ウイルスワクチン用の遺伝的アジュバント
本発明は、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドなどの外来性ポリペプチドのウイルスワクチン中における発現を高める組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は遺伝的アジュバントを介してアジュバント化を強化したウイルスワクチンを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の説明］
本願は、２００６年４月２６付の米国仮特許出願第６０／７９５０９７号に優先権を主張するものである。
【０００２】
上記出願、及び該出願中の全ての引用文献又はその審査中に引用された全ての文献（「出願引用文献」）、及び出願引用文献中で引用又は参照されている全ての文献、及び本明細書中で引用又は参照されている全ての文献（本明細書引用文献）、及び本明細書引用文献中で引用又は参照されている全ての文献、本明細書中又は参照により本明細書に組み込まれている文献中で言及されている全ての製品についてのメーカーの説明書、記述、仕様書、製品シートを参照により本願に組み込み、これらは本発明を実施するために使用してもよい。
【０００３】
本発明は、広義にはウイルスワクチン及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明はベクター（有利にはウイルスベクター）中の遺伝子によって発現される抗原に対する免疫応答を亢進する１又は複数の遺伝的アジュバントを含んでもよいウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、遺伝的ワクチン、プラスミドワクチン又はポリヌクレオチドワクチンとも呼ばれ、抗原に対する免疫化に遺伝子導入を利用するための比較的容易で経済的な方法である。ＤＮＡワクチンは毒性が低く、そのさらなる開発が望まれているが、臨床現場に導入されて成功するためには、そのアプローチの有効性を向上させるためのさらなる戦略が必要である（非特許文献１）。ＤＮＡワクチンは、従来のワクチンがもつ欠点のほとんどを克服しており、将来のワクチンとしての可能性を秘めている。しかし、市販されている製品はまだない。これはおそらく、この技術がヒトにおいて効率的に免疫応答を誘導することができていないためであろう（非特許文献２）。
【０００５】
ＤＮＡワクチンとアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターには多くの類似点がある。ＡＡＶベクターはウイルス遺伝子を何らコードしておらず、ＡＡＶベクターゲノム中に存在するウイルス配列は１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）だけである。しかし、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドによる特異的送達により、インビボでの遺伝子導入効率が非常に高いという利点をもっている。ＤＮＡワクチンと異なり、ＡＡＶは単回投与で、非ヒト霊長類（「ＮＨＰ」）において、ＡＡＶにより発現された抗原に対する液性及び細胞性免疫応答を誘発することができる。
【非特許文献１】Shaw & Strong, Front Biosci. 2006 Jan 1;11:1189-98
【非特許文献２】Glenting & Wessels, Microb Cell Fact. 2005 Sep 6;4:26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡワクチン用の遺伝的アジュバントについては総説があるが（例えばCalarota & Weiner, Expert Rev Vaccines. 2004 Aug;3(4 Suppl):S135-49, Calarota & Weiner, Immunol Rev. 2004 Jun;199:84-99及びKutzler & Weiner, J Clin Invest. 2004 Nov;114(9):1241-4参照）、ウイルスワクチン用の、特にＡＡＶに基づくウイルスワクチン用の遺伝的アジュバントについては未だによく分かっていない。
【０００７】
効果的かつ安全なウイルスワクチン、特に防御反応を誘発するのに十分な量の目的とする標的抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するウイルスワクチンが必要とされている。
【０００８】
本願中で引用又は特定する全ての文献は、本発明の先行技術として利用可能なことを自認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクター中で発現される遺伝子のタンパク質産物のアジュバント化、すなわち免疫応答の亢進に関する。Ａｄ５などの他の多くのベクターと異なり、ＡＡＶは筋肉、脳、肝臓、肺及び網膜に注射されても穏やかな炎症反応しか誘導せず、これは遺伝子治療用のベクターとして望ましい特性である。しかし、送達後に自然免疫応答を誘発しないということは、ベクターだけでなく導入遺伝子のタンパク質産物に対しても免疫応答が減弱されている可能性がある。したがって、ＡＡＶは非常に安全であるが免疫原性のほとんどない、送達のみのベクターとみなすことができる。このことは、ＡＡＶベクターを用いたワクチンが、化学的又は分子的アジュバントの添加による利益を受け得ること示唆している。このようなアジュバントの目的は、導入遺伝子の発現と同時に炎症反応を発生させるか模倣し、遺伝子産物に対するＴ細胞及びＢ細胞の反応を増強することである。
【００１０】
生物学的には、アジュバント化は遺伝的アジュバントを介したものが好適である。物理的アジュバントは効果的ではあるが、導入遺伝子の発現が遅れた場合には、発現が最大のときに免疫応答を適切に生じさせるためのアジュバントが存在しないことがあり得る。その結果、望ましくない抗ベクター（投入粒子）免疫応答が亢進されるかも知れず、さらにベクターに載せた抗原に対する免疫応答に何らかの影響を及ぼし得る。本発明は、ＡＡＶベクター内で発現された病原遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答を、アジュバントの遺伝子である第２の遺伝子を共発現させることで亢進しようとするものである。
【００１１】
本発明は、免疫原性又はワクチン組成物に関し、該組成物はベクター、有利にはウイルスベクター、さらに有利にはＡＡＶベクターを含んでもよく、該ベクターは遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓ抗原、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２であってよい。
【００１２】
ベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。特に好ましい実施形態においては、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。
【００１３】
また、本発明は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤を包含し、該製剤は上述の組成物及び薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤のいずれを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤を包含し、該製剤は、遺伝的アジュバントをコードするベクターと、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含んでもよい。
【００１４】
本発明は、動物における免疫応答を刺激又は誘発する方法に関し、該方法は、本明細書に開示している製剤のいずれかを動物細胞に有効量投与するステップ及び該細胞内で目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させるステップを含んでもよい。好ましくは、動物はヒトである。
【００１５】
本発明は、前述の方法のいずれかを実施するためのキットをも包含し、該キットは、本願に開示しているＤＮＡプラスミド又は製剤、さらには動物において免疫応答を刺激又は誘発する方法を実施するための説明書を含んでもよい。
【００１６】
本開示及び特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む」「含有する」（comprise）等の用語は米国特許法に帰する意味を有する。「本質的に〜からなる」という用語も、米国特許法に帰する意味を有し、これは例えば、明示的に記載されていない要素を許すが、先行技術中の要素、又は本発明の基本的特徴若しくは新規な特徴に影響する要素は除外する。
【００１７】
これら及びその他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されているか又は詳細な説明から明らかであり、詳細な説明に包含される。
【００１８】
以下の詳細な説明は例示のために挙げるものであり、記載している特定の実施形態のみに本発明を限定することを意図するものではなく、添付の図面と一緒にすることで最も良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクター中で発現される遺伝子のタンパク質産物のアジュバント化、すなわち免疫応答の亢進に関する。ＡＡＶは非常に安全であるが免疫原性のほとんどない送達のみのベクターとみなすことができる。このことは、ＡＡＶベクターを用いたワクチンが化学的又は分子的アジュバントの添加による利益を受け得ることを示唆している。物理的アジュバントは効果的ではあるが、導入遺伝子の発現が遅れた場合には、発現が最大のときに免疫応答を適切に生じさせるためのアジュバントが存在しないことがあり得る。その結果、望ましくない抗ベクター（投入粒子）免疫応答が亢進され、ベクターに載せた抗原に対する免疫応答に何らかの影響を及ぼす可能性がある。本発明は、ウイルスベクター内で発現された病原遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答を、アジュバントの遺伝子である第２の遺伝子を共発現させることで亢進しようとするものである。
【００２０】
ＡＡＶベクターが好ましいが、本発明は他のウイルスベクターも想定する。別のウイルスベクターとしては特に限定されないが、アデノウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科などのウイルス科に由来するウイルスベクターを挙げることができる。
【００２１】
本発明は免疫原性又はワクチン組成物に関し、該組成物はベクター、有利にはウイルスベクター、さらに有利にはＡＡＶベクターを含んでもよく、該ベクターは遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓ抗原、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２であってよい。
【００２２】
ＣＴＡ１−ＤＤは、例えば米国特許第６５８９５２９号明細書及び同第５９１７０２６号明細書に記載されている。
【００２３】
Ｆａｓ抗原は、例えば米国特許第６９５３８４７号明細書；同第６９４９３６０号明細書；同第６８９７２９５号明細書；同第６８５５５４３号明細書；同第６７７７５４０号明細書；同第６４６５６１８号明細書；同第６３１６４１８号明細書；同第６３０６８２０号明細書；同第６３０６３９５号明細書；同第６２８４８０１号明細書；同第６２７０９９８号明細書；同第６１７７５９２号明細書；同第６１７１７９８号明細書；同第６１１４５０７号明細書；同第６０８６８７７号明細書；同第６０５４４３６号明細書；同第６０２０１３５号明細書；同第６０１５５５９号明細書；同第５９９４３１３号明細書；同第５８７４５４６号明細書；同第５８３０４６９号明細書；同第５６６３０７０号明細書；同第５６５２２１０号明細書及び同第５６２０８８９号明細書に記載されている。
【００２４】
別の実施形態においては、ｆａｓ抗原の代わりに、又はそれに加えて、ＮＫが仲介するアポトーシスの誘導剤を使用してもよい。
【００２５】
フラジェリンは、例えば米国特許第６８０５８６５号明細書；同第６７４０３２５号明細書；同第６５８５９８０号明細書；同第６５８２７０５号明細書；同第６４１９９３２号明細書；同第６２１１１５９号明細書；同第６１３００８２号明細書；同第５７８６１７９号明細書；同第５７５０１１５号明細書；同第５７４７６５９号明細書；同第５７２５８５８号明細書；同第５６３５１８２号明細書；同第５１５３３１２号明細書；同第４８８６７４８号明細書及び同第４２０１７７０号明細書に記載されている。
【００２６】
ＩＬ−２は、例えば米国特許第７０１５２０５号明細書；同第６９９４９７６号明細書；同第６９８９１４６号明細書；同第６９７７０７２号明細書；同第６９６７０２９号明細書；同第６９６２６９４号明細書；同第６９５６１１９号明細書；同第６９５５８０７号明細書；同第６９２９７９１号明細書；同第６９２１５３０号明細書；同第６９０６１７０号明細書；同第６９０５６８０号明細書；同第６８９６８７９号明細書；同第６８９３８６９号明細書；同第６８８４７８６号明細書；同第６８８４５９８号明細書；同第６８５８５８３号明細書；同第６８５２３１３号明細書；同第６８３８４７４号明細書；同第６８２８１４７号明細書；同第６８１８４４２号明細書；同第６７７４２２６号明細書；同第６７５９２４１号明細書；同第６７５６０３８号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第６７４６６６９号明細書；同第６７３４０１４号明細書；同第６７１９９７２号明細書；同第６７１６４３３号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６６９９４７６号明細書；同第６６９３０８３号明細書；同第６６９２９５４号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６８２７３６号明細書；同第６６６０７２３号明細書；同第６６６０２５８号明細書；同第６６２７６４７号明細書；同第６６１７１３５号明細書；同第６６１３７６２号明細書；同第６６０５２８６号明細書；同第６６０５２７３号明細書；同第６５８６００２号明細書；同第６５５９１３７号明細書；同第６５４８０６８号明細書；同第６５３４２７７号明細書；同第６５３４０５５号明細書；同第６５３１４５３号明細書；同第６５２８０５１号明細書；同第６５２５１０２号明細書；同第６５１１８００号明細書；同第６５０９３１３号明細書；同第６５０６５８２号明細書；同第６５０３７１３号明細書；同第６５００６４１号明細書；同第６４９７８７６号明細書；同第６４８２８４５号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４５８８２９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４５１３０５号明細書；同第６４４８０７３号明細書；同第６４３６９８９号明細書；同第６４１３７７１号明細書；同第６４０７２１８号明細書；同第６４０６７１０号明細書；同第６４０６６９９号明細書；同第６４０６６９６号明細書；同第６３８４２０２号明細書；同第６３８３７３９号明細書；同第６３５８７５１号明細書；同第６３５８５２４号明細書；同第６３５２７２３号明細書；同第６３４８４４９号明細書；同第６３４６２４７号明細書；同第６３２３０２７号明細書；同第６３１２７１８号明細書；同第６２９１４８３号明細書；同第６２７７３６８号明細書；同第６２７４５５２号明細書；同第６２７０７５８号明細書；同第６２６７９５５号明細書；同第６２５２０５８号明細書；同第６２５１８６６号明細書；同第６２４８３１９号明細書；同第６２３２０８７号明細書；同第６２３１８９３号明細書；同第６２１８３７１号明細書；同第６２０７８０２号明細書；同第６２０７４５４号明細書；同第６２０７１７０号明細書；同第６１９７９２５号明細書；同第６１８０１０３号明細書；同第６１６８７８７号明細書；同第６１６８７８５号明細書；同第６１６６１８６号明細書；同第６１５９４６３号明細書；同第６１５９４６２号明細書；同第６１５６３０５号明細書；同第６１５００９９号明細書；同第６１３３４３３号明細書；同第６１２７１７０号明細書；同第６１０７０７７号明細書；同第６０９９８４７号明細書；同第６０９９８４６号明細書；同第６０９３７２３号明細書；同第６０８６９０２号明細書；同第６０８３５０３号明細書；同第６０７７５１９号明細書；同第６０７０１２６号明細書；同第６０６３７６８号明細書；同第６０６３３７５号明細書；同第６０６００６８号明細書；同第６０５４２９７号明細書；同第６０５１２２７号明細書；同第６０４８５３０号明細書；同第６０４５８０２号明細書；同第６０１７５４４号明細書；同第５９９７８６５号明細書；同第５９８９５４６号明細書；同第５９７７３１６号明細書；同第５９７６５２２号明細書；同第５９６８８９８号明細書；同第５９６５３６６号明細書；同第５９６５１２０号明細書；同第５９６１９７９号明細書；同第５９５８７６５号明細書；同第５９３２４２７号明細書；同第５９３２２０８号明細書；同第５９１９４８０号明細書；同第５９１９４６５号明細書；同第５８９７９９０号明細書；同第５８８８５１３号明細書；同第５８７９６７３号明細書；同第５８７４０８５号明細書；同第５８７４０７６号明細書；同第５８６６１２５号明細書；同第５８５８９７８号明細書；同第５８５１９８４号明細書；同第５８４７００４号明細書；同第５８４３４２３号明細書；同第５８４３３９７号明細書；同第５８３７８４０号明細書；同第５８１４３１４号明細書；同第５８１４２９５号明細書；同第５８００８１０号明細書；同第５７９５９６４号明細書；同第５７８９１８５号明細書；同第５７８８９６４号明細書；同第５７８３５５７号明細書；同第５７７６４６５号明細書；同第５７５６５４０号明細書；同第５７４７０２４号明細書；同第５６９８５３０号明細書；同第５６９８１９４号明細書；同第５６９３３２２号明細書；同第５６７４４８３号明細書；同第５６５０１５２号明細書；同第５６４３５６５号明細書；同第５６３５４７８号明細書；同第５６３５３８８号明細書；同第５６３５３８６号明細書；同第５６３２９８３号明細書；同第５６２７０５２号明細書；同第５６１６５５４号明細書；同第５５９１６３２号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５５８０５６１号明細書；同第５５３０１０１号明細書；同第５５０３８４１号明細書；同第５５００３４０号明細書；同第５４７４８９９号明細書；同第５４２５９４０号明細書；同第５４０９６９８号明細書；同第５３４６９８９号明細書；同第５２５０２９５号明細書；同第５２３８８２３号明細書；同第５２２５５３５号明細書；同第５１２０５２５号明細書；同第５１００６６４号明細書；同第５０９８７０２号明細書；同第４９７１７９５号明細書；同第ＲＥ３３２５２号明細書；同第４９３８９５６号明細書；同第４８９４２２７号明細書；同第４８６３７２７号明細書；同第４８６３７２６号明細書；同第４８４５１９８号明細書；同第４６０４３７７号明細書；同第４４７３４９３号明細書及び同第４４１１９９３号明細書に記載されている。
【００２７】
ＩＬ−１２は、例えば米国特許第６９９５００８号明細書；同第６９８９１４６号明細書；同第６９８４３８９号明細書；同第６９５６１１９号明細書；同第６９０２７３４号明細書；同第６８９９８８５号明細書；同第６８９６８７９号明細書；同第６８９３８６９号明細書；同第６８９３８２１号明細書；同第６８６７０００号明細書；同第６８５２３１３号明細書；同第６８３８２９０号明細書；同第６８３８２６０号明細書；同第６８３０７５１号明細書；同第６８１８４４４号明細書；同第６７７４２２６号明細書；同第６７７４１３０号明細書；同第６７５９２４１号明細書；同第６７５６０３８号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第６７４６６６９号明細書；同第６７１６４３３号明細書；同第６７１６４２２号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６７０６２６４号明細書；同第６６９３１０５号明細書；同第６６９２９５４号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６７５１０５号明細書；同第６６６０２５８号明細書；同第６６１７１３５号明細書；同第６６０５２８６号明細書；同第６５５８９５１号明細書；同第６５４８０６８号明細書；同第６５３４２７７号明細書；同第６５２８０５１号明細書；同第６５０９３２１号明細書；同第６５０３７１３号明細書；同第６４９７８７６号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４７５９９９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４４８０７３号明細書；同第６４２３３０８号明細書；同第６４２０３３５号明細書；同第６４０７２１８号明細書；同第６３８４２０２号明細書；同第６３８４０１８号明細書；同第６３７５９４４号明細書；同第６３６５１６５号明細書；同第６３４８４４９号明細書；同第６３４６２４７号明細書；同第６３３８８４８号明細書；同第６２７４５５２号明細書；同第６２７０７５８号明細書；同第６２３９１１６号明細書；同第６２２５２９２号明細書；同第６２２５１１７号明細書；同第６２１４８０６号明細書；同第６２０７４５４号明細書；同第６１６８９２３号明細書；同第６１６８７８７号明細書；同第６１６００９３号明細書；同第６１５９４６２号明細書；同第６１５６３０５号明細書；同第６１２７１７０号明細書；同第６０９６８６９号明細書；同第６０８０７４２号明細書；同第６０８０３９９号明細書；同第６０７７５１９号明細書；同第６０７１８９３号明細書；同第６０７０１２６号明細書；同第６０６３３７５号明細書；同第６０５１２２７号明細書；同第６０４８５３０号明細書；同第６０４５８０２号明細書；同第６０１７５４４号明細書；同第６００４８１２号明細書；同第５９９７８６５号明細書；同第５９８５２６４号明細書；同第５９７６５３９号明細書；同第５９６２４２４号明細書；同第５９６１９７９号明細書；同第５９１９４８０号明細書；同第５８８８５１３号明細書；同第５８５１９８４号明細書；同第５８４７００４号明細書；同第５８４３４２３号明細書；同第５８１１０９７号明細書；同第５７５６５４０号明細書；同第５７４１８１５号明細書；同第５７３６５２４号明細書；同第５７２３１２７号明細書；同第５７０５１５１号明細書；同第５６９８１９４号明細書；同第５６９３３２２号明細書；同第５６７４４８３号明細書；同第５６６５３４７号明細書；同第５６３５３８８号明細書；同第５６３２９８３号明細書及び同第５５４７８５２号明細書に記載されている。
【００２８】
米国特許第６６９３０８６号明細書の遺伝的アジュバントも本発明の想定範囲内である。ＬＴ及びＣＴ遺伝的アジュバントも本発明に有用である。
【００２９】
ＬＴアジュバントは、例えば米国特許第６９８７１７６号明細書；同第６８１８２２２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５８５９７５号明細書；同第６５７６７５７号明細書；同第６５７６２４４号明細書；同第６５６９４３５号明細書；同第６５４１０１１号明細書；同第６４４０４２３号明細書；同第６４３６４０７号明細書；同第６４１３５２３号明細書；同第６４０６７０３号明細書；同第６１２９９２３号明細書；同第６０８３６８３号明細書；同第６０７７６７８号明細書；同第６０５１４１６号明細書；同第６０３３６７３号明細書；同第６０１９９８２号明細書；同第５９８５２４３号明細書；同第５９７６５２５号明細書；同第５９１９４６３号明細書；同第５８９７４７５号明細書；同第５８６９０６６号明細書；同第５８５８３５２号明細書；同第５６８１７３６号明細書及び同第５６７９５６４号明細書に記載されている。
【００３０】
ＣＴアジュバントは、例えば米国特許第６８４９７２５号明細書；同第６８１８４０５号明細書；同第６７９７４７１号明細書；同第６７９３９２８号明細書；同第６７５９２００号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第ＲＥ３８３９２号明細書；同第６６０７７３２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５６５８２８号明細書；同第６５４４５１８号明細書；同第６４７２５８５号明細書；同第６４２０５９１号明細書；同第６３９５９６４号明細書；同第６１１７６５０号明細書；同第６０７４３５２号明細書；同第５９８０８９８号明細書；同第５９１７０２６号明細書；同第５８５９０１８号明細書；同第５７８３１８２号明細書；同第５７２３５８５号明細書；同第５６７９５４５号明細書；同第５５７１８９３号明細書；同第５５６５２１５号明細書；同第４８６９２４７号明細書；同第４４１１８８８号明細書及び同第４０３４０９０号明細書に記載されている。
【００３１】
本発明の目的のためには、遺伝的アジュバントの要件は、それがヌクレオチド配列にコードされており、ウイルスベクター内で発現されるということだけである。遺伝的アジュバントに関して考慮すべき要素としては特に限定されないが、例えばウイルスベクターのキャパシティーに対するアジュバント遺伝子の大きさ、ベクターの構築及び生産にかかる時間及び費用、並びに安全性を挙げることができる。
【００３２】
本明細書において、遺伝的アジュバントとは、ベクターによって発現されるサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンド、それらの最適な組合せなどの生物学的活性因子を意味し、抗原をコードする初回刺激用のＤＮＡワクチンと一緒に投与されると、抗原をコードするＤＮＡワクチンのみによる初回刺激で生じる免疫応答と比較して、抗原特異的な粘膜免疫応答を亢進するものである。その他の望ましい遺伝的アジュバントとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＦＮ）、（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、ＴＮＦ−α、それらの組合せをコードするＤＮＡ配列、等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。遺伝的アジュバントは、パラポックスウイルスの免疫賦活性ポリペプチドであってもよく、例えばパラポックスウイルスＤ１７０１株若しくはＮＺ２株のポリペプチド、又はパラポックスの免疫賦活性ポリペプチドＢ２ＷＬ若しくはＰＰ３０（例えば米国特許第６７５２９９５号参照）であってもよい。当業者であれば抗原特異的免疫応答を亢進するさらに別の生物学的活性因子を容易に選択することができる。また、同因子を含有する好適なプラスミドベクターは、公知の技術により構築することができる。
【００３３】
本発明はさらに、物理的アジュバントによる免疫応答の補助を提供する。物理的アジュバントの投与は当業者に周知であり、遺伝的アジュバントと一緒に、同時に及び／又は連続して投与することができる。物理的アジュバントを投与するために当業者にとって日常的な実験が必要とされてもよい。物理的アジュバントについて考慮すべき要素としては、生ウイルスとの適合性、導入遺伝子の発現開始に対する投与の時期、安全性、実行可能性等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。したがって、臨床段階にあるアジュバントが好ましい。好ましい物理的アジュバントは特に限定されるものではないが、ＣｐＧ、ＣＲＯＮＹ（ＮＫＴ細胞ＣＤ１リガンド）、ＩＣ３１、イミキモド、ＩＱＭ、ＱＳ−２１等を挙げることができる。
【００３４】
ＣｐＧは例えば、米国特許第７０１４９９２号明細書；同第７０１０６１０号明細書；同第６９９４８７０号明細書；同第６９８９４４２号明細書；同第６９７９７２８号明細書；同第６９７７１４６号明細書；同第６９７７０６９号明細書；同第６９６５４５４号明細書；同第６９６４９５１号明細書；同第６９６０４３６号明細書；同第６９６０４３４号明細書；同第６９５１６５１号明細書；同第６９４９５２０号明細書；同第６９４９３６１号明細書；同第６９４２９７２号明細書；同第６９３６２５５号明細書；同第６９３２９７２号明細書；同第６９１９２０４号明細書；同第６９１４１４８号明細書；同第６９１３８９０号明細書；同第６９１１３０６号明細書；同第６９０８９０１号明細書；同第６８９３８２０号明細書；同第６８８４４３５号明細書；同第６８８１５６１号明細書；同第６８８１５５６号明細書；同第６８７８６１６号明細書；同第６８７２５２４号明細書；同第６８５８３８８号明細書；同第６８４６４７７号明細書；同第６８３５５４１号明細書；同第６８２８４３５号明細書；同第６８２１９５７号明細書；同第６８１８４０４号明細書；同第６８１５４２９号明細書；同第６８１５１６６号明細書；同第６８１１９８２号明細書；同第６８０８９０８号明細書；同第６７９４１３７号明細書；同第６７８７５２４号明細書；同第６７８５７４１号明細書；同第６７８３９３３号明細書；同第６７７３８９７号明細書；同第６７６７９９１号明細書；同第６７６２２８１号明細書；同第６７５６２００号明細書；同第６７５３０１５号明細書；同第６７３７０６６号明細書；同第６７３３７７７号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６７０９８１８号明細書；同第６６９６５５５号明細書；同第６６９３０８６号明細書；同第６６８９６０６号明細書；同第６６８９５８８号明細書；同第６６７３９１２号明細書；同第６６７１８４５号明細書；同第６６６７１７４号明細書；同第６６５３２９５号明細書；同第６６５３２９２号明細書；同第６６４９７５１号明細書；同第６６３９０６２号明細書；同第６６３６６２３号明細書；同第６６２７１９８号明細書；同第６６１３８９４号明細書；同第６６１３７５１号明細書；同第６６０５４３２号明細書；同第６６０００３２号明細書；同第６５９９７００号明細書；同第６５９３４６６号明細書；同第６５９００９２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５７６７５２号明細書；同第６５６９６２１号明細書；同第６５６６３３８号明細書；同第６５５９２７９号明細書；同第６５５２００６号明細書；同第６５３４６４６号明細書；同第６５３４５２３号明細書；同第６５１１８０８号明細書；同第６４８６１３２号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４７６０００号明細書；同第６４７２１５３号明細書；同第６４６５４３８号明細書；同第６４５１３２０号明細書；同第６４２９１９９号明細書；同第６４２６３３４号明細書；同第６４２０３８０号明細書；同第６４１０５３１号明細書；同第６４０６７０５号明細書；同第６３９５２７８号明細書；同第６３６６７９３号明細書；同第６３３９０６８号明細書；同第６３３１３９３号明細書；同第６３２９４１７号明細書；同第６３２９３７９号明細書；同第６３２６４８７号明細書；同第６３２３１８０号明細書；同第６３１３０９５号明細書；同第６３０９８２８号明細書；同第６２６５１７１号明細書；同第６２５１５９４号明細書；同第６２４５７３６号明細書；同第６２３９１１６号明細書；同第６２２５２９２号明細書；同第６２１８３７１号明細書；同第６２１４８０６号明細書；同第６２１４５５６号明細書；同第６２０７６４６号明細書；同第６２００７５６号明細書；同第６１９４３８８号明細書；同第６１９１３０６号明細書；同第６１８４２１１号明細書；同第６１８０６１４号明細書；同第６１７５００２号明細書；同第６１５３５９１号明細書；同第６１４７２００号明細書；同第６１２２６７１号明細書；同第６０９６７１２号明細書；同第６０９０７９１号明細書；同第６０８４１０２号明細書；同第６０５７４６５号明細書；同第６０１７７０４号明細書；同第６００４７５０号明細書；同第５９９０１５９号明細書；同第５９７２８８３号明細書；同第５９４５４１３号明細書；同第５９４２６１０号明細書；同第５９３５９３２号明細書；同第５９１７１２２号明細書；同第５９１６７５０号明細書；同第５８６３９０１号明細書；同第５８５６４６２号明細書；同第５８５１７６２号明細書；同第５８４９８６３号明細書；同第５８４０８７９号明細書；同第５８４０４９７号明細書；同第５８３４４３１号明細書；同第５８３２３８２号明細書；同第５７８６１４６号明細書；同第５７８０４４８号明細書；同第５７３６６２６号明細書；同第５７３６４８０号明細書；同第５７００９２６号明細書；同第５６４８３３６号明細書；同第５５５４７４４号明細書；同第５５５２４７１号明細書；同第５５３２１７０号明細書；同第５５０８１６４号明細書；同第５４７２６７２号明細書；同第５４５１４６３号明細書；同第５４１９９６６号明細書；同第５４０５９９０号明細書；同第５４０１８３７号明細書；同第５２４４６５５号明細書；同第５１１４９１８号明細書；同第５０１３８３０号明細書；同第４９４５０５９号明細書；同第４８４０９３５号明細書；同第４５６９９１７号明細書；同第４４８５０３８号明細書；同第４４３１６５４号明細書及び同第４３６８０３４号明細書に記載されている。
【００３５】
ＩＣ３１は、例えば米国特許第６１３６３０９号明細書に記載されている。イミキモドは、例えば米国特許第６０１１０５５号明細書及び同第５７５０４９５号明細書に記載されている。ＩＱＭは、例えば米国特許第６４６５１７３号明細書；同第６１５３４０８号明細書；同第６０１１１４６号明細書；同第５９７６５５１号明細書及び同第５０６８１７７号明細書に記載されている。ＱＳ−２１は、例えば米国特許第７０１４８５６号明細書；同第７００１６０１号明細書；同第６９７９４４８号明細書；同第６９６７０２２号明細書；同第６９３６２５３号明細書；同第６９１６４７６号明細書；同第６９０５６８６号明細書；同第６８９９８８５号明細書；同第６８９０５３５号明細書；同第６８７５４３４号明細書；同第６８５５３１６号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６４５４９５号明細書；同第６６１０６５９号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５２４５８４号明細書；同第６４５８３６９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４０３１０４号明細書；同第６３７５９４５号明細書；同第６３５５２５６号明細書；同第６２７０８００号明細書；同第６２４８５８５号明細書；同第６２３１８５９号明細書；同第６１２３９４８号明細書；同第６０３６９５９号明細書；同第５７２３１３０号明細書及び同第５６１２０３０号明細書に記載されている。
【００３６】
