エイムステスト用の試薬
【課題】本発明は、変異原性試験用試薬においてエイムステスト用の試薬、並びに当該試薬を用いた測定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のエイムステスト用の試薬は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結することを特徴とする。また、上述の水溶液（イ）、（ロ）およびＳ９（ハ）を重層凍結することをも特徴とする。
【解決手段】本発明のエイムステスト用の試薬は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結することを特徴とする。また、上述の水溶液（イ）、（ロ）およびＳ９（ハ）を重層凍結することをも特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の変異原性（発癌性）を調査するための試薬に関する。さらに本発明は、上記試薬を用いることを特徴とする、変異原性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、わが国や欧米先進国において製造される化学物質は、その種類、量ともに飛躍的に増大し、医薬品、農薬、工業化学品など広範囲な用途に使用されている。一方、これらの化学物質の中には、その安全性が確認されずに生活の場や産業界に導入されたため、薬害、公害、職業病などの原因となったものもあった。これらの苦い経験を繰り返さないために、各国において、古くから規制されている医薬品、農薬などのみならず一般の化学物質についても各種の規制が行われるようになってきた。わが国では、化学物質による職業癌など重篤な疾病の発生を防止するためには、化学物質が職場に導入される前に有害性を調査し、その結果に基づき必要な対策を講じることが必要であることから、昭和５２年に労働安全衛生法が改正され、化学物質の有害性調査制度が制定され、昭和５４年６月３０日から施行された。この制度は、大別して、わが国で新たに製造または輸入される化学物質（新規化学物質）について一定の有害性調査を行うことと、すでにわが国で製造または輸入された化学物質（既存化学物質）について特別の有害性調査を行うことからなっており、新規化学物質については、癌原性の疑いの有無をスクリーニングするために主として変異原性試験を実施することが義務付けられている。
【０００３】変異原性試験方法とは、大別して微生物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、実験動物を用いる方法などがある。微生物を用いる方法は、比較的容易かつ経済的に行えるという長所があり、例えばカリフォルニア大学エイムス氏により開発されたサルモネラ菌を用いる試験（エイムステスト）は、多くの物質について変異原性が検出され、特に塩基対置換型の変異に加えて他の方法（大腸菌による方法など）では検出が難しいフレームシフト型の変異が検出できるため、広く用いられる方法である。これらの方法により、多くの発癌物質が突然変異原性物質であることが明らかになり、また、検出された変異原性物質が発癌物質であったという事例も報告されている。
【０００４】エイムステストでは、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）およびニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む水溶液（ロ）からなるＳ９コファクター、および／またはラット肝臓のホモジネートを９,０００Ｇで遠心分離した肝臓のミクロソーム分画であるＳ９と、上記Ｓ９コファクターからなるＳ９ｍｉｘを試薬として用いている。
【０００５】エイムステスト用の試薬としては、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの試薬が広く市販されているが、保管に関しては−８０℃で保存するのが最も好ましい方法である。しかし、保存、流通などの都合上、−８０℃を維持しておくことは、物理的、コスト的に問題を伴う。例えば、保存、流通時の偶発的温度変化は試薬成分の変性をまねくことになり、管理体制に慎重を要する。そこで、品質の安定性面からも長期間保存に適した試薬の開発が希求されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの品質変性を防止したエイムステスト用の試薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来の問題解決のために鋭意研究に努めた結果、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの組成中、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）とを重層凍結（別々の層になる様に充填し凍結する）することで、保存時の温度変化に対する安定性を向上させて長期間維持することを見いだした。そして、変異原性試験に、重層凍結した本発明の試薬が採用可能であることを見出した。
【０００８】本発明は、例えば労働安全衛生法第５７条の２の新規化学物質の有害性の調査や、同法５７条の３の既存化学物質の有害性の調査などの変異原性試験に関する試薬の提供であって、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬の提供に関する。さらに、前記の水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬をも提供する。
【０００９】また、本発明は、上記する試験において、エイムステスト用の試薬を利用するものである。より詳細には、本発明の試薬を利用し、新しく開発された全ての化学物質について、有害性の調査を行うことにより、癌原性の疑いのある化学物質のスクリーニングや、既存化学物質のうちで、癌その他の重度の健康障害を生じるおそれのあるものについて試験することを含む。
