エンドトキシンの作用の緩和
本発明は、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などの病原菌による感染の作用を治療するための経口組成物の製造における肉抽出物及びペプトンを個別に又は組み合わせて含む経口組成物の使用に関する。こうした作用には、腸上皮細胞の完全性障害及び下痢並びに他のＣＯＸ−２媒介作用が含まれていることがある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用を緩和するための栄養手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物の胃腸管は、とりわけ、老化、ウィルス、細菌及び／又はそれらの毒素或いは暴行及び薬物乱用が原因のものを含む、様々な障害を生じるリスクがある。
【０００３】
様々な胃腸障害の徴候を軽減し得るいくつかの要因又は治療法がある。とりわけ、微生物叢として知られている常在フローラは、腸の環境の調節において重要な役割を果たす。微生物から放出された又は食品成分として食事と一緒に摂取された前生物的分子と共にプロバイオティックスとして知られている腸に住んでいる非病原性微生物は、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を含む胃腸障害を予防又は治療する潜在的な手段を与える。
【０００４】
ヒト腸内細菌は、腸内におけるＣ．ディフィシレ毒素Ａの産生を調節し、毒素Ａは、従来のマウスよりも無菌マウスから単離した腸膜により結合することが実証されており、これは、常在微生物がＣ．ディフィシレの病原性に重要な役割を果たすことを示している。Ｃ．ディフィシレ誘導大腸炎及び下痢を治療するための栄養手法を試験した臨床研究の結果、乳酸菌ＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＧ）が入院している成人又は乳児における大腸炎の徴候を改善することが示されている。同じ方法で、非病原性酵母菌サッカロミセスボウラディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）は、成人又は乳児におけるＣ．ディフィシレ誘導大腸炎及び下痢の予防又は治療に明白な効果があることが示されている。さらに、ロシア特許ＲＵ２１６８９１５号は、子供及び病弱な人々における胃腸障害に対する治療又は予防食品として、所定の割合で牛肉、豚肉、湯通しした牛のレバー、カボチャ又はペポカボチャ、及びバターを含む肉製品の使用を開示している。上記のすべての報告は、Ｃ．ディフィシレ感染に対する栄養介入の分野が依然として開かれていることを示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用を治療するためのペプトン及び／又は肉抽出物を含む経口組成物の使用に関する。こうした作用には、アクチンフィラメントの分解による腸管上皮の完全性障害及びその結果として生じる密着帯の破壊、並びに腸液の毒素誘導分泌の結果として生じる下痢及びシクロオキシゲナーゼ誘導によって媒介された他のプロセスがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本出願では、「経口組成物」は、任意の摂取可能な組成物を表すものであり、栄養組成物、栄養補助食品、又は医薬品であってよい。これは、例えば、薬物療法のアジュバントであってもよい。これは、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用に苦しんでいる乳児又は早産児から高齢者までのヒトに使用するものである。これはまた、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用に苦しんでいる猫、犬、魚、ウサギ、ネズミ、ハムスターなどのペット、より一般に、馬、牛、ニワトリ、羊など人間によって飼育されている任意の動物を対象としている。
【０００７】
「肉抽出物」という用語は、とりわけ、牛、豚、ラム、鶏及び／又は七面鳥など任意の肉の抽出物を包含するものである。これは、上記の肉の混合物由来であってもよい。いずれにしても、これは、少なくとも窒素、アミノ酸、及び炭素を供給することになる。本発明で使用するのに適した市販の肉抽出物の例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔである。
【０００８】
「酵母抽出物」という用語は、酵母自己消化物の水溶性部分を含んでいてよく、ビタミンＢ複合体を含むことが好ましい。これはまた、パン酵母自己消化物の可溶性及び不溶性部分の両方を含む抽出物を包含するものであり、この場合は、さらにリボフラビン及びパントテン酸を含むことが好ましい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態では、「酵母抽出物」は、微生物を包含せず、微生物によって産生された酵素を含まない。酵母抽出物は、サッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの抽出物であってよい。本発明で使用するのに適した市販の酵母抽出物の例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔである。
【０００９】
「ペプトン」という用語は、タンパク様物質の部分酵素又は酸加水分解によって得た生成物の任意の可溶性混合物を表す。タンパク質出発物質の選択は重要ではないが、カゼイン、乳清及び肉タンパク質が好ましい。ペプトンの分子量は、３ｋＤａ未満であることが好ましい。本発明で使用するのに適した市販のペプトンの例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅである。
【００１０】
エンテロトキシンは、腸粘膜に作用する細菌外毒素である。これらは、病原菌によって腸内に産生され得る。細菌エンテロトキシンは、粘膜及び全身の免疫反応の両方を活性化させる強力な粘膜イムノゲンであり、したがって食中毒、一般的な下痢、大腸炎、慢性炎症及び赤痢を含む様々な疾患の原因である。エンテロトキシンはまた、重篤な粘膜潰瘍、出血性炎症性滲出又は血性下痢を生じる。毒素誘導疾患は、しばしば腹部の痙攣及び直腸痛を伴う。エンテロトキシンは、体液分泌及び腸炎症の主要な刺激物質である。それらの上皮細胞への結合により、線維状アクチンの非分離及び密着帯の透過性の増大並びに細胞内経路及び後続の合成及び体液分泌活性化物質の放出の活性化が生じる。毒素はまた、感覚腸神経の活性化及び感覚神経ペプチドの放出、それに続くサイトカインの放出及び上皮細胞破壊を経て、通常粘膜中の好中球の遊出及び腸細胞壊死を特徴とする重篤な炎症を誘導する。
【００１１】
病原菌は、共生ミクロフローラの一部であってよく、即ち、例えば、抗生物質、特に広域抗生物質を用いた治療中に起こり得るようにミクロフローラのバランスが乱されない場合、及び乱されるまで悪影響なく腸内に存在し得る。このような場合には、これらの「日和見病原体」は、急速に増殖し、腸ミクロフローラの支配に及び、腸炎を引き起こす毒素を産生する可能性がある。こうした細菌の例には、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）があり、本発明の組成物は、こうした細菌によって産生された毒素の作用を治療するのに特によく適している。したがって、本発明は、院内感染の治療に使用するのに特に適していることが理解されよう。
【００１２】
他のエンテロトキシン産生細菌の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、鼠チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シンゲラエ（Ｓｈｉｎｇｅｌｌａｅ）、アエロモナスヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又は毒素原性バクテロイデスフラジリス（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＥＴＢＦ））である。