本発明に使用可能な、その他の好適な公知のアジュバントの例としては、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％（ｗ／ｖ）Ｓｐａｎ８５）、（シトシンが非メチル化シトシンである）ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａ抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ＱｕｉｌＡ、インターロイキン、その他のＴｏｌｌ様受容体リガンド又はＮＫ細胞リガンド等単独又はそれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。実験動物に対して、フロイント；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；及び細菌から抽出された３種類の成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジマイコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に含有するＲＩＢＩを使用することができる。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原対して作られた抗体の量を測定することで決定することができる。
【００３７】
組成物の有効性を高めるアジュバントのさらなる例として、（１）水中油滴型エマルション製剤（ムラミルペプチド（下記参照）又は細菌細胞壁成分などのその他の特定の免疫賦活剤と共に又はそれら無しで）：例えば（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０，及び０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（場合によりＭＴＰ−ＰＥも含有）、マイクロ流動化装置（microfluidizer）でサブミクロン粒子に製剤化されているＭＦ５９（商標）（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット及びChapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックをブロックされた５％ポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含み、マイクロ流動化（microfluidize）によりサブミクロンエマルションにされているか、又はボルテックスでより大きな粒子サイズのエマルションにされているＳＡＦ、並びに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレバロース（trebalose）ジマイコレート（ＴＤＭ）、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１又は複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ribi Immunochem社製, Hamilton, Mont.）；（２）ＱＳ２１又はSTIMULON（商標）（Cambridge Bioscience社製, Worcester, Mass.）などのサポニンアジュバントを使用してもよく、或いはそれから生成するＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの粒子（このＩＳＣＯＭは別に洗浄剤（detergent）を含まなくてよい（例えば国際公開第００／０７６２１号パンフレット））；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）及びフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開第９９／４４６３６号パンフレット）等）、インターフェロン（例えばガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン、；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）又は３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（英国特許第２２２０２２１号明細書及び欧州特許出願公開第０６８９４５４（Ａ）号明細書）（肺炎球菌サッカライドと使用する場合は、必要に応じてミョウバンが実質的に存在しなくてもよい（例えば国際公開第００／５６３５８号パンフレット））；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１及び／又は水中油滴型エマルション（例えば欧州特許出願公開第０８３５３１８（Ａ）号明細書、同第０７３５８９８（Ａ）号明細書、同第０７６１２３１（Ａ）号明細書）との組合せ、；（７）ＣｐＧモチーフ［Krieg Vaccine 2000, 19,618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman et al., Nat. Med. 1997,3,849-854；Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837；Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 870-876；Chu et al., J. Exp.Med, 1997, 186, 1623-1631；Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344；Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224；Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549；Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883；Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845；Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575；Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78；Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873；Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122；Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402；Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761及び Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906；国際特許出願国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、同第９８／１６２４７号パンフレット、同第９８／１８８１０号パンフレット、同第９８／４０１００号パンフレット、同第９８／５５４９５号パンフレット、同第９８／３７９１９号パンフレット及び同第９８／５２５８１号パンフレット］を含む、すなわちシトシンが非メチル化シトシンであるＣＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む、オリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテル又はポリオキシエチレンエステル（例えば国際公開第９９／５２５４９号パンフレット）；（９）オクトキシノール（国際公開第０１／２１２０７号パンフレット）若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルと組み合わせたポリオキシエチレンソイビタンエステル系界面活性剤（polyoxyethylene soibitan ester surfactant）、又はオクトキシノール（国際公開第０１／２１１５２号パンフレット）などの別の非イオン性界面活性剤の少なくとも１つと組み合わせたエステル系界面活性剤；（１０）サポニン及び免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号パンフレット）；（１１）免疫不活化在及び金属塩粒子（例えば国際公開第００／２３１０５号パンフレット）；（１２）サポニン及び水中油滴型エマルション（例えば国際公開第９９／１１２４１号パンフレット）；（１３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（必要に応じて＋ステロール）例えば国際公開第９８／５７６５９号パンフレット；（１４）組成物の効果を高める免疫賦活剤として作用するその他の物質、等を挙げることができる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）等を挙げることができる。
【００３８】
ベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。特に好ましい実施形態においては、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とするＨＩＶ若しくはＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。
【００３９】
ＨＩＶ配列は、例えば米国特許第７００８７８４号明細書；同第７００１７５９号明細書；同第６９９５００８号明細書；同第６９９４９６９号明細書；同第６９６４７６３号明細書；同第６９５８２１１号明細書；同第６９４２９６９号明細書；同第６９３３２８６号明細書；同第６８９７３０１号明細書；同第６８９０９０８号明細書；同第６８６９９３３号明細書；同第６８６９７５９号明細書；同第６８６１５１５号明細書；同第６８４１６５７号明細書；同第６８２８１４８号明細書；同第６８２４８６６号明細書；同第６８２１９４５号明細書；同第６８１８７４０号明細書；同第６８１４９３４号明細書；同第６７９０９４１号明細書；同第６７８３９８１号明細書；同第６７４７１２６号明細書；同第６７３４１６０号明細書；同第６７２３５５８号明細書；同第６７０３４９３号明細書；同第６６９９９８５号明細書；同第６６９６２９１号明細書；同第６６８６３３３号明細書；同第６６８６１５０号明細書；同第６６８００２５号明細書；同第６６７０１８１号明細書；同第ＲＥ３８３５２号明細書；同第６６６４０４１号明細書；同第６６６０９０４号明細書；同第６６５３０８１号明細書；同第６６４９３４０号明細書；同第６６４２３６７号明細書；同第６６３０４５５号明細書；同第６６１３５３０号明細書；同第６５９６５３９号明細書；同第６５９３１２４号明細書；同第６５８６１９２号明細書；同第６５８５９７９号明細書；同第６５６２５７５号明細書；同第６５４１２４８号明細書；同第６５３４３１２号明細書；同第６５３１５８７号明細書；同第６５３１２７６号明細書；同第６５３１１２３号明細書；同第６５２８２５１号明細書；同第６５２１７３９号明細書；同第６５１４７３６号明細書；同第６５０３７０５号明細書；同第６４９８０３３号明細書；同第６４９８０２５号明細書；同第６４９２１２０号明細書；同第６４９２１１０号明細書；同第６４８９０９８号明細書；同第６４８２９２８号明細書；同第６４８２８０５号明細書；同第６４７１９５６号明細書；同第６４６８９８２号明細書；同第６４６１５６７号明細書；同第６４５８５２７号明細書；同第６４４８０１４号明細書；同第６４４０４６１号明細書；同第６４３２６３１号明細書；同第６４２９３０６号明細書；同第６４２９２９０号明細書；同第６４２９００９号明細書；同第６４１９９３１号明細書；同第６４１０２５７号明細書；同第６４０７０７８号明細書；同第６４０４９０７号明細書；同第６３９９３０７号明細書；同第６３７２９５６号明細書；同第６３７２４２５号明細書；同第６３５０７３０号明細書；同第６３３５０１７号明細書；同第６３０９８５３号明細書；同第６３０３３１７号明細書；同第６３０３２９５号明細書；同第６２９１２２７号明細書；同第６２８７６０５号明細書；同第６２７７６３４号明細書；同第６２６５１４９号明細書；同第６２５８５９９号明細書；同第６２５８３１９号明細書；同第６２４８５７４号明細書；同第６２４２５６８号明細書；同第６２４２１８７号明細書；同第６２３５８８１号明細書；同第６２３５４７９号明細書；同第６２３２１２０号明細書；同第６２２５０６７号明細書；同第６２２２０２５号明細書；同第６２２１６６１号明細書；同第６２２１５７８号明細書；同第６２１４９８２号明細書；同第６２０７４２６号明細書；同第６２０４２５３号明細書；同第６１９７７５５号明細書；同第６１９７５８３号明細書；同第６１９７５６３号明細書；同第６１９７４９９号明細書；同第６１７１７８５号明細書；同第６１６８９５３号明細書；同第６１６８９４８号明細書；同第６１６６１９７号明細書；同第６１５６９５２号明細書；同第６１４９９１０号明細書；同第６１４０４６６号明細書；同第６１２７１５５号明細書；同第６１２４４４８号明細書；同第６１２４４３９号明細書；同第６１１４３４９号明細書；同第６１１４１４１号明細書；同第６１１０４６６号明細書；同第６１０７０７８号明細書；同第６１０７０２０号明細書；同第６０９０３９２号明細書；同第６０８６８９１号明細書；同第６０６３６０８号明細書；同第６０４８８３７号明細書；同第６０４３３４７号明細書；同第６０４０１６６号明細書；同第６０３７１６５号明細書；同第６０３７１５２号明細書；同第６０３３９０２号明細書；同第６０３３８８１号明細書；同第６０２７８８４号明細書；同第６０１５６６１号明細書；同第６０１３４３２号明細書；同第６０１０８９５号明細書；同第６００８３４３号明細書；同第６００７９８４号明細書；同第６００４８０６号明細書；同第６００１９８９号明細書；同第６００１９６８号明細書；同第６００１６４８号明細書；同第５９９８１９３号明細書；同第５９９４０５６号明細書；同第５９９３８１９号明細書；同第５９９０２７６号明細書；同第５９８５６４１号明細書；同第５９８１５０５号明細書；同第５９８１２７６号明細書；同第５９８１１７１号明細書；同第５９８１１６７号明細書；同第５９７２７０１号明細書；同第５９６８７３０号明細書；同第５９６２６３５号明細書；同第５９６２４２８号明細書；同第５９５８７６８号明細書；同第５９５５２６８号明細書；同第５９３９２６２号明細書；同第５９３５８１０号明細書；同第５９１９６２５号明細書；同第５８８８７６７号明細書；同第５８８５８０６号明細書；同第５８８３０８１号明細書；同第５８７６９７６号明細書；同第５８７４０８７号明細書；同第５８６９３３９号明細書；同第５８６６７０１号明細書；同第５８５８７８５号明細書；同第５８５８７３２号明細書；同第５８５６１８８号明細書；同第５８５６０８６号明細書；同第５８５４９６７号明細書；同第５８５３７１６号明細書；同第５８４６５４６号明細書；同第５８４３７５２号明細書；同第５８４３６４０号明細書；同第５８３７４６４号明細書；同第５８３０８７６号明細書；同第５８３０６５０号明細書；同第５８３０６４１号明細書；同第５８２０８６５号明細書；同第５８１７７９２号明細書；同第５８１７６３７号明細書；同第５８１７６３５号明細書；同第５８１４４５８号明細書；同第５７９８３６５号明細書；同第５７９８２０８号明細書；同第５７９２７５６号明細書；同第５７９２４５９号明細書；同第５７８６１９９号明細書；同第５７７３５７３号明細書；同第５７７３２６０号明細書；同第５７７０４２８号明細書；同第５７６７２３３号明細書；同第５７６３２６８号明細書；同第５７４７２９２号明細書；同第５７４１４９２号明細書；同第５７３９１１８号明細書；同第５７１１９４７号明細書；同第５６９８６８７号明細書；同第５６８８６８８号明細書；同第５６８３６６１号明細書；同第５６７７１２４号明細書；同第５６７２６９５号明細書；同第５６６５５７７号明細書；同第５６５４１９５号明細書；同第５６５０３０９号明細書；同第５６５０３０２号明細書；同第５６５０２６８号明細書；同第５６３９６００号明細書；同第５６３１１２８号明細書；同第５６１８６６４号明細書；同第５６０５６８９号明細書；同第５５９４１２３号明細書；同第５５９３９７２号明細書；同第５５８７２８５号明細書；同第５５８３０３５号明細書；同第５５７１７１２号明細書；同第５５３６６４８号明細書；同第５５３２１４６号明細書；同第５５２７８９５号明細書；同第５５２７６７３号明細書；同第５５１２４３０号明細書；同第５５０３７２１号明細書；同第５４７０７３０号明細書；同第５４３９８０９号明細書；同第５４２７９２９号明細書；同第Ｈ００１４３１号明細書；同第５３８６０２２号明細書；同第５３５２６００号明細書；同第５３１８９７９号明細書；同第５３１４８０９号明細書；同第５２９８６１２号明細書；同第５２７８１７３号明細書；同第５２５２４７７号明細書；同第５２３４８０９号明細書；同第５２２５３４７号明細書；同第５２２１６０８号明細書；同第５１９８３４６号明細書；同第５１８４０２０号明細書；同第５１５６９４９号明細書；同第５１５３２０２号明細書；同第５１３９９４０号明細書；同第５１１０８０２号明細書；同第５０９６８１５号明細書；同第５０７９３５２号明細書；同第５０６６７８２号明細書；同第５０３０４４９号明細書；同第５００８１８２号明細書；同第４９６５１８８号明細書；同第４９１８１６６号明細書及び同第４８８９８１８号明細書に開示されている。
【００４０】
特に有利な実施形態においては、本発明の目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドはＨＩＶ−１タンパク質であり、有利には、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｎｅｆ、逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子にコードされるＨＩＶ−１タンパク質、又は免疫原性を有する任意のその断片である。有利な実施形態において、ｅｎｖ及びＲＴ配列は、Genbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５８（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来し、ｇａｇ及びｔａｔ配列はGenbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５７（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来し、ｒｅｖ及びｎｅｆ配列は、Genbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５４（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来する。
【００４１】
ＳＩＶ配列は、例えば米国特許第６９３３３７７号明細書；同第６８４１６５７号明細書；同第６８１８７４０号明細書；同第６７９０６５７号明細書；同第６７４７１２６号明細書；同第６７１２６１２号明細書；同第６６５６７０６号明細書；同第６５９６５３９号明細書；同第６５４１００９号明細書；同第６５３１１２３号明細書；同第６２４８５７４号明細書；同第６０８３５０４号明細書；同第６００８０４４号明細書；同第５７７７０７４号明細書；同第５７７３５７３号明細書；同第５７５３６７４号明細書；同第５６６５３６２号明細書；同第５６５４１９５号明細書；同第５６５２２６０号明細書及び同第５４５９０６０号明細書に開示されている。
【００４２】
特に有利な実施形態において、ベクターは、ＳＩＶ及び／又はＨＩＶ並びに分子的アジュバントを含む、ＡＡＶベクターである。ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及び分子的アジュバントをコードするｒＡＡＶベクターの概略図については、例えば実施例３を参照されたい。
【００４３】
本明細書において、「抗原」又は「免疫原」とは、宿主動物において特定の免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、死滅若しくは弱毒化した、又は生きた生物の全体；生物のサブユニット又は一部；免疫原性特性を有するインサートを含有する組換えベクター；宿主に提示されると免疫応答を誘導することができるＤＮＡの断片；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、又はその任意の組合せを含んでもよい。あるいは、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含んでもよい。
【００４４】
本明細書において、「免疫原性タンパク質又はペプチド」とは、免疫学的に活性なペプチド及びポリペプチド等をも意味する。ここで、免疫学的に活性とは、宿主に投与されると、該タンパク質に対する液性及び／又は細胞性の免疫応答を惹起することができることである。好ましくは、タンパク質断片は、完全なタンパク質と実質的に同じ程度の免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明によるタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープすなわち抗原決定部位を含むか、本質的に含むか、又はからなる。エピトープとは、液性（Ｂ細胞）及び／又は細胞性（Ｔ細胞）の免疫応答を誘導することができるタンパク質部位に関する。
【００４５】
さらに、「免疫原性タンパク質又はペプチド」とは、ポリペプチドが本明細書に定義の免疫学的応答を生じさせる機能を有する限り、配列への欠失、付加及び置換をも包含する。この点に関し、特に好ましい置換は、性質を保存するものであり、すなわち、アミノ酸のファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は一般的に４つのファミリー、すなわち（１）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）無電荷極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは芳香族アミノ酸に分類されることもある。ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる単独置換、若しくはその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸による単独置換、若しくはその逆；スレオニンのセリンによる単独置換、若しくはその逆；又はアミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸による同様に保存的な置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが合理的に予測される。したがって、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有し、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない軽微なアミノ酸置換を含むタンパク質は、参照ポリペプチドの定義に含まれる。
【００４６】
「エピトープ」とは、抗原又はハプテン上の、特異的なＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答する部位を意味する。エピトープという用語はまた、「抗原決定基」又は「抗原決定部位」と置き換えて使用することができる。ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を阻害する能力を有することを示す簡単なイムノアッセイを用いて、同じエピトープを認識する抗体を同定することができる。
【００４７】
組成物又はワクチンに対する「免疫学的応答（immunological response）」とは、宿主内における、目的とする組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体介在性免疫応答の発症である。通常、「免疫学的応答」としては、以下の効果の１又は複数が含まれるがこれらに限定されるものではない：目的とする組成物又はワクチンに含まれる１又は複数の抗原に特異的に向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生。宿主は、新たな感染に対する耐性が亢進されるか又は疾患の臨床的重傷度が緩和されるような、治療的又は防御的免疫学的応答のいずれかを示すことが好ましい。このような防御は、感染宿主が通常示す症状の緩和又は消失、感染宿主における回復時間の短縮及び／又はウイルス価の低下により実証される。
【００４８】
本明細書において「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドとは、上記の免疫学的応答を誘発するアミノ酸配列をも意味する。本明細書における「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドには、タンパク質の全長配列、そのアナログ、又はその免疫原性断片が含まれる。「免疫原性断片」とは、１又は複数のエピトープを含むタンパク質の断片、したがって上記の免疫学的応答を誘発する、タンパク質の断片である。このような断片は、当該技術分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えばEpitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.Jを参照されたい。例えば線状エピトープは、例えばタンパク質分子の様々な部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上に同時に合成し、該ペプチドが支持体上に付着している間にペプチドを抗体と反応させることで決定することができる。このような技術は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第４７０８８７１号明細書；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及びGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715に記載されており、これらの全体を参照により本願に組み込んだものとする。同様に、コンフォメーションエピトープも、例えばＸ線結晶解析及び２次元核磁気共鳴によりアミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することで容易に同定される。例えば前述のEpitope Mapping Protocolsを参照されたい。特にT. parvaのタンパク質に適用可能な方法がＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号明細書に十分に記載されており、その全体を参照により本願に組み込んだものとする。
【００４９】
合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換え又は合成に由来する抗原も定義に含まれる。例えばBergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249；及びSuhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998参照。本発明の目的のためには、免疫原性断片は、通常、該分子の少なくとも約３アミノ酸、好ましくは少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸、最も好ましくは２５又はそれ以上のアミノ酸の分子を含む。断片の長さに決定的な上限はなく、タンパク質配列のほぼ全長、又はタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質を含んでもよい。
【００５０】
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、エピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる。全タンパク質又はポリタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドは、より有利には、全タンパク質又はポリタンパク質をコードする配列の最低２１ヌクレオチド、有利には少なくとも４２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５７、８７又は１５０個の連続又は隣接するヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、或いはからなる。本発明の実施には、過度の実験は必要なく、重複ペプチドライブラリーの作製（Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168）、Pepscan（Geysen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178-182；Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol., 19, 43-47；Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533；Multipin.（登録商標） Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561）、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号パンフレットなどの抗原決定手法を使用することができ、これら全ての全体を参照により本願に組み込んだものとする。本明細書に引用して組み込まれた他の文献も、免疫原又は抗原のエピトープ、及びかかるエピトープをコードする核酸分子の決定方法に参照してもよい。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログの任意の組合せが含まれる。ポリヌクレオチドは、三次元構造を有してもよく、既知の又は未知の機能を発揮してもよい。「ポリヌクレオチド」という用語は、２本鎖分子、１本鎖分子、及び３本鎖らせん分子を含む。特に特定又は要求されない限り、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドの実施形態は、（ｉ）２本鎖型、及び（ii）ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはハイブリッド分子のいずれかの２本鎖型を形成することが知られている又は予測される２つの相補型の各々、の両方を包含する。
【００５２】
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチド、ウラシル、その他の糖類、フルオロリボース及びチオラートなどの連結基、並びにヌクレオチド枝を含んでもよい。ヌクレオチドの配列は重合の後に、標識成分とのコンジュゲート化などでさらに修飾されてもよい。この定義に含まれるその他の種類の修飾としては、キャップ、アナログによる天然ヌクレオチドの１又は複数の置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド、又は固体支持体に結合させる手段の導入を挙げることができる。ポリヌクレオチドは、化学合成によって得てもよく、又は微生物に由来してもよい。
【００５３】
本発明はさらに、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補鎖も含む。相補鎖は重合体であってもよく、どのような長さでもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログを任意の組合せで含んでもよい。
【００５４】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「ポリペプチド断片」とは、アミノ酸残基の任意の長さの重合体を指し、本明細書において相互に置換え可能に使用される。この重合体は線状又は分枝状であってよく、修飾アミノ酸又はアミノ酸アナログを含んでもよく、アミノ酸以外の化学的部分が挿入されていてもよい。これらの用語は、自然に又は介入的に修飾されたアミノ酸重合体をも包含し、そのような修飾としては、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の任意の操作若しくは修飾（例えば標識成分又は生理活性成分とのコンジュゲート化）を挙げることができる。
【００５５】
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、それらが自然環境下で会合している物質を実質的に含まないものである。実質的に含まないとは、少なくとも５０％、有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも８０％、さらにより有利には少なくとも９０％これらの物質を含まないことを意味する。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを上げる条件は周知である。例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition （Sambrook et al. 1989）参照。関連する条件の例として（ストリンジェンシーが高くなる順に）、インキュベーション温度２５℃、３７℃、５０℃，及び６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）及びその他の緩衝系を使用したその同等条件；ホルムアミド濃度０％、２５％、５０％，及び７５％；インキュベーション時間５分〜２４時間；１、２又はそれ以上の洗浄ステップ；洗浄インキュベーション時間１、２又は１５分；並びに洗浄液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ又は脱イオン水を挙げることができる。
【００５７】
