エキノカンジン系薬物に対する耐性の分析方法
真菌遺伝子ＦＫＳ１の短い２つの領域に生じる突然変異に関する核酸増幅分析法。これらの標的配列中の突然変異はエキノカンジン系薬物に対する耐性と関連することが示されている。分析法は、塩基配列決定による検出または標識されたハイブリダイゼーションプローブによる検出を含みうる。さらに、そのような分析法を実施するためのプライマー、プローブおよび試薬のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真菌の核酸分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染症は重病患者における発病および死亡の重要な原因であり、その影響は、真菌感染症であることを迅速に診断し効果的に治療することに失敗すると深刻化する。抗真菌薬を広範に使用してきた結果、天然の耐性真菌種の淘汰だけでなく、感受性菌種における耐性の出現を招いてきた。真菌病の治療は、利用可能な抗真菌薬の種類がほとんどないことによって阻まれている。最近、β−（１→３）−Ｄ−グルカン・シンターゼを阻害することにより真菌細胞壁を標的とする新しい種類のエキノカンジン系薬物の最初のものとして、カスポファンギンが臨床に導入された。カスポファンギンの使用は急速に増大しており、インビトロにおける感受性の低下したカンジダ属菌種の臨床分離株が、治療の失敗とインビトロにおける高い最小阻止濃度ＭＩＣの値との間の強い関連性とともに報告されている。患者のカスポファンギンへの曝露が増大するにつれ、またミカファンギンやアニデュラファンギンなどの他のエキノカンジン系薬物が市場に参入するにつれ、ＭＩＣ値の高い臨床分離株の数が増すであろうことが予想される。
【０００３】
エキノカンジン類は、ここ数十年の間に市場に参入した最初の新しい主要な種類の抗真菌薬である。真菌は、細胞壁構造がなくては生存することができず、あるいは何らかの形で細胞壁構造が著しく変化した場合ですら生存することができないので、真菌が細胞壁の完全性を維持することは非常に重要である。細胞壁は、糖タンパク質の外側層と、グルカン、キチンおよびガラクトマンナンを含む炭水化物ポリマーの内側層とで構成される層状組織を備えた細胞外マトリックスである。腐生性真菌および病原性真菌では、炭水化物層は主としてβ（１→３）−グルカンおよびα（１→３）−グルカンから成るが、さらに多少のβ（１→６）−グルカンおよびキチンを含んでいる。グルカンはまたエキソポリマーとして真菌細胞壁から真菌感染症患者の血液中に放出され、様々な先天性免疫応答を活性化することが知られている。細胞壁の生合成の際には構成ポリマーは絶えず化学的に修飾されかつ再構成されるので、真菌細胞壁は動的な構造体である。例えば、β（１−３）−グルカンの形成を担うグルカン・シンターゼ複合体の触媒サブユニットと推定されるＦｋｓ１ｐは、皮質のアクチンパッチ内に局在することが知られている。Ｆｋｓ１ｐは細胞壁の再形成部位へと細胞表面上を移動し、Ｆｋｓ１ｐが動けない細胞は細胞壁の構造および機能が不完全である。Ｆｋｓ１ｐはＦＫＳ１遺伝子の産物である。エキノカンジンは、脂肪アシル側鎖にＮ−結合した環状ヘキサペプチドであり、主要な細胞壁生体高分子の生合成を担うβ（１→３）−Ｄ−グルカン・シンターゼを阻害する。エキノカンジン系薬物であるカスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギンは、β−１，３−グルカン・シンターゼを阻害することにより真菌細胞壁を標的とする新しい種類の抗真菌化合物の筆頭である。最初に承認された薬物であるカスポファンギンの、真菌感染症の治療における安全性および忍容性は、大多数の患者において臨床または実験室における薬物に関連した深刻な有害事象が報告されることなく、最近のいくつかの研究において評価されている。
【０００４】
これらの薬物は、既存の抗真菌薬に対する交差耐性を伴わずカンジダ属およびアスペルギルス属菌種に対する広域スペクトルの抗真菌活性を有しており、したがってアゾール耐性の酵母およびカビに対して有効である。重要なことは、エキノカンジン類は細胞壁に重大な影響を与えるため酵母に殺菌性を有することである。エキノカンジン類はカビに対して活性を有するが、単に成長している菌糸先端を阻害するように見える。しかしながらエキノカンジン類は、侵入性を有する接合菌網、クリプトコックス・ネオフォルマンスまたはフザリウム属菌種に対する活性は低いが、アスペルギルス属菌種に対しては臨床的に非常に有効である。カスポファンギンは、多くの重大な真菌感染症、たとえば難治性であるかまたは他の治療法に耐えられない患者における侵入性アスペルギルス症、食道のカンジダ症、カンジダ血症、および他のカンジダ感染症（腹腔内の膿瘍、腹膜炎および胸膜腔感染を含む）などの治療に関して米国およびその他の国々で承認されている。カスポファンギンはまた、持続性発熱および好中球減少の患者において疑われる真菌感染症の経験療法についても指摘されている。カスポファンギンは現在、ボリコナゾールのようなトリアゾール系薬物と共に、酵母およびカビに対する初期の抗真菌療法に広く使用されている。類縁の薬物であるミカファンギンおよびアニデュラファンギンの参入により、臨床現場におけるこの非常に効果的な新しい種類の薬物の作用域がさらに拡がるであろう。
【０００５】
最初に承認されたエキノカンジンが２００２年に市場に参入して以来、クリニックでのカスポファンギンの使用は急速に増大しており、これは特にアメリカ合衆国におけるカスポファンギンの表示ラベルが、食道のカンジダ症、カンジダ血症および他のカンジダ感染症、ならびに経験療法を含むように最近拡張されたからである。カスポファンギンに対するインビトロでの感受性が低下したカンジダの臨床分離株が報告されており、インビボでの失敗とインビトロでのカスポファンギンＭＩＣ値上昇との間の相関が注目されてきたが、最小阻止濃度（ＭＩＣ）の値と臨床成績との間の厳密な相関は未だ確立されていない。患者のカスポファンギンへの曝露が増大し、またミカファンギン（２００５年６月）およびアニデュラファンギンが市場に参入するにつれ、ＭＩＣ値の高い臨床分離株の数が増加し、また、ますます多くの患者が薬物感受性の低下に起因する治療の失敗に陥るであろうことが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、真菌類、限定するものではないがカンジダ属の真菌などにおける、エキノカンジン系薬物に対する耐性に関連した遺伝子突然変異を検出する核酸分析法である。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＦＫＳ１タンパク質をコードする特定の領域の指数関数的な核酸増幅を、好ましくは塩基配列決定または対立遺伝子を識別できる標識プローブを用いた検出のうちいずれかと組み合わせて使用するような核酸分析法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、前述の分析法を行なうための、試薬ならびにプライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチド・セットのキットである。
本発明は、カンジダ属のような酵母およびアスペルギルス属のようなカビなどの真菌における、カスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギンを含むエキノカンジン系薬物に対する耐性を付与する突然変異を検出する核酸分析法を含む。該分析法は、真菌を含むかまたは真菌を含む疑いのある任意のサンプル、限定するものではないがヒトから得たサンプル、例えば血液、尿、または組織サンプルに適している。カンジダ属菌種としては、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ギリモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂａｔｒａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびＣ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）が挙げられる。アスペルギルス属菌種には、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）が挙げられる。該分析法の標的は、ＦＫＳ１ｐファミリータンパク質中の２つの保存された領域のうち一方、または好ましくは両方に対応する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）配列である。本発明者らが第１領域またはＨＳ１と呼ぶ領域は、アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐのＰｈｅ６４１〜Ｐｒｏ６４９に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、各々の保存領域の一端または両端の１個、２個または数個、最大５個の追加アミノ酸に相当する場合もある。本発明者らが第２領域またはＨＳ２と呼ぶ領域は、アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐのＡｓｐ１３５７〜Ｌｅｕ１３６４に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、両端の追加アミノ酸、ＣａＦｋｓ１ｐのアミノ酸１３４５からＬｅｕ１３６４を越えて１個、２個または最大５個のアミノ酸まで（例えばアミノ酸１３４５−１３６９）に相当する場合もある。実験室株および臨床分離株を使用して、本発明者らはエキノカンジン耐性を付与するいくつかの突然変異を上記領域中に同定した。本発明者らが使用した実験室株の中には、ＣＡＩ４およびＭ７０（実施例２を参照）ならびに本発明者らが作製した実験室突然変異株（本明細書では「ＮＲ」株（例えばＮＲ２）とする）がある。この実験室株および臨床分離株から、本発明者らは、耐性を与えるいくつかの単一アミノ酸の変化、例えばＦ６４１Ｌ、Ｆ６４１Ｓ、Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆ、Ｄ６４８Ｙ、Ｐ６４９Ｈ、Ｒ１３６１ＨおよびＲ１３６１Ｇなど、ならびに該アミノ酸の変化の原因であるいくつかのＳＮＰを同定した。
【００１０】
本発明の分析法は、上述のアミノ酸配列に対応する、または同配列をコードする、前述の標的配列すなわち標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む核酸配列の増幅を含む。指数関数的に増幅する任意の方法、例えば、いずれも当技術分野においてよく知られている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）（米国特許第４，９６５，１８８号明細書および国際公開公報第０３／０５４２３３Ａ１号パンフレットを参照）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己維持配列増幅）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）およびＱβレプリカーゼを介した増幅などを使用することができる。
【００１１】
増幅された標的配列中の突然変異の検出は、任意の方法、たとえば限定するものではないが塩基配列決定法および標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する検出法などにより実施できる。塩基配列決定法には、例えば従来のジデオキシ法およびパイロシークエンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）があり、これらはいずれも当技術分野において周知である。ハイブリダイゼーションプローブを利用する検出法は、増幅の後で実施してもよい、すなわち終点検出でもよいし、あるいはリアルタイムで実施してもよい、すなわち増幅の際に実施してもよい。ハイブリダイゼーションプローブを使用するリアルタイムの方法には、米国特許第５，４８７，９７２号明細書および米国特許第５，５３８，８４８号明細書に記載の５’ヌクレアーゼ検出法；米国特許第５，９２５，５１７号明細書に記載の分子ビーコンのプローブを利用する検出法；ＦＲＥＴ‐プローブ対を使用する検出法；リ、キュー．（Ｌｉ，Ｑ．）ら、（２００２）「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第３０巻（２）ｃ５に記載の二本鎖プローブを使用する検出法；ならびにアフォニア（Ａｆｏｎｉａ）ら、（２００２）「Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 第３２巻、ｐ．９４６−９に記載の副溝結合（ＭＧＢ）プローブが挙げられる。
【００１２】
本発明のプローブ検出法は、対立遺伝子を識別する少なくとも１つのプローブ；すなわち、一方の対立遺伝子（例えば野生型配列）にはハイブリダイズし、その対立遺伝子からのシグナルを生成させるが、他方の対立遺伝子（例えば突然変異の対立遺伝子）については使用した検出条件下においてハイブリダイズせずシグナルも生成させないプローブ、を使用する。対立遺伝子を識別するプローブは一般に、やや短い結合配列、典型的には長さ２５ヌクレオチド以下で、多くの場合２５ヌクレオチドより５−１０ヌクレオチド短い結合配列を有している。本発明による薬剤耐性突然変異体の検出には、標的配列全体を調べるために２以上のプローブを利用する場合がある。複数のプローブを用いて特定の突然変異を同定することも可能である、すなわち１つのプローブが、特定のヌクレオチド部位に生じることが知られた、または生じる疑いのあるそれぞれの突然変異について特異的であってもよい。複数のプローブを用いる分析法は、各々１つのプローブを含む並列の増幅だけでなく、各反応槽が２以上の異なるプローブを含む部分的または全体的に多重化された分析を含む場合がある。
【００１３】
本発明による分析キットはプローブおよび増幅プライマーを含んでいる。一般に、プライマーはリポーター・プローブとしての機能は果たさないが、そうしてはならないわけではない。例えば、いわゆる「サソリ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）」プライマーには、ヘアピンプローブ、または分子ビーコンプローブが結合している。ウィトカム（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ）ら（１９９４）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ−Ｐｒｏｂｉｎｇ Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１１７巻、ｐ．８０４−８０７）。分析キットは、増幅および検出に必要なすべての試薬、少なくとも必要なプライマー、プローブ、重合酵素およびｄＮＴＰを含むことが好ましい。分析キットは、他の目的のための、例えば対照オリゴヌクレオチドの増幅のためのプライマーおよびプローブを含む場合もある。キットはさらにサンプル調製試薬を含んでもよい。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも分析用のプライマーおよびプローブを含んでいるオリゴヌクレオチド・セットを含む。任意選択でそのようなセットに対照オリゴヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００１５】
本発明の１以上の実施形態の詳細について、添付の図面および以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的および利点は、該説明および図面から、また特許請求の範囲から明白になるであろう。
【００１６】
本願において使用されるように、一定の略語が用いられる。
ＧＳはグルカン・シンターゼの略語である。
Ｆｋｓ１ｐは、現在β（１−３）−グルカン形成を担うグルカン・シンターゼ複合体の触媒サブユニットとされているＦｋｓ１タンパク質の略語である。
【００１７】
ＦＫＳ１はＦｋｓ１ｐをコードする遺伝子である。
ＣａＦｋｓ１ｐはＣ．アルビカンスのＦｋｓ１タンパク質である。
ＣａＦＫＳ１はＣ．アルビカンスのＦＫＳ１遺伝子である。
【００１８】
Ｓｅｒ６４５は、あるアミノ酸（この例ではセリン）と、タンパク質中での該アミノ酸の位置とを指定するための通常の命名法である。ＣａＦｋｓ１ｐでは、セリンはアミノ酸番号６４５である。
【００１９】
Ｓ６４５Ｐは突然変異を表しており、最初に野生型タンパク質のアミノ酸（この例では「Ｓ」、セリン）を；次にそのアミノ酸の位置（この例では「６４５」で、野生型ではＳｅｒ６４５を示す）を；そして最後に突然変異アミノ酸（この例では「Ｐ」、プロリン）を示している。
【００２０】
Ｔ１９３３Ｃは、１９３３位のヌクレオチドにおけるＴからＣへの遺伝子突然変異を表している。遺伝子ＣａＦＫＳ１では、１９３３位のヌクレオチドはＣａＦｋｓ１ｐのＳｅｒ６４５をコードするトリプレット内にあり、突然変異によりアミノ酸の変化がもたらされる。
【００２１】
ＳＮＰは「一塩基多型」の略語である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
真菌のＦＫＳ１遺伝子から対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて１，３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼ（ＧＳ）サブユニットＦｋｓ１ｐとなる。本発明による分析法は、真菌において保存されている２つの短い遺伝子領域のうち一方または両方における突然変異を検出することを目指している。カンジダ属および一部のアスペルギルス属菌種のアミノ酸配列ならびに該アミノ酸配列に対応する遺伝子配列のいずれも周知である。
【００２３】
いくつかのＣａＦＫＳ１配列が利用可能である。増幅プライマーおよびプローブのデザインについて、本発明者らは３つのもの、すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５、Ｆ０２７２９５およびＣＡ２０４３を利用した。図１Ａおよび１Ｂはヌクレオチド配列Ｄ８８８１５を示す。図２は、ＣａＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列を示す。図１Ａおよび１Ｂでは、本発明の分析法の標的に含まれている２つの短いＤＮＡ配列に下線が付されている。該配列は、ＣａＦＫＳ１についてはヌクレオチドＴ１９２１〜Ｔ１９４７、およびＧ４０６９〜Ｇ４０９２に及ぶ。図２では、これに対応するＣａＦｋｓ１ｐの短いアミノ酸配列に下線が付されている。該配列は、Ｆ（Ｐｈｅ）６４１〜Ｐ６４９、およびＤ１３５７〜Ｌ１３６４に及ぶ。
【００２４】
様々な真菌におけるＦｋｓ１タンパク質を生産するアミノ酸の配置については、通常のアラインメントにより位置が示される。図３は、Ｃ．アルビカンスおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のアラインメントを示す。線よりも上方には、Ｃ．アルビカンスの野生型タンパク質ＣａＦｋｓ１ｐの、アミノ酸６４１（Ｐｈｅ６４１）からアミノ酸６４９（Ｐｒｏ６４９）までの部分配列がある。この配列は、Ｓ．セレビシエのＦｋｓ１ｐアミノ酸配列のアミノ酸６３９（Ｐｈｅ６３９）〜６４７（Ｐｒｏ６４６）に非常によく似ている。線よりも下方には、Ｃ．アルビカンスの野生型タンパク質ＣａＦｋｓ１ｐの、アミノ酸１３５７（Ａｓｐ１３５７）からアミノ酸１３６４（Ｌｅｕ１３６４）までの部分配列がある。この配列は、Ｓ．セレビシエのＦｋｓ１ｐアミノ酸配列のアミノ酸１３５３（Ａｓｐ１３５３）〜１３６０（Ｌｅｕ１３６０）に非常によく似ている。同様のアラインメントを、他の真菌種のＦｋｓ１タンパク質について行うこともできる。
