オリゴラムノシドの直接合成法、オリゴラムノシド含有組成物および医薬としてのその使用
本発明は、オリゴラムノシドの調製法であって、ラムノースの保護または脱保護反応を行わない、アセトニトリル中でのワンポット反応を含む方法に関する。本発明はまた、前記方法を用いて得ることができる、２〜１２のラムノース単位を有するオリゴラムノシドの混合物を含んでなる組成物に関する。本発明はさらに、好ましくは炎症性機序を調節することを目的とする、前記組成物を含んでなる、医薬および化粧処置方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、オリゴラムノシド(oligorhamnoside)の直接合成法に関する。合成法は、ラムノースの保護または脱保護反応を行わない、アセトニトリル中でのワンポット反応からなる。得られるオリゴラムノシド混合物は抗炎症活性を示す。
【０００２】
炎症反応は、ウイルスもしくは細菌などの病原体によるかまたは化学的もしくは物理的攻撃によるそれらの細胞または血管組織に対する攻撃に直面した生物の免疫系による応答である。痛みを伴うことの多い炎症は一般に治癒応答である。しかしながら、ある場合（関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患など）において、それが最初の刺激より深刻な結果をもたらすことがある。
【０００３】
接触過敏反応は、細胞病変または炎症反応の起始部の細胞上または組織中に存在する抗原に対して向けられる特異的免疫反応である。これらの過敏反応は、病原微生物に対する防御機構の枠組みの中でまたはアレルギー反応の場合において発現する可能性がある。それらの反応は、炎症反応において主たる役割を担う内皮細胞は言うまでもなく、種々のタイプの細胞、特に皮膚細胞および特定の白血球を利用する。
【０００４】
介在する細胞間相互作用には、一般にリガンドと受容体間の特異的認識現象が含まれる。過去２０年間に、フコースおよびラムノースのような特定の糖により特異的認識を確実にすることが可能なタンパク質などの多くの細胞表面受容体が同定された。
【０００５】
レクチンは、特に炎症プロセス時の細胞間の接着および認識現象において極めて重要な役割を果たす真核細胞の膜内に埋め込まれているタンパク質である。膜レクチンは、特にエンドサイトーシス、複合糖質の細胞内輸送および内皮透過性に関与している。さらに、これらのタンパク質、多くの場合、膜貫通型タンパク質は、特異的抗原認識（細胞外ドメイン）および細胞活性化（細胞内ドメイン）にも寄与している。レクチンは、特定の糖、特にラムノースを特異的に認識することができる。
【０００６】
オリゴラムノシドの研究および治療上の使用では、これまで以上にこれらの生成物の大量での入手可能性を必要とする。残念なことに、それらの生成物はミクロ不均質混合物として存在するという事実から、生細胞から均質型で単離することが難しい。可能な場合でも、このような化合物の精製は難しく、一般に収率は非常に悪い。これらの制約より、簡易で効率的なオリゴラムノシド合成法が望まれていることが示される。
【０００７】
２０世紀中、多くの研究者が独自のオリゴ糖合成法を提供するよう試みた。最初のものはFischer, Koenigs and Knorr, Lemieuxが着手した（糖単位の活性化および保護の概念を導入した、Lemieux, R. U., Morgan, A. R., The preparation and configurations of tri-O-acetyl-alpha-D-glucopyranose 1, 2-(orthoesters). Canadian journal of chemistry, 1965. 43: p. 2199-2204）。次に、Paulsen（Paulsen, H., Kutschker, W., Lockhoff, O., Building units for Oligosaccharides, XXXIII: synthesis of beta-glycosidically linked disaccharides of L-rhamnose. Chemical Berstein, 1981. 114: p. 3233-3241）、つい最近では、Schmidt and Seeberger（Seeberger, P. H. H. W. C, Solid-phase oligosaccharide synthesis and combinatorial carbohydrate libraries. Chemical reviews, 2000. 100 (no. 12): p. 4349-4393; Seeberger, P. H., Plant, O. J., Synthesis of Oligosaccharides, reagents and methods related thereto. 2001, MIT(Cambridge MA): United States, p. 50）が、反応収率および特異性を高めるために、固相支持体でのより複雑な方法を提案した。オリゴ糖の合成には、新規治療用物質を発見するために、目的としてそれらの生体適合性の活用があった。しかしながら、これらの方法は糖の保護および脱保護工程の総てを必要とする戦略に基づく。従って、これらの合成法は扱いにくく、残念なことに、収率も非常に低い（その低い収率によって工業生産の可能性が低下する）。従って、これらの化合物の合成を反応工程を最小限に抑えて可能にする好適な独自の方法を見つけることが極めて重要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、ラムノースの保護または脱保護反応を行わずに、アセトニトリル中でオリゴラムノシドを直接合成する（ワンポット合成(one-pot synthesis)）ことが可能であることに気付いた。
【０００９】
単一工程反応でのこの合成にはアセトニトリル中でのラムノースの特異的溶解特性（ラムノースは冷アセトニトリルに極めて不溶性であり、温アセトニトリルに対してはやや溶解度が高い）を利用する。
【００１０】
本発明の意味において、「オリゴラムノシド」とは、αまたはβ立体配置のグリコシド結合によって互いに結合された、左旋性または右旋性、有利には左旋性立体配置のラムノースモチーフからなるオリゴマーを意味すると理解される。前記のオリゴマーは直鎖または分枝状のものであり得る。
【００１１】
本発明は、オリゴラムノシドの調製法であって、次の連続工程：
ａ）酸触媒の存在下、アセトニトリル中にて、単一反応工程でラムノースを自己縮合させて、その自己縮合により生成したオリゴラムノシドを沈殿させ、次いで
ｂ）工程ａ）後に得られるオリゴラムノシドを含む沈殿物を濾過により回収する
ことを含んでなる方法に関する。
【００１２】
該方法の独自性は、アセトニトリル中でのラムノースの自己縮合反応が、ラムノースの水酸基の予備的保護工程を行わず、同様にラムノースの水酸基の連続的脱保護工程を行わずに直接実施されるということにある。
【発明の具体的説明】
【００１３】
前記の工程ａ）中、オリゴラムノシドの迅速な沈殿を確実に行うために飽和状態で作業する一方で、最終的な粗生成物における過剰のラムノースを制限するために、作業は有利には均質媒質中で行われる。従って、アセトニトリル溶液は、有利にはラムノースで飽和している。
【００１４】
ラムノース、アセトニトリルおよび酸触媒の混合物は、有利には加熱下、場合によっては攪拌下、温度２０℃〜１２０℃、さらに有利には３５℃〜７５℃にて反応させる。自己縮合温度は糖が分解しないように１２０℃を超えてはならない。有利な形では、加熱温度は大気圧にて約６５℃である。ラムノース、アセトニトリルおよび酸触媒の混合物は、有利には５分〜２４時間、さらに有利には３時間混合する。
【００１５】
糖の化学では、グリコシド結合の形成を有利に進めるために酸触媒を使用することは極めて古典的である。本発明の範囲内において、酸触媒は、有利には塩酸、硫酸、リン酸、オルト−、メタ−およびパラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ルイス酸（特に塩化亜鉛および塩化第二鉄）、粘土酸(clay acid)（特にモンモリロナイトＫ−１０）、合成樹脂酸、ゼオライトならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
置換ベンゼンスルホン酸は、有利にはオルト−、メタ−およびパラ−ブロモベンゼンスルホン酸である。
【００１７】
ルイス酸は、例えば、塩化亜鉛、塩化第二鉄もしくはその他の金属、メタロイドまたはハロゲン化ランタニドである。
【００１８】
合成樹脂酸の例としては、特にタイプ「Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）」、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）」および「Ｄｏｗｅｘ（商標）」が挙げられる。
【００１９】
反応が非常に迅速であるため、触媒の量を制御しなければならない。反応をさらに制御するためには、その速度を落とす必要がある。酸触媒の添加量は、有利には一定にする。触媒の添加量は、有利には１モルのラムノースに対して約０．１モルの触媒とする。
【００２０】
工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水は、有利には物理的にまたは化学的に排除される。合成中に生成する水を排除するための物理技術の例としては、特に蒸留または吸着剤の使用が挙げられる。合成中に生成する水を排除するための化学技術の例としては、特に乾燥剤の使用が挙げられる。
【００２１】
本発明の有利な変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水は、炭酸塩、硫酸塩、塩化カルシウム、五酸化リン、モレキュラーシーブスまたはこれらの種々の乾燥剤の組合せからなる群から選択される乾燥剤によって排除する。乾燥剤は、反応媒質に直接加えることができるし、「ソックスレー型」(Soxhlet-type)固体／液体抽出カートリッジ内に溶媒蒸気のレベルで存在していてもよい。
【００２２】
本発明の変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応は不活性ガス（例えば、アルゴンまたは窒素）雰囲気下、大気圧にて実施する。
【００２３】
本発明のもう１つの変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応は減圧にて（好ましくは約２６０ｍｂａｒ）、有利にはオートクレーブ内で実施する。
【００２４】
試薬は、反応が常に最も有利なモル比で実施されるように、分割してまたは連続して入れることができる。
工程ｂ）の前に反応混合物を、有利には縮合反応温度〜０℃の間の範囲の温度まで、さらに有利には周囲温度まで、すなわち、約２０℃まで冷却する。
この追加冷却工程により、工程ａ）中に生成するオリゴラムノシドの沈殿を有利に進める。
【００２５】
工程ｂ）中に回収される沈殿物を沈殿物（Ｐ１）と呼ぶ。この沈殿物は、有利には濾過（例えば、ブフナー濾過）により回収する。
【００２６】
前記沈殿物（Ｐ１）を、有利にはアセトニトリルで洗浄する。工程ｂ）後に得られた濾液を減圧蒸発させて、未反応のラムノース、さらに溶液中に入った沈殿物（Ｐ１）のラムノシル化誘導体を含有する第２の沈殿物（（Ｐ２））を回収する。
【００２７】
反応中のオリゴラムノシドの沈殿物は溶媒分子（アセトニトリル）を放出する。そのため、最小塊の可溶化が可逆的に生じ、このような理由でアセトニトリル相の蒸発により得られる沈殿物（Ｐ２）が高割合のラムノースとわずかな合成オリゴラムノシドを含有している。
【００２８】
得られたオリゴラムノシドは、１２に等しい、有利には２〜９の間の範囲の最大重合度を示す。
【００２９】
操作条件の変更は、塊の分布に変化をもたらさないが、オリゴラムノシドの形成速度論に変化をもたらさないだけであると考えられている。実際に、特定の大きさから始め、オリゴマーがアセトニトリルにもはや溶けず、沈殿すると考えられる場合には、この現象は別の２つの正反対の基礎現象を伴う。第１の現象は、その後、最も小さいオリゴマーをさらに可溶化することが可能な溶媒分子の放出であり、第２の現象は共沈現象である。十分に大きな塊のオリゴマーは、反応媒質に不溶性となった場合に、より小さなその同族体の沈殿を引き起こす可能性がある。
【００３０】
これらの３つの現象、沈殿、共沈および再溶解が、おそらく塊分布の定性的均一性の原因であると思われる。
【００３１】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する。ラムノースモチーフが４個の水酸基を有している場合、理論的には４つのグリコシド結合を形成するはずである。しかしながら、本発明の方法の実施において、グリコシド結合の形成に関与するのはラムノースモチーフの水酸基のうちせいぜい３個であることが示されている。これは立体障害問題が原因であると考えられる。
【００３２】
本発明の方法のオリゴラムノシド重量収率は、投入したラムノースの重量に対し３０〜６０％の間にある。
【００３３】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる可能性がある、２〜１２のラムノースモチーフ、有利には２〜９のラムノースモチーフを含むオリゴラムノシドの混合物からなる組成物にも関する。
