オリゴ糖の製造方法
【課題】安全性の高いオリゴ糖、特に、フルクトースを末端に有するオリゴ糖の製造方法を提供すること。
【解決手段】カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む、オリゴ糖の製造方法。
【解決手段】カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む、オリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は、整腸作用等の様々な生理活性作用を有することから健康食品等に利用されている。オリゴ糖の製造方法としては、酵素を利用してショ糖、乳糖、デンプン等から合成する方法、植物由来の多糖類を酵素分解する方法、酸またはアルカリ条件で糖を異性化する方法、植物に含まれるオリゴ糖を抽出する方法等が挙げられる（例えば、特許文献１）。
【０００３】
上記製造方法のなかで、植物に含まれるオリゴ糖を抽出する方法は、得られるオリゴ糖の安全性が高く、さらには、経済的であるので好ましい。しかしながら、一般に、植物中におけるオリゴ糖の含有量は低く、原料として使用し得る植物種に制限があるのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５１６５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、安全性の高いオリゴ糖、特に、フルクトースを末端に有するオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はオリゴ糖の製造方法を提供する。該製造方法は、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む。
好ましい実施形態においては、上記カエデ科カエデ属樹木が、サトウカエデ、イタヤカエデ、クロカエデ、アメリカハナノキ、ギンカエデ、シロスジカエデ、アメリカヤマモミジ、およびノルウェーカエデからなる群より選択される少なくとも一種である。
好ましい実施形態においては、上記樹液が濃縮樹液である。
好ましい実施形態においては、上記濃縮樹液が、メープルシロップおよび／またはメープルシュガーである。
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む。
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、安全性の高いオリゴ糖、特に、フルクトースを末端に有するオリゴ糖の製造方法が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図２】実験例２のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】実験例３のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図４】実験例４のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図５】実験例５のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図６】実験例６のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図７】実験例７のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上記のとおり、オリゴ糖の抽出原料として使用し得る植物種は限られていたところ、本発明者らは、カエデ科カエデ属樹木の樹液中にオリゴ糖が含まれていること、特に４以上の単糖単位を有するオリゴ糖が比較的高濃度（例えば、主成分のショ糖１００ｍｏｌに対して５．５ｍｏｌ以上）で含まれていることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む。本発明の製造方法によれば、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取するので、得られるオリゴ糖は、天然成分由来であり、これまで長く広範囲で食されてきた食品に含まれている成分であることから、極めて安全性が高い。また、本発明の製造方法によれば、高価な酵素を必要としないので、低コストでオリゴ糖を得ることができる。なお、本明細書において、オリゴ糖とは、鎖中に３〜２０の単糖単位を有する重合糖を意味する。
【００１０】
上記カエデ科カエデ属樹木としては、その樹液がオリゴ糖を含有する限りにおいて、任意の適切な樹木が採用され得る。カエデ科カエデ属樹木としては、サトウカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、イタヤカエデ（Ａｃｅｒ ｍｏｎｏ）、クロカエデ（Ａｃｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、アメリカハナノキ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、ギンカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｎｕｍ）、シロスジカエデ（Ａｃｅｒ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｍ）、アメリカヤマモミジ（Ａｃｅｒ ｓｐｉｃａｔｕｍ）、および、ノルウェーカエデ（Ａｃｅｒ ｐｌａｔａｎｏｉｄｅｓ）が好ましく、サトウカエデがさらに好ましい。これらの樹液は、オリゴ糖を高濃度で含有するので、優れた生産効率でオリゴ糖が得られ得るからである。
【００１１】
上記樹液は、上記カエデ科カエデ属樹木の幹に穴を開け、溢出する樹液を採取することにより得られる未加工の樹液（以下、「メープルサップ」と称する場合がある）であってもよく、該未加工の樹液を濃縮して得られる濃縮樹液であってもよい。未加工の樹液およびその濃縮樹液は、樹木からの採取時期に応じて、含有成分比、色、香り等が異なるが、いずれの時期に採取したものであっても用いることができる。
【００１２】
樹液の濃縮方法としては、任意の適切な方法が採用され得る。例えば、加熱濃縮方法；減圧濃縮、凍結濃縮、膜濃縮等の非加熱濃縮方法；および、それらの組み合わせが挙げられる。加熱濃縮は、濃縮効率に優れる点で好ましい。非加熱濃縮は、オリゴ糖の熱分解のおそれがない点で好ましい。加熱濃縮時の加熱温度は、通常、９０〜１２０℃である。加熱時間は、所望の濃縮倍率等に応じて適切に設定され得る。
【００１３】
上記濃縮樹液の固形分濃度は、好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは１０重量％以上、特に好ましくは３０重量％以上である。濃縮樹液としては、実質的に水分を含まず、固形分濃度がほぼ１００重量％である濃縮物を用いてもよい。メープルサップの固形分濃度は通常２〜３重量％であるので、該固形分濃度を有する濃縮樹液を用いることにより、優れた生産効率でオリゴ糖が得られ得る。
【００１４】
上記濃縮樹液としては、メープルシロップ、メープルシュガー等が好ましく用いられ得る。これらは、広く市販されており、入手が容易であるとともに、高濃度でオリゴ糖を含有し得る。
【００１５】
上記樹液から採取されるオリゴ糖の重合度は、代表的には３〜１０、好ましくは４〜８である。