【００１３】
クロストリジウムディフィシレ感染は、抗生物質の摂取によって腸の微生物叢が変化した入院患者の大腸炎及び下痢の主な原因である。Ｃ．ディフィシレは、２種類のエンテロトキシン：毒素Ａ及び毒素Ｂを放出することによって腸炎を引き起こす。どちらの毒素もヒトに対して強力な細胞毒性をもつが、毒素Ａが体液分泌（したがって下痢）及び腸の炎症の主要な刺激物質である。毒素Ａは、上皮細胞の表面に結合し、被覆小窩で細胞質中に内部移行する。内部移行は、アクチン張力繊維の分解、アクチン関連付着板の破壊、密着帯の開口、細胞剥離及び体液分泌の増大をもたらす。これらの作用は、培養ヒト上皮細胞系、例えばＴ８４結腸細胞系でｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されており、この場合、単層への毒素Ａの添加により経上皮抵抗が減少し、単層の透過性が増大した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣ．ディフィシレエンテロトキシンは、モルモット、ウサギ又はラットの回腸を毒素Ａに曝露した場合、粘膜中の好中球の遊出及び腸細胞壊死を特徴とする重篤な炎症を誘導することがわかっている。この急性炎症反応をもたらすメカニズムは、感覚腸神経の活性化及び感覚神経ペプチドの放出であると思われる。最近の研究は、毒素Ａが腸内のＣＯＸ−２の発現を上向き調節することも提案した。
【００１４】
胃腸の病原体が原因の障害の最も一般的な結果は下痢である。下痢は、病原菌（エンテロトキシン産生細菌を含む）、寄生虫又はウィルスによって誘導され得る腸内の上皮細胞からの分泌が増大した結果である。
【００１５】
ＣＯＸ−２は、アラキドン酸からのプロスタグランジンの合成を触媒する酵素である。ＣＯＸ−２の知られている他の基質には、それぞれＰＧＥ１及びＰＧＥ３を産生するジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ：６）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）がある。ヒトＣＯＸ−２遺伝子はクローン化されており、そのゲノムパターン並びにそのｃＡＭＰ、ＮＦ−κＢ及びＴＧＦ−β、ＩＬ−１又はＴＮＦ−αなど異なる成分への遺伝子発現の応答性が説明されている。
【００１６】
ＣＯＸ−２は、アレルギー反応及び腸の炎症を含む多くの炎症に関連している。腸の炎症及び障害の中で、ＣＯＸ−２活性が関与しているのは、胃炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、又は腸癌である。
【００１７】
ペプトンは、体積で０．３〜７％のペプトンを含む経口組成物の形で投与することが好ましい。ペプトンの適当な供給源には乳清タンパク質があり、平均ペプチドサイズが５アミノ酸以下の高度に加水分解した乳清タンパク質が特に好ましいが、加水分解の程度が１５〜２０％の乳清タンパク質も使用することができる。肉タンパク質はペプトンの代替供給源であり、肉タンパク質の中では牛肉タンパク質が好ましい。肉抽出物を、好ましくは０．３〜７．０体積％の量で加えてもよい。好ましい実施形態では、経口組成物は、（体積で）１％の肉抽出物及び１％のペプトンを含む。さらに、この組成物は、好ましくは０．０１〜５体積％の濃度で酵母抽出物を含んでいてよい。
【００１８】
本発明の経口組成物は、様々な異なる食品の形態を取ることができる。例えば、標的集団が乳児集団の場合、乳児用調製粉乳であってよい。これは、スープなどの脱水食品であってもよい。これは、さらに経腸組成物又は栄養補助剤であってよい。腸の障害に苦しんでいる個体がペットの場合、経口組成物は、任意のウェット又はドライペットフードであってもよい。
【００１９】
本発明による組成物を医薬品に混合する場合、任意の適切な賦形剤と一緒に混合して任意の医薬形態にすることができる。
【００２０】
ペプトンと一緒に又はペプトンを含まずに肉抽出物を、或いは単独でペプトンを摂取することによって、腸管上皮の完全性障害及び下痢などの腸の障害からも明らかなように病原体による感染に苦しんでいる個体は、同じ障害をもつが、肉抽出物もペプトンも補充していない食餌を取っている個体と比較して、体液分泌が正常化し、細胞構造がより損傷を受けず、且つ炎症が低減することを発見した。
【００２１】
本発明の枠内では、腸の不調、損傷及びストレスを受けた個体の腸の完全性に対して改善された効果が得られるように、肉抽出物及び／又はペプトンは酵母抽出物を伴っていてもよい。
【実施例】
【００２２】
以下の実施例は、本発明の範囲に含まれる製品の一部及びそれらを作製する方法を例示したものである。それらは、決して本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明に関して修正及び変更を行うことができる。即ち、当業者は、種々の応用のために本発明の化合物の天然に存在するレベルを合理的に調整するため、これらの実施例中の多くの変形形態が広範な処方、成分、処理、混合物を含むことを認識するはずである。
【００２３】
（実施例１）
密着帯及びアクチンフィラメントへの組成物の作用
原料と方法
ヒト結腸細胞系Ｔ８４（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４８）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭグルタミン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１中で培養した。ヒト初代皮膚線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００２４】
Ｔ８４単層を０．５×１０６細胞／インサートで６穴インサートプレートに播種し、３週間培養した。ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）の基底値を測定し、培地を、ｄｅ Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ増殖培地（以下「ＭＲＳ」と呼ぶ、１％牛肉抽出物、１％肉ペプトン及び０．５％酵母抽出物をＰＢＳ中に含む溶液）の２０％溶液と交換した。３７℃で１ｈ後、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で単層の先端側に加え、３７℃で１、２、４、６及び２４ｈ後にＴＥＥＲをさらに測定した。対照の単層は培地にだけ曝露した。各条件で三通りのインサートを用いた。各時点で、１ｍｌの先端及び１ｍｌの基底外側の培地を捕集し、製造業者の使用説明書に従って細胞毒性検出キットを用いてＬＤＨ放出を測定することによって細胞生存度を評価した。
【００２５】
Ｔ８４細胞又はヒト初代線維芽細胞（２×１０５／チャンバー）を４チャンバースライドガラスに播種し、前述のように増殖させ、２０％ＭＲＳ溶液で１ｈインキュベートしてから毒素Ａを最終濃度５００ｎｇ／ｍｌで加えた。６ｈ後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、アセトンを用いて−２０℃で５分間透過化処理し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で処理して非特異的標識を低減させた。アクチン非分離及び細胞の球体化を、２００Ｕ／ｍｌローダミン標識ファロトキシンで標識付けした後蛍光顕微鏡によって評価した。
【００２６】
結果