【００３４】
オリゴラムノシドの重合度の関数としてのオリゴラムノシドの分布はポアソン分布にほぼ従う。
【００３５】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する。グリコシド結合はαまたはβ結合であり得る。
【００３６】
本発明はまた、本発明の組成物、すなわち、前述のようなオリゴラムノシドの混合物からなる医薬にも関する。
【００３７】
本発明の医薬は、有利には炎症性機序を調節することを目的とする。
該医薬は、特に皮膚および／または粘膜のアレルギー、炎症もしくは免疫反応または病変の予防または処置を目的とする。本発明の医薬はまた、炎症ストレスに関連する免疫応答を抑制することも目的とする。
【００３８】
本発明の医薬は、特に白血球（例えば、ヒト顆粒球、特にヒト好中球および肥満細胞）の活性化を抑制することを目的とする、前もって生成された、免疫反応のメディエーターの放出を妨げる医薬である。該医薬はまた、循環リンパ球と内皮細胞の接着抑制も可能にし、そうすることによってこれらの白血球の炎症部位への移行を抑制する。該医薬はさらに、白血球の補充および経内皮通過に寄与する、ケラチノサイトからのサイトカイン、Ｔリンパ球およびランゲルハンス細胞のアクチベーター（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）または接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ）の分泌抑制も可能にする。本発明の医薬はまた、ケラチノサイト過形成現象の抑制薬でもある。
【００３９】
本発明の医薬はまた、皮膚の樹状細胞による抗原プロセシング、抗原提示細胞、すなわち、皮膚の樹状細胞およびランゲルハンス細胞の成熟、ならびにリンパ球と抗原提示細胞間の認識現象の抑制薬でもある。
【００４０】
従って、本発明の医薬は、アトピー性および／または接触湿疹、炎症性皮膚疾患、刺激性皮膚炎、座瘡、自己免疫疾患、例えば、乾癬、光免疫抑制、白斑、粃糠疹、強皮症、関節リウマチ、クローン病および移植片拒絶からなる群から選択される疾病の予防または治療を目的とする。
【００４１】
本発明の医薬はまた、加齢に伴う慢性的な炎症問題およびそれらの影響の予防および治療も目的とする。該医薬は、特にアナフィラキシー過敏症(anaphylactic sensitivities)、皮膚の色素異常症、皮膚の血管過剰増生(dermal hypervasculority)および炎症性亀裂からなる群から選択される疾病の予防または治療を目的とする。
【００４２】
本発明の変形によれば、該医薬は組成物または香料のアレルゲン性および／または刺激性を低減することを目的とする。
【００４３】
本発明の医薬は、有利には０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する。
【００４４】
本発明の医薬は、いずれの経路による投与に対しても製剤することができる。該医薬は、有利には局所、経口、皮下、注射、直腸および膣経路により投与することを目的として製剤される。
【００４５】
医薬が経口経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は水溶液、エマルション剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、散剤、粒剤、液剤または経口懸濁剤の形態で与えられる。
【００４６】
医薬が皮下経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬または前記組成物は注射用滅菌アンプル剤の形態で与えられる。
医薬が直腸の経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は坐剤の形態で与えられる。
【００４７】
医薬が膣経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は膣坐剤の形態で与えられる。
【００４８】
本発明の医薬は局所適用が好ましい。従って、該医薬は、例えば、水溶液、白もしくは有色のクリーム剤、ポマード、乳剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、漿液、ペースト剤、泡沫剤、エアゾール剤またはスティック剤の形態となるように製剤される。
【００４９】
本発明の医薬の投与量は、疾病の治療を受ける人の体重と年齢によって変動する。当然、各患者の用量は医師によっても調整される。
【００５０】
本発明はまた、敏感であるか、炎症を起こしているか、耐性がないか、アレルギー体質であるか、老化しているか、危険な徴候を示しているか、皮膚バリア障害を示しているか、皮膚の発赤を示しているかまたは内因性老化、外因性老化もしくはホルモン老化に関連する非病理学的免疫学的不均衡(non-pathological immunological imbalance)を示している、皮膚および／または粘膜の化粧処置のための方法であって、皮膚および／または粘膜に、前述のようなオリゴラムノシドの混合物を含んでなる組成物を適用することからなる方法にも関する。
【００５１】
本発明はまた、皮膚の自然老化を遅延させおよび／または外的攻撃を受けた皮膚の促進老化を予防するための、特に皮膚の光老化を予防するための化粧処置方法であって、皮膚および／または粘膜に、前述のようなオリゴラムノシドの混合物を含んでなる組成物を適用することからなる方法にも関する。
【００５２】
化粧用途の範囲内において、本発明の組成物は、有利には組成物の総重量に対して０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する。
【００５３】
化粧料用組成物が局所経路により投与することを目的として製剤される場合、前記組成物は、例えば、水溶液、白もしくは有色のクリーム剤、ポマード、乳剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、漿液、ペースト剤、泡沫剤、エアゾール剤、シャンプー剤またはスティック剤の形態で与えられる。
【００５４】
本発明の他の特徴および利点は、以下に示す実施例での説明により明らかとなる。これらの実施例では、次の図面を参照する。これらの図面および実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、いかなる場合においてもその範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：オリゴラムノシドの直接合成
乾燥剤（ＣａＣｌ２）トラップを備えた冷却器にセットされた１００ｍｌ二口丸底フラスコに、アルゴン下、２５ｍｌのアセトニトリル（モレキュラーシーブ ３Ａで乾燥させたもの）を入れる。ラムノース（３６０ｍｇ）を４等分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる（その際には完全溶解するのを待って次の分量を加える）。
【００５６】
アルゴン下で維持した混合物に酸触媒ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）０．６Ｍ溶液（重量比 ０．１ｇ／ラムノース１ｇ）０．３ｍｌを加える。その溶液を６５℃にて４０分間攪拌する（磁気攪拌装置）。
【００５７】
反応後、攪拌を止め、その混合物を周囲温度にて３０分間冷却する。
生成した沈殿物（Ｐ１）を多孔率４の焼結ガラスでの真空濾過により回収し、次いで、それをアセトニトリル、そして無水エーテルで洗浄した後、最小限の水に溶かし、凍結乾燥する。このようにして、１２６ｍｇの白色粉末（オリゴラムノシドに相当する）を得ている（この場合の収率は３５％である）。
【００５８】
回収した濾液をロータリーエバポレーターで減圧蒸発させ（１５ｍｍＨｇ）、このようにして２３４ｍｇの固体（Ｐ２）（低分子量のラムノース／オリゴラムノシド混合物に相当する）を得る。合成オリゴ糖のサイズ分布および質量は、それぞれ、ＨＰＬＣおよび質量分析により測定している。
【００５９】
オリゴラムノシド（Ｐ１）および（Ｐ２）は、ガードカラム（６０×１０．０ｍｍ）を装着したＰｈｅｎｏｍｅｘ社製ＲＥＺＥＸ ＲＳＯ−オリゴ糖カラム（２００×１０．０ｍｍ）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析している。溶離剤は１００％Ｈ２Ｏ、流速０．３ｍｌ／分、カラム温度８０℃である。水中５０ｍｇ／ｍｌの濃度の注入サンプル１０μｌを示差屈折計を用いて検出する。これらの条件下、分析は５０分間続き、この分析によってラムノース（保持時間４７分間）とラムノシル化誘導体（保持時間１５〜４４分間）を分離することができる。
【００６０】
オリゴラムノシド（Ｐ１）および（Ｐ２）の質量は、重合度１〜５の場合はエレクトロスプレー質量分析、重合度５〜１２の場合はＬＳＩＭＳにより決定する。これらの質量分析は最大重合度が１２に等しいことを示す。総ての水酸基が反応したラムノースモチーフを除く、総てのグリコシド結合型が認められた。
【００６１】
実施例２：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を４０℃にて、実施例１に従って４０分間の間攪拌する。
実施例１に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、７２ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２０％である）。
【００６２】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２８８ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６３】
実施例３：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１および２のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を６５℃にて、ただし６時間の間攪拌する。実施例１および２に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１４４ｍｇの黄褐色沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は４０％である）。
【００６４】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２１６ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１および２のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６５】
実施例４：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１、２、３のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を４０℃にて６時間の間攪拌する。実施例１〜３に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１２６ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は３５％である）。
【００６６】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２３４ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜３のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６７】
実施例５：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、６５℃のアセトニトリルに入れるラムノースの総量は２００ｍｇである。
実施例１〜４に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、３０ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は１５％である）。
【００６８】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は１７０ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜４のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６９】
実施例６：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、触媒ＰＴＳＡの量を増やし、重量比 ０．２ｇ／ラムノース１ｇである。
実施例１〜５に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１２６ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は３５％である）。