【００１６】
１つの実施形態において、上記樹液から採取されるオリゴ糖は、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む。該末端にフルクトースを有するオリゴ糖は、代表的には非還元糖である。該末端にフルクトースを有するオリゴ糖としては、例えば、ラフィノースが挙げられる。また、該末端にフルクトースを有するオリゴ糖の別の例としては、インベルターゼ消化により末端のフルクトースを脱離させた後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（以下、「ＰＭＰ」と称する場合がある）誘導体化して下記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第１のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。また、該末端にフルクトースを有するオリゴ糖のさらに別の例としては、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化して下記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第２のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。
［泳動条件（Ａ）］
キャピラリー ： 内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長（試料導入側キャピラリー末端から検出部までの長さ）５０ｃｍ）
印加電圧 ： １５ｋＶ
泳動溶液 ： ２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ： ２５℃
【００１７】
上記ＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度は、下記式（Ｉ）に示すとおり、各試料の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることによって求められる。すなわち、上記第１のオリゴ糖の相対移動度は、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第１のオリゴ糖の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることにより求められる。また、上記第２のオリゴ糖の相対移動度は、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第２のオリゴ糖の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることにより求められる。ここで、電気泳動移動度は、下記式（ＩＩ）から求められる。なお、式（ＩＩ）中、中性物質としては、メシチルオキシド、シンナミルアルコール等の任意の適切な中性物質が用いられ得る。
【００１８】
式（Ｉ）： ［相対移動度（μｅｐｒｅｌ）］＝［試料の電気泳動移動度］−［ＰＭＰ誘導体化Ｇｌｃの電気泳動移動度］
＝Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔ−1）Ｖ−1−Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔＩＳ−1）Ｖ−1
＝Ｌ・ｌ（ｔＩＳ−1−ｔ−1）Ｖ−1 （単位：ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１）
（Ｌ:キャピラリー全長（ｃｍ）、ｌ：有効長（ｃｍ）、ｔ０: 中性物質の移動時間（ｍｉｎ）、ｔ:試料の移動時間（ｍｉｎ）、ｔＩＳ: 標準物質（ここでは、ＰＭＰ誘導体化グルコース）の移動時間（ｍｉｎ）、Ｖ:印加電圧（ｋＶ））
【００１９】
式（ＩＩ）： 電気泳動移動度（μｅｐ）＝Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔ−1）Ｖ−1 （単位：ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１）
（Ｌ:キャピラリー全長（ｃｍ）、ｌ：有効長（ｃｍ）、ｔ０: 中性物質の移動時間（ｍｉｎ）、ｔ:試料の移動時間（ｍｉｎ）、Ｖ:印加電圧（ｋＶ））
【００２０】
キャピラリー電気泳動においては、電気浸透流速（ｌ／ｔ０）の影響によって再現性が低下する場合があるが、相対移動度を求める上記式（Ｉ）においては、数式の項から電気浸透流速（ｌ／ｔ０）が相殺され、除かれている。そのため、相対移動度は、信頼性が高い値として、エレクトロフェログラム上のピークの同定に有用である。また、式（ＩＩ）に示すとおり、通常、電気泳動移動度を算出する際には測定試料に中性物質を添加する必要がある。これに対し、相対移動度は、予め比較対象となる成分を含む測定試料を用いることにより、中性物質を別途添加することなく求められ得る。そのため、相対移動度は、中性物質の添加による分離の影響を受けず、通常の電気泳動移動度よりも信頼性が高いと考えられる。特に、本発明においては、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第１および第２のオリゴ糖と近い移動時間を有し、分離に関する挙動が類似するＰＭＰ誘導体化グルコースを標準物質として用いるので、得られる相対移動度の信頼性は十分に高いものである。
【００２１】
別の実施形態において、上記樹液から採取されるオリゴ糖は、末端にフルクトースを有さないオリゴ糖を含む。該末端にフルクトースを有さないオリゴ糖は、代表的には還元糖である。該末端にフルクトースを有さない還元性のオリゴ糖としては、例えば、インベルターゼ消化することなくＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第１’のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。また、該末端にフルクトースを有さない還元性のオリゴ糖の別の例としては、インベルターゼ消化することなくＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第２’のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。第１’のオリゴ糖および第２’のオリゴ糖はそれぞれ、上記第１のオリゴ糖および第２のオリゴ糖において末端のフルクトースが欠如したオリゴ糖であり得る。なお、それぞれのオリゴ糖の相対移動度の求め方は上述したとおりである。
【００２２】