【００１０】本発明のエイムステストとは、本試験には、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium：ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３６、ＴＡ１５３７、ＴＡ１５３８、ＴＡ１００、ＴＡ９８など）のヒスチジン要求株、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＷＰ２ｕｖｒＡ）のトリプトファン要求性株を用いる。該ネズミチフス菌（Ｈｉｓ-：ヒスチジン要求性）と変異原性を調べようとしている試料とを接触させて、ヒスチジンの入っていない寒天培地プレート上で一定時間培養する。この本培養に先立って、プレインキュベートするか否かでプレインキュベート法とプレート法があるが方法は限定されない。培養した結果、試料に変異原性があれば、Ｈｉｓ-菌株に復帰突然変異が起こり、Ｈｉｓ+（ヒスチジン非要求性）菌株となり、プレート上で増殖して菌のコロニーが出現する。変異原性がなければ、Ｈｉｓ-菌株の復帰突然変異は起こらずコロニーの出現はみられない。変異原性の強さは出現するコロニー数で判定される。また、多くの化学物質は、生体内で代謝活性化された後ＤＮＡと反応して変異原性を示すとされている。ネズミチフス菌などの微生物では、この代謝活性化の作用を欠くものが多い。そこで、ネズミチフス菌に代謝活性化を与えて代謝物の変異原性を調べる為に、本発明の変異原性試験用試薬のＳ９ｍｉｘを加えた代謝活性化法を併せて行うことが好ましい。大腸菌を利用する方法も、試験の方法はヒスチジンとトリプトファンが異なるだけで、該ネズミチフス菌を用いる場合と同様である。
【００１１】本発明のエイムステスト用の試薬であるＳ９コファクターの組成は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）からなる。また、Ｓ９ｍｉｘとは、該Ｓ９コファクターにＳ９（ハ）を加えたものである。本発明は、一般に用いられるＳ９コファクター、Ｓ９ｍｉｘの組成、配合量を用いればよく限定されない。例えば、Ｓ９コファクター９ｍＬ当たりの量は、０．４Ｍ 塩化マグネシウム水溶液 ０．２ｍＬ、１．６５Ｍ 塩化カリウム水溶液０．２ｍＬ、１Ｍ グルコース-６-リン酸水溶液 ０．０５ｍＬ、０．１ＭＮＡＤＰＨ水溶液 ０．４ｍＬ、０．１Ｍ ＮＡＤＨ水溶液 ０．４ｍＬ、０．２Ｍ ナトリウム-リン酸緩衝液（ｐＨ７．４） ５ｍＬ、精製水２．７５ｍＬが一般的である。
【００１２】本発明のエイムステスト用の試薬のＳ９コファクターの製造方法は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結することに特徴を有する。すなわち、滅菌条件下で、試験管に水溶液（イ）を一定量添加しこれを凍結させる。ついで、該水溶液（イ）が溶解しないうちに、該凍結の上に水溶液（ロ）を一定量を添加重層して凍結させ、変異原性試験に用いる前まで、凍結保存する。また、上記とは添加順序を逆にして、水溶液（ロ）を凍結した後、その上に水溶液（イ）を添加重層して凍結してもよい。さらに、試験管中のＳ９コファクター組成の最終濃度が変化しないように、凍結した水溶液（イ）の上に精製水の一定量を添加重層して凍結層を構成せしめた後、その上に水溶液（ロ）を添加重層して凍結してもよく、その作製手段は限定されない。このように、各水溶液を添加重層して凍結することを、本発明では重層凍結といい、必須要件とする。
【００１３】また、本発明のエイムステスト用の試薬のＳ９ｍｉｘの製造方法も限定されないが、前述と同様にして水溶液（イ）を凍結後、水溶液（ロ）を添加重層し凍結後、さらにその上にＳ９（ハ）を添加重層後、凍結してもよい。ここで、該水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）の重層凍結の順序は限定されず、適宜変更して行ってもよい。
【００１４】
【発明の実施の態様】本発明のエイムステスト用の試薬は、Ｓ９コファクターと、Ｓ９コファクターとＳ９からなるＳ９ｍｉｘの形態で用いられる。
【００１５】本発明のエイムステスト用の試薬を用いた試験の実施については、微生物を用いる変異原性の試験の一般的手法の手順にしたがって行えばよい。
【００１６】Ｓ９コファクターの調製およびＳ９ｍｉｘの調製表１．Ｓ９コファクター
【００１７】本発明のＳ９コファクターの調整方法は、予め精製水に溶解された塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）およびグルコース-６-リンを含む水溶液（イ）を、クリーンベンチ内で、該水溶液を滅菌済み試験管に添加後、液体窒素にて凍結する。ついで、予め精製水に溶解されたＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ水溶液（ロ）を、クリーンベンチ内で、上記で液体窒素で凍結させた水溶液（イ）の上に添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結する。
【００１８】表２．Ｓ９ｍｉｘ
【００１９】Ｓ９ｍｉｘの調製方法は、上述の水溶液（イ）を、クリーンベンチ内で滅菌済み試験管に添加後、液体窒素にて凍結する。ついで、クリーンベンチ内で、前記で液体窒素で凍結させた水溶液（イ）の上に水溶液（ロ）を添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結する。さらにＳ９（ハ）を添加重層後、凍結する。
【００２０】限定されないが、Ｓ９ｍｉｘ中のＳ９量は０．１ｍＬのＳ９ ／ １ｍＬのＳ９ｍｉｘ（プレート当たり５０μＬ Ｓ９量）を用いる。塩化マグネシウムと塩化カリウムを同じ溶液にすることによって、またはＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを０．２Ｍリン酸緩衝液で溶解することによって、さらにＳ９量を増すこともできる。
