カゼイン由来のプロテアーゼ阻害ペプチド
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害する、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物と、病態を治療又は予防するためのこれらの化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物の使用とに関する。特に病態は歯周病であり得る。化合物、ペプチド及びペプチド模倣物は様々なカゼイン、例えばα−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインから誘導され得る。本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物が阻害するプロテアーゼ活性には、ジンジパインのプロテアーゼ活性が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害する、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物と、病態を治療又は予防するためのこれらの化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物の使用とに関する。特に病態は歯周病であり得る。
【０００２】
本願はオーストラリア仮出願第２００９９０２８４１号（この出願はその全体が参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
歯周病は歯の支持組織の細菌関連の炎症性疾患であり、重大な公衆衛生上の問題である。ヒト集団のほぼ全てが或る程度歯周病に罹患している。１９８９年の米国の歯科衛生調査によると、研究対象の集団の８５％が歯周病を有するという報告があった。歯周病の主形態は歯肉縁での歯垢の非特異的な集積に関連する歯肉炎である。歯周病のより破壊的な形態（歯周炎）は特定のグラム陰性細菌による歯肉縁下感染に関連する。この疾患に関与する主な細菌性病原体は「レッドコンプレックス」としても知られ、該レッドコンプレックスは、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）及びトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）からなる。ポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）は慢性歯周炎における主要病因である。
【０００４】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要病原性因子は、その細胞外システインプロテアーゼ（まとめてジンジパインとして知られる）であると考えられている。最も一般的なものはＲｇｐＡ及びＲｇｐＢ（Ａｒｇ−ジンジパイン）及びＫｇｐ（Ｌｙｓ−ジンジパイン）である。Ａｒｇ−ジンジパインはＡｒｇ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断し、Ｌｙｓ−ジンジパインはＬｙｓ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断する。
【０００５】
これらの細胞結合型システインプロテアーゼは、増殖並びに生存及び病原性に関する他の内因性機能及び外因性機能のためのペプチドをもたらすタンパク質の分解に重要であると考えられている。生存及び病原性に関するこれらの機能の幾つかは、宿主組織への細菌付着、血球凝集、並びに細菌の細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質のプロセシングであり得る。ＲｇｐＡ及びＫｇｐの触媒ドメインは一連の非共有的に結合した配列関連の血液凝集因子／付着因子ドメインを有する細胞表面上で複合体として結合することができるが、ＲｇｐＢはプロテアーゼ付着因子複合体の一部として存在するのではないことが分かっており、触媒ドメインのみからなっている可能性がある。
【０００６】
ジンジパインを阻害することが見出されている天然由来型及び合成型の両方の分子が幾つか存在する。ジンジパインの天然阻害剤は生物活性産物のスクリーニングにより見出されており、幾つかの合成阻害剤はプロテアーゼ活性部位及びプロテアーゼ阻害剤の構造に基づき合成されている。例えば、Ａｒｇ−ジンジパイン阻害剤及びＬｙｓ−ジンジパイン阻害剤はクランベリー果汁［具体的にはポリフェノール、及び高分子量の非透析性成分（ＮＤＭ）］、緑茶カテキン及びニンニクから単離されている。これらの阻害剤は、合成型であるか、生産するのにコストがかかるか、許容できない風味があるか、又はヒトでの使用が認可されていない等といった１つ又は複数の問題を抱えている。
【０００７】
様々な疾患、特に歯周病の発病に関与する細菌酵素のより良好な又は代替となる阻害剤が必要とされている。
【０００８】
本明細書における任意の従来技術に対する参考文献は、この従来技術がオーストラリアにおける共通の一般知識若しくは権限（jurisdiction）の一部を形成するという、又はこの従来技術が当業者によって関連があるものと確認され、理解され、かつみなされることを合理的に期待することができるという承認又は任意の形態の示唆ではなく、またそのように解釈すべきでないものとする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物がカゼイン又はその断片のアミノ酸配列を含む、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が提供される。１つの実施の形態では、酵素は細胞外プロテアーゼであり得る。特定の実施の形態では、細胞外プロテアーゼはシステインプロテアーゼ、例えばジンジパインである。或る特定の実施の形態では、プロテアーゼはＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ又はＫｇｐである。
【００１０】
或る特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号１）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ（配列番号２）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号４）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
更なる実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号６）、
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号７）、
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号８）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ（配列番号９）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号１０）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１１）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１２）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１３）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号１４）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１５）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１６）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１７）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１８）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１９）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２０）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２１）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号２２）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２３）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２４）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２５）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号２６）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２７）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２８）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２９）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３０）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３１）、及び
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３２）
からなる更なる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は配列番号１〜配列番号３２における保存的置換体を含む。これらの置換は以下で更に記載する。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣物の長さは少なくとも１３アミノ酸である。他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは７０アミノ酸以下である。或る特定の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは１５アミノ酸〜６１アミノ酸である。他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは２０アミノ酸〜３０アミノ酸である。
【００１４】
更なる実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はリン酸化又はグリコシル化されていない。別の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は翻訳後修飾されている。例えば、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はリン酸化のみ、又はグリコシル化のみ、又はリン酸化及びグリコシル化の両方を受けていてもよい。１つ又は複数の残基がこのように修飾されていてもよい。
【００１５】
特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号３２（端を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。これらの実施の形態では、配列番号１〜配列番号３２、及び更なるアミノ酸残基を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、配列番号１〜配列番号３２「から本質的になる」であろう。同様に、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、対応する配列番号より短くても配列番号１〜配列番号３２のうちの１つ「から本質的になる」。このようなときにはこれらの実施の形態は全長のカゼイン配列を含まない。
【００１６】
他の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はこのようなアミノ酸配列から本質的になる。幾つかの実施の形態では、該群は配列番号１〜配列番号５からなる。
【００１７】
或る特定の実施の形態では、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物がヘリックス構造を形成することが可能であるアミノ酸配列を含み、細菌酵素の活性を非競合的に阻害、低減又は阻止する、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が提供される。
【００１８】
他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、酵素が基質と相互作用する場合、酵素、基質又は酵素及び基質の両方と結合すること等により、酵素が基質から生成物を生成するのを阻害、低減又は阻止する。
【００１９】