上記樹液からオリゴ糖を採取する方法としては、任意の適切な方法が採用され得る。該採取方法としては、クロマトグラフィー法、限外ろ過法、再結晶法等が挙げられる。例えば、クロマトグラフィー法を用いる場合は、上記樹液をカラムクロマトグラフィーに供し、示差屈折計（ＲＩ）等の検出器でオリゴ糖を検出することにより、オリゴ糖を含む画分を分取することができる。これにより、粗精製または精製されたオリゴ糖が採取され得る。必要に応じて、上記樹液に任意の適切な溶媒を加え、所望の濃度に調整してからカラムクロマトグラフィーに供してもよい。溶媒は、代表的には水、緩衝液、親水性有機溶媒、またはこれらの混合物である。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。また、例えば、再結晶法を用いる場合は、水；メタノール、エタノール、アセトニトリル等の親水性（極性）有機溶媒；クロロホルム、ヘキサン等の非極性溶媒；またはこれらの混合液等から再結晶を行うことにより、粗精製または精製されたオリゴ糖を得ることができる。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、オリゴ糖が提供される。該オリゴ糖は、上記カエデ科カエデ属樹木の樹液に含まれるオリゴ糖である。該オリゴ糖は、インベルターゼ消化後、ＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）でキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第１のオリゴ糖）、および、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第２のオリゴ糖）を含み得る。また、該オリゴ糖は、インベルターゼ消化することなく、ＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）でキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第１’のオリゴ糖）、および、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第２’のオリゴ糖）を含み得る。これらのオリゴ糖は、カエデ科カエデ属樹木の樹液に含まれているので、該樹液から任意の適切な方法で採取することにより得られ得る。採取方法としては、上述したとおりである。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【００２５】
［実験例１］
サトウカエデのメープルサップ ８３μＬを、遠心式減圧装置を用いて常温で蒸発乾固し、得られた常温蒸発乾固物を１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５） ５０μＬに溶かした。得られた溶液に２００Ｕ/ｍｌ インベルターゼ水溶液（生化学工業社製、製品名「Ｉｎｖｅｒｔｅｒｓｅ（ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）」） ５μＬを加え、３７℃で３０分インキュベートした後、沸騰水浴中で１分加熱して酵素反応を停止させた。これにより、メープルサップのインベルターゼ消化物を得た。
【００２６】
上記メープルサップのインベルターゼ消化物を蒸発乾固した後、０．３Ｍ ＮａＯＨ ５０μＬを加えて再度溶解した。得られた溶液に、０．５ｍｏｌ/Ｌ １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（キシダ化学社製）のメタノール溶液を加えて混和し、７０℃で３０分反応させた。次いで、該反応液を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いて中和し、中和後の反応液に精製水 １００μＬを加えた。得られた溶液に対し、２００μＬのクロロホルムで３回抽出を行うことにより過剰試薬を除去し、遠心式減圧装置で溶媒を完全に蒸発させて固体反応物を得た。該固体反応物を精製水 １００μＬに溶解し、分析用試料とした。
【００２７】
上記分析用試料を以下の条件で、キャピラリー電気泳動に供した。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図１に示す。
［分析条件］
装置：キャピラリー電気泳動装置（大塚電子社製、製品名「ＣＡＰＩ−３１００」）
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ、ジーエルサイエンス社製、製品名「Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｔｕｂｉｎｇ」）
泳動溶液：２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
印加電圧：１５ｋＶ
検出波長：２４５ｎｍ
試料導入：落差法（２．５ｃｍ×３０ｓｅｃ）
分析温度：２５℃
上記泳動溶液は、四ホウ酸ナトリウム（ナカライテスク社製）を精製水中に溶解し、ｐＨメーターでｐＨを測定しながら水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０．５とした後にメスアップして正確にホウ酸濃度として２００ｍＭとすることにより、調製した。使用時は、脱気し、次いで、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過してから使用した。
【００２８】
［実験例２］
インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にして、キャピラリー電気泳動を行った。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図２に示す。
【００２９】
図１に示されるとおり、メープルサップのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも４つのピークが明確に認められた（※１〜※４で示したピーク）。図１中の「※１」で示したピーク面積（ピークレスポンス）は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約６％であった。また、図２に示されるとおり、メープルサップのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも４つのピークが明確に認められた（※１〜※４で示したピーク）。図１の※１〜※４で示したピークはそれぞれ、図２の※１〜※４で示したピークと検出時間がほぼ一致するものの、その面積は著しく大きかった。このことから、メープルサップ中には、末端にフルクトースを有する少なくとも４種類のオリゴ糖が比較的高濃度で含まれ、これらのオリゴ糖から末端のフルクトースが欠如したオリゴ糖が少量含まれることが示唆される。
【００３０】
図１および２中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図１および２中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３１】
［実験例３］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシロップ １０μＬを用いてインベルターゼ消化を行ったこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図３に示す。
【００３２】
［実験例４］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシロップ １０μＬを用いたこと、および、インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図４に示す。
【００３３】