毒素Ａは、上皮細胞の密着帯に影響し、それは上皮単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の低下によって測定される作用である。ＭＲＳが毒素Ａの病原性を相殺できるかどうか評価するために、Ｔ８４単層を組成物の存在下又は不在下で毒素Ａに曝露し、ＴＥＥＲを測定した。１００ｎｇ／ｍｌの毒素ＡをＴ８４単層に加えた結果、６ｈのインキュベーション後にＴＥＥＲ対照値が３分の１に低下した（３０９±８対９８５±４９Ωｃｍ２）。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと一緒に加えることにより、ＴＥＥＲ低下が抑制された（１４０３±９５対３０９±８Ωｃｍ２）が、Ｔ８４細胞の基底ＴＥＥＲ値は変化しなかった（１２１７±２７７Ωｃｍ２対９８５±４９Ωｃｍ２）。細胞生存度の改変は観察されず、毒素Ａが６ｈの期間中に細胞死を誘導しないことが示唆された。上記の結果は、ペプトン、肉抽出物及び酵母抽出物の混合物によって毒素Ａが相殺され、Ｔ８４単層の毒素Ａ誘導ＴＥＥＲ低下が妨げられ得ることを実証している。
【００２７】
毒素Ａ誘導ＴＥＥＲ低下に対するＭＲＳの保護作用が細胞の球体化をもたらす細胞骨格の変化と相関関係にあったかどうかを明らかにするために、Ｔ８４細胞を毒素Ａ単独で又は２０％ＭＲＳ溶液と併せて処理し、細胞骨格アクチンを免疫細胞化学によって分析した。５００ｎｇ／ｍｌの毒素Ａを加えることによってＴ８４細胞の球体化が誘導され、それは、アクチン非分離、及びパッケージングにより細胞単層が蜂の巣形を示すことによって証明されている。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと併せて加えることにより、毒素Ａによって誘導されるアクチン非分離とその後の細胞の球体化が一部妨げられるが、単独で加えた場合、細胞の細胞骨格に影響を及ぼさなかった。これらの作用は、Ｔ８４単層の空間配置によってほとんど見えなかった。判断をより容易にするために、平面単層を形成する初代ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験を繰り返した。毒素Ａの存在下で６ｈ後に、すべての線維芽細胞が、完全な細胞骨格の破壊を示唆する球状の外観を示した。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと併せて加えることにより、アクチン非分離及び細胞の球体化が一部妨げられた。毒素Ａと２０％の組成物で処理した線維芽細胞の形状は似ていたが、対照線維芽細胞又は組合せ単独で処理した線維芽細胞の形状とは同一ではなかった。したがって、ＭＲＳは、アクチン非分離による細胞骨格変化とその後の細胞の球体化を一部妨げて毒素Ａを相殺することができる。
【００２８】
次いで、２０％ＭＲＳ溶液の代わりに以下のものを使用してこれらの実験を繰り返した。
１％牛肉ペプトン溶液の２０％溶液
１％牛肉抽出物溶液の２０％溶液
０．５％酵母抽出物溶液の２０％溶液
１％の高度に加水分解した乳清ペプチド（平均ペプチドサイズ約５アミノ酸未満）を含む溶液
１０％の高度に加水分解した乳清ペプチド（平均ペプチドサイズ５アミノ酸以下）を含む溶液
【００２９】
２０％ＭＲＳ溶液と同様の結果が得られた。
【００３０】
考察
ここで観察された保護作用のメカニズムははっきりと解明されておらず、おそらく多種多様である。毒素Ａは、アクチンフィラメントの重合を誘導し、細胞骨格アクチンの非分離をもたらす。アクチン破壊は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察される細胞の球体化、及び密着帯の透過性の増大の原因である。アクチンに対する毒素Ａの作用は、タンパク質のＲｈｏファミリーに対するそのグルコトランスフェラーゼ活性によるものである。毒素Ａは、グルコシル残基をＵＤＰグルコースからＲｈｏ、Ｒａｃ及びＣｄｃ−４２のスレオニン３７へ酵素的に転移させることができ、アクチン張力繊維の分解、アクチン関連付着板の破壊、密着帯の開口、細胞剥離及び体液分泌の増大をもたらす。それらの作用は、Ｔ８４細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されており、この場合、単層への毒素Ａの添加により、上皮細胞中のＲｈｏタンパク質の改変が原因で経上皮抵抗が減少し、単層の透過性が増大した。したがって、我々は、ペプトン、酵母抽出物、及び牛肉抽出物が、Ｒｈｏタンパク質のシグナル伝達経路に干渉し、毒素Ａの作用を阻害すると考える。特定の理論に拘泥するものではないが、この干渉は、グルコシル残基のＲｈｏタンパク質への転移の上流又は下流であってよい。
【００３１】
（実施例２）
エンテロトキシンを産生する胃腸病原体が原因の損傷に対する組成物の作用
原料と方法
６週齢の雄マウスを、腸の微生物叢を排除するために６０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、２５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン、３００ｍｇ／Ｌアモキシシリン及び１０ｍｇ／Ｌアンホテリシンで１週間適宜処理した。次いでマウスを３つのグループ：ｉ）対照グループ；ｉｉ）適宜２０％ＭＲＳ溶液を溶かした飲料水を１週間与えたグループ；及びｉｉｉ）２日おきに組成物５００μｌを２回胃管栄養によって与えたグループに分けた。処理が終了した次の日、３０ｍｇ／ｋｇ体重のナトリウムペントバルビタールで動物に麻酔をかけ、手術の全所要時間にわたって０．８〜３％イソフルオラン麻酔下で暖かい毛布（３７℃）の上に置いた。腹部を正中切開によって開き、空腸の末端を露出させた。５ｃｍの空腸セグメント２個の各末端を手術糸で２重に結紮させて、それらの間に２ｃｍの間隔がある腸ループを２個形成した。一方のループには、対照としてＰＢＳ ６００μｌを注射し、もう一方には、毒素Ａを２０μｇ含有するＰＢＳ ６００μｌを注射した。次いで腸ループを腹腔に戻し、切開部を縫合して閉じた。マウスを回復させ、継続的に経過を観察した。動物を４ｈ後に安楽死させ、ループを単離し、それらの質量対長さ比（ｍｇ／ｃｍで）を記録して体液分泌を評価した。次いでループを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）中に浸し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
【００３２】
結果
下痢及び大腸炎をもたらすＣ．ディフィシレ感染は、病院及び高齢者宅でほとんど発生して抗生物質を摂取している患者を襲い、それによって彼らの腸の微生物叢が変化する。本発明の組成物及びその成分がｉｎ ｖｉｖｏで毒素Ａの作用を相殺できるかどうかを評価するために、マウスモデルを使用した。ヒトのＣ．ディフィシレ感染を誘発する条件を模倣するために、マウスを、それらの腸の微生物叢を変化させることを目的とした抗生物質で１週間処理した。抗生物質処理が終了した次の日、あるグループのマウスに適宜２０％ＭＲＳ溶液を１週間与えた。この期間の終了時、腸ループを形成し、ＰＢＳ又は毒素Ａ ２０μｇを注射した。４ｈのインキュベーション後、対照マウス由来のループは、毒素Ａを注射した場合にＰＢＳ注射ループと比較して体液分泌の増大を示した（１２１．９±３１．７対６４．６±１３．５ｍｇ／ｃｍ）。対照的に、１週間ＭＲＳを与えられたマウスでは、毒素Ａ又はＰＢＳを注射したループにおいて体液分泌の違いは観察されなかった（７３．６±８．３対６６．８±１０．８ｍｇ／ｃｍ）。マウスに２回投与で２０％ＭＲＳ溶液５００μｌを胃管栄養によって与えた場合、類似の結果が得られた。これらの結果は、ペプトン、肉抽出物及び酵母抽出物を用いた処理が、腸の微生物叢の欠陥を示している対象において毒素Ａの悪影響を抑制できることを示している。
【００３３】
組成物が毒素Ａの直接的な不活性化によってその保護作用を発揮するかどうかを確認するために、２０％ＭＲＳ溶液、又は対照としてのＰＢＳを毒素Ａと１ｈ混合してから、この混合物を１週間抗生物質で処理したマウスの腸ループに注射した。対照（ＰＢＳ）とＭＲＳ注射ループの間に毒素Ａ誘導体液分泌のレベルで有意差は記録されなかった。この結果は、組成物が直接的な結合及び毒素の不活性化によって毒素Ａの作用を相殺せず、そのため毒素結合エピトープの毒素切断又はマスキングがもたらされ得ることを示唆している。