【００７０】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２３４ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜５のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７１】
実施例７：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、アセトニトリルおよびラムノース重量を増やし、時間を延長している。
乾燥剤（ＣａＣｌ２）トラップを備えた冷却器にセットされた１００ｍｌ二口丸底フラスコに、アルゴン下、８０ｍｌの乾燥アセトニトリルを入れる。ラムノース（５５０ｍｇ）を少分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる。この場合には、溶液を６５℃にて４時間の間攪拌する。
【００７２】
実施例１〜６に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１３７．５ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２５％である）。
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は４１２．５ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜６のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７３】
実施例８：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）の代わりにＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）１５ｄｒｙなどの樹脂酸を用いる。
アルゴン下で維持した混合物にこの触媒（５００ｍｇ）を加える。
【００７４】
実施例１〜７に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、９０ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２５％である）。
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２７０ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜７のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７５】
実施例９：オリゴラムノシドの直接合成
抽出カートリッジを備えたソックスレー型固体／液体抽出器に１００ｍｌ二口丸底フラスコをセットする（抽出器自体は、真空吸気口を備えた冷却器にセットされている）。乾燥塩化カルシウムをＣａＣｌ２／ラムノース重量比２０で抽出カートリッジに充填する（ガラスウールの上に置く）。
【００７６】
そのフラスコに、アルゴン下、８０ｍｌのアセトニトリル（モレキュラーシーブ ３Ａで乾燥させたもの）を入れる。
ラムノース（５５０ｍｇ）を４等分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる（その際には完全溶解するのを待って次の分量を加える）。
【００７７】
アルゴン下で維持した混合物に酸触媒ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）０．６Ｍ溶液（重量比 ０．２ｇ／ラムノース１ｇ）１ｍｌを加える。
次いで、アセンブリーを圧力調節器を備えた真空源（フィルターポンプ）と接続して、２６０ｍｂａｒとする。一度、この圧力に達したら、その溶液を６５℃にて（この温度は選択した圧力におけるアセトニトリルの還流に相当する温度である）攪拌する（磁気攪拌装置）。真空および温度を４時間維持する（この時間は抽出器の充填／吸引数サイクルに相当する）。
【００７８】
反応後、真空および攪拌を止め、その混合物を周囲温度にて３０分間冷却する。
実施例１〜８に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、２７５ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は５０％である）。
【００７９】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２７５ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜８のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００８０】
実施例１０：オリゴラムノシドの薬理学的解析
これらの炎症プロセスにおいて作用する種々の免疫細胞を研究した。それらの免疫細胞は皮膚の樹状細胞、内皮細胞、特定の白血球およびケラチノサイトである。
【００８１】
１）細胞生存性の測定技術の原理
ＭＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］還元技術（Sigmaより販売）
この技術は、生存している、代謝的に活性な細胞の定量化を非放射性手法により可能にする比色試験である。ＭＴＴは、電位依存的にミトコンドリアの膜に結合するカチオン性分子である。ミトコンドリアレベルでは、ＭＴＴはミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってホルマザンブルーに還元される。従って、死細胞は透明なままであるが、これとは対照的に生細胞は青色に染まる。生存度の測定は、この後、自動読取装置を使用した光学濃度の測定によって実施する。
【００８２】
しかしながら、この解析方法は非接着細胞（単球および樹状細胞）よりも接着細胞（ケラチノサイトタイプ）に適しているように思われる。そのため、解析する分化細胞に対するオリゴラムノシドの細胞毒性について判断するために別の研究、すなわち、ヨウ化プロピジウムの存在下でのフローサイトメトリーが構想された。
【００８３】
ＸＴＴテトラゾリウム塩還元技術
これは細胞増殖および生（代謝的に活性な）細胞数の定量化を放射性同位元素の取込みを行わずに可能にする技術である。ＸＴＴ（黄色）は、ＭＴＴと同じく、電位依存的にミトコンドリアの膜に結合するカチオン性分子である。
【００８４】
ミトコンドリアレベルでは、ＸＴＴはミトコンドリアテトラゾリウムレダクターゼによってホルマザン（橙色）に還元される。この方法は、ＭＴＴ法よりもコストは高いが、そのプロトコールでは色素を放出するためのＳＤＳによる細胞の溶解を必要としない。実際、還元生成物は細胞内で溶解している。従って、この方法はより迅速である。死細胞は無色のままであるが、これとは対照的に生細胞は処理を行っていない場合も行った場合も有色となる。ホルマザン生成物のレベルは分光光度計を波長４５０ｎｍにて使用することによって検出され、そのレベルは代謝的に活性な細胞の数に正比例する。
【００８５】
２）毒性試験
ヒト皮膚生検材料からケラチノサイトを単離し、培養下においた。同じ生成物濃度で処理した４ウェルの光学濃度（吸光度）測定値の平均をとった。この平均を４つの対照ウェルで得た測定値の平均と比較した（スチューデントｔ検定−平均値の比較−有意差 ｐ＜０．０５の場合９５％にて、ｐ＜０．０１の場合９９％）。
【００８６】
処理した細胞の生存度を１００％の対照（未処理の細胞）に対する割合として表す（ＯＤ 処理済／ＯＤ 対照×１００）。
ラムノースは最高濃度のものでさえ細胞毒性を示していない（表１参照）。
【００８７】
【表１】
【００８８】
オリゴラムノシドは高濃度、５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で毒性を示す（表２参照）。
【００８９】
【表２】
【００９０】
内皮細胞を培養下におき、不死化し、それらの表現型を安定させた。研究した細胞系は虫垂内皮細胞、脳微小血管内皮細胞、腸間膜リンパ節内皮細胞、末梢リンパ節内皮細胞および皮膚微小血管内皮細胞であった。
【００９１】
細胞毒性試験は、テトラゾリウム塩、ＭＴＴの変換による生化学的検査を利用して実施した。得られた結果は極めて明確であり、ペンチル−ラムノシドについては毒性が認められていない（図１および２参照）。生存度は、実際には常に８５％を超えており、このことは研究した総ての細胞系に当てはまる。
図１：ラムノースの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
図２：オリゴラムノシドの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【００９２】
インキュベーションの４時間（タンパク質合成の開始に必要な時間である）に対応した刺激ピークが現れることに特に注目してほしい。このピークの存在は、細胞にはオリゴラムノシドに対して耐性があり（毒性がないということ）、それらを同化するということを示していることから、興味深い。これらの生成物は培養培地を富化させるように思われる。
これらの結果は他の内皮細胞系の場合でも同様である。
【００９３】
３）前炎症性培地で培養したヒト細胞へのアルキル−ラムノシドの影響
樹状細胞について
３群の細胞を解析した：１）オリゴラムノシドまたは選択した活性化シグナルに曝露しなかったもの（陰性対照として使用する）２）活性化シグナルとともに２４時間インキュベートしたもの（陽性対照として使用する）および３）オリゴラムノシドと２４時間接触させていたもの。
【００９４】
使用する培養培地は、１０％ＦＣＳ、グルタミン（２ｍＭ）ならびに抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン(Bioproducts)を補給したＲＰＭＩ １６４０(Bioproducts)タイプの古典的な培地である。使用するリンス液はＰＩバッファー(Bioproducts)である。使用する細胞活性化剤はＩＮＦγ(SIGMA)である。
それらの結果は以下の表３に示す。
【００９５】
【表３】
【００９６】
生存度は、ＰＩシグナルの割合を直接変換した死亡率から決定している。表３に示された結果は、細胞生存性（１００−死亡率）、すなわち、研究した各ウェル中の生細胞の割合を反映している。
【００９７】
アレルギー誘発作用は、樹状細胞の成熟およびＣＤ８６ Ｂ７．２受容体の発現に反映される。この受容体が多く示されるほど、成熟細胞の割合が高くなり、研究したラムノシル化誘導体のアレルギー誘発作用は強くなっている。
【００９８】
オリゴラムノシドは、樹状細胞の細胞死も活性化または促進成熟も引き起こさない。実際に、研究した樹状細胞は、未成熟樹状細胞の特異的受容体を発現し続けるかまたは成熟に関する他の対照膜マーカーの発現の増加を示さない。特に、これらの結果では成熟樹状細胞に特徴的なＣＤ８６分子が高密度ではないことから、樹状細胞は試験したオリゴラムノシドを、未成熟ＤＣを活性化または成熟ＤＣへと促進するまたは変換することが可能な活性化シグナルとして見なしていなかった。
【００９９】
アクチベーターＩＬ−１β刺激によりケラチノサイトによって放出されるＩＬ−８のアッセイ
ＩＬ−８のアッセイにより、オリゴラムノシドを、使用するアクチベーター、ＩＬ−１βと同時に添加した際のそれらの抗炎症性を評価することが可能である。このアッセイは処理後に回収した上清において実施する。実際には、アクチベーターＩＬ−１βと接触させて置いた正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）はＩＬ−８を分泌し、細胞上清におけるその濃度は、未処理のＮＨＫの場合の３．２ｐｇ／ｍｌ／μｇタンパク質から活性化したものの場合の約３２ｐｇ／ｍｌ／μｇタンパク質まで変化する。
【０１００】
サイトカインアッセイを精密化するために、さらなるアッセイ（細胞タンパク質についてのアッセイ）を実施する。このアッセイにより、各ウェルについての、細胞タンパク質１μｇ当たりのＩＬ−８分泌量を示すことができる（実験の節に記載されているＢＣＡ法）。
【０１０１】
ケラチノサイトをオリゴラムノシドおよびアゴニストＩＬ−１βで２４時間処理する。２４時間後、細胞上清中に放出されたサイトカインＩＬ−８をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）により定量する。
【０１０２】
標準クラスの市販のキットにより、４５０ｎｍで測定した吸光度とそれぞれの細胞上清に存在するＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を関係付けることが可能である。
試験する種々の濃度を４ウェルの細胞で評価している。従って、各処理条件に対して４つの異なるＩＬ−８濃度値（ｐｇ／ｍｌ）が得られる。これらの定量化は、ウェル当たりのタンパク質量として報告することができる。
【０１０３】
第１の試験は、ＩＬ−１βとオリゴラムノシドを一緒に２４時間インキュベートすることからなる。以下の結果（表４参照）は、これらの４つの値の平均と標準偏差である。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
これらの結果は、オリゴラムノシドをアクチベーターと直接接触させて置いたことがその抑制に影響を与えていること（２７％，１ｍｇ／ｍｌ）（表５参照）、そしてオリゴラムノシド濃度が低い場合にはこの効果が検出されないことを示している。