【００２５】
１生物種の適切なアミノ酸配列について記載すれば、当業者がそのアミノ酸配列に対応する遺伝子配列を知るのには十分であり、その逆も同様である。さらに、１生物種の適切なアミノ酸配列の配置について記載すれば、当業者が他の生物種の対応するアミノ酸配列の配置や、従って対応する遺伝子配列の配置を知るのには十分であり；また、１生物種の適切な遺伝子配列の配置について記載すれば、当業者が他の生物種における遺伝子配列の配置を知り、そこから対応するアミノ酸配列の配置を知るのには十分である。本発明者らは主としてＣ．アルビカンスおよびＣ．クルセイを用いて研究してきたので、本明細書中の説明はＣ．アルビカンスのアミノ酸および遺伝子配列に基づいている。Ｃ．アルビカンスのＦＫＳ１遺伝子（ＣａＦＫＳ１）の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５である。これに対応するＣ．アルビカンスのアミノ酸配列（ＣａＦｋｓ１ｐ）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ２１５３５である。他の生物種の配列は：アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ｕ７９７２８；アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ＡＡＣＤ０１００００６１；カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、ＣＲ３８０９５３；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、ＤＱ０１７８９４；クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ＡＡＥＹ０１００００７０；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ＡＦ１４８７１５；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ＸＭ３２７１５６；ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ＡＦ１９１０９６；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｕ０８４５９；ヤロウィア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ＣＲ３８２１３１である。
【００２６】
本発明の分析法は、図２において下線を付した２つの短いアミノ酸配列に対応する核酸配列、好ましくはＤＮＡ塩基配列を対象とする。下線を付した第１の配列に関して、第１の標的配列は、（ＣａＦｋｓ１ｐを基準とすれば）Ｐｈｅ６４１〜Ｐｒｏ６４９を最小限として、任意選択で一端または両端に１〜５個、好ましくは１または２個の追加アミノ酸をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。下線を付した第２の配列に関して、第２の標的配列は、Ａｓｐ１３５７〜Ｌｅｕ１３６４を最小限として、任意選択で一端または両端に１〜５個、好ましくは１または２個の追加アミノ酸をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。
【００２７】
本発明による分析法は、第１の標的配列を含む第１の核酸領域の増幅を含んでいる。本発明による好ましい分析法は、第２の標的配列を含む第２の核酸領域の増幅も含んでいる。第１の領域および第２の領域の両方を、両領域にかかる１組のプライマー対を使用して増幅することができる。別例として、２対のプライマー、すなわち第１の領域にかかる第１のプライマー対および第２の領域にかかる第２のプライマー対を利用してもよい。特に、標的配列中の突然変異を検出するために塩基配列決定法を利用することになっている場合、本発明者らはより短いアンプリコンを、従って２組のプライマー対の利用を選択する。上に示されるように、本発明の分析法は特定の増幅法に限定されない。実施例に反映されているように、本発明者らは現在までポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法を利用して検討してきたが、他の方法を使用してもよい。
【００２８】
標的配列中の突然変異は塩基配列決定法によって検出することができる。実施例に反映されているように、本発明者らはサイクルシーケンシングを利用したが、他の塩基配列決定法が使用されてもよい。標的配列中の突然変異の検出は、分析法において野生型の標的配列と突然変異を含む配列とを識別するハイブリダイゼーションプローブを利用することによってなされてもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいし、またはこの２つの組み合わせでもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、非天然ヌクレオチド例えば２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでもよい。該プローブは、非天然のヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエート結合を含んでもよい。該プローブはＰＮＡであってもよい。本発明の分析法に有用なハイブリダイゼーションプローブには、標的配列の対立遺伝子にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを生じるプローブが挙げられる。好ましいプローブは蛍光標識され、検出可能な蛍光シグナルを生じる。ハイブリダイゼーションプローブを使用する検出は、終点検出（すなわち増幅完了後の検出）とすることができる。本発明の好ましいプローブ分析法は、均一系の分析法、すなわち、結合していないプローブから結合したプローブを分離する必要のない分析法である。より好ましい均一系の分析法には、リアルタイム検出（最も好ましくはリアルタイム蛍光検出）、すなわち増幅の間に複数回検出する方法がある。リアルタイム増幅分析法については、本発明者らは、２重蛍光標識プローブ、最も好ましくは、フルオロフォアと、さらに４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）のような非蛍光性の消光剤とで標識されたプローブがよいと考える。
【００２９】
任意の適切なプローブ系探査方法をリアルタイム分析に利用可能であり、該方法には、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光を発するＳＹＢＲ色素のようなＤＮＡ蛍光色素と組み合わせてハイブリダイゼーションプローブを利用する方法がある。例えば、ＳＹＢＲグリーン色素を増幅の検出に使用し、対立遺伝子を識別可能な蛍光ハイブリダイゼーションプローブを、野生型の標的配列の増幅を検出するために、ホモ接合の野生型の標的、突然変異型と野生型とのヘテロ接合の標的、またはホモ接合の突然変異型の標的の存在を示すプローブ蛍光の傾きと共に使用することができる。別の手法は、増幅された標的配列（野生型または突然変異型）の一方の鎖を検出するための、ミスマッチを許容するプローブと、標的配列が突然変異しているかどうか判断するための、対立遺伝子特異的なプローブまたは他方の鎖にハイブリダイズ可能なプローブとを利用することであろう。別例として、実施例で実証されているように、野生型の標的配列および特定の突然変異の存在を示すために複数のプローブを利用することもできる。本発明者らは、カスポファンギン感受性の低下をもたらすいくつかの突然変異を第１および第２の標的配列中に同定した。第１の標的配列では、該突然変異は（ＣａＦＫＳ１を基準にすると）Ｔ１９２１Ｃ、Ｔ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｃ１９３４Ｇ、Ｇ１９４２ＴおよびＣ１９４６Ａである。第２の標的配列では、該突然変異は（ＣａＦＫＳ１を基準にすると）Ｃ４０８１ＧおよびＧ４０８２Ａである。
【００３０】
突然変異の分析およびＳＮＰ遺伝子型決定のための多種多様な分子レベルの方法が利用可能である。なかでも、自己報告性の分子ビーコンプローブを用いて検出されるリアルタイムＰＣＲは、強力な手法の代表である。分子ビーコンプローブは、そのヘアピン構造に起因して、分子内ハイブリダイゼーションと分子間ハイブリダイゼーションとの間で熱力学的に調節された平衡状態から、非常に近似した標的配列を、対応する直線状プローブに比べてより特異的にかつより広い温度範囲で識別するように設計することが可能である。分子ビーコンの識別力は、抗生物質耐性をもたらす突然変異の分析、対立遺伝子の区別、ホモ接合型およびヘテロ接合型のＳＮＰ、ならびに他の数多くの用途に適用されて成功している。
【００３１】
分子ビーコンプローブの選択性は、カスポファンギンに対する感受性の低下をもたらすＣａＦＫＳ１対立遺伝子の分析に有用であった。本発明者らが「ＨＳ１」配列と呼ぶ第１の標的配列についての分析法は、ＣａＦＫＳ１のコドン６４５の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔに注目したものであり、該突然変異は、カスポファンギンに対する感受性の低下を示すＣ．アルビカンス臨床分離株を用いて同定されたものである。標的領域中の耐性対立遺伝子を検出するための対立遺伝子特異的プローブの設計は、この領域内にＳＮＰ（Ｔ１９２９Ａ）があるという事実によって複雑になった。多くの臨床分離株に出現するこのＳＮＰに対応するために、ＳＮＰに相当する部位に揺らぎ塩基を用いてプローブを設計した。所与の条件下ではプローブ分子プールの半分だけが相補的な標的ＤＮＡに結合するので、プローブへの揺らぎ塩基の導入により蛍光の全体的な出力は減少した。しかしながら、そのようなプローブはＣａＦＫＳ１中にＴ１９２９Ａ ＳＮＰが存在するか否かにかかわらずＣ．アルビカンス集団全体との反応性を有するため、縮重プローブの高い融通性から得るものは、絶対的な蛍光強度の損失よりもはるかに大きかった。
【００３２】
ＣａＦＫＳ１の１つの野生型対立遺伝子および３つの突然変異型対立遺伝子に対応する４つの縮重分子ビーコンを合成し、４つのプローブはすべて、ほとんどの標的について一致シグナルとミスマッチシグナルとの比が１００％近い優れた識別特性を示した。相補的なＤＮＡ標的との特異的ハイブリダイゼーションだけが４つのプローブすべてについて観察された。唯一の例外は、分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴとＴ１９２２Ｃ対立遺伝子を含む鋳型との軽微なハイブリダイゼーションであった。この結果は、該ミスマッチのプローブ領域内での位置が外側寄りであることと、比較的安定したＤＮＡ−ＤＮＡミスマッチ対合であることが知られているＴ・Ｇミスマッチを形成するエネルギー論とよって説明することができる。対立遺伝子のヘテロ接合の場合には、分子ビーコンプローブ（野生型および突然変異型の配列を認識する）により、ホモ接合の鋳型と比較して２分の１の大きさの蛍光シグナルが生じた。
【００３３】
カスポファンギンに対する感受性が低下した突然変異体の生成はまれな事象であり、生細胞当たり突然変異体＜１０−８の突然変異頻度に一致していた。耐性変異の形成にはカスポファンギン含有固形培地上でのインキュベーションを延長する必要があり（＞７日）、そこで残余の細胞増殖が生じた。本発明者らは、薬物に曝露する前にＣ．アルビカンス培養物中にカスポファンギン耐性細胞を観察したことがない。対立遺伝子特異的な分子ビーコンにより、２つの異なる菌株由来の８５個の自然発生した感受性低下突然変異体を分析した。ＣＡＩ４株の分離株３５種で見つかった突然変異は、すでに述べたＳｅｒ６４５のコドンに影響する置換と同一であった。そのような突然変異はまた、Ｍ７０株のカスポファンギン耐性誘導株５０種の大多数を占めていた。３つの新しい突然変異、すなわちＰｈｅ６４１、Ｌｅｕ６４４およびＳｅｒ６４５のコドンに影響を及ぼすＴ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｃ１９３４Ｇが、Ｍ７０由来の自然発生した突然変異体のうち６株において検出された。これらの結果は、カスポファンギンに対する感受性が低下したＣ．アルビカンスの実験室株および臨床株についての最近の突然変異分析と一致している。大多数のヌクレオチド置換はＣａＦＫＳ１のコドン６４５で見つかった。ＣａＦＫＳ１の他の部位で新しく発見された突然変異は唯一Ｍ７０株の子孫で見つかり、その相対頻度は１２％以下であった。
【００３４】
全体として、個々の分子ビーコンの適用により、カスポファンギン耐性誘導株８５種すべての遺伝子型を決定することができた。分子ビーコンが標的とした３つの対立遺伝子は７９株中に正確に同定され、ＤＮＡ塩基配列分析によって確認された。６株中の、分子ビーコンが標的としなかった３つの新しい突然変異も、ＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。１つの反応において４つの分子ビーコンすべてを多重使用することにより、ＣａＦＫＳ１の第１の標的配列中のカスポファンギン耐性突然変異を検出する普遍的な閉管分析法がもたらされた。そのような分析法では、ＦＡＭシグナルにより野生型ＣａＦＫＳ１対立遺伝子の存在が示され、ＨＥＸ蛍光からはＤＮＡサンプル中にＴ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４ＴのＣａＦＫＳ１突然変異のうち１つが存在することが報告された。上記３つの突然変異のうちいずれかについてヘテロ接合のＣ．アルビカンス株から抽出されたＤＮＡは、ＦＡＭシグナルおよびＨＥＸシグナルの両方を生じた。したがって、該分析法により、ホモ接合型およびヘテロ接合型のいずれの状態でも、カスポファンギン感受性を低下させるＣ．アルビカンスＣａＦＫＳ１遺伝子中の既知突然変異を確実に検出することが可能となった。該分析法はまた、薬物感受性に影響を及ぼす可能性のある領域中の他の突然変異を同定するのに十分な感度であった。
【００３５】
上述のように、本発明者らは、カスポファンギン感受性の低下に関連した突然変異がＣａＦＫＳ１中の短い保存領域にマッピングされることを示した。最も顕著な部位はＳｅｒ６４５であって置換Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆを含み、これらの置換はＣ．アルビカンスの実験室株および臨床分離株のいずれにおいても見出された。該突然変異は優性のようであり、ヘテロ接合およびホモ接合のいずれの状態においても高レベルのカスポファンギン耐性をもたらした。そのような突然変異を標的とする診断プローブは、Ｃ．アルビカンスにおいてカスポファンギン耐性を検査するための迅速かつ正確なツールを提供することができる。
【００３６】
ＦＫＳ１突然変異の分析に基づいたカスポファンギン耐性の迅速な診断法は、単一ヌクレオチドの違いを有するヘテロ接合およびホモ接合の対立遺伝子を識別する能力を有すると共に、そのような対立遺伝子を多重形式で同時に検出する能力を有していなければならない。分子ビーコン技術は、対立遺伝子の識別および多重検出の両方について優れた技術の代表である。
【００３７】
カスポファンギンに対する感受性が低下した５０を超えるＣ．アルビカンス臨床分離株および実験室分離株についてＣａＦＫＳ１のＤＮＡ塩基配列を分析したところ、それぞれアミノ酸の変異Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５ＹおよびＳ６４５Ｆをもたらす３つの突然変異、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔが明らかとなった。これらのヌクレオチド置換に加えて、配列決定データのアラインメントから、この領域内の別の可変ポイントが示された。分析したすべてのＣ．アルビカンス株の約２５％において、カンジダ・アルビカンスゲノム配列プロジェクトの一部としてＳＣ５３１４株でも報告された単一ヌクレオチドの同義的置換Ｔ１９２９Ａが観察された。この所見は、該置換が、この領域をカバーしている対立遺伝子特異的プローブによる識別に必要なプローブとアンプリコンとのハイブリダイゼーションを変化させる可能性を有するので、重要である。ＣａＦＫＳ１配列のコンセンサスデータに基づいて、本発明者らは、ヌクレオチド１９２０〜１９４４をカバーする４つの対立遺伝子特異的分子ビーコンプローブを設計した。この作業については実施例で詳細に報告する。１つのプローブは、カスポファンギン感受性のＣ．アルビカンス株に見出される野生型（ＷＴ）ＣａＦＫＳ１対立遺伝子に相補的であり、３つのプローブについては、カスポファンギン耐性の分離株中に認められた突然変異型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子（Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ）に相補的とした。ビーコンはすべて同一の６ヌクレオチド長のステム領域５’ＣＧＣＧＡＧおよびＣＴＣＧＣＧ３’を有し、標的配列に対して確実にアラインするように、ＣａＦＫＳ１の１９２９位のＳＮＰに対応する部位に揺らぎ塩基Ａ／Ｔ（５０：５０）を用いて合成した。野生型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴは５’端をＦＡＭで標識し、３つの突然変異型ビーコンは５’端をＨＥＸで標識した。すべての分子ビーコンは３’端にＤＡＢＣＹＬ消光剤修飾を有するものとした。プライマーおよびプローブの設計の詳細については実施例３で述べる。該プローブ用の識別温度枠については実施例４で述べる。検出はこの枠内で実施した。
【００３８】
Ｃ．アルビカンスＣＡＩ４株およびＭ７０株の自然発生のカスポファンギン耐性突然変異を、４μｇ／ｍｌ（ＭＩＣの４０倍）のカスポファンギンを含んだ固体増殖培地での直接選択によって分離した。自然発生のカスポファンギン耐性誘導株の形成頻度は、いずれの株についても生細胞当たりの突然変異体が＜１０−８であった。いずれの菌株についても、カスポファンギンを含むプレート上で数少ない収縮した成長の遅いコロニーの形成が観察された。このコロニーを、同量のカスポファンギンを含んだ新鮮なプレート上に画線接種したが、増殖しなかった。インキュベーションを１０日以上延長した後、小さな収縮したコロニーのごく一部から成長の速い滑らかな誘導体が生じ、該誘導体は再接種後にカスポファンギン含有培地上で増殖可能であった。個々のプレート／培養当たりそのような誘導体を１つだけ保存し、詳しい分析のために使用した。合計では、カスポファンギンに対する感受性が低下した分離株が、ＣＡＩ４株およびＭ７０株についてそれぞれ３５株および５０株分離された。インビトロでのカスポファンギン感受性試験から、すべての実験室誘導分離株についてカスポファンギン濃度＞１６μｇ／ｍｌの高いＭＩＣ値が明らかとなった。分離手順の詳細については実施例２において述べる。
【００３９】