【００３４】
考察
ＭＲＳ組成物は、毒素Ａによって誘導される腸液分泌からマウスを保護した。特定の理論に拘泥するものではないが、我々は、毒素Ａを切断するペプトン、牛肉抽出物及び酵母抽出物の保護作用が、２つの主な理由で酵素活性によるものではないと考える：ｉ）使用した溶液は常に、溶液中に含まれるプロテアーゼなど任意の酵素の非活性化をもたらすオートクレーブにかけており、ｉｉ）マウスの腸ループに注射する前に毒素Ａと一緒に混合及びインキュベートした組成物は、腸液分泌を阻害できなかった。したがって、ペプトン、酵母抽出物及び牛肉抽出物の保護活性は、腸上皮細胞上の毒素Ａ受容体に結合し、毒素Ａの結合及び関与しているシグナル伝達経路の活性化を妨げ得る溶液中の自由分子（例えばアミノ酸又はペプチド）の存在によるものであると我々は考える。
【００３５】
（実施例３）
ＣＯＸ−２発現に対する組成物の作用
原料と方法
実施例２に記載されているものと同じ手順を使用した。ＲＮＡをマウス腸ループから抽出し、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（登録商標）酵素２００Ｕを用いて全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した。５’−ＣＡＣＡＧＴＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣ−３’をセンス、５’−ＴＣＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧ−３’をアンチセンスプライマーとして用いてＰＣＲによってマウスＣＯＸ−２の４００ｂｐ断片を増幅した。５’−ＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＡＧＧＴ−３’をセンス、５’−ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴ−３’をアンチセンスプライマーとして用いて同じＲＴミックスから内部標準として用いたβ−アクチンの７００ｂｐ断片を増幅した。ＤＮＡ混入を排除するために、ＲＮＡ試料にＰＣＲを直接行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに添加し、撮影し、写真をバンド強度の定量化による濃度測定に使用した。内部標準β−アクチンの発現に対して標準化を行った：ＣＯＸ−２と対応するβ−アクチンのｍＲＮＡシグナルの比を決定し、任意スコア１を割り当てた「無処理試料」（水を与えてＰＢＳを注射した）のものを基準として示した。
【００３６】
結果
毒素Ａ媒介体液分泌に関与していることが知られているＣＯＸ−２が組成物の保護作用にも関係しているかどうかを明らかにするために、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。異なる処理によるＣＯＸ−２発現の変化を、β−アクチンを基準として示した。対照マウスの腸ループ中に毒素Ａを２０μｇ注射した結果、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現が３．６倍増大した。マウスを組成物で１週間処理した結果、毒素Ａによって媒介されたＣＯＸ−２増大が２分の１に低下した。毒素Ａによって誘導された腸のＣＯＸ−２発現は、ペプトン又は牛肉抽出物処理下ではマウスの基底レベルに完全に標準化されたが、酵母抽出物処理下では２．３分の１に低減した。組成物もその成分もＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現の基底レベルを著しく改変していない。胃管栄養によって投与した場合、組成物又はその成分は、毒素Ａによって誘導されたＣＯＸ−２ ｍＲＮＡの増大を相殺することも可能であった。
【００３７】
考察
毒素Ａが上皮細胞上に結合するとき、好中球遊走及び腸細胞壊死及び柔突起の破壊を含む炎症を誘導することがわかっている。これらの作用は、基質Ｐ及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドなどの感覚神経ペプチドの放出によって媒介され、その後感覚腸神経が活性化される。さらに、腸上皮におけるＳＰの受容体であるＮＫ−１Ｒの発現は、Ｃ．ディフィシレに感染した動物とヒトの両方で著しく増大する。最近の研究では、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａが腸内のＣＯＸ−２の発現を上向き調節することも提案されている。ＣＯＸ−２は、腸液分泌を増大させ、下痢を生じさせることで知られている薬剤であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の合成を媒介するシクロオキシゲナーゼ酵素の誘導アイソフォームである。特定の理論に拘泥するものではないが、我々は、ペプトン、酵母抽出物及び牛肉抽出物がこれらの経路のいずれかを阻害し毒素Ａを相殺すると考える。我々の結果は、ペプトン、酵母抽出物又は牛肉抽出物が、腸の毒素媒介ＣＯＸ−２誘導を阻害することを示唆している。これは、我々の溶液がその腸受容体への毒素の結合を阻害又は低減する場合にＣＯＸ−２活性化をもたらす毒素Ａ媒介シグナル伝達の阻害による可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用を緩和するための栄養手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物の胃腸管は、とりわけ、老化、ウィルス、細菌及び／又はそれらの毒素或いは暴行及び薬物乱用が原因のものを含む、様々な障害を生じるリスクがある。
【０００３】
様々な胃腸障害の徴候を軽減し得るいくつかの要因又は治療法がある。とりわけ、微生物叢として知られている常在フローラは、腸の環境の調節において重要な役割を果たす。微生物から放出された又は食品成分として食事と一緒に摂取された前生物的分子と共にプロバイオティックスとして知られている腸に住んでいる非病原性微生物は、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を含む胃腸障害を予防又は治療する潜在的な手段を与える。
【０００４】
ヒト腸内細菌は、腸内におけるＣ．ディフィシレ毒素Ａの産生を調節し、毒素Ａは、従来のマウスよりも無菌マウスから単離した腸膜により結合することが実証されており、これは、常在微生物がＣ．ディフィシレの病原性に重要な役割を果たすことを示している。Ｃ．ディフィシレ誘導大腸炎及び下痢を治療するための栄養手法を試験した臨床研究の結果、乳酸菌ＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＧ）が入院している成人又は乳児における大腸炎の徴候を改善することが示されている。同じ方法で、非病原性酵母菌サッカロミセスボウラディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）は、成人又は乳児におけるＣ．ディフィシレ誘導大腸炎及び下痢の予防又は治療に明白な効果があることが示されている。さらに、ロシア特許ＲＵ２１６８９１５号は、子供及び病弱な人々における胃腸障害に対する治療又は予防食品として、所定の割合で牛肉、豚肉、湯通しした牛のレバー、カボチャ又はペポカボチャ、及びバターを含む肉製品の使用を開示している。上記のすべての報告は、Ｃ．ディフィシレ感染に対する栄養介入の分野が依然として開かれていることを示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用を治療するためのペプトン及び／又は肉抽出物を含む経口組成物の使用に関する。こうした作用には、アクチンフィラメントの分解による腸管上皮の完全性障害及びその結果として生じる密着帯の破壊、並びに腸液の毒素誘導分泌の結果として生じる下痢及びシクロオキシゲナーゼ誘導によって媒介された他のプロセスがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本出願では、「経口組成物」は、任意の摂取可能な組成物を表すものであり、栄養組成物、栄養補助食品、又は医薬品であってよい。これは、例えば、薬物療法のアジュバントであってもよい。これは、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用に苦しんでいる乳児又は早産児から高齢者までのヒトに使用するものである。これはまた、病原体による感染の結果として生じるエンテロトキシンの作用に苦しんでいる猫、犬、魚、ウサギ、ネズミ、ハムスターなどのペット、より一般に、馬、牛、ニワトリ、羊など人間によって飼育されている任意の動物を対象としている。
