可能である。近い値とは、好ましくは、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％、さらにより好ましくは、５％未満より離れていない値を意味する。
【００４８】
参照値はまた、例えば、未感染の細胞、従って、患者のウイルスによる感染の不在における、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値でもよい。好ましくは、未感染の細胞における発現と比較して、所定の共受容体を用いる参照ウイルスでの細胞の感染後、前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現は、特に、調節され、増加し、又は減少することが、事前に示される。あらかじめ決められたそれと同じ性質をもつｍｉＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現値の増加又は減少は、従って、ウイルスによる同じ共受容体の使用を示す。同じ性質の増加した又は減少した発現とは、好ましくは、同じ兆候（それぞれ、陰性又は陽性）の、ｌｏｇ２の割合（感染した細胞における前記ｍｉＲＮＡ及び/又は標的ｍＲＮＡの発現／未感染の細胞における前記ｍｉＲＮＡ及び/又は標的ｍＲＮＡの発現）の値を意味する。本発明による感染した患者のウイルスにより用いられる共受容体を同定するための方法における、発現レベルと所定の値（ｉｉｉ）とを比較するためのステップは、少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡが、未感染の試験細胞における少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルと比較して、増加又は減少するかどうかを測定することにより、その結果、選択的に適用される。
【００４９】
例えば、未感染の細胞において、それの発現についてが共受容体ＣＸＣＲ４を用いる参照ＨＩＶウイルスにより特異的に調節（増加又は減少）されるとして示される、一つ又は複数のマイクロＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現の測定は、患者由来のウイルスによる感染後の細胞において、前記マイクロＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現の測定と比較され得る。所定のマイクロＲＮＡの所定の調節がない場合、この試験は、ＣＸＣＲ４が患者由来のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体ではないことが確認される。反対に、所定の調節（増加又は減少）が観察された場合、試験は、ＣＸＣＲ４が患者のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることが確認され、それは、そのようなウイルスは、例えば、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を用い得る、二重トロピズムを有するウイルスであってもよいことは指摘され得る。
【００５０】
その発現が測定されるｍｉＲＮＡは、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ（特に、配列番号３１、ｕｇａｇｕｇｕｇｕｇｕｇｕｇｕｇａｇｕｇｕｇｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３（特に、配列番号３２、ａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇａｃｃｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*（特に、配列番号３３、ａｇｇｇａｇｇｇａｃｇｇｇｇｇｃｕｇｕｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５（特に、配列番号３４、ｇａｇｃｃａｇｕｕｇｇａｃａｇｇａｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８（特に配列番号３５、ａｇｇｇａｕｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｕｇｇｃｇｇｃｃｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（特に配列番号３６、ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕ）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（特に配列番号３７、ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ（特に配列番号３８、ｕｇｕａａａｃａｕｃｃｕｃｇａｃｕｇｇａａｇ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ（特に配列番号３９、ｕｃａｇｕｇｃａｃｕａｃａｇａａｃｕｕｕｇｕ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*（特に配列番号４０、ａｕａａａｇｃｕａｇａｕａａｃｃｇａａａｇｕ）からなる群から選択され得る。好ましくは、その発現について測定されるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８である。
【００５１】
その発現について測定されるｍｉＲＮＡはまた、配列番号３１〜４０の配列の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び配列番号３１〜４０の配列のｍｉＲＮＡ由来であり、特に同じ標的ｍＲＮＡの発現を調節する同じ機能を充足する他の種において存在するオーソログ配列であってもよい。例えば、これらのｍｉＲＮＡは、核酸の一つ又はいくつかの変異による配列番号３１〜４０の配列のｍｉＲＮＡ由来であってもよい。
【００５２】
その発現について測定されるｍＲＮＡは、例えば、配列番号３１〜４０のｍｉＲＮＡ、又はそれら由来のｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡからなる群から選択されてもよい。特に、標的ｍＲＮＡは、上述のようなデータベースに同定され得る。
【００５３】
例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現の増加、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少は、ＣＸＣＲ４が患者のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることを示す。反対に、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現の増加がないこと、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少がないことは、ＣＸＣＲ４が患者のウイルスにより用いられる共受容体ではないことを示す。
【実施例】
【００５４】
材料及び方法
ウイルス及び細胞株
この研究に用いられるウイルスは、共受容体ＣＸＣＲ４を双方ともに用いる原型ＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤウイルス、共受容体ＣＣＲ５を用いるＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８ウイルス、並びにＣＸＣＲ４共受容体を用いる（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４と称される４つの単離株）、ＣＣＲ５共受容体を用いる（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３と称される３つの単離株）、又はＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の双方の共受容体を用い得る（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４と称される４つの単離株）第一の単離株由来のウイルス、並びにその侵入のためにＣＤ４、又はＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５も用いない別のレトロウイルスＰＦＶ−１である。
【００５５】
Ｊｕｒｋａｔ、及び安定した方法でＣＣＲ５を発現するＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞株は、用いられる。
【００５６】
感染
−原型ウイルスでの感染
Ｊｕｒｋａｔ、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、感染多様性に関する調節を考慮するために、感染用量のＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、ＨＩＶ−２ ＲＯＤで、３日間感染された。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８、又はＰＦＶ−１で３日間感染された。
【００５７】
−初期の単離株由来のウイルスでの感染
Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４、Ｒ５ １、Ｒ５ ２、Ｒ５ ３、ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、又はｄｕａｌ ４ウイルスで、３日間感染された。未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、対照（ＮＩ）として用いられる。
【００５８】
マイクロＲＮＡの発現の分析
−マイクロＲＮＡチップごとの分析
原型ウイルスでの感染の３日後、ＲＮＡは、抽出され、マイクロＲＮＡチップ（ＬＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による分析に供される。
【００５９】