【００２１】試験する化学物質の構造によって代謝活性化に最適のＳ９量が異なる。例えば、ジメチルニトロソアミンの場合には、Ｓ９量が多いほど代謝活性化がよい。逆に、アフラトキシンやベンゾ〔ａ〕ピレンの場合には、Ｓ９量が少ない方に最適量がある。しかし、これも用いる動物の種類、薬剤代謝系の誘導物質の種類などでＳ９中の代謝酵素系の質と量が異なるので、最適のＳ９量も異なってくる。一般には、０．１ｍＬのＳ９ ／ １ｍＬのＳ９ｍｉｘを用いる。
【００２２】以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２３】
【実施例】実施例１：エイムステスト用の試薬の保存安定性試験変異原性試験用試薬の−２０℃における加速保存安定性試験を以下の様に行った。
【００２４】（１）混合試薬の調製方法従来の混合試薬として、下表３に示す組成の水溶液を凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）に、予めＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を混合し、メスアップした。氷冷しながら、該混合溶液を、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に９ｍＬずつ添加した。直ちに液体窒素で凍結後、ディープフリーザー（−８０℃）およびフリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２５】（２）二層試薬の調製方法二層試薬として、下表３に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）を重層凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に８ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに１ｍＬずつ添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結して水溶液（イ）の凍結層上に、水溶液（ロ）の凍結層を構成した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２６】表３．Ｓ９コファクター組成
【００２７】（３）Ｓ９ｍｉｘの調製方法Ｓ９ｍｉｘとして、下表４に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）の上にＳ９を重層凍結したものである。Ｓ９については、市販品（オリエンタル酵母工業社製：ラット肝ホモジネート［Ｓ-９］）を用いた。
【００２８】塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および水溶液（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に８．０ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。凍結後、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに１ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。さらに凍結後、滅菌したＳ９を該チューブに１．０ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２９】表４．Ｓ９ｍｉｘ組成
【００３０】各試薬を調製後、-８０℃および−２０℃の２区分で０時間〜６ヶ月間保存した。保存後、氷中にて解凍し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３１】測定結果を図１に示した。図１のＡ３４０ｎｍ／Ａ２６０ｎｍを表した図は、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度測定値の比を調べることで還元型としてのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ量を示している。
【００３２】図１から分かるように、従来の混合試薬と比較して、本発明の塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を別々に重層凍結した二層試薬は、−２０℃での保存でもはるかに保存安定であることが認められた。また、水溶液（イ）水溶液（ロ）の上にＳ９（ハ）を各々別々に重層凍結した本発明のＳ９ｍｉｘについても同様に−２０℃で保存安定であった。さらに、並行して本発明の二層試薬およびＳ９ｍｉｘを各々の各保存期間終了後に、サルモネラ菌ＴＡ９８を用いてエイムステストを行ったが、０時間と代わりない活性を示し製品として大変優良であることが示された。
【００３３】また、三層試薬として、下表５に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）の間に精製水（ニ）を重層凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調製した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および水溶液（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に７．５ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。凍結後、滅菌した精製水（ニ）を該チューブに０．５ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。さらに凍結後、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに２ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）で保存した。