本発明はさらに、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドと機能的に同等なバリアント及び誘導体並びにその機能的に同等な断片をコードするポリヌクレオチドを包含し、これは該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの特性を高めるか、低下させるか、又は大きな影響を与えなくてもよい。これらの機能的に同等なバリアント、誘導体及び断片は、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変更しないＤＮＡ配列の変化、及びアミノ酸残基の保存的置換を生じるＤＮＡ配列の変化、１又は数個のアミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換は、コードされるポリペプチドの特性に大きな影響を与えない。保存的なアミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態においては、バリアントは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する。
【００５８】
本発明の目的のためには、配列同一性又は配列相同性は、重複部分及び同一部分を最大化しつつ配列のギャップを最小化するように整列させたときの配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は多数の数学的アルゴリズムのいずれを用いて決定してもよい。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例として、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990；87: 2264-2268のアルゴリズム（Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90: 5873-5877で改変）を挙げることができる。
【００５９】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の例として、Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11-17のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用するときは、ＰＡＭ１２０重み残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用することができる。局所的に配列が類似している領域の特定及びアラインメントに有用なさらに別のアルゴリズムとして、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988；85: 2444-2448に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムがある。
【００６０】
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Washington University BLAST）ソフトウェアのバージョン２．０が、本発明に基づく使用に有利である。各種ＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０の実行可能プログラムがftp ://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロード可能である。このプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４はパブリックドメインのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいている（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990；215: 403-410；Gish & States, 1993；Nature Genetics 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877。これら全ての全体を参照により本明細書に組み込んだものとする）。
【００６１】
一般的に、アミノ酸配列の比較は、構造が既知のポリペプチドのアミノ酸配列と構造が未知のポリペプチドのアミノ酸配列を整列させて行う。次いで、配列中のアミノ酸を比較し、相同なアミノ酸のグループをひとまとめにする。この方法は、ポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸の挿入及び欠失を明らかにする。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いて決定することができる（前述の相同性についての記述も参照されたい）。本明細書中で他で言及しているものに加え、国立バイオテクノロジー情報センターが提供しているプログラムであるＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにも触れておく。これらのプログラムは本目的のために当該技術分野で広く使用されており、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。
【００６２】
これらのプログラム集の全ての検索プログラムにおいて、ギャップ付きアラインメント・ルーチンはデータベース検索自体に不可欠である。所望であれば、ギャップをオフにすることもできる。長さ１のギャップに対するデフォルトのペナルティ（Ｑ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＱ＝９、ＢＬＡＳＴＮではＱ＝１０であるが、これは任意の整数に変更することができる。ギャップの延長に対する残基当たりのデフォルトのペナルティ（Ｒ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＲ＝２、ＢＬＡＳＴＮではＲ＝１０であるが、これも任意の整数に変更することができる。重複部分及び同一部分を最大化しつつ配列ギャップを最小化するように配列を整列させるために、Ｑ及びＲは値の任意の組合せで使用することができる。デフォルトのアミノ酸比較マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭなどのその他のアミノ酸比較マトリックスを利用することもできる。
【００６３】
或いは、又はさらに、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「相同性」又は「同一性」は、２つの配列間の相同性の定量的測定値を指してもよい。パーセント配列相同性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｄｉｆはアラインメント時の２配列中の非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆ は配列の片方に存在する残基の数である。）として計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
【００６４】
或いは、又はさらに、配列に関する「相同性」又は「同一性」は、２つの配列のうち短い方の配列中のヌクレオチド又はアミノ酸数で割った、同一のヌクレオチド又はアミノ酸部位の数を意味してもよく、ここで２つの配列のアラインメントはWilbur and Lipmanのアルゴリズム（Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983；80:726；参照により本明細書に組み込んだものとする）にしたがって、例えば、ウィンドウサイズ＝２０ヌクレオチド、語長＝４ヌクレオチド及びギャップペナルティ＝４を用いて決定することができ、アラインメントを含む配列データのコンピュータ支援分析及び解析は、市販のプログラム（例えば、Intelligenetics（商標）Suite、Intelligenetics Inc.社製、 CA）を使用して適宜行うことができる。ＲＮＡ配列はＤＮＡ配列に類似である、又はある程度の配列同一性又は配列相同性を有するという場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価とみなされる。したがって、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内であり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価とみなすことで、ＤＮＡ配列に由来するものとしてよい。
【００６５】
さらに、当業者であれば、過度の実験をせずに、その他多数のプログラム又は文献を参考にしてパーセント相同性を決定することができる。
【００６６】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター配列及び必要に応じてエンハンサーに作動可能に連結された、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。
【００６７】
「ベクター」とは、インビトロ又はインビボにおいて標的細胞に送達されるべき異種（heterologous）ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡプラスミド又はウイルスを意味する。異種ポリヌクレオチドは、治療目的のための目的とする配列を含んでもよく、必要に応じて発現カセットの形態であってもよい。本明細書において、ベクターは、最終的な標的である細胞又は対象中における複製能を有していなくともよい。ベクターという用語にはクローニングベクターが含まれ、ウイルスベクターも含まれる。
【００６８】
「組換え体」とは、天然には見られない並び方で別のポリヌクレオチドに連結しているポリヌクレオチド又は天然には生じないポリヌクレオチドのいずれかであって、半合成又は合成起源のものを意味する。
【００６９】
「異種」とは、その残りの部分と比較したときに遺伝学的に区別される物体に由来することである。例えば、遺伝子操作技術によって、ポリヌクレオチドを異なる出所（source）に由来するプラスミド又はベクター内に置くことができるが、これは異種ポリヌクレオチドである。あるプロモーターをその天然のコード配列から取り出し、該天然配列以外のコード配列に作動可能に連結すれば、それは異種プロモーターである。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の追加的コード配列などの追加的配列；プロモーターなどの調節エレメント（controlling elements）；リボソーム結合部位；ポリアデニル化部位；同じプロモーター又は異なるプロモーターに制御される追加的な転写単位；クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列；並びに本発明の実施形態を提供するのに望ましいと考えられる任意の構造を含んでもよい。
【００７１】
有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するためのエレメントは、発明的（inventive）ベクター内に存在する。このベクターは最小限、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン及びプロモーター、並びに必要に応じてプラスミドなどの特定のベクター及び特定のウイルスベクター（例えば、ポックスウイルス以外のウイルスベクター）用のポリアデニル化配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片を有利にコードする場合、ベクター内において、ＡＴＧは読み枠の５’側に位置し、終止コドンは３’側に位置する。エンハンサー配列、イントロンなどの安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列など、発現を調節するためのその他のエレメントが存在してもよい。
【００７２】
インビボ又はインビトロのいずれかにおいて本発明の遺伝子の遺伝子産物を発現するためのベクター、組換え体又はプラスミドを作製及び／又は投与する方法は、任意の望ましい方法であってよく、例えば米国特許第４６０３１１２号明細書；同第４７６９３３０号明細書；同第４３９４４４８号明細書；同第４７２２８４８号明細書；同第４７４５０５１号明細書；同第４７６９３３１号明細書；同第４９４５０５０号明細書；同第５４９４８０７号明細書；同第５５１４３７５号明細書；同第５７４４１４０号明細書；同第５７４４１４１号明細書；同第５７５６１０３号明細書；同第５７６２９３８号明細書；同第５７６６５９９号明細書；同第５９９００９１号明細書；同第５１７４９９３号明細書；同第５５０５９４１号明細書；同第５３３８６８３号明細書；同第５４９４８０７号明細書；同第５５９１６３９号明細書；同第５５８９４６６号明細書；同第５６７７１７８号明細書；同第５５９１４３９号明細書；同第５５５２１４３号明細書；同第５５８０８５９号明細書；同第６１３００６６号明細書；同第６００４７７７号明細書；同第６１３００６６号明細書；同第６４９７８８３号明細書；同第６４６４９８４号明細書；同第６４５１７７０号明細書；同第６３９１３１４号明細書；同第６３８７３７６号明細書；同第６３７６４７３号明細書；同第６３６８６０３号明細書；同第６３４８１９６号明細書；同第６３０６４００号明細書；同第６２２８８４６号明細書；同第６２２１３６２号明細書；同第６２１７８８３号明細書；同第６２０７１６６号明細書；同第６２０７１６５号明細書；同第６１５９４７７号明細書；同第６１５３１９９号明細書；同第６０９０３９３号明細書；同第６０７４６４９号明細書；同第６０４５８０３号明細書；同第６０３３６７０号明細書；同第６４８５７２９号明細書；同第６１０３５２６号明細書；同第６２２４８８２号明細書；同第６３１２６８２号明細書；同第６３４８４５０号明細書及び同第６３１２６８３号明細書；１９８６年１０月１６日提出の米国特許出願第９２０１９７号明細書；国際公開第９０／０１５４３号パンフレット；同第９１／１１５２５号パンフレット；同第９４／１６７１６号パンフレット；同第９６／３９４９１号パンフレット；同第９８／３３５１０号パンフレット；欧州特許第２６５７８５号明細書及び同第０３７０５７３号明細書；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993;4:3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994;269:2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11371-11377；Graham, Tibtech 1990;8:85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992;3:237-52；Ju et al., Diabetologia 1998;41:736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991;65:3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984;4:399-406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995;39, “Baculovirus Expression Protocols,”Humana Press Inc.；Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997;9:271及びRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11307-11312に開示されている方法若しくはこれらに引用されている文献に開示されている方法又はその類似の方法がある。したがって、本発明におけるベクターは、（参照により本明細書に組み込んだものとする文献にあるように）ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニア−アンカラ（modified vaccinia-Ankara）、トリポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、ブタポックスウイルス等）、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、イヌヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルス等の任意の好適な組換えウイルス又はウイルスベクターであってよく、或いはベクターはプラスミドであってもよい。本明細書に引用した文献及び参照により本明細書に組み込んだものとする文献は、本発明の実施に有用なベクターの例を提供するだけでなく、本発明の組成物中の、すなわち本発明の組成物に含まれる１又は複数のベクターに発現されるべき目的とする非抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチド、又はその断片の出所も提供する。
【００７３】
本発明はまた、発現ベクターなどのベクターを含む調製物、例えば治療用組成物にも関する。調製物は、１又は複数の目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる（有利には、発現する）１又は複数のベクター（例えばインビボの発現ベクターなどの発現ベクター）を含むか、から本質的になるか、又はからなるものであってよい。有利には、薬学的に許容される担体、賦形剤又は媒体中において、ベクターは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードする（有利には、発現する）ポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドを含み、これを発現する。したがって、本発明の実施形態によれば、調製物中のその他の１又は複数のベクターは、１又は複数のその他の目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドのタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなり、このベクターは適当な環境下でこれらの１又は複数を発現する。
【００７４】
別の実施形態によれば、調製物中の１又は複数のベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドであるタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなり、この１又は複数のベクターは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現する。有利には、発明的調製物は、少なくとも２つのベクターを含むか、から本質的になるか、又はからなり、該ベクターは、他に由来する同一のタンパク質及び／又は異なるタンパク質（proteins）をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる（さらに、有利には、これらを適切な条件下、好適な条件下、又は好適な宿主細胞内で、有利にはインビボで、発現する）が、有利には、同一の、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチド、又は融合タンパク質をコードし、有利にはインビボで発現するポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる１又は複数のベクターを含む調製物。また、本発明は、異なる目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコード及び発現するポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなるベクターの混合物にも関する。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターはウイルスベクター、特にインビボ用の発現ベクターである。有利な実施形態において、発現ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、例えば、米国特許第７０２２５１９号明細書；同第７０１５０２６号明細書；同第６９９５００６号明細書；同第６９８９２６４号明細書；同第６９８４５１７号明細書；同第６９７９５３９号明細書；同第６９６７０１８号明細書；同第６９５３６９０号明細書；同第６９５１７５８号明細書；同第６９５１７５３号明細書；同第６９４６１２６号明細書；同第６９４３０１９号明細書；同第６９３６５９５号明細書；同第６９３６４６６号明細書；同第６９３６２４３号明細書；同第６９３３３７３号明細書；同第６９３３１５０号明細書；同第６９３３１１３号明細書；同第６９２７２８１号明細書；同第６９２４１２８号明細書；同第６８９７０６３号明細書；同第６８９３８６５号明細書；同第６８８７４６３号明細書；同第６８５５３１４号明細書；同第６８４６６６５号明細書；同第６８４１３５７号明細書；同第６８３５４０９号明細書；同第６８２１７７５号明細書；同第６８０５０７３号明細書；同第６７９７７０２号明細書；同第６７９７５０５号明細書；同第６７９３９２６号明細書；同第６７８０６３９号明細書；同第６７８０４０９号明細書；同第６７７７１８５号明細書；同第６７６４８４５号明細書；同第６７５９５１８号明細書；同第６７５９２３７号明細書；同第６７５９０５０号明細書；同第６７４３４２３号明細書；同第６７３３７５７号明細書；同第６７２３５５８号明細書；同第６７２３５５１号明細書；同第６７２３５１２号明細書；同第６７１００３６号明細書；同第６７０３２３７号明細書；同第６６８６２００号明細書；同第６６７７１５５号明細書；同第６６６０５２１号明細書；同第６６５６７２７号明細書；同第６６４９５９７号明細書；同第６６４２０５１号明細書；同第６６３２６７０号明細書；同第６６２７６１７号明細書；同第６６１０２９０号明細書；同第６６０７８８２号明細書；同第６５９９６９２号明細書；同第６５９６５３５号明細書；同第６５９３１２４号明細書；同第６５９３１２３号明細書；同第６５９３１０５号明細書；同第６５８９５２３号明細書；同第６５８６２０８号明細書；同第６５８２６９２号明細書；同第６５６６１１８号明細書；同第６５５８９４８号明細書；同第６５４８２８６号明細書；同第６５４１２５８号明細書；同第６５４１０１２号明細書；同第６５３４２６１号明細書；同第６５２１４２６号明細書；同第６５２１２２５号明細書；同第６５０９１５０号明細書；同第６５０６６００号明細書；同第６５０６３７９号明細書；同第６５０３８８８号明細書；同第６５０３８８７号明細書；同第６５０３７１７号明細書；同第６４９８２４４号明細書；同第６４９１９０７号明細書；同第６４８５９６６号明細書；同第６４８２６３４号明細書；同第６４８２６３３号明細書；同第６４７５７６９号明細書；同第６４６８７７１号明細書；同第６４６８５２４号明細書；同第６４５８５８７号明細書；同第６４５１５９４号明細書；同第６４４８０７４号明細書；同第６４４０７４２号明細書；同第６４３６７０８号明細書；同第６４２９００１号明細書；同第６４２８９８８号明細書；同第６４１６９９２号明細書；同第６４１０３００号明細書；同第６３９１８５８号明細書；同第６３８７６７０号明細書；同第６３８７３６８号明細書；同第６３８３７９４号明細書；同第６３７６２３７号明細書；同第６３６５４０３号明細書；同第６３４６４１５号明細書；同第６３３５０１１号明細書；同第６３２９１８１号明細書；同第６３２５９９８号明細書；同第６３１２９５７号明細書；同第６３０６６５０号明細書；同第６３０３３７１号明細書；同第６３０２６８５号明細書；同第６２９４３７９号明細書；同第６２９４３７０号明細書；同第６２８７８５７号明細書；同第６２７４３５４号明細書；同第６２７０９９６号明細書；同第６２６１８３４号明細書；同第６２６１５５１号明細書；同第６２５８５９５号明細書；同第６２５１６７７号明細書；同第６２４２４２６号明細書；同第６２３２１０５号明細書；同第６２２５１１３号明細書；同第６２２１６４６号明細書；同第６２１１１６３号明細書；同第６２０７４５７号明細書；同第６２０７４５３号明細書；同第６１７１５９７号明細書；同第６１６２７９６号明細書；同第６１５６３０３号明細書；同第６１４３５４８号明細書；同第６１１７６８０号明細書；同第６１１０４５６号明細書；同第６０９３５７０号明細書；同第６０５７１５２号明細書；同第６０４０１８３号明細書；同第６０４０１７２号明細書；同第６０３７１７７号明細書；同第６０３３８８５号明細書；同第６０２７９３１号明細書；同第６０２０１９２号明細書；同第６００４７９７号明細書；同第６００１６５０号明細書；同第５９７６８５３号明細書；同第５９６５４４１号明細書；同第５９６２４２４号明細書；同第５９６２３１３号明細書；同第５９５８７６８号明細書；同第５９４５３３５号明細書；同第５９４２４９６号明細書；同第５９４０５３０号明細書；同第５９３９５３８号明細書；同第５９２８９４３号明細書；同第５８７４５５６号明細書；同第５８７４３０４号明細書；同第５８７１９８２号明細書；同第５８６９３０５号明細書；同第５８６９２３０号明細書；同第５８６６５５２号明細書；同第５８６３５４１号明細書；同第５８５８３５１号明細書；同第５８５６１５２号明細書；同第５８４６５４６号明細書；同第５８４６５２８号明細書；同第５８３７４８４号明細書；同第５８３４４４０号明細書；同第５７８９３９０号明細書；同第５７８０２８０号明細書；同第５７７３２８９号明細書；同第５７６３４１６号明細書；同第５７５６２８３号明細書；同第５７５３５００号明細書；同第５７４１６８３号明細書；同第５６９１１７６号明細書；同第５６８８６７６号明細書；同第５６８８６７５号明細書；同第５６８１７３１号明細書；同第５６７７１５８号明細書；同第５６５８７７６号明細書；同第５６５０３０９号明細書；同第５６４６０３４号明細書；同第５６２２８５６号明細書；同第５６０４０９０号明細書；同第５４７８７４５号明細書；同第５４７４９３５号明細書；同第５４３６１４６号明細書；同第５４１６０１７号明細書；同第５３５４６７８号明細書；同第５２５２４７９号明細書；同第５１７３４１４号明細書；同第５１５５４６８号明細書；同第５１３９９４１号明細書；同第４７９７３６８号明細書及び同第４５５９７１３号明細書に開示されている。
【００７６】
それより好ましくない実施形態では、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスはヒトＡｄ５ベクター、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失アデノウイルスであってよい。
【００７７】
それらの組換え体を作製する方法及びその組換え体の投与方法に関する情報について、当業者は本明細書に引用されている文献及び国際公開第９０／１２８８２号パンフレットを参照することができる。例えば、ワクシニアウイルスについては、とりわけ米国特許第４７６９３３０号明細書、同第４７２２８４８号明細書、同第４６０３１１２号明細書、同第５１１０５８７号明細書、同第５４９４８０７号明細書及び同第５７６２９３８号明細書；鶏痘については、とりわけ米国特許第５１７４９９３号明細書、同第５５０５９４１号明細書及び同米国特許第５７６６５９９明細書；カナリア痘については、とりわけ米国特許第５７５６１０３号明細書；ブタポックスについては、とりわけ米国特許第第５３８２４２５号明細書；ラクーンポックスについては、とりわけ国際公開第００／０３０３０号パンフレットを挙げることができる。
【００７８】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現されるべき１又は複数のポリヌクレオチドのための１又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又はその挿入部位、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子又はその挿入部位、Ａ型封入体（ＡＴＩ）をコードする領域である。本明細書に引用されている文献、特にワクシニアウイルスに関する文献も参照されたい。カナリア痘の場合、有利には、１又は複数の挿入部位はＯＲＦのＣ３、Ｃ５及び／又はＣ６である。本明細書に引用されている文献、特にカナリア痘ウイルスに関する文献も参照されたい。鶏痘の場合、１又は複数の挿入部位はＯＲＦのＦ７及び／又はＦ８である。本明細書に引用されている文献、特に鶏痘ウイルスに関する文献も参照されたい。ＭＶＡウイルス領域の１又は複数の挿入部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040等の様々な刊行物に見つかるものであり、またこの点に関連して、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396にＭＶＡの全ゲノムが記載されており、これから当業者であれば他の挿入部位又は他のプロモーターを使用することができる。
【００７９】
有利には、発現されるべきポリヌクレオチドはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの調節下に挿入される。ＣＭＶプロモーターは、最小限のプロモーター又は全長プロモーターであってよい（例えば、米国特許第６３６８８２５号明細書参照）。いくつかの有利な実施形態においては、ＣＭＶプロモーターは、より大きな遺伝的アジュバントをベクター中にクローニングすることを可能にする短縮又は切断されたプロモーターである。
【００８０】
有利には、発現されるべきポリヌクレオチドは、特定のポックスウイルスプロモーター、例えばとりわけワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の調節下に挿入される。
【００８１】
特に好ましい実施形態においては、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス（ＨＡＶ）又はイヌアデノウイルス（ＣＡＶ）などのアデノウイルスである。
【００８２】
一実施形態においては、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス、特に血清型が５型のアデノウイルスであって、ウイルスゲノム中のＥ１領域、特にGenbankアクセッション番号Ｍ７３２６０及び参照されている刊行物J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285で開示されているｈＡｄ５の配列のヌクレオチド番号約４５９〜約３５１０の欠失により複製不能にされたものである。この欠失アデノウイルスは、Ｅ１発現２９３（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞、特にＰＥＲ．Ｃ６（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）中で増殖する。このヒトアデノウイルスはＥ３領域、特にヌクレオチド番号約２８５９２〜約３０４７０に欠失があってもよい。Ｅ１領域内の欠失は、Ｅ３領域内の欠失と組み合わされてもよい（例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335；F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許第６１３３０２８号明細書；同第６６９２９５６号明細書；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810参照）。挿入部位は最終的には、Ｅ１及び／又はＥ３領域を一部又は全部欠失させた後のＥ１及び／又はＥ３座（領域）であってよい。有利には、発現ベクターがアデノウイルスである場合、発現されるべきポリヌクレオチドは、強力なプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）、特にM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530のヌクレオチド番号約−７３４〜約＋７のエンハンサー／プロモーター領域又はPromega Corp.社製のｐＣＩベクターのエンハンサー／プロモーター領域などの、真核細胞中で機能するプロモーターの調節下に挿入される。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはマウス又はヒト起源である。伸長因子１αのプロモーターを使用することもできる。筋肉特異的プロモーターを使用することもできる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。強力なプロモーターは、本明細書中でプラスミドベクターとの関連でも記載している。一実施形態においては、スプライシング配列がエンハンサー／プロモーター領域の下流にあってもよい。例えば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離されたイントロン１（R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギ又はヒトのβグロビン遺伝子から単離されたイントロン、特にｂグロビン遺伝子のイントロン２、免疫グロブリン遺伝子から単離されたイントロン、ＳＶ４０初期遺伝子のスプライシング配列、又はマウス免疫グロブリン受容配列（Genbankアクセッション番号ＣＶＵ４７１２０のヌクレオチド番号約８９０〜約１０２２）と融合したヒトβグロビン遺伝子のドナー配列を含むPromege Corp.社製のｐＣＩベクターから単離されるキメライントロン配列。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子（特にGenbankアクセッション番号ＢＯＶＧＨＲＨのヌクレオチド番号約２３３９〜２５５０）、ウサギβグロビン遺伝子又はＳＶ４０後期遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８３】
別の実施形態においては、ウイルスベクターはイヌアデノウイルス、特にＣＡＶ−２である（例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５５２９７８０号明細書；同第５６８８９２０号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第９５／１４１０２号パンフレット参照）。ＣＡＶでは、挿入部位はＥ３領域内にあってもよく、及び／又はＥ４領域と右側ＩＴＲ領域の間の領域にあってもよい（米国特許第６０９０３９３号明細書及び同第６１５６５６７号明細書参照）。一実施形態においては、インサートは、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）又はヒトアデノウイルスベクター用の既に記載したプロモーターなどのプロモーターの調節下にあってもよい。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８４】