【０００７】
「肉抽出物」という用語は、とりわけ、牛、豚、ラム、鶏及び／又は七面鳥など任意の肉の抽出物を包含するものである。これは、上記の肉の混合物由来であってもよい。いずれにしても、これは、少なくとも窒素、アミノ酸、及び炭素を供給することになる。本発明で使用するのに適した市販の肉抽出物の例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔである。
【０００８】
「酵母抽出物」という用語は、酵母自己消化物の水溶性部分を含んでいてよく、ビタミンＢ複合体を含むことが好ましい。これはまた、パン酵母自己消化物の可溶性及び不溶性部分の両方を含む抽出物を包含するものであり、この場合は、さらにリボフラビン及びパントテン酸を含むことが好ましい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態では、「酵母抽出物」は、微生物を包含せず、微生物によって産生された酵素を含まない。酵母抽出物は、サッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの抽出物であってよい。本発明で使用するのに適した市販の酵母抽出物の例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔである。
【０００９】
「ペプトン」という用語は、タンパク様物質の部分酵素又は酸加水分解によって得た生成物の任意の可溶性混合物を表す。タンパク質出発物質の選択は重要ではないが、カゼイン、乳清及び肉タンパク質が好ましい。ペプトンの分子量は、３ｋＤａ未満であることが好ましい。本発明で使用するのに適した市販のペプトンの例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社によって供給されているＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅである。
【００１０】
エンテロトキシンは、腸粘膜に作用する細菌外毒素である。これらは、病原菌によって腸内に産生され得る。細菌エンテロトキシンは、粘膜及び全身の免疫反応の両方を活性化させる強力な粘膜イムノゲンであり、したがって食中毒、一般的な下痢、大腸炎、慢性炎症及び赤痢を含む様々な疾患の原因である。エンテロトキシンはまた、重篤な粘膜潰瘍、出血性炎症性滲出又は血性下痢を生じる。毒素誘導疾患は、しばしば腹部の痙攣及び直腸痛を伴う。エンテロトキシンは、体液分泌及び腸炎症の主要な刺激物質である。それらの上皮細胞への結合により、線維状アクチンの非分離及び密着帯の透過性の増大並びに細胞内経路及び後続の合成及び体液分泌活性化物質の放出の活性化が生じる。毒素はまた、感覚腸神経の活性化及び感覚神経ペプチドの放出、それに続くサイトカインの放出及び上皮細胞破壊を経て、通常粘膜中の好中球の遊出及び腸細胞壊死を特徴とする重篤な炎症を誘導する。
【００１１】
病原菌は、共生ミクロフローラの一部であってよく、即ち、例えば、抗生物質、特に広域抗生物質を用いた治療中に起こり得るようにミクロフローラのバランスが乱されない場合、及び乱されるまで悪影響なく腸内に存在し得る。このような場合には、これらの「日和見病原体」は、急速に増殖し、腸ミクロフローラの支配に及び、腸炎を引き起こす毒素を産生する可能性がある。こうした細菌の例には、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）があり、本発明の組成物は、こうした細菌によって産生された毒素の作用を治療するのに特によく適している。したがって、本発明は、院内感染の治療に使用するのに特に適していることが理解されよう。
【００１２】
他のエンテロトキシン産生細菌の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、鼠チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シンゲラエ（Ｓｈｉｎｇｅｌｌａｅ）、アエロモナスヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又は毒素原性バクテロイデスフラジリス（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＥＴＢＦ））である。
【００１３】
クロストリジウムディフィシレ感染は、抗生物質の摂取によって腸の微生物叢が変化した入院患者の大腸炎及び下痢の主な原因である。Ｃ．ディフィシレは、２種類のエンテロトキシン：毒素Ａ及び毒素Ｂを放出することによって腸炎を引き起こす。どちらの毒素もヒトに対して強力な細胞毒性をもつが、毒素Ａが体液分泌（したがって下痢）及び腸の炎症の主要な刺激物質である。毒素Ａは、上皮細胞の表面に結合し、被覆小窩で細胞質中に内部移行する。内部移行は、アクチン張力繊維の分解、アクチン関連付着板の破壊、密着帯の開口、細胞剥離及び体液分泌の増大をもたらす。これらの作用は、培養ヒト上皮細胞系、例えばＴ８４結腸細胞系でｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されており、この場合、単層への毒素Ａの添加により経上皮抵抗が減少し、単層の透過性が増大した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣ．ディフィシレエンテロトキシンは、モルモット、ウサギ又はラットの回腸を毒素Ａに曝露した場合、粘膜中の好中球の遊出及び腸細胞壊死を特徴とする重篤な炎症を誘導することがわかっている。この急性炎症反応をもたらすメカニズムは、感覚腸神経の活性化及び感覚神経ペプチドの放出であると思われる。最近の研究は、毒素Ａが腸内のＣＯＸ−２の発現を上向き調節することも提案した。
【００１４】
胃腸の病原体が原因の障害の最も一般的な結果は下痢である。下痢は、病原菌（エンテロトキシン産生細菌を含む）、寄生虫又はウィルスによって誘導され得る腸内の上皮細胞からの分泌が増大した結果である。
【００１５】
ＣＯＸ−２は、アラキドン酸からのプロスタグランジンの合成を触媒する酵素である。ＣＯＸ−２の知られている他の基質には、それぞれＰＧＥ１及びＰＧＥ３を産生するジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ：６）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）がある。ヒトＣＯＸ−２遺伝子はクローン化されており、そのゲノムパターン並びにそのｃＡＭＰ、ＮＦ−κＢ及びＴＧＦ−β、ＩＬ−１又はＴＮＦ−αなど異なる成分への遺伝子発現の応答性が説明されている。
【００１６】
ＣＯＸ−２は、アレルギー反応及び腸の炎症を含む多くの炎症に関連している。腸の炎症及び障害の中で、ＣＯＸ−２活性が関与しているのは、胃炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、又は腸癌である。
【００１７】