【００３４】表５．Ｓ９コファクター組成
【００３５】結果は本三層試薬においても、各試薬を調製後、-８０℃および−２０℃の２区分で０時間〜６ヶ月間保存した。保存後、氷中にて解凍し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度測定値の比を調べ、還元型としてのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ量を測定し、保存安定性試験を行った。本三層試薬の保存安定性については、−８０℃及び−２０℃ともに変わりなく、ひいては−２０℃での保存条件においても−８０℃と変わりなく試薬として保存安定であることが示された。さらに、並行して三層試薬を各保存期間後に、サルモネラ菌ＴＡ９８を用いてエイムステストを行ったが、０時間と代わりない活性を示し製品として大変優良であることが示された。
【００３６】
【発明の効果】上記の通り、本発明の試薬は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を別々に重層凍結したり、また、水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）を、別々に重層凍結したりすることにより保存安定に優れ、保存時、流通時の偶発的温度変化にも高い活性を長期間維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 −２０℃における保存安定性を、Ａ３４０ｎｍ／Ａ２６０ｎｍの吸光度測定により調べた結果を示す図である
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の変異原性（発癌性）を調査するための試薬に関する。さらに本発明は、上記試薬を用いることを特徴とする、変異原性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、わが国や欧米先進国において製造される化学物質は、その種類、量ともに飛躍的に増大し、医薬品、農薬、工業化学品など広範囲な用途に使用されている。一方、これらの化学物質の中には、その安全性が確認されずに生活の場や産業界に導入されたため、薬害、公害、職業病などの原因となったものもあった。これらの苦い経験を繰り返さないために、各国において、古くから規制されている医薬品、農薬などのみならず一般の化学物質についても各種の規制が行われるようになってきた。わが国では、化学物質による職業癌など重篤な疾病の発生を防止するためには、化学物質が職場に導入される前に有害性を調査し、その結果に基づき必要な対策を講じることが必要であることから、昭和５２年に労働安全衛生法が改正され、化学物質の有害性調査制度が制定され、昭和５４年６月３０日から施行された。この制度は、大別して、わが国で新たに製造または輸入される化学物質（新規化学物質）について一定の有害性調査を行うことと、すでにわが国で製造または輸入された化学物質（既存化学物質）について特別の有害性調査を行うことからなっており、新規化学物質については、癌原性の疑いの有無をスクリーニングするために主として変異原性試験を実施することが義務付けられている。
【０００３】変異原性試験方法とは、大別して微生物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、実験動物を用いる方法などがある。微生物を用いる方法は、比較的容易かつ経済的に行えるという長所があり、例えばカリフォルニア大学エイムス氏により開発されたサルモネラ菌を用いる試験（エイムステスト）は、多くの物質について変異原性が検出され、特に塩基対置換型の変異に加えて他の方法（大腸菌による方法など）では検出が難しいフレームシフト型の変異が検出できるため、広く用いられる方法である。これらの方法により、多くの発癌物質が突然変異原性物質であることが明らかになり、また、検出された変異原性物質が発癌物質であったという事例も報告されている。
【０００４】エイムステストでは、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）およびニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む水溶液（ロ）からなるＳ９コファクター、および／またはラット肝臓のホモジネートを９,０００Ｇで遠心分離した肝臓のミクロソーム分画であるＳ９と、上記Ｓ９コファクターからなるＳ９ｍｉｘを試薬として用いている。
【０００５】エイムステスト用の試薬としては、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの試薬が広く市販されているが、保管に関しては−８０℃で保存するのが最も好ましい方法である。しかし、保存、流通などの都合上、−８０℃を維持しておくことは、物理的、コスト的に問題を伴う。例えば、保存、流通時の偶発的温度変化は試薬成分の変性をまねくことになり、管理体制に慎重を要する。そこで、品質の安定性面からも長期間保存に適した試薬の開発が希求されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの品質変性を防止したエイムステスト用の試薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来の問題解決のために鋭意研究に努めた結果、Ｓ９コファクターおよびＳ９ｍｉｘの組成中、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）とを重層凍結（別々の層になる様に充填し凍結する）することで、保存時の温度変化に対する安定性を向上させて長期間維持することを見いだした。そして、変異原性試験に、重層凍結した本発明の試薬が採用可能であることを見出した。