図３に示されるとおり、メープルシロップのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図３中の「※１」で示したピーク面積は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約８％であった。また、図４に示されるとおり、メープルシロップのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図３の※１〜※３で示したピークはそれぞれ、図４の※１〜※３で示したピークと検出時間がほぼ一致していた。
【００３４】
図３および４中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図３および４中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３５】
［実験例５］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシュガー（メープルファームズジャパン社製、製造番号「２０１００４」） ３．５ｍｇを用いてインベルターゼ消化を行ったこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図５に示す。
【００３６】
［実験例６］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシュガー（メープルファームズジャパン社製、製造番号「２０１００４」） ３．５ｍｇを用いたこと、および、インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図６に示す。
【００３７】
図５に示されるとおり、メープルシュガーのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図５中の「※１」で示したピーク面積は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約７％であった。また、図６に示されるとおり、メープルシュガーのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図５の※１〜※３で示したピークはそれぞれ、図６の※１〜※３で示したピークと検出時間がほぼ一致していた。
【００３８】
図５および６中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図５および６中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３９】
［実験例７］
実験例１と同様にして得たメープルサップの分析試料、イソマルトペンタオース（Ｇｌｃがα１−６結合した五糖）標品（生化学工業社製）のＰＭＰ誘導体、および、マルトースシリーズ（Ｇｌｃがα１−４結合したオリゴ糖）（マルトヘプタオース（東京化成社製）、マルトテトラオース（シグマ社製）、およびマルトトリオース（和光純薬社製）を含む）標品のＰＭＰ誘導体を混合して得た試料を以下の条件でキャピラリー電気泳動に供した。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図７に示す。なお、図７中、ＧｌｃはＰＭＰ誘導体化グルコース、Ｍａｌ３はＰＭＰ誘導体化マルトトリオース、Ｍａｌ４はＰＭＰ誘導体化マルトテトラオース、Ｉｓｏｍａｌ５はＰＭＰ誘導体化イソマルトペンタオース、Ｍａｌ７は、ＰＭＰ誘導体化マルトヘプタオースを表す。
［分析条件］
装置：キャピラリー電気泳動装置（大塚電子社製、製品名「ＣＡＰＩ−３１００」）
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ、ジーエルサイエンス社製、製品名「Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｔｕｂｉｎｇ」）
泳動溶液：５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
印加電圧：２０ｋＶ
検出波長：２４５ｎｍ
試料導入：落差法（２．５ｃｍ×３０ｓｅｃ）
分析温度：２５℃
【００４０】
図７に示されるとおり、イソマルトペンタオースおよびマルトースシリーズ標品のＰＭＰ誘導体はすべて重合度が大きい順に検出され、メープルサップインベルターゼ消化物由来のオリゴ糖のピーク（「※」で示す）はイソマルトペンタオース（五糖）のピークとマルトテトラオース（四糖）のピークとの間に検出された。重合度が同じであるマルトースシリーズのオリゴ糖とイソマルトシリーズのオリゴ糖とでは、イソマルトシリーズのオリゴ糖の方が大きい泳動速度を有することを考慮すると、「※」のピークは四糖または五糖のオリゴ糖に相当することが予測される。したがって、インベルターゼ未消化のメープルサップは、末端にフルクトースを有し、五糖または六糖であるオリゴ糖を含むと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の製造方法によって得られるオリゴ糖は、安全性が高く、整腸作用、保湿作用等の高い機能性が期待されることから、飲食品、化粧品、飼料等の分野において好適に利用され得る。また、メープルシロップおよびメープルシュガーの風味に寄与することが期待されることから、飲食品の分野において特に好適に利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は、整腸作用等の様々な生理活性作用を有することから健康食品等に利用されている。オリゴ糖の製造方法としては、酵素を利用してショ糖、乳糖、デンプン等から合成する方法、植物由来の多糖類を酵素分解する方法、酸またはアルカリ条件で糖を異性化する方法、植物に含まれるオリゴ糖を抽出する方法等が挙げられる（例えば、特許文献１）。
【０００３】
上記製造方法のなかで、植物に含まれるオリゴ糖を抽出する方法は、得られるオリゴ糖の安全性が高く、さらには、経済的であるので好ましい。しかしながら、一般に、植物中におけるオリゴ糖の含有量は低く、原料として使用し得る植物種に制限があるのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５１６５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、安全性の高いオリゴ糖、特に、フルクトースを末端に有するオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はオリゴ糖の製造方法を提供する。該製造方法は、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む。
好ましい実施形態においては、上記カエデ科カエデ属樹木が、サトウカエデ、イタヤカエデ、クロカエデ、アメリカハナノキ、ギンカエデ、シロスジカエデ、アメリカヤマモミジ、およびノルウェーカエデからなる群より選択される少なくとも一種である。
好ましい実施形態においては、上記樹液が濃縮樹液である。
好ましい実施形態においては、上記濃縮樹液が、メープルシロップおよび／またはメープルシュガーである。
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む。
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