別の実施の形態では、本発明は、必要とする患者の口腔においてポルフィロモナス・ジンジバリス酵素の活性を阻害、低減又は阻止するのに使用される治療用ペプチドであって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、又はそのグリコシル化変異体及びリン酸化変異体、並びにその欠失突然変異体及び置換突然変異体からなる群から選択される、治療用ペプチドを提供する。幾つかの実施の形態では、配列番号１の変異体及び突然変異体は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、配列番号２の変異体及び突然変異体は、配列番号４及び配列番号９からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、配列番号３の変異体及び突然変異体は、配列番号５及び配列番号１０〜配列番号３２からなる群から選択される。
【００２０】
或る特定の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、細菌酵素を阻害する組成物が提供される。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００２１】
１つの実施の形態では、１つ又は複数の病態を治療又は予防する方法であって、有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を、必要とする被験体に投与することを含む、１つ又は複数の病態を治療又は予防する方法が提供される。１つの実施の形態では、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物は被験体の歯茎に直接投与される。１つの実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品及び他の食品等の口に適用可能な組成物の一部であり得る。治療又は予防に好適な病態又は疾患の例としては歯周病及び齲蝕が挙げられる。ジンジパインの酵素活性により引き起こされる又はジンジパインの酵素活性に関連する任意の疾患又は病態は、本発明による治療又は予防に好適であり得る。
【００２２】
治療を必要とする又は歯周病若しくは齲蝕を発症する危険性のある被験体は動物である。幾つかの実施の形態では、被験体はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ又はウシである。
【００２３】
別の実施の形態では、被験体において歯周病の症状を治療又は緩和する方法であって、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を被験体に投与することを含む、被験体において歯周病の症状を治療又は緩和する方法が提供される。
【００２４】
幾つかの実施の形態によれば、細菌酵素を阻害する方法であって、酵素と、配列番号１〜配列番号５及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば配列番号１〜配列番号３２及びそれと少なくとも６０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物とを接触させることを含む、細菌酵素を阻害する方法が提供される。特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸配列は全長のカゼイン配列を含まない。これらの実施の形態のいずれかによれば、細菌酵素はジンジパインであってもよく、例えばジンジパインはポルフィロモナス・ジンジバリス由来である。
【００２５】
これらの実施の形態のいずれかによれば、接触する工程は、組成物を、それを必要とする被験体（例えばヒト）、例えば歯周病若しくは齲蝕を治療する必要がある、又は歯周病若しくは齲蝕を発症する危険性のある被験体に投与することを含み得る。これらの実施の形態のいずれかによれば、該方法は歯周病又は齲蝕の症状を治療又は緩和するのに効果的であり得る。
【００２６】
別の実施の形態では、本発明の方法は、抗炎症剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリスにより発現されるタンパク質と結合する抗体、抗生物質、及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を投与することを更に含む。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。抗炎症剤は非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。ＮＳＡＩＤの例としてはシクロオキシゲナーゼを阻害する化合物が挙げられる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、イブプロフェン及びナプロキセンが挙げられる。バイオフィルム抑制剤の一例はフマル酸レダクターゼの阻害剤、例えばオキサンテルである。
【００２７】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして本明細書中で特定された、他の病態の治療又は予防用の薬剤の調製における有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態）の治療又は予防用の医薬組成物も提供する。組成物は、抗炎症剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリス由来のタンパク質と結合する抗体、抗生物質、及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を更に含むことができる。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。
【００２９】
幾つかの実施の形態によれば、被験体において細菌酵素を阻害するのに有効な量の細菌酵素を阻害するカゼイン又はその断片のアミノ酸配列、例えば配列番号１〜配列番号５及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つ、又は配列番号１〜配列番号３２及びそれらと少なくとも６０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む医薬組成物が提供される。特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸配列は全長のカゼイン配列を含まない。
【００３０】
これらの実施の形態のいずれかによれば、組成物は、二価カチオン、例えば亜鉛、並びに／又は抗炎症剤、抗生物質、バイオフィルム抑制剤、及びポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリスにより発現されるタンパク質と結合する抗体からなる群から選択される作用物質を更に含み得る。
【００３１】
これらの実施の形態のいずれかによれば、組成物は歯茎への局所投与用に構築することができ、かつ／又は単位剤形で提供することができる。
【００３２】
別の実施の形態では、本発明は、活性成分として本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態）の治療又は予防用の組成物を提供する。組成物は二価カチオンを更に含むことができる。
【００３３】
別の実施の形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を主成分として含む医薬組成物を提供する。組成物は、例えば歯周病及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態の治療又は予防に使用することができる。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００３４】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態の治療又は予防に使用される本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００３５】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病の治療又は予防に使用される、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物を提供する。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、（ａ）本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを備える部品のキットを提供する。
【００３７】
或る特定の実施の形態では、二価カチオンは、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｎ２＋及びＭｎ２＋からなる群から選択される。また、二価カチオンはＳｎＦ＋及びＣｕＦ＋のようなフッ化物に関連するものであり得る。幾つかの実施の形態では、二価カチオンはＣａ２＋又はＺｎ２＋である。
【００３８】
或る特定の実施の形態では、二価カチオンと化合物、ペプチド又はペプチド模倣物との比は１．０：２．０〜１．０：１０．０の範囲、例えば１．０：４．０の範囲である。
【００３９】
本明細書で使用されるように、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語及びその用語の変化形、例えば「含む（"comprising", "comprises" and "comprised"）」は、更なる添加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）
【化１】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０５）
【化２】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）
【化３】
ペプチド及びκ−カゼイン（１０９〜１３７）
【化４】
ペプチドの存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。アッセイにおける細胞の平均数は４．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬである。
【図２】合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）
【化５】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）
【化６】
ペプチド及びκ−カゼイン（１０９〜１３７）
【化７】
ペプチドの存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。アッセイにおける細胞の平均数は４．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬである。
【図３】１００μＭの合成型のカゼイン由来ペプチドの存在下における精製プロテアーゼ複合体のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性
【化８】
及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性
【化９】
を示す図である。６回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図４】幾つかの濃度のκ−カゼイン（１０９〜１３７）の存在下における精製ＲｇｐＢのタンパク質分解活性を示す図である。ＲｇｐＢの濃度は０．２３μｇ／ｍＬである。
【図５】蛍光ＢＳＡ基質（ＤＱＴＭ ＢＳＡ）及び５００μＭのカゼインペプチドを用いて測定されたポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なプロテイナーゼ活性及びＬｙｓ特異的なプロテイナーゼ活性を示す図である。κ−カゼイン（１０６〜１６９）は天然由来型であり、他のκ−カゼインペプチドは合成型であった。誤差バーを３つの技術的反復測定結果及び２つの生物学的反復測定結果の標準偏差として算出した。全てのペプチドが対照の値と有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。κ−カゼイン（１１７〜１２３）及びκ−カゼイン（１２７〜１３７）は互いに有意に（ｐ＜０．０５）異なっていないが、残りのペプチドとは有意に異なっている。κ−カゼイン（１０６〜１６９）はκ−カゼイン（１０６〜１３７）と有意に異なっていたが、κ−カゼイン（１０９〜１３７）又はκ−カゼイン（１１７〜１３７）とは有意に異なっていなかった。κ−カゼイン（１０６〜１３７）はκ−カゼイン（１１７〜１３７）を除く全てのペプチドと有意に異なっていた。κ−カゼイン（１０９〜１３７）はκ−カゼイン（１０６〜１６９）を除く全てのペプチドと有意に異なっていた。
【図６】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。３つの別個の細菌培養物及び４回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図７】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図８】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下における精製プロテアーゼ複合体のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性
【化１０】
及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性
【化１１】
を示す図である。６回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図９】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド
【化１２】
、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド
【化１３】
及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図１０】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド
【化１４】
、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド
【化１５】
及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図１１】０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び１．０ｍＭの濃度でのＢＡｐＮＡ基質を用いた０μＭ
【化１６】
、２５μＭ
【化１７】
、５０μＭ
【化１８】
、７５μＭ
【化１９】
及び１００μＭ
【化２０】
の濃度でのκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドによる精製ＲｇｐＢの阻害のラインウェーバー・バークプロットを示す図である。
【図１２】κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドによるＲｇｐＢの阻害に関する阻害定数（Ｋｉ）の評価のための二次プロットを示す図である。それぞれの点集合に関する直線は各データ集合の線形回帰分析結果を表す。Ｋｉを、回帰直線の負の切片として評価した。
【図１３】κ−カゼイン（１０９〜１３７）、並びにヒトセリン／システインプロテイナーゼ阻害剤クレードＧ成員１スプライス変異体３（Ｑ５ＵＧＩ５）、血漿セリンプロテアーゼＣ１阻害剤（Ｐ０５１５５）及び推定セリンプロテイナーゼ阻害剤（ＫＵファミリー）（Ａ３ＬＱ３０）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１４】ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５短鎖アイソフォーム（Ｑ３ＬＸ９５）、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５（Ｑ９ＮＱ３８）、ヒトエラフィン（エラスターゼ特異的阻害剤）（Ｐ１９９５７）及びヒトＰＩ３タンパク質（ペプチダーゼ阻害剤３、皮膚由来（ＳＫＡＬＰ）、アイソフォームＣＲＡ＿ａ）（Ｑ６ＦＧ７４）とのβ−カゼイン（１９３〜２０９）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１５】ＡＴＰ依存性ＣｌｐプロテアーゼＡＴＰ結合サブユニットｃｌｐＸ（Ｐ５０８６６）、セリンプロテアーゼ（Ｑ１ＮＥ６６）及びＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテイナーゼ（Ｑ７ＶＨＴ４）とのαＳ１−カゼイン（１１〜２３）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１６】提唱された不競合的阻害モデルを示す図である。Ｅ＝Ａｒｇ−ジンジパイン又はＬｙｓ−ジンジパイン、Ｓ＝ＢＡｐＮＡ基質又はＧＰＫＮＡ基質、Ｉ＝κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド、及びＰ＝ｐ−ニトロアニリド生成物。
【図１７ａ】κ−カゼイン（１０９〜１３７）、Ｚｎ（ＩＩ）及び基質（ＢＡｐＮＡ）との相互作用に関与するＲｇｐＢ活性部位の残基を示す図である。ＲｇｐＢのＨｉｓ２１１及びＧｌｕ１５２、κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＡｓｐ１１５（Ａｓｐ７）及びＧｌｕ１１８（Ｇｌｕ１０）とＺｎ（ＩＩ）との間の静電相互作用を強調している。ペプチドのＩｌｅ１２２（Ｉｌｅ１４）とＢＡｐＮＡ基質との間の疎水性相互作用も強調している。ＲｇｐＢのＴｒｐ２８４及びＣｙｓ２４４がそれぞれ、基質のＡｒｇ残基及びアミド結合との相互作用を形成する。
【図１７ｂ】Ｚｎ（ＩＩ）の存在下でＲｇｐＢ：ＢＡｐＮＡ複合体と結合するκ−カゼイン（１０９〜１３７）の提唱された分子モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【００４２】
プロテアーゼ阻害作用を示す化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を口腔ケア製品、機能性食品及び医薬品に使用することができる。本発明により、ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞外プロテアーゼ阻害活性を特徴とする新たなミルクカゼインペプチドが同定された。これらのペプチドは、合成的に製造するか、又はミルクカゼインの酵素消化により得ることができる。ペプチドをヒト、ウシ、ヤギ及びヒツジを含む様々な種由来のミルクカゼインから得ることができる。
【００４３】
ウシのミルクカゼインは、更なるタンパク質分解に比較的耐性のあることが知られているタンパク質の天然供給源である。ウシのミルクカゼインは牛乳消化後のヒトの小腸末梢部及び血液で検出されている。
【００４４】
これらのペプチドには幾つかの利点があり、これには天然供給源から誘導することができること、感知可能なほどの風味を有しないこと、及び併用すると、亜鉛等の二価カチオンの風味を消すことができるといったことが含まれるが、これらに限定されない。ペプチドは、
αＳ１−カゼイン（１１〜２３） （配列番号１）
β−カゼイン（１９３〜２０９） （配列番号２）
κ−カゼイン（１０９〜１３７） （配列番号３）
β−カゼイン（１９３〜２０５） （配列番号４）
κ−カゼイン（１１７〜１３７） （配列番号５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明は配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列の機能的断片も含む。機能的断片は配列番号１〜配列番号５に対応するアミノ酸配列よりも短いが、配列番号１〜配列番号５に対応するアミノ酸配列の機能を維持しているアミノ酸配列である。機能的断片は、例えばエクソペプチダーゼを用いてアミノ酸配列を短くし、又はより長さの短いアミノ酸配列を合成し、その後以下の実施例に示される方法等により任意のプロテアーゼ阻害活性を試験することにより容易に求めることができる。
【００４６】
配列番号１〜配列番号５が誘導されるウシカゼインに対してオーソロガス及びパラロガスであるタンパク質の断片に対応する配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列の変異体も本発明の範囲内である。
【００４７】
配列が遺伝子重複事象により分離した場合、該配列は「パラロガス」である。すなわち同じゲノムの２つの異なる位置を占めるように、生物において遺伝子が重複する場合、２つのコピーはパラロガスである。
【００４８】
配列が種分化事象により分離した場合、該配列は「オーソロガス」である。すなわち種が２つの異なる種に分化する場合、得られる種の単一遺伝子の分化コピーはオーソロガスであるといえる。
【００４９】
本発明の範囲内にある別の変異体群は、翻訳後修飾を含有する配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列である。特定の翻訳後修飾はリン酸化及びグリコシル化である。これらの修飾を説明するために、以下のようにウシカゼインの多くの既知の遺伝的変異体が知られている：
Ａ．αＳ１−カゼイン類
１．αＳ１−カゼインＸａ−９Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）
２．αＳ１−カゼイン断片
Ｂ．αＳ２−カゼイン類
１．αＳ２−カゼインＸａ−１５Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）
２．αＳ２−カゼインＸａ−９Ｐ（ｆ５１〜２０７）（遺伝的変異体−Ａ、Ｃ）
３．αＳ２−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ６５〜２０３）（遺伝的変異体−Ａ、Ｃ）
Ｃ．β−カゼイン類
１．β−カゼインＸａ−５Ｐ（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
２．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
３．β−カゼインＸａ−（ｆ１０６〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２）
４．β−カゼインＸａ−（ｆ１０８〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ２、Ｂ、Ｆ、Ｇ及びＨ２）
５．β−カゼインＸａ−４Ｐ（ｆ１〜２８）（遺伝的変異体−Ａ２、Ｄ及びＨ１）
６．β−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ１〜１０５）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
７．β−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ１〜１０７）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
８．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜１０５）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
９．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜１０７）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
Ｄ．κ−カゼイン類
１．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｈ、Ｉ及びＪ）
２．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（ｆ１０６〜１６９）（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２及びＪ）
３．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（ｆ１１７〜１６９）（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２及びＪ）
ａＸは遺伝的変異体を示し、遺伝的変異体は以下の括弧内で述べられた変異体のいずれか１つであり得る。
【００５０】
上記の名称はカゼインの既知の変異体を示している。例えばβ−カゼインＢ−１Ｐ（ｆ２９〜２０９）は、該タンパク質がβ−ファミリーのカゼインの一部であり、Ｂ遺伝的変異体であり、リン酸化することができるアミノ酸残基を含有し、残基２９〜残基２０９のβ−カゼインタンパク質の断片であることを示す。どのアミノ酸がこれらのタンパク質においてリン酸化を受けやすいかは既知である。カゼイン変異体の名称及び更なる説明は、Farrell et al. Nomenclature of Proteins of Cow's Milk - Sixth Revision. Journal of Dairy Science (2004)87:1641-1674に記載されている。したがって、配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列に対応するこれらの配列の断片は変異体であり、開示される本発明の一部を形成する。
【００５１】
ペプチドの特定の配列ではなくペプチドの物理的性質によりプロテアーゼ阻害活性がもたらされると考えられるため、活性を実質的に損うことなく、ペプチド配列においていわゆる保存的置換を行うことができる。本発明を限定するものではないが、幾つかの実施形態では、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸の最大２５％が保存的に置換される。活性の実質的な喪失をもたらさないこのような保存的置換が本発明に包含されることが意図される。上記で言及された保存的置換の概念は当業者に十分に理解されているが、明確化のために、保存的置換は以下に記載のものである。
【００５２】
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及び
Ｐｒｏ、Ｎα−アルカルアミノ酸（alkalamino acids）。
【００５３】
当業者にとって既知のように、アミノ酸の極性群、荷電（＋）群、荷電（−）群又は脂肪族群のうちの１つの成員の同じ群の別の成員による任意の置換は、保存的置換であり得る。
【００５４】
これらの付加的な実施形態を例示するために（本発明を限定しない）、以下の配列が与えられる：
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号１）（ボス・タウルス（Bos taurus）（ウシ））
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号６）（ブバルス・ブバリス（Bubalus bubalis）（アジアスイギュウ（家畜種）（Domestic water buffalo）））
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号７）（キャプラ・ヒルカス（Capra hircus）（ヤギ））