【０００８】本発明は、例えば労働安全衛生法第５７条の２の新規化学物質の有害性の調査や、同法５７条の３の既存化学物質の有害性の調査などの変異原性試験に関する試薬の提供であって、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬の提供に関する。さらに、前記の水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬をも提供する。
【０００９】また、本発明は、上記する試験において、エイムステスト用の試薬を利用するものである。より詳細には、本発明の試薬を利用し、新しく開発された全ての化学物質について、有害性の調査を行うことにより、癌原性の疑いのある化学物質のスクリーニングや、既存化学物質のうちで、癌その他の重度の健康障害を生じるおそれのあるものについて試験することを含む。
【００１０】本発明のエイムステストとは、本試験には、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium：ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３６、ＴＡ１５３７、ＴＡ１５３８、ＴＡ１００、ＴＡ９８など）のヒスチジン要求株、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＷＰ２ｕｖｒＡ）のトリプトファン要求性株を用いる。該ネズミチフス菌（Ｈｉｓ-：ヒスチジン要求性）と変異原性を調べようとしている試料とを接触させて、ヒスチジンの入っていない寒天培地プレート上で一定時間培養する。この本培養に先立って、プレインキュベートするか否かでプレインキュベート法とプレート法があるが方法は限定されない。培養した結果、試料に変異原性があれば、Ｈｉｓ-菌株に復帰突然変異が起こり、Ｈｉｓ+（ヒスチジン非要求性）菌株となり、プレート上で増殖して菌のコロニーが出現する。変異原性がなければ、Ｈｉｓ-菌株の復帰突然変異は起こらずコロニーの出現はみられない。変異原性の強さは出現するコロニー数で判定される。また、多くの化学物質は、生体内で代謝活性化された後ＤＮＡと反応して変異原性を示すとされている。ネズミチフス菌などの微生物では、この代謝活性化の作用を欠くものが多い。そこで、ネズミチフス菌に代謝活性化を与えて代謝物の変異原性を調べる為に、本発明の変異原性試験用試薬のＳ９ｍｉｘを加えた代謝活性化法を併せて行うことが好ましい。大腸菌を利用する方法も、試験の方法はヒスチジンとトリプトファンが異なるだけで、該ネズミチフス菌を用いる場合と同様である。
【００１１】本発明のエイムステスト用の試薬であるＳ９コファクターの組成は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）からなる。また、Ｓ９ｍｉｘとは、該Ｓ９コファクターにＳ９（ハ）を加えたものである。本発明は、一般に用いられるＳ９コファクター、Ｓ９ｍｉｘの組成、配合量を用いればよく限定されない。例えば、Ｓ９コファクター９ｍＬ当たりの量は、０．４Ｍ 塩化マグネシウム水溶液 ０．２ｍＬ、１．６５Ｍ 塩化カリウム水溶液０．２ｍＬ、１Ｍ グルコース-６-リン酸水溶液 ０．０５ｍＬ、０．１ＭＮＡＤＰＨ水溶液 ０．４ｍＬ、０．１Ｍ ＮＡＤＨ水溶液 ０．４ｍＬ、０．２Ｍ ナトリウム-リン酸緩衝液（ｐＨ７．４） ５ｍＬ、精製水２．７５ｍＬが一般的である。
【００１２】本発明のエイムステスト用の試薬のＳ９コファクターの製造方法は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を重層凍結することに特徴を有する。すなわち、滅菌条件下で、試験管に水溶液（イ）を一定量添加しこれを凍結させる。ついで、該水溶液（イ）が溶解しないうちに、該凍結の上に水溶液（ロ）を一定量を添加重層して凍結させ、変異原性試験に用いる前まで、凍結保存する。また、上記とは添加順序を逆にして、水溶液（ロ）を凍結した後、その上に水溶液（イ）を添加重層して凍結してもよい。さらに、試験管中のＳ９コファクター組成の最終濃度が変化しないように、凍結した水溶液（イ）の上に精製水の一定量を添加重層して凍結層を構成せしめた後、その上に水溶液（ロ）を添加重層して凍結してもよく、その作製手段は限定されない。このように、各水溶液を添加重層して凍結することを、本発明では重層凍結といい、必須要件とする。
【００１３】また、本発明のエイムステスト用の試薬のＳ９ｍｉｘの製造方法も限定されないが、前述と同様にして水溶液（イ）を凍結後、水溶液（ロ）を添加重層し凍結後、さらにその上にＳ９（ハ）を添加重層後、凍結してもよい。ここで、該水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）の重層凍結の順序は限定されず、適宜変更して行ってもよい。
【００１４】
【発明の実施の態様】本発明のエイムステスト用の試薬は、Ｓ９コファクターと、Ｓ９コファクターとＳ９からなるＳ９ｍｉｘの形態で用いられる。
【００１５】本発明のエイムステスト用の試薬を用いた試験の実施については、微生物を用いる変異原性の試験の一般的手法の手順にしたがって行えばよい。
【００１６】Ｓ９コファクターの調製およびＳ９ｍｉｘの調製表１．Ｓ９コファクター
【００１７】本発明のＳ９コファクターの調整方法は、予め精製水に溶解された塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）およびグルコース-６-リンを含む水溶液（イ）を、クリーンベンチ内で、該水溶液を滅菌済み試験管に添加後、液体窒素にて凍結する。ついで、予め精製水に溶解されたＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ水溶液（ロ）を、クリーンベンチ内で、上記で液体窒素で凍結させた水溶液（イ）の上に添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結する。