−ＲＴ−ＰＣＲによるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現の分析
初期の単離株由来のウイルスによる感染の３日後、細胞は溶解され、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析される。感染した細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５対照細胞（ＮＩ）におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現に対して相対的に標準化される。
【００６０】
結果
実施例１：マイクロＲＮＡの同定
共受容体ＣＸＣＲ４を双方共に用いる原型ウイルスＨＩＶ−１ ＮＬ４．３及びＨＩＶ−２ ＲＯＤにより誘導されたマイクロＲＮＡの発現の調節が、研究された。個人間のバリエーションを制限するために、及び個別の遺伝的背景（及び従ってマイクロＲＮＡの比較可能なリスト）を用いて実施するために、これらの調節は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＣＣＲ５を発現するＪｕｒｋａｔ株の感染の間、双方ともに研究された。感染の３日が、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＲＮＡは抽出され、マイクロＲＮＡチップでの分析に供される。表１は、ＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤの双方により調節されるマイクロＲＮＡのサブ集団を示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１。１ 及び１００ ＴＣＩＤ５０における、Ｊｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞のＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤでの感染の間誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６３】
ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８での（Ｒ５トロピズムを有する、表２）、及びその侵入のために、ＣＤ４、又はＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５を用いない対照レトロウイルスＰＦＶ−１でのＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞の感染はまた、マイクロＲＮＡの発現の調節を引き起こす。
【００６４】
【表２】
【００６５】
表２。ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８での感染の間、誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６６】
これらの表を比較することにより、９つのマイクロＲＮＡの発現がＨＩＶ及びそのトロピズムの独立した感染の間、体系的に減少することが見られ得る（表３）。これらのマイクロＲＮＡの発現は、ＰＦＶ−１での感染により影響を受けない。
【００６７】
【表３】
【００６８】
表３。ＮＬ４．３、ＲＯＤ、及びＮＬＡＤ８での感染の間、誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６９】
さらに、５つのマイクロＲＮＡの発現は、ＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間増加するが、ＮＬＡＤ８での感染の間減少する。最終的に、４つのマイクロＲＮＡの発現は、ＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間特に減少するが、ＮＬＡＤ８での感染の間減少しない（表４）。特にＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間、その発現が増加又は減少するマイクロＲＮＡは、ＰＦＶ−１での感染の間、影響を受けない。
【００７０】
【表４】
【００７１】
表４。ＮＬ４．３、及びＲＯＤでの感染の間、特異的に誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節（増加、感染の間その発現が増加するマイクロＲＮＡ、減少、感染の間その発現が減少するマイクロＲＮＡ）。
【００７２】
これらの結果は、ウイルスの侵入により誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの調節の重要性を説明する。これらの分析はまた、マイクロＲＮＡの細胞リストにおける変化に基づくＨＩＶによる特定の種類の共受容体（ここではＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５）の使用を区別するための発明による方法に起因して、可能性を示す。
【００７３】
実施例２：
それによって得られた結果を実証するために、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（受容体ＣＸＣＲ４、及び受容体ＣＣＲ５の双方を発現する）は、共受容体ＣＸＣＲ４を用いる（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４）、共受容体ＣＣＲ５を用いる（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３）、又は共受容体ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の双方を用い得る（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４）初期の単離株に由来するウイルスで感染させる。
【００７４】
感染した又は未感染（ＮＩ、対照）の細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、３日後に測定される。予期され、図１に示される様に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染の細胞において変更されなかった。この発現は、細胞に侵入するための共受容体としてＣＣＲ５のみを用いるウイルス（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３）で感染された細胞において、もはや変更されない（図１）。他方で、この発現は、細胞に侵入するためにＣＸＣＲ４共受容体を用いることのできるウイルス（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、Ｘ４ ４、ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４）で感染された細胞において、著しく増加する（図１）。
【００７５】
これらの結果は、ＣＸＣＲ４共受容体に関与する感染のみが、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現の減少を誘導することを示す。
【００７６】
これらの結果は、それ故、実施例１で得られるデータを支持し、必要であれば、感染した細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルが、この細胞を感染するためのウイルスにより用いられる共受容体の決定を可能にすることを証明し、それ故、このウイルスのトロピズムの同定を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の細胞トロピズム、特に細胞に侵入するためのＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５受容体を用いるＨＩＶウイルスの能力を特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
細胞におけるＨＩＶウイルスの侵入は、エンベロープタンパク質ｇｐ４１及びｇｐ１２０を含むいくつかのウイルスタンパク質を伴う。ＨＩＶウイルスの複製サイクルの第一のステップは、ｇｐ１２０タンパク質とＣＤ４細胞タンパク質との相互作用による、ウイルスと補助のＴ４リンパ球との結合を伴う。さらに、ウイルスと細胞膜の融合が生じるために、ＨＩＶウイルスは、細胞共受容体と相互作用する必要がある。インビボにおける最も重要な共受容体は、ケモカインの受容体であるＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５である。様々な共受容体の使用は、従って感染への免疫不全症における時間依存的変化に関連する：感染の初期において、いわゆるＲ５ウイルスは、ＣＣＲ５共受容体と相互作用し、その後、後半のステージにおいて、特定のウイルス（いわゆるＸ４ウイルス）は、ＣＸＣＲ４共受容体を使用する。このステージでは、ウイルス集団は、Ｒ５及びＸ４ウイルスの混合物、又は二重Ｒ５／Ｘ４トロピズムを有するウイルスを含む。特定の場合では、ウイルスＲ５は、ＡＩＤＳの出現を直接的に誘導し得、しかしながら、それは、疾患の進行に一般的に関連するＸ４ウイルスの出現である。それ故、患者においてＸ４ウイルスの早期出現を検出することができることは極めて重要である。
【０００３】
従って、ＨＩＶウイルスの細胞トロピズムを決定する目的を有するいくつかの方法が開発されている。
【０００４】