【０１０６】
第２の試験（ＮＨＫに対する８時間の事前処理にオリゴラムノシドを使用し、その後、ＩＬ−１βとオリゴラムノシドを一緒に２４時間加える）を実施する。
以上のように、２つのアッセイを実施し（ＩＬ−８およびタンパク質）、それらの結果を以下の表に要約している（表５参照）。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
これらの結果は、ＮＨＫをオリゴラムノシドと接触させて置く事前処理が、抑制の増強（２８％，１ｍｇ／ｍｌ）に本当の意味で影響を与えていないことを示しており、より低い濃度でもこの抑制が検出できる。このことから、オリゴラムノシドでの事前処理は上清へのＩＬ−８放出の抑制を有利に進めるものであるという結論を下すことができる。
【０１０９】
オリゴラムノシドがケラチノサイトの反応部位を占有し、二次反応の抑制（ＩＬ−１β部位の遮断）をもたらすと推測できるが、本発明者らは炎症プロセス抑制機構について結論を下すことができない。
【０１１０】
ＰＭＡによるケラチノサイトの刺激後のプロスタグランジン（６−ケトＰＧＦ１α）のアッセイ
プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）はアラキドン酸分解経路の不安定な代謝産物であり、プロスタグランジンＥ２同様、血管拡張作用を有する炎症メディエーターである。ＰＧＩ２の不安定性は、６−ケトプロスタグランジンＦ１α（６−ケトＰＧＦ１α）へのその迅速な変換（非酵素的水和）にある。従って、このプロスタグランジンをＰＧＩ２合成についてのマーカーとして測定する。
【０１１１】
【表６】
ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）はプロテインキナーゼＣのアクチベーターであり、ＩＬ−１βをはじめとするサイトカインのＮＨＫへの効果に類似し、脂質分子、プロスタグランジン６−ケトＰＧＦ１αを放出するように細胞に働きかける非生理的アクチベーターである。このプロスタグランジンはＥＬＩＳＡによりアッセイする。２つのアクチベーターＩＬ−１βおよびＰＭＡを使用する。インドメタシン（アスピリン系鎮痛薬）は、遊離アラキドン酸のトリグリセリドへの再取り込みを刺激してエイコサノイドの放出を減少させる抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であり、６−ケトＰＧＦ１αの放出を抑制するためにこのインドメタシンを使用する。
【０１１２】
２つの試験を実施した。第１の試験は、ＮＨＫをオリゴラムノシドにより４時間事前処理した後、オリゴラムノシドの存在下でその刺激を２時間モニタリングすることからなる。それらの結果は上記表６に要約している。
【０１１３】
オリゴラムノシドによる事前処理を１２時間に延長した第２の試験を実施した。それらの結果は以下の表７に要約している。
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
これらの試験条件下、刺激を受けたＮＨＫによるメディエーター ６−ケトＰＧＦ１αの放出は少ない。しかしながら、細胞を高濃度の（１ｍｇ／ｍｌより高い）オリゴラムノシドで処理した場合にはこれがわずかに抑制されるようである。
【０１１６】
ＰＭＡ刺激によりＮＨＫによって放出されるＰＧＥ２のアッセイ
オリゴラムノシドを、細胞上清へのＰＧＥ２放出の抑制剤として評価した。これらの生成物をＮＨＫと１ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの同時存在下においた。４ウェルのＮＨＫへの刺激について各試験条件を評価した。
【０１１７】
以下の表８に要約した結果は、各細胞上清（刺激したものまたは刺激していないもの）から得た処理２４時間後の平均ＰＧＥ２濃度値（ｐｇ／ｍｌ）であり、細胞量（μｇで表す）として報告している。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
オリゴラムノシドは、どちらかといえば高濃度：２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌでＰＧＥ２の放出を抑制し、平均抑制は５０％〜６０％である。より低濃度では、その抑制力が低下し、０．１ｍｇ／ｍｌで無効となる。
【０１２０】
ヒト好中球によって放出される分子、ＬＴＢ４およびＰＧＥ２のアッセイ
正常ヒト血液から好中球を単離し、独自の方法により精製する。次いで、それらを、２種類の脂質分子（シクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ経路より生じるアラキドン酸誘導体、すなわち、ロイコトリエン ＬＴＢ４およびプロスタグランジン ＰＧＥ２）の放出を引き起こす刺激バッファーにより活性化する。この刺激バッファーは、特にＣａ２＋およびＭｇ２＋イオンを含有している。これらのアッセイはＥＬＩＳＡタイプの市販のアッセイキットにより実施する。
【０１２１】
オリゴラムノシドで処理した好中球の細胞生存性をトリパンブルーを使用して評価する。生存性は最高オリゴラムノシド濃度においてさえも申し分ない。
これらの結果は、同じ試験において刺激した細胞の２つの上清をアッセイした値の平均を示している。
脂質分子放出の抑制について得られた結果を以下の表９に要約している。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
インドメタシンをＰＧＥ２放出の特異的抑制薬として、ノルジヒドログアイアレチン酸をＬＴＢ４放出の特異的抑制薬として使用する。
この表から、オリゴラムノシドによる好中球の処理後に観察されるＰＧＥ２放出の非常に弱い抑制（１１％）があると結論付けることができる。しかしながら、濃度１ｍｇ／ｍｌのオリゴラムノシドの存在下ではＬＴＢ４放出の２６％抑制が得られ、確認されている。
【０１２４】
最後に、濃度１ｍｇ／ｍｌのオリゴラムノシドは、２つの独立試験においてＮＨＫによるＩＬ−８放出の２７％〜２８％抑制を確実に行うが、ＮＨＫによる６−ケトＰＧＦ１α放出については若干減少している。より高い濃度（１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ）のオリゴラムノシドはＮＨＫによるＰＧＥ２放出を平均して５０％〜６０％抑制している。２つの独立試験では、これらの同じ分子の濃度１ｍｇ／ｍｌのものが好中球によるＬＴＢ４放出の２１％および２６％の抑制に影響を与えている。これらの分子はヒト好中球によるＰＧＥ２放出には影響しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ラムノースの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【図２】オリゴラムノシドの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、オリゴラムノシド(oligorhamnoside)の直接合成法に関する。合成法は、ラムノースの保護または脱保護反応を行わない、アセトニトリル中でのワンポット反応からなる。得られるオリゴラムノシド混合物は抗炎症活性を示す。
【０００２】
炎症反応は、ウイルスもしくは細菌などの病原体によるかまたは化学的もしくは物理的攻撃によるそれらの細胞または血管組織に対する攻撃に直面した生物の免疫系による応答である。痛みを伴うことの多い炎症は一般に治癒応答である。しかしながら、ある場合（関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患など）において、それが最初の刺激より深刻な結果をもたらすことがある。
【０００３】
接触過敏反応は、細胞病変または炎症反応の起始部の細胞上または組織中に存在する抗原に対して向けられる特異的免疫反応である。これらの過敏反応は、病原微生物に対する防御機構の枠組みの中でまたはアレルギー反応の場合において発現する可能性がある。それらの反応は、炎症反応において主たる役割を担う内皮細胞は言うまでもなく、種々のタイプの細胞、特に皮膚細胞および特定の白血球を利用する。
【０００４】
介在する細胞間相互作用には、一般にリガンドと受容体間の特異的認識現象が含まれる。過去２０年間に、フコースおよびラムノースのような特定の糖により特異的認識を確実にすることが可能なタンパク質などの多くの細胞表面受容体が同定された。
【０００５】
レクチンは、特に炎症プロセス時の細胞間の接着および認識現象において極めて重要な役割を果たす真核細胞の膜内に埋め込まれているタンパク質である。膜レクチンは、特にエンドサイトーシス、複合糖質の細胞内輸送および内皮透過性に関与している。さらに、これらのタンパク質、多くの場合、膜貫通型タンパク質は、特異的抗原認識（細胞外ドメイン）および細胞活性化（細胞内ドメイン）にも寄与している。レクチンは、特定の糖、特にラムノースを特異的に認識することができる。
【０００６】
オリゴラムノシドの研究および治療上の使用では、これまで以上にこれらの生成物の大量での入手可能性を必要とする。残念なことに、それらの生成物はミクロ不均質混合物として存在するという事実から、生細胞から均質型で単離することが難しい。可能な場合でも、このような化合物の精製は難しく、一般に収率は非常に悪い。これらの制約より、簡易で効率的なオリゴラムノシド合成法が望まれていることが示される。
【０００７】
２０世紀中、多くの研究者が独自のオリゴ糖合成法を提供するよう試みた。最初のものはFischer, Koenigs and Knorr, Lemieuxが着手した（糖単位の活性化および保護の概念を導入した、Lemieux, R. U., Morgan, A. R., The preparation and configurations of tri-O-acetyl-alpha-D-glucopyranose 1, 2-(orthoesters). Canadian journal of chemistry, 1965. 43: p. 2199-2204）。次に、Paulsen（Paulsen, H., Kutschker, W., Lockhoff, O., Building units for Oligosaccharides, XXXIII: synthesis of beta-glycosidically linked disaccharides of L-rhamnose. Chemical Berstein, 1981. 114: p. 3233-3241）、つい最近では、Schmidt and Seeberger（Seeberger, P. H. H. W. C, Solid-phase oligosaccharide synthesis and combinatorial carbohydrate libraries. Chemical reviews, 2000. 100 (no. 12): p. 4349-4393; Seeberger, P. H., Plant, O. J., Synthesis of Oligosaccharides, reagents and methods related thereto. 2001, MIT(Cambridge MA): United States, p. 50）が、反応収率および特異性を高めるために、固相支持体でのより複雑な方法を提案した。オリゴ糖の合成には、新規治療用物質を発見するために、目的としてそれらの生体適合性の活用があった。しかしながら、これらの方法は糖の保護および脱保護工程の総てを必要とする戦略に基づく。従って、これらの合成法は扱いにくく、残念なことに、収率も非常に低い（その低い収率によって工業生産の可能性が低下する）。従って、これらの化合物の合成を反応工程を最小限に抑えて可能にする好適な独自の方法を見つけることが極めて重要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、ラムノースの保護または脱保護反応を行わずに、アセトニトリル中でオリゴラムノシドを直接合成する（ワンポット合成(one-pot synthesis)）ことが可能であることに気付いた。
【０００９】
単一工程反応でのこの合成にはアセトニトリル中でのラムノースの特異的溶解特性（ラムノースは冷アセトニトリルに極めて不溶性であり、温アセトニトリルに対してはやや溶解度が高い）を利用する。
【００１０】
本発明の意味において、「オリゴラムノシド」とは、αまたはβ立体配置のグリコシド結合によって互いに結合された、左旋性または右旋性、有利には左旋性立体配置のラムノースモチーフからなるオリゴマーを意味すると理解される。前記のオリゴマーは直鎖または分枝状のものであり得る。
【００１１】
本発明は、オリゴラムノシドの調製法であって、次の連続工程：
ａ）酸触媒の存在下、アセトニトリル中にて、単一反応工程でラムノースを自己縮合させて、その自己縮合により生成したオリゴラムノシドを沈殿させ、次いで
ｂ）工程ａ）後に得られるオリゴラムノシドを含む沈殿物を濾過により回収する
ことを含んでなる方法に関する。
【００１２】
該方法の独自性は、アセトニトリル中でのラムノースの自己縮合反応が、ラムノースの水酸基の予備的保護工程を行わず、同様にラムノースの水酸基の連続的脱保護工程を行わずに直接実施されるということにある。
【発明の具体的説明】
【００１３】