【００１８】表２．Ｓ９ｍｉｘ
【００１９】Ｓ９ｍｉｘの調製方法は、上述の水溶液（イ）を、クリーンベンチ内で滅菌済み試験管に添加後、液体窒素にて凍結する。ついで、クリーンベンチ内で、前記で液体窒素で凍結させた水溶液（イ）の上に水溶液（ロ）を添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結する。さらにＳ９（ハ）を添加重層後、凍結する。
【００２０】限定されないが、Ｓ９ｍｉｘ中のＳ９量は０．１ｍＬのＳ９ ／ １ｍＬのＳ９ｍｉｘ（プレート当たり５０μＬ Ｓ９量）を用いる。塩化マグネシウムと塩化カリウムを同じ溶液にすることによって、またはＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを０．２Ｍリン酸緩衝液で溶解することによって、さらにＳ９量を増すこともできる。
【００２１】試験する化学物質の構造によって代謝活性化に最適のＳ９量が異なる。例えば、ジメチルニトロソアミンの場合には、Ｓ９量が多いほど代謝活性化がよい。逆に、アフラトキシンやベンゾ〔ａ〕ピレンの場合には、Ｓ９量が少ない方に最適量がある。しかし、これも用いる動物の種類、薬剤代謝系の誘導物質の種類などでＳ９中の代謝酵素系の質と量が異なるので、最適のＳ９量も異なってくる。一般には、０．１ｍＬのＳ９ ／ １ｍＬのＳ９ｍｉｘを用いる。
【００２２】以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２３】
【実施例】実施例１：エイムステスト用の試薬の保存安定性試験変異原性試験用試薬の−２０℃における加速保存安定性試験を以下の様に行った。
【００２４】（１）混合試薬の調製方法従来の混合試薬として、下表３に示す組成の水溶液を凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）に、予めＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を混合し、メスアップした。氷冷しながら、該混合溶液を、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に９ｍＬずつ添加した。直ちに液体窒素で凍結後、ディープフリーザー（−８０℃）およびフリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２５】（２）二層試薬の調製方法二層試薬として、下表３に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）を重層凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に８ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに１ｍＬずつ添加重層した後、直ちに液体窒素で凍結して水溶液（イ）の凍結層上に、水溶液（ロ）の凍結層を構成した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２６】表３．Ｓ９コファクター組成
【００２７】（３）Ｓ９ｍｉｘの調製方法Ｓ９ｍｉｘとして、下表４に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）の上にＳ９を重層凍結したものである。Ｓ９については、市販品（オリエンタル酵母工業社製：ラット肝ホモジネート［Ｓ-９］）を用いた。
【００２８】塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調整した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および水溶液（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に８．０ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。凍結後、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに１ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。さらに凍結後、滅菌したＳ９を該チューブに１．０ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）の２区分にて保存した。
【００２９】表４．Ｓ９ｍｉｘ組成
【００３０】各試薬を調製後、-８０℃および−２０℃の２区分で０時間〜６ヶ月間保存した。保存後、氷中にて解凍し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３１】測定結果を図１に示した。図１のＡ３４０ｎｍ／Ａ２６０ｎｍを表した図は、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度測定値の比を調べることで還元型としてのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ量を示している。
【００３２】図１から分かるように、従来の混合試薬と比較して、本発明の塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を別々に重層凍結した二層試薬は、−２０℃での保存でもはるかに保存安定であることが認められた。また、水溶液（イ）水溶液（ロ）の上にＳ９（ハ）を各々別々に重層凍結した本発明のＳ９ｍｉｘについても同様に−２０℃で保存安定であった。さらに、並行して本発明の二層試薬およびＳ９ｍｉｘを各々の各保存期間終了後に、サルモネラ菌ＴＡ９８を用いてエイムステストを行ったが、０時間と代わりない活性を示し製品として大変優良であることが示された。