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号８）（オービス・アリエス（Ovis aries）（ヒツジ））
β−カゼイン（１９３〜２０９）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ（配列番号２）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ（配列番号９）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
β−カゼイン（１９３〜２０５）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号４）（ボス・タウルス（ウシ））
κ−カゼイン（１０９〜１３７）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号１０）（アカスイギュウ（Syncerus caffer nanus）（フォーレストバッファロー（Forest Buffalo）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１１）（ボス・インディカス（Bos indicus）（コブウシ（Zebu）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１２）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１３）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号１４）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１６）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１７）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１８）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１９）（オレアムノス・アメリカヌス（Oreamnos americanus）（シロイワヤギ（Mountain goat）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２０）（オレアムノス・アメリカヌス（シロイワヤギ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２１）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
κ−カゼイン（１１７〜１３７）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号２２）（アカスイギュウ（フォーレストバッファロー））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２３）（ボス・インディカス（コブウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２４）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号２６）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２７）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２８）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２９）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３０）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３１）（オレアムノス・アメリカヌス（シロイワヤギ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３２）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
（Ｐ）は前述のアミノ酸がリン酸化されていることを指す。すなわちＳｅｒ（Ｐ）はリン酸化されたセリンアミノ酸である。
【００５５】
（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ）は、前述のアミノ酸がアミノ酸側鎖のヒドロキシ酸素と結合したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有することを指す。すなわちＴｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ）はその側鎖のヒドロキシ酸素と結合したＮ−アセチルガラクトサミンを有するトレオニンアミノ酸である。他のグリカンはＧａｌＮＡｃと結合し、グリカン鎖長を増大することにより、二糖類、例えばＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ、三糖類、例えばＮｅｕＡｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌ（β１−３）［ＮｅｕＡｃ（α２−６）］ＧａｌＮＡｃ、及び四糖類、例えばＮｅｕＡｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−３）［ＮｅｕＡｃ（α２−６）］ＧａｌＮａｃを含むようにすることができる。
【００５６】
本発明は、ＤＥＰＴＸＰＴＴＥ（式中、Ｘ＝ＴＱ又はＳＴ）、ＱＥＰＶＸ１ＧＰＶＲＧＰＸ２ＰＩＩＸ３Ｉ（式中、Ｘ１＝Ｌ、Ｎ又はＫ、Ｘ２＝Ｆ、Ｙ又はＣ、及びＸ３＝Ｌ、Ｈ又はＶ）及びＥＶＬＮＥＮＬＬＲＦからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物も提供する。
【００５７】
これらの実施形態では本発明は、配列番号１〜配列番号３２（端を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になるが、全長カゼイン配列を含まない、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００５８】
配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つにより規定されるアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の欠失を、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のプロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する能力を損わずに行うことができることが当業者に理解されるであろう。或る特定の実施形態では、配列番号１〜配列番号３２を含むペプチド又はペプチド模倣物の最大２５％が欠失され得るが、得られるペプチド又はペプチド模倣物はプロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する能力を維持していなければならない。配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つと１つ又は複数のアミノ酸欠失によって異なるアミノ酸配列を有する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が依然として、プロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載のものを含む実験を実施することができる。
【００５９】
本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を、歯周病の治療又は予防を必要とする被験体の歯茎に直接投与することができる。幾つかの実施形態では、本発明の組成物を局所的に投与するが、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を非経口的に、例えば注射により静脈内に、腹腔内に、筋内に、髄腔内に又は皮下にも投与することができることが当業者に理解されるであろう。
【００６０】
代替的には、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物を、経口投与（舌下投与及び口腔投与を含む）、経肺投与（鼻内投与及び吸入投与）、経皮投与、又は直腸投与用の組成物として構築することができる。
【００６１】
治療を必要とする被験体は歯周病の亜臨床（subclinical：無症候性）症状又は臨床症状を示す被験体であり得る。歯周病の亜臨床兆候又は臨床兆候は、歯肉の急性又は慢性の炎症を含む。血漿及び白血球の血液から損傷組織への移動の増大を含む急性炎症の特質が存在し得る。発赤（紅化）、発熱（熱増大）、腫瘍（腫脹）、痛み（疼痛）及び機能喪失（機能低下）を含む歯肉の急性感染の臨床徴候も存在し得る。慢性炎症は白血球細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞）の浸潤を特徴とし得る。組織及び骨量の減少が観察される場合もある。治療を必要とする被験体は、歯周部位に存在するポルフィロモナス・ジンジバリス細菌レベルが、歯周病ではない個体で観察される正常な範囲を超えて増大していることも特徴とし得る。
【００６２】
投与経路は、投与するアンタゴニスト又は組成物の性質、及び被験体の病態の重症度を含む多くの因子に応じて異なり得る。本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物の投与頻度、及び本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物の投与量は、特に被験体における歯周病の発症又は進行の段階に応じて被験体ごとに異なり得ることが理解される。投与頻度は臨床医が決定することができる。
【００６３】
ジンジパイン又は関連のプロテアーゼ（例えば他のシステインプロテアーゼ）のプロテアーゼ活性の結果として起こる、又はそれに関連する任意の疾患、病態又は症状は、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物により予防又は治療することができることも考慮する。さらに、歯周病の結果として起こる、若しくはそれに関連する他の疾患、病態若しくは症状も治療することができるか、又はこれらの疾患、病態若しくは症状を発症する危険性を低減することができる。例えば、歯周病は個体が心疾患を発症する危険性を増大させ得る。この心疾患を発症する増大した危険性は、歯周病の個体に本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を投与することにより歯周病を治療することによって低減させることができる。
【００６４】
「ペプチド模倣物」は、本発明のペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能的特性を有する合成化合物である（機能的特性を本明細書で更に記載する）。通常、ペプチド模倣物は本発明のペプチドと同じ又は類似の構造、例えばカゼイン又はその断片と同じ又は類似の配列を有する。ペプチド模倣物は一般的に、自然には合成されない残基を少なくとも１つ含有する。ペプチド模倣化合物の非天然構成要素は、ａ）天然型のアミド結合（「ペプチド結合」）による連結以外の残基連結基、ｂ）自然発生的なアミノ酸残基の代わりとなる非天然型の残基、又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわち二次構造、例えばβターン構造（turn）、γターン構造、βシート構造、αヘリックス構造等を誘導又は安定させる残基のうちの１つ又は複数によるものであり得る。
【００６５】
ペプチド模倣物は、科学文献及び特許文献、例えばOrganic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223、Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119、Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27、Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234に記載の多様な手順及び方法論を用いて合成することができる。
【００６６】
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物を、ＧＭＰ条件下で、又は幾つかの実施形態では従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和（levigating）、乳化、カプセル封入、封入若しくは凍結乾燥のプロセスにより製造することができる。
【００６７】
医薬組成物を、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いて構築することができる。これらの成分により、ペプチド又はペプチド模倣物を薬学的に使用することができる調製物へと加工処理するのが容易となり得る。
【００６８】
治療のための投与は非経口投与、静脈内投与、経口投与、皮下投与、動脈内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、局所投与、鼻内投与又は筋内投与であり得る。