ペプトンは、体積で０．３〜７％のペプトンを含む経口組成物の形で投与することが好ましい。ペプトンの適当な供給源には乳清タンパク質があり、平均ペプチドサイズが５アミノ酸以下の高度に加水分解した乳清タンパク質が特に好ましいが、加水分解の程度が１５〜２０％の乳清タンパク質も使用することができる。肉タンパク質はペプトンの代替供給源であり、肉タンパク質の中では牛肉タンパク質が好ましい。肉抽出物を、好ましくは０．３〜７．０体積％の量で加えてもよい。好ましい実施形態では、経口組成物は、（体積で）１％の肉抽出物及び１％のペプトンを含む。さらに、この組成物は、好ましくは０．０１〜５体積％の濃度で酵母抽出物を含んでいてよい。
【００１８】
本発明の経口組成物は、様々な異なる食品の形態を取ることができる。例えば、標的集団が乳児集団の場合、乳児用調製粉乳であってよい。これは、スープなどの脱水食品であってもよい。これは、さらに経腸組成物又は栄養補助剤であってよい。腸の障害に苦しんでいる個体がペットの場合、経口組成物は、任意のウェット又はドライペットフードであってもよい。
【００１９】
本発明による組成物を医薬品に混合する場合、任意の適切な賦形剤と一緒に混合して任意の医薬形態にすることができる。
【００２０】
ペプトンと一緒に又はペプトンを含まずに肉抽出物を、或いは単独でペプトンを摂取することによって、腸管上皮の完全性障害及び下痢などの腸の障害からも明らかなように病原体による感染に苦しんでいる個体は、同じ障害をもつが、肉抽出物もペプトンも補充していない食餌を取っている個体と比較して、体液分泌が正常化し、細胞構造がより損傷を受けず、且つ炎症が低減することを発見した。
【００２１】
本発明の枠内では、腸の不調、損傷及びストレスを受けた個体の腸の完全性に対して改善された効果が得られるように、肉抽出物及び／又はペプトンは酵母抽出物を伴っていてもよい。
【実施例】
【００２２】
以下の実施例は、本発明の範囲に含まれる製品の一部及びそれらを作製する方法を例示したものである。それらは、決して本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明に関して修正及び変更を行うことができる。即ち、当業者は、種々の応用のために本発明の化合物の天然に存在するレベルを合理的に調整するため、これらの実施例中の多くの変形形態が広範な処方、成分、処理、混合物を含むことを認識するはずである。
【００２３】
（実施例１）
密着帯及びアクチンフィラメントへの組成物の作用
原料と方法
ヒト結腸細胞系Ｔ８４（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４８）を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭグルタミン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１中で培養した。ヒト初代皮膚線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００２４】
Ｔ８４単層を０．５×１０６細胞／インサートで６穴インサートプレートに播種し、３週間培養した。ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）の基底値を測定し、培地を、ｄｅ Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ増殖培地（以下「ＭＲＳ」と呼ぶ、１％牛肉抽出物、１％肉ペプトン及び０．５％酵母抽出物をＰＢＳ中に含む溶液）の２０％溶液と交換した。３７℃で１ｈ後、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で単層の先端側に加え、３７℃で１、２、４、６及び２４ｈ後にＴＥＥＲをさらに測定した。対照の単層は培地にだけ曝露した。各条件で三通りのインサートを用いた。各時点で、１ｍｌの先端及び１ｍｌの基底外側の培地を捕集し、製造業者の使用説明書に従って細胞毒性検出キットを用いてＬＤＨ放出を測定することによって細胞生存度を評価した。
【００２５】
Ｔ８４細胞又はヒト初代線維芽細胞（２×１０５／チャンバー）を４チャンバースライドガラスに播種し、前述のように増殖させ、２０％ＭＲＳ溶液で１ｈインキュベートしてから毒素Ａを最終濃度５００ｎｇ／ｍｌで加えた。６ｈ後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、アセトンを用いて−２０℃で５分間透過化処理し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で処理して非特異的標識を低減させた。アクチン非分離及び細胞の球体化を、２００Ｕ／ｍｌローダミン標識ファロトキシンで標識付けした後蛍光顕微鏡によって評価した。
【００２６】
結果
毒素Ａは、上皮細胞の密着帯に影響し、それは上皮単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の低下によって測定される作用である。ＭＲＳが毒素Ａの病原性を相殺できるかどうか評価するために、Ｔ８４単層を組成物の存在下又は不在下で毒素Ａに曝露し、ＴＥＥＲを測定した。１００ｎｇ／ｍｌの毒素ＡをＴ８４単層に加えた結果、６ｈのインキュベーション後にＴＥＥＲ対照値が３分の１に低下した（３０９±８対９８５±４９Ωｃｍ２）。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと一緒に加えることにより、ＴＥＥＲ低下が抑制された（１４０３±９５対３０９±８Ωｃｍ２）が、Ｔ８４細胞の基底ＴＥＥＲ値は変化しなかった（１２１７±２７７Ωｃｍ２対９８５±４９Ωｃｍ２）。細胞生存度の改変は観察されず、毒素Ａが６ｈの期間中に細胞死を誘導しないことが示唆された。上記の結果は、ペプトン、肉抽出物及び酵母抽出物の混合物によって毒素Ａが相殺され、Ｔ８４単層の毒素Ａ誘導ＴＥＥＲ低下が妨げられ得ることを実証している。
【００２７】
毒素Ａ誘導ＴＥＥＲ低下に対するＭＲＳの保護作用が細胞の球体化をもたらす細胞骨格の変化と相関関係にあったかどうかを明らかにするために、Ｔ８４細胞を毒素Ａ単独で又は２０％ＭＲＳ溶液と併せて処理し、細胞骨格アクチンを免疫細胞化学によって分析した。５００ｎｇ／ｍｌの毒素Ａを加えることによってＴ８４細胞の球体化が誘導され、それは、アクチン非分離、及びパッケージングにより細胞単層が蜂の巣形を示すことによって証明されている。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと併せて加えることにより、毒素Ａによって誘導されるアクチン非分離とその後の細胞の球体化が一部妨げられるが、単独で加えた場合、細胞の細胞骨格に影響を及ぼさなかった。これらの作用は、Ｔ８４単層の空間配置によってほとんど見えなかった。判断をより容易にするために、平面単層を形成する初代ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験を繰り返した。毒素Ａの存在下で６ｈ後に、すべての線維芽細胞が、完全な細胞骨格の破壊を示唆する球状の外観を示した。２０％ＭＲＳ溶液を毒素Ａと併せて加えることにより、アクチン非分離及び細胞の球体化が一部妨げられた。毒素Ａと２０％の組成物で処理した線維芽細胞の形状は似ていたが、対照線維芽細胞又は組合せ単独で処理した線維芽細胞の形状とは同一ではなかった。したがって、ＭＲＳは、アクチン非分離による細胞骨格変化とその後の細胞の球体化を一部妨げて毒素Ａを相殺することができる。
【００２８】
次いで、２０％ＭＲＳ溶液の代わりに以下のものを使用してこれらの実験を繰り返した。
１％牛肉ペプトン溶液の２０％溶液
１％牛肉抽出物溶液の２０％溶液
０．５％酵母抽出物溶液の２０％溶液
１％の高度に加水分解した乳清ペプチド（平均ペプチドサイズ約５アミノ酸未満）を含む溶液
１０％の高度に加水分解した乳清ペプチド（平均ペプチドサイズ５アミノ酸以下）を含む溶液
【００２９】