別の特定の実施形態においては、ウイルスベクターはイヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）又はネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）などのヘルペスウイルスである。ＣＨＶでは、挿入部位は、特にチミジンキナーゼ遺伝子内、ＯＲＦ３内、又はＵＬ４３ＯＲＦ内であってよい（米国特許第６１５９４７７号明細書参照）。一実施形態においては、発現すべきポリヌクレオチドを、真核細胞中で機能するプロモーター、有利にはＣＭＶ−ＩＥプロモーター（マウス又はヒト）の調節下に挿入してもよい。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、発現ベクターはプラスミドベクター又はＤＮＡプラスミドベクター、特にインビボ用の発現ベクターである。非制限的な具体例においては、ｐＶＲ１０２０又は１０１２プラスミド（VICAL Inc.；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217、例えば、米国特許第５８４６９４６号明細書及び同第６４５１７６９号明細書参照）を、ポリヌクレオチド配列挿入用のベクターとして利用することができる。ｐＶＲ１０２０プラスミドはｐＶＲ１０１２に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含む。一実施形態においては、ヒトｔＰＡシグナルはGenbankアクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４のアミノ酸Ｍ（１）〜アミノ酸Ｓ（２３）を含む。別の非制限的な具体例においては、ポリヌクレオチド配列挿入用のベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankアクセッション番号Ｕ２８０７０のウマＩＧＦ１のアミノ酸Ｍ（２４）〜アミノ酸Ａ（４８）のシグナルペプチド配列を含んでもよい。実施の際に参考又は利用することができるＤＮＡプラスミドについてのさらなる情報は、例えば米国特許第６８５２７０５号明細書；同第６８１８６２８号明細書；同第６５８６４１２号明細書；同第６５７６２４３号明細書；同第６５５８６７４号明細書；同第６４６４９８４号明細書；同第６４５１７７０号明細書；同第６３７６４７３号明細書及び同第６２２１３６２号明細書に見つかる。
【００８６】
プラスミドという用語は、本発明に基づくポリヌクレオチドと望ましい宿主又は標的の１又は複数の細胞内におけるインビボの発現に必要なエレメントとを含むあらゆるＤＮＡ転写単位を包含し、この点に関連し、線状プラスミドのみならず、スーパーコイル、非スーパーコイル、環状プラスミドも本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８７】
さらに、プラスミドはそれぞれ、プロモーターに作動可能に連結されているか又はプロモーターの調節下にあるか又はプロモーターに依存する、異種ペプチド配列、バリアント、アナログ又は断片と融合していてもよい目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になる。一般的に、真核細胞内で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト若しくはマウス起源、又は場合によってラット若しくはモルモットなどの別の起源であってもよい、前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサー部分と関連があってもなくてもよい実際のプロモーター部分を含んでよい。ＰＣＴ出願国際公開第８７／０３９０５号パンフレットを初めとして、欧州特許出願公開第２６０１４８（Ａ）号明細書、同第３２３５９７（Ａ）号明細書、米国特許第５１６８０６２号明細書、同第５３８５８３９号明細書及び同第４９６８６１５号明細書を参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はマウスＣＭＶ−ＩＥである。
【００８８】
より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源又は細胞起源のいずれかである。本発明の実施に利用して有用であり得るＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施に利用して有用であり得る強力な細胞プロモーターは、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）などの細胞骨格遺伝子のプロモーターである。
【００８９】
これらのプロモーターの機能的サブ断片、すなわち適切な促進活性を維持しているこれらのプロモーターの部分は本発明に含まれ、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第９８／００１６６号パンフレット又は米国特許第６１５６５６７号明細書に基づく切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターを本発明の実施に使用することができる。したがって、本発明の実施におけるプロモーターには、全長プロモーターの誘導体及びサブ断片であって適切な促進活性を有するもの、したがってプロモーターとして機能するものが含まれ、好ましくは促進活性はこれらの誘導体又はサブ断片が由来する実際の又は全長のプロモーターの促進活性と実質的に類似の促進活性である（例えば、全長ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に対する米国特許第６１５６５６７号明細書の切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性と同様）。したがって、本発明の実施におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、全長プロモーターのプロモーター部分及び／又は全長プロモーターのエンハンサー部分、並びに誘導体及びサブ断片を含むか、から本質的になるか、又はからなってよい。
【００９０】
プラスミドは、他の発現調節エレメント（expression control element）を含むか又はから本質的になることが好ましい。例えばイントロン配列、好ましくはhＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願国際公開第８９／０１０３６号パンフレット）、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）などの安定化配列の組込みが特に有利である。
【００９１】
ポックスウイルス以外のウイルスベクター及びプラスミドのためのポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５１２２４５８号明細書参照）、又はウサギβグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル又はＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルを使用することができる。
【００９２】
本発明の別の実施形態によれば、発現ベクターは、適切な細胞系でタンパク質をインビトロで発現させるために使用される発現ベクターである。発現されたタンパク質は、分泌後（又は分泌後でなくても）、培養液上清中に、又は培養液上清から回収することができ（分泌が起こらない場合は通常、細胞溶解が起こるか又は細胞溶解を行う）、必要に応じて限外ろ過などの濃縮方法で濃縮し、かつ／又はアフィニティー、イオン交換又はゲルろ過クロマトグラフィー法などの精製手段で精製する。
【００９３】
「宿主細胞」とは、遺伝子を改変された原核細胞又は真核細胞、或いは組換えプラスミドやベクターなどの外来性ポリヌクレオチドを投与することでその遺伝子を改変することができる原核細胞又は真核細胞を意味する。遺伝子改変細胞という場合、この用語は、最初に改変された細胞とその子孫の両方を意味する。有利な宿主細胞としては特に限定されないが、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、結腸癌（Ｃａｃｏ−２）細胞、ＣＯＳ７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）系統、ミンク肺（Ｍｖ１Ｌｕ）細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｕ９３７細胞、ＶＥＲＯ細胞等を挙げることができる。所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なクローニングベクター又は発現ベクターに挿入してもよく、次いでベクターを複製又は増幅に適した宿主細胞に導入してもよい。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段で宿主細胞に導入することができる。目的とするポリヌクレオチドを含むベクターは、多くの適切な手段のいずれかを用いて宿主細胞に導入することができ、そのような手段としては、直接的取込み；エンドサイトーシス；トランスフェクション；ｆ接合（f-mating）；エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又は他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；感染（ベクターが感染性であれば、例えばレトロウイルスベクター）等を挙げることができる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は宿主細胞の特徴に拠ることが多い。
【００９４】
有利な実施形態においては、本発明は、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを標的細胞内に送達し、発現させるための治療有効量の製剤の投与を提供する。治療有効量を決定することは当業者の日常的な実験に過ぎない。一実施形態において、製剤は、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターと薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む。有利な実施形態において、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、トランスフェクションを促進し、かつ／又はベクター若しくはタンパク質の保存性を向上させる。
【００９５】
薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、当該技術分野において当業者に周知である。例えば、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、０．９％ＮａＣｌ（例えば、生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であってよい。本発明の方法に使用することができるその他の薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は特に限定されるものではないが、例えばポリ−（Ｌ−グルタメート）又はポリビニルピロリドンを挙げることができる。薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、ベクター（又はインビトロで発明的ベクターから発現されたタンパク質）の投与を容易化するものであれば任意の化合物又は化合物の組合せであってよく、有利には、担体、媒体又は賦形剤はトランスフェクションを容易化し、かつ／又はベクター（又はタンパク質）の保存性を向上させるものであってよい。投与量及び投与体積は、本明細書に一般的な記述で開示されており、当該技術分野の知識と併せてこの開示を読むことで、当業者は過度の実験をせずとも投与量及び投与体積を決定することができる。
【００９６】
抗原は、標準的な賦形剤と組み合わせてもよく、そのような賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩等を挙げることができる。組成物は、ｐＨ調整・緩衝剤、毒性調節剤等、生理学的状態に近づけるために必要な薬学的に許容される補助剤を含んでもよい（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等）。これらの製剤中の抗原の濃度は広い範囲で変更することができ、選択する特定の投与形態及び患者のニーズによって、基本的に液体の体積、粘度、体重等に基づいて選択される。その結果得られる組成物の形態は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、ゲル、クリーム、ローション剤、軟膏、噴霧剤等であってよい。
【００９７】
医薬製剤中の本発明の免疫原性抗原の濃度は、広い範囲で変更することができる、すなわち、重量で約０．１％未満、通常約２％若しくは少なくとも約２％から、多ければ２０％〜５０％、又はそれ以上であり、選択する特定の投与形態によって、基本的には液体の体積、粘度等に基づいて選択される。
【００９８】
有利には、本発明の医薬及び／又は治療用の、組成物及び／又は製剤は、本明細書に記載の１又は複数の発現ベクター及び／又はポリペプチドの治療反応を誘発するのに有効な量含むか、から本質的になるか、又はからなる。有効量は、本明細書に組み込まれている文献及び当該技術分野の知識を含む本開示から、過度な実験なしに決定することができる。
【００９９】
プラスミドベクターに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物の場合、投与量は一般的に、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現する、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ及びさらに有利には約１００μｇ〜約８００μｇのプラスミドを含むか、から本質的になるか、又はからなってもよい。プラスミドベクターに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物をエレクトロポレーションを用いて投与する場合、プラスミドの投与量は通常、約０．１μｇ〜１ｍｇ、有利には約１μｇ〜１００μｇ、有利には約２μｇ〜５０μｇである。投与体積は約０．１〜約２ｍｌ、有利には約０．２〜約１ｍｌであってよい。これらの投与量及び投与体積は、イヌ及びその他の哺乳動物（例えばウマ及びネコ）を標的種とした治療に適している。
【０１００】
治療組成物及び／又は医薬組成物は、遺伝的アジュバント及び／又は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドを発現する組換えウイルス（有利にはＡＡＶ）を、投与量当たり約１０４〜約１０１１、有利には約１０５〜約１０１０、さらに有利には約１０６〜約１０９個のウイルス粒子を含む。ポックスウイルスに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物の場合、投与量は約１０２ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕであってよい。医薬組成物は、遺伝的アジュバント及び／又は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドを発現するポックスウイルス組換え体又はヘルペスウイルス組換え体を、投与量当たり約１０５〜１０９、有利には約１０６〜１０８ｐｆｕ含む。
【０１０１】
哺乳動物を標的種とする組成物の投与量体積、例えばウイルスベクターに基づくイヌ用組成物（例えば、非ポックスウイルス型ウイルスベクターに基づく組成物）の投与量体積は、通常約０．１〜約２．０ｍｌ、好ましくは約０．１〜約１．０ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌである。
【０１０２】
新たな細胞培養で産生されたウイルス又は生物又は病原体の不活化組成物については、単回投与単位として約１０４〜１０９等量のＣＣＩＤ５０（不活化前のタイター）、有利には約１０５〜１０８等量のＣＣＩＤ５０で動物に投与することができる。単回投与単位の体積は０．２ｍｌ〜５．０ｍｌ、有利には０．５ｍｌ〜２．０ｍｌ、さらに有利には約２．０ｍｌであってよい。単回投与と複数回投与が可能であり、例えば２〜４週間の間隔を空けて２回注入してもよく、有利には最初の注入から約３週間後に追加免疫してもよい。
【０１０３】
本明細書の開示は例として提供するものであり、本発明がこれらの例に限定されないことが当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当該技術分野の知識から、当業者であれば、各種注入プロトコールで使用される投与回数、投与経路、および投与量を、過度の実験なしに決定することができる。
【０１０４】
本発明の一実施形態は、免疫応答の誘発に有効な量の組換えワクチンの送達及び発現のための製剤を投与することを含む、免疫応答を動物で誘発する方法である。本発明のさらに別の実施形態は、免疫学的応答又は防御反応を動物において誘導する方法であり、該方法は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチド及び遺伝的アジュバントの送達及び発現のための製剤であって、組換えワクチン及び薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤を動物に有効量投与することを含む。
【０１０５】
本発明は、動物、有利にはヒトの免疫応答を誘発、誘導、又は刺激する方法に関する。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、組換えワクチンと動物において免疫応答を誘発するのに有効な量を送達する方法を実施するための説明書とを含む、動物において免疫学的応答又は防御反応を誘導する方法を実施するためのキットである。
【０１０７】
本発明を、以下に非限定的な実施例を用いてさらに詳細に記載する。
［実施例］
【０１０８】
［実施例１］
分子的アジュバントによるＡＡＶベクターのアジュバント化
以下の分子的アジュバントを、ＳＩＶのｇａｇ抗原を共発現するＡＡＶ１ベクター中にクローニングし、発現させる：ＩＬ−２、ＩＬ−１２、フラジェリン最小ＴＬＲ４結合ドメイン（Flagellin minimal TLR4 binding domain）、ＣＴＡ１−ＤＤ、及びｆａｓ抗原の一バージョン（a version of fas antigen）。フラジェリンの場合、フラジェリン及びＳＩＶ ｇａｇ抗原の融合コンストラクトを発現させる。コンストラクトはそれぞれ、マウスにおける発現、アジュバント機能、ベクターの産生及び免疫応答について評価する。さらに、ＳＩＶ ｅｎｖ抗原を発現するＡＡＶ１ベクターと組み合わせてベクターを与えたときの、非ヒト霊長類におけるベクターの免疫原性及び効果について特徴解析を行う。ＩＬ−２及びＣＴＡ１−ＤＤ配列を最適化し、ＩＬ−２を発現するベクターを構築し、その特徴を解析する。
【０１０９】
［実施例２］
モデル非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるアジュバント評価実験の概要
暴露前の時点（pre-challenge time points）における免疫原性の免疫学的分析（図２）並びに様々なベクターによって誘発された免疫応答の幅、特異性、記憶表現型（memory phenotype）及び機能に焦点を当てた特徴解析を行う。
【０１１０】
表現型、テトラマー（Ａ＊０１．．．等）、ＢＡＬ分析などのフレッシュな分析（fresh analysis）のための時点が利用可能である。暴露前の時点のほとんどで、保管及びレトロスペクティブ解析用にバイアルを凍結する。
【０１１１】
マカクの好ましい暴露モデルは、低投与量での反復粘膜暴露である。有効性の評価は、ウイルス負荷分析及び反応により生成される特異的ワクチンの低レベルモニタリングによって行われる。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
［実施例３］
ＡＡＶアジュバント化ベクターのデザイン
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現するｒＡＡＶベクターのプロトタイプを図３に示す。分子的アジュバントを、最大１．１ｋｂのサイズのＡｆｅ１断片としてベクター中にクローニングする。ＣＭＶカセットが切断されている場合、より大きなアジュバントを導入することができる。これにより得られる、ｒＡＡＶベクターにより発現されるポリタンパク質は、ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ、口蹄疫（ＦＭＤＶ）ウイルス２Ａペプチド及び分子的アジュバントを含む。
【０１１４】
ＦＭＤＶ ２ＡペプチドはＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及び分子的アジュバントのｃｉｓ開裂を仲介する（例えばFurler et al., Gene Ther. 2001 Jun;8(11):864-73参照）。ＦＭＤＶ ２Ａプロテアーゼは、例えば、米国特許第６８９６８８１号明細書；同第６８９３８６６号明細書；同第６８８４６２３号明細書；同第６６３２８００号明細書；同第６５８６４１１号明細書；同第６５３１１３６号明細書；同第６２３２０９９号明細書及び同第６１７１５９２号明細書にも開示されている。
【０１１５】
［実施例４］
ＡＡＶベクター中のインターロイキンアジュバントの発現
ＩＬ−１２コンストラクトは短縮されたＣＭＶプロモーターを含み、ＡＡＶベクターに導入することができる。ＩＬ−１２アジュバントは約１７４３ｂｐであるが、短縮されたＣＭＶプロモーターと一緒にＡＡＶベクター中に導入することができる。
【０１１６】
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現する親ベクタークローンを、遺伝的アジュバントＩＬ−２を発現するクローンと共に図４Ａに示す。得られる、ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏとアカゲザルＩＬ−２とを発現するポリタンパク質も図４Ａに示す。ＩＬ−１２コンストラクトは短縮されたＣＭＶプロモーターを含み、ＡＡＶベクターに導入することができる。
【０１１７】
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及びＩＬ−２の発現を示すウェスタンブロットを図４Ｂに示す。
【０１１８】
アカゲザルＩＬ−１２を含むＳＩＶアジュバントコンストラクトの一過性のトランスフェクションを図５Ａ及び５Ｂに示す。コンストラクトを図５Ａに示す。ｇａｇ及びＩＬ−１２の発現を示すウェスタンブロットを図５Ｂに示す。
【０１１９】
［実施例５］
ＡＡＶベクター中のフラジェリンアジュバントの発現
フラジェリンコンストラクトは、融合タンパク質がＳＩＶ／ＨＩＶ配列とフラジェリン配列で作製されるため、ＦＭＤＶ ２Ａ開裂部位を有していない。ＳＩＶ ｐｒｏ遺伝子を含まない別のフラジェリンコンストラクトも想定される。
【０１２０】
フラジェリン−ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ融合ベクターのクローニング戦略を図６Ａに示す。作製されたクローン及び予測される前駆体タンパク質を図６Ｂに示す。ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを図６Ｃに示す。
【０１２１】
別のフラジェリンコンストラクトを図７Ａに示す。トランスフェクションされた細胞内におけるｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを図７Ｂに示す。
【０１２２】
［実施例５］
ＡＡＶベクター内のＣＴＡ１−ＤＤアジュバントの発現
インビトロにおけるＣＴＡ１−ＤＤの発現を図８Ａ及び８Ｂに示す。ＣＴＡ１−ＤＤコンストラクトを図８Ａに示す。ＣＴＡ１−ＤＤの発現を示すウェスタンブロットを図８Ｂに示す。
【０１２３】
本発明を、以下の番号を付したパラグラフにさらに記載する。
【０１２４】
１．ウイルスベクターを含む免疫原性又はワクチン組成物であって、該ベクターが遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組成物。
【０１２５】
２．ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、パラグラフ１に記載の組成物。
【０１２６】
３．遺伝的アジュバントがＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓリガンド、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２である、パラグラフ１又は２に記載の組成物。
【０１２７】
４．ウイルスベクターが、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の組成物。
【０１２８】
５．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ４に記載の組成物。
【０１２９】
６．目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ５に記載の組成物。
【０１３０】
７．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド、又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【０１３１】
８．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、パラグラフ１−３のいずれかに記載の組成物と、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【０１３２】
９．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ８に記載の製剤。
【０１３３】
１０．目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ９に記載の製剤。
【０１３４】
１１．動物において免疫応答を刺激する方法であって、パラグラフ７〜１０のいずれかに記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【０１３５】
１２．動物において免疫応答を誘発する方法であって、パラグラフ７〜１０のいずれかに記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【０１３６】
１３．動物がヒトである、パラグラフ１１又は１２に記載の方法。
【０１３７】
１４．パラグラフ１１〜１３の方法のいずれかを実施するためのキットであって、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載の組成物又は製剤とパラグラフ１１〜１３のいずれかに記載の方法を実施するための説明書とを含むキット。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態を詳細に記載してきたが、上記パラグラフにより定義される本発明は、上述の特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく多くの明白な変更が可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＡＡＶベクターを用いたＨＩＶワクチンに対する免疫応答への分子的アジュバントの効果を示す図である。
【図２】サンプリング並びに免疫応答及びその有効性の評価を示す図である。
【図３】代表的なＡＡＶアジュバント化ベクターのデザインを示す図である。
【図４Ａ】ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現する親ベクタークローン、遺伝的アジュバントＩＬ−２を発現するクローン、及びＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏとＩＬ−２とを発現するポリタンパク質を示す図である。
【図４Ｂ】ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及びＩＬ−２の発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】アカゲザルＩＬ−１２を含むＳＩＶアジュバントコンストラクトを示す図である。
【図５Ｂ】ｇａｇ及びＩＬ−１２の発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ａ】フラジェリン−ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ融合ベクターのためのクローニング戦略を示す図である。
【図６Ｂ】作製されたクローン及び予測される前駆体タンパク質を示す図である。
【図６Ｃ】ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図７Ａ】別のフラジェリンコンストラクトを示す図である。
【図７Ｂ】ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図８Ａ】ＣＴＡ１−ＤＤコンストラクトを示す図である。
【図８Ｂ】ＣＴＡ１−ＤＤの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の説明］
本願は、２００６年４月２６付の米国仮特許出願第６０／７９５０９７号に優先権を主張するものである。
【０００２】
上記出願、及び該出願中の全ての引用文献又はその審査中に引用された全ての文献（「出願引用文献」）、及び出願引用文献中で引用又は参照されている全ての文献、及び本明細書中で引用又は参照されている全ての文献（本明細書引用文献）、及び本明細書引用文献中で引用又は参照されている全ての文献、本明細書中又は参照により本明細書に組み込まれている文献中で言及されている全ての製品についてのメーカーの説明書、記述、仕様書、製品シートを参照により本願に組み込み、これらは本発明を実施するために使用してもよい。
【０００３】
本発明は、広義にはウイルスワクチン及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明はベクター（有利にはウイルスベクター）中の遺伝子によって発現される抗原に対する免疫応答を亢進する１又は複数の遺伝的アジュバントを含んでもよいウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、遺伝的ワクチン、プラスミドワクチン又はポリヌクレオチドワクチンとも呼ばれ、抗原に対する免疫化に遺伝子導入を利用するための比較的容易で経済的な方法である。ＤＮＡワクチンは毒性が低く、そのさらなる開発が望まれているが、臨床現場に導入されて成功するためには、そのアプローチの有効性を向上させるためのさらなる戦略が必要である（非特許文献１）。ＤＮＡワクチンは、従来のワクチンがもつ欠点のほとんどを克服しており、将来のワクチンとしての可能性を秘めている。しかし、市販されている製品はまだない。これはおそらく、この技術がヒトにおいて効率的に免疫応答を誘導することができていないためであろう（非特許文献２）。
【０００５】
ＤＮＡワクチンとアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターには多くの類似点がある。ＡＡＶベクターはウイルス遺伝子を何らコードしておらず、ＡＡＶベクターゲノム中に存在するウイルス配列は１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）だけである。しかし、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドによる特異的送達により、インビボでの遺伝子導入効率が非常に高いという利点をもっている。ＤＮＡワクチンと異なり、ＡＡＶは単回投与で、非ヒト霊長類（「ＮＨＰ」）において、ＡＡＶにより発現された抗原に対する液性及び細胞性免疫応答を誘発することができる。
【非特許文献１】Shaw & Strong, Front Biosci. 2006 Jan 1;11:1189-98
【非特許文献２】Glenting & Wessels, Microb Cell Fact. 2005 Sep 6;4:26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡワクチン用の遺伝的アジュバントについては総説があるが（例えばCalarota & Weiner, Expert Rev Vaccines. 2004 Aug;3(4 Suppl):S135-49, Calarota & Weiner, Immunol Rev. 2004 Jun;199:84-99及びKutzler & Weiner, J Clin Invest. 2004 Nov;114(9):1241-4参照）、ウイルスワクチン用の、特にＡＡＶに基づくウイルスワクチン用の遺伝的アジュバントについては未だによく分かっていない。
【０００７】
効果的かつ安全なウイルスワクチン、特に防御反応を誘発するのに十分な量の目的とする標的抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するウイルスワクチンが必要とされている。
【０００８】
本願中で引用又は特定する全ての文献は、本発明の先行技術として利用可能なことを自認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクター中で発現される遺伝子のタンパク質産物のアジュバント化、すなわち免疫応答の亢進に関する。Ａｄ５などの他の多くのベクターと異なり、ＡＡＶは筋肉、脳、肝臓、肺及び網膜に注射されても穏やかな炎症反応しか誘導せず、これは遺伝子治療用のベクターとして望ましい特性である。しかし、送達後に自然免疫応答を誘発しないということは、ベクターだけでなく導入遺伝子のタンパク質産物に対しても免疫応答が減弱されている可能性がある。したがって、ＡＡＶは非常に安全であるが免疫原性のほとんどない、送達のみのベクターとみなすことができる。このことは、ＡＡＶベクターを用いたワクチンが、化学的又は分子的アジュバントの添加による利益を受け得ること示唆している。このようなアジュバントの目的は、導入遺伝子の発現と同時に炎症反応を発生させるか模倣し、遺伝子産物に対するＴ細胞及びＢ細胞の反応を増強することである。