好ましい実施形態においては、上記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、安全性の高いオリゴ糖、特に、フルクトースを末端に有するオリゴ糖の製造方法が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図２】実験例２のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】実験例３のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図４】実験例４のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図５】実験例５のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図６】実験例６のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【図７】実験例７のキャピラリー電気泳動で得られたエレクトロフェログラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上記のとおり、オリゴ糖の抽出原料として使用し得る植物種は限られていたところ、本発明者らは、カエデ科カエデ属樹木の樹液中にオリゴ糖が含まれていること、特に４以上の単糖単位を有するオリゴ糖が比較的高濃度（例えば、主成分のショ糖１００ｍｏｌに対して５．５ｍｏｌ以上）で含まれていることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む。本発明の製造方法によれば、カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取するので、得られるオリゴ糖は、天然成分由来であり、これまで長く広範囲で食されてきた食品に含まれている成分であることから、極めて安全性が高い。また、本発明の製造方法によれば、高価な酵素を必要としないので、低コストでオリゴ糖を得ることができる。なお、本明細書において、オリゴ糖とは、鎖中に３〜２０の単糖単位を有する重合糖を意味する。
【００１０】
上記カエデ科カエデ属樹木としては、その樹液がオリゴ糖を含有する限りにおいて、任意の適切な樹木が採用され得る。カエデ科カエデ属樹木としては、サトウカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、イタヤカエデ（Ａｃｅｒ ｍｏｎｏ）、クロカエデ（Ａｃｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、アメリカハナノキ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、ギンカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｎｕｍ）、シロスジカエデ（Ａｃｅｒ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｍ）、アメリカヤマモミジ（Ａｃｅｒ ｓｐｉｃａｔｕｍ）、および、ノルウェーカエデ（Ａｃｅｒ ｐｌａｔａｎｏｉｄｅｓ）が好ましく、サトウカエデがさらに好ましい。これらの樹液は、オリゴ糖を高濃度で含有するので、優れた生産効率でオリゴ糖が得られ得るからである。
【００１１】
上記樹液は、上記カエデ科カエデ属樹木の幹に穴を開け、溢出する樹液を採取することにより得られる未加工の樹液（以下、「メープルサップ」と称する場合がある）であってもよく、該未加工の樹液を濃縮して得られる濃縮樹液であってもよい。未加工の樹液およびその濃縮樹液は、樹木からの採取時期に応じて、含有成分比、色、香り等が異なるが、いずれの時期に採取したものであっても用いることができる。
【００１２】
樹液の濃縮方法としては、任意の適切な方法が採用され得る。例えば、加熱濃縮方法；減圧濃縮、凍結濃縮、膜濃縮等の非加熱濃縮方法；および、それらの組み合わせが挙げられる。加熱濃縮は、濃縮効率に優れる点で好ましい。非加熱濃縮は、オリゴ糖の熱分解のおそれがない点で好ましい。加熱濃縮時の加熱温度は、通常、９０〜１２０℃である。加熱時間は、所望の濃縮倍率等に応じて適切に設定され得る。
【００１３】
上記濃縮樹液の固形分濃度は、好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは１０重量％以上、特に好ましくは３０重量％以上である。濃縮樹液としては、実質的に水分を含まず、固形分濃度がほぼ１００重量％である濃縮物を用いてもよい。メープルサップの固形分濃度は通常２〜３重量％であるので、該固形分濃度を有する濃縮樹液を用いることにより、優れた生産効率でオリゴ糖が得られ得る。
【００１４】
上記濃縮樹液としては、メープルシロップ、メープルシュガー等が好ましく用いられ得る。これらは、広く市販されており、入手が容易であるとともに、高濃度でオリゴ糖を含有し得る。
【００１５】
上記樹液から採取されるオリゴ糖の重合度は、代表的には３〜１０、好ましくは４〜８である。
【００１６】
１つの実施形態において、上記樹液から採取されるオリゴ糖は、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む。該末端にフルクトースを有するオリゴ糖は、代表的には非還元糖である。該末端にフルクトースを有するオリゴ糖としては、例えば、ラフィノースが挙げられる。また、該末端にフルクトースを有するオリゴ糖の別の例としては、インベルターゼ消化により末端のフルクトースを脱離させた後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（以下、「ＰＭＰ」と称する場合がある）誘導体化して下記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第１のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。また、該末端にフルクトースを有するオリゴ糖のさらに別の例としては、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化して下記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第２のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。
［泳動条件（Ａ）］
キャピラリー ： 内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長（試料導入側キャピラリー末端から検出部までの長さ）５０ｃｍ）
印加電圧 ： １５ｋＶ
泳動溶液 ： ２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ： ２５℃
【００１７】
上記ＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度は、下記式（Ｉ）に示すとおり、各試料の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることによって求められる。すなわち、上記第１のオリゴ糖の相対移動度は、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第１のオリゴ糖の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることにより求められる。また、上記第２のオリゴ糖の相対移動度は、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第２のオリゴ糖の電気泳動移動度からＰＭＰ誘導体化グルコースの電気泳動移動度を減ずることにより求められる。ここで、電気泳動移動度は、下記式（ＩＩ）から求められる。なお、式（ＩＩ）中、中性物質としては、メシチルオキシド、シンナミルアルコール等の任意の適切な中性物質が用いられ得る。