２０％ＭＲＳ溶液と同様の結果が得られた。
【００３０】
考察
ここで観察された保護作用のメカニズムははっきりと解明されておらず、おそらく多種多様である。毒素Ａは、アクチンフィラメントの重合を誘導し、細胞骨格アクチンの非分離をもたらす。アクチン破壊は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察される細胞の球体化、及び密着帯の透過性の増大の原因である。アクチンに対する毒素Ａの作用は、タンパク質のＲｈｏファミリーに対するそのグルコトランスフェラーゼ活性によるものである。毒素Ａは、グルコシル残基をＵＤＰグルコースからＲｈｏ、Ｒａｃ及びＣｄｃ−４２のスレオニン３７へ酵素的に転移させることができ、アクチン張力繊維の分解、アクチン関連付着板の破壊、密着帯の開口、細胞剥離及び体液分泌の増大をもたらす。それらの作用は、Ｔ８４細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されており、この場合、単層への毒素Ａの添加により、上皮細胞中のＲｈｏタンパク質の改変が原因で経上皮抵抗が減少し、単層の透過性が増大した。したがって、我々は、ペプトン、酵母抽出物、及び牛肉抽出物が、Ｒｈｏタンパク質のシグナル伝達経路に干渉し、毒素Ａの作用を阻害すると考える。特定の理論に拘泥するものではないが、この干渉は、グルコシル残基のＲｈｏタンパク質への転移の上流又は下流であってよい。
【００３１】
（実施例２）
エンテロトキシンを産生する胃腸病原体が原因の損傷に対する組成物の作用
原料と方法
６週齢の雄マウスを、腸の微生物叢を排除するために６０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、２５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン、３００ｍｇ／Ｌアモキシシリン及び１０ｍｇ／Ｌアンホテリシンで１週間適宜処理した。次いでマウスを３つのグループ：ｉ）対照グループ；ｉｉ）適宜２０％ＭＲＳ溶液を溶かした飲料水を１週間与えたグループ；及びｉｉｉ）２日おきに組成物５００μｌを２回胃管栄養によって与えたグループに分けた。処理が終了した次の日、３０ｍｇ／ｋｇ体重のナトリウムペントバルビタールで動物に麻酔をかけ、手術の全所要時間にわたって０．８〜３％イソフルオラン麻酔下で暖かい毛布（３７℃）の上に置いた。腹部を正中切開によって開き、空腸の末端を露出させた。５ｃｍの空腸セグメント２個の各末端を手術糸で２重に結紮させて、それらの間に２ｃｍの間隔がある腸ループを２個形成した。一方のループには、対照としてＰＢＳ ６００μｌを注射し、もう一方には、毒素Ａを２０μｇ含有するＰＢＳ ６００μｌを注射した。次いで腸ループを腹腔に戻し、切開部を縫合して閉じた。マウスを回復させ、継続的に経過を観察した。動物を４ｈ後に安楽死させ、ループを単離し、それらの質量対長さ比（ｍｇ／ｃｍで）を記録して体液分泌を評価した。次いでループを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）中に浸し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
【００３２】
結果
下痢及び大腸炎をもたらすＣ．ディフィシレ感染は、病院及び高齢者宅でほとんど発生して抗生物質を摂取している患者を襲い、それによって彼らの腸の微生物叢が変化する。本発明の組成物及びその成分がｉｎ ｖｉｖｏで毒素Ａの作用を相殺できるかどうかを評価するために、マウスモデルを使用した。ヒトのＣ．ディフィシレ感染を誘発する条件を模倣するために、マウスを、それらの腸の微生物叢を変化させることを目的とした抗生物質で１週間処理した。抗生物質処理が終了した次の日、あるグループのマウスに適宜２０％ＭＲＳ溶液を１週間与えた。この期間の終了時、腸ループを形成し、ＰＢＳ又は毒素Ａ ２０μｇを注射した。４ｈのインキュベーション後、対照マウス由来のループは、毒素Ａを注射した場合にＰＢＳ注射ループと比較して体液分泌の増大を示した（１２１．９±３１．７対６４．６±１３．５ｍｇ／ｃｍ）。対照的に、１週間ＭＲＳを与えられたマウスでは、毒素Ａ又はＰＢＳを注射したループにおいて体液分泌の違いは観察されなかった（７３．６±８．３対６６．８±１０．８ｍｇ／ｃｍ）。マウスに２回投与で２０％ＭＲＳ溶液５００μｌを胃管栄養によって与えた場合、類似の結果が得られた。これらの結果は、ペプトン、肉抽出物及び酵母抽出物を用いた処理が、腸の微生物叢の欠陥を示している対象において毒素Ａの悪影響を抑制できることを示している。
【００３３】
組成物が毒素Ａの直接的な不活性化によってその保護作用を発揮するかどうかを確認するために、２０％ＭＲＳ溶液、又は対照としてのＰＢＳを毒素Ａと１ｈ混合してから、この混合物を１週間抗生物質で処理したマウスの腸ループに注射した。対照（ＰＢＳ）とＭＲＳ注射ループの間に毒素Ａ誘導体液分泌のレベルで有意差は記録されなかった。この結果は、組成物が直接的な結合及び毒素の不活性化によって毒素Ａの作用を相殺せず、そのため毒素結合エピトープの毒素切断又はマスキングがもたらされ得ることを示唆している。
【００３４】
考察
ＭＲＳ組成物は、毒素Ａによって誘導される腸液分泌からマウスを保護した。特定の理論に拘泥するものではないが、我々は、毒素Ａを切断するペプトン、牛肉抽出物及び酵母抽出物の保護作用が、２つの主な理由で酵素活性によるものではないと考える：ｉ）使用した溶液は常に、溶液中に含まれるプロテアーゼなど任意の酵素の非活性化をもたらすオートクレーブにかけており、ｉｉ）マウスの腸ループに注射する前に毒素Ａと一緒に混合及びインキュベートした組成物は、腸液分泌を阻害できなかった。したがって、ペプトン、酵母抽出物及び牛肉抽出物の保護活性は、腸上皮細胞上の毒素Ａ受容体に結合し、毒素Ａの結合及び関与しているシグナル伝達経路の活性化を妨げ得る溶液中の自由分子（例えばアミノ酸又はペプチド）の存在によるものであると我々は考える。
【００３５】
（実施例３）
ＣＯＸ−２発現に対する組成物の作用
原料と方法
実施例２に記載されているものと同じ手順を使用した。ＲＮＡをマウス腸ループから抽出し、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（登録商標）酵素２００Ｕを用いて全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した。５’−ＣＡＣＡＧＴＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣ−３’をセンス、５’−ＴＣＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧ−３’をアンチセンスプライマーとして用いてＰＣＲによってマウスＣＯＸ−２の４００ｂｐ断片を増幅した。５’−ＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＡＧＧＴ−３’をセンス、５’−ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴ−３’をアンチセンスプライマーとして用いて同じＲＴミックスから内部標準として用いたβ−アクチンの７００ｂｐ断片を増幅した。ＤＮＡ混入を排除するために、ＲＮＡ試料にＰＣＲを直接行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに添加し、撮影し、写真をバンド強度の定量化による濃度測定に使用した。内部標準β−アクチンの発現に対して標準化を行った：ＣＯＸ−２と対応するβ−アクチンのｍＲＮＡシグナルの比を決定し、任意スコア１を割り当てた「無処理試料」（水を与えてＰＢＳを注射した）のものを基準として示した。
【００３６】
結果