前記の工程ａ）中、オリゴラムノシドの迅速な沈殿を確実に行うために飽和状態で作業する一方で、最終的な粗生成物における過剰のラムノースを制限するために、作業は有利には均質媒質中で行われる。従って、アセトニトリル溶液は、有利にはラムノースで飽和している。
【００１４】
ラムノース、アセトニトリルおよび酸触媒の混合物は、有利には加熱下、場合によっては攪拌下、温度２０℃〜１２０℃、さらに有利には３５℃〜７５℃にて反応させる。自己縮合温度は糖が分解しないように１２０℃を超えてはならない。有利な形では、加熱温度は大気圧にて約６５℃である。ラムノース、アセトニトリルおよび酸触媒の混合物は、有利には５分〜２４時間、さらに有利には３時間混合する。
【００１５】
糖の化学では、グリコシド結合の形成を有利に進めるために酸触媒を使用することは極めて古典的である。本発明の範囲内において、酸触媒は、有利には塩酸、硫酸、リン酸、オルト−、メタ−およびパラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ルイス酸（特に塩化亜鉛および塩化第二鉄）、粘土酸(clay acid)（特にモンモリロナイトＫ−１０）、合成樹脂酸、ゼオライトならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
置換ベンゼンスルホン酸は、有利にはオルト−、メタ−およびパラ−ブロモベンゼンスルホン酸である。
【００１７】
ルイス酸は、例えば、塩化亜鉛、塩化第二鉄もしくはその他の金属、メタロイドまたはハロゲン化ランタニドである。
【００１８】
合成樹脂酸の例としては、特にタイプ「Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）」、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）」および「Ｄｏｗｅｘ（商標）」が挙げられる。
【００１９】
反応が非常に迅速であるため、触媒の量を制御しなければならない。反応をさらに制御するためには、その速度を落とす必要がある。酸触媒の添加量は、有利には一定にする。触媒の添加量は、有利には１モルのラムノースに対して約０．１モルの触媒とする。
【００２０】
工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水は、有利には物理的にまたは化学的に排除される。合成中に生成する水を排除するための物理技術の例としては、特に蒸留または吸着剤の使用が挙げられる。合成中に生成する水を排除するための化学技術の例としては、特に乾燥剤の使用が挙げられる。
【００２１】
本発明の有利な変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水は、炭酸塩、硫酸塩、塩化カルシウム、五酸化リン、モレキュラーシーブスまたはこれらの種々の乾燥剤の組合せからなる群から選択される乾燥剤によって排除する。乾燥剤は、反応媒質に直接加えることができるし、「ソックスレー型」(Soxhlet-type)固体／液体抽出カートリッジ内に溶媒蒸気のレベルで存在していてもよい。
【００２２】
本発明の変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応は不活性ガス（例えば、アルゴンまたは窒素）雰囲気下、大気圧にて実施する。
【００２３】
本発明のもう１つの変形によれば、工程ａ）の自己縮合反応は減圧にて（好ましくは約２６０ｍｂａｒ）、有利にはオートクレーブ内で実施する。
【００２４】
試薬は、反応が常に最も有利なモル比で実施されるように、分割してまたは連続して入れることができる。
工程ｂ）の前に反応混合物を、有利には縮合反応温度〜０℃の間の範囲の温度まで、さらに有利には周囲温度まで、すなわち、約２０℃まで冷却する。
この追加冷却工程により、工程ａ）中に生成するオリゴラムノシドの沈殿を有利に進める。
【００２５】
工程ｂ）中に回収される沈殿物を沈殿物（Ｐ１）と呼ぶ。この沈殿物は、有利には濾過（例えば、ブフナー濾過）により回収する。
【００２６】
前記沈殿物（Ｐ１）を、有利にはアセトニトリルで洗浄する。工程ｂ）後に得られた濾液を減圧蒸発させて、未反応のラムノース、さらに溶液中に入った沈殿物（Ｐ１）のラムノシル化誘導体を含有する第２の沈殿物（（Ｐ２））を回収する。
【００２７】
反応中のオリゴラムノシドの沈殿物は溶媒分子（アセトニトリル）を放出する。そのため、最小塊の可溶化が可逆的に生じ、このような理由でアセトニトリル相の蒸発により得られる沈殿物（Ｐ２）が高割合のラムノースとわずかな合成オリゴラムノシドを含有している。
【００２８】
得られたオリゴラムノシドは、１２に等しい、有利には２〜９の間の範囲の最大重合度を示す。
【００２９】
操作条件の変更は、塊の分布に変化をもたらさないが、オリゴラムノシドの形成速度論に変化をもたらさないだけであると考えられている。実際に、特定の大きさから始め、オリゴマーがアセトニトリルにもはや溶けず、沈殿すると考えられる場合には、この現象は別の２つの正反対の基礎現象を伴う。第１の現象は、その後、最も小さいオリゴマーをさらに可溶化することが可能な溶媒分子の放出であり、第２の現象は共沈現象である。十分に大きな塊のオリゴマーは、反応媒質に不溶性となった場合に、より小さなその同族体の沈殿を引き起こす可能性がある。
【００３０】
これらの３つの現象、沈殿、共沈および再溶解が、おそらく塊分布の定性的均一性の原因であると思われる。
【００３１】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する。ラムノースモチーフが４個の水酸基を有している場合、理論的には４つのグリコシド結合を形成するはずである。しかしながら、本発明の方法の実施において、グリコシド結合の形成に関与するのはラムノースモチーフの水酸基のうちせいぜい３個であることが示されている。これは立体障害問題が原因であると考えられる。
【００３２】
本発明の方法のオリゴラムノシド重量収率は、投入したラムノースの重量に対し３０〜６０％の間にある。
【００３３】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる可能性がある、２〜１２のラムノースモチーフ、有利には２〜９のラムノースモチーフを含むオリゴラムノシドの混合物からなる組成物にも関する。
【００３４】
オリゴラムノシドの重合度の関数としてのオリゴラムノシドの分布はポアソン分布にほぼ従う。
【００３５】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する。グリコシド結合はαまたはβ結合であり得る。
【００３６】
本発明はまた、本発明の組成物、すなわち、前述のようなオリゴラムノシドの混合物からなる医薬にも関する。
【００３７】
本発明の医薬は、有利には炎症性機序を調節することを目的とする。
該医薬は、特に皮膚および／または粘膜のアレルギー、炎症もしくは免疫反応または病変の予防または処置を目的とする。本発明の医薬はまた、炎症ストレスに関連する免疫応答を抑制することも目的とする。
【００３８】
本発明の医薬は、特に白血球（例えば、ヒト顆粒球、特にヒト好中球および肥満細胞）の活性化を抑制することを目的とする、前もって生成された、免疫反応のメディエーターの放出を妨げる医薬である。該医薬はまた、循環リンパ球と内皮細胞の接着抑制も可能にし、そうすることによってこれらの白血球の炎症部位への移行を抑制する。該医薬はさらに、白血球の補充および経内皮通過に寄与する、ケラチノサイトからのサイトカイン、Ｔリンパ球およびランゲルハンス細胞のアクチベーター（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）または接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ）の分泌抑制も可能にする。本発明の医薬はまた、ケラチノサイト過形成現象の抑制薬でもある。
【００３９】
本発明の医薬はまた、皮膚の樹状細胞による抗原プロセシング、抗原提示細胞、すなわち、皮膚の樹状細胞およびランゲルハンス細胞の成熟、ならびにリンパ球と抗原提示細胞間の認識現象の抑制薬でもある。
【００４０】
従って、本発明の医薬は、アトピー性および／または接触湿疹、炎症性皮膚疾患、刺激性皮膚炎、座瘡、自己免疫疾患、例えば、乾癬、光免疫抑制、白斑、粃糠疹、強皮症、関節リウマチ、クローン病および移植片拒絶からなる群から選択される疾病の予防または治療を目的とする。
【００４１】
本発明の医薬はまた、加齢に伴う慢性的な炎症問題およびそれらの影響の予防および治療も目的とする。該医薬は、特にアナフィラキシー過敏症(anaphylactic sensitivities)、皮膚の色素異常症、皮膚の血管過剰増生(dermal hypervasculority)および炎症性亀裂からなる群から選択される疾病の予防または治療を目的とする。
【００４２】
本発明の変形によれば、該医薬は組成物または香料のアレルゲン性および／または刺激性を低減することを目的とする。
【００４３】
本発明の医薬は、有利には０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する。
【００４４】
本発明の医薬は、いずれの経路による投与に対しても製剤することができる。該医薬は、有利には局所、経口、皮下、注射、直腸および膣経路により投与することを目的として製剤される。
【００４５】
医薬が経口経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は水溶液、エマルション剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、散剤、粒剤、液剤または経口懸濁剤の形態で与えられる。
【００４６】
医薬が皮下経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬または前記組成物は注射用滅菌アンプル剤の形態で与えられる。
医薬が直腸の経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は坐剤の形態で与えられる。
【００４７】
医薬が膣経路により投与することを目的として製剤される場合、前記医薬は膣坐剤の形態で与えられる。
【００４８】
本発明の医薬は局所適用が好ましい。従って、該医薬は、例えば、水溶液、白もしくは有色のクリーム剤、ポマード、乳剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、漿液、ペースト剤、泡沫剤、エアゾール剤またはスティック剤の形態となるように製剤される。
【００４９】
本発明の医薬の投与量は、疾病の治療を受ける人の体重と年齢によって変動する。当然、各患者の用量は医師によっても調整される。
【００５０】
本発明はまた、敏感であるか、炎症を起こしているか、耐性がないか、アレルギー体質であるか、老化しているか、危険な徴候を示しているか、皮膚バリア障害を示しているか、皮膚の発赤を示しているかまたは内因性老化、外因性老化もしくはホルモン老化に関連する非病理学的免疫学的不均衡(non-pathological immunological imbalance)を示している、皮膚および／または粘膜の化粧処置のための方法であって、皮膚および／または粘膜に、前述のようなオリゴラムノシドの混合物を含んでなる組成物を適用することからなる方法にも関する。
【００５１】
本発明はまた、皮膚の自然老化を遅延させおよび／または外的攻撃を受けた皮膚の促進老化を予防するための、特に皮膚の光老化を予防するための化粧処置方法であって、皮膚および／または粘膜に、前述のようなオリゴラムノシドの混合物を含んでなる組成物を適用することからなる方法にも関する。
【００５２】
化粧用途の範囲内において、本発明の組成物は、有利には組成物の総重量に対して０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する。
【００５３】
化粧料用組成物が局所経路により投与することを目的として製剤される場合、前記組成物は、例えば、水溶液、白もしくは有色のクリーム剤、ポマード、乳剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、漿液、ペースト剤、泡沫剤、エアゾール剤、シャンプー剤またはスティック剤の形態で与えられる。
【００５４】
本発明の他の特徴および利点は、以下に示す実施例での説明により明らかとなる。これらの実施例では、次の図面を参照する。これらの図面および実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、いかなる場合においてもその範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：オリゴラムノシドの直接合成
乾燥剤（ＣａＣｌ２）トラップを備えた冷却器にセットされた１００ｍｌ二口丸底フラスコに、アルゴン下、２５ｍｌのアセトニトリル（モレキュラーシーブ ３Ａで乾燥させたもの）を入れる。ラムノース（３６０ｍｇ）を４等分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる（その際には完全溶解するのを待って次の分量を加える）。
【００５６】