例えば、ＴＲＯＦＩＬＥ試験（ＭＯＮＯＧＲＡＭ）は、Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＰｆｉｚｅｒにより提案されたＨＩＶウイルスの表現型試験である。最初に、患者のＨＩＶウイルスのエンベロープについてコードする領域を含むベクターのライブラリーが合成される。これらのベクターはその後増幅され、エンベロープについてコードする領域は、いずれのエンベロープタンパク質を含まないＨＩＶウイルスを発現し、且つルシフェラーゼの遺伝子を発現するベクターにクローン化される。最終的に、これらのベクターから得られる組み換えウイルスは、ＣＤ４及びＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４を発現する細胞を感染するために用いられる。これらの細胞を感染するウイルス能力は、ルシフェラーゼにより産生される発光を測定することにより、決定される。この試験は、Ａｆｓｓａｐｓ（フランス健康製品安全局）及びＨＡＳ（「Ｈａｕｔｅ Ａｕｔｏｒｉｔｅ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ」、フランス健康高等当局）に対して、ＴＲＴ−５により、２００７年１１月に通知されたように、いくつかの欠点を有する。第一に、それは大変高コストである。さらに、結果を受け取るための時間が４〜５週間であり、それは治療の変化の場合における迅速な意思決定に適合しない。さらに、ウイルストロピズムにおける変化が、そのような時間内で特定の患者に生じ得ることは、不可能なことではない。さらに、プロファイル試験は、ＨＩＶ−２型のウイルスについて利用することができない。
【０００５】
従って、ＨＩＶウイルスの細胞トロピズムの決定を可能にする、単純で、迅速で、信頼でき、且つ安価な代替の試験に対する深刻な要求が存在する。本発明の目的は、そのような試験を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＨＩＶウイルスにより感染した可能性のある細胞におけるｍｉＲＮＡの発現は、細胞に進入するためにＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体に依存して調節されるという、発明者らによる、 予期されない発見に由来する。
【０００７】
従って、本発明は、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、細胞に侵入するために細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより細胞の感染の間、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡの発現が細胞へのその侵入のためにウイルスにより用いられる細胞共受容体に従って特異的に調節され、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルについて調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルについての変更が共受容体の使用に特有であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、ウイルスにより感染した患者において、細胞に侵入するために細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）ウイルスを含み得る患者からのサンプルと、ウイルスの細胞受容体、及びのウイルスの少なくとも一つ細胞共受容体を発現する試験細胞とを接触させること；
ｉｉ）試験細胞において少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉｉ）発現レベルを所定の値と比較すること；
ｉｖ）ウイルスが試験細胞により発現された細胞共受容体を使用するかどうかそれらから推測すること、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５トロピズムを有する初期のＨＩＶ−１単離株、又は２重トロピズム（ｄｕａｌ）を有するウイルスによる感染に応答したｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現を示す。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、４つのＤＵＡＬ単離株（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、ｄｕａｌ ４）、４つのＣＸＣＲ４単離株（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、Ｘ４ ４）、及び３つのＣＣＲ５単離株（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、Ｒ５ ３）で感染された。感染から３日後、細胞は溶解され、ＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８に対するＲＴ−ｑＰＣＲにより分析された。感染した細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染のＪｕｒｋａｔ Ｒ５対照細胞（ＮＩ）の発現により標準化される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細
用語「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」とは、これらの遺伝子の転写から生じるｍＲＮＡの翻訳を分解する又は遮断することにより、ある特定の遺伝子の転写後制御に関与する、一般的に２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡの種類を意味する。ｍｉＲＮＡの「標的ｍＲＮＡ」とは、それについて知られている、又はそれについて分解されることが決定されている、又はそれについて翻訳が前記ｍｉＲＮＡにより遮断される、ｍＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡは、特に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ（（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：Ｄ１５４−Ｄ１５８）、及びｍｉＲＮＡに関するデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）に記述される。
【００１１】
語句「ウイルス」は、本明細書で用いられるように、ウイルスの全ての種類を含む。特に、ウイルスは、それらの変異体又は種がより高い又はより低い病原性であるウイルスの群、例えば、レトロウイルス、特にＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ハシカのウイルス、ヘルペスウイルス（ＥＢＶ、Ｓｉｍｐｌｅｘ、及び/又はＣＭＶウイルスを含む）、パピローマウイルスから選択され得る。好ましくは、ウイルスは、ヒトレトロウイルウイルス、特に、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、及びＸＭＲＶから選択される。さらにより好ましくは、ウイルスは、ＨＩＶ、及び特にＨＩＶ−１、及びＨＩＶ−２ウイルスである(ＨＩＶデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘに特に記述される）。本発明によるウイルスがＨＩＶである場合、感染を実行するために用いられるウイルスは、例えば、ＨＩＶ−１、ＮＬ４．３、ＨＩＶ−２ ＲＯＤ、若しくはＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８ウイルス、又は患者由来のウイルスなどの原型ウイルスでもよい。本発明によるＨＩＶウイルスはまた、標的細胞に侵入するための一つ又は複数の共受容体を用い得る。好ましくは、本発明によるマイクロＲＮＡを同定するための方法において、用いられるＨＩＶウイルスは、細胞に侵入するための共受容体の一つの種類のみを用いる。
【００１２】
用語「患者」とは、ウイルスにより感染したヒトを表す。好ましくは、ウイルスはＨＩＶである。患者は、その結果、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）を発症し得る。場合により、患者は、抗レトロウイルス治療下、例えば、HAART（高活性抗レトロウイルス療法）治療下にある。
【００１３】
本発明による用語「受容体」及び「細胞受容体」とは、ウイルスによる標的細胞の認識に関与し、一般的にこのウイルスと標的細胞との結合をもたらす細胞表層構造、一般的にタンパク質を表す。用語「共受容体」及び「細胞共受容体」は、ウイルスの侵入に関与する全ての細胞表面タンパク質を集合させ、細胞受容体は除外される。
【００１４】
ウイルスがＨＩＶである場合、用語「共受容体」及び「細胞共受容体」は、より具体的には、ウイルスと細胞受容体ＣＤ４との相互作用に加えて、ウイルスの侵入に関与する全ての細胞表面タンパク質を集める。宿主細胞におけるＨＩＶウイルスの侵入は、細胞とウイルス膜との融合を含む。特に、共受容体は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択され得る。好ましくは、共受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４である。
【００１５】
ＣＸＣＲ４はまた、Ｆｕｓｉｎ、ＬＥＳＴＲ、及びＮＰＹ３Ｒの名称で知られている。ＣＸＣＲ４遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子の配列をここで選択的に指定する。遺伝子ＣＸＣＲ４は、配列番号２により表される配列を有し得るＣＸＣＲ４タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１６】
ＣＣＲ５はまた、ＣＫＲ−５、及びＣＭＫＲＢ５の名称で知られている。遺伝子ＣＣＲ５は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ５遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ５遺伝子は、配列番号４により表される配列を有し得るＣＣＲ５タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１７】
ＣＣＲ３はまた、ＣＣ−ＣＫＲ−３、ＣＫＲ−３、及びＣＭＫＢＲ３の名称で知られている。ＣＣＲ３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ３遺伝子は、配列番号６により表される配列を有し得るＣＣＲ３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１８】