【００１０】
生物学的には、アジュバント化は遺伝的アジュバントを介したものが好適である。物理的アジュバントは効果的ではあるが、導入遺伝子の発現が遅れた場合には、発現が最大のときに免疫応答を適切に生じさせるためのアジュバントが存在しないことがあり得る。その結果、望ましくない抗ベクター（投入粒子）免疫応答が亢進されるかも知れず、さらにベクターに載せた抗原に対する免疫応答に何らかの影響を及ぼし得る。本発明は、ＡＡＶベクター内で発現された病原遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答を、アジュバントの遺伝子である第２の遺伝子を共発現させることで亢進しようとするものである。
【００１１】
本発明は、免疫原性又はワクチン組成物に関し、該組成物はベクター、有利にはウイルスベクター、さらに有利にはＡＡＶベクターを含んでもよく、該ベクターは遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓ抗原、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２であってよい。
【００１２】
ベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。特に好ましい実施形態においては、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。
【００１３】
また、本発明は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤を包含し、該製剤は上述の組成物及び薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤のいずれを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤を包含し、該製剤は、遺伝的アジュバントをコードするベクターと、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含んでもよい。
【００１４】
本発明は、動物における免疫応答を刺激又は誘発する方法に関し、該方法は、本明細書に開示している製剤のいずれかを動物細胞に有効量投与するステップ及び該細胞内で目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させるステップを含んでもよい。好ましくは、動物はヒトである。
【００１５】
本発明は、前述の方法のいずれかを実施するためのキットをも包含し、該キットは、本願に開示しているＤＮＡプラスミド又は製剤、さらには動物において免疫応答を刺激又は誘発する方法を実施するための説明書を含んでもよい。
【００１６】
本開示及び特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む」「含有する」（comprise）等の用語は米国特許法に帰する意味を有する。「本質的に〜からなる」という用語も、米国特許法に帰する意味を有し、これは例えば、明示的に記載されていない要素を許すが、先行技術中の要素、又は本発明の基本的特徴若しくは新規な特徴に影響する要素は除外する。
【００１７】
これら及びその他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されているか又は詳細な説明から明らかであり、詳細な説明に包含される。
【００１８】
以下の詳細な説明は例示のために挙げるものであり、記載している特定の実施形態のみに本発明を限定することを意図するものではなく、添付の図面と一緒にすることで最も良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクター中で発現される遺伝子のタンパク質産物のアジュバント化、すなわち免疫応答の亢進に関する。ＡＡＶは非常に安全であるが免疫原性のほとんどない送達のみのベクターとみなすことができる。このことは、ＡＡＶベクターを用いたワクチンが化学的又は分子的アジュバントの添加による利益を受け得ることを示唆している。物理的アジュバントは効果的ではあるが、導入遺伝子の発現が遅れた場合には、発現が最大のときに免疫応答を適切に生じさせるためのアジュバントが存在しないことがあり得る。その結果、望ましくない抗ベクター（投入粒子）免疫応答が亢進され、ベクターに載せた抗原に対する免疫応答に何らかの影響を及ぼす可能性がある。本発明は、ウイルスベクター内で発現された病原遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答を、アジュバントの遺伝子である第２の遺伝子を共発現させることで亢進しようとするものである。
【００２０】
ＡＡＶベクターが好ましいが、本発明は他のウイルスベクターも想定する。別のウイルスベクターとしては特に限定されないが、アデノウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科などのウイルス科に由来するウイルスベクターを挙げることができる。
【００２１】
本発明は免疫原性又はワクチン組成物に関し、該組成物はベクター、有利にはウイルスベクター、さらに有利にはＡＡＶベクターを含んでもよく、該ベクターは遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓ抗原、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２であってよい。
【００２２】
ＣＴＡ１−ＤＤは、例えば米国特許第６５８９５２９号明細書及び同第５９１７０２６号明細書に記載されている。
【００２３】
Ｆａｓ抗原は、例えば米国特許第６９５３８４７号明細書；同第６９４９３６０号明細書；同第６８９７２９５号明細書；同第６８５５５４３号明細書；同第６７７７５４０号明細書；同第６４６５６１８号明細書；同第６３１６４１８号明細書；同第６３０６８２０号明細書；同第６３０６３９５号明細書；同第６２８４８０１号明細書；同第６２７０９９８号明細書；同第６１７７５９２号明細書；同第６１７１７９８号明細書；同第６１１４５０７号明細書；同第６０８６８７７号明細書；同第６０５４４３６号明細書；同第６０２０１３５号明細書；同第６０１５５５９号明細書；同第５９９４３１３号明細書；同第５８７４５４６号明細書；同第５８３０４６９号明細書；同第５６６３０７０号明細書；同第５６５２２１０号明細書及び同第５６２０８８９号明細書に記載されている。
【００２４】
別の実施形態においては、ｆａｓ抗原の代わりに、又はそれに加えて、ＮＫが仲介するアポトーシスの誘導剤を使用してもよい。
【００２５】
フラジェリンは、例えば米国特許第６８０５８６５号明細書；同第６７４０３２５号明細書；同第６５８５９８０号明細書；同第６５８２７０５号明細書；同第６４１９９３２号明細書；同第６２１１１５９号明細書；同第６１３００８２号明細書；同第５７８６１７９号明細書；同第５７５０１１５号明細書；同第５７４７６５９号明細書；同第５７２５８５８号明細書；同第５６３５１８２号明細書；同第５１５３３１２号明細書；同第４８８６７４８号明細書及び同第４２０１７７０号明細書に記載されている。
【００２６】
ＩＬ−２は、例えば米国特許第７０１５２０５号明細書；同第６９９４９７６号明細書；同第６９８９１４６号明細書；同第６９７７０７２号明細書；同第６９６７０２９号明細書；同第６９６２６９４号明細書；同第６９５６１１９号明細書；同第６９５５８０７号明細書；同第６９２９７９１号明細書；同第６９２１５３０号明細書；同第６９０６１７０号明細書；同第６９０５６８０号明細書；同第６８９６８７９号明細書；同第６８９３８６９号明細書；同第６８８４７８６号明細書；同第６８８４５９８号明細書；同第６８５８５８３号明細書；同第６８５２３１３号明細書；同第６８３８４７４号明細書；同第６８２８１４７号明細書；同第６８１８４４２号明細書；同第６７７４２２６号明細書；同第６７５９２４１号明細書；同第６７５６０３８号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第６７４６６６９号明細書；同第６７３４０１４号明細書；同第６７１９９７２号明細書；同第６７１６４３３号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６６９９４７６号明細書；同第６６９３０８３号明細書；同第６６９２９５４号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６８２７３６号明細書；同第６６６０７２３号明細書；同第６６６０２５８号明細書；同第６６２７６４７号明細書；同第６６１７１３５号明細書；同第６６１３７６２号明細書；同第６６０５２８６号明細書；同第６６０５２７３号明細書；同第６５８６００２号明細書；同第６５５９１３７号明細書；同第６５４８０６８号明細書；同第６５３４２７７号明細書；同第６５３４０５５号明細書；同第６５３１４５３号明細書；同第６５２８０５１号明細書；同第６５２５１０２号明細書；同第６５１１８００号明細書；同第６５０９３１３号明細書；同第６５０６５８２号明細書；同第６５０３７１３号明細書；同第６５００６４１号明細書；同第６４９７８７６号明細書；同第６４８２８４５号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４５８８２９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４５１３０５号明細書；同第６４４８０７３号明細書；同第６４３６９８９号明細書；同第６４１３７７１号明細書；同第６４０７２１８号明細書；同第６４０６７１０号明細書；同第６４０６６９９号明細書；同第６４０６６９６号明細書；同第６３８４２０２号明細書；同第６３８３７３９号明細書；同第６３５８７５１号明細書；同第６３５８５２４号明細書；同第６３５２７２３号明細書；同第６３４８４４９号明細書；同第６３４６２４７号明細書；同第６３２３０２７号明細書；同第６３１２７１８号明細書；同第６２９１４８３号明細書；同第６２７７３６８号明細書；同第６２７４５５２号明細書；同第６２７０７５８号明細書；同第６２６７９５５号明細書；同第６２５２０５８号明細書；同第６２５１８６６号明細書；同第６２４８３１９号明細書；同第６２３２０８７号明細書；同第６２３１８９３号明細書；同第６２１８３７１号明細書；同第６２０７８０２号明細書；同第６２０７４５４号明細書；同第６２０７１７０号明細書；同第６１９７９２５号明細書；同第６１８０１０３号明細書；同第６１６８７８７号明細書；同第６１６８７８５号明細書；同第６１６６１８６号明細書；同第６１５９４６３号明細書；同第６１５９４６２号明細書；同第６１５６３０５号明細書；同第６１５００９９号明細書；同第６１３３４３３号明細書；同第６１２７１７０号明細書；同第６１０７０７７号明細書；同第６０９９８４７号明細書；同第６０９９８４６号明細書；同第６０９３７２３号明細書；同第６０８６９０２号明細書；同第６０８３５０３号明細書；同第６０７７５１９号明細書；同第６０７０１２６号明細書；同第６０６３７６８号明細書；同第６０６３３７５号明細書；同第６０６００６８号明細書；同第６０５４２９７号明細書；同第６０５１２２７号明細書；同第６０４８５３０号明細書；同第６０４５８０２号明細書；同第６０１７５４４号明細書；同第５９９７８６５号明細書；同第５９８９５４６号明細書；同第５９７７３１６号明細書；同第５９７６５２２号明細書；同第５９６８８９８号明細書；同第５９６５３６６号明細書；同第５９６５１２０号明細書；同第５９６１９７９号明細書；同第５９５８７６５号明細書；同第５９３２４２７号明細書；同第５９３２２０８号明細書；同第５９１９４８０号明細書；同第５９１９４６５号明細書；同第５８９７９９０号明細書；同第５８８８５１３号明細書；同第５８７９６７３号明細書；同第５８７４０８５号明細書；同第５８７４０７６号明細書；同第５８６６１２５号明細書；同第５８５８９７８号明細書；同第５８５１９８４号明細書；同第５８４７００４号明細書；同第５８４３４２３号明細書；同第５８４３３９７号明細書；同第５８３７８４０号明細書；同第５８１４３１４号明細書；同第５８１４２９５号明細書；同第５８００８１０号明細書；同第５７９５９６４号明細書；同第５７８９１８５号明細書；同第５７８８９６４号明細書；同第５７８３５５７号明細書；同第５７７６４６５号明細書；同第５７５６５４０号明細書；同第５７４７０２４号明細書；同第５６９８５３０号明細書；同第５６９８１９４号明細書；同第５６９３３２２号明細書；同第５６７４４８３号明細書；同第５６５０１５２号明細書；同第５６４３５６５号明細書；同第５６３５４７８号明細書；同第５６３５３８８号明細書；同第５６３５３８６号明細書；同第５６３２９８３号明細書；同第５６２７０５２号明細書；同第５６１６５５４号明細書；同第５５９１６３２号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５５８０５６１号明細書；同第５５３０１０１号明細書；同第５５０３８４１号明細書；同第５５００３４０号明細書；同第５４７４８９９号明細書；同第５４２５９４０号明細書；同第５４０９６９８号明細書；同第５３４６９８９号明細書；同第５２５０２９５号明細書；同第５２３８８２３号明細書；同第５２２５５３５号明細書；同第５１２０５２５号明細書；同第５１００６６４号明細書；同第５０９８７０２号明細書；同第４９７１７９５号明細書；同第ＲＥ３３２５２号明細書；同第４９３８９５６号明細書；同第４８９４２２７号明細書；同第４８６３７２７号明細書；同第４８６３７２６号明細書；同第４８４５１９８号明細書；同第４６０４３７７号明細書；同第４４７３４９３号明細書及び同第４４１１９９３号明細書に記載されている。
【００２７】
ＩＬ−１２は、例えば米国特許第６９９５００８号明細書；同第６９８９１４６号明細書；同第６９８４３８９号明細書；同第６９５６１１９号明細書；同第６９０２７３４号明細書；同第６８９９８８５号明細書；同第６８９６８７９号明細書；同第６８９３８６９号明細書；同第６８９３８２１号明細書；同第６８６７０００号明細書；同第６８５２３１３号明細書；同第６８３８２９０号明細書；同第６８３８２６０号明細書；同第６８３０７５１号明細書；同第６８１８４４４号明細書；同第６７７４２２６号明細書；同第６７７４１３０号明細書；同第６７５９２４１号明細書；同第６７５６０３８号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第６７４６６６９号明細書；同第６７１６４３３号明細書；同第６７１６４２２号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６７０６２６４号明細書；同第６６９３１０５号明細書；同第６６９２９５４号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６７５１０５号明細書；同第６６６０２５８号明細書；同第６６１７１３５号明細書；同第６６０５２８６号明細書；同第６５５８９５１号明細書；同第６５４８０６８号明細書；同第６５３４２７７号明細書；同第６５２８０５１号明細書；同第６５０９３２１号明細書；同第６５０３７１３号明細書；同第６４９７８７６号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４７５９９９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４４８０７３号明細書；同第６４２３３０８号明細書；同第６４２０３３５号明細書；同第６４０７２１８号明細書；同第６３８４２０２号明細書；同第６３８４０１８号明細書；同第６３７５９４４号明細書；同第６３６５１６５号明細書；同第６３４８４４９号明細書；同第６３４６２４７号明細書；同第６３３８８４８号明細書；同第６２７４５５２号明細書；同第６２７０７５８号明細書；同第６２３９１１６号明細書；同第６２２５２９２号明細書；同第６２２５１１７号明細書；同第６２１４８０６号明細書；同第６２０７４５４号明細書；同第６１６８９２３号明細書；同第６１６８７８７号明細書；同第６１６００９３号明細書；同第６１５９４６２号明細書；同第６１５６３０５号明細書；同第６１２７１７０号明細書；同第６０９６８６９号明細書；同第６０８０７４２号明細書；同第６０８０３９９号明細書；同第６０７７５１９号明細書；同第６０７１８９３号明細書；同第６０７０１２６号明細書；同第６０６３３７５号明細書；同第６０５１２２７号明細書；同第６０４８５３０号明細書；同第６０４５８０２号明細書；同第６０１７５４４号明細書；同第６００４８１２号明細書；同第５９９７８６５号明細書；同第５９８５２６４号明細書；同第５９７６５３９号明細書；同第５９６２４２４号明細書；同第５９６１９７９号明細書；同第５９１９４８０号明細書；同第５８８８５１３号明細書；同第５８５１９８４号明細書；同第５８４７００４号明細書；同第５８４３４２３号明細書；同第５８１１０９７号明細書；同第５７５６５４０号明細書；同第５７４１８１５号明細書；同第５７３６５２４号明細書；同第５７２３１２７号明細書；同第５７０５１５１号明細書；同第５６９８１９４号明細書；同第５６９３３２２号明細書；同第５６７４４８３号明細書；同第５６６５３４７号明細書；同第５６３５３８８号明細書；同第５６３２９８３号明細書及び同第５５４７８５２号明細書に記載されている。
【００２８】
米国特許第６６９３０８６号明細書の遺伝的アジュバントも本発明の想定範囲内である。ＬＴ及びＣＴ遺伝的アジュバントも本発明に有用である。
【００２９】
ＬＴアジュバントは、例えば米国特許第６９８７１７６号明細書；同第６８１８２２２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５８５９７５号明細書；同第６５７６７５７号明細書；同第６５７６２４４号明細書；同第６５６９４３５号明細書；同第６５４１０１１号明細書；同第６４４０４２３号明細書；同第６４３６４０７号明細書；同第６４１３５２３号明細書；同第６４０６７０３号明細書；同第６１２９９２３号明細書；同第６０８３６８３号明細書；同第６０７７６７８号明細書；同第６０５１４１６号明細書；同第６０３３６７３号明細書；同第６０１９９８２号明細書；同第５９８５２４３号明細書；同第５９７６５２５号明細書；同第５９１９４６３号明細書；同第５８９７４７５号明細書；同第５８６９０６６号明細書；同第５８５８３５２号明細書；同第５６８１７３６号明細書及び同第５６７９５６４号明細書に記載されている。
【００３０】
ＣＴアジュバントは、例えば米国特許第６８４９７２５号明細書；同第６８１８４０５号明細書；同第６７９７４７１号明細書；同第６７９３９２８号明細書；同第６７５９２００号明細書；同第６７４９８５６号明細書；同第ＲＥ３８３９２号明細書；同第６６０７７３２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５６５８２８号明細書；同第６５４４５１８号明細書；同第６４７２５８５号明細書；同第６４２０５９１号明細書；同第６３９５９６４号明細書；同第６１１７６５０号明細書；同第６０７４３５２号明細書；同第５９８０８９８号明細書；同第５９１７０２６号明細書；同第５８５９０１８号明細書；同第５７８３１８２号明細書；同第５７２３５８５号明細書；同第５６７９５４５号明細書；同第５５７１８９３号明細書；同第５５６５２１５号明細書；同第４８６９２４７号明細書；同第４４１１８８８号明細書及び同第４０３４０９０号明細書に記載されている。
【００３１】
本発明の目的のためには、遺伝的アジュバントの要件は、それがヌクレオチド配列にコードされており、ウイルスベクター内で発現されるということだけである。遺伝的アジュバントに関して考慮すべき要素としては特に限定されないが、例えばウイルスベクターのキャパシティーに対するアジュバント遺伝子の大きさ、ベクターの構築及び生産にかかる時間及び費用、並びに安全性を挙げることができる。
【００３２】
本明細書において、遺伝的アジュバントとは、ベクターによって発現されるサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンド、それらの最適な組合せなどの生物学的活性因子を意味し、抗原をコードする初回刺激用のＤＮＡワクチンと一緒に投与されると、抗原をコードするＤＮＡワクチンのみによる初回刺激で生じる免疫応答と比較して、抗原特異的な粘膜免疫応答を亢進するものである。その他の望ましい遺伝的アジュバントとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＦＮ）、（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、ＴＮＦ−α、それらの組合せをコードするＤＮＡ配列、等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。遺伝的アジュバントは、パラポックスウイルスの免疫賦活性ポリペプチドであってもよく、例えばパラポックスウイルスＤ１７０１株若しくはＮＺ２株のポリペプチド、又はパラポックスの免疫賦活性ポリペプチドＢ２ＷＬ若しくはＰＰ３０（例えば米国特許第６７５２９９５号参照）であってもよい。当業者であれば抗原特異的免疫応答を亢進するさらに別の生物学的活性因子を容易に選択することができる。また、同因子を含有する好適なプラスミドベクターは、公知の技術により構築することができる。
【００３３】
本発明はさらに、物理的アジュバントによる免疫応答の補助を提供する。物理的アジュバントの投与は当業者に周知であり、遺伝的アジュバントと一緒に、同時に及び／又は連続して投与することができる。物理的アジュバントを投与するために当業者にとって日常的な実験が必要とされてもよい。物理的アジュバントについて考慮すべき要素としては、生ウイルスとの適合性、導入遺伝子の発現開始に対する投与の時期、安全性、実行可能性等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。したがって、臨床段階にあるアジュバントが好ましい。好ましい物理的アジュバントは特に限定されるものではないが、ＣｐＧ、ＣＲＯＮＹ（ＮＫＴ細胞ＣＤ１リガンド）、ＩＣ３１、イミキモド、ＩＱＭ、ＱＳ−２１等を挙げることができる。
【００３４】
ＣｐＧは例えば、米国特許第７０１４９９２号明細書；同第７０１０６１０号明細書；同第６９９４８７０号明細書；同第６９８９４４２号明細書；同第６９７９７２８号明細書；同第６９７７１４６号明細書；同第６９７７０６９号明細書；同第６９６５４５４号明細書；同第６９６４９５１号明細書；同第６９６０４３６号明細書；同第６９６０４３４号明細書；同第６９５１６５１号明細書；同第６９４９５２０号明細書；同第６９４９３６１号明細書；同第６９４２９７２号明細書；同第６９３６２５５号明細書；同第６９３２９７２号明細書；同第６９１９２０４号明細書；同第６９１４１４８号明細書；同第６９１３８９０号明細書；同第６９１１３０６号明細書；同第６９０８９０１号明細書；同第６８９３８２０号明細書；同第６８８４４３５号明細書；同第６８８１５６１号明細書；同第６８８１５５６号明細書；同第６８７８６１６号明細書；同第６８７２５２４号明細書；同第６８５８３８８号明細書；同第６８４６４７７号明細書；同第６８３５５４１号明細書；同第６８２８４３５号明細書；同第６８２１９５７号明細書；同第６８１８４０４号明細書；同第６８１５４２９号明細書；同第６８１５１６６号明細書；同第６８１１９８２号明細書；同第６８０８９０８号明細書；同第６７９４１３７号明細書；同第６７８７５２４号明細書；同第６７８５７４１号明細書；同第６７８３９３３号明細書；同第６７７３８９７号明細書；同第６７６７９９１号明細書；同第６７６２２８１号明細書；同第６７５６２００号明細書；同第６７５３０１５号明細書；同第６７３７０６６号明細書；同第６７３３７７７号明細書；同第６７１３２７９号明細書；同第６７０９８１８号明細書；同第６６９６５５５号明細書；同第６６９３０８６号明細書；同第６６８９６０６号明細書；同第６６８９５８８号明細書；同第６６７３９１２号明細書；同第６６７１８４５号明細書；同第６６６７１７４号明細書；同第６６５３２９５号明細書；同第６６５３２９２号明細書；同第６６４９７５１号明細書；同第６６３９０６２号明細書；同第６６３６６２３号明細書；同第６６２７１９８号明細書；同第６６１３８９４号明細書；同第６６１３７５１号明細書；同第６６０５４３２号明細書；同第６６０００３２号明細書；同第６５９９７００号明細書；同第６５９３４６６号明細書；同第６５９００９２号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５７６７５２号明細書；同第６５６９６２１号明細書；同第６５６６３３８号明細書；同第６５５９２７９号明細書；同第６５５２００６号明細書；同第６５３４６４６号明細書；同第６５３４５２３号明細書；同第６５１１８０８号明細書；同第６４８６１３２号明細書；同第６４７９２５８号明細書；同第６４７６０００号明細書；同第６４７２１５３号明細書；同第６４６５４３８号明細書；同第６４５１３２０号明細書；同第６４２９１９９号明細書；同第６４２６３３４号明細書；同第６４２０３８０号明細書；同第６４１０５３１号明細書；同第６４０６７０５号明細書；同第６３９５２７８号明細書；同第６３６６７９３号明細書；同第６３３９０６８号明細書；同第６３３１３９３号明細書；同第６３２９４１７号明細書；同第６３２９３７９号明細書；同第６３２６４８７号明細書；同第６３２３１８０号明細書；同第６３１３０９５号明細書；同第６３０９８２８号明細書；同第６２６５１７１号明細書；同第６２５１５９４号明細書；同第６２４５７３６号明細書；同第６２３９１１６号明細書；同第６２２５２９２号明細書；同第６２１８３７１号明細書；同第６２１４８０６号明細書；同第６２１４５５６号明細書；同第６２０７６４６号明細書；同第６２００７５６号明細書；同第６１９４３８８号明細書；同第６１９１３０６号明細書；同第６１８４２１１号明細書；同第６１８０６１４号明細書；同第６１７５００２号明細書；同第６１５３５９１号明細書；同第６１４７２００号明細書；同第６１２２６７１号明細書；同第６０９６７１２号明細書；同第６０９０７９１号明細書；同第６０８４１０２号明細書；同第６０５７４６５号明細書；同第６０１７７０４号明細書；同第６００４７５０号明細書；同第５９９０１５９号明細書；同第５９７２８８３号明細書；同第５９４５４１３号明細書；同第５９４２６１０号明細書；同第５９３５９３２号明細書；同第５９１７１２２号明細書；同第５９１６７５０号明細書；同第５８６３９０１号明細書；同第５８５６４６２号明細書；同第５８５１７６２号明細書；同第５８４９８６３号明細書；同第５８４０８７９号明細書；同第５８４０４９７号明細書；同第５８３４４３１号明細書；同第５８３２３８２号明細書；同第５７８６１４６号明細書；同第５７８０４４８号明細書；同第５７３６６２６号明細書；同第５７３６４８０号明細書；同第５７００９２６号明細書；同第５６４８３３６号明細書；同第５５５４７４４号明細書；同第５５５２４７１号明細書；同第５５３２１７０号明細書；同第５５０８１６４号明細書；同第５４７２６７２号明細書；同第５４５１４６３号明細書；同第５４１９９６６号明細書；同第５４０５９９０号明細書；同第５４０１８３７号明細書；同第５２４４６５５号明細書；同第５１１４９１８号明細書；同第５０１３８３０号明細書；同第４９４５０５９号明細書；同第４８４０９３５号明細書；同第４５６９９１７号明細書；同第４４８５０３８号明細書；同第４４３１６５４号明細書及び同第４３６８０３４号明細書に記載されている。
【００３５】
ＩＣ３１は、例えば米国特許第６１３６３０９号明細書に記載されている。イミキモドは、例えば米国特許第６０１１０５５号明細書及び同第５７５０４９５号明細書に記載されている。ＩＱＭは、例えば米国特許第６４６５１７３号明細書；同第６１５３４０８号明細書；同第６０１１１４６号明細書；同第５９７６５５１号明細書及び同第５０６８１７７号明細書に記載されている。ＱＳ−２１は、例えば米国特許第７０１４８５６号明細書；同第７００１６０１号明細書；同第６９７９４４８号明細書；同第６９６７０２２号明細書；同第６９３６２５３号明細書；同第６９１６４７６号明細書；同第６９０５６８６号明細書；同第６８９９８８５号明細書；同第６８９０５３５号明細書；同第６８７５４３４号明細書；同第６８５５３１６号明細書；同第６６８２９０９号明細書；同第６６４５４９５号明細書；同第６６１０６５９号明細書；同第６５８９５２９号明細書；同第６５２４５８４号明細書；同第６４５８３６９号明細書；同第６４５５５０３号明細書；同第６４０３１０４号明細書；同第６３７５９４５号明細書；同第６３５５２５６号明細書；同第６２７０８００号明細書；同第６２４８５８５号明細書；同第６２３１８５９号明細書；同第６１２３９４８号明細書；同第６０３６９５９号明細書；同第５７２３１３０号明細書及び同第５６１２０３０号明細書に記載されている。
【００３６】
本発明に使用可能な、その他の好適な公知のアジュバントの例としては、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％（ｗ／ｖ）Ｓｐａｎ８５）、（シトシンが非メチル化シトシンである）ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａ抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ＱｕｉｌＡ、インターロイキン、その他のＴｏｌｌ様受容体リガンド又はＮＫ細胞リガンド等単独又はそれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。実験動物に対して、フロイント；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；及び細菌から抽出された３種類の成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジマイコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に含有するＲＩＢＩを使用することができる。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原対して作られた抗体の量を測定することで決定することができる。
【００３７】
組成物の有効性を高めるアジュバントのさらなる例として、（１）水中油滴型エマルション製剤（ムラミルペプチド（下記参照）又は細菌細胞壁成分などのその他の特定の免疫賦活剤と共に又はそれら無しで）：例えば（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０，及び０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（場合によりＭＴＰ−ＰＥも含有）、マイクロ流動化装置（microfluidizer）でサブミクロン粒子に製剤化されているＭＦ５９（商標）（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット及びChapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックをブロックされた５％ポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含み、マイクロ流動化（microfluidize）によりサブミクロンエマルションにされているか、又はボルテックスでより大きな粒子サイズのエマルションにされているＳＡＦ、並びに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレバロース（trebalose）ジマイコレート（ＴＤＭ）、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１又は複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ribi Immunochem社製, Hamilton, Mont.）；（２）ＱＳ２１又はSTIMULON（商標）（Cambridge Bioscience社製, Worcester, Mass.）などのサポニンアジュバントを使用してもよく、或いはそれから生成するＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの粒子（このＩＳＣＯＭは別に洗浄剤（detergent）を含まなくてよい（例えば国際公開第００／０７６２１号パンフレット））；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）及びフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開第９９／４４６３６号パンフレット）等）、インターフェロン（例えばガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン、；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）又は３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（英国特許第２２２０２２１号明細書及び欧州特許出願公開第０６８９４５４（Ａ）号明細書）（肺炎球菌サッカライドと使用する場合は、必要に応じてミョウバンが実質的に存在しなくてもよい（例えば国際公開第００／５６３５８号パンフレット））；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１及び／又は水中油滴型エマルション（例えば欧州特許出願公開第０８３５３１８（Ａ）号明細書、同第０７３５８９８（Ａ）号明細書、同第０７６１２３１（Ａ）号明細書）との組合せ、；（７）ＣｐＧモチーフ［Krieg Vaccine 2000, 19,618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman et al., Nat. Med. 1997,3,849-854；Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837；Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 870-876；Chu et al., J. Exp.Med, 1997, 186, 1623-1631；Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344；Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224；Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549；Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883；Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845；Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575；Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78；Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873；Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122；Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402；Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761及び Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906；国際特許出願国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、同第９８／１６２４７号パンフレット、同第９８／１８８１０号パンフレット、同第９８／４０１００号パンフレット、同第９８／５５４９５号パンフレット、同第９８／３７９１９号パンフレット及び同第９８／５２５８１号パンフレット］を含む、すなわちシトシンが非メチル化シトシンであるＣＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む、オリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテル又はポリオキシエチレンエステル（例えば国際公開第９９／５２５４９号パンフレット）；（９）オクトキシノール（国際公開第０１／２１２０７号パンフレット）若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルと組み合わせたポリオキシエチレンソイビタンエステル系界面活性剤（polyoxyethylene soibitan ester surfactant）、又はオクトキシノール（国際公開第０１／２１１５２号パンフレット）などの別の非イオン性界面活性剤の少なくとも１つと組み合わせたエステル系界面活性剤；（１０）サポニン及び免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号パンフレット）；（１１）免疫不活化在及び金属塩粒子（例えば国際公開第００／２３１０５号パンフレット）；（１２）サポニン及び水中油滴型エマルション（例えば国際公開第９９／１１２４１号パンフレット）；（１３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（必要に応じて＋ステロール）例えば国際公開第９８／５７６５９号パンフレット；（１４）組成物の効果を高める免疫賦活剤として作用するその他の物質、等を挙げることができる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）等を挙げることができる。