アルゴン下で維持した混合物に酸触媒ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）０．６Ｍ溶液（重量比 ０．１ｇ／ラムノース１ｇ）０．３ｍｌを加える。その溶液を６５℃にて４０分間攪拌する（磁気攪拌装置）。
【００５７】
反応後、攪拌を止め、その混合物を周囲温度にて３０分間冷却する。
生成した沈殿物（Ｐ１）を多孔率４の焼結ガラスでの真空濾過により回収し、次いで、それをアセトニトリル、そして無水エーテルで洗浄した後、最小限の水に溶かし、凍結乾燥する。このようにして、１２６ｍｇの白色粉末（オリゴラムノシドに相当する）を得ている（この場合の収率は３５％である）。
【００５８】
回収した濾液をロータリーエバポレーターで減圧蒸発させ（１５ｍｍＨｇ）、このようにして２３４ｍｇの固体（Ｐ２）（低分子量のラムノース／オリゴラムノシド混合物に相当する）を得る。合成オリゴ糖のサイズ分布および質量は、それぞれ、ＨＰＬＣおよび質量分析により測定している。
【００５９】
オリゴラムノシド（Ｐ１）および（Ｐ２）は、ガードカラム（６０×１０．０ｍｍ）を装着したＰｈｅｎｏｍｅｘ社製ＲＥＺＥＸ ＲＳＯ−オリゴ糖カラム（２００×１０．０ｍｍ）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析している。溶離剤は１００％Ｈ２Ｏ、流速０．３ｍｌ／分、カラム温度８０℃である。水中５０ｍｇ／ｍｌの濃度の注入サンプル１０μｌを示差屈折計を用いて検出する。これらの条件下、分析は５０分間続き、この分析によってラムノース（保持時間４７分間）とラムノシル化誘導体（保持時間１５〜４４分間）を分離することができる。
【００６０】
オリゴラムノシド（Ｐ１）および（Ｐ２）の質量は、重合度１〜５の場合はエレクトロスプレー質量分析、重合度５〜１２の場合はＬＳＩＭＳにより決定する。これらの質量分析は最大重合度が１２に等しいことを示す。総ての水酸基が反応したラムノースモチーフを除く、総てのグリコシド結合型が認められた。
【００６１】
実施例２：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を４０℃にて、実施例１に従って４０分間の間攪拌する。
実施例１に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、７２ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２０％である）。
【００６２】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２８８ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６３】
実施例３：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１および２のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を６５℃にて、ただし６時間の間攪拌する。実施例１および２に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１４４ｍｇの黄褐色沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は４０％である）。
【００６４】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２１６ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１および２のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６５】
実施例４：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１、２、３のプロトコールに従うが、この場合には、溶液を４０℃にて６時間の間攪拌する。実施例１〜３に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１２６ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は３５％である）。
【００６６】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２３４ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜３のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６７】
実施例５：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、６５℃のアセトニトリルに入れるラムノースの総量は２００ｍｇである。
実施例１〜４に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、３０ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は１５％である）。
【００６８】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は１７０ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜４のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００６９】
実施例６：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、この場合には、触媒ＰＴＳＡの量を増やし、重量比 ０．２ｇ／ラムノース１ｇである。
実施例１〜５に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１２６ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は３５％である）。
【００７０】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２３４ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜５のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７１】
実施例７：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、アセトニトリルおよびラムノース重量を増やし、時間を延長している。
乾燥剤（ＣａＣｌ２）トラップを備えた冷却器にセットされた１００ｍｌ二口丸底フラスコに、アルゴン下、８０ｍｌの乾燥アセトニトリルを入れる。ラムノース（５５０ｍｇ）を少分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる。この場合には、溶液を６５℃にて４時間の間攪拌する。
【００７２】
実施例１〜６に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、１３７．５ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２５％である）。
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は４１２．５ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜６のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７３】
実施例８：オリゴラムノシドの直接合成
この方法は実施例１のプロトコールに従うが、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）の代わりにＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）１５ｄｒｙなどの樹脂酸を用いる。
アルゴン下で維持した混合物にこの触媒（５００ｍｇ）を加える。
【００７４】
実施例１〜７に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、９０ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は２５％である）。
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２７０ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜７のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００７５】
実施例９：オリゴラムノシドの直接合成
抽出カートリッジを備えたソックスレー型固体／液体抽出器に１００ｍｌ二口丸底フラスコをセットする（抽出器自体は、真空吸気口を備えた冷却器にセットされている）。乾燥塩化カルシウムをＣａＣｌ２／ラムノース重量比２０で抽出カートリッジに充填する（ガラスウールの上に置く）。
【００７６】
そのフラスコに、アルゴン下、８０ｍｌのアセトニトリル（モレキュラーシーブ ３Ａで乾燥させたもの）を入れる。
ラムノース（５５０ｍｇ）を４等分量ずつ温（６５℃）アセトニトリルに入れる（その際には完全溶解するのを待って次の分量を加える）。
【００７７】
アルゴン下で維持した混合物に酸触媒ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）０．６Ｍ溶液（重量比 ０．２ｇ／ラムノース１ｇ）１ｍｌを加える。
次いで、アセンブリーを圧力調節器を備えた真空源（フィルターポンプ）と接続して、２６０ｍｂａｒとする。一度、この圧力に達したら、その溶液を６５℃にて（この温度は選択した圧力におけるアセトニトリルの還流に相当する温度である）攪拌する（磁気攪拌装置）。真空および温度を４時間維持する（この時間は抽出器の充填／吸引数サイクルに相当する）。
【００７８】
反応後、真空および攪拌を止め、その混合物を周囲温度にて３０分間冷却する。
実施例１〜８に記載されているプロトコールと同じプロトコールに従って反応させ、処理した後、２７５ｍｇの沈殿物（Ｐ１）を得る（この場合の収率は５０％である）。
【００７９】
この実施例における固体（Ｐ２）の回収重量は２７５ｍｇである。
ＨＰＬＣおよび質量分析による解析では、実施例１〜８のプロトコールに従って得られた結果と同じ結果が得られた。
【００８０】
実施例１０：オリゴラムノシドの薬理学的解析
これらの炎症プロセスにおいて作用する種々の免疫細胞を研究した。それらの免疫細胞は皮膚の樹状細胞、内皮細胞、特定の白血球およびケラチノサイトである。
【００８１】
１）細胞生存性の測定技術の原理
ＭＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］還元技術（Sigmaより販売）
この技術は、生存している、代謝的に活性な細胞の定量化を非放射性手法により可能にする比色試験である。ＭＴＴは、電位依存的にミトコンドリアの膜に結合するカチオン性分子である。ミトコンドリアレベルでは、ＭＴＴはミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってホルマザンブルーに還元される。従って、死細胞は透明なままであるが、これとは対照的に生細胞は青色に染まる。生存度の測定は、この後、自動読取装置を使用した光学濃度の測定によって実施する。
【００８２】
しかしながら、この解析方法は非接着細胞（単球および樹状細胞）よりも接着細胞（ケラチノサイトタイプ）に適しているように思われる。そのため、解析する分化細胞に対するオリゴラムノシドの細胞毒性について判断するために別の研究、すなわち、ヨウ化プロピジウムの存在下でのフローサイトメトリーが構想された。
【００８３】
ＸＴＴテトラゾリウム塩還元技術
これは細胞増殖および生（代謝的に活性な）細胞数の定量化を放射性同位元素の取込みを行わずに可能にする技術である。ＸＴＴ（黄色）は、ＭＴＴと同じく、電位依存的にミトコンドリアの膜に結合するカチオン性分子である。
【００８４】
ミトコンドリアレベルでは、ＸＴＴはミトコンドリアテトラゾリウムレダクターゼによってホルマザン（橙色）に還元される。この方法は、ＭＴＴ法よりもコストは高いが、そのプロトコールでは色素を放出するためのＳＤＳによる細胞の溶解を必要としない。実際、還元生成物は細胞内で溶解している。従って、この方法はより迅速である。死細胞は無色のままであるが、これとは対照的に生細胞は処理を行っていない場合も行った場合も有色となる。ホルマザン生成物のレベルは分光光度計を波長４５０ｎｍにて使用することによって検出され、そのレベルは代謝的に活性な細胞の数に正比例する。
【００８５】
２）毒性試験
ヒト皮膚生検材料からケラチノサイトを単離し、培養下においた。同じ生成物濃度で処理した４ウェルの光学濃度（吸光度）測定値の平均をとった。この平均を４つの対照ウェルで得た測定値の平均と比較した（スチューデントｔ検定−平均値の比較−有意差 ｐ＜０．０５の場合９５％にて、ｐ＜０．０１の場合９９％）。
【００８６】
処理した細胞の生存度を１００％の対照（未処理の細胞）に対する割合として表す（ＯＤ 処理済／ＯＤ 対照×１００）。