【００３３】また、三層試薬として、下表５に示す組成のうち水溶液（イ）と水溶液（ロ）の間に精製水（ニ）を重層凍結したものである。先ず、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を精製水に溶解した水溶液（イ）を調製した。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを溶解後、ｐＨ７．４に調製した水溶液（ロ）を作製した。該水溶液（イ）および水溶液（ロ）を各々氷冷しながら、０．２２μｍフィルターにて減圧しながら濾過滅菌した。クリーンベンチ内にて、滅菌した水溶液（イ）を１３ｍＬ容アシストチューブ（市販品）に７．５ｍＬずつ添加した後、直ちに液体窒素で凍結した。凍結後、滅菌した精製水（ニ）を該チューブに０．５ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。さらに凍結後、滅菌した水溶液（ロ）を、該チューブに２ｍＬずつ添加重層後、直ちに液体窒素で凍結した。ついで、ディープフリーザー（−８０℃）および、フリーザー（−２０℃）で保存した。
【００３４】表５．Ｓ９コファクター組成
【００３５】結果は本三層試薬においても、各試薬を調製後、-８０℃および−２０℃の２区分で０時間〜６ヶ月間保存した。保存後、氷中にて解凍し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ３４０ｎｍおよびＡ２６０ｎｍの吸光度測定値の比を調べ、還元型としてのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ量を測定し、保存安定性試験を行った。本三層試薬の保存安定性については、−８０℃及び−２０℃ともに変わりなく、ひいては−２０℃での保存条件においても−８０℃と変わりなく試薬として保存安定であることが示された。さらに、並行して三層試薬を各保存期間後に、サルモネラ菌ＴＡ９８を用いてエイムステストを行ったが、０時間と代わりない活性を示し製品として大変優良であることが示された。
【００３６】
【発明の効果】上記の通り、本発明の試薬は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液（イ）と、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨを含む水溶液（ロ）を別々に重層凍結したり、また、水溶液（イ）、水溶液（ロ）およびＳ９（ハ）を、別々に重層凍結したりすることにより保存安定に優れ、保存時、流通時の偶発的温度変化にも高い活性を長期間維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 −２０℃における保存安定性を、Ａ３４０ｎｍ／Ａ２６０ｎｍの吸光度測定により調べた結果を示す図である
【特許請求の範囲】
【請求項１】変異原性試験用試薬であって、水溶液（イ）と水溶液（ロ）あるいは、水溶液（イ）、水溶液（ロ）とＳ９（ハ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬。
【請求項２】請求項１記載の水溶液（イ）と水溶液（ロ）が、次の水溶液（イ）と水溶液（ロ）であるエイムステスト用の試薬。
（イ）塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液。
（ロ）ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドを含む水溶液。
【請求項３】変異原性試験方法であって、請求項１ないし２に記載されたエイムステスト用の試薬によって測定する変異原性試験方法。
【請求項１】変異原性試験用試薬であって、水溶液（イ）と水溶液（ロ）あるいは、水溶液（イ）、水溶液（ロ）とＳ９（ハ）を重層凍結してなるエイムステスト用の試薬。
【請求項２】請求項１記載の水溶液（イ）と水溶液（ロ）が、次の水溶液（イ）と水溶液（ロ）であるエイムステスト用の試薬。
（イ）塩化マグネシウム、塩化カリウム、ナトリウム-リン酸緩衝液およびグルコース-６-リン酸を含む水溶液。
（ロ）ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチン酸アミド-アデニンジヌクレオチドを含む水溶液。
【請求項３】変異原性試験方法であって、請求項１ないし２に記載されたエイムステスト用の試薬によって測定する変異原性試験方法。
【図１】
【公開番号】特開２０００−２１７５９４（Ｐ２０００−２１７５９４Ａ）
【公開日】平成１２年８月８日（２０００．８．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−２１０６４
【出願日】平成１１年１月２９日（１９９９．１．２９）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５９４０８７０１２）北山ラベス株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１２年８月８日（２０００．８．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年１月２９日（１９９９．１．２９）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５９４０８７０１２）北山ラベス株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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