【００３８】
ベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。特に好ましい実施形態においては、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、目的とするＨＩＶ若しくはＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。
【００３９】
ＨＩＶ配列は、例えば米国特許第７００８７８４号明細書；同第７００１７５９号明細書；同第６９９５００８号明細書；同第６９９４９６９号明細書；同第６９６４７６３号明細書；同第６９５８２１１号明細書；同第６９４２９６９号明細書；同第６９３３２８６号明細書；同第６８９７３０１号明細書；同第６８９０９０８号明細書；同第６８６９９３３号明細書；同第６８６９７５９号明細書；同第６８６１５１５号明細書；同第６８４１６５７号明細書；同第６８２８１４８号明細書；同第６８２４８６６号明細書；同第６８２１９４５号明細書；同第６８１８７４０号明細書；同第６８１４９３４号明細書；同第６７９０９４１号明細書；同第６７８３９８１号明細書；同第６７４７１２６号明細書；同第６７３４１６０号明細書；同第６７２３５５８号明細書；同第６７０３４９３号明細書；同第６６９９９８５号明細書；同第６６９６２９１号明細書；同第６６８６３３３号明細書；同第６６８６１５０号明細書；同第６６８００２５号明細書；同第６６７０１８１号明細書；同第ＲＥ３８３５２号明細書；同第６６６４０４１号明細書；同第６６６０９０４号明細書；同第６６５３０８１号明細書；同第６６４９３４０号明細書；同第６６４２３６７号明細書；同第６６３０４５５号明細書；同第６６１３５３０号明細書；同第６５９６５３９号明細書；同第６５９３１２４号明細書；同第６５８６１９２号明細書；同第６５８５９７９号明細書；同第６５６２５７５号明細書；同第６５４１２４８号明細書；同第６５３４３１２号明細書；同第６５３１５８７号明細書；同第６５３１２７６号明細書；同第６５３１１２３号明細書；同第６５２８２５１号明細書；同第６５２１７３９号明細書；同第６５１４７３６号明細書；同第６５０３７０５号明細書；同第６４９８０３３号明細書；同第６４９８０２５号明細書；同第６４９２１２０号明細書；同第６４９２１１０号明細書；同第６４８９０９８号明細書；同第６４８２９２８号明細書；同第６４８２８０５号明細書；同第６４７１９５６号明細書；同第６４６８９８２号明細書；同第６４６１５６７号明細書；同第６４５８５２７号明細書；同第６４４８０１４号明細書；同第６４４０４６１号明細書；同第６４３２６３１号明細書；同第６４２９３０６号明細書；同第６４２９２９０号明細書；同第６４２９００９号明細書；同第６４１９９３１号明細書；同第６４１０２５７号明細書；同第６４０７０７８号明細書；同第６４０４９０７号明細書；同第６３９９３０７号明細書；同第６３７２９５６号明細書；同第６３７２４２５号明細書；同第６３５０７３０号明細書；同第６３３５０１７号明細書；同第６３０９８５３号明細書；同第６３０３３１７号明細書；同第６３０３２９５号明細書；同第６２９１２２７号明細書；同第６２８７６０５号明細書；同第６２７７６３４号明細書；同第６２６５１４９号明細書；同第６２５８５９９号明細書；同第６２５８３１９号明細書；同第６２４８５７４号明細書；同第６２４２５６８号明細書；同第６２４２１８７号明細書；同第６２３５８８１号明細書；同第６２３５４７９号明細書；同第６２３２１２０号明細書；同第６２２５０６７号明細書；同第６２２２０２５号明細書；同第６２２１６６１号明細書；同第６２２１５７８号明細書；同第６２１４９８２号明細書；同第６２０７４２６号明細書；同第６２０４２５３号明細書；同第６１９７７５５号明細書；同第６１９７５８３号明細書；同第６１９７５６３号明細書；同第６１９７４９９号明細書；同第６１７１７８５号明細書；同第６１６８９５３号明細書；同第６１６８９４８号明細書；同第６１６６１９７号明細書；同第６１５６９５２号明細書；同第６１４９９１０号明細書；同第６１４０４６６号明細書；同第６１２７１５５号明細書；同第６１２４４４８号明細書；同第６１２４４３９号明細書；同第６１１４３４９号明細書；同第６１１４１４１号明細書；同第６１１０４６６号明細書；同第６１０７０７８号明細書；同第６１０７０２０号明細書；同第６０９０３９２号明細書；同第６０８６８９１号明細書；同第６０６３６０８号明細書；同第６０４８８３７号明細書；同第６０４３３４７号明細書；同第６０４０１６６号明細書；同第６０３７１６５号明細書；同第６０３７１５２号明細書；同第６０３３９０２号明細書；同第６０３３８８１号明細書；同第６０２７８８４号明細書；同第６０１５６６１号明細書；同第６０１３４３２号明細書；同第６０１０８９５号明細書；同第６００８３４３号明細書；同第６００７９８４号明細書；同第６００４８０６号明細書；同第６００１９８９号明細書；同第６００１９６８号明細書；同第６００１６４８号明細書；同第５９９８１９３号明細書；同第５９９４０５６号明細書；同第５９９３８１９号明細書；同第５９９０２７６号明細書；同第５９８５６４１号明細書；同第５９８１５０５号明細書；同第５９８１２７６号明細書；同第５９８１１７１号明細書；同第５９８１１６７号明細書；同第５９７２７０１号明細書；同第５９６８７３０号明細書；同第５９６２６３５号明細書；同第５９６２４２８号明細書；同第５９５８７６８号明細書；同第５９５５２６８号明細書；同第５９３９２６２号明細書；同第５９３５８１０号明細書；同第５９１９６２５号明細書；同第５８８８７６７号明細書；同第５８８５８０６号明細書；同第５８８３０８１号明細書；同第５８７６９７６号明細書；同第５８７４０８７号明細書；同第５８６９３３９号明細書；同第５８６６７０１号明細書；同第５８５８７８５号明細書；同第５８５８７３２号明細書；同第５８５６１８８号明細書；同第５８５６０８６号明細書；同第５８５４９６７号明細書；同第５８５３７１６号明細書；同第５８４６５４６号明細書；同第５８４３７５２号明細書；同第５８４３６４０号明細書；同第５８３７４６４号明細書；同第５８３０８７６号明細書；同第５８３０６５０号明細書；同第５８３０６４１号明細書；同第５８２０８６５号明細書；同第５８１７７９２号明細書；同第５８１７６３７号明細書；同第５８１７６３５号明細書；同第５８１４４５８号明細書；同第５７９８３６５号明細書；同第５７９８２０８号明細書；同第５７９２７５６号明細書；同第５７９２４５９号明細書；同第５７８６１９９号明細書；同第５７７３５７３号明細書；同第５７７３２６０号明細書；同第５７７０４２８号明細書；同第５７６７２３３号明細書；同第５７６３２６８号明細書；同第５７４７２９２号明細書；同第５７４１４９２号明細書；同第５７３９１１８号明細書；同第５７１１９４７号明細書；同第５６９８６８７号明細書；同第５６８８６８８号明細書；同第５６８３６６１号明細書；同第５６７７１２４号明細書；同第５６７２６９５号明細書；同第５６６５５７７号明細書；同第５６５４１９５号明細書；同第５６５０３０９号明細書；同第５６５０３０２号明細書；同第５６５０２６８号明細書；同第５６３９６００号明細書；同第５６３１１２８号明細書；同第５６１８６６４号明細書；同第５６０５６８９号明細書；同第５５９４１２３号明細書；同第５５９３９７２号明細書；同第５５８７２８５号明細書；同第５５８３０３５号明細書；同第５５７１７１２号明細書；同第５５３６６４８号明細書；同第５５３２１４６号明細書；同第５５２７８９５号明細書；同第５５２７６７３号明細書；同第５５１２４３０号明細書；同第５５０３７２１号明細書；同第５４７０７３０号明細書；同第５４３９８０９号明細書；同第５４２７９２９号明細書；同第Ｈ００１４３１号明細書；同第５３８６０２２号明細書；同第５３５２６００号明細書；同第５３１８９７９号明細書；同第５３１４８０９号明細書；同第５２９８６１２号明細書；同第５２７８１７３号明細書；同第５２５２４７７号明細書；同第５２３４８０９号明細書；同第５２２５３４７号明細書；同第５２２１６０８号明細書；同第５１９８３４６号明細書；同第５１８４０２０号明細書；同第５１５６９４９号明細書；同第５１５３２０２号明細書；同第５１３９９４０号明細書；同第５１１０８０２号明細書；同第５０９６８１５号明細書；同第５０７９３５２号明細書；同第５０６６７８２号明細書；同第５０３０４４９号明細書；同第５００８１８２号明細書；同第４９６５１８８号明細書；同第４９１８１６６号明細書及び同第４８８９８１８号明細書に開示されている。
【００４０】
特に有利な実施形態においては、本発明の目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドはＨＩＶ−１タンパク質であり、有利には、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｎｅｆ、逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子にコードされるＨＩＶ−１タンパク質、又は免疫原性を有する任意のその断片である。有利な実施形態において、ｅｎｖ及びＲＴ配列は、Genbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５８（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来し、ｇａｇ及びｔａｔ配列はGenbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５７（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来し、ｒｅｖ及びｎｅｆ配列は、Genbankアクセッション番号ＡＦ０６７１５４（例えばLole et al., J Virol. 1999 Jan;73(1):152-60参照、その開示を参照により本願に組み込んだものとする）に由来する。
【００４１】
ＳＩＶ配列は、例えば米国特許第６９３３３７７号明細書；同第６８４１６５７号明細書；同第６８１８７４０号明細書；同第６７９０６５７号明細書；同第６７４７１２６号明細書；同第６７１２６１２号明細書；同第６６５６７０６号明細書；同第６５９６５３９号明細書；同第６５４１００９号明細書；同第６５３１１２３号明細書；同第６２４８５７４号明細書；同第６０８３５０４号明細書；同第６００８０４４号明細書；同第５７７７０７４号明細書；同第５７７３５７３号明細書；同第５７５３６７４号明細書；同第５６６５３６２号明細書；同第５６５４１９５号明細書；同第５６５２２６０号明細書及び同第５４５９０６０号明細書に開示されている。
【００４２】
特に有利な実施形態において、ベクターは、ＳＩＶ及び／又はＨＩＶ並びに分子的アジュバントを含む、ＡＡＶベクターである。ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及び分子的アジュバントをコードするｒＡＡＶベクターの概略図については、例えば実施例３を参照されたい。
【００４３】
本明細書において、「抗原」又は「免疫原」とは、宿主動物において特定の免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、死滅若しくは弱毒化した、又は生きた生物の全体；生物のサブユニット又は一部；免疫原性特性を有するインサートを含有する組換えベクター；宿主に提示されると免疫応答を誘導することができるＤＮＡの断片；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、又はその任意の組合せを含んでもよい。あるいは、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含んでもよい。
【００４４】
本明細書において、「免疫原性タンパク質又はペプチド」とは、免疫学的に活性なペプチド及びポリペプチド等をも意味する。ここで、免疫学的に活性とは、宿主に投与されると、該タンパク質に対する液性及び／又は細胞性の免疫応答を惹起することができることである。好ましくは、タンパク質断片は、完全なタンパク質と実質的に同じ程度の免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明によるタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープすなわち抗原決定部位を含むか、本質的に含むか、又はからなる。エピトープとは、液性（Ｂ細胞）及び／又は細胞性（Ｔ細胞）の免疫応答を誘導することができるタンパク質部位に関する。
【００４５】
さらに、「免疫原性タンパク質又はペプチド」とは、ポリペプチドが本明細書に定義の免疫学的応答を生じさせる機能を有する限り、配列への欠失、付加及び置換をも包含する。この点に関し、特に好ましい置換は、性質を保存するものであり、すなわち、アミノ酸のファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は一般的に４つのファミリー、すなわち（１）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）無電荷極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは芳香族アミノ酸に分類されることもある。ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる単独置換、若しくはその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸による単独置換、若しくはその逆；スレオニンのセリンによる単独置換、若しくはその逆；又はアミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸による同様に保存的な置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが合理的に予測される。したがって、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有し、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない軽微なアミノ酸置換を含むタンパク質は、参照ポリペプチドの定義に含まれる。
【００４６】
「エピトープ」とは、抗原又はハプテン上の、特異的なＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答する部位を意味する。エピトープという用語はまた、「抗原決定基」又は「抗原決定部位」と置き換えて使用することができる。ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を阻害する能力を有することを示す簡単なイムノアッセイを用いて、同じエピトープを認識する抗体を同定することができる。
【００４７】
組成物又はワクチンに対する「免疫学的応答（immunological response）」とは、宿主内における、目的とする組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体介在性免疫応答の発症である。通常、「免疫学的応答」としては、以下の効果の１又は複数が含まれるがこれらに限定されるものではない：目的とする組成物又はワクチンに含まれる１又は複数の抗原に特異的に向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生。宿主は、新たな感染に対する耐性が亢進されるか又は疾患の臨床的重傷度が緩和されるような、治療的又は防御的免疫学的応答のいずれかを示すことが好ましい。このような防御は、感染宿主が通常示す症状の緩和又は消失、感染宿主における回復時間の短縮及び／又はウイルス価の低下により実証される。
【００４８】
本明細書において「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドとは、上記の免疫学的応答を誘発するアミノ酸配列をも意味する。本明細書における「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドには、タンパク質の全長配列、そのアナログ、又はその免疫原性断片が含まれる。「免疫原性断片」とは、１又は複数のエピトープを含むタンパク質の断片、したがって上記の免疫学的応答を誘発する、タンパク質の断片である。このような断片は、当該技術分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えばEpitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.Jを参照されたい。例えば線状エピトープは、例えばタンパク質分子の様々な部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上に同時に合成し、該ペプチドが支持体上に付着している間にペプチドを抗体と反応させることで決定することができる。このような技術は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第４７０８８７１号明細書；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及びGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715に記載されており、これらの全体を参照により本願に組み込んだものとする。同様に、コンフォメーションエピトープも、例えばＸ線結晶解析及び２次元核磁気共鳴によりアミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することで容易に同定される。例えば前述のEpitope Mapping Protocolsを参照されたい。特にT. parvaのタンパク質に適用可能な方法がＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号明細書に十分に記載されており、その全体を参照により本願に組み込んだものとする。
【００４９】
合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換え又は合成に由来する抗原も定義に含まれる。例えばBergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249；及びSuhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998参照。本発明の目的のためには、免疫原性断片は、通常、該分子の少なくとも約３アミノ酸、好ましくは少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸、最も好ましくは２５又はそれ以上のアミノ酸の分子を含む。断片の長さに決定的な上限はなく、タンパク質配列のほぼ全長、又はタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質を含んでもよい。
【００５０】
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、エピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる。全タンパク質又はポリタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドは、より有利には、全タンパク質又はポリタンパク質をコードする配列の最低２１ヌクレオチド、有利には少なくとも４２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５７、８７又は１５０個の連続又は隣接するヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、或いはからなる。本発明の実施には、過度の実験は必要なく、重複ペプチドライブラリーの作製（Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168）、Pepscan（Geysen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178-182；Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol., 19, 43-47；Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533；Multipin.（登録商標） Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561）、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号パンフレットなどの抗原決定手法を使用することができ、これら全ての全体を参照により本願に組み込んだものとする。本明細書に引用して組み込まれた他の文献も、免疫原又は抗原のエピトープ、及びかかるエピトープをコードする核酸分子の決定方法に参照してもよい。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログの任意の組合せが含まれる。ポリヌクレオチドは、三次元構造を有してもよく、既知の又は未知の機能を発揮してもよい。「ポリヌクレオチド」という用語は、２本鎖分子、１本鎖分子、及び３本鎖らせん分子を含む。特に特定又は要求されない限り、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドの実施形態は、（ｉ）２本鎖型、及び（ii）ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはハイブリッド分子のいずれかの２本鎖型を形成することが知られている又は予測される２つの相補型の各々、の両方を包含する。
【００５２】
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチド、ウラシル、その他の糖類、フルオロリボース及びチオラートなどの連結基、並びにヌクレオチド枝を含んでもよい。ヌクレオチドの配列は重合の後に、標識成分とのコンジュゲート化などでさらに修飾されてもよい。この定義に含まれるその他の種類の修飾としては、キャップ、アナログによる天然ヌクレオチドの１又は複数の置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド、又は固体支持体に結合させる手段の導入を挙げることができる。ポリヌクレオチドは、化学合成によって得てもよく、又は微生物に由来してもよい。
【００５３】
本発明はさらに、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補鎖も含む。相補鎖は重合体であってもよく、どのような長さでもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログを任意の組合せで含んでもよい。
【００５４】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「ポリペプチド断片」とは、アミノ酸残基の任意の長さの重合体を指し、本明細書において相互に置換え可能に使用される。この重合体は線状又は分枝状であってよく、修飾アミノ酸又はアミノ酸アナログを含んでもよく、アミノ酸以外の化学的部分が挿入されていてもよい。これらの用語は、自然に又は介入的に修飾されたアミノ酸重合体をも包含し、そのような修飾としては、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の任意の操作若しくは修飾（例えば標識成分又は生理活性成分とのコンジュゲート化）を挙げることができる。
【００５５】
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、それらが自然環境下で会合している物質を実質的に含まないものである。実質的に含まないとは、少なくとも５０％、有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも８０％、さらにより有利には少なくとも９０％これらの物質を含まないことを意味する。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを上げる条件は周知である。例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition （Sambrook et al. 1989）参照。関連する条件の例として（ストリンジェンシーが高くなる順に）、インキュベーション温度２５℃、３７℃、５０℃，及び６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）及びその他の緩衝系を使用したその同等条件；ホルムアミド濃度０％、２５％、５０％，及び７５％；インキュベーション時間５分〜２４時間；１、２又はそれ以上の洗浄ステップ；洗浄インキュベーション時間１、２又は１５分；並びに洗浄液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ又は脱イオン水を挙げることができる。
【００５７】
本発明はさらに、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドと機能的に同等なバリアント及び誘導体並びにその機能的に同等な断片をコードするポリヌクレオチドを包含し、これは該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの特性を高めるか、低下させるか、又は大きな影響を与えなくてもよい。これらの機能的に同等なバリアント、誘導体及び断片は、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変更しないＤＮＡ配列の変化、及びアミノ酸残基の保存的置換を生じるＤＮＡ配列の変化、１又は数個のアミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換は、コードされるポリペプチドの特性に大きな影響を与えない。保存的なアミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態においては、バリアントは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する。
【００５８】
本発明の目的のためには、配列同一性又は配列相同性は、重複部分及び同一部分を最大化しつつ配列のギャップを最小化するように整列させたときの配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は多数の数学的アルゴリズムのいずれを用いて決定してもよい。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例として、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990；87: 2264-2268のアルゴリズム（Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90: 5873-5877で改変）を挙げることができる。
【００５９】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の例として、Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11-17のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用するときは、ＰＡＭ１２０重み残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用することができる。局所的に配列が類似している領域の特定及びアラインメントに有用なさらに別のアルゴリズムとして、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988；85: 2444-2448に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムがある。
【００６０】
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Washington University BLAST）ソフトウェアのバージョン２．０が、本発明に基づく使用に有利である。各種ＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０の実行可能プログラムがftp ://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロード可能である。このプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４はパブリックドメインのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいている（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990；215: 403-410；Gish & States, 1993；Nature Genetics 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877。これら全ての全体を参照により本明細書に組み込んだものとする）。
【００６１】
一般的に、アミノ酸配列の比較は、構造が既知のポリペプチドのアミノ酸配列と構造が未知のポリペプチドのアミノ酸配列を整列させて行う。次いで、配列中のアミノ酸を比較し、相同なアミノ酸のグループをひとまとめにする。この方法は、ポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸の挿入及び欠失を明らかにする。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いて決定することができる（前述の相同性についての記述も参照されたい）。本明細書中で他で言及しているものに加え、国立バイオテクノロジー情報センターが提供しているプログラムであるＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにも触れておく。これらのプログラムは本目的のために当該技術分野で広く使用されており、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。
【００６２】
これらのプログラム集の全ての検索プログラムにおいて、ギャップ付きアラインメント・ルーチンはデータベース検索自体に不可欠である。所望であれば、ギャップをオフにすることもできる。長さ１のギャップに対するデフォルトのペナルティ（Ｑ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＱ＝９、ＢＬＡＳＴＮではＱ＝１０であるが、これは任意の整数に変更することができる。ギャップの延長に対する残基当たりのデフォルトのペナルティ（Ｒ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＲ＝２、ＢＬＡＳＴＮではＲ＝１０であるが、これも任意の整数に変更することができる。重複部分及び同一部分を最大化しつつ配列ギャップを最小化するように配列を整列させるために、Ｑ及びＲは値の任意の組合せで使用することができる。デフォルトのアミノ酸比較マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭなどのその他のアミノ酸比較マトリックスを利用することもできる。