ＣＣＲ２はまた、ＣＣＲ２ｂ、及びＣＭＫＢＲ２の名称で知られている。ＣＣＲ２遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ２遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ２遺伝子は、配列番号８により表される配列を有し得るＣＣＲ２タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００１９】
ＣＣＲ１はまた、ＣＫＲ１、及びＣＭＫＢＲ１の名称で知られている。ＣＣＲ１遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ１遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ１遺伝子は、配列番号１０により表される配列を有し得るＣＣＲ１タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２０】
ＣＣＲ４はまた、ＣＫＲ−４の名称で知られている。ＣＣＲ４遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ４遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ４遺伝子は、配列番号１２により表される配列を有し得るＣＣＲ４タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２１】
ＣＣＲ８はまた、ＣｈｅｍＲ１、ＴＥＲ１、及びＣＭＫＢＲ８の名称で知られている。ＣＣＲ８遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ８遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ８遺伝子は、配列番号１４により表される配列を有し得るＣＣＲ８タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２２】
ＣＣＲ９はまた、Ｄ６の名称で知られている。ＣＣＲ９遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＣＲ９遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＣＲ９遺伝子は、配列番号１６により表される配列を有し得るＣＣＲ９タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２３】
ＣＸＣＲ２はまた、ＩＬ−８ＲＢの名称で知られている。ＣＸＣＲ２遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣＸＣＲ２遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣＸＣＲ２遺伝子は、配列番号１８により表される配列を有し得るＣＸＣＲ２タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２４】
ＳＴＲＬ３３はまた、Ｂｏｎｚｏ、ＣＸＣＲ６、及びＴＹＭＳＴＲの名称で知られている。ＳＴＲＬ３３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号１９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＳＴＲＬ３３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＳＴＲＬ３３遺伝子は、配列番号２０により表される配列を有し得るＳＴＲＬ３３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２５】
Ｖ２８はまた、ＣＭＫＢＲＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、及びＧＰＲ１３の名称で知られている。Ｖ２８遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２１、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＶ２８遺伝子の配列をここで選択的に指定する。Ｖ２８遺伝子は、配列番号２２により表される配列を有し得るＶ２８タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２６】
ｇｐｒ１又はＧＰＲ１遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２３、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトｇｐｒ１遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ｇｐｒ１遺伝子は、配列番号２４により表される配列を有し得るｇｐｒ１タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２７】
ｇｐｒ１５又はＧＰＲ１５はまた、ＢＯＢの名称で知られている。ｇｐｒ１５遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２５、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトｇｐｒ１５遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ｇｐｒ１５遺伝子は、配列番号２６により表される配列を有し得るｇｐｒ１５タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２８】
Ａｐｊはアンジオテンシン受容体様アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）及びＡＧＴＲＬ１の名称で知られている。Ａｐｊ遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２７、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＡｐｊ遺伝子の配列をここで選択的に指定する。Ａｐｊ遺伝子は、配列番号２８により表される配列を有し得るＡｐｊタンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００２９】
ＣｈｅｍＲ２３はまた、ＣＭＫＬＲ１、及びＤＥＺの名称で知られている。ＣｈｅｍＲ２３遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が、例えば、配列番号２９、又はその任意の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び他の種において存在するオーソログ配列であり得る、ヒトＣｈｅｍＲ２３遺伝子の配列をここで選択的に指定する。ＣｈｅｍＲ２３遺伝子は、配列番号３０により表される配列を有し得るＣｈｅｍＲ２３タンパク質、又は任意のその自然変異体についてコードする。
【００３０】
本発明に従って、「試験細胞」は、本発明に従ってウイルスにより感染され得る任意の細胞を意味する。好ましくは、ウイルスがＨＩＶである場合、本発明による試験細胞は、上記で定義されたように、ＨＩＶウイルスのＣＤ４、第一の及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する。さらに好ましくは、本発明による試験細胞は、ＣＸＣＲ４、及びＣＣＲ５を発現する。本発明による試験細胞は、これらの受容体を自然に発現し得、またはこれらの受容体を発現するために、遺伝子的に操作され得る。本発明による試験細胞は、例えば、樹枝状細胞、リンパ球系由来の細胞（好ましくは、Ｔリンパ球）、又は骨髄系（好ましくは、マクロファージ）、上皮細胞、又は線維芽細胞でもよい。好ましくは、本発明による試験細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）１９（５）：６２１−６に特に記述される）、例えば、細胞クローンＪｕｒｋａｔ Ｅ６−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＴＩＢ−１５２）、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（Ａｌｋｈａｔｉｂ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９５５−１９５８ ａｎｄ ｔｈｅ ＡＩＤＳ ｒｅａｇｅｎｔ ＮＩＢＳＣ，ＵＫに特に記述される）からなる群から選択される。よりさらに好ましくは、本発明による試験細胞は、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞である。
【００３１】
本発明によるＨＩＶウイルスを用いて試験細胞を感染させることを可能にする技術は、当業者によく知られており、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０（４５９９）：８６８−７１）に特に記述される。
【００３２】
試験細胞におけるマイクロＲＮＡ発現レベル又は標的ｍＲＮＡ発現レベルは、当業者に知られている任意の技術により測定され得る。ＲＮＡの定量を可能にする多くの方法、例えば、ＲＮＡ配列の特異的なオリゴヌクレオチドを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に基づく方法、又はこれらのＲＮＡ、二倍又は三倍のこれらのＲＮＡと、プローブとのハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で許容する方法は知られている。標的ｍＲＮＡの発現レベルが測定された場合、それは、ＲＴ−ＰＣＲを行うこと、又は全てのｍＲＮＡの逆転写を可能にするシングルプローブを用いた特異的なｃＤＮＡチップを作ることを可能にする。本発明によるプローブは、好ましくは、マイクロアレイに配置される。ストリンジェントな条件は、当業者により容易に決定され得る。例えば、本発明によるストリンジェントな条件は、１０〜２０時間、好ましくは１６時間、４０〜５０℃、好ましくは５０℃の温度で、５００ｍＭ〜２ＭのＮａＣｌ、好ましくは１ＭのＮａＣｌの濃度により誘導されるのと同等のイオン強度の存在下でのハイブリダイゼーションステップを含み得る。他の生成物はまた、バッファ溶液、例えばＴｒｉｓ又はＭＥＳ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ、及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）として添加され得る。