ＣＡＩ４株およびＭ７０株のＣａＦＫＳ１遺伝子の予備的な塩基配列決定（実施例２を参照）から、ＣＡＩ４のＣａＦＫＳ１遺伝子中にはＴ１９２９Ａ ＳＮＰが存在し、Ｍ７０には存在しないことが明らかになった。親株のＣＡＩ４およびＭ７０ならびに前記菌株のカスポファンギン耐性誘導株から染色体ＤＮＡを抽出し、鋳型としてＣａＦＫＳ１分子ビーコンとともにリアルタイムＰＣＲ実験に使用した。図４は、野生型および変異型両方の様々な標的のヌクレオチド配列と、利用したプライマーおよび分子ビーコンプローブを示している。図４では、プローブのプローブ領域および標的鎖の標的配列に下線が付されている。プローブおよび標的配列中の、ＣａＦＫＳ１のＨＳ１領域中の突然変異に対応する塩基は、太字体になっている。Ｗで示された塩基の位置は、その位置がＡまたはＴであるという点だけが異なる２種の縮重分子ビーコンの等モル混合物を示す。染色体ＤＮＡサンプルをそれぞれ、感受性の低下した異なる対立遺伝子を示す個々の分子ビーコンプローブを用いた４つの別個のＰＣＲ反応に供した。リアルタイムＰＣＲのプロトコールは実施例５に記載されている。すべての反応についてアニーリング温度を６１℃とすることにより、異なるＣａＦＫＳ１対立遺伝子同士を良好に識別することが可能であった（実施例４を参照）。突然変異型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＣＡＩ４株のカスポファンギン耐性誘導株３５種すべてについて見出された。その大多数（分離株２０種）はヘテロ接合の突然変異ｗｔ／Ｔ１９３３Ｃを有し、１５種の突然変異体がホモ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを含んでいた。Ｔ１９３３Ｃのヘテロ接合の場合には、分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴおよびＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃからの同程度の２つのシグナルが生じた（図５）。図５は、個々の分子ビーコンおよびＤＮＡ標的を用いた４つの別個のＰＣＲの結果である。
【００４０】
【化１】
は、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃビーコン＋ホモ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４１】
【化２】
は、ＣａＦＫＳ１−ＷＴビーコン＋ホモ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４２】
【化３】
は、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃビーコン＋ヘテロ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４３】
【化４】
は、ＣａＦＫＳ１−ＷＴビーコン＋ヘテロ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡである。
【００４４】
図６Ａ−６Ｄは、４つの分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴ（図６Ａ）、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ（図６Ｂ）、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ａ（図６Ｃ）およびＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔ（図６Ｄ）による、１０種のＣａＦＫＳ１ホモ接合型対立遺伝子の識別を示す。各プロットは、突然変異を有する個々の対立遺伝子ＤＮＡ、すなわち
【００４５】
【化５】
は野生型（突然変異もＳＮＰも無し）：
【００４６】
【化６】
はＴ１９３３Ｃ：
【００４７】
【化７】
はＣ１９３４Ａ：
【００４８】
【化８】
はＣ１９３４Ｔ：
【００４９】
【化９】
はＴ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５０】
【化１０】
はＴ１９３３Ｃ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５１】
【化１１】
はＣ１９３４Ａ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５２】
【化１２】
はＣ１９３４Ｔ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５３】
【化１３】
はＴ１９２２Ｃ：
【００５４】
【化１４】
はＧ１９３２Ｔ＋Ｃ１９３４Ｇ：
【００５５】
【化１５】
はブランク（ＤＮＡ無し）、を用いた１１通りの個々のＰＣＲの結果をまとめたものである。
【００５６】
ホモ接合のＣａＦＫＳ１突然変異を有するＤＮＡサンプルは、対応する突然変異型分子ビーコンからの明瞭な応答を生じ、ＣａＦＫＳ１−ＷＴからのシグナルは生じなかった（図６Ｂ−６Ｄ）。反対に、親株ＣＡＩ４からの染色体ＤＮＡはＣａＦＫＳ１−ＷＴプローブのみと反応し、蛍光は突然変異型ビーコンからは検出されなかった（図６Ａ）。
【００５７】
菌株Ｍ７０のカスポファンギン耐性誘導株のＣａＦＫＳ１対立遺伝子について遺伝子型を決定すると、５０サンプルのうち４４サンプル中で既知の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔが明らかとなった。ＣＡＩ４突然変異体の場合のように、Ｍ７０誘導株の大多数はヘテロ接合型の突然変異Ｔ１９３３Ｃとなっていた。感受性の低下した５０株のうち２５株が１コピーのＣａＦＫＳ１にＴ１９３３Ｃ置換を有することが分かった。ヘテロ接合の突然変異Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔは６菌株に検出された。ヘテロ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有するＤＮＡサンプルに関するすべてのリアルタイムＰＣＲにおいて、ＣａＦＫＳ１−ＷＴ分子ビーコンと、３つの突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔのうちの１つとに由来する２種類の蛍光シグナルが生じた。ＣａＦＫＳ１の１９３３位および１９３４位におけるヘテロ接合の突然変異とは別に、これらの部位におけるホモ接合の置換も１３菌株で検出された。これらは対応する突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔを用いた特異的ハイブリダイゼーションによって同定された（図６Ｂ−６Ｄ）。
【００５８】
５０菌株のうち６菌株では、染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅が野生型分子ビーコンによって弱く検出されただけで突然変異型分子ビーコンでは全く検出されず（５菌株）、また１菌株は野生型および突然変異型のいずれの分子ビーコンによっても検出されなかった。プローブの対立遺伝子特異性を考えると、これらのデータは鋳型の配列に未知の変化が生じたことを示唆するものである。
【００５９】
リアルタイムＰＣＲの結果を確認し、かつ６つのＭ７０誘導株の未決着の問題を明確にするために、すべてのカスポファンギン耐性のＣＡＩ４菌株およびＭ７０菌株のＣａＦＫＳ１に関するＤＮＡ塩基配列決定を用いた。３５種のＣＡＩ４誘導株および４４種のＭ７０誘導株すべてについて、リアルタイムＰＣＲの結果と塩基配列決定の結果との間に１００％の相関が見出された。分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＴとのハイブリダイゼーションによってリアルタイムＰＣＲ実験においてＣａＦＫＳ１の１９３３位および１９３４位に検出されたヘテロ接合およびホモ接合の突然変異はすべて、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認された。新しいホモ接合型突然変異Ｔ１９２２Ｃの存在は、リアルタイムＰＣＲ実験で曖昧な結果を示した５つのＭ７０誘導株のＣａＦＫＳ１遺伝子で見つかった。さらに、ＤＮＡ塩基配列決定から、リアルタイムＰＣＲではいかなる蛍光応答も生じなかったカスポファンギン耐性Ｍ７０誘導株１株のＣａＦＫＳ１遺伝子中に、２つの新しいホモ接合型突然変異Ｇ１９３２ＴおよびＣ１９３４Ｇが明らかとなった。予想通り、ＣＡＩ４株の誘導株はすべてＴ１９２９Ａ ＳＮＰを有し、Ｍ７０株の誘導株は該ＳＮＰを欠いていたが、このことは塩基配列決定から明らかとなった。
【００６０】
ＣａＦＫＳ１分子ビーコンを別個に適用することにより、Ｃ．アルビカンスのＣａＦＫＳ１遺伝子中の３つの既知の突然変異について遺伝子型決定が可能であった。本発明者らはさらに、所与のＤＮＡサンプル中のそのような突然変異を同時に評価するのに適した多重リアルタイムＰＣＲ形式において、４つの縮重ＣａＦＫＳ１分子ビーコンすべてを併用する可能性について調査した。実施例５を参照されたい。本発明者らは、野生型と突然変異型とで異なるフルオロフォアで標識した４つのＣａＦＫＳ１分子ビーコンすべてを一緒に合わせて、個々のＰＣＲに添加する総合プローブ混合物とした。野生型のＣＡＩ４株およびＭ７０株、ならびに前記菌株の、１２の異なるＣａＦＫＳ１遺伝子型を表わす１２のカスポファンギン耐性誘導株の染色体ＤＮＡを、鋳型として多重リアルタイムＰＣＲに使用した。多重リアルタイムＰＣＲ実験の条件は、アニーリング温度が６０℃であることを唯一の例外として、個々の分子ビーコンを用いたリアルタイムＰＣＲの条件と同一とした。野生型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴはＦＡＭで標識し、突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔは、ＨＥＸで標識した。これらのプローブを使用して、蛍光出力の性質によりカスポファンギン感受性菌株およびカスポファンギン耐性菌株を同定することができた。
【００６１】
図７は、ＣａＦＫＳ１突然変異の多重リアルタイムＰＣＲ分析について、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ４０００ソフトウェアのグラフィック出力を例証している。上側の半円はＦＡＭシグナルが観察されると強調表示されて野生型ＣａＦＫＳ１ ＤＮＡの存在を報告する。下側の半円はＨＥＸシグナルが観察されると強調表示されて、ＣａＦＫＳ１ ＤＮＡ中に３つの記載の突然変異のうちいずれかが存在することを報告する。ホモ接合型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＦＡＭまたはＨＥＸシグナルのいずれか一方を生じ、ヘテロ接合型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＦＡＭおよびＨＥＸシグナルを両方生じる。
【００６２】
感受性のＣＡＩ４株およびＭ７０株由来のＤＮＡが多重リアルタイムＰＣＲに供されると、ＦＡＭ蛍光だけが観察された。ＣａＦＫＳ１中にホモ接合型の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有するＤＮＡを用いた多重リアルタイムＰＣＲではＨＥＸ蛍光だけが報告された（図７）。分析されたＤＮＡが、ＣａＦＫＳ１遺伝子中にヘテロ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有することが知られた菌株に由来する場合、ＦＡＭおよびＨＥＸシグナルの両方が同程度検出された（図７）。ＣａＦＫＳ１に２つの新しい突然変異Ｇ１９３２ＴおよびＣ１９３４Ｇを有する菌株由来の染色体ＤＮＡを用いた多重リアルタイムＰＣＲでは、ＦＡＭまたはＨＥＸいずれの蛍光も生じなかった。ホモ接合型の突然変異Ｔ１９２２Ｃを含んでいる菌株由来の染色体ＤＮＡを用いた反応では軽微なＦＡＭシグナルが観察された。
【００６３】
本発明者らはまた、本発明者らが「ＨＳ２」と呼ぶ第２の標的領域のために、特に１つの突然変異Ｇ４０８２Ａについて、プライマーおよびプローブを設計した。これは実施例６において報告する。第２の標的部位を含む分析法を設計する際には、突然変異Ｃ４０８１Ｇまたはその他のそのような突然変異について同様に突然変異型プローブを設計することが可能であり、設計は別個に為されてもよいし、あるいはＨＳ２について、またはＨＳ１およびＨＳ２について、前述の実施例のように多重化されてもよい。
【実施例１】
【００６４】
突然変異の同定のための、適切なＣａＦＫＳ１遺伝子フラグメントの核酸増幅とサイクルシーケンシングとの併用について、４つの異なる菌株を利用して実証した。ＣａＦＫＳ１のフラグメント（約４５０ｂｐ）を、菌株ＣＡＩ４−Ｒ１、ＮＲ２、ＮＲ３およびＮＲ４由来のゲノムＤＮＡから増幅させた。ＣａＦＫＳ１の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）に基づいた、ＰＣＲに使用したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ５’−ＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣ−３’および５’−ＡＡＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧ−３’であった。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、ＤＮＡ塩基配列を決定した。カンジダ属の臨床分離株については、５’−ＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡＧ−３’および５’−ＧＧＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧ−３’をそれぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いて、ＤＮＡ塩基配列分析用にＣａＦＫＳ１ ＯＲＦの大きな一部分（約２．６ｋｂ）を増幅させた。上述のＣａＦＫＳ１の第１の標的領域（コーディングヌクレオチド１９２１−１９４７に相当）に加えて、このフラグメントは第２の標的ヌクレオチド４０６９−４０９２を含んでいる。ＰＣＲ生成物を精製し、蛍光標識法（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））によって定量し、ＤＴＣＳクイック・スタート・キット（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を使用して５’方向および３’方向の両方について塩基配列を決定した。
【実施例２】
【００６５】
核酸増幅およびサイクルシーケンシングを使用するＤＮＡ塩基配列分析は、それ自体分析技術としても、またプローブ系分析法を評価するための対照としても使用することができる。
【００６６】
Ｃ．アルビカンスの染色体ＤＮＡを、Ｑ‐バイオジーン（Ｑ‐Ｂｉｏｇｅｎｅ）ＦａｓｔＤＮＡキット（米国カリフォルニア州アーバイン所在のＱ‐バイオジーン）を用いて、液体ＹＰＤ培地中で一晩増殖させた細胞から抽出した。ＰＣＲ実験は、ｉＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在のバイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で実施した。ＣａＦＫＳ１のＨＳ１と名付けた領域を、プライマーＣａＦＫＳ１−Ｆ１７１９およびＣａＦＫＳ１−Ｒ２２１２（図４）を使用して増幅させた。各１００μｌのＰＣＲ反応物には、０．２５μＭの各プライマー、２．５ＵのｉＴａｑ（ＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在のバイオ・ラッド・ラボラトリーズ）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．４および約５０ｎｇのＣ．アルビカンス染色体ＤＮＡを含めた。サイクル反応条件は、９５℃で３分を１サイクル、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、７２℃で３分を１サイクルとした。ＰＣＲ生成物を、ＭｏｎｔａｇｅＰＣＲ精製キット（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して精製した。塩基配列決定のためのＰＣＲ生成物を、ＣＥＱ（ＴＭ）ダイターミネーター・サイクルシーケンシング−クイック・スタート・キット（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）を使用して、製造業者の推奨に従ってｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラーで入手および精製した。塩基配列決定反応にはプライマーＣａＦＫＳ１−Ｆ１７１９またはＣａＦＫＳ１−Ｒ２２１２を使用した。塩基配列決定のＰＣＲのサイクル反応条件は、９５℃で３分を１サイクル、９６℃で２０秒、５０℃で２０秒、６０℃で１分を３０サイクルとした。ＤＮＡの塩基配列決定はすべてＣＥＱ（ＴＭ）８０００遺伝子分析システム（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）で実施した。ＣＥＱ（ＴＭ）８０００遺伝子分析システムソフトウェア（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）を、ハードウェアの制御ならびに実施後の配列決定結果の分析に使用した。
【００６７】
Ｃ．アルビカンス菌株ＣＡＩ４はＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス所在のＡＴＣＣ）から購入した。Ｃ．アルビカンス菌株Ｍ７０はメルクカルチャーコレクション（米国ニュージャージー州ローウェイ所在のＭＲＬ）から得た。菌株は、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％デキストロース）で増殖させた。菌株ＣＡＩ４の増殖用には；ＹＰＤ培地にウリジン（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））を補足して２５ｍｇ／ｍｌとした。カスポファンギン（米国ニュージャージー州ローウェイ所在のメルク（Ｍｅｒｃｋ））は、直接ＹＰＤに添加して４μｇ／ｍｌとした。寒天プレートは３０℃でインキュベートし、液体培養物は、３０℃で回転振盪機（１００ｒｐｍ）にて３ｍｌのＹＰＤを含む１２ｍｌの培養試験管中で増殖させた。カスポファンギンに対する感受性は、ＮＣＣＬＳ文書Ｍ２７−Ａ２に概説されているようにして、ＲＰＭＩ−１６４０培地（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・アルドリッチ）における液体マイクロブロス希釈法で評価した。
【００６８】
Ｃ．アルビカンス菌株ＣＡＩ４およびＭ７０の自然発生的なカスポファンギン耐性突然変異体は、４μｇ／ｍｌのカスポファンギンを含んだＹＰＤプレート上に液体ＹＰＤでの１８時間培養物１００μｌ（細胞〜１０８個）を播種することにより分離した。開始時のコロニー数を正確に測定するために、前記終夜培養物の系列希釈物を、抗生物質による選択のないＹＰＤプレート上に播種した。選択プレートを３０℃で１０−１４日間インキュベートした。各選択プレートから、薬物に対して耐性の少なくとも４つの個別のコロニーを、新鮮なカスポファンギン含有プレート上に再度播種して耐性の表現型を確認した。
【実施例３】
【００６９】