【００１８】
式（Ｉ）： ［相対移動度（μｅｐｒｅｌ）］＝［試料の電気泳動移動度］−［ＰＭＰ誘導体化Ｇｌｃの電気泳動移動度］
＝Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔ−1）Ｖ−1−Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔＩＳ−1）Ｖ−1
＝Ｌ・ｌ（ｔＩＳ−1−ｔ−1）Ｖ−1 （単位：ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１）
（Ｌ:キャピラリー全長（ｃｍ）、ｌ：有効長（ｃｍ）、ｔ０: 中性物質の移動時間（ｍｉｎ）、ｔ:試料の移動時間（ｍｉｎ）、ｔＩＳ: 標準物質（ここでは、ＰＭＰ誘導体化グルコース）の移動時間（ｍｉｎ）、Ｖ:印加電圧（ｋＶ））
【００１９】
式（ＩＩ）： 電気泳動移動度（μｅｐ）＝Ｌ・ｌ（ｔ０−1−ｔ−1）Ｖ−1 （単位：ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１）
（Ｌ:キャピラリー全長（ｃｍ）、ｌ：有効長（ｃｍ）、ｔ０: 中性物質の移動時間（ｍｉｎ）、ｔ:試料の移動時間（ｍｉｎ）、Ｖ:印加電圧（ｋＶ））
【００２０】
キャピラリー電気泳動においては、電気浸透流速（ｌ／ｔ０）の影響によって再現性が低下する場合があるが、相対移動度を求める上記式（Ｉ）においては、数式の項から電気浸透流速（ｌ／ｔ０）が相殺され、除かれている。そのため、相対移動度は、信頼性が高い値として、エレクトロフェログラム上のピークの同定に有用である。また、式（ＩＩ）に示すとおり、通常、電気泳動移動度を算出する際には測定試料に中性物質を添加する必要がある。これに対し、相対移動度は、予め比較対象となる成分を含む測定試料を用いることにより、中性物質を別途添加することなく求められ得る。そのため、相対移動度は、中性物質の添加による分離の影響を受けず、通常の電気泳動移動度よりも信頼性が高いと考えられる。特に、本発明においては、インベルターゼ消化およびＰＭＰ誘導体化した第１および第２のオリゴ糖と近い移動時間を有し、分離に関する挙動が類似するＰＭＰ誘導体化グルコースを標準物質として用いるので、得られる相対移動度の信頼性は十分に高いものである。
【００２１】
別の実施形態において、上記樹液から採取されるオリゴ糖は、末端にフルクトースを有さないオリゴ糖を含む。該末端にフルクトースを有さないオリゴ糖は、代表的には還元糖である。該末端にフルクトースを有さない還元性のオリゴ糖としては、例えば、インベルターゼ消化することなくＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第１’のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。また、該末端にフルクトースを有さない還元性のオリゴ糖の別の例としては、インベルターゼ消化することなくＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）のキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（以下、「第２’のオリゴ糖」と称する場合がある）が挙げられる。第１’のオリゴ糖および第２’のオリゴ糖はそれぞれ、上記第１のオリゴ糖および第２のオリゴ糖において末端のフルクトースが欠如したオリゴ糖であり得る。なお、それぞれのオリゴ糖の相対移動度の求め方は上述したとおりである。
【００２２】
上記樹液からオリゴ糖を採取する方法としては、任意の適切な方法が採用され得る。該採取方法としては、クロマトグラフィー法、限外ろ過法、再結晶法等が挙げられる。例えば、クロマトグラフィー法を用いる場合は、上記樹液をカラムクロマトグラフィーに供し、示差屈折計（ＲＩ）等の検出器でオリゴ糖を検出することにより、オリゴ糖を含む画分を分取することができる。これにより、粗精製または精製されたオリゴ糖が採取され得る。必要に応じて、上記樹液に任意の適切な溶媒を加え、所望の濃度に調整してからカラムクロマトグラフィーに供してもよい。溶媒は、代表的には水、緩衝液、親水性有機溶媒、またはこれらの混合物である。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。また、例えば、再結晶法を用いる場合は、水；メタノール、エタノール、アセトニトリル等の親水性（極性）有機溶媒；クロロホルム、ヘキサン等の非極性溶媒；またはこれらの混合液等から再結晶を行うことにより、粗精製または精製されたオリゴ糖を得ることができる。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、オリゴ糖が提供される。該オリゴ糖は、上記カエデ科カエデ属樹木の樹液に含まれるオリゴ糖である。該オリゴ糖は、インベルターゼ消化後、ＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）でキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第１のオリゴ糖）、および、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第２のオリゴ糖）を含み得る。また、該オリゴ糖は、インベルターゼ消化することなく、ＰＭＰ誘導体化して上記泳動条件（Ａ）でキャピラリー電気泳動に供したときに、ＰＭＰ誘導体化グルコースに対して、−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第１’のオリゴ糖）、および、−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖（第２’のオリゴ糖）を含み得る。これらのオリゴ糖は、カエデ科カエデ属樹木の樹液に含まれているので、該樹液から任意の適切な方法で採取することにより得られ得る。採取方法としては、上述したとおりである。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【００２５】
［実験例１］
サトウカエデのメープルサップ ８３μＬを、遠心式減圧装置を用いて常温で蒸発乾固し、得られた常温蒸発乾固物を１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５） ５０μＬに溶かした。得られた溶液に２００Ｕ/ｍｌ インベルターゼ水溶液（生化学工業社製、製品名「Ｉｎｖｅｒｔｅｒｓｅ（ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）」） ５μＬを加え、３７℃で３０分インキュベートした後、沸騰水浴中で１分加熱して酵素反応を停止させた。これにより、メープルサップのインベルターゼ消化物を得た。
【００２６】