【００６３】
或いは、又はさらに、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「相同性」又は「同一性」は、２つの配列間の相同性の定量的測定値を指してもよい。パーセント配列相同性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｄｉｆはアラインメント時の２配列中の非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆ は配列の片方に存在する残基の数である。）として計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
【００６４】
或いは、又はさらに、配列に関する「相同性」又は「同一性」は、２つの配列のうち短い方の配列中のヌクレオチド又はアミノ酸数で割った、同一のヌクレオチド又はアミノ酸部位の数を意味してもよく、ここで２つの配列のアラインメントはWilbur and Lipmanのアルゴリズム（Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983；80:726；参照により本明細書に組み込んだものとする）にしたがって、例えば、ウィンドウサイズ＝２０ヌクレオチド、語長＝４ヌクレオチド及びギャップペナルティ＝４を用いて決定することができ、アラインメントを含む配列データのコンピュータ支援分析及び解析は、市販のプログラム（例えば、Intelligenetics（商標）Suite、Intelligenetics Inc.社製、 CA）を使用して適宜行うことができる。ＲＮＡ配列はＤＮＡ配列に類似である、又はある程度の配列同一性又は配列相同性を有するという場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価とみなされる。したがって、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内であり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価とみなすことで、ＤＮＡ配列に由来するものとしてよい。
【００６５】
さらに、当業者であれば、過度の実験をせずに、その他多数のプログラム又は文献を参考にしてパーセント相同性を決定することができる。
【００６６】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター配列及び必要に応じてエンハンサーに作動可能に連結された、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。
【００６７】
「ベクター」とは、インビトロ又はインビボにおいて標的細胞に送達されるべき異種（heterologous）ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡプラスミド又はウイルスを意味する。異種ポリヌクレオチドは、治療目的のための目的とする配列を含んでもよく、必要に応じて発現カセットの形態であってもよい。本明細書において、ベクターは、最終的な標的である細胞又は対象中における複製能を有していなくともよい。ベクターという用語にはクローニングベクターが含まれ、ウイルスベクターも含まれる。
【００６８】
「組換え体」とは、天然には見られない並び方で別のポリヌクレオチドに連結しているポリヌクレオチド又は天然には生じないポリヌクレオチドのいずれかであって、半合成又は合成起源のものを意味する。
【００６９】
「異種」とは、その残りの部分と比較したときに遺伝学的に区別される物体に由来することである。例えば、遺伝子操作技術によって、ポリヌクレオチドを異なる出所（source）に由来するプラスミド又はベクター内に置くことができるが、これは異種ポリヌクレオチドである。あるプロモーターをその天然のコード配列から取り出し、該天然配列以外のコード配列に作動可能に連結すれば、それは異種プロモーターである。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の追加的コード配列などの追加的配列；プロモーターなどの調節エレメント（controlling elements）；リボソーム結合部位；ポリアデニル化部位；同じプロモーター又は異なるプロモーターに制御される追加的な転写単位；クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列；並びに本発明の実施形態を提供するのに望ましいと考えられる任意の構造を含んでもよい。
【００７１】
有利には、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するためのエレメントは、発明的（inventive）ベクター内に存在する。このベクターは最小限、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン及びプロモーター、並びに必要に応じてプラスミドなどの特定のベクター及び特定のウイルスベクター（例えば、ポックスウイルス以外のウイルスベクター）用のポリアデニル化配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片を有利にコードする場合、ベクター内において、ＡＴＧは読み枠の５’側に位置し、終止コドンは３’側に位置する。エンハンサー配列、イントロンなどの安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列など、発現を調節するためのその他のエレメントが存在してもよい。
【００７２】
インビボ又はインビトロのいずれかにおいて本発明の遺伝子の遺伝子産物を発現するためのベクター、組換え体又はプラスミドを作製及び／又は投与する方法は、任意の望ましい方法であってよく、例えば米国特許第４６０３１１２号明細書；同第４７６９３３０号明細書；同第４３９４４４８号明細書；同第４７２２８４８号明細書；同第４７４５０５１号明細書；同第４７６９３３１号明細書；同第４９４５０５０号明細書；同第５４９４８０７号明細書；同第５５１４３７５号明細書；同第５７４４１４０号明細書；同第５７４４１４１号明細書；同第５７５６１０３号明細書；同第５７６２９３８号明細書；同第５７６６５９９号明細書；同第５９９００９１号明細書；同第５１７４９９３号明細書；同第５５０５９４１号明細書；同第５３３８６８３号明細書；同第５４９４８０７号明細書；同第５５９１６３９号明細書；同第５５８９４６６号明細書；同第５６７７１７８号明細書；同第５５９１４３９号明細書；同第５５５２１４３号明細書；同第５５８０８５９号明細書；同第６１３００６６号明細書；同第６００４７７７号明細書；同第６１３００６６号明細書；同第６４９７８８３号明細書；同第６４６４９８４号明細書；同第６４５１７７０号明細書；同第６３９１３１４号明細書；同第６３８７３７６号明細書；同第６３７６４７３号明細書；同第６３６８６０３号明細書；同第６３４８１９６号明細書；同第６３０６４００号明細書；同第６２２８８４６号明細書；同第６２２１３６２号明細書；同第６２１７８８３号明細書；同第６２０７１６６号明細書；同第６２０７１６５号明細書；同第６１５９４７７号明細書；同第６１５３１９９号明細書；同第６０９０３９３号明細書；同第６０７４６４９号明細書；同第６０４５８０３号明細書；同第６０３３６７０号明細書；同第６４８５７２９号明細書；同第６１０３５２６号明細書；同第６２２４８８２号明細書；同第６３１２６８２号明細書；同第６３４８４５０号明細書及び同第６３１２６８３号明細書；１９８６年１０月１６日提出の米国特許出願第９２０１９７号明細書；国際公開第９０／０１５４３号パンフレット；同第９１／１１５２５号パンフレット；同第９４／１６７１６号パンフレット；同第９６／３９４９１号パンフレット；同第９８／３３５１０号パンフレット；欧州特許第２６５７８５号明細書及び同第０３７０５７３号明細書；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993;4:3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994;269:2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11371-11377；Graham, Tibtech 1990;8:85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992;3:237-52；Ju et al., Diabetologia 1998;41:736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991;65:3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984;4:399-406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995;39, “Baculovirus Expression Protocols,”Humana Press Inc.；Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997;9:271及びRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11307-11312に開示されている方法若しくはこれらに引用されている文献に開示されている方法又はその類似の方法がある。したがって、本発明におけるベクターは、（参照により本明細書に組み込んだものとする文献にあるように）ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニア−アンカラ（modified vaccinia-Ankara）、トリポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、ブタポックスウイルス等）、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、イヌヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルス等の任意の好適な組換えウイルス又はウイルスベクターであってよく、或いはベクターはプラスミドであってもよい。本明細書に引用した文献及び参照により本明細書に組み込んだものとする文献は、本発明の実施に有用なベクターの例を提供するだけでなく、本発明の組成物中の、すなわち本発明の組成物に含まれる１又は複数のベクターに発現されるべき目的とする非抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチド、又はその断片の出所も提供する。
【００７３】
本発明はまた、発現ベクターなどのベクターを含む調製物、例えば治療用組成物にも関する。調製物は、１又は複数の目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる（有利には、発現する）１又は複数のベクター（例えばインビボの発現ベクターなどの発現ベクター）を含むか、から本質的になるか、又はからなるものであってよい。有利には、薬学的に許容される担体、賦形剤又は媒体中において、ベクターは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードする（有利には、発現する）ポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドを含み、これを発現する。したがって、本発明の実施形態によれば、調製物中のその他の１又は複数のベクターは、１又は複数のその他の目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドのタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなり、このベクターは適当な環境下でこれらの１又は複数を発現する。
【００７４】
別の実施形態によれば、調製物中の１又は複数のベクターは、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドであるタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなり、この１又は複数のベクターは目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現する。有利には、発明的調製物は、少なくとも２つのベクターを含むか、から本質的になるか、又はからなり、該ベクターは、他に由来する同一のタンパク質及び／又は異なるタンパク質（proteins）をコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる（さらに、有利には、これらを適切な条件下、好適な条件下、又は好適な宿主細胞内で、有利にはインビボで、発現する）が、有利には、同一の、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである。目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチド、又は融合タンパク質をコードし、有利にはインビボで発現するポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる１又は複数のベクターを含む調製物。また、本発明は、異なる目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコード及び発現するポリヌクレオチドを含むか、から本質的になるか、又はからなるベクターの混合物にも関する。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターはウイルスベクター、特にインビボ用の発現ベクターである。有利な実施形態において、発現ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、例えば、米国特許第７０２２５１９号明細書；同第７０１５０２６号明細書；同第６９９５００６号明細書；同第６９８９２６４号明細書；同第６９８４５１７号明細書；同第６９７９５３９号明細書；同第６９６７０１８号明細書；同第６９５３６９０号明細書；同第６９５１７５８号明細書；同第６９５１７５３号明細書；同第６９４６１２６号明細書；同第６９４３０１９号明細書；同第６９３６５９５号明細書；同第６９３６４６６号明細書；同第６９３６２４３号明細書；同第６９３３３７３号明細書；同第６９３３１５０号明細書；同第６９３３１１３号明細書；同第６９２７２８１号明細書；同第６９２４１２８号明細書；同第６８９７０６３号明細書；同第６８９３８６５号明細書；同第６８８７４６３号明細書；同第６８５５３１４号明細書；同第６８４６６６５号明細書；同第６８４１３５７号明細書；同第６８３５４０９号明細書；同第６８２１７７５号明細書；同第６８０５０７３号明細書；同第６７９７７０２号明細書；同第６７９７５０５号明細書；同第６７９３９２６号明細書；同第６７８０６３９号明細書；同第６７８０４０９号明細書；同第６７７７１８５号明細書；同第６７６４８４５号明細書；同第６７５９５１８号明細書；同第６７５９２３７号明細書；同第６７５９０５０号明細書；同第６７４３４２３号明細書；同第６７３３７５７号明細書；同第６７２３５５８号明細書；同第６７２３５５１号明細書；同第６７２３５１２号明細書；同第６７１００３６号明細書；同第６７０３２３７号明細書；同第６６８６２００号明細書；同第６６７７１５５号明細書；同第６６６０５２１号明細書；同第６６５６７２７号明細書；同第６６４９５９７号明細書；同第６６４２０５１号明細書；同第６６３２６７０号明細書；同第６６２７６１７号明細書；同第６６１０２９０号明細書；同第６６０７８８２号明細書；同第６５９９６９２号明細書；同第６５９６５３５号明細書；同第６５９３１２４号明細書；同第６５９３１２３号明細書；同第６５９３１０５号明細書；同第６５８９５２３号明細書；同第６５８６２０８号明細書；同第６５８２６９２号明細書；同第６５６６１１８号明細書；同第６５５８９４８号明細書；同第６５４８２８６号明細書；同第６５４１２５８号明細書；同第６５４１０１２号明細書；同第６５３４２６１号明細書；同第６５２１４２６号明細書；同第６５２１２２５号明細書；同第６５０９１５０号明細書；同第６５０６６００号明細書；同第６５０６３７９号明細書；同第６５０３８８８号明細書；同第６５０３８８７号明細書；同第６５０３７１７号明細書；同第６４９８２４４号明細書；同第６４９１９０７号明細書；同第６４８５９６６号明細書；同第６４８２６３４号明細書；同第６４８２６３３号明細書；同第６４７５７６９号明細書；同第６４６８７７１号明細書；同第６４６８５２４号明細書；同第６４５８５８７号明細書；同第６４５１５９４号明細書；同第６４４８０７４号明細書；同第６４４０７４２号明細書；同第６４３６７０８号明細書；同第６４２９００１号明細書；同第６４２８９８８号明細書；同第６４１６９９２号明細書；同第６４１０３００号明細書；同第６３９１８５８号明細書；同第６３８７６７０号明細書；同第６３８７３６８号明細書；同第６３８３７９４号明細書；同第６３７６２３７号明細書；同第６３６５４０３号明細書；同第６３４６４１５号明細書；同第６３３５０１１号明細書；同第６３２９１８１号明細書；同第６３２５９９８号明細書；同第６３１２９５７号明細書；同第６３０６６５０号明細書；同第６３０３３７１号明細書；同第６３０２６８５号明細書；同第６２９４３７９号明細書；同第６２９４３７０号明細書；同第６２８７８５７号明細書；同第６２７４３５４号明細書；同第６２７０９９６号明細書；同第６２６１８３４号明細書；同第６２６１５５１号明細書；同第６２５８５９５号明細書；同第６２５１６７７号明細書；同第６２４２４２６号明細書；同第６２３２１０５号明細書；同第６２２５１１３号明細書；同第６２２１６４６号明細書；同第６２１１１６３号明細書；同第６２０７４５７号明細書；同第６２０７４５３号明細書；同第６１７１５９７号明細書；同第６１６２７９６号明細書；同第６１５６３０３号明細書；同第６１４３５４８号明細書；同第６１１７６８０号明細書；同第６１１０４５６号明細書；同第６０９３５７０号明細書；同第６０５７１５２号明細書；同第６０４０１８３号明細書；同第６０４０１７２号明細書；同第６０３７１７７号明細書；同第６０３３８８５号明細書；同第６０２７９３１号明細書；同第６０２０１９２号明細書；同第６００４７９７号明細書；同第６００１６５０号明細書；同第５９７６８５３号明細書；同第５９６５４４１号明細書；同第５９６２４２４号明細書；同第５９６２３１３号明細書；同第５９５８７６８号明細書；同第５９４５３３５号明細書；同第５９４２４９６号明細書；同第５９４０５３０号明細書；同第５９３９５３８号明細書；同第５９２８９４３号明細書；同第５８７４５５６号明細書；同第５８７４３０４号明細書；同第５８７１９８２号明細書；同第５８６９３０５号明細書；同第５８６９２３０号明細書；同第５８６６５５２号明細書；同第５８６３５４１号明細書；同第５８５８３５１号明細書；同第５８５６１５２号明細書；同第５８４６５４６号明細書；同第５８４６５２８号明細書；同第５８３７４８４号明細書；同第５８３４４４０号明細書；同第５７８９３９０号明細書；同第５７８０２８０号明細書；同第５７７３２８９号明細書；同第５７６３４１６号明細書；同第５７５６２８３号明細書；同第５７５３５００号明細書；同第５７４１６８３号明細書；同第５６９１１７６号明細書；同第５６８８６７６号明細書；同第５６８８６７５号明細書；同第５６８１７３１号明細書；同第５６７７１５８号明細書；同第５６５８７７６号明細書；同第５６５０３０９号明細書；同第５６４６０３４号明細書；同第５６２２８５６号明細書；同第５６０４０９０号明細書；同第５４７８７４５号明細書；同第５４７４９３５号明細書；同第５４３６１４６号明細書；同第５４１６０１７号明細書；同第５３５４６７８号明細書；同第５２５２４７９号明細書；同第５１７３４１４号明細書；同第５１５５４６８号明細書；同第５１３９９４１号明細書；同第４７９７３６８号明細書及び同第４５５９７１３号明細書に開示されている。
【００７６】
それより好ましくない実施形態では、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスはヒトＡｄ５ベクター、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失アデノウイルスであってよい。
【００７７】
それらの組換え体を作製する方法及びその組換え体の投与方法に関する情報について、当業者は本明細書に引用されている文献及び国際公開第９０／１２８８２号パンフレットを参照することができる。例えば、ワクシニアウイルスについては、とりわけ米国特許第４７６９３３０号明細書、同第４７２２８４８号明細書、同第４６０３１１２号明細書、同第５１１０５８７号明細書、同第５４９４８０７号明細書及び同第５７６２９３８号明細書；鶏痘については、とりわけ米国特許第５１７４９９３号明細書、同第５５０５９４１号明細書及び同米国特許第５７６６５９９明細書；カナリア痘については、とりわけ米国特許第５７５６１０３号明細書；ブタポックスについては、とりわけ米国特許第第５３８２４２５号明細書；ラクーンポックスについては、とりわけ国際公開第００／０３０３０号パンフレットを挙げることができる。
【００７８】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現されるべき１又は複数のポリヌクレオチドのための１又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又はその挿入部位、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子又はその挿入部位、Ａ型封入体（ＡＴＩ）をコードする領域である。本明細書に引用されている文献、特にワクシニアウイルスに関する文献も参照されたい。カナリア痘の場合、有利には、１又は複数の挿入部位はＯＲＦのＣ３、Ｃ５及び／又はＣ６である。本明細書に引用されている文献、特にカナリア痘ウイルスに関する文献も参照されたい。鶏痘の場合、１又は複数の挿入部位はＯＲＦのＦ７及び／又はＦ８である。本明細書に引用されている文献、特に鶏痘ウイルスに関する文献も参照されたい。ＭＶＡウイルス領域の１又は複数の挿入部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040等の様々な刊行物に見つかるものであり、またこの点に関連して、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396にＭＶＡの全ゲノムが記載されており、これから当業者であれば他の挿入部位又は他のプロモーターを使用することができる。
【００７９】
有利には、発現されるべきポリヌクレオチドはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの調節下に挿入される。ＣＭＶプロモーターは、最小限のプロモーター又は全長プロモーターであってよい（例えば、米国特許第６３６８８２５号明細書参照）。いくつかの有利な実施形態においては、ＣＭＶプロモーターは、より大きな遺伝的アジュバントをベクター中にクローニングすることを可能にする短縮又は切断されたプロモーターである。
【００８０】
有利には、発現されるべきポリヌクレオチドは、特定のポックスウイルスプロモーター、例えばとりわけワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の調節下に挿入される。
【００８１】
特に好ましい実施形態においては、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス（ＨＡＶ）又はイヌアデノウイルス（ＣＡＶ）などのアデノウイルスである。
【００８２】
一実施形態においては、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス、特に血清型が５型のアデノウイルスであって、ウイルスゲノム中のＥ１領域、特にGenbankアクセッション番号Ｍ７３２６０及び参照されている刊行物J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285で開示されているｈＡｄ５の配列のヌクレオチド番号約４５９〜約３５１０の欠失により複製不能にされたものである。この欠失アデノウイルスは、Ｅ１発現２９３（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞、特にＰＥＲ．Ｃ６（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）中で増殖する。このヒトアデノウイルスはＥ３領域、特にヌクレオチド番号約２８５９２〜約３０４７０に欠失があってもよい。Ｅ１領域内の欠失は、Ｅ３領域内の欠失と組み合わされてもよい（例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335；F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許第６１３３０２８号明細書；同第６６９２９５６号明細書；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810参照）。挿入部位は最終的には、Ｅ１及び／又はＥ３領域を一部又は全部欠失させた後のＥ１及び／又はＥ３座（領域）であってよい。有利には、発現ベクターがアデノウイルスである場合、発現されるべきポリヌクレオチドは、強力なプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）、特にM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530のヌクレオチド番号約−７３４〜約＋７のエンハンサー／プロモーター領域又はPromega Corp.社製のｐＣＩベクターのエンハンサー／プロモーター領域などの、真核細胞中で機能するプロモーターの調節下に挿入される。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはマウス又はヒト起源である。伸長因子１αのプロモーターを使用することもできる。筋肉特異的プロモーターを使用することもできる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。強力なプロモーターは、本明細書中でプラスミドベクターとの関連でも記載している。一実施形態においては、スプライシング配列がエンハンサー／プロモーター領域の下流にあってもよい。例えば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離されたイントロン１（R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギ又はヒトのβグロビン遺伝子から単離されたイントロン、特にｂグロビン遺伝子のイントロン２、免疫グロブリン遺伝子から単離されたイントロン、ＳＶ４０初期遺伝子のスプライシング配列、又はマウス免疫グロブリン受容配列（Genbankアクセッション番号ＣＶＵ４７１２０のヌクレオチド番号約８９０〜約１０２２）と融合したヒトβグロビン遺伝子のドナー配列を含むPromege Corp.社製のｐＣＩベクターから単離されるキメライントロン配列。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子（特にGenbankアクセッション番号ＢＯＶＧＨＲＨのヌクレオチド番号約２３３９〜２５５０）、ウサギβグロビン遺伝子又はＳＶ４０後期遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８３】
別の実施形態においては、ウイルスベクターはイヌアデノウイルス、特にＣＡＶ−２である（例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５５２９７８０号明細書；同第５６８８９２０号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第９５／１４１０２号パンフレット参照）。ＣＡＶでは、挿入部位はＥ３領域内にあってもよく、及び／又はＥ４領域と右側ＩＴＲ領域の間の領域にあってもよい（米国特許第６０９０３９３号明細書及び同第６１５６５６７号明細書参照）。一実施形態においては、インサートは、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）又はヒトアデノウイルスベクター用の既に記載したプロモーターなどのプロモーターの調節下にあってもよい。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８４】
別の特定の実施形態においては、ウイルスベクターはイヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）又はネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）などのヘルペスウイルスである。ＣＨＶでは、挿入部位は、特にチミジンキナーゼ遺伝子内、ＯＲＦ３内、又はＵＬ４３ＯＲＦ内であってよい（米国特許第６１５９４７７号明細書参照）。一実施形態においては、発現すべきポリヌクレオチドを、真核細胞中で機能するプロモーター、有利にはＣＭＶ−ＩＥプロモーター（マウス又はヒト）の調節下に挿入してもよい。発現すべきポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入してもよい。
【００８５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、発現ベクターはプラスミドベクター又はＤＮＡプラスミドベクター、特にインビボ用の発現ベクターである。非制限的な具体例においては、ｐＶＲ１０２０又は１０１２プラスミド（VICAL Inc.；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217、例えば、米国特許第５８４６９４６号明細書及び同第６４５１７６９号明細書参照）を、ポリヌクレオチド配列挿入用のベクターとして利用することができる。ｐＶＲ１０２０プラスミドはｐＶＲ１０１２に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含む。一実施形態においては、ヒトｔＰＡシグナルはGenbankアクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４のアミノ酸Ｍ（１）〜アミノ酸Ｓ（２３）を含む。別の非制限的な具体例においては、ポリヌクレオチド配列挿入用のベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankアクセッション番号Ｕ２８０７０のウマＩＧＦ１のアミノ酸Ｍ（２４）〜アミノ酸Ａ（４８）のシグナルペプチド配列を含んでもよい。実施の際に参考又は利用することができるＤＮＡプラスミドについてのさらなる情報は、例えば米国特許第６８５２７０５号明細書；同第６８１８６２８号明細書；同第６５８６４１２号明細書；同第６５７６２４３号明細書；同第６５５８６７４号明細書；同第６４６４９８４号明細書；同第６４５１７７０号明細書；同第６３７６４７３号明細書及び同第６２２１３６２号明細書に見つかる。
【００８６】
プラスミドという用語は、本発明に基づくポリヌクレオチドと望ましい宿主又は標的の１又は複数の細胞内におけるインビボの発現に必要なエレメントとを含むあらゆるＤＮＡ転写単位を包含し、この点に関連し、線状プラスミドのみならず、スーパーコイル、非スーパーコイル、環状プラスミドも本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８７】
さらに、プラスミドはそれぞれ、プロモーターに作動可能に連結されているか又はプロモーターの調節下にあるか又はプロモーターに依存する、異種ペプチド配列、バリアント、アナログ又は断片と融合していてもよい目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、から本質的になる。一般的に、真核細胞内で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト若しくはマウス起源、又は場合によってラット若しくはモルモットなどの別の起源であってもよい、前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサー部分と関連があってもなくてもよい実際のプロモーター部分を含んでよい。ＰＣＴ出願国際公開第８７／０３９０５号パンフレットを初めとして、欧州特許出願公開第２６０１４８（Ａ）号明細書、同第３２３５９７（Ａ）号明細書、米国特許第５１６８０６２号明細書、同第５３８５８３９号明細書及び同第４９６８６１５号明細書を参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はマウスＣＭＶ−ＩＥである。
【００８８】
より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源又は細胞起源のいずれかである。本発明の実施に利用して有用であり得るＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施に利用して有用であり得る強力な細胞プロモーターは、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）などの細胞骨格遺伝子のプロモーターである。
【００８９】