報告されているＣａＦＫＳ１の３つのＤＮＡ塩基配列であるＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５およびＡＦ０２７２９５およびＣＡ２０４３を、ＦＫＳ１の分子ビーコンおよびプライマーの設計に使用した。分析用プライマーおよびプローブの設計は当技術分野において周知である。研究者を支援する多数の出版物が利用可能である。さらに、作業を早め、かつ試行錯誤によって行われる必要のある調整を縮小するために、コンピューター・ソフトウェア・パッケージを利用可能である（実施例４を参照）。本発明者らはそのようなソフトウェア・パッケージを使用した。分子ビーコンおよびＤＮＡプライマー（図４）を、Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ３．０ソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト所在のプレミア・バイオソフト（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ））を使用して設計した。ソフトウェアのパラメータ既定値をすべての分子ビーコンおよびプライマーの構築に適用した。分子ビーコンは、５’端をフルオロフォアである５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）で、また３’端をダブシルで標識した。分子ビーコンおよびプライマーのいずれもバイオサーチ・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（米国カリフォルニア州ノヴァト所在のバイオサーチ・テクノロジーズ）から購入した。ＣａＦＫＳ１対立遺伝子に特異的な分子ビーコンのハイブリダイゼーション特性を、一本鎖の標的オリゴヌクレオチドを用いて十分な温度範囲（２５℃〜９５℃）について試験した（図４）。分子ビーコンと標的とのハイブリダイゼーションは、ストラタジーンＭＸ４０００定量的多重ＰＣＲシステム（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）で実施した。データのモニタリングおよび分析のためにＭＸ４０００ソフトウェア中から「分子ビーコン融解曲線」実験タイプを選択した。各５０μｌのハイブリダイゼーション反応液には、１×ストラタジーン・コアＰＣＲバッファー、４ｍＭのＭｇＣｌ２、個々の標的オリゴヌクレオチド１００ｐｍｏｌ、および５ｐｍｏｌの分子ビーコンを含めた。実験の温度条件は、９５℃で３分間加熱することと、８０℃に冷却した後で温度勾配を−０．５℃とした３０秒間のステップ１１２回で２５℃まで冷却することと、からなるものとした。個々の反応についての蛍光出力を冷却ステップの最後に計測した。「分子ビーコン融解曲線」実験の最終データを、「ＳＹＢＲグリーン（解離曲線あり）」タイプの実験に変換した。分子ビーコン−標的対それぞれの融解温度（Ｔｍ）は、蛍光出力の一次導関数−Ｒ’（Ｔ）の最大値に対応する温度ポイントとしてＭＸ４０００ソフトウェアによって決定された。温度プロファイル分析実験はそれぞれ３連で実施した。
【実施例４】
【００７０】
核酸ハイブリダイゼーションプローブが２つまたはそれ以上の対立遺伝子を識別する能力は温度に依存する；すなわち、あるプローブが標的と１ヌクレオチド異なる配列を７０℃で識別する場合、該プローブは恐らく４０℃ではミスマッチな標的に結合し、そのような低い温度では識別しないだろう。
【００７１】
本発明者らは、プローブ設計および分析法設計の一部として、プローブの対立遺伝子識別能力を分析した。ハイブリダイゼーション・プロファイルを、野生型ＣａＦＫＳ１対立遺伝子と、１９３３位および１９３４位にカスポファンギン耐性突然変異、ならびに１９２９位にＳＮＰを有する様々なＣａＦＫＳ１対立遺伝子とに相当する８つのＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型に対する分子ビーコンプローブについて決定した（図４）。図４に「標的」として記載されたオリゴヌクレオチドを、プローブの融解曲線分析に使用した。いくつかの標的配列では、記載のように下線部分が１つのプローブに相補的であり、融解曲線分析の際の二次構造の形成を低減するために末端にはアデノシンの繰り返しを付加した。最初に、各々の分子ビーコンプローブのハイブリダイゼーションについて、プローブ領域の配列に相補的で、１９２９位のＳＮＰに相当するヌクレオチド塩基が異なる２つのＤＮＡ標的を用いて評価した。縮重分子ビーコンプローブはそれぞれ、そのようなＤＮＡ標的とともに２種類の分子間ハイブリッドを形成した。安定なハイブリッドは、標的オリゴヌクレオチドと、分子ビーコンのうちの相補配列を有する部分集団とにより形成された。１９２９位に単一のミスマッチヌクレオチドを有する別の部分集団の分子ビーコンプローブは、同じＤＮＡ標的とともにより安定性の低いハイブリッドを形成した。結果として、蛍光出力の一次導関数（−Ｒ’（Ｔ））として表わされる上記混合プローブの融解曲線は、より安定な分子ビーコン−標的ハイブリッドおよび安定性の低い分子ビーコン−標的ハイブリッドのＴｍに対応する２つの別個のピークを示した。次に、本発明者らは、各分子ビーコンと非相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調査した（図４）。そのようなミスマッチを有するハイブリッドは一般に相補体よりも安定性は低かったが、分子ビーコンの縮重により２つのハイブリッド部分集団について同じ傾向が生じた。比較的安定性の高い分子間ハイブリッドは、標的オリゴヌクレオチドと単一ミスマッチを有するビーコン部分集団とによって形成され、安定性の低いハイブリッドは、オリゴヌクレオチドと二重にミスマッチを有するビーコン部分集団とで構成された。縮重分子ビーコンと標的オリゴヌクレオチドとの８対それぞれについて得られた２つのＴｍ値のうち、ミスマッチが無いかまたは１つである安定性の高いビーコン−標的ハイブリッドに対応する高いほうのＴｍ値のみを取り入れた。ＣａＦＫＳ１分子ビーコンと該ビーコンに相補的なＤＮＡ標的とに関するＴｍ値は互いにかなり接近しており、温度範囲６２．７〜６４．０℃に入った。同様に、対応する識別ウィンドウは類似の温度域を占める。このような均一性は、個々のビーコンについてプローブ領域配列の長さを変えることにより達成された。分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴ、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡおよびＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔは、それぞれ２４、２３、２５および２５ヌクレオチド長のプローブ領域を有するものであった。
【実施例５】
【００７２】
増幅のリアルタイム分析を図４に記載のプライマーおよびプローブについて実証した。該分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を、分子ビーコンプローブを利用するリアルタイム検出とともに含むものとした。
【００７３】
個々の単一プローブ（図４）を使用する分析については、手順を以下のとおりとした。リアルタイムＰＣＲ実験は、ストラタジーンＭｘ４０００定量的多重ＰＣＲシステムにおいて、設定を「定量的ＰＣＲ（多重標準）［Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ （Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）］」として実施した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＱＰＣＲコア試薬キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）の試薬をすべての反応に使用した。５０μｌのＰＣＲ反応液にはそれぞれ１×ストラタジーン・コアＰＣＲバッファー、０．２μＭの分子ビーコン、各々０．２５μＭのＨＳ１ＡＮ２プライマーおよびＨＳ１ＳＮ２プライマー（図４）、２．５ＵのＳｕｒｅＳｔａｒｔ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２および約５０ｎｇのＣ．アルビカンス染色体ＤＮＡを含めた。多重ＰＣＲ実験では、４つの分子ビーコン（図４）の各々の濃度を０．２μＭとした。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーのパラメータを：９５℃で１０分を１サイクル、９５℃で３０秒、６１℃で３０秒、および７２℃で３０秒を４５サイクルとした。ＰＣＲ実験を多重形式で実施する場合は、６０℃のアニーリング温度を使用した。Ｍｘ４０００システムのフィルタゲインセットを、様々な分子ビーコンからの蛍光シグナルの大きさを均等化する目的でＦＡＭ−９６０ ＨＥＸ−７２０に変更した。蛍光をアニーリング・ステップの間に３回計測した。
【００７４】
ＰＣＲ増幅の間にストラタジーンＭｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルを、Ｍｘ４０００ソフトウェアを使用してリアルタイムでモニターした。各実行の終わりに、増幅のプロットデータをグラフ形式に変換し、画像ファイルとして保存するかまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌへエクスポートして表計算ファイルとして保存した。多重ＰＣＲ反応の場合には、ＰＣＲ増幅の最終的な結果を「定量的ＰＣＲ（多重標準）」タイプの実験から「定量的プレート読出（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄ）」タイプの実験に変換した。個々のフルオロフォアに関する蛍光の変化の合計（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）を分析値として得た。結果をグラフ形式または数値形式に変換し、画像または表計算ファイルとして保存した。
【００７５】
多重分析については、本発明者らは上述のＰＣＲ増幅を利用し、ただし熱サイクル反応のアニーリング温度を６１℃ではなく６０℃とした。複数のプローブを同一の反応において利用した。
【実施例６】
【００７６】
ＰＣＲ増幅分析法のためのプライマーおよび分子ビーコンプローブを、本発明者らがＨＳ２と呼ぶ第２のＤＮＡ塩基配列のために設計した。プライマーは、次の配列：
ＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣ−３’
ＣＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧ−３’
を有する。
【００７７】
野生型遺伝子配列とエキノカンジン耐性変異Ｇ４０８２Ａとを区別するために、対立遺伝子を識別可能な１対の分子プローブのヌクレオチド配列を設計した。各々の一端をフルオロフォアで、他端をＤＡＢＣＹＬのような非蛍光性の消光剤で標識することになる。もちろん識別可能なフルオロフォアを利用して、上記プローブのうち一方を含む終点分析法およびリアルタイム増幅において、あるいは両方のプローブを含む多重分析法において、第１の標的配列用のプライマーおよびプローブを一緒に用いる状態または用いない状態で、野生型プローブは野生型遺伝子配列にのみハイブリダイズしてそこで蛍光を発し、突然変異型プローブは突然変異配列にのみハイブリダイズしてそこで蛍光を発するようにすることになる。
【００７８】
分子ビーコンプローブは、６ヌクレオチド長のステムを形成する相補的な３’および５’アーム配列に隣接した長さ２４ヌクレオチドの一本鎖ループを有している。いずれのプローブも計算上６１．５℃のＴｍを有する。その配列は；
野生型プローブ：
【００７９】
【化１６】
突然変異型プローブ：
【００８０】
【化１７】
である。
【００８１】
上記配列において、相補的なアームには下線を付し、突然変異体において変化した単一ヌクレオチドは太字になっている。
本発明のいくつかの実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされうることは理解されるだろう。例えば、ＰＣＲ以外の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡを使用することも可能であり、また、分子ビーコンプローブ以外の対立遺伝子識別プローブを使用することもできる。従って、他の実施形態は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１Ａ】遺伝子配列ＣａＦＫＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図１Ｂ】遺伝子配列ＣａＦＫＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図２】アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ２１５３５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図３】サッカロマイセス・セレビシエのＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列をカンジダ・アルビカンスのＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列とともにアラインメントして示す図である。
【図４】実施例において利用したプライマー、プローブおよびプローブ標的の配列を示す表である。
【図５】リアルタイムＰＣＲ分析におけるヘテロ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ａ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｂ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｃ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｄ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図７】多重リアルタイム分析の検出結果の形式を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は真菌の核酸分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染症は重病患者における発病および死亡の重要な原因であり、その影響は、真菌感染症であることを迅速に診断し効果的に治療することに失敗すると深刻化する。抗真菌薬を広範に使用してきた結果、天然の耐性真菌種の淘汰だけでなく、感受性菌種における耐性の出現を招いてきた。真菌病の治療は、利用可能な抗真菌薬の種類がほとんどないことによって阻まれている。最近、β−（１→３）−Ｄ−グルカン・シンターゼを阻害することにより真菌細胞壁を標的とする新しい種類のエキノカンジン系薬物の最初のものとして、カスポファンギンが臨床に導入された。カスポファンギンの使用は急速に増大しており、インビトロにおける感受性の低下したカンジダ属菌種の臨床分離株が、治療の失敗とインビトロにおける高い最小阻止濃度ＭＩＣの値との間の強い関連性とともに報告されている。患者のカスポファンギンへの曝露が増大するにつれ、またミカファンギンやアニデュラファンギンなどの他のエキノカンジン系薬物が市場に参入するにつれ、ＭＩＣ値の高い臨床分離株の数が増すであろうことが予想される。
【０００３】
エキノカンジン類は、ここ数十年の間に市場に参入した最初の新しい主要な種類の抗真菌薬である。真菌は、細胞壁構造がなくては生存することができず、あるいは何らかの形で細胞壁構造が著しく変化した場合ですら生存することができないので、真菌が細胞壁の完全性を維持することは非常に重要である。細胞壁は、糖タンパク質の外側層と、グルカン、キチンおよびガラクトマンナンを含む炭水化物ポリマーの内側層とで構成される層状組織を備えた細胞外マトリックスである。腐生性真菌および病原性真菌では、炭水化物層は主としてβ（１→３）−グルカンおよびα（１→３）−グルカンから成るが、さらに多少のβ（１→６）−グルカンおよびキチンを含んでいる。グルカンはまたエキソポリマーとして真菌細胞壁から真菌感染症患者の血液中に放出され、様々な先天性免疫応答を活性化することが知られている。細胞壁の生合成の際には構成ポリマーは絶えず化学的に修飾されかつ再構成されるので、真菌細胞壁は動的な構造体である。例えば、β（１−３）−グルカンの形成を担うグルカン・シンターゼ複合体の触媒サブユニットと推定されるＦｋｓ１ｐは、皮質のアクチンパッチ内に局在することが知られている。Ｆｋｓ１ｐは細胞壁の再形成部位へと細胞表面上を移動し、Ｆｋｓ１ｐが動けない細胞は細胞壁の構造および機能が不完全である。Ｆｋｓ１ｐはＦＫＳ１遺伝子の産物である。エキノカンジンは、脂肪アシル側鎖にＮ−結合した環状ヘキサペプチドであり、主要な細胞壁生体高分子の生合成を担うβ（１→３）−Ｄ−グルカン・シンターゼを阻害する。エキノカンジン系薬物であるカスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギンは、β−１，３−グルカン・シンターゼを阻害することにより真菌細胞壁を標的とする新しい種類の抗真菌化合物の筆頭である。最初に承認された薬物であるカスポファンギンの、真菌感染症の治療における安全性および忍容性は、大多数の患者において臨床または実験室における薬物に関連した深刻な有害事象が報告されることなく、最近のいくつかの研究において評価されている。
【０００４】
これらの薬物は、既存の抗真菌薬に対する交差耐性を伴わずカンジダ属およびアスペルギルス属菌種に対する広域スペクトルの抗真菌活性を有しており、したがってアゾール耐性の酵母およびカビに対して有効である。重要なことは、エキノカンジン類は細胞壁に重大な影響を与えるため酵母に殺菌性を有することである。エキノカンジン類はカビに対して活性を有するが、単に成長している菌糸先端を阻害するように見える。しかしながらエキノカンジン類は、侵入性を有する接合菌網、クリプトコックス・ネオフォルマンスまたはフザリウム属菌種に対する活性は低いが、アスペルギルス属菌種に対しては臨床的に非常に有効である。カスポファンギンは、多くの重大な真菌感染症、たとえば難治性であるかまたは他の治療法に耐えられない患者における侵入性アスペルギルス症、食道のカンジダ症、カンジダ血症、および他のカンジダ感染症（腹腔内の膿瘍、腹膜炎および胸膜腔感染を含む）などの治療に関して米国およびその他の国々で承認されている。カスポファンギンはまた、持続性発熱および好中球減少の患者において疑われる真菌感染症の経験療法についても指摘されている。カスポファンギンは現在、ボリコナゾールのようなトリアゾール系薬物と共に、酵母およびカビに対する初期の抗真菌療法に広く使用されている。類縁の薬物であるミカファンギンおよびアニデュラファンギンの参入により、臨床現場におけるこの非常に効果的な新しい種類の薬物の作用域がさらに拡がるであろう。
【０００５】
最初に承認されたエキノカンジンが２００２年に市場に参入して以来、クリニックでのカスポファンギンの使用は急速に増大しており、これは特にアメリカ合衆国におけるカスポファンギンの表示ラベルが、食道のカンジダ症、カンジダ血症および他のカンジダ感染症、ならびに経験療法を含むように最近拡張されたからである。カスポファンギンに対するインビトロでの感受性が低下したカンジダの臨床分離株が報告されており、インビボでの失敗とインビトロでのカスポファンギンＭＩＣ値上昇との間の相関が注目されてきたが、最小阻止濃度（ＭＩＣ）の値と臨床成績との間の厳密な相関は未だ確立されていない。患者のカスポファンギンへの曝露が増大し、またミカファンギン（２００５年６月）およびアニデュラファンギンが市場に参入するにつれ、ＭＩＣ値の高い臨床分離株の数が増加し、また、ますます多くの患者が薬物感受性の低下に起因する治療の失敗に陥るであろうことが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、真菌類、限定するものではないがカンジダ属の真菌などにおける、エキノカンジン系薬物に対する耐性に関連した遺伝子突然変異を検出する核酸分析法である。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＦＫＳ１タンパク質をコードする特定の領域の指数関数的な核酸増幅を、好ましくは塩基配列決定または対立遺伝子を識別できる標識プローブを用いた検出のうちいずれかと組み合わせて使用するような核酸分析法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、前述の分析法を行なうための、試薬ならびにプライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチド・セットのキットである。