【００６９】
非経口投与用の医薬組成物は一般的に滅菌されており、実質的に等張である。ハンクス液、リンガー液、又は生理食塩バッファー若しくは酢酸バッファー等の生理学的に相溶性のバッファーを使用することができる。該溶液には、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤が含有されていてもよい。ペプチド又はペプチド模倣物を粉末形態で準備し、使用前に発熱性物質除去滅菌水等の溶媒に溶解させてもよい。
【００７０】
ペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本明細書で規定の本発明のペプチドに対する「アミノ酸配列の同一性のパーセント（％）」又は「パーセント（％）同一な」は、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、特定のペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本発明のペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される（配列同一性の一部としてはいずれの保存的置換も考慮しない）。
【００７１】
当業者は、比較対象の配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要となる任意のアルゴリズム（非限定的な例が以下に記載される）を含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを求めることができる。アミノ酸配列をアラインメントする場合、所定のアミノ酸配列Ｂに対する（to, with, or against）所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（代替的には所定のアミノ酸配列Ｂに対して或る特定のアミノ酸配列同一性パーセントを有するか又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表すことができる）は、アミノ酸配列同一性パーセント＝Ｘ／Ｙ×１００（式中、ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアラインメントにより完全な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）として算出することができる。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性パーセントと等しくない。
【００７２】
同一性パーセントを算出する際には、通常正確な一致数を数える。数学アルゴリズムを用いて２つの配列間の同一性パーセントの測定を達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズム（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように修正）である。このようなアルゴリズムをAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込む。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０）をAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように利用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係を検出する反復サーチ（iterated search）を行うのに使用することができる。上記のAltschul et al. (1997)を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用することができる。アラインメントを手検測（manually by inspection）により行うこともできる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例はＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸配列又はＤＮＡ配列全体をアライメントすることにより、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを幾つかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールに使用する。ＣｌｕｓｔａｌＷによるアミノ酸配列のアラインメントの後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例はＧＥＮＥＤＯＣ（商標）又はＪａｌＶｉｅｗ（http://www.jalview.org/）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）により、多数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性の評価が可能になる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムを、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。
【００７３】
本発明はヒトでの適用が見出されているが、本発明は獣医学的目的にも有用である。本発明は、本明細書に記載のように、ウシ、ヒツジ、ウマ及びトリ等の家畜動物、ネコ及びイヌ等のペット、並びに動物園の動物における疾患又は病態の治療又は予防に有用である。
【００７４】
上述の医薬組成物を含有する本発明の経口組成物を、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品、並びに他の食品等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用することができる。本発明による経口組成物は特定の経口組成物の種類及び形態に応じて更なる既知の成分を更に含んでいてもよい。
【００７５】
任意で組成物は、グラム陰性の嫌気性細菌にとって毒性であるか、又はグラム陰性の嫌気性細菌の増殖を阻害する１つ又は複数の抗生物質を更に含んでいてもよい。潜在的に任意の静菌性又は殺菌性の抗生物質を本発明の組成物に使用することができる。好適な抗生物質としては、アモキシシリン、ドキシサイクリン又はメトロニダゾールが挙げられる。
【００７６】
本発明の或る特定の形態において、経口組成物は性質が実質的に液体のもの、例えば洗口液又はリンス剤であり得る。このような調製物において、ビヒクルは通常、望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は通常、調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは通常、エタノール又はイソプロパノールである。或る特定の実施形態では、アルコールはエタノールである。
【００７７】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して、約５〜約９、通常約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（例えばクエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【００７８】
本発明の他の望ましい形態において、組成物は、性質が実質的に固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はゲル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に、歯科的に許容される研磨材料を含有する。
【００７９】
歯磨きペーストにおいて、液体ビヒクルは、通常調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なゲルにおいて、約２．５％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールが通常用いられる。
【００８０】
歯磨きペースト、クリーム及びゲルは通常、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、例えば約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然型又は合成型の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は、合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として利用可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ Ｄはおよそ５８．００重量％のＳｉＯ２、２５．４０重量％のＭｇＯ、３．０５重量％のＮａ２Ｏ、０．９８重量％のＬｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【００８１】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【００８２】
従来通り経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売又はそうでなくとも流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、歯磨きペースト、クリーム又はゲルは通常、それを実質的に歯磨きペースト、ゲル又は歯科用クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、若しくはプラスチック製の）、又は内容物を測り出すための他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサーに入っている。
【００８３】
治療作用又は予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物をより化粧品として許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料はその性質がアニオン性、非イオン性又は両性であってもよく、幾つかの実施形態では活性剤と相互作用しない。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが通常である。アニオン性界面活性剤の好適な例は、高級脂肪酸モノ硫酸モノグリセリドの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、スルホン酸１，２−ジヒドロキシプロパンの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキルラジカル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないとされるＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト（sarconite）化合物の使用は、これらの材料が酸溶液中での歯のエナメル質の溶解性を或る程度低減させることに加えて、炭水化物分解による口腔での酸形成の阻害における長期にわたる顕著な効果を示すために特に有益である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有し、エチレンオキシドと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物（該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」)は親水性ポリオキシエチレン部分を含有する）、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物である。
【００８４】
界面活性剤は通常、約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の活性剤の溶解を助け、それにより必要となる可溶化保湿剤の量を減らすことができることは注目に値する。
【００８５】
増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【００８６】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤はそれぞれ又はともに、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含まれ得る。
【００８７】
本発明の組成物の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を、例えば加温したガム基剤中に攪拌すること又はガム基剤の外面をコーティングすることによりロゼンジに、又はチューイングガム若しくは他の製品に組み込むこともできる。ガム基剤の例は、望ましくは従来の可塑剤若しくは柔軟剤、糖類、又は例えばグルコース、ソルビトール等の他の甘味料を含むジェルトン、ゴム乳液、ビニライト樹脂等である。
【００８８】
更なる態様では、本発明は、（ａ）化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを備える部品のキットを提供する。望ましくは該キットは、このような治療を必要とする患者における歯周病の治療又は予防に使用される取扱説明書を更に含む。
【００８９】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効な（elegant）口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有してもよい。