ラムノースは最高濃度のものでさえ細胞毒性を示していない（表１参照）。
【００８７】
【表１】
【００８８】
オリゴラムノシドは高濃度、５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で毒性を示す（表２参照）。
【００８９】
【表２】
【００９０】
内皮細胞を培養下におき、不死化し、それらの表現型を安定させた。研究した細胞系は虫垂内皮細胞、脳微小血管内皮細胞、腸間膜リンパ節内皮細胞、末梢リンパ節内皮細胞および皮膚微小血管内皮細胞であった。
【００９１】
細胞毒性試験は、テトラゾリウム塩、ＭＴＴの変換による生化学的検査を利用して実施した。得られた結果は極めて明確であり、ペンチル−ラムノシドについては毒性が認められていない（図１および２参照）。生存度は、実際には常に８５％を超えており、このことは研究した総ての細胞系に当てはまる。
図１：ラムノースの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
図２：オリゴラムノシドの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【００９２】
インキュベーションの４時間（タンパク質合成の開始に必要な時間である）に対応した刺激ピークが現れることに特に注目してほしい。このピークの存在は、細胞にはオリゴラムノシドに対して耐性があり（毒性がないということ）、それらを同化するということを示していることから、興味深い。これらの生成物は培養培地を富化させるように思われる。
これらの結果は他の内皮細胞系の場合でも同様である。
【００９３】
３）前炎症性培地で培養したヒト細胞へのアルキル−ラムノシドの影響
樹状細胞について
３群の細胞を解析した：１）オリゴラムノシドまたは選択した活性化シグナルに曝露しなかったもの（陰性対照として使用する）２）活性化シグナルとともに２４時間インキュベートしたもの（陽性対照として使用する）および３）オリゴラムノシドと２４時間接触させていたもの。
【００９４】
使用する培養培地は、１０％ＦＣＳ、グルタミン（２ｍＭ）ならびに抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン(Bioproducts)を補給したＲＰＭＩ １６４０(Bioproducts)タイプの古典的な培地である。使用するリンス液はＰＩバッファー(Bioproducts)である。使用する細胞活性化剤はＩＮＦγ(SIGMA)である。
それらの結果は以下の表３に示す。
【００９５】
【表３】
【００９６】
生存度は、ＰＩシグナルの割合を直接変換した死亡率から決定している。表３に示された結果は、細胞生存性（１００−死亡率）、すなわち、研究した各ウェル中の生細胞の割合を反映している。
【００９７】
アレルギー誘発作用は、樹状細胞の成熟およびＣＤ８６ Ｂ７．２受容体の発現に反映される。この受容体が多く示されるほど、成熟細胞の割合が高くなり、研究したラムノシル化誘導体のアレルギー誘発作用は強くなっている。
【００９８】
オリゴラムノシドは、樹状細胞の細胞死も活性化または促進成熟も引き起こさない。実際に、研究した樹状細胞は、未成熟樹状細胞の特異的受容体を発現し続けるかまたは成熟に関する他の対照膜マーカーの発現の増加を示さない。特に、これらの結果では成熟樹状細胞に特徴的なＣＤ８６分子が高密度ではないことから、樹状細胞は試験したオリゴラムノシドを、未成熟ＤＣを活性化または成熟ＤＣへと促進するまたは変換することが可能な活性化シグナルとして見なしていなかった。
【００９９】
アクチベーターＩＬ−１β刺激によりケラチノサイトによって放出されるＩＬ−８のアッセイ
ＩＬ−８のアッセイにより、オリゴラムノシドを、使用するアクチベーター、ＩＬ−１βと同時に添加した際のそれらの抗炎症性を評価することが可能である。このアッセイは処理後に回収した上清において実施する。実際には、アクチベーターＩＬ−１βと接触させて置いた正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）はＩＬ−８を分泌し、細胞上清におけるその濃度は、未処理のＮＨＫの場合の３．２ｐｇ／ｍｌ／μｇタンパク質から活性化したものの場合の約３２ｐｇ／ｍｌ／μｇタンパク質まで変化する。
【０１００】
サイトカインアッセイを精密化するために、さらなるアッセイ（細胞タンパク質についてのアッセイ）を実施する。このアッセイにより、各ウェルについての、細胞タンパク質１μｇ当たりのＩＬ−８分泌量を示すことができる（実験の節に記載されているＢＣＡ法）。
【０１０１】
ケラチノサイトをオリゴラムノシドおよびアゴニストＩＬ−１βで２４時間処理する。２４時間後、細胞上清中に放出されたサイトカインＩＬ−８をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）により定量する。
【０１０２】
標準クラスの市販のキットにより、４５０ｎｍで測定した吸光度とそれぞれの細胞上清に存在するＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を関係付けることが可能である。
試験する種々の濃度を４ウェルの細胞で評価している。従って、各処理条件に対して４つの異なるＩＬ−８濃度値（ｐｇ／ｍｌ）が得られる。これらの定量化は、ウェル当たりのタンパク質量として報告することができる。
【０１０３】
第１の試験は、ＩＬ−１βとオリゴラムノシドを一緒に２４時間インキュベートすることからなる。以下の結果（表４参照）は、これらの４つの値の平均と標準偏差である。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
これらの結果は、オリゴラムノシドをアクチベーターと直接接触させて置いたことがその抑制に影響を与えていること（２７％，１ｍｇ／ｍｌ）（表５参照）、そしてオリゴラムノシド濃度が低い場合にはこの効果が検出されないことを示している。
【０１０６】
第２の試験（ＮＨＫに対する８時間の事前処理にオリゴラムノシドを使用し、その後、ＩＬ−１βとオリゴラムノシドを一緒に２４時間加える）を実施する。
以上のように、２つのアッセイを実施し（ＩＬ−８およびタンパク質）、それらの結果を以下の表に要約している（表５参照）。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
これらの結果は、ＮＨＫをオリゴラムノシドと接触させて置く事前処理が、抑制の増強（２８％，１ｍｇ／ｍｌ）に本当の意味で影響を与えていないことを示しており、より低い濃度でもこの抑制が検出できる。このことから、オリゴラムノシドでの事前処理は上清へのＩＬ−８放出の抑制を有利に進めるものであるという結論を下すことができる。
【０１０９】
オリゴラムノシドがケラチノサイトの反応部位を占有し、二次反応の抑制（ＩＬ−１β部位の遮断）をもたらすと推測できるが、本発明者らは炎症プロセス抑制機構について結論を下すことができない。
【０１１０】
ＰＭＡによるケラチノサイトの刺激後のプロスタグランジン（６−ケトＰＧＦ１α）のアッセイ
プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）はアラキドン酸分解経路の不安定な代謝産物であり、プロスタグランジンＥ２同様、血管拡張作用を有する炎症メディエーターである。ＰＧＩ２の不安定性は、６−ケトプロスタグランジンＦ１α（６−ケトＰＧＦ１α）へのその迅速な変換（非酵素的水和）にある。従って、このプロスタグランジンをＰＧＩ２合成についてのマーカーとして測定する。
【０１１１】
【表６】
ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）はプロテインキナーゼＣのアクチベーターであり、ＩＬ−１βをはじめとするサイトカインのＮＨＫへの効果に類似し、脂質分子、プロスタグランジン６−ケトＰＧＦ１αを放出するように細胞に働きかける非生理的アクチベーターである。このプロスタグランジンはＥＬＩＳＡによりアッセイする。２つのアクチベーターＩＬ−１βおよびＰＭＡを使用する。インドメタシン（アスピリン系鎮痛薬）は、遊離アラキドン酸のトリグリセリドへの再取り込みを刺激してエイコサノイドの放出を減少させる抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であり、６−ケトＰＧＦ１αの放出を抑制するためにこのインドメタシンを使用する。
【０１１２】
２つの試験を実施した。第１の試験は、ＮＨＫをオリゴラムノシドにより４時間事前処理した後、オリゴラムノシドの存在下でその刺激を２時間モニタリングすることからなる。それらの結果は上記表６に要約している。
【０１１３】
オリゴラムノシドによる事前処理を１２時間に延長した第２の試験を実施した。それらの結果は以下の表７に要約している。
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
これらの試験条件下、刺激を受けたＮＨＫによるメディエーター ６−ケトＰＧＦ１αの放出は少ない。しかしながら、細胞を高濃度の（１ｍｇ／ｍｌより高い）オリゴラムノシドで処理した場合にはこれがわずかに抑制されるようである。
【０１１６】
ＰＭＡ刺激によりＮＨＫによって放出されるＰＧＥ２のアッセイ
オリゴラムノシドを、細胞上清へのＰＧＥ２放出の抑制剤として評価した。これらの生成物をＮＨＫと１ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの同時存在下においた。４ウェルのＮＨＫへの刺激について各試験条件を評価した。
【０１１７】
以下の表８に要約した結果は、各細胞上清（刺激したものまたは刺激していないもの）から得た処理２４時間後の平均ＰＧＥ２濃度値（ｐｇ／ｍｌ）であり、細胞量（μｇで表す）として報告している。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
オリゴラムノシドは、どちらかといえば高濃度：２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌでＰＧＥ２の放出を抑制し、平均抑制は５０％〜６０％である。より低濃度では、その抑制力が低下し、０．１ｍｇ／ｍｌで無効となる。
【０１２０】
ヒト好中球によって放出される分子、ＬＴＢ４およびＰＧＥ２のアッセイ
正常ヒト血液から好中球を単離し、独自の方法により精製する。次いで、それらを、２種類の脂質分子（シクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ経路より生じるアラキドン酸誘導体、すなわち、ロイコトリエン ＬＴＢ４およびプロスタグランジン ＰＧＥ２）の放出を引き起こす刺激バッファーにより活性化する。この刺激バッファーは、特にＣａ２＋およびＭｇ２＋イオンを含有している。これらのアッセイはＥＬＩＳＡタイプの市販のアッセイキットにより実施する。
【０１２１】
オリゴラムノシドで処理した好中球の細胞生存性をトリパンブルーを使用して評価する。生存性は最高オリゴラムノシド濃度においてさえも申し分ない。
これらの結果は、同じ試験において刺激した細胞の２つの上清をアッセイした値の平均を示している。
脂質分子放出の抑制について得られた結果を以下の表９に要約している。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
インドメタシンをＰＧＥ２放出の特異的抑制薬として、ノルジヒドログアイアレチン酸をＬＴＢ４放出の特異的抑制薬として使用する。
この表から、オリゴラムノシドによる好中球の処理後に観察されるＰＧＥ２放出の非常に弱い抑制（１１％）があると結論付けることができる。しかしながら、濃度１ｍｇ／ｍｌのオリゴラムノシドの存在下ではＬＴＢ４放出の２６％抑制が得られ、確認されている。
【０１２４】
最後に、濃度１ｍｇ／ｍｌのオリゴラムノシドは、２つの独立試験においてＮＨＫによるＩＬ−８放出の２７％〜２８％抑制を確実に行うが、ＮＨＫによる６−ケトＰＧＦ１α放出については若干減少している。より高い濃度（１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ）のオリゴラムノシドはＮＨＫによるＰＧＥ２放出を平均して５０％〜６０％抑制している。２つの独立試験では、これらの同じ分子の濃度１ｍｇ／ｍｌのものが好中球によるＬＴＢ４放出の２１％および２６％の抑制に影響を与えている。これらの分子はヒト好中球によるＰＧＥ２放出には影響しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ラムノースの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【図２】オリゴラムノシドの存在下での末梢リンパ節に由来する内皮細胞の生存度。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴラムノシドの調製法であって、次の連続工程：
ａ）酸触媒の存在下、アセトニトリル中にて、単一反応工程でラムノースを自己縮合させて、その自己縮合により生成したオリゴラムノシドを沈殿させ、次いで