本発明は、カンジダ属のような酵母およびアスペルギルス属のようなカビなどの真菌における、カスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギンを含むエキノカンジン系薬物に対する耐性を付与する突然変異を検出する核酸分析法を含む。該分析法は、真菌を含むかまたは真菌を含む疑いのある任意のサンプル、限定するものではないがヒトから得たサンプル、例えば血液、尿、または組織サンプルに適している。カンジダ属菌種としては、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ギリモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂａｔｒａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびＣ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）が挙げられる。アスペルギルス属菌種には、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）が挙げられる。該分析法の標的は、ＦＫＳ１ｐファミリータンパク質中の２つの保存された領域のうち一方、または好ましくは両方に対応する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）配列である。本発明者らが第１領域またはＨＳ１と呼ぶ領域は、アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐのＰｈｅ６４１〜Ｐｒｏ６４９に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、各々の保存領域の一端または両端の１個、２個または数個、最大５個の追加アミノ酸に相当する場合もある。本発明者らが第２領域またはＨＳ２と呼ぶ領域は、アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐのＡｓｐ１３５７〜Ｌｅｕ１３６４に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、両端の追加アミノ酸、ＣａＦｋｓ１ｐのアミノ酸１３４５からＬｅｕ１３６４を越えて１個、２個または最大５個のアミノ酸まで（例えばアミノ酸１３４５−１３６９）に相当する場合もある。実験室株および臨床分離株を使用して、本発明者らはエキノカンジン耐性を付与するいくつかの突然変異を上記領域中に同定した。本発明者らが使用した実験室株の中には、ＣＡＩ４およびＭ７０（実施例２を参照）ならびに本発明者らが作製した実験室突然変異株（本明細書では「ＮＲ」株（例えばＮＲ２）とする）がある。この実験室株および臨床分離株から、本発明者らは、耐性を与えるいくつかの単一アミノ酸の変化、例えばＦ６４１Ｌ、Ｆ６４１Ｓ、Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆ、Ｄ６４８Ｙ、Ｐ６４９Ｈ、Ｒ１３６１ＨおよびＲ１３６１Ｇなど、ならびに該アミノ酸の変化の原因であるいくつかのＳＮＰを同定した。
【００１０】
本発明の分析法は、上述のアミノ酸配列に対応する、または同配列をコードする、前述の標的配列すなわち標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む核酸配列の増幅を含む。指数関数的に増幅する任意の方法、例えば、いずれも当技術分野においてよく知られている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）（米国特許第４，９６５，１８８号明細書および国際公開公報第０３／０５４２３３Ａ１号パンフレットを参照）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自己維持配列増幅）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）およびＱβレプリカーゼを介した増幅などを使用することができる。
【００１１】
増幅された標的配列中の突然変異の検出は、任意の方法、たとえば限定するものではないが塩基配列決定法および標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する検出法などにより実施できる。塩基配列決定法には、例えば従来のジデオキシ法およびパイロシークエンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）があり、これらはいずれも当技術分野において周知である。ハイブリダイゼーションプローブを利用する検出法は、増幅の後で実施してもよい、すなわち終点検出でもよいし、あるいはリアルタイムで実施してもよい、すなわち増幅の際に実施してもよい。ハイブリダイゼーションプローブを使用するリアルタイムの方法には、米国特許第５，４８７，９７２号明細書および米国特許第５，５３８，８４８号明細書に記載の５’ヌクレアーゼ検出法；米国特許第５，９２５，５１７号明細書に記載の分子ビーコンのプローブを利用する検出法；ＦＲＥＴ‐プローブ対を使用する検出法；リ、キュー．（Ｌｉ，Ｑ．）ら、（２００２）「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第３０巻（２）ｃ５に記載の二本鎖プローブを使用する検出法；ならびにアフォニア（Ａｆｏｎｉａ）ら、（２００２）「Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 第３２巻、ｐ．９４６−９に記載の副溝結合（ＭＧＢ）プローブが挙げられる。
【００１２】
本発明のプローブ検出法は、対立遺伝子を識別する少なくとも１つのプローブ；すなわち、一方の対立遺伝子（例えば野生型配列）にはハイブリダイズし、その対立遺伝子からのシグナルを生成させるが、他方の対立遺伝子（例えば突然変異の対立遺伝子）については使用した検出条件下においてハイブリダイズせずシグナルも生成させないプローブ、を使用する。対立遺伝子を識別するプローブは一般に、やや短い結合配列、典型的には長さ２５ヌクレオチド以下で、多くの場合２５ヌクレオチドより５−１０ヌクレオチド短い結合配列を有している。本発明による薬剤耐性突然変異体の検出には、標的配列全体を調べるために２以上のプローブを利用する場合がある。複数のプローブを用いて特定の突然変異を同定することも可能である、すなわち１つのプローブが、特定のヌクレオチド部位に生じることが知られた、または生じる疑いのあるそれぞれの突然変異について特異的であってもよい。複数のプローブを用いる分析法は、各々１つのプローブを含む並列の増幅だけでなく、各反応槽が２以上の異なるプローブを含む部分的または全体的に多重化された分析を含む場合がある。
【００１３】
本発明による分析キットはプローブおよび増幅プライマーを含んでいる。一般に、プライマーはリポーター・プローブとしての機能は果たさないが、そうしてはならないわけではない。例えば、いわゆる「サソリ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）」プライマーには、ヘアピンプローブ、または分子ビーコンプローブが結合している。ウィトカム（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ）ら（１９９４）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ−Ｐｒｏｂｉｎｇ Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１１７巻、ｐ．８０４−８０７）。分析キットは、増幅および検出に必要なすべての試薬、少なくとも必要なプライマー、プローブ、重合酵素およびｄＮＴＰを含むことが好ましい。分析キットは、他の目的のための、例えば対照オリゴヌクレオチドの増幅のためのプライマーおよびプローブを含む場合もある。キットはさらにサンプル調製試薬を含んでもよい。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも分析用のプライマーおよびプローブを含んでいるオリゴヌクレオチド・セットを含む。任意選択でそのようなセットに対照オリゴヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００１５】
本発明の１以上の実施形態の詳細について、添付の図面および以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的および利点は、該説明および図面から、また特許請求の範囲から明白になるであろう。
【００１６】
本願において使用されるように、一定の略語が用いられる。
ＧＳはグルカン・シンターゼの略語である。
Ｆｋｓ１ｐは、現在β（１−３）−グルカン形成を担うグルカン・シンターゼ複合体の触媒サブユニットとされているＦｋｓ１タンパク質の略語である。
【００１７】
ＦＫＳ１はＦｋｓ１ｐをコードする遺伝子である。
ＣａＦｋｓ１ｐはＣ．アルビカンスのＦｋｓ１タンパク質である。
ＣａＦＫＳ１はＣ．アルビカンスのＦＫＳ１遺伝子である。
【００１８】
Ｓｅｒ６４５は、あるアミノ酸（この例ではセリン）と、タンパク質中での該アミノ酸の位置とを指定するための通常の命名法である。ＣａＦｋｓ１ｐでは、セリンはアミノ酸番号６４５である。
【００１９】
Ｓ６４５Ｐは突然変異を表しており、最初に野生型タンパク質のアミノ酸（この例では「Ｓ」、セリン）を；次にそのアミノ酸の位置（この例では「６４５」で、野生型ではＳｅｒ６４５を示す）を；そして最後に突然変異アミノ酸（この例では「Ｐ」、プロリン）を示している。
【００２０】
Ｔ１９３３Ｃは、１９３３位のヌクレオチドにおけるＴからＣへの遺伝子突然変異を表している。遺伝子ＣａＦＫＳ１では、１９３３位のヌクレオチドはＣａＦｋｓ１ｐのＳｅｒ６４５をコードするトリプレット内にあり、突然変異によりアミノ酸の変化がもたらされる。
【００２１】
ＳＮＰは「一塩基多型」の略語である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
真菌のＦＫＳ１遺伝子から対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて１，３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼ（ＧＳ）サブユニットＦｋｓ１ｐとなる。本発明による分析法は、真菌において保存されている２つの短い遺伝子領域のうち一方または両方における突然変異を検出することを目指している。カンジダ属および一部のアスペルギルス属菌種のアミノ酸配列ならびに該アミノ酸配列に対応する遺伝子配列のいずれも周知である。
【００２３】
いくつかのＣａＦＫＳ１配列が利用可能である。増幅プライマーおよびプローブのデザインについて、本発明者らは３つのもの、すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５、Ｆ０２７２９５およびＣＡ２０４３を利用した。図１Ａおよび１Ｂはヌクレオチド配列Ｄ８８８１５を示す。図２は、ＣａＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列を示す。図１Ａおよび１Ｂでは、本発明の分析法の標的に含まれている２つの短いＤＮＡ配列に下線が付されている。該配列は、ＣａＦＫＳ１についてはヌクレオチドＴ１９２１〜Ｔ１９４７、およびＧ４０６９〜Ｇ４０９２に及ぶ。図２では、これに対応するＣａＦｋｓ１ｐの短いアミノ酸配列に下線が付されている。該配列は、Ｆ（Ｐｈｅ）６４１〜Ｐ６４９、およびＤ１３５７〜Ｌ１３６４に及ぶ。
【００２４】
様々な真菌におけるＦｋｓ１タンパク質を生産するアミノ酸の配置については、通常のアラインメントにより位置が示される。図３は、Ｃ．アルビカンスおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のアラインメントを示す。線よりも上方には、Ｃ．アルビカンスの野生型タンパク質ＣａＦｋｓ１ｐの、アミノ酸６４１（Ｐｈｅ６４１）からアミノ酸６４９（Ｐｒｏ６４９）までの部分配列がある。この配列は、Ｓ．セレビシエのＦｋｓ１ｐアミノ酸配列のアミノ酸６３９（Ｐｈｅ６３９）〜６４７（Ｐｒｏ６４６）に非常によく似ている。線よりも下方には、Ｃ．アルビカンスの野生型タンパク質ＣａＦｋｓ１ｐの、アミノ酸１３５７（Ａｓｐ１３５７）からアミノ酸１３６４（Ｌｅｕ１３６４）までの部分配列がある。この配列は、Ｓ．セレビシエのＦｋｓ１ｐアミノ酸配列のアミノ酸１３５３（Ａｓｐ１３５３）〜１３６０（Ｌｅｕ１３６０）に非常によく似ている。同様のアラインメントを、他の真菌種のＦｋｓ１タンパク質について行うこともできる。
【００２５】
１生物種の適切なアミノ酸配列について記載すれば、当業者がそのアミノ酸配列に対応する遺伝子配列を知るのには十分であり、その逆も同様である。さらに、１生物種の適切なアミノ酸配列の配置について記載すれば、当業者が他の生物種の対応するアミノ酸配列の配置や、従って対応する遺伝子配列の配置を知るのには十分であり；また、１生物種の適切な遺伝子配列の配置について記載すれば、当業者が他の生物種における遺伝子配列の配置を知り、そこから対応するアミノ酸配列の配置を知るのには十分である。本発明者らは主としてＣ．アルビカンスおよびＣ．クルセイを用いて研究してきたので、本明細書中の説明はＣ．アルビカンスのアミノ酸および遺伝子配列に基づいている。Ｃ．アルビカンスのＦＫＳ１遺伝子（ＣａＦＫＳ１）の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５である。これに対応するＣ．アルビカンスのアミノ酸配列（ＣａＦｋｓ１ｐ）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ２１５３５である。他の生物種の配列は：アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ｕ７９７２８；アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ＡＡＣＤ０１００００６１；カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、ＣＲ３８０９５３；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、ＤＱ０１７８９４；クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ＡＡＥＹ０１００００７０；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ＡＦ１４８７１５；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ＸＭ３２７１５６；ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ＡＦ１９１０９６；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｕ０８４５９；ヤロウィア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ＣＲ３８２１３１である。
【００２６】
本発明の分析法は、図２において下線を付した２つの短いアミノ酸配列に対応する核酸配列、好ましくはＤＮＡ塩基配列を対象とする。下線を付した第１の配列に関して、第１の標的配列は、（ＣａＦｋｓ１ｐを基準とすれば）Ｐｈｅ６４１〜Ｐｒｏ６４９を最小限として、任意選択で一端または両端に１〜５個、好ましくは１または２個の追加アミノ酸をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。下線を付した第２の配列に関して、第２の標的配列は、Ａｓｐ１３５７〜Ｌｅｕ１３６４を最小限として、任意選択で一端または両端に１〜５個、好ましくは１または２個の追加アミノ酸をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。
【００２７】
本発明による分析法は、第１の標的配列を含む第１の核酸領域の増幅を含んでいる。本発明による好ましい分析法は、第２の標的配列を含む第２の核酸領域の増幅も含んでいる。第１の領域および第２の領域の両方を、両領域にかかる１組のプライマー対を使用して増幅することができる。別例として、２対のプライマー、すなわち第１の領域にかかる第１のプライマー対および第２の領域にかかる第２のプライマー対を利用してもよい。特に、標的配列中の突然変異を検出するために塩基配列決定法を利用することになっている場合、本発明者らはより短いアンプリコンを、従って２組のプライマー対の利用を選択する。上に示されるように、本発明の分析法は特定の増幅法に限定されない。実施例に反映されているように、本発明者らは現在までポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法を利用して検討してきたが、他の方法を使用してもよい。
【００２８】
標的配列中の突然変異は塩基配列決定法によって検出することができる。実施例に反映されているように、本発明者らはサイクルシーケンシングを利用したが、他の塩基配列決定法が使用されてもよい。標的配列中の突然変異の検出は、分析法において野生型の標的配列と突然変異を含む配列とを識別するハイブリダイゼーションプローブを利用することによってなされてもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいし、またはこの２つの組み合わせでもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、非天然ヌクレオチド例えば２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでもよい。該プローブは、非天然のヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエート結合を含んでもよい。該プローブはＰＮＡであってもよい。本発明の分析法に有用なハイブリダイゼーションプローブには、標的配列の対立遺伝子にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを生じるプローブが挙げられる。好ましいプローブは蛍光標識され、検出可能な蛍光シグナルを生じる。ハイブリダイゼーションプローブを使用する検出は、終点検出（すなわち増幅完了後の検出）とすることができる。本発明の好ましいプローブ分析法は、均一系の分析法、すなわち、結合していないプローブから結合したプローブを分離する必要のない分析法である。より好ましい均一系の分析法には、リアルタイム検出（最も好ましくはリアルタイム蛍光検出）、すなわち増幅の間に複数回検出する方法がある。リアルタイム増幅分析法については、本発明者らは、２重蛍光標識プローブ、最も好ましくは、フルオロフォアと、さらに４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）のような非蛍光性の消光剤とで標識されたプローブがよいと考える。
【００２９】