【００９０】
錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管での崩壊及び吸収を遅らせ、それによりより長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料を利用してもよい。
【００９１】
経口使用のための製剤を、硬ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）、又は軟ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）提示してもよい。
【００９２】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【００９３】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料、例えばベンゾエート、例えばエチルｐ−ヒドロキシベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【００９４】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより構築してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【００９５】
本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例を記載し、本発明の幾つかの態様及び実施形態を説明する。
【実施例】
【００９６】
材料及び方法
【００９７】
ペプチドの酵素消化及び精製
カゼイネート−ＨＣｌ（Bonlac Foods, Melbourne Australia）を、最終濃度が２１．５ｇ／Ｌになるまで常時攪拌しながら、５０℃、ｐＨ８．０の脱イオン水にゆっくりと添加することにより溶解させた。カゼイネートが溶解したら、温度を３７℃まで下げ、１ＭのＨＣｌをゆっくりと添加することによりｐＨを６．３まで調整して、カゼインの沈殿を回避した。加水分解を開始するために、レンネット（９０％キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）、１４５ＩＭＣＵ／ｍｌ、単一濃度（Single Strength）、Chr. Hanson）を、カゼイン１ｇ当たり１．２ＩＭＣＵの最終濃度となるまで添加し、溶液を３７℃で１時間攪拌した。１ＭのＨＣｌ及び１ＭのＮａＯＨを添加することにより、溶液のｐＨを６．３±０．２に維持した。最終濃度が４％になるまでトリクロロ酢酸を添加することにより、加水分解を停止させ、沈殿したタンパク質を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、４℃）によりペレット状にした。カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含有する上清を、３０００Ｄａのカットオフ膜（Ｓ１０Ｙ３、Amicon）を用いた透析濾過により濃縮した。それからこの材料を凍結乾燥した。調製物をＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Amersham Pharmacia Biotech, USA）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Amersham Biosciences, USA）を用いて分画し、流速０．５ｍｌ／分で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて溶出した。溶出液を２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長でモニタリングした。２分毎に画分を回収した。全ての試料をＣｈｒｉｓｔ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ（Osterode am Harz, Germany）で凍結乾燥し、−７０℃で保存した。Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより画分を更に分画し、９０％アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを用いて溶出した。溶出液を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００Ｓダイオードアレイ及び多波長検出器（Agilent Tech., Palo Alto, California）を用いて２１４ｎｍの一次波長でモニタリングした。回収した全ての画分を凍結乾燥し、−７０℃で保存した。それぞれの画分の同一性を質量分光分析により確認した。
【００９８】
グリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）を、前に記載のように（Malkoski et al., 2001）キモシン消化により得た。κ−カゼイン（１０６〜１３７）を、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｖ８株（Roche, Penzberg Germany）由来のエンドプロテアーゼ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｅ：Ｓ；１：２００）を用いた、３７℃、２４時間での５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）バッファーに溶解したグリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）の加水分解により得た。２ＭのＮａＯＨを添加することによりｐＨを６．０まで増大させることにより、加水分解を終わらせ、分析（Ｃ１８）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてペプチドを分離した。回収した画分を分析し、ＭＳ／ＭＳ分析を用いてペプチドを同定した。
【００９９】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ
ペプチド試料を、標準的なバッファー（５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）中で飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）マトリクスを用いたＭＴＰ ３８４ターゲットグラウンド鋼板上で同時に結晶化させた（１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））。試料をＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker, Bremen, Germany）で分析した。ローカルＭＡＳＣＯＴサーバーでインストールしたカゼインデータベースに適合させた分画スペクトルを用いたBruker DaltonicsのｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ２．４及びBruker DaltonicsのＢｉｏＴｏｏｌｓ３．０ソフトウェアを用いて、分析を行った。
【０１００】
固相ペプチド合成
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０５）ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド、κ−カゼイン（１０６〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１１７〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１１７〜１２３）ペプチド及びκ−カゼイン（１２７〜１３７）ペプチドを、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチドシンセサイザー（CEM Corporation, North Carolina）で標準的なＦｍｏｃ−ケミストリプロトコルを用いて調製した。ペプチド合成は各Ｃ末端アミノ酸に結合したＷａｎｇ樹脂上のアミド末端から進行した。Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。
【０１０１】
エレクトロスプレーＭＳ
ＲＰ−ＨＰＬＣにより回収された画分を、エレクトロスプレー質量分析モードで操作するＥｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステム（Bruker Daltonics）を用いて分析した。試料の注入を３４０μＬ／時間で行い、窒素流は５Ｌ／分、乾燥ガス温度は３００℃であった。
【０１０２】
細菌株及び増殖条件
グリセロール又はポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０及びＡＴＣＣ ３３２７７細胞の凍結乾燥培養物を、ウマ血液アガー（ＨＢＡ、Oxoid）上で３７℃で嫌気的に増殖させた。ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞を継代培養により維持し、第３代〜第７代のの細胞だけを用いて、へミン（５ｍｇ／Ｌ）及びシステイン（０．５ｇ／Ｌ）、並びにＡＴＣＣ ３３２７７ではビタミンＫ３（メナジオン）（５ｍｇ／Ｌ）を添加したブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）（３７ｇ／Ｌ）２０ｍＬ及び２００ｍＬに接種した。６５０ｎｍの波長での培養物の光学密度（ＯＤ）の測定により増殖を求めた。培養物のグラム染色を任意のコンタミネーションを確認するために行った。ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞を遠心分離（８０００×ｇ、２０分、４℃）により指数増殖期で回収し、０．５ｇ／Ｌのシステインを含有するＴＣ１５０バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））で１回洗浄した。洗浄した細胞を２ｍＬのＴＣ１５０バッファー（０．５ｇ／Ｌのシステインを有する）で再懸濁し、４℃で維持し、すぐにタンパク質分解アッセイに使用した。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体及びＲｇｐＢの精製
【０１０３】
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を後期指数増殖期まで２Ｌのバッチ培養物中で増殖させ、前に記載された手順（Pathirana et al., 2006）に基づき、Ａｒｇ−セファロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４抽出物からＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体を精製した。前に公開された手順（Chen et al., 2002、Pike et al., 1994）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＨＧ６６株からＲｇｐＢを精製した。
【０１０４】
発色基質を用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の測定
インキュベーション容量を減らして９６ウェルプレートを用いて行うように修正し、適合させたポルフィロモナス・ジンジバリスの全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性のために開発したアッセイを用いて細菌のプロテアーゼ阻害活性を求めた（O'Brien-Simpson et al., 1998、O'Brien-Simpson et al., 2001）。合成発色基質；Ｎ−α−ベンゾイル−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−ＢＡｐＮＡ）及びＮ−（ｐ−トシル）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ４−ニトロアニリド酢酸塩（ＧＰＫ−ＮＡ）（Sigma Aldrich）を用いてＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を求めた。Ａｒｇ特異的な反応バッファー及びＬｙｓ特異的な反応バッファーは、３０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、０．９３ｍＭのＬ−システイン、４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌに溶解した２ｍＭのＬ−ＢＡｐＮＡ又はＧＰＫ−ＮＡをそれぞれ含有していた。要求される濃度に応じて、カゼインペプチドをＴＣ１５０バッファーで希釈した。１０ｍＭのＬ−システイン（ｐＨ８．０）１０μＬ及びポルフィロモナス・ジンジバリス全細胞懸濁液、精製ＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体（０．０１μｇ／μＬ）又は精製ＲｇｐＢ（０．００１１６μｇ／μＬ）のいずれかを最終容量が１００μＬとなるまで添加した。それから試料を３７℃で１５分間インキュベートした後、Ａｒｇ特異的な反応バッファー又はＬｙｓ特異的な反応バッファーを添加した（総容量２００μＬ）。PerkinElmerの１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＶＩＣＴＯＲ３（商標）（Waltham, MA）を用いて、３７℃で１０秒間隔で約２０分間、ｐＨ８．０で、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより、活性を求めた。８ｍＭのＺｎＣｌ２のストック溶液を脱イオン水で調製し、特定のアッセイで要求される濃度で凍結乾燥したカゼインペプチドを溶解させるのに使用した。対照試料は、あらゆるプロテアーゼ阻害物質、すなわちペプチド及び／又は亜鉛を欠いていた以外は（however）試験試料と同一であった。