【００３３】
第一の共受容体を用いる第一のウイルス、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスでそれぞれ感染された試験細胞におけるマイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡのそれによって測定された発現レベルは、未感染の細胞と比較してそれぞれのウイルスでの感染の間、その発現が調節されるマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡの同定を、可能にし得る。それぞれのウイルスでの感染の間、その発現が調節されるマイクロＲＮＡ及びそれらの標的ｍＲＮＡの同定は、ｍｉＲＮＡ又はそれらの標的ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較することにより達成され得、それぞれのウイルスでの感染後、未感染細胞における前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現レベルと共に測定され得る。好ましくは、マイクロＲＮＡ又はそれの標的ｍＲＮＡは、ウイルスでの試験細胞の感染の間、調節された発現を有すると考えられるため、この発現は、未感染の試験細胞における発現と比較して、それぞれ０．５超、又は０．５未満のｌｏｇ２の割合（感染した細胞における前記ｍｉＲＮＡの発現／未感染の細胞における前記ｍｉＲＮＡの発現）で増加又は減少する。
【００３４】
それぞれのウイルスでの感染の間、調節される発現を有するとして同定されたマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡは、従って、その発現がウイルスによる共受容体の使用により特異的に調節されるｍｉＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを選択するために、比較され得る。
【００３５】
本発明による「共受容体の使用の特異的な発現レベルの調節」とは、ウイルスにより用いられる共受容体の同定を可能にするのに十分な発現の調節、増加、又は減少を意味する。
【００３６】
「未感染の試験細胞」又は「患者由来のウイルスにより未感染の細胞」とは、本発明による方法において、その細胞共受容体が、試験細胞により提示されるが、試験細胞に侵入するためにウイルスにより用いられる第一の共受容体又は少なくとも一つの他の共受容体とは異なる、ウイルスと何らの接触をさせられていないが、ウイルス、特にレトロウイルスにより感染された細胞を意味する。例えば、このウイルスは、ＶＳＶ型又はＰＦＶ−１ウイルスの両種性エンベロープによる偽型化したＨＩＶウイルスでもよい。
【００３７】
例えば、未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるｍｉＲＮＡ又はその標的ｍＲＮＡの発現と比較して、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５を発現する）におけるＣＸＣＲ４共受容体を用いる第一のＨＩＶウイルスでの感染の間、ｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現が増加する場合、その上未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現と比較して、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞におけるＣＣＲ共受容体を用いる第二のＨＩＶウイルスでの感染の間、ｍｉＲＮＡ又は一つのその標的ｍＲＮＡの発現が増加しない場合、その結果、前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現は、ＨＩＶウイルスによるＣＸＣＲ４受容体の使用に特異的である。
【００３８】
本発明はまた、細胞に進入するための受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスによる細胞の感染の間、その発現が、細胞へのその進入のために用いられるウイルスにより用いられる細胞共受容体に応じて特に変更される、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞中のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）このようにして決定されたマイクロＲＮＡの発現レベルを比較すること；
ｉｉｉ）その発現レベルについての変更が共受容体の使用に特異的であるマイクロＲＮＡを同定すること、
を含む、方法に関する。
【００３９】
第一の共受容体を用いるウイルス、及び別の共受容体を用いる他のウイルスによるそれぞれの感染後、試験細胞中のマイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡのそれに関して測定された発現レベルは、その後、互いに直接的に比較され得る。この比較は、その後、それの発現についての変更が、ウイルスによる第一の共受容体、又は少なくとも一つの他の共受容体の使用に特異的である、マイクロＲＮＡ又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定することが可能である。
【００４０】
本発明による方法はまた、その発現レベルについての変更が、細胞に侵入するためのウイルスによる共受容体の使用に特異的である、そのようにして同定された、特徴的なマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを同定することを可能にするさらなるステップを含み得る。ｍｉＲＮＡの標的は、データベース、特にｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／、及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２に特に記述される）、及びＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／、及びＬｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２０：１５−２０、Ｇｒｉｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２７：９１−１０５、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：９２−１０５に特に記述される）で確認され得る。
【００４１】
語句「ＨＩＶウイルスを含み得る患者由来のサンプル」は、ウイルスを含み得る、患者由来の全ての生物学的液体、又は組織、例えば、末梢血、生殖器粘膜、リンパ系組織、脳脊髄液、胎盤、又は母乳を含む。サンプルは、試験細胞と直接接触し得る。好ましくは、ウイルスは、宿主細胞と接触前に、サンプルから抽出される。例えば、患者のウイルスは、生物学的サンプルからの第一の単離体由来であり得、当業者により知られている任意の方法により得ることができ、例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ（（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０（４５９９）：８６８−７１により記述される技術に特に従って、ＨＩＶウイルスの単離は、ＨＩＶで感染された患者由来のリンパ球と、ＨＩＶについて血清反応陰性ドナーのリンパ球との共培養により実行され得る。ＨＩＶウイルスにより感染された患者の末梢血はまた、（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２１１０−４により特に記述されるように）細胞から血漿を分離するために処理され得る。
【００４２】
患者において細胞に侵入するための細胞受容体及び少なくとも一つの共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するための方法を適用するために、少なくとも一つのｍｉＲＮＡ、及び/又は少なくとも一つのこのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡは、測定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、共受容体のウイルスによる使用に特異的な発現レベルの変更を有するとして同定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、本発明による方法により同定される。
【００４３】
特に、本発明による患者においてウイルスを同定するための方法は、ＣＸＣＲ４及び／又はＣＣＲ５を用いるウイルスを同定するために用いられ得る。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び／又はその標的ｍＲＮＡは、その結果、ＣＸＣＲ４、及び／又はＣＣＲ５受容体のＨＩＶウイルスによる使用に特異的な発現レベルの変更を有するとして同定される。好ましくは、このｍｉＲＮＡ、及び/又はその標的ｍＲＮＡは、本発明によるｍｉＲＮＡを同定するための方法により同定される。
【００４４】
好ましくは、本発明による方法は、患者におけるＣＸＣＲ４共受容体を用いるウイルスの存在又は不在を同定するために適用される。本発明による方法はまた、ＣＸＣＲ４受容体を用いるウイルスの出現を同定するために、及び従って、患者における疾患の進行を観察するために、時間をかけて様々な期間において、サンプルされた同じ患者に由来するサンプルに関して数回実行され得る。
【００４５】
所定の値は、単一の値、例えば、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現レベル、又は発現レベルの平均でもよい。