任意の適切なプローブ系探査方法をリアルタイム分析に利用可能であり、該方法には、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光を発するＳＹＢＲ色素のようなＤＮＡ蛍光色素と組み合わせてハイブリダイゼーションプローブを利用する方法がある。例えば、ＳＹＢＲグリーン色素を増幅の検出に使用し、対立遺伝子を識別可能な蛍光ハイブリダイゼーションプローブを、野生型の標的配列の増幅を検出するために、ホモ接合の野生型の標的、突然変異型と野生型とのヘテロ接合の標的、またはホモ接合の突然変異型の標的の存在を示すプローブ蛍光の傾きと共に使用することができる。別の手法は、増幅された標的配列（野生型または突然変異型）の一方の鎖を検出するための、ミスマッチを許容するプローブと、標的配列が突然変異しているかどうか判断するための、対立遺伝子特異的なプローブまたは他方の鎖にハイブリダイズ可能なプローブとを利用することであろう。別例として、実施例で実証されているように、野生型の標的配列および特定の突然変異の存在を示すために複数のプローブを利用することもできる。本発明者らは、カスポファンギン感受性の低下をもたらすいくつかの突然変異を第１および第２の標的配列中に同定した。第１の標的配列では、該突然変異は（ＣａＦＫＳ１を基準にすると）Ｔ１９２１Ｃ、Ｔ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｃ１９３４Ｇ、Ｇ１９４２ＴおよびＣ１９４６Ａである。第２の標的配列では、該突然変異は（ＣａＦＫＳ１を基準にすると）Ｃ４０８１ＧおよびＧ４０８２Ａである。
【００３０】
突然変異の分析およびＳＮＰ遺伝子型決定のための多種多様な分子レベルの方法が利用可能である。なかでも、自己報告性の分子ビーコンプローブを用いて検出されるリアルタイムＰＣＲは、強力な手法の代表である。分子ビーコンプローブは、そのヘアピン構造に起因して、分子内ハイブリダイゼーションと分子間ハイブリダイゼーションとの間で熱力学的に調節された平衡状態から、非常に近似した標的配列を、対応する直線状プローブに比べてより特異的にかつより広い温度範囲で識別するように設計することが可能である。分子ビーコンの識別力は、抗生物質耐性をもたらす突然変異の分析、対立遺伝子の区別、ホモ接合型およびヘテロ接合型のＳＮＰ、ならびに他の数多くの用途に適用されて成功している。
【００３１】
分子ビーコンプローブの選択性は、カスポファンギンに対する感受性の低下をもたらすＣａＦＫＳ１対立遺伝子の分析に有用であった。本発明者らが「ＨＳ１」配列と呼ぶ第１の標的配列についての分析法は、ＣａＦＫＳ１のコドン６４５の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔに注目したものであり、該突然変異は、カスポファンギンに対する感受性の低下を示すＣ．アルビカンス臨床分離株を用いて同定されたものである。標的領域中の耐性対立遺伝子を検出するための対立遺伝子特異的プローブの設計は、この領域内にＳＮＰ（Ｔ１９２９Ａ）があるという事実によって複雑になった。多くの臨床分離株に出現するこのＳＮＰに対応するために、ＳＮＰに相当する部位に揺らぎ塩基を用いてプローブを設計した。所与の条件下ではプローブ分子プールの半分だけが相補的な標的ＤＮＡに結合するので、プローブへの揺らぎ塩基の導入により蛍光の全体的な出力は減少した。しかしながら、そのようなプローブはＣａＦＫＳ１中にＴ１９２９Ａ ＳＮＰが存在するか否かにかかわらずＣ．アルビカンス集団全体との反応性を有するため、縮重プローブの高い融通性から得るものは、絶対的な蛍光強度の損失よりもはるかに大きかった。
【００３２】
ＣａＦＫＳ１の１つの野生型対立遺伝子および３つの突然変異型対立遺伝子に対応する４つの縮重分子ビーコンを合成し、４つのプローブはすべて、ほとんどの標的について一致シグナルとミスマッチシグナルとの比が１００％近い優れた識別特性を示した。相補的なＤＮＡ標的との特異的ハイブリダイゼーションだけが４つのプローブすべてについて観察された。唯一の例外は、分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴとＴ１９２２Ｃ対立遺伝子を含む鋳型との軽微なハイブリダイゼーションであった。この結果は、該ミスマッチのプローブ領域内での位置が外側寄りであることと、比較的安定したＤＮＡ−ＤＮＡミスマッチ対合であることが知られているＴ・Ｇミスマッチを形成するエネルギー論とよって説明することができる。対立遺伝子のヘテロ接合の場合には、分子ビーコンプローブ（野生型および突然変異型の配列を認識する）により、ホモ接合の鋳型と比較して２分の１の大きさの蛍光シグナルが生じた。
【００３３】
カスポファンギンに対する感受性が低下した突然変異体の生成はまれな事象であり、生細胞当たり突然変異体＜１０−８の突然変異頻度に一致していた。耐性変異の形成にはカスポファンギン含有固形培地上でのインキュベーションを延長する必要があり（＞７日）、そこで残余の細胞増殖が生じた。本発明者らは、薬物に曝露する前にＣ．アルビカンス培養物中にカスポファンギン耐性細胞を観察したことがない。対立遺伝子特異的な分子ビーコンにより、２つの異なる菌株由来の８５個の自然発生した感受性低下突然変異体を分析した。ＣＡＩ４株の分離株３５種で見つかった突然変異は、すでに述べたＳｅｒ６４５のコドンに影響する置換と同一であった。そのような突然変異はまた、Ｍ７０株のカスポファンギン耐性誘導株５０種の大多数を占めていた。３つの新しい突然変異、すなわちＰｈｅ６４１、Ｌｅｕ６４４およびＳｅｒ６４５のコドンに影響を及ぼすＴ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｃ１９３４Ｇが、Ｍ７０由来の自然発生した突然変異体のうち６株において検出された。これらの結果は、カスポファンギンに対する感受性が低下したＣ．アルビカンスの実験室株および臨床株についての最近の突然変異分析と一致している。大多数のヌクレオチド置換はＣａＦＫＳ１のコドン６４５で見つかった。ＣａＦＫＳ１の他の部位で新しく発見された突然変異は唯一Ｍ７０株の子孫で見つかり、その相対頻度は１２％以下であった。
【００３４】
全体として、個々の分子ビーコンの適用により、カスポファンギン耐性誘導株８５種すべての遺伝子型を決定することができた。分子ビーコンが標的とした３つの対立遺伝子は７９株中に正確に同定され、ＤＮＡ塩基配列分析によって確認された。６株中の、分子ビーコンが標的としなかった３つの新しい突然変異も、ＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。１つの反応において４つの分子ビーコンすべてを多重使用することにより、ＣａＦＫＳ１の第１の標的配列中のカスポファンギン耐性突然変異を検出する普遍的な閉管分析法がもたらされた。そのような分析法では、ＦＡＭシグナルにより野生型ＣａＦＫＳ１対立遺伝子の存在が示され、ＨＥＸ蛍光からはＤＮＡサンプル中にＴ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４ＴのＣａＦＫＳ１突然変異のうち１つが存在することが報告された。上記３つの突然変異のうちいずれかについてヘテロ接合のＣ．アルビカンス株から抽出されたＤＮＡは、ＦＡＭシグナルおよびＨＥＸシグナルの両方を生じた。したがって、該分析法により、ホモ接合型およびヘテロ接合型のいずれの状態でも、カスポファンギン感受性を低下させるＣ．アルビカンスＣａＦＫＳ１遺伝子中の既知突然変異を確実に検出することが可能となった。該分析法はまた、薬物感受性に影響を及ぼす可能性のある領域中の他の突然変異を同定するのに十分な感度であった。
【００３５】
上述のように、本発明者らは、カスポファンギン感受性の低下に関連した突然変異がＣａＦＫＳ１中の短い保存領域にマッピングされることを示した。最も顕著な部位はＳｅｒ６４５であって置換Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆを含み、これらの置換はＣ．アルビカンスの実験室株および臨床分離株のいずれにおいても見出された。該突然変異は優性のようであり、ヘテロ接合およびホモ接合のいずれの状態においても高レベルのカスポファンギン耐性をもたらした。そのような突然変異を標的とする診断プローブは、Ｃ．アルビカンスにおいてカスポファンギン耐性を検査するための迅速かつ正確なツールを提供することができる。
【００３６】
ＦＫＳ１突然変異の分析に基づいたカスポファンギン耐性の迅速な診断法は、単一ヌクレオチドの違いを有するヘテロ接合およびホモ接合の対立遺伝子を識別する能力を有すると共に、そのような対立遺伝子を多重形式で同時に検出する能力を有していなければならない。分子ビーコン技術は、対立遺伝子の識別および多重検出の両方について優れた技術の代表である。
【００３７】
カスポファンギンに対する感受性が低下した５０を超えるＣ．アルビカンス臨床分離株および実験室分離株についてＣａＦＫＳ１のＤＮＡ塩基配列を分析したところ、それぞれアミノ酸の変異Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５ＹおよびＳ６４５Ｆをもたらす３つの突然変異、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔが明らかとなった。これらのヌクレオチド置換に加えて、配列決定データのアラインメントから、この領域内の別の可変ポイントが示された。分析したすべてのＣ．アルビカンス株の約２５％において、カンジダ・アルビカンスゲノム配列プロジェクトの一部としてＳＣ５３１４株でも報告された単一ヌクレオチドの同義的置換Ｔ１９２９Ａが観察された。この所見は、該置換が、この領域をカバーしている対立遺伝子特異的プローブによる識別に必要なプローブとアンプリコンとのハイブリダイゼーションを変化させる可能性を有するので、重要である。ＣａＦＫＳ１配列のコンセンサスデータに基づいて、本発明者らは、ヌクレオチド１９２０〜１９４４をカバーする４つの対立遺伝子特異的分子ビーコンプローブを設計した。この作業については実施例で詳細に報告する。１つのプローブは、カスポファンギン感受性のＣ．アルビカンス株に見出される野生型（ＷＴ）ＣａＦＫＳ１対立遺伝子に相補的であり、３つのプローブについては、カスポファンギン耐性の分離株中に認められた突然変異型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子（Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ）に相補的とした。ビーコンはすべて同一の６ヌクレオチド長のステム領域５’ＣＧＣＧＡＧおよびＣＴＣＧＣＧ３’を有し、標的配列に対して確実にアラインするように、ＣａＦＫＳ１の１９２９位のＳＮＰに対応する部位に揺らぎ塩基Ａ／Ｔ（５０：５０）を用いて合成した。野生型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴは５’端をＦＡＭで標識し、３つの突然変異型ビーコンは５’端をＨＥＸで標識した。すべての分子ビーコンは３’端にＤＡＢＣＹＬ消光剤修飾を有するものとした。プライマーおよびプローブの設計の詳細については実施例３で述べる。該プローブ用の識別温度枠については実施例４で述べる。検出はこの枠内で実施した。
【００３８】
Ｃ．アルビカンスＣＡＩ４株およびＭ７０株の自然発生のカスポファンギン耐性突然変異を、４μｇ／ｍｌ（ＭＩＣの４０倍）のカスポファンギンを含んだ固体増殖培地での直接選択によって分離した。自然発生のカスポファンギン耐性誘導株の形成頻度は、いずれの株についても生細胞当たりの突然変異体が＜１０−８であった。いずれの菌株についても、カスポファンギンを含むプレート上で数少ない収縮した成長の遅いコロニーの形成が観察された。このコロニーを、同量のカスポファンギンを含んだ新鮮なプレート上に画線接種したが、増殖しなかった。インキュベーションを１０日以上延長した後、小さな収縮したコロニーのごく一部から成長の速い滑らかな誘導体が生じ、該誘導体は再接種後にカスポファンギン含有培地上で増殖可能であった。個々のプレート／培養当たりそのような誘導体を１つだけ保存し、詳しい分析のために使用した。合計では、カスポファンギンに対する感受性が低下した分離株が、ＣＡＩ４株およびＭ７０株についてそれぞれ３５株および５０株分離された。インビトロでのカスポファンギン感受性試験から、すべての実験室誘導分離株についてカスポファンギン濃度＞１６μｇ／ｍｌの高いＭＩＣ値が明らかとなった。分離手順の詳細については実施例２において述べる。
【００３９】
ＣＡＩ４株およびＭ７０株のＣａＦＫＳ１遺伝子の予備的な塩基配列決定（実施例２を参照）から、ＣＡＩ４のＣａＦＫＳ１遺伝子中にはＴ１９２９Ａ ＳＮＰが存在し、Ｍ７０には存在しないことが明らかになった。親株のＣＡＩ４およびＭ７０ならびに前記菌株のカスポファンギン耐性誘導株から染色体ＤＮＡを抽出し、鋳型としてＣａＦＫＳ１分子ビーコンとともにリアルタイムＰＣＲ実験に使用した。図４は、野生型および変異型両方の様々な標的のヌクレオチド配列と、利用したプライマーおよび分子ビーコンプローブを示している。図４では、プローブのプローブ領域および標的鎖の標的配列に下線が付されている。プローブおよび標的配列中の、ＣａＦＫＳ１のＨＳ１領域中の突然変異に対応する塩基は、太字体になっている。Ｗで示された塩基の位置は、その位置がＡまたはＴであるという点だけが異なる２種の縮重分子ビーコンの等モル混合物を示す。染色体ＤＮＡサンプルをそれぞれ、感受性の低下した異なる対立遺伝子を示す個々の分子ビーコンプローブを用いた４つの別個のＰＣＲ反応に供した。リアルタイムＰＣＲのプロトコールは実施例５に記載されている。すべての反応についてアニーリング温度を６１℃とすることにより、異なるＣａＦＫＳ１対立遺伝子同士を良好に識別することが可能であった（実施例４を参照）。突然変異型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＣＡＩ４株のカスポファンギン耐性誘導株３５種すべてについて見出された。その大多数（分離株２０種）はヘテロ接合の突然変異ｗｔ／Ｔ１９３３Ｃを有し、１５種の突然変異体がホモ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを含んでいた。Ｔ１９３３Ｃのヘテロ接合の場合には、分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴおよびＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃからの同程度の２つのシグナルが生じた（図５）。図５は、個々の分子ビーコンおよびＤＮＡ標的を用いた４つの別個のＰＣＲの結果である。
【００４０】
【化１】
は、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃビーコン＋ホモ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４１】
【化２】
は、ＣａＦＫＳ１−ＷＴビーコン＋ホモ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４２】
【化３】
は、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃビーコン＋ヘテロ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡ：
【００４３】
【化４】
は、ＣａＦＫＳ１−ＷＴビーコン＋ヘテロ接合のＴ１９３３Ｃ突然変異を備えたＣａＦＫＳ１対立遺伝子のＤＮＡである。
【００４４】
図６Ａ−６Ｄは、４つの分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴ（図６Ａ）、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ（図６Ｂ）、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ａ（図６Ｃ）およびＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔ（図６Ｄ）による、１０種のＣａＦＫＳ１ホモ接合型対立遺伝子の識別を示す。各プロットは、突然変異を有する個々の対立遺伝子ＤＮＡ、すなわち
【００４５】
【化５】
は野生型（突然変異もＳＮＰも無し）：
【００４６】
【化６】
はＴ１９３３Ｃ：
【００４７】
【化７】
はＣ１９３４Ａ：
【００４８】
【化８】
はＣ１９３４Ｔ：
【００４９】
【化９】
はＴ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５０】
【化１０】
はＴ１９３３Ｃ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５１】
【化１１】
はＣ１９３４Ａ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５２】
【化１２】
はＣ１９３４Ｔ＋Ｔ１９２９Ａ ＳＮＰ：
【００５３】
【化１３】
はＴ１９２２Ｃ：
【００５４】
【化１４】
はＧ１９３２Ｔ＋Ｃ１９３４Ｇ：
【００５５】
【化１５】
はブランク（ＤＮＡ無し）、を用いた１１通りの個々のＰＣＲの結果をまとめたものである。
【００５６】
ホモ接合のＣａＦＫＳ１突然変異を有するＤＮＡサンプルは、対応する突然変異型分子ビーコンからの明瞭な応答を生じ、ＣａＦＫＳ１−ＷＴからのシグナルは生じなかった（図６Ｂ−６Ｄ）。反対に、親株ＣＡＩ４からの染色体ＤＮＡはＣａＦＫＳ１−ＷＴプローブのみと反応し、蛍光は突然変異型ビーコンからは検出されなかった（図６Ａ）。
【００５７】
菌株Ｍ７０のカスポファンギン耐性誘導株のＣａＦＫＳ１対立遺伝子について遺伝子型を決定すると、５０サンプルのうち４４サンプル中で既知の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔが明らかとなった。ＣＡＩ４突然変異体の場合のように、Ｍ７０誘導株の大多数はヘテロ接合型の突然変異Ｔ１９３３Ｃとなっていた。感受性の低下した５０株のうち２５株が１コピーのＣａＦＫＳ１にＴ１９３３Ｃ置換を有することが分かった。ヘテロ接合の突然変異Ｃ１９３４ＡおよびＣ１９３４Ｔは６菌株に検出された。ヘテロ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有するＤＮＡサンプルに関するすべてのリアルタイムＰＣＲにおいて、ＣａＦＫＳ１−ＷＴ分子ビーコンと、３つの突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔのうちの１つとに由来する２種類の蛍光シグナルが生じた。ＣａＦＫＳ１の１９３３位および１９３４位におけるヘテロ接合の突然変異とは別に、これらの部位におけるホモ接合の置換も１３菌株で検出された。これらは対応する突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔを用いた特異的ハイブリダイゼーションによって同定された（図６Ｂ−６Ｄ）。
【００５８】
５０菌株のうち６菌株では、染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅が野生型分子ビーコンによって弱く検出されただけで突然変異型分子ビーコンでは全く検出されず（５菌株）、また１菌株は野生型および突然変異型のいずれの分子ビーコンによっても検出されなかった。プローブの対立遺伝子特異性を考えると、これらのデータは鋳型の配列に未知の変化が生じたことを示唆するものである。
【００５９】