【０１０５】
インキュベーション後、分析（Ｃ１８）カラム及びバッファーＢが０％〜１００％という線形勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、アッセイ内容物を分析し、アッセイ中、カゼインペプチド分解が起こったか判定した。溶出した画分をＥＳＩ−ＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
【０１０６】
蛍光標識したウシ血清アルブミンを用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのタンパク質分解活性の測定
前に公開された手順（Grenier et al., 2002、Yoshioka et al., 2003）を修正してＤＱ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＢＳＡ（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて、細菌のプロテアーゼ阻害活性も求めた。指数増殖（Ｏ．Ｄ６５０ｎｍ＝０．６）中に回収したポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７の全細胞を、１つのウェル当たり５．６×１０９ｃｆｕ／ｍＬでアッセイに使用した。アッセイ混合物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞（１００μＬ培養物）、ＴＣ１５０及び阻害剤（最終容量８０μｌ）、並びにＤＱ ＢＳＡ（２０μＬ、２００μｇ／ｍＬ）を含有していた。１ｍＭのＮ−α−ｐ−トシル−ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で処理した細胞を対照として使用した。ＴＬＣＫはＲｇｐ活性及びＫｇｐ活性の両方を阻害するとことが知られている（Fletcher et al., 1994、Pike et al., 1994）。アッセイ混合物を３７℃で２時間暗所でインキュベートし、その後蛍光光度計（PerkinElmerの１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＶＩＣＴＯＲ３（商標））を用いて、蛍光を測定した（Ｅｍ ５３５ｎｍ、Ｅｘ ４８５ｎｍ）。陰性対照（ＴＬＣＫ処理細胞）から得られた蛍光値を全ての値から減算した。特に明記しない限り、三連で２〜３回の生物学的反復測定により全てのアッセイを実施した。
【０１０７】
部分阻害濃度指数
部分阻害濃度指数（ＦＩＣ指数）は、２つ以上の阻害剤又は抗菌剤の相互作用（相乗的、相加的、又は拮抗的）を規定する尺度である（Berenbaum, 1978）。ＦＩＣ指数をＦＩＣ指数＝［（Ａ＋Ｂ）／Ａ］＋［（Ａ＋Ｂ）／Ｂ］（式中、Ａはκ−カゼイン（１０９〜１３７）の効果を表し、Ｂは塩化亜鉛の効果を表し、Ａ＋Ｂは両方の組合せの効果を表す）として算出する。１を超えるＦＩＣ指数は拮抗効果を示し、１に等しいＦＩＣ指数は相加効果を示し、１未満のＦＩＣ指数は相乗効果を示す。
【０１０８】
阻害の種類及び阻害定数（Ｋｉ）の測定
０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び１ｍＭの基質（ＢＡｐＮＡ）濃度でのＯＤ４０５／秒として初期反応速度を得た。阻害剤（ペプチド）濃度は０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μ及び１００μＭの範囲であった。データをラインウェーバー・バーク（二重逆数）プロットとしてグラフにし、傾きを一次線形回帰により求めた。ラインウェーバー・バークプロットを用いて、Ｋｍ（酵素親和性）及びＶｍａｘ（最大反応速度）値、並びに酵素阻害の種類を求めて、競合阻害剤と、非競合阻害剤と、不競合阻害剤とを区別することができる（Stryer et al., 2002）。阻害剤濃度に対してラインウェーバー・バークプロットの傾きをプロットすることにより、阻害定数（Ｋｉ）を求めた。
【０１０９】
分子モデリング
ＦＵＧＵＥプログラム（Shi et al., 2001）を用いて、１０３４個のタンパク質ファミリーと１０２３０個のアラインメント構造とを含有するキュレーション（curated）タンパク質データベース、ＨＯＭＳＴＲＡＤ（Mizuguchi et al., 1998）に対して阻害剤ペプチドで起こり得る構造モチーフを特定した。ＦＵＧＵＥは、構造プロファイルのデータベースをスキャンし、配列構造適合性スコアを算出し、潜在的なホモログ及びアラインメントのリストを作成する。特異性、感受性及びランク付けをＺスコアに従って算出する。Ｚスコア閾値６は９９％の特異性を示し、Ｚスコア閾値５は９５％の特異性を示す。阻害剤ペプチドモデルを、ＳＹＢＹＬ／Ｔｒｉｐｏｓを用いて構築した。社内（in-house）ソフトウェアを用いて、阻害剤ペプチドにおける潜在的な金属結合部位を、骨格に対する金属原子位置及びモデルペプチドのＣ□原子位置の軌跡により特定した。
【０１１０】
結果
【０１１１】
発色基質を用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の測定
２００μＭのペプチド濃度で、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を約９０％阻害する最も有効な結果を示したが、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）はそれぞれ、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の約７０％及び約６０％の阻害を示した（図１、図２及び表１、表２；陰影セル（shading key）に関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。β-カゼイン（１９３〜２０９）は、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の両方を５０％阻害したが、より短いβ−カゼインペプチド（１９３〜２０５）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を１５％しか阻害しなかった（図１、図２及び表１、表２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。ペプチドを様々な濃度で分析し、タンパク質分解活性の阻害率（％）により、ペプチド濃度に対する用量応答性が実証された（図１、図２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。続いて、精製された外膜プロテアーゼ複合体（ＲｇｐＡ及びＫｇｐを含む）をタンパク質分解アッセイに使用して、観察されるタンパク質分解の阻害が全細胞に存在し得る他のプロテアーゼによるものではないことが確認された。したがって、ペプチドはＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を阻害し、更には僅か１００μＭのペプチドで阻害能の増大を示した（図３、表１、表２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。
【０１１２】
Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の最も有意な阻害を示すκ−カゼイン（１０９〜１３７）を更に評価した。ペプチドを精製ＲｇｐＢに対して評価し、ペプチドの結合位置を求めた。ＲｇｐＢのタンパク質分解活性の阻害は、ペプチドがプロテアーゼ複合体ではなく、プロテアーゼ自体と結合することを示した（図４、表１）。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
阻害に必須の残基を明らかにするため、ＬｙｓリッチＮ末端領域を有しない一連のペプチドを合成した；κ−カゼイン（１１７〜１２３）、κ−カゼイン（１２７〜１３７）及びκ−カゼイン（１１７〜１３７）。蛍光ＢＳＡによる全細胞アッセイにおいて、及び発色基質による精製ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を用いたタンパク質分解アッセイにおいて、ポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテイナーゼの阻害に関して、これらの合成ペプチドをスクリーニングした（表３、表４、図５）。κ−カゼイン（１１７〜１３７）だけがより長いκ−カゼイン（１０９〜１３７）と同程度の阻害能を有する阻害活性を示した。このことにより、プロテイナーゼ阻害に関してＮ末端領域のＬｙｓ残基は重要ではないことが実証された。精製κ−カゼイン（１０６−１６９）は、蛍光ＢＳＡによる全細胞アッセイで試験した場合、より短いκ−カゼイン（１０９〜１３７）と同程度の有効性を示した（図５）。
【０１１６】
また蛍光基質であるＤＱ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＢＳＡを、ポルフィロモナス・ジンジバリスの全細胞のプロテイナーゼ活性に対するカゼインペプチドの阻害活性を測定するのに使用した。ペプチドを添加する前に、アッセイを、１つのウェルあたりの細胞数及びインキュベーション時間に関して最適化した。アッセイに関して、１つのウェル当たり１０９個の細胞との２時間のインキュベーション期間を選択したが、これはタンパク質の加水分解速度がこれらの条件下で線形であったためであった。カゼインに由来するグリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）ペプチドは、アッセイにおいて５００μＭのペプチド濃度でＢＳＡに対するプロテイナーゼ活性を６０％阻害した。より短い合成断片であるκ−カゼイン（１０６〜１３７）は、発色アッセイにおいて２００μＭの濃度ではＡｒｇ特異的なプロテアーゼ活性及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼ活性に対する効果をほとんど有しなかったが、蛍光アッセイにおいて５００μＭのペプチド濃度でプロテアーゼ活性を約３７％阻害した（表４及び図５）。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
補助阻害剤（Co-inhibitor）としての塩化亜鉛
ＺｎＣｌ２は、ベンズアミジン及びクロルヘキシジン等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤の阻害能を増大させることが分かっている潜在的な補助阻害剤である。補助阻害剤としての亜鉛の可能性を調べるために、全細胞のＡｒｇ特異的なプロテアーゼアッセイ及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイを、ペプチド［κ−カゼイン（１０９〜１３７）／β−カゼイン（１９３〜２０９）／αＳ１−カゼイン（１１〜２３）］とＺｎＣｌ２とを１：４の比で用いて行った。
【０１２０】
１００μＭでは、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を６０％阻害し、４００μＭのＺｎＣｌ２は３０％の阻害を示した。しかしながら、κ−カゼイン（１０９〜１３７）及びＺｎＣｌ２を１：４の比で組み合せると、阻害は９０％まで増大した（図６）。ペプチドと亜鉛との混合物は、精製プロテアーゼ複合体を用いて分析した場合でも、Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性の阻害の増大を示した（図８；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。同様の結果がκ−カゼイン（１０９〜１３７）を用いたＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイにおいて観察された。すなわち、ＺｎＣｌ２の添加により、個々で分析した場合のペプチドの阻害能と比較して９０％まで阻害能が増大した（図７）。ＦＩＣ指数に基づくと、Ｚｎ２＋の効果は相乗的である（表５）。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
１００μＭのβ−カゼイン（１９３〜２０９）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を３０％阻害したが、４００μＭのＺｎＣｌ２は５０％の阻害を示した。１：４の比で組み合わせると、タンパク質分解の阻害は７０％まで増大した（図９；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。Ｌｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイでは、β−カゼイン（１９３〜２０９）：ＺｎＣｌ２の混合物により、個々で分析した場合のペプチドの阻害剤の阻害能と比較して９０％まで阻害能が増大した（図１０；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。β−カゼイン（１９３〜２０９）及びＺｎＣｌ２のＦＩＣ値は、阻害が相乗的であることを示している（表６）。