上記メープルサップのインベルターゼ消化物を蒸発乾固した後、０．３Ｍ ＮａＯＨ ５０μＬを加えて再度溶解した。得られた溶液に、０．５ｍｏｌ/Ｌ １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（キシダ化学社製）のメタノール溶液を加えて混和し、７０℃で３０分反応させた。次いで、該反応液を０．３ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いて中和し、中和後の反応液に精製水 １００μＬを加えた。得られた溶液に対し、２００μＬのクロロホルムで３回抽出を行うことにより過剰試薬を除去し、遠心式減圧装置で溶媒を完全に蒸発させて固体反応物を得た。該固体反応物を精製水 １００μＬに溶解し、分析用試料とした。
【００２７】
上記分析用試料を以下の条件で、キャピラリー電気泳動に供した。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図１に示す。
［分析条件］
装置：キャピラリー電気泳動装置（大塚電子社製、製品名「ＣＡＰＩ−３１００」）
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ、ジーエルサイエンス社製、製品名「Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｔｕｂｉｎｇ」）
泳動溶液：２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
印加電圧：１５ｋＶ
検出波長：２４５ｎｍ
試料導入：落差法（２．５ｃｍ×３０ｓｅｃ）
分析温度：２５℃
上記泳動溶液は、四ホウ酸ナトリウム（ナカライテスク社製）を精製水中に溶解し、ｐＨメーターでｐＨを測定しながら水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０．５とした後にメスアップして正確にホウ酸濃度として２００ｍＭとすることにより、調製した。使用時は、脱気し、次いで、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過してから使用した。
【００２８】
［実験例２］
インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にして、キャピラリー電気泳動を行った。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図２に示す。
【００２９】
図１に示されるとおり、メープルサップのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも４つのピークが明確に認められた（※１〜※４で示したピーク）。図１中の「※１」で示したピーク面積（ピークレスポンス）は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約６％であった。また、図２に示されるとおり、メープルサップのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも４つのピークが明確に認められた（※１〜※４で示したピーク）。図１の※１〜※４で示したピークはそれぞれ、図２の※１〜※４で示したピークと検出時間がほぼ一致するものの、その面積は著しく大きかった。このことから、メープルサップ中には、末端にフルクトースを有する少なくとも４種類のオリゴ糖が比較的高濃度で含まれ、これらのオリゴ糖から末端のフルクトースが欠如したオリゴ糖が少量含まれることが示唆される。
【００３０】
図１および２中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図１および２中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３１】
［実験例３］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシロップ １０μＬを用いてインベルターゼ消化を行ったこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図３に示す。
【００３２】
［実験例４］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシロップ １０μＬを用いたこと、および、インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図４に示す。
【００３３】
図３に示されるとおり、メープルシロップのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図３中の「※１」で示したピーク面積は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約８％であった。また、図４に示されるとおり、メープルシロップのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図３の※１〜※３で示したピークはそれぞれ、図４の※１〜※３で示したピークと検出時間がほぼ一致していた。
【００３４】
図３および４中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図３および４中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３５】
［実験例５］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシュガー（メープルファームズジャパン社製、製造番号「２０１００４」） ３．５ｍｇを用いてインベルターゼ消化を行ったこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図５に示す。
【００３６】
［実験例６］
メープルサップ ８３μＬの常温蒸発乾固物の代わりにメープルシュガー（メープルファームズジャパン社製、製造番号「２０１００４」） ３．５ｍｇを用いたこと、および、インベルターゼ消化しないこと以外は実験例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図６に示す。
【００３７】
図５に示されるとおり、メープルシュガーのインベルターゼ消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図５中の「※１」で示したピーク面積は、ＰＭＰ誘導体化グルコースのピーク面積に対して、約７％であった。また、図６に示されるとおり、メープルシュガーのインベルターゼ未消化物のＰＭＰ誘導体を電気泳動して得られたエレクトロフェログラムには、オリゴ糖に相当する少なくとも３つのピークが明確に認められた（※１〜※３で示したピーク）。図５の※１〜※３で示したピークはそれぞれ、図６の※１〜※３で示したピークと検出時間がほぼ一致していた。
【００３８】
図５および６中のピーク「※１」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。また、図５および６中のピーク「※２」に相当するＰＭＰ誘導体化オリゴ糖のＰＭＰ誘導体化グルコースに対する相対移動度を求めたところ、これらの相対移動度はともに−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の範囲内であった。
【００３９】
［実験例７］