リアルタイムＰＣＲの結果を確認し、かつ６つのＭ７０誘導株の未決着の問題を明確にするために、すべてのカスポファンギン耐性のＣＡＩ４菌株およびＭ７０菌株のＣａＦＫＳ１に関するＤＮＡ塩基配列決定を用いた。３５種のＣＡＩ４誘導株および４４種のＭ７０誘導株すべてについて、リアルタイムＰＣＲの結果と塩基配列決定の結果との間に１００％の相関が見出された。分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＴとのハイブリダイゼーションによってリアルタイムＰＣＲ実験においてＣａＦＫＳ１の１９３３位および１９３４位に検出されたヘテロ接合およびホモ接合の突然変異はすべて、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認された。新しいホモ接合型突然変異Ｔ１９２２Ｃの存在は、リアルタイムＰＣＲ実験で曖昧な結果を示した５つのＭ７０誘導株のＣａＦＫＳ１遺伝子で見つかった。さらに、ＤＮＡ塩基配列決定から、リアルタイムＰＣＲではいかなる蛍光応答も生じなかったカスポファンギン耐性Ｍ７０誘導株１株のＣａＦＫＳ１遺伝子中に、２つの新しいホモ接合型突然変異Ｇ１９３２ＴおよびＣ１９３４Ｇが明らかとなった。予想通り、ＣＡＩ４株の誘導株はすべてＴ１９２９Ａ ＳＮＰを有し、Ｍ７０株の誘導株は該ＳＮＰを欠いていたが、このことは塩基配列決定から明らかとなった。
【００６０】
ＣａＦＫＳ１分子ビーコンを別個に適用することにより、Ｃ．アルビカンスのＣａＦＫＳ１遺伝子中の３つの既知の突然変異について遺伝子型決定が可能であった。本発明者らはさらに、所与のＤＮＡサンプル中のそのような突然変異を同時に評価するのに適した多重リアルタイムＰＣＲ形式において、４つの縮重ＣａＦＫＳ１分子ビーコンすべてを併用する可能性について調査した。実施例５を参照されたい。本発明者らは、野生型と突然変異型とで異なるフルオロフォアで標識した４つのＣａＦＫＳ１分子ビーコンすべてを一緒に合わせて、個々のＰＣＲに添加する総合プローブ混合物とした。野生型のＣＡＩ４株およびＭ７０株、ならびに前記菌株の、１２の異なるＣａＦＫＳ１遺伝子型を表わす１２のカスポファンギン耐性誘導株の染色体ＤＮＡを、鋳型として多重リアルタイムＰＣＲに使用した。多重リアルタイムＰＣＲ実験の条件は、アニーリング温度が６０℃であることを唯一の例外として、個々の分子ビーコンを用いたリアルタイムＰＣＲの条件と同一とした。野生型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴはＦＡＭで標識し、突然変異型分子ビーコンＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡまたはＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔは、ＨＥＸで標識した。これらのプローブを使用して、蛍光出力の性質によりカスポファンギン感受性菌株およびカスポファンギン耐性菌株を同定することができた。
【００６１】
図７は、ＣａＦＫＳ１突然変異の多重リアルタイムＰＣＲ分析について、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＭＸ４０００ソフトウェアのグラフィック出力を例証している。上側の半円はＦＡＭシグナルが観察されると強調表示されて野生型ＣａＦＫＳ１ ＤＮＡの存在を報告する。下側の半円はＨＥＸシグナルが観察されると強調表示されて、ＣａＦＫＳ１ ＤＮＡ中に３つの記載の突然変異のうちいずれかが存在することを報告する。ホモ接合型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＦＡＭまたはＨＥＸシグナルのいずれか一方を生じ、ヘテロ接合型のＣａＦＫＳ１対立遺伝子はＦＡＭおよびＨＥＸシグナルを両方生じる。
【００６２】
感受性のＣＡＩ４株およびＭ７０株由来のＤＮＡが多重リアルタイムＰＣＲに供されると、ＦＡＭ蛍光だけが観察された。ＣａＦＫＳ１中にホモ接合型の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有するＤＮＡを用いた多重リアルタイムＰＣＲではＨＥＸ蛍光だけが報告された（図７）。分析されたＤＮＡが、ＣａＦＫＳ１遺伝子中にヘテロ接合の突然変異Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４ＡまたはＣ１９３４Ｔを有することが知られた菌株に由来する場合、ＦＡＭおよびＨＥＸシグナルの両方が同程度検出された（図７）。ＣａＦＫＳ１に２つの新しい突然変異Ｇ１９３２ＴおよびＣ１９３４Ｇを有する菌株由来の染色体ＤＮＡを用いた多重リアルタイムＰＣＲでは、ＦＡＭまたはＨＥＸいずれの蛍光も生じなかった。ホモ接合型の突然変異Ｔ１９２２Ｃを含んでいる菌株由来の染色体ＤＮＡを用いた反応では軽微なＦＡＭシグナルが観察された。
【００６３】
本発明者らはまた、本発明者らが「ＨＳ２」と呼ぶ第２の標的領域のために、特に１つの突然変異Ｇ４０８２Ａについて、プライマーおよびプローブを設計した。これは実施例６において報告する。第２の標的部位を含む分析法を設計する際には、突然変異Ｃ４０８１Ｇまたはその他のそのような突然変異について同様に突然変異型プローブを設計することが可能であり、設計は別個に為されてもよいし、あるいはＨＳ２について、またはＨＳ１およびＨＳ２について、前述の実施例のように多重化されてもよい。
【実施例１】
【００６４】
突然変異の同定のための、適切なＣａＦＫＳ１遺伝子フラグメントの核酸増幅とサイクルシーケンシングとの併用について、４つの異なる菌株を利用して実証した。ＣａＦＫＳ１のフラグメント（約４５０ｂｐ）を、菌株ＣＡＩ４−Ｒ１、ＮＲ２、ＮＲ３およびＮＲ４由来のゲノムＤＮＡから増幅させた。ＣａＦＫＳ１の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）に基づいた、ＰＣＲに使用したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ５’−ＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣ−３’および５’−ＡＡＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧ−３’であった。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、ＤＮＡ塩基配列を決定した。カンジダ属の臨床分離株については、５’−ＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡＧ−３’および５’−ＧＧＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧ−３’をそれぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いて、ＤＮＡ塩基配列分析用にＣａＦＫＳ１ ＯＲＦの大きな一部分（約２．６ｋｂ）を増幅させた。上述のＣａＦＫＳ１の第１の標的領域（コーディングヌクレオチド１９２１−１９４７に相当）に加えて、このフラグメントは第２の標的ヌクレオチド４０６９−４０９２を含んでいる。ＰＣＲ生成物を精製し、蛍光標識法（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））によって定量し、ＤＴＣＳクイック・スタート・キット（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を使用して５’方向および３’方向の両方について塩基配列を決定した。
【実施例２】
【００６５】
核酸増幅およびサイクルシーケンシングを使用するＤＮＡ塩基配列分析は、それ自体分析技術としても、またプローブ系分析法を評価するための対照としても使用することができる。
【００６６】
Ｃ．アルビカンスの染色体ＤＮＡを、Ｑ‐バイオジーン（Ｑ‐Ｂｉｏｇｅｎｅ）ＦａｓｔＤＮＡキット（米国カリフォルニア州アーバイン所在のＱ‐バイオジーン）を用いて、液体ＹＰＤ培地中で一晩増殖させた細胞から抽出した。ＰＣＲ実験は、ｉＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在のバイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で実施した。ＣａＦＫＳ１のＨＳ１と名付けた領域を、プライマーＣａＦＫＳ１−Ｆ１７１９およびＣａＦＫＳ１−Ｒ２２１２（図４）を使用して増幅させた。各１００μｌのＰＣＲ反応物には、０．２５μＭの各プライマー、２．５ＵのｉＴａｑ（ＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在のバイオ・ラッド・ラボラトリーズ）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．４および約５０ｎｇのＣ．アルビカンス染色体ＤＮＡを含めた。サイクル反応条件は、９５℃で３分を１サイクル、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、７２℃で３分を１サイクルとした。ＰＣＲ生成物を、ＭｏｎｔａｇｅＰＣＲ精製キット（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して精製した。塩基配列決定のためのＰＣＲ生成物を、ＣＥＱ（ＴＭ）ダイターミネーター・サイクルシーケンシング−クイック・スタート・キット（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）を使用して、製造業者の推奨に従ってｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラーで入手および精製した。塩基配列決定反応にはプライマーＣａＦＫＳ１−Ｆ１７１９またはＣａＦＫＳ１−Ｒ２２１２を使用した。塩基配列決定のＰＣＲのサイクル反応条件は、９５℃で３分を１サイクル、９６℃で２０秒、５０℃で２０秒、６０℃で１分を３０サイクルとした。ＤＮＡの塩基配列決定はすべてＣＥＱ（ＴＭ）８０００遺伝子分析システム（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）で実施した。ＣＥＱ（ＴＭ）８０００遺伝子分析システムソフトウェア（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマン・コールター）を、ハードウェアの制御ならびに実施後の配列決定結果の分析に使用した。
【００６７】
Ｃ．アルビカンス菌株ＣＡＩ４はＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス所在のＡＴＣＣ）から購入した。Ｃ．アルビカンス菌株Ｍ７０はメルクカルチャーコレクション（米国ニュージャージー州ローウェイ所在のＭＲＬ）から得た。菌株は、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％デキストロース）で増殖させた。菌株ＣＡＩ４の増殖用には；ＹＰＤ培地にウリジン（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））を補足して２５ｍｇ／ｍｌとした。カスポファンギン（米国ニュージャージー州ローウェイ所在のメルク（Ｍｅｒｃｋ））は、直接ＹＰＤに添加して４μｇ／ｍｌとした。寒天プレートは３０℃でインキュベートし、液体培養物は、３０℃で回転振盪機（１００ｒｐｍ）にて３ｍｌのＹＰＤを含む１２ｍｌの培養試験管中で増殖させた。カスポファンギンに対する感受性は、ＮＣＣＬＳ文書Ｍ２７−Ａ２に概説されているようにして、ＲＰＭＩ−１６４０培地（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・アルドリッチ）における液体マイクロブロス希釈法で評価した。
【００６８】
Ｃ．アルビカンス菌株ＣＡＩ４およびＭ７０の自然発生的なカスポファンギン耐性突然変異体は、４μｇ／ｍｌのカスポファンギンを含んだＹＰＤプレート上に液体ＹＰＤでの１８時間培養物１００μｌ（細胞〜１０８個）を播種することにより分離した。開始時のコロニー数を正確に測定するために、前記終夜培養物の系列希釈物を、抗生物質による選択のないＹＰＤプレート上に播種した。選択プレートを３０℃で１０−１４日間インキュベートした。各選択プレートから、薬物に対して耐性の少なくとも４つの個別のコロニーを、新鮮なカスポファンギン含有プレート上に再度播種して耐性の表現型を確認した。
【実施例３】
【００６９】
報告されているＣａＦＫＳ１の３つのＤＮＡ塩基配列であるＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５およびＡＦ０２７２９５およびＣＡ２０４３を、ＦＫＳ１の分子ビーコンおよびプライマーの設計に使用した。分析用プライマーおよびプローブの設計は当技術分野において周知である。研究者を支援する多数の出版物が利用可能である。さらに、作業を早め、かつ試行錯誤によって行われる必要のある調整を縮小するために、コンピューター・ソフトウェア・パッケージを利用可能である（実施例４を参照）。本発明者らはそのようなソフトウェア・パッケージを使用した。分子ビーコンおよびＤＮＡプライマー（図４）を、Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ３．０ソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト所在のプレミア・バイオソフト（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ））を使用して設計した。ソフトウェアのパラメータ既定値をすべての分子ビーコンおよびプライマーの構築に適用した。分子ビーコンは、５’端をフルオロフォアである５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）で、また３’端をダブシルで標識した。分子ビーコンおよびプライマーのいずれもバイオサーチ・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（米国カリフォルニア州ノヴァト所在のバイオサーチ・テクノロジーズ）から購入した。ＣａＦＫＳ１対立遺伝子に特異的な分子ビーコンのハイブリダイゼーション特性を、一本鎖の標的オリゴヌクレオチドを用いて十分な温度範囲（２５℃〜９５℃）について試験した（図４）。分子ビーコンと標的とのハイブリダイゼーションは、ストラタジーンＭＸ４０００定量的多重ＰＣＲシステム（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）で実施した。データのモニタリングおよび分析のためにＭＸ４０００ソフトウェア中から「分子ビーコン融解曲線」実験タイプを選択した。各５０μｌのハイブリダイゼーション反応液には、１×ストラタジーン・コアＰＣＲバッファー、４ｍＭのＭｇＣｌ２、個々の標的オリゴヌクレオチド１００ｐｍｏｌ、および５ｐｍｏｌの分子ビーコンを含めた。実験の温度条件は、９５℃で３分間加熱することと、８０℃に冷却した後で温度勾配を−０．５℃とした３０秒間のステップ１１２回で２５℃まで冷却することと、からなるものとした。個々の反応についての蛍光出力を冷却ステップの最後に計測した。「分子ビーコン融解曲線」実験の最終データを、「ＳＹＢＲグリーン（解離曲線あり）」タイプの実験に変換した。分子ビーコン−標的対それぞれの融解温度（Ｔｍ）は、蛍光出力の一次導関数−Ｒ’（Ｔ）の最大値に対応する温度ポイントとしてＭＸ４０００ソフトウェアによって決定された。温度プロファイル分析実験はそれぞれ３連で実施した。
【実施例４】
【００７０】
核酸ハイブリダイゼーションプローブが２つまたはそれ以上の対立遺伝子を識別する能力は温度に依存する；すなわち、あるプローブが標的と１ヌクレオチド異なる配列を７０℃で識別する場合、該プローブは恐らく４０℃ではミスマッチな標的に結合し、そのような低い温度では識別しないだろう。
【００７１】
本発明者らは、プローブ設計および分析法設計の一部として、プローブの対立遺伝子識別能力を分析した。ハイブリダイゼーション・プロファイルを、野生型ＣａＦＫＳ１対立遺伝子と、１９３３位および１９３４位にカスポファンギン耐性突然変異、ならびに１９２９位にＳＮＰを有する様々なＣａＦＫＳ１対立遺伝子とに相当する８つのＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型に対する分子ビーコンプローブについて決定した（図４）。図４に「標的」として記載されたオリゴヌクレオチドを、プローブの融解曲線分析に使用した。いくつかの標的配列では、記載のように下線部分が１つのプローブに相補的であり、融解曲線分析の際の二次構造の形成を低減するために末端にはアデノシンの繰り返しを付加した。最初に、各々の分子ビーコンプローブのハイブリダイゼーションについて、プローブ領域の配列に相補的で、１９２９位のＳＮＰに相当するヌクレオチド塩基が異なる２つのＤＮＡ標的を用いて評価した。縮重分子ビーコンプローブはそれぞれ、そのようなＤＮＡ標的とともに２種類の分子間ハイブリッドを形成した。安定なハイブリッドは、標的オリゴヌクレオチドと、分子ビーコンのうちの相補配列を有する部分集団とにより形成された。１９２９位に単一のミスマッチヌクレオチドを有する別の部分集団の分子ビーコンプローブは、同じＤＮＡ標的とともにより安定性の低いハイブリッドを形成した。結果として、蛍光出力の一次導関数（−Ｒ’（Ｔ））として表わされる上記混合プローブの融解曲線は、より安定な分子ビーコン−標的ハイブリッドおよび安定性の低い分子ビーコン−標的ハイブリッドのＴｍに対応する２つの別個のピークを示した。次に、本発明者らは、各分子ビーコンと非相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調査した（図４）。そのようなミスマッチを有するハイブリッドは一般に相補体よりも安定性は低かったが、分子ビーコンの縮重により２つのハイブリッド部分集団について同じ傾向が生じた。比較的安定性の高い分子間ハイブリッドは、標的オリゴヌクレオチドと単一ミスマッチを有するビーコン部分集団とによって形成され、安定性の低いハイブリッドは、オリゴヌクレオチドと二重にミスマッチを有するビーコン部分集団とで構成された。縮重分子ビーコンと標的オリゴヌクレオチドとの８対それぞれについて得られた２つのＴｍ値のうち、ミスマッチが無いかまたは１つである安定性の高いビーコン−標的ハイブリッドに対応する高いほうのＴｍ値のみを取り入れた。ＣａＦＫＳ１分子ビーコンと該ビーコンに相補的なＤＮＡ標的とに関するＴｍ値は互いにかなり接近しており、温度範囲６２．７〜６４．０℃に入った。同様に、対応する識別ウィンドウは類似の温度域を占める。このような均一性は、個々のビーコンについてプローブ領域配列の長さを変えることにより達成された。分子ビーコンＣａＦＫＳ１−ＷＴ、ＣａＦＫＳ１−Ｔ１９３３Ｃ、ＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４ＡおよびＣａＦＫＳ１−Ｃ１９３４Ｔは、それぞれ２４、２３、２５および２５ヌクレオチド長のプローブ領域を有するものであった。
【実施例５】
【００７２】
増幅のリアルタイム分析を図４に記載のプライマーおよびプローブについて実証した。該分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を、分子ビーコンプローブを利用するリアルタイム検出とともに含むものとした。
【００７３】