【００４６】
例えば、所定の共受容体を用いるウイルスを同定するために、所定の値は、この受容体を発現し、細胞に侵入するためにこの共受容体を用いることについて知られている参照ウイルスで感染された細胞中における所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値であってもよい。例えば、患者において、ＣＸＣＲ４及び／又はＣＣＲ５を用いるウイルスを同定するために、所定の値は、細胞に侵入するために、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を用いる参照ＨＩＶウイルスでの感染後、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を発現する細胞における、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値であってもよい。
【００４７】
得られる発現レベルと所定の値との比較は、試験されるウイルスが、細胞に侵入するための参照ウイルスと同じ共受容体を用いるかどうかを決定することを可能にする。例えば、得られる値が所定の値に近い場合、試験されるウイルスにより用いられる共受容体が、細胞に侵入するための参照ウイルスにより用いられるそれと同一であることを推測することが可能である。近い値とは、好ましくは、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％、さらにより好ましくは、５％未満より離れていない値を意味する。
【００４８】
参照値はまた、例えば、未感染の細胞、従って、患者のウイルスによる感染の不在における、所定のｍｉＲＮＡ又は所定の標的ｍＲＮＡの発現の値でもよい。好ましくは、未感染の細胞における発現と比較して、所定の共受容体を用いる参照ウイルスでの細胞の感染後、前記ｍｉＲＮＡ又は前記標的ｍＲＮＡの発現は、特に、調節され、増加し、又は減少することが、事前に示される。あらかじめ決められたそれと同じ性質をもつｍｉＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現値の増加又は減少は、従って、ウイルスによる同じ共受容体の使用を示す。同じ性質の増加した又は減少した発現とは、好ましくは、同じ兆候（それぞれ、陰性又は陽性）の、ｌｏｇ２の割合（感染した細胞における前記ｍｉＲＮＡ及び/又は標的ｍＲＮＡの発現／未感染の細胞における前記ｍｉＲＮＡ及び/又は標的ｍＲＮＡの発現）の値を意味する。本発明による感染した患者のウイルスにより用いられる共受容体を同定するための方法における、発現レベルと所定の値（ｉｉｉ）とを比較するためのステップは、少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡが、未感染の試験細胞における少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルと比較して、増加又は減少するかどうかを測定することにより、その結果、選択的に適用される。
【００４９】
例えば、未感染の細胞において、それの発現についてが共受容体ＣＸＣＲ４を用いる参照ＨＩＶウイルスにより特異的に調節（増加又は減少）されるとして示される、一つ又は複数のマイクロＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現の測定は、患者由来のウイルスによる感染後の細胞において、前記マイクロＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現の測定と比較され得る。所定のマイクロＲＮＡの所定の調節がない場合、この試験は、ＣＸＣＲ４が患者由来のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体ではないことが確認される。反対に、所定の調節（増加又は減少）が観察された場合、試験は、ＣＸＣＲ４が患者のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることが確認され、それは、そのようなウイルスは、例えば、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を用い得る、二重トロピズムを有するウイルスであってもよいことは指摘され得る。
【００５０】
その発現が測定されるｍｉＲＮＡは、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ（特に、配列番号３１、ｕｇａｇｕｇｕｇｕｇｕｇｕｇｕｇａｇｕｇｕｇｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３（特に、配列番号３２、ａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｇｇｇａｃｃｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*（特に、配列番号３３、ａｇｇｇａｇｇｇａｃｇｇｇｇｇｃｕｇｕｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５（特に、配列番号３４、ｇａｇｃｃａｇｕｕｇｇａｃａｇｇａｇｃ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８（特に配列番号３５、ａｇｇｇａｕｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｕｇｇｃｇｇｃｃｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（特に配列番号３６、ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕ）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（特に配列番号３７、ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ（特に配列番号３８、ｕｇｕａａａｃａｕｃｃｕｃｇａｃｕｇｇａａｇ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ（特に配列番号３９、ｕｃａｇｕｇｃａｃｕａｃａｇａａｃｕｕｕｇｕ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*（特に配列番号４０、ａｕａａａｇｃｕａｇａｕａａｃｃｇａａａｇｕ）からなる群から選択され得る。好ましくは、その発現について測定されるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８である。
【００５１】
その発現について測定されるｍｉＲＮＡはまた、配列番号３１〜４０の配列の対立遺伝子若しくは多型の変異体、及び配列番号３１〜４０の配列のｍｉＲＮＡ由来であり、特に同じ標的ｍＲＮＡの発現を調節する同じ機能を充足する他の種において存在するオーソログ配列であってもよい。例えば、これらのｍｉＲＮＡは、核酸の一つ又はいくつかの変異による配列番号３１〜４０の配列のｍｉＲＮＡ由来であってもよい。
【００５２】
その発現について測定されるｍＲＮＡは、例えば、配列番号３１〜４０のｍｉＲＮＡ、又はそれら由来のｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡからなる群から選択されてもよい。特に、標的ｍＲＮＡは、上述のようなデータベースに同定され得る。
【００５３】
例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現の増加、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少は、ＣＸＣＲ４が患者のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることを示す。反対に、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８からなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現の増加がないこと、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少がないことは、ＣＸＣＲ４が患者のウイルスにより用いられる共受容体ではないことを示す。
【実施例】
【００５４】
材料及び方法
ウイルス及び細胞株
この研究に用いられるウイルスは、共受容体ＣＸＣＲ４を双方ともに用いる原型ＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤウイルス、共受容体ＣＣＲ５を用いるＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８ウイルス、並びにＣＸＣＲ４共受容体を用いる（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４と称される４つの単離株）、ＣＣＲ５共受容体を用いる（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３と称される３つの単離株）、又はＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の双方の共受容体を用い得る（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４と称される４つの単離株）第一の単離株由来のウイルス、並びにその侵入のためにＣＤ４、又はＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５も用いない別のレトロウイルスＰＦＶ−１である。
【００５５】
Ｊｕｒｋａｔ、及び安定した方法でＣＣＲ５を発現するＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞株は、用いられる。
【００５６】
感染
−原型ウイルスでの感染