ｂ）工程ａ）後に得られるオリゴラムノシドを含む沈殿物を濾過により回収する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ａ）中の反応混合物の温度が、２０℃〜１２０℃の間、有利には３５℃〜７５℃の間にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸触媒が、塩酸、硫酸、リン酸、オルト−、メタ−およびパラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ルイス酸（特に塩化亜鉛および塩化第二鉄）、粘土酸（特にモンモリロナイトＫ−１０）、合成樹脂酸、ゼオライト、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水を、物理的にまたは化学的に排除する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
水排除技術が、炭酸塩、硫酸塩、塩化カルシウム、五酸化リン、モレキュラーシーブまたはこれらの種々の乾燥剤の組合せからなる群から選択される乾燥剤の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）が、アルゴンまたは窒素のような不活性ガス雰囲気下、大気圧にて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が、減圧にてオートクレーブ内で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前に、反応混合物を縮合反応温度〜０℃の間の範囲の温度まで冷却する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物を、周囲温度、有利には２０℃まで冷却する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）後に回収される沈殿物を、アセトニトリルで洗浄する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）後に得られる濾液に含まれるアセトニトリルを蒸発させて、オリゴラムノシドを含有する第２の沈殿物を回収する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られうる、オリゴラムノシドの混合物を含んでなる、組成物であって、
オリゴラムノシドが、２〜１２のラムノースモチーフ、有利には２〜９のラムノースモチーフを含む、組成物。
【請求項１３】
オリゴラムノシドの重合度の関数としてのオリゴラムノシドの分布が、ポアソン分布にほぼ従う、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含有する、医薬。
【請求項１６】
炎症性機序を調節するための、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
皮膚および／または粘膜のアレルギー、炎症もしくは免疫反応または病変を予防または処置するための、請求項１５または１６に記載の医薬。
【請求項１８】
炎症ストレスに関連する免疫応答を抑制するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１９】
白血球の活性化、ケラチノサイトからのサイトカインの分泌、ケラチノサイト過形成現象、皮膚の樹状細胞による抗原プロセシング、抗原提示細胞の成熟およびリンパ球と抗原提示細胞間の認識現象を抑制するための、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２０】
アトピー性および／または接触湿疹、炎症性皮膚疾患、刺激性皮膚炎、座瘡、自己免疫疾患、例えば、乾癬、光免疫抑制、白斑、粃糠疹、強皮症、慢性関節リウマチ、クローン病および移植片拒絶からなる群から選択される疾病を予防または処置するための、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
加齢に伴う慢性的な炎症問題およびそれらの影響を予防および処置するための、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２２】
アナフィラキシー過敏症、皮膚の色素異常症、皮膚の血管過剰増生および炎症性亀裂からなる群から選択される疾病を予防または処置するための、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
組成物または香料のアレルゲン性および／または刺激性を低減するための、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２４】
０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２５】
敏感であるか、炎症を起こしているか、耐性がないか、アレルギー体質であるか、老化しているか、危険な徴候を示しているか、皮膚バリア障害を示しているか、皮膚の発赤を示しているかまたは内因性老化、外因性老化もしくはホルモン老化に関連する非病理学的免疫学的不均衡を示している、皮膚および／または粘膜の化粧処置方法であって、
皮膚および／または粘膜に、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を適用することからなる、方法。
【請求項２６】
皮膚の自然老化を遅延させおよび／または外的攻撃を受けた皮膚の促進老化を予防するための、特に皮膚の光老化を予防するための化粧処置方法であって、
皮膚に、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を適用することからなる、方法。
【請求項１】
オリゴラムノシドの調製法であって、次の連続工程：
ａ）酸触媒の存在下、アセトニトリル中にて、単一反応工程でラムノースを自己縮合させて、その自己縮合により生成したオリゴラムノシドを沈殿させ、次いで
ｂ）工程ａ）後に得られるオリゴラムノシドを含む沈殿物を濾過により回収する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ａ）中の反応混合物の温度が、２０℃〜１２０℃の間、有利には３５℃〜７５℃の間にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸触媒が、塩酸、硫酸、リン酸、オルト−、メタ−およびパラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ルイス酸（特に塩化亜鉛および塩化第二鉄）、粘土酸（特にモンモリロナイトＫ−１０）、合成樹脂酸、ゼオライト、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の自己縮合反応中に生成する水を、物理的にまたは化学的に排除する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
水排除技術が、炭酸塩、硫酸塩、塩化カルシウム、五酸化リン、モレキュラーシーブまたはこれらの種々の乾燥剤の組合せからなる群から選択される乾燥剤の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）が、アルゴンまたは窒素のような不活性ガス雰囲気下、大気圧にて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が、減圧にてオートクレーブ内で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前に、反応混合物を縮合反応温度〜０℃の間の範囲の温度まで冷却する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物を、周囲温度、有利には２０℃まで冷却する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）後に回収される沈殿物を、アセトニトリルで洗浄する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）後に得られる濾液に含まれるアセトニトリルを蒸発させて、オリゴラムノシドを含有する第２の沈殿物を回収する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られうる、オリゴラムノシドの混合物を含んでなる、組成物であって、
オリゴラムノシドが、２〜１２のラムノースモチーフ、有利には２〜９のラムノースモチーフを含む、組成物。
【請求項１３】
オリゴラムノシドの重合度の関数としてのオリゴラムノシドの分布が、ポアソン分布にほぼ従う、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ラムノースモチーフにおいてそれらの水酸基の最大３個のものがグリコシド結合の形成に関与する、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含有する、医薬。
【請求項１６】
炎症性機序を調節するための、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
皮膚および／または粘膜のアレルギー、炎症もしくは免疫反応または病変を予防または処置するための、請求項１５または１６に記載の医薬。
【請求項１８】
炎症ストレスに関連する免疫応答を抑制するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１９】
白血球の活性化、ケラチノサイトからのサイトカインの分泌、ケラチノサイト過形成現象、皮膚の樹状細胞による抗原プロセシング、抗原提示細胞の成熟およびリンパ球と抗原提示細胞間の認識現象を抑制するための、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２０】
アトピー性および／または接触湿疹、炎症性皮膚疾患、刺激性皮膚炎、座瘡、自己免疫疾患、例えば、乾癬、光免疫抑制、白斑、粃糠疹、強皮症、慢性関節リウマチ、クローン病および移植片拒絶からなる群から選択される疾病を予防または処置するための、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
加齢に伴う慢性的な炎症問題およびそれらの影響を予防および処置するための、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２２】
アナフィラキシー過敏症、皮膚の色素異常症、皮膚の血管過剰増生および炎症性亀裂からなる群から選択される疾病を予防または処置するための、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
組成物または香料のアレルゲン性および／または刺激性を低減するための、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２４】
０．００１重量％〜５０重量％のオリゴラムノシドを含有する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２５】
敏感であるか、炎症を起こしているか、耐性がないか、アレルギー体質であるか、老化しているか、危険な徴候を示しているか、皮膚バリア障害を示しているか、皮膚の発赤を示しているかまたは内因性老化、外因性老化もしくはホルモン老化に関連する非病理学的免疫学的不均衡を示している、皮膚および／または粘膜の化粧処置方法であって、
皮膚および／または粘膜に、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を適用することからなる、方法。
【請求項２６】
皮膚の自然老化を遅延させおよび／または外的攻撃を受けた皮膚の促進老化を予防するための、特に皮膚の光老化を予防するための化粧処置方法であって、
皮膚に、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を適用することからなる、方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５０９９１２（Ｐ２００７−５０９９１２Ａ）
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３７３６６（Ｐ２００６−５３７３６６）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／００２７９３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２５５３
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５００１６６２３１）ピエール、ファブレ、デルモ‐コスメティーク (30)
【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／００２７９３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２５５３
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５００１６６２３１）ピエール、ファブレ、デルモ‐コスメティーク (30)
【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
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