個々の単一プローブ（図４）を使用する分析については、手順を以下のとおりとした。リアルタイムＰＣＲ実験は、ストラタジーンＭｘ４０００定量的多重ＰＣＲシステムにおいて、設定を「定量的ＰＣＲ（多重標準）［Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ （Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）］」として実施した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＱＰＣＲコア試薬キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）の試薬をすべての反応に使用した。５０μｌのＰＣＲ反応液にはそれぞれ１×ストラタジーン・コアＰＣＲバッファー、０．２μＭの分子ビーコン、各々０．２５μＭのＨＳ１ＡＮ２プライマーおよびＨＳ１ＳＮ２プライマー（図４）、２．５ＵのＳｕｒｅＳｔａｒｔ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２および約５０ｎｇのＣ．アルビカンス染色体ＤＮＡを含めた。多重ＰＣＲ実験では、４つの分子ビーコン（図４）の各々の濃度を０．２μＭとした。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーのパラメータを：９５℃で１０分を１サイクル、９５℃で３０秒、６１℃で３０秒、および７２℃で３０秒を４５サイクルとした。ＰＣＲ実験を多重形式で実施する場合は、６０℃のアニーリング温度を使用した。Ｍｘ４０００システムのフィルタゲインセットを、様々な分子ビーコンからの蛍光シグナルの大きさを均等化する目的でＦＡＭ−９６０ ＨＥＸ−７２０に変更した。蛍光をアニーリング・ステップの間に３回計測した。
【００７４】
ＰＣＲ増幅の間にストラタジーンＭｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルを、Ｍｘ４０００ソフトウェアを使用してリアルタイムでモニターした。各実行の終わりに、増幅のプロットデータをグラフ形式に変換し、画像ファイルとして保存するかまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌへエクスポートして表計算ファイルとして保存した。多重ＰＣＲ反応の場合には、ＰＣＲ増幅の最終的な結果を「定量的ＰＣＲ（多重標準）」タイプの実験から「定量的プレート読出（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄ）」タイプの実験に変換した。個々のフルオロフォアに関する蛍光の変化の合計（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）を分析値として得た。結果をグラフ形式または数値形式に変換し、画像または表計算ファイルとして保存した。
【００７５】
多重分析については、本発明者らは上述のＰＣＲ増幅を利用し、ただし熱サイクル反応のアニーリング温度を６１℃ではなく６０℃とした。複数のプローブを同一の反応において利用した。
【実施例６】
【００７６】
ＰＣＲ増幅分析法のためのプライマーおよび分子ビーコンプローブを、本発明者らがＨＳ２と呼ぶ第２のＤＮＡ塩基配列のために設計した。プライマーは、次の配列：
ＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣ−３’
ＣＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧ−３’
を有する。
【００７７】
野生型遺伝子配列とエキノカンジン耐性変異Ｇ４０８２Ａとを区別するために、対立遺伝子を識別可能な１対の分子プローブのヌクレオチド配列を設計した。各々の一端をフルオロフォアで、他端をＤＡＢＣＹＬのような非蛍光性の消光剤で標識することになる。もちろん識別可能なフルオロフォアを利用して、上記プローブのうち一方を含む終点分析法およびリアルタイム増幅において、あるいは両方のプローブを含む多重分析法において、第１の標的配列用のプライマーおよびプローブを一緒に用いる状態または用いない状態で、野生型プローブは野生型遺伝子配列にのみハイブリダイズしてそこで蛍光を発し、突然変異型プローブは突然変異配列にのみハイブリダイズしてそこで蛍光を発するようにすることになる。
【００７８】
分子ビーコンプローブは、６ヌクレオチド長のステムを形成する相補的な３’および５’アーム配列に隣接した長さ２４ヌクレオチドの一本鎖ループを有している。いずれのプローブも計算上６１．５℃のＴｍを有する。その配列は；
野生型プローブ：
【００７９】
【化１６】
突然変異型プローブ：
【００８０】
【化１７】
である。
【００８１】
上記配列において、相補的なアームには下線を付し、突然変異体において変化した単一ヌクレオチドは太字になっている。
本発明のいくつかの実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされうることは理解されるだろう。例えば、ＰＣＲ以外の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡを使用することも可能であり、また、分子ビーコンプローブ以外の対立遺伝子識別プローブを使用することもできる。従って、他の実施形態は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１Ａ】遺伝子配列ＣａＦＫＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図１Ｂ】遺伝子配列ＣａＦＫＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８８８１５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図２】アミノ酸配列ＣａＦｋｓ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ２１５３５）を、エキノカンジン感受性を低下させる突然変異の領域に下線を付して示す図である。
【図３】サッカロマイセス・セレビシエのＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列をカンジダ・アルビカンスのＦｋｓ１ｐのアミノ酸配列とともにアラインメントして示す図である。
【図４】実施例において利用したプライマー、プローブおよびプローブ標的の配列を示す表である。
【図５】リアルタイムＰＣＲ分析におけるヘテロ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ａ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｂ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｃ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図６Ｄ】リアルタイムＰＣＲ分析におけるホモ接合型サンプルからの蛍光曲線のプロット図である。
【図７】多重リアルタイム分析の検出結果の形式を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキノカンジン系薬物に対して感受性で、かつ１−３β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応するＦＫＳ１遺伝子を含む真菌における、エキノカンジン系薬物に対する耐性についての核酸分析法であって、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸６３６〜６５４の少なくとも一部分であってアミノ酸６４１〜６４９を含む部分に対応するＦＫＳ１の第１の核酸標的配列を増幅することと、増幅した第１の標的配列における野生型対立遺伝子との何らかの差異を検出することと、からなる分析法。
【請求項２】
真菌はカンジダ属真菌である、請求項１に記載の分析法。
【請求項３】
ＣａＦｋｓ１ｐのＦ６４１Ｌ、Ｆ６４１Ｓ、Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆ、Ｄ６４８Ｙ、およびＰ６４９Ｈからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を検出することができる、請求項１または請求項２に記載の分析法。
【請求項４】
前記増幅工程は、１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３４５〜１３６９の少なくとも一部分であってアミノ酸１３５７〜１３６４を含む部分に対応する、ＦＫＳ１遺伝子の第２の核酸標的配列を増幅することを含み、かつ前記検出工程が、増幅した第２の標的配列における野生型対立遺伝子との何らかの差異を検出することを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項５】
ＣａＦｋｓ１ｐのＲ１３６１ＨおよびＲ１３６１Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の変化を検出することができる、請求項４に記載の分析法。
【請求項６】
第１の標的配列および第２の標的配列の増幅は同一の反応液中で実施される、請求項４または５に記載の分析法。
【請求項７】
前記検出工程は塩基配列決定法を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項８】
前記検出工程は、増幅した第１および第２の標的配列を、標識したハイブリダイゼーションプローブと接触させることを含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項９】
検出は、均一系の終点検出またはリアルタイム検出である、請求項８に記載の分析法。
【請求項１０】
請求項９に記載のリアルタイム分析法。
【請求項１１】
前記増幅工程は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡからなる群から選択される増幅方法を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項１２】
前記第１の標的配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第１の対と、１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸６３６〜６５４の少なくとも一部分であってアミノ酸６４１〜６４９を含む部分に対応するＦＫＳ１遺伝子の第１の標的配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーとを含む、オリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１３】
１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３４５〜１３６９の少なくとも一部分であってアミノ酸１３５７〜１３６４を含む部分に対応するＦＫＳ１遺伝子の第２の標的配列を増幅するための、順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第２の対を含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１４】
順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第１の対が、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３５７〜１３６４に対応するアミノ酸も網羅する、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１５】
ＣａＦＫＳ１のＴ１９２１Ｃ、Ｔ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｃ１９３４Ｇ、Ｃ１９４２Ｔ、およびＣ１９４６Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１６】
ＣａＦＫＳ１のＣ４０８１ＧおよびＧ４０８２Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１７】
前記順方向プライマーおよび逆方向プライマーにより規定された増幅生成物の塩基配列決定を行うための塩基配列決定用プライマーをさらに含んでなる、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１８】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の分析法を実施するための試薬キット。
【請求項１９】
請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セットを含む、請求項１８に記載の試薬キット。
【請求項２０】
サンプル調製およびＤＮＡ抽出のための試薬をさらに含む、請求項１８または請求項１９に記載の試薬キット。
【請求項１】
エキノカンジン系薬物に対して感受性で、かつ１−３β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応するＦＫＳ１遺伝子を含む真菌における、エキノカンジン系薬物に対する耐性についての核酸分析法であって、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸６３６〜６５４の少なくとも一部分であってアミノ酸６４１〜６４９を含む部分に対応するＦＫＳ１の第１の核酸標的配列を増幅することと、増幅した第１の標的配列における野生型対立遺伝子との何らかの差異を検出することと、からなる分析法。
【請求項２】
真菌はカンジダ属真菌である、請求項１に記載の分析法。
【請求項３】
ＣａＦｋｓ１ｐのＦ６４１Ｌ、Ｆ６４１Ｓ、Ｓ６４５Ｐ、Ｓ６４５Ｙ、Ｓ６４５Ｆ、Ｄ６４８Ｙ、およびＰ６４９Ｈからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を検出することができる、請求項１または請求項２に記載の分析法。
【請求項４】
前記増幅工程は、１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３４５〜１３６９の少なくとも一部分であってアミノ酸１３５７〜１３６４を含む部分に対応する、ＦＫＳ１遺伝子の第２の核酸標的配列を増幅することを含み、かつ前記検出工程が、増幅した第２の標的配列における野生型対立遺伝子との何らかの差異を検出することを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項５】
ＣａＦｋｓ１ｐのＲ１３６１ＨおよびＲ１３６１Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の変化を検出することができる、請求項４に記載の分析法。
【請求項６】
第１の標的配列および第２の標的配列の増幅は同一の反応液中で実施される、請求項４または５に記載の分析法。
【請求項７】
前記検出工程は塩基配列決定法を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項８】
前記検出工程は、増幅した第１および第２の標的配列を、標識したハイブリダイゼーションプローブと接触させることを含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項９】
検出は、均一系の終点検出またはリアルタイム検出である、請求項８に記載の分析法。
【請求項１０】
請求項９に記載のリアルタイム分析法。
【請求項１１】
前記増幅工程は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡからなる群から選択される増幅方法を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項１２】
前記第１の標的配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第１の対と、１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸６３６〜６５４の少なくとも一部分であってアミノ酸６４１〜６４９を含む部分に対応するＦＫＳ１遺伝子の第１の標的配列を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーとを含む、オリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１３】
１−３−β−Ｄ−グルカン・シンターゼのサブユニットＦｋｓ１ｐに対応し、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３４５〜１３６９の少なくとも一部分であってアミノ酸１３５７〜１３６４を含む部分に対応するＦＫＳ１遺伝子の第２の標的配列を増幅するための、順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第２の対を含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１４】
順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第１の対が、ＣａＦｋｓ１ｐアミノ酸１３５７〜１３６４に対応するアミノ酸も網羅する、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１５】
ＣａＦＫＳ１のＴ１９２１Ｃ、Ｔ１９２２Ｃ、Ｇ１９３２Ｔ、Ｔ１９３３Ｃ、Ｃ１９３４Ａ、Ｃ１９３４Ｔ、Ｃ１９３４Ｇ、Ｃ１９４２Ｔ、およびＣ１９４６Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１６】
ＣａＦＫＳ１のＣ４０８１ＧおよびＧ４０８２Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１７】
前記順方向プライマーおよび逆方向プライマーにより規定された増幅生成物の塩基配列決定を行うための塩基配列決定用プライマーをさらに含んでなる、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
【請求項１８】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の分析法を実施するための試薬キット。
【請求項１９】
請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド・セットを含む、請求項１８に記載の試薬キット。
【請求項２０】
サンプル調製およびＤＮＡ抽出のための試薬をさらに含む、請求項１８または請求項１９に記載の試薬キット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５０２１７４（Ｐ２００９−５０２１７４Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４１６７（Ｐ２００８−５２４１６７）
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４３０５
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０８０２７４３１）ユニバーシティ オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＤＥＮＴＩＳＴＲＹ ＯＦ ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４３０５
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０８０２７４３１）ユニバーシティ オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＤＥＮＴＩＳＴＲＹ ＯＦ ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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