【０１２３】
【表６】
【０１２４】
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）は１００μＭでＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を４０％阻害したが、ＺｎＣｌ２は４００μＭでＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を５０％阻害した。阻害剤を１：４の比で組み合わせると、タンパク質分解の阻害は７０％まで増大した（図９；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。Ｌｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイでは、阻害剤の混合物により、８５％まで阻害能が増大した（図１０；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。これとは対照的に、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）及びＺｎＣｌ２に関して算出されたＦＩＣ値は、両方の阻害剤の混合物が相乗的ではなく、相加的であることを示している（表７）。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
阻害定数（Ｋｉ）及び阻害機構の測定
κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドの阻害定数及び阻害機構を求めるために精製ＲｇｐＢを用いて、酵素反応速度アッセイを行なった。作成したラインウェーバー・バークプロットは、κ−カゼイン（１０９〜１３７）による不競合阻害を示している（図１１；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。不競合阻害の場合、Ｋｉ値は５０％阻害に要求される阻害剤濃度（ＩＣ５０）の値に等しい。Ｋｉ値は阻害剤とＥＳ複合体との結合に関する解離定数を表し、この場合Ｋｉ値は４０．２μＭである（図１２）。
【０１２７】
カゼイン由来ペプチドのＢＬＡＳＴサーチ及び配列アラインメント
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）配列は、ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡプロテアーゼサブユニット（シャペロン様プロテアーゼ）との配列類似性を示す（図１５）。ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡは、微生物におけるストレス応答に重要なＡＴＰ依存性セリンプロテアーゼ複合体（それぞれＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＡＰと呼ばれる）のサブユニットである。黄色ブドウ球菌では、ＣｌｐＸＰは浸透圧ストレス、酸化ストレス及び低温下での生存に一定の役割を果たす。ポルフィロモナス・ジンジバリスでは、ＣｌｐＸＰの喪失は酸化ストレス耐性に影響しないが、宿主の上皮細胞の浸潤、熱耐性及びバイオフィルム形成に重要であると考えられる。ＣｌｐＡＰ及びＣｌｐＸＰは同一の活性を有してはいないが、類似している。カゼイン配列は、ＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテアーゼ（ＦｔｓＨ １）（これもポルフィロモナス・ジンジバリスにおけるバイオフィルム形成に一定の役割を果たす）とも類似性を示す。カゼイン配列は既知のプロテアーゼ阻害剤とは類似性を全く示さない。
【０１２８】
β−カゼイン（１９３〜２０９）は、幾つかのプロテアーゼ阻害剤との配列類似性を示す（図１４）。セリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５又はＬＥＫＴＩ（リンパ上皮カザールタイプ関連阻害剤）は、複数の異なる阻害剤単位を含有するセリンプロテアーゼ阻害剤である。該阻害剤は粘膜上皮の抗炎症保護及び／又は抗菌保護に重要であると考えられ、トリプシン１、カテプシンＧ、プラスミン、サブチリシン−Ａ及びエラスターゼ−２を阻害することが分かっている。エラフィン（又は別名ＳＫＡＬＰ（皮膚由来抗ロイコプロテアーゼ）としても知られている）は更に、エラスターゼ、アルギニルペプチダーゼ、プロテイナーゼ３及びミエロブラスチンを阻害するが、トリプシン、α−キモトリプシン、カテプシンＧ及びプラスミンを阻害しないセリンプロテアーゼ阻害剤である。エラフィンは主にセリンプロテアーゼ阻害剤として作用するが、抗炎症機能にも関与する。エラフィンはそのプロテアーゼ阻害機能とは関係なく、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗菌性及び抗真菌性も示す。
【０１２９】
ＢＬＡＳＴサーチにより、幾つかのプロテアーゼ阻害剤とのκ−カゼイン（１０９〜１３７）の配列類似性が明らかになった（図１３）。これらの中でも、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｑ５ＵＧＩ５及びＰ０５１５５）又はセルピンＧ１が血管透過性の調節及び炎症の抑制；第ＸＩＩａ因子及び血漿カリクレイン（血漿カリクレイン−キニン系のプロテアーゼ）、Ｃ１ｒ又はＣ１ｓプロテアーゼ（相補系）、プラスミン及び組織プラスミノーゲン活性化因子（線溶系）、並びに第ＸＩ因子及びトロンビン（凝固系）を阻害するのに重要である可能性があると考えられている。
【０１３０】
２００μＭの濃度では、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は全細胞アッセイにおいて、Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性の約９３％の阻害、及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の９８％の阻害を示した。またペプチドは、２００μＭ濃度で精製ＲｇｐＢプロテアーゼを８０％超阻害した（表１及び表２）。これらの結果は、ペプチドが３つのリシル残基を有するがアルギニル残基を有さず、そのためＲｇｐＢプロテアーゼにより切断されないため特に重要である。
【０１３１】
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）は全細胞のプロテアーゼ活性を約６０％阻害し、β−カゼイン（１９３〜２０９）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の両方の約４０％〜５０％の阻害を示した。この結果は精製プロテアーゼ複合体に対するプロテアーゼ阻害機能の改善も示している。しかしながら、β−カゼイン（１９３〜２０５）は、僅かに長いペプチドと比較して、両方のジンジパインに対して、さほど効力を有しなかった。このことは、追加の残基又はペプチドの長さがペプチドの阻害機能に重要な役割を果たすことを示していると考えられる。
【０１３２】
ＺｎＣｌ２は、ベンズアミジン及びクロルヘキシジン等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤の阻害能を増大させることが示されている潜在的な補助阻害剤である。様々なペプチド対亜鉛の比の効果を、両方の阻害剤の間に相乗効果があるかどうかを判定するために調べた。ＦＩＣ指数を相乗効果を算出するのに用いている。阻害剤の組合せが相加的である場合、ＦＩＣ指数は１に等しくなる。阻害剤同士が拮抗的である場合、同じ効果を得るのにより多くの阻害剤が必要とされ、合計が１より大きくなるのに対し、２つの阻害剤の組合せが別々の場合よりも効果的である場合、相乗効果により合計は１未満になる。全細胞のＡｒｇ特異的なプロテアーゼアッセイの結果及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイの結果から算出されたＦＩＣ指数に基づき、κ−カゼイン（１０９〜１３７）とＺｎＣｌ２との混合物及びβ−カゼイン（１９３〜２０９）とＺｎＣｌ２との混合物は相乗的であったが、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）とＺｎＣｌ２との混合物は相加的であった（表５、表６及び表７）。
【０１３３】
ジンジパイン活性の反応速度のラインウェーバー・バーク分析により、酵素阻害の種類を求めて、競合阻害剤と、非競合阻害剤と、不競合阻害剤とを区別することができる。競合阻害剤は、阻害されていない酵素と同じｙ切片を有する（Ｖｍａｘが同じである）が、それぞれの阻害剤濃度に対して異なる傾き及びｘ切片を有する（Ｋｍが異なる）。非競合阻害は、阻害されていない酵素と同じｘ切片を有するプロットをもたらす（Ｋｍが同じままである）が、異なる傾き及びｙ切片を有する（Ｖｍａｘを低減させる）。不競合阻害により、ｙ軸及びｘ軸の両方で異なる切片が生じるが、同じ傾きがもたらされる。酵素反応速度アッセイ及びラインウェーバー・バークプロットに基づくと、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドは不競合阻害剤である。いずれの理論又は作用機構にも縛られるものではないが、不競合阻害剤は、ペプチドが酵素−基質複合体とだけ結合し、生成物の形成を妨げることを意味し得る。Ｋｍ値及びＶｍａｘ値の両方が低減する。基質の結合は酵素の構造変化を誘導すると考えられている。新たな構造により、阻害剤の結合が可能になる（図１６）。これは、酵素及び酵素−基質複合体の両方と結合することができる非競合阻害剤（Ｖｍａｘを低減させる（阻害剤が触媒作用を妨げる）が、Ｋｍ値は変化しない（酵素に対する基質の親和性には影響がない））とは異なる。
【０１３４】
ペプチドの阻害定数は４０．２μＭであり、不競合阻害剤の場合、Ｋｉ値はＩＣ５０値と等しい。ＲｇｐＢの他の阻害剤とのＫｉ値の比較により、このペプチド阻害剤が同程度のＫｉ値を有し、クロルヘキシジン（２．６２×１０−４Ｍ）及びドキシサイクリン（不競合阻害剤）と同様のＲｇｐＢに対するＫｉ値を有するＲｇｐＢの中程度の阻害剤であり、３μＭのＲｇｐＢに対するＩＣ５０を有することが明らかになる。
【０１３５】
ＢＬＡＳＴサーチにより、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）の、ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡプロテアーゼサブユニット（シャペロン様プロテアーゼ）、並びにポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルム形成に一定の役割を果たすＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテアーゼ（ＦｔｓＨ１）との配列類似性が明らかになった。β−カゼイン（１９３〜２０９）配列は、セリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５又はＬＥＫＴＩ（リンパ上皮カザールタイプ関連阻害剤）等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤、及びエラフィンとの配列類似性を示す。これらのセリンプロテアーゼ阻害剤は両方ともそのプロテアーゼ阻害機能とは関係なく、抗菌機能も示す。κ−カゼイン（１０９〜１３７）も幾つかのプロテアーゼ阻害剤との部分的な配列類似性を示す。それらのプロテアーゼ阻害剤の中には、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｑ５ＵＧＩ５及びＰ０５１５５）又はセルピンＧ１が含まれる。
【０１３６】
Ｆｕｇｕｅプログラムを用いて、キュレーションタンパク質データベース、ＨＯＭＳＴＲＡＤに対してペプチドで起こり得る構造モチーフを特定した。３．８７のＺスコアがκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドで得られ、α−ヘリックス構造に関する９０％の信頼性を示す。κ−カゼイン（１０９〜１３７）で起こり得る構造モチーフは、α−ヘリックス貫通残基１０９〜１２６、ターン構造、及び別のα−ヘリックス貫通残基１２９〜１３７とを含む。これらのモチーフに基づき、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドのモデルをＳＹＢＹＬソフトウェアを用いて構築した。ＲｇｐＢを阻害するκ−カゼイン（１０９〜１３７）のモデルを、ＲｇｐＢの結晶構造（ＰＤＢ １ｃｖｒ）、及び潜在的な金属結合部位を有する提唱されたκ−カゼイン（１０９〜１３７）のモデルに基づき展開した。図１７（ａ）は、ペプチド阻害剤であるκ−カゼイン（１０９〜１３７）、Ｚｎ（ＩＩ）、及び合成基質（ＢＡｐＮＡ）との相互作用に関与するＲｇｐＢ活性部位の残基を強調する提唱されたモデルを示す。このモデルはＲｇｐＢのＨｉｓ２１１残基及びＧｌｕ１５２残基、κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＡｓｐ１１５残基及びＧｌｕ１１８残基とＺｎ（ＩＩ）との間の静電相互作用を強調している。κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＩｌｅ１２２残基はＢＡｐＮＡ基質との疎水性相互作用を形成する。またＲｇｐＢのＴｒｐ２８４残基及びＣｙｓ２４４残基はそれぞれ、ＢＡｐＮＡ基質のＡｒｇ残基及