Ｊｕｒｋａｔ、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、感染多様性に関する調節を考慮するために、感染用量のＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、ＨＩＶ−２ ＲＯＤで、３日間感染された。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８、又はＰＦＶ−１で３日間感染された。
【００５７】
−初期の単離株由来のウイルスでの感染
Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４、Ｒ５ １、Ｒ５ ２、Ｒ５ ３、ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、又はｄｕａｌ ４ウイルスで、３日間感染された。未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞は、対照（ＮＩ）として用いられる。
【００５８】
マイクロＲＮＡの発現の分析
−マイクロＲＮＡチップごとの分析
原型ウイルスでの感染の３日後、ＲＮＡは、抽出され、マイクロＲＮＡチップ（ＬＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による分析に供される。
【００５９】
−ＲＴ−ＰＣＲによるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現の分析
初期の単離株由来のウイルスによる感染の３日後、細胞は溶解され、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析される。感染した細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染のＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５対照細胞（ＮＩ）におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現に対して相対的に標準化される。
【００６０】
結果
実施例１：マイクロＲＮＡの同定
共受容体ＣＸＣＲ４を双方共に用いる原型ウイルスＨＩＶ−１ ＮＬ４．３及びＨＩＶ−２ ＲＯＤにより誘導されたマイクロＲＮＡの発現の調節が、研究された。個人間のバリエーションを制限するために、及び個別の遺伝的背景（及び従ってマイクロＲＮＡの比較可能なリスト）を用いて実施するために、これらの調節は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＣＣＲ５を発現するＪｕｒｋａｔ株の感染の間、双方ともに研究された。感染の３日が、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＲＮＡは抽出され、マイクロＲＮＡチップでの分析に供される。表１は、ＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤの双方により調節されるマイクロＲＮＡのサブ集団を示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１。１ 及び１００ ＴＣＩＤ５０における、Ｊｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞のＨＩＶ−１ ＮＬ４．３、及びＨＩＶ−２ ＲＯＤでの感染の間誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６３】
ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８での（Ｒ５トロピズムを有する、表２）、及びその侵入のために、ＣＤ４、又はＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５を用いない対照レトロウイルスＰＦＶ−１でのＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞の感染はまた、マイクロＲＮＡの発現の調節を引き起こす。
【００６４】
【表２】
【００６５】
表２。ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８での感染の間、誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６６】
これらの表を比較することにより、９つのマイクロＲＮＡの発現がＨＩＶ及びそのトロピズムの独立した感染の間、体系的に減少することが見られ得る（表３）。これらのマイクロＲＮＡの発現は、ＰＦＶ−１での感染により影響を受けない。
【００６７】
【表３】
【００６８】
表３。ＮＬ４．３、ＲＯＤ、及びＮＬＡＤ８での感染の間、誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節。
【００６９】
さらに、５つのマイクロＲＮＡの発現は、ＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間増加するが、ＮＬＡＤ８での感染の間減少する。最終的に、４つのマイクロＲＮＡの発現は、ＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間特に減少するが、ＮＬＡＤ８での感染の間減少しない（表４）。特にＮＬ４．３、又はＲＯＤでの感染の間、その発現が増加又は減少するマイクロＲＮＡは、ＰＦＶ−１での感染の間、影響を受けない。
【００７０】
【表４】
【００７１】
表４。ＮＬ４．３、及びＲＯＤでの感染の間、特異的に誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの有意（ｐ＜０．０１）な調節（増加、感染の間その発現が増加するマイクロＲＮＡ、減少、感染の間その発現が減少するマイクロＲＮＡ）。
【００７２】
これらの結果は、ウイルスの侵入により誘導された細胞マイクロＲＮＡのリストの調節の重要性を説明する。これらの分析はまた、マイクロＲＮＡの細胞リストにおける変化に基づくＨＩＶによる特定の種類の共受容体（ここではＣＸＣＲ４、又はＣＣＲ５）の使用を区別するための発明による方法に起因して、可能性を示す。
【００７３】
実施例２：
それによって得られた結果を実証するために、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞（受容体ＣＸＣＲ４、及び受容体ＣＣＲ５の双方を発現する）は、共受容体ＣＸＣＲ４を用いる（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、及びＸ４ ４）、共受容体ＣＣＲ５を用いる（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３）、又は共受容体ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５の双方を用い得る（ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４）初期の単離株に由来するウイルスで感染させる。
【００７４】
感染した又は未感染（ＮＩ、対照）の細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、３日後に測定される。予期され、図１に示される様に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現は、未感染の細胞において変更されなかった。この発現は、細胞に侵入するための共受容体としてＣＣＲ５のみを用いるウイルス（Ｒ５ １、Ｒ５ ２、及びＲ５ ３）で感染された細胞において、もはや変更されない（図１）。他方で、この発現は、細胞に侵入するためにＣＸＣＲ４共受容体を用いることのできるウイルス（Ｘ４ １、Ｘ４ ２、Ｘ４ ３、Ｘ４ ４、ｄｕａｌ １、ｄｕａｌ ２、ｄｕａｌ ３、及びｄｕａｌ ４）で感染された細胞において、著しく増加する（図１）。
【００７５】
これらの結果は、ＣＸＣＲ４共受容体に関与する感染のみが、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現の減少を誘導することを示す。
【００７６】
これらの結果は、それ故、実施例１で得られるデータを支持し、必要であれば、感染した細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルが、この細胞を感染するためのウイルスにより用いられる共受容体の決定を可能にすることを証明し、それ故、このウイルスのトロピズムの同定を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、細胞に進入するために、細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスによる細胞の感染の間、マイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡの発現が細胞へのそれの進入のためにウイルスにより用いられる細胞共受容体に従って特に変更され、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルが調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルの変更が共受容体の使用に特異的であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
該試験細胞が、第一及び第二の共受容体を発現し、細胞に侵入するために、第一の共受容体を用いる第一のウイルス、及び第二の共受容体を用いる第二のウイルスで感染される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ウイルスがレトロウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルスがＨＩＶウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＩＶウイルスの一つにより用いられる共受容体が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体が、ＣＸＣＲ４であり、第二のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体が、ＣＣＲ５である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該試験細胞が、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスに感染した患者において、細胞に侵入するために、細胞受容体及びに少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）ウイルスを含み得る患者由来のサンプルと、ウイルスの細胞受容体、及びの少なくとも一つウイルスの細胞共受容体を発現する試験細胞とを接触させること；