毒素Ａ媒介体液分泌に関与していることが知られているＣＯＸ−２が組成物の保護作用にも関係しているかどうかを明らかにするために、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。異なる処理によるＣＯＸ−２発現の変化を、β−アクチンを基準として示した。対照マウスの腸ループ中に毒素Ａを２０μｇ注射した結果、ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現が３．６倍増大した。マウスを組成物で１週間処理した結果、毒素Ａによって媒介されたＣＯＸ−２増大が２分の１に低下した。毒素Ａによって誘導された腸のＣＯＸ−２発現は、ペプトン又は牛肉抽出物処理下ではマウスの基底レベルに完全に標準化されたが、酵母抽出物処理下では２．３分の１に低減した。組成物もその成分もＣＯＸ−２ ｍＲＮＡ発現の基底レベルを著しく改変していない。胃管栄養によって投与した場合、組成物又はその成分は、毒素Ａによって誘導されたＣＯＸ−２ ｍＲＮＡの増大を相殺することも可能であった。
【００３７】
考察
毒素Ａが上皮細胞上に結合するとき、好中球遊走及び腸細胞壊死及び柔突起の破壊を含む炎症を誘導することがわかっている。これらの作用は、基質Ｐ及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドなどの感覚神経ペプチドの放出によって媒介され、その後感覚腸神経が活性化される。さらに、腸上皮におけるＳＰの受容体であるＮＫ−１Ｒの発現は、Ｃ．ディフィシレに感染した動物とヒトの両方で著しく増大する。最近の研究では、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａが腸内のＣＯＸ−２の発現を上向き調節することも提案されている。ＣＯＸ−２は、腸液分泌を増大させ、下痢を生じさせることで知られている薬剤であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の合成を媒介するシクロオキシゲナーゼ酵素の誘導アイソフォームである。特定の理論に拘泥するものではないが、我々は、ペプトン、酵母抽出物及び牛肉抽出物がこれらの経路のいずれかを阻害し毒素Ａを相殺すると考える。我々の結果は、ペプトン、酵母抽出物又は牛肉抽出物が、腸の毒素媒介ＣＯＸ−２誘導を阻害することを示唆している。これは、我々の溶液がその腸受容体への毒素の結合を阻害又は低減する場合にＣＯＸ−２活性化をもたらす毒素Ａ媒介シグナル伝達の阻害による可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロトキシン産生病原体による感染の作用を治療するための、経口組成物の製造におけるペプトン及び／又は肉抽出物の使用。
【請求項２】
作用が、腸管上皮の完全性障害、下痢及び他のＣＯＸ−２媒介作用を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
病原体が、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、鼠チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シンゲラエ（Ｓｈｉｎｇｅｌｌａｅ）、アエロモナスヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及び／又は毒素原性バクテロイデスフラジリス（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
経口組成物が０．３〜７体積％のペプトン又は肉抽出物を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ペプトンが、平均ペプチドサイズが５アミノ酸以下の乳清タンパク質の加水分解産物である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
経口組成物がペプトンと肉抽出物の両方を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
経口組成物が０．３〜７体積％の肉抽出物及び０．３〜７体積％のペプトンを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
経口組成物が酵母抽出物をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
経口組成物が０．０１〜５体積％の酵母抽出物を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
経口組成物が薬物療法に対するアジュバントである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
経口組成物が乳児用調製粉乳又は経腸組成物である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
エンテロトキシン産生病原体による感染の作用を治療するための、経口組成物の製造におけるペプトン及び／又は肉抽出物の使用。
【請求項２】
作用が、腸管上皮の完全性障害、下痢及び他のＣＯＸ−２媒介作用を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
病原体が、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、鼠チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シンゲラエ（Ｓｈｉｎｇｅｌｌａｅ）、アエロモナスヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及び／又は毒素原性バクテロイデスフラジリス（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
経口組成物が０．３〜７体積％のペプトン又は肉抽出物を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ペプトンが、平均ペプチドサイズが５アミノ酸以下の乳清タンパク質の加水分解産物である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
経口組成物がペプトンと肉抽出物の両方を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
経口組成物が０．３〜７体積％の肉抽出物及び０．３〜７体積％のペプトンを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
経口組成物が酵母抽出物をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
経口組成物が０．０１〜５体積％の酵母抽出物を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
経口組成物が薬物療法に対するアジュバントである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
経口組成物が乳児用調製粉乳又は経腸組成物である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【公表番号】特表２００７−５２７４１０（Ｐ２００７−５２７４１０Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４６６６（Ｐ２００６−５３４６６６）
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９６０６
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９６０６
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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