これらのプロモーターの機能的サブ断片、すなわち適切な促進活性を維持しているこれらのプロモーターの部分は本発明に含まれ、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第９８／００１６６号パンフレット又は米国特許第６１５６５６７号明細書に基づく切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターを本発明の実施に使用することができる。したがって、本発明の実施におけるプロモーターには、全長プロモーターの誘導体及びサブ断片であって適切な促進活性を有するもの、したがってプロモーターとして機能するものが含まれ、好ましくは促進活性はこれらの誘導体又はサブ断片が由来する実際の又は全長のプロモーターの促進活性と実質的に類似の促進活性である（例えば、全長ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に対する米国特許第６１５６５６７号明細書の切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性と同様）。したがって、本発明の実施におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、全長プロモーターのプロモーター部分及び／又は全長プロモーターのエンハンサー部分、並びに誘導体及びサブ断片を含むか、から本質的になるか、又はからなってよい。
【００９０】
プラスミドは、他の発現調節エレメント（expression control element）を含むか又はから本質的になることが好ましい。例えばイントロン配列、好ましくはhＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願国際公開第８９／０１０３６号パンフレット）、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）などの安定化配列の組込みが特に有利である。
【００９１】
ポックスウイルス以外のウイルスベクター及びプラスミドのためのポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５１２２４５８号明細書参照）、又はウサギβグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル又はＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルを使用することができる。
【００９２】
本発明の別の実施形態によれば、発現ベクターは、適切な細胞系でタンパク質をインビトロで発現させるために使用される発現ベクターである。発現されたタンパク質は、分泌後（又は分泌後でなくても）、培養液上清中に、又は培養液上清から回収することができ（分泌が起こらない場合は通常、細胞溶解が起こるか又は細胞溶解を行う）、必要に応じて限外ろ過などの濃縮方法で濃縮し、かつ／又はアフィニティー、イオン交換又はゲルろ過クロマトグラフィー法などの精製手段で精製する。
【００９３】
「宿主細胞」とは、遺伝子を改変された原核細胞又は真核細胞、或いは組換えプラスミドやベクターなどの外来性ポリヌクレオチドを投与することでその遺伝子を改変することができる原核細胞又は真核細胞を意味する。遺伝子改変細胞という場合、この用語は、最初に改変された細胞とその子孫の両方を意味する。有利な宿主細胞としては特に限定されないが、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、結腸癌（Ｃａｃｏ−２）細胞、ＣＯＳ７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）系統、ミンク肺（Ｍｖ１Ｌｕ）細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｕ９３７細胞、ＶＥＲＯ細胞等を挙げることができる。所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なクローニングベクター又は発現ベクターに挿入してもよく、次いでベクターを複製又は増幅に適した宿主細胞に導入してもよい。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段で宿主細胞に導入することができる。目的とするポリヌクレオチドを含むベクターは、多くの適切な手段のいずれかを用いて宿主細胞に導入することができ、そのような手段としては、直接的取込み；エンドサイトーシス；トランスフェクション；ｆ接合（f-mating）；エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又は他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；感染（ベクターが感染性であれば、例えばレトロウイルスベクター）等を挙げることができる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は宿主細胞の特徴に拠ることが多い。
【００９４】
有利な実施形態においては、本発明は、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを標的細胞内に送達し、発現させるための治療有効量の製剤の投与を提供する。治療有効量を決定することは当業者の日常的な実験に過ぎない。一実施形態において、製剤は、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターと薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む。有利な実施形態において、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、トランスフェクションを促進し、かつ／又はベクター若しくはタンパク質の保存性を向上させる。
【００９５】
薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、当該技術分野において当業者に周知である。例えば、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、０．９％ＮａＣｌ（例えば、生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であってよい。本発明の方法に使用することができるその他の薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は特に限定されるものではないが、例えばポリ−（Ｌ−グルタメート）又はポリビニルピロリドンを挙げることができる。薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、ベクター（又はインビトロで発明的ベクターから発現されたタンパク質）の投与を容易化するものであれば任意の化合物又は化合物の組合せであってよく、有利には、担体、媒体又は賦形剤はトランスフェクションを容易化し、かつ／又はベクター（又はタンパク質）の保存性を向上させるものであってよい。投与量及び投与体積は、本明細書に一般的な記述で開示されており、当該技術分野の知識と併せてこの開示を読むことで、当業者は過度の実験をせずとも投与量及び投与体積を決定することができる。
【００９６】
抗原は、標準的な賦形剤と組み合わせてもよく、そのような賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩等を挙げることができる。組成物は、ｐＨ調整・緩衝剤、毒性調節剤等、生理学的状態に近づけるために必要な薬学的に許容される補助剤を含んでもよい（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等）。これらの製剤中の抗原の濃度は広い範囲で変更することができ、選択する特定の投与形態及び患者のニーズによって、基本的に液体の体積、粘度、体重等に基づいて選択される。その結果得られる組成物の形態は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、ゲル、クリーム、ローション剤、軟膏、噴霧剤等であってよい。
【００９７】
医薬製剤中の本発明の免疫原性抗原の濃度は、広い範囲で変更することができる、すなわち、重量で約０．１％未満、通常約２％若しくは少なくとも約２％から、多ければ２０％〜５０％、又はそれ以上であり、選択する特定の投与形態によって、基本的には液体の体積、粘度等に基づいて選択される。
【００９８】
有利には、本発明の医薬及び／又は治療用の、組成物及び／又は製剤は、本明細書に記載の１又は複数の発現ベクター及び／又はポリペプチドの治療反応を誘発するのに有効な量含むか、から本質的になるか、又はからなる。有効量は、本明細書に組み込まれている文献及び当該技術分野の知識を含む本開示から、過度な実験なしに決定することができる。
【００９９】
プラスミドベクターに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物の場合、投与量は一般的に、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現する、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ及びさらに有利には約１００μｇ〜約８００μｇのプラスミドを含むか、から本質的になるか、又はからなってもよい。プラスミドベクターに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物をエレクトロポレーションを用いて投与する場合、プラスミドの投与量は通常、約０．１μｇ〜１ｍｇ、有利には約１μｇ〜１００μｇ、有利には約２μｇ〜５０μｇである。投与体積は約０．１〜約２ｍｌ、有利には約０．２〜約１ｍｌであってよい。これらの投与量及び投与体積は、イヌ及びその他の哺乳動物（例えばウマ及びネコ）を標的種とした治療に適している。
【０１００】
治療組成物及び／又は医薬組成物は、遺伝的アジュバント及び／又は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドを発現する組換えウイルス（有利にはＡＡＶ）を、投与量当たり約１０４〜約１０１１、有利には約１０５〜約１０１０、さらに有利には約１０６〜約１０９個のウイルス粒子を含む。ポックスウイルスに基づく治療組成物及び／又は医薬組成物の場合、投与量は約１０２ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕであってよい。医薬組成物は、遺伝的アジュバント及び／又は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドを発現するポックスウイルス組換え体又はヘルペスウイルス組換え体を、投与量当たり約１０５〜１０９、有利には約１０６〜１０８ｐｆｕ含む。
【０１０１】
哺乳動物を標的種とする組成物の投与量体積、例えばウイルスベクターに基づくイヌ用組成物（例えば、非ポックスウイルス型ウイルスベクターに基づく組成物）の投与量体積は、通常約０．１〜約２．０ｍｌ、好ましくは約０．１〜約１．０ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌである。
【０１０２】
新たな細胞培養で産生されたウイルス又は生物又は病原体の不活化組成物については、単回投与単位として約１０４〜１０９等量のＣＣＩＤ５０（不活化前のタイター）、有利には約１０５〜１０８等量のＣＣＩＤ５０で動物に投与することができる。単回投与単位の体積は０．２ｍｌ〜５．０ｍｌ、有利には０．５ｍｌ〜２．０ｍｌ、さらに有利には約２．０ｍｌであってよい。単回投与と複数回投与が可能であり、例えば２〜４週間の間隔を空けて２回注入してもよく、有利には最初の注入から約３週間後に追加免疫してもよい。
【０１０３】
本明細書の開示は例として提供するものであり、本発明がこれらの例に限定されないことが当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当該技術分野の知識から、当業者であれば、各種注入プロトコールで使用される投与回数、投与経路、および投与量を、過度の実験なしに決定することができる。
【０１０４】
本発明の一実施形態は、免疫応答の誘発に有効な量の組換えワクチンの送達及び発現のための製剤を投与することを含む、免疫応答を動物で誘発する方法である。本発明のさらに別の実施形態は、免疫学的応答又は防御反応を動物において誘導する方法であり、該方法は目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチド及び遺伝的アジュバントの送達及び発現のための製剤であって、組換えワクチン及び薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤を含む製剤を動物に有効量投与することを含む。
【０１０５】
本発明は、動物、有利にはヒトの免疫応答を誘発、誘導、又は刺激する方法に関する。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、組換えワクチンと動物において免疫応答を誘発するのに有効な量を送達する方法を実施するための説明書とを含む、動物において免疫学的応答又は防御反応を誘導する方法を実施するためのキットである。
【０１０７】
本発明を、以下に非限定的な実施例を用いてさらに詳細に記載する。
［実施例］
【０１０８】
［実施例１］
分子的アジュバントによるＡＡＶベクターのアジュバント化
以下の分子的アジュバントを、ＳＩＶのｇａｇ抗原を共発現するＡＡＶ１ベクター中にクローニングし、発現させる：ＩＬ−２、ＩＬ−１２、フラジェリン最小ＴＬＲ４結合ドメイン（Flagellin minimal TLR4 binding domain）、ＣＴＡ１−ＤＤ、及びｆａｓ抗原の一バージョン（a version of fas antigen）。フラジェリンの場合、フラジェリン及びＳＩＶ ｇａｇ抗原の融合コンストラクトを発現させる。コンストラクトはそれぞれ、マウスにおける発現、アジュバント機能、ベクターの産生及び免疫応答について評価する。さらに、ＳＩＶ ｅｎｖ抗原を発現するＡＡＶ１ベクターと組み合わせてベクターを与えたときの、非ヒト霊長類におけるベクターの免疫原性及び効果について特徴解析を行う。ＩＬ−２及びＣＴＡ１−ＤＤ配列を最適化し、ＩＬ−２を発現するベクターを構築し、その特徴を解析する。
【０１０９】
［実施例２］
モデル非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるアジュバント評価実験の概要
暴露前の時点（pre-challenge time points）における免疫原性の免疫学的分析（図２）並びに様々なベクターによって誘発された免疫応答の幅、特異性、記憶表現型（memory phenotype）及び機能に焦点を当てた特徴解析を行う。
【０１１０】
表現型、テトラマー（Ａ＊０１．．．等）、ＢＡＬ分析などのフレッシュな分析（fresh analysis）のための時点が利用可能である。暴露前の時点のほとんどで、保管及びレトロスペクティブ解析用にバイアルを凍結する。
【０１１１】
マカクの好ましい暴露モデルは、低投与量での反復粘膜暴露である。有効性の評価は、ウイルス負荷分析及び反応により生成される特異的ワクチンの低レベルモニタリングによって行われる。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
［実施例３］
ＡＡＶアジュバント化ベクターのデザイン
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現するｒＡＡＶベクターのプロトタイプを図３に示す。分子的アジュバントを、最大１．１ｋｂのサイズのＡｆｅ１断片としてベクター中にクローニングする。ＣＭＶカセットが切断されている場合、より大きなアジュバントを導入することができる。これにより得られる、ｒＡＡＶベクターにより発現されるポリタンパク質は、ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ、口蹄疫（ＦＭＤＶ）ウイルス２Ａペプチド及び分子的アジュバントを含む。
【０１１４】
ＦＭＤＶ ２ＡペプチドはＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及び分子的アジュバントのｃｉｓ開裂を仲介する（例えばFurler et al., Gene Ther. 2001 Jun;8(11):864-73参照）。ＦＭＤＶ ２Ａプロテアーゼは、例えば、米国特許第６８９６８８１号明細書；同第６８９３８６６号明細書；同第６８８４６２３号明細書；同第６６３２８００号明細書；同第６５８６４１１号明細書；同第６５３１１３６号明細書；同第６２３２０９９号明細書及び同第６１７１５９２号明細書にも開示されている。
【０１１５】
［実施例４］
ＡＡＶベクター中のインターロイキンアジュバントの発現
ＩＬ−１２コンストラクトは短縮されたＣＭＶプロモーターを含み、ＡＡＶベクターに導入することができる。ＩＬ−１２アジュバントは約１７４３ｂｐであるが、短縮されたＣＭＶプロモーターと一緒にＡＡＶベクター中に導入することができる。
【０１１６】
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現する親ベクタークローンを、遺伝的アジュバントＩＬ−２を発現するクローンと共に図４Ａに示す。得られる、ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏとアカゲザルＩＬ−２とを発現するポリタンパク質も図４Ａに示す。ＩＬ−１２コンストラクトは短縮されたＣＭＶプロモーターを含み、ＡＡＶベクターに導入することができる。
【０１１７】
ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及びＩＬ−２の発現を示すウェスタンブロットを図４Ｂに示す。
【０１１８】
アカゲザルＩＬ−１２を含むＳＩＶアジュバントコンストラクトの一過性のトランスフェクションを図５Ａ及び５Ｂに示す。コンストラクトを図５Ａに示す。ｇａｇ及びＩＬ−１２の発現を示すウェスタンブロットを図５Ｂに示す。
【０１１９】
［実施例５］
ＡＡＶベクター中のフラジェリンアジュバントの発現
フラジェリンコンストラクトは、融合タンパク質がＳＩＶ／ＨＩＶ配列とフラジェリン配列で作製されるため、ＦＭＤＶ ２Ａ開裂部位を有していない。ＳＩＶ ｐｒｏ遺伝子を含まない別のフラジェリンコンストラクトも想定される。
【０１２０】
フラジェリン−ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ融合ベクターのクローニング戦略を図６Ａに示す。作製されたクローン及び予測される前駆体タンパク質を図６Ｂに示す。ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを図６Ｃに示す。
【０１２１】
別のフラジェリンコンストラクトを図７Ａに示す。トランスフェクションされた細胞内におけるｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを図７Ｂに示す。
【０１２２】
［実施例５］
ＡＡＶベクター内のＣＴＡ１−ＤＤアジュバントの発現
インビトロにおけるＣＴＡ１−ＤＤの発現を図８Ａ及び８Ｂに示す。ＣＴＡ１−ＤＤコンストラクトを図８Ａに示す。ＣＴＡ１−ＤＤの発現を示すウェスタンブロットを図８Ｂに示す。
【０１２３】
本発明を、以下の番号を付したパラグラフにさらに記載する。
【０１２４】
１．ウイルスベクターを含む免疫原性又はワクチン組成物であって、該ベクターが遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組成物。
【０１２５】
２．ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、パラグラフ１に記載の組成物。
【０１２６】
３．遺伝的アジュバントがＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓリガンド、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２である、パラグラフ１又は２に記載の組成物。
【０１２７】
４．ウイルスベクターが、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の組成物。
【０１２８】
５．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ４に記載の組成物。
【０１２９】
６．目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ５に記載の組成物。
【０１３０】
７．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド、又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【０１３１】
８．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、パラグラフ１−３のいずれかに記載の組成物と、目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【０１３２】
９．目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ８に記載の製剤。
【０１３３】
１０．目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、パラグラフ９に記載の製剤。
【０１３４】
１１．動物において免疫応答を刺激する方法であって、パラグラフ７〜１０のいずれかに記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【０１３５】
１２．動物において免疫応答を誘発する方法であって、パラグラフ７〜１０のいずれかに記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【０１３６】
１３．動物がヒトである、パラグラフ１１又は１２に記載の方法。
【０１３７】
１４．パラグラフ１１〜１３の方法のいずれかを実施するためのキットであって、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載の組成物又は製剤とパラグラフ１１〜１３のいずれかに記載の方法を実施するための説明書とを含むキット。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態を詳細に記載してきたが、上記パラグラフにより定義される本発明は、上述の特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく多くの明白な変更が可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＡＡＶベクターを用いたＨＩＶワクチンに対する免疫応答への分子的アジュバントの効果を示す図である。
【図２】サンプリング並びに免疫応答及びその有効性の評価を示す図である。
【図３】代表的なＡＡＶアジュバント化ベクターのデザインを示す図である。
【図４Ａ】ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏを発現する親ベクタークローン、遺伝的アジュバントＩＬ−２を発現するクローン、及びＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏとＩＬ−２とを発現するポリタンパク質を示す図である。
【図４Ｂ】ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ及びＩＬ−２の発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】アカゲザルＩＬ−１２を含むＳＩＶアジュバントコンストラクトを示す図である。
【図５Ｂ】ｇａｇ及びＩＬ−１２の発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ａ】フラジェリン−ＳＩＶ ｇａｇ−ｐｒｏ融合ベクターのためのクローニング戦略を示す図である。
【図６Ｂ】作製されたクローン及び予測される前駆体タンパク質を示す図である。
【図６Ｃ】ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図７Ａ】別のフラジェリンコンストラクトを示す図である。
【図７Ｂ】ｇａｇ及びフラジェリンの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図８Ａ】ＣＴＡ１−ＤＤコンストラクトを示す図である。
【図８Ｂ】ＣＴＡ１−ＤＤの発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターを含む免疫原性又はワクチン組成物であって、前記ベクターが遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列と目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含む、組成物。
【請求項２】
ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
遺伝的アジュバントがＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓリガンド、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項１に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項７】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項２に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項８】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項３に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項９】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項４に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項１０】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項５に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項１１】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項６に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１２】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項７に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１３】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項８に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１４】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項９に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１５】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項１０に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１６】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項６に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１７】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項７に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１８】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項８に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１９】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項９に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項２０】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１０に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１】
ウイルスベクターを含む免疫原性又はワクチン組成物であって、前記ベクターが遺伝的アジュバントをコードするポリヌクレオチド配列と目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含む、組成物。
【請求項２】
ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
遺伝的アジュバントがＣＴＡ１−ＤＤ、ｆａｓリガンド、フラジェリン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
目的とする免疫不全ウイルスの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、目的とするＨＩＶ又はＳＩＶの抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項１に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項７】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項２に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項８】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項３に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項９】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項４に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項１０】
目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの送達及び発現のための製剤であって、請求項５に記載の組成物と薬学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む製剤。
【請求項１１】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項６に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１２】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項７に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１３】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項８に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１４】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項９に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１５】
動物において免疫応答を刺激する方法であって、請求項１０に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１６】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項６に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１７】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項７に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１８】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項８に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項１９】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項９に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項２０】
動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１０に記載の製剤を動物の細胞に有効量投与すること及び目的とする抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを前記細胞中で発現させることを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５３５３４３（Ｐ２００９−５３５３４３Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０７８２２（Ｐ２００９−５０７８２２）
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２７３７２
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５０２１５０７６４）インターナショナル エイズ バクシーン イニシアティブ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２７３７２
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５０２１５０７６４）インターナショナル エイズ バクシーン イニシアティブ (3)
【Ｆターム（参考）】
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