実験例１と同様にして得たメープルサップの分析試料、イソマルトペンタオース（Ｇｌｃがα１−６結合した五糖）標品（生化学工業社製）のＰＭＰ誘導体、および、マルトースシリーズ（Ｇｌｃがα１−４結合したオリゴ糖）（マルトヘプタオース（東京化成社製）、マルトテトラオース（シグマ社製）、およびマルトトリオース（和光純薬社製）を含む）標品のＰＭＰ誘導体を混合して得た試料を以下の条件でキャピラリー電気泳動に供した。該電気泳動で得られたエレクトロフェログラムを図７に示す。なお、図７中、ＧｌｃはＰＭＰ誘導体化グルコース、Ｍａｌ３はＰＭＰ誘導体化マルトトリオース、Ｍａｌ４はＰＭＰ誘導体化マルトテトラオース、Ｉｓｏｍａｌ５はＰＭＰ誘導体化イソマルトペンタオース、Ｍａｌ７は、ＰＭＰ誘導体化マルトヘプタオースを表す。
［分析条件］
装置：キャピラリー電気泳動装置（大塚電子社製、製品名「ＣＡＰＩ−３１００」）
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ、ジーエルサイエンス社製、製品名「Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｔｕｂｉｎｇ」）
泳動溶液：５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
印加電圧：２０ｋＶ
検出波長：２４５ｎｍ
試料導入：落差法（２．５ｃｍ×３０ｓｅｃ）
分析温度：２５℃
【００４０】
図７に示されるとおり、イソマルトペンタオースおよびマルトースシリーズ標品のＰＭＰ誘導体はすべて重合度が大きい順に検出され、メープルサップインベルターゼ消化物由来のオリゴ糖のピーク（「※」で示す）はイソマルトペンタオース（五糖）のピークとマルトテトラオース（四糖）のピークとの間に検出された。重合度が同じであるマルトースシリーズのオリゴ糖とイソマルトシリーズのオリゴ糖とでは、イソマルトシリーズのオリゴ糖の方が大きい泳動速度を有することを考慮すると、「※」のピークは四糖または五糖のオリゴ糖に相当することが予測される。したがって、インベルターゼ未消化のメープルサップは、末端にフルクトースを有し、五糖または六糖であるオリゴ糖を含むと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の製造方法によって得られるオリゴ糖は、安全性が高く、整腸作用、保湿作用等の高い機能性が期待されることから、飲食品、化粧品、飼料等の分野において好適に利用され得る。また、メープルシロップおよびメープルシュガーの風味に寄与することが期待されることから、飲食品の分野において特に好適に利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む、オリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記カエデ科カエデ属樹木が、サトウカエデ、イタヤカエデ、クロカエデ、アメリカハナノキ、ギンカエデ、シロスジカエデ、アメリカヤマモミジ、およびノルウェーカエデからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記樹液が濃縮樹液である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記濃縮樹液が、メープルシロップおよび／またはメープルシュガーである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記採取されるオリゴ糖が、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項７】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項８】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項９】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項１】
カエデ科カエデ属樹木の樹液からオリゴ糖を採取する工程を含む、オリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記カエデ科カエデ属樹木が、サトウカエデ、イタヤカエデ、クロカエデ、アメリカハナノキ、ギンカエデ、シロスジカエデ、アメリカヤマモミジ、およびノルウェーカエデからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記樹液が濃縮樹液である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記濃縮樹液が、メープルシロップおよび／またはメープルシュガーである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記採取されるオリゴ糖が、末端にフルクトースを有するオリゴ糖を含む、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項７】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化後、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項８】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−３．２〜−２．９ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【請求項９】
前記採取されるオリゴ糖が、インベルターゼ消化することなく、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化して下記泳動条件でキャピラリー電気泳動に供したときに、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン誘導体化グルコースに対して−２．５〜−２．１ｃｍ２ｍｉｎ−１ｋＶ−１の相対移動度を有するオリゴ糖を含む、請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
［泳動条件］
キャピラリー：内面未修飾のフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、長さ６２ｃｍ、有効長５０ｃｍ）
印加電圧 ：１５ｋＶ
泳動溶液 ：２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）
分析温度 ：２５℃
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−４６６１８（Ｐ２０１１−４６６１８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９４２３５（Ｐ２００９−１９４２３５）
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（５９５１４８９８１）株式会社メープルファームズジャパン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（５９５１４８９８１）株式会社メープルファームズジャパン (1)
【Ｆターム（参考）】
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