ｉｉ）試験細胞中における少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉｉ）発現レベルと所定値とを比較すること；
ｉｖ）ウイルスが、試験細胞により発現された細胞共受容体を使用するかどうかをそれらから推測すること、
を含む、方法。
【請求項９】
該所定値が、未感染の試験細胞におけるｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡの発現レベルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ウイルスが、ＨＩＶウイルスであって、該試験細胞が細胞受容体ＣＤ４を発現する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
該試験細胞が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択される細胞共受容体を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該試験細胞がＣＸＣＲ４を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を含む群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の増加、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*を含む群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少が、ＣＸＣＲ４がＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該マイクロＲＮＡの発現レベル、又は該ｍＲＮＡの量が、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロチップにより測定される、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該試験細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞からなる群から選択される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
マイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡを同定するためのインビトロ方法であって、細胞に進入するために、細胞受容体及び少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスによる細胞の感染の間、マイクロＲＮＡ、又はそれらの標的ｍＲＮＡの発現が細胞へのそれの進入のためにウイルスにより用いられる細胞共受容体に従って特に変更され、以下：
ｉ）第一の共受容体を用いる第一のウイルスによる、及び別の共受容体を用いる少なくとも一つの他のウイルスによるそれぞれの感染後、受容体、第一の共受容体、及び少なくとも一つの他の共受容体を発現する試験細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉ）未感染の細胞における発現レベルと比較して、それぞれのウイルスによる感染の間、その発現レベルが調節されるマイクロＲＮＡを同定すること；
ｉｉｉ）このようにして同定されたマイクロＲＮＡを比較すること；
ｉｖ）その発現レベルの変更が共受容体の使用に特異的であるマイクロＲＮＡを選択すること；
ｖ）このようにして選択されたマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを任意で同定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
該試験細胞が、第一及び第二の共受容体を発現し、細胞に侵入するために、第一の共受容体を用いる第一のウイルス、及び第二の共受容体を用いる第二のウイルスで感染される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ウイルスがレトロウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルスがＨＩＶウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＩＶウイルスの一つにより用いられる共受容体が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体が、ＣＸＣＲ４であり、第二のＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体が、ＣＣＲ５である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該試験細胞が、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスに感染した患者において、細胞に侵入するために、細胞受容体及びに少なくとも一つの細胞共受容体を用いるウイルスにより用いられる細胞共受容体を同定するためのインビトロ方法であって、以下：
ｉ）ウイルスを含み得る患者由来のサンプルと、ウイルスの細胞受容体、及びの少なくとも一つウイルスの細胞共受容体を発現する試験細胞とを接触させること；
ｉｉ）試験細胞中における少なくとも一つのｍｉＲＮＡ及び/又は少なくとも一つのｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの発現レベルを決定すること；
ｉｉｉ）発現レベルと所定値とを比較すること；
ｉｖ）ウイルスが、試験細胞により発現された細胞共受容体を使用するかどうかをそれらから推測すること、
を含む、方法。
【請求項９】
該所定値が、未感染の試験細胞におけるｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡの発現レベルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ウイルスが、ＨＩＶウイルスであって、該試験細胞が細胞受容体ＣＤ４を発現する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
該試験細胞が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、及びＣｈｅｍＲ２３からなる群から選択される細胞共受容体を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該試験細胞がＣＸＣＲ４を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*からなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｈｓａ−ｍｉＲ５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９*、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を含む群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の増加、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９*を含む群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現の減少が、ＣＸＣＲ４がＨＩＶウイルスにより用いられる共受容体であることを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該マイクロＲＮＡの発現レベル、又は該ｍＲＮＡの量が、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロチップにより測定される、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該試験細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ−ＣＣＲ５細胞からなる群から選択される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５０３６２０（Ｐ２０１３−５０３６２０Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７３６９（Ｐ２０１２−５２７３６９）
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５１８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２７０７５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０５１３８８８６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５１８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２７０７５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０５１３８８８６）
【Ｆターム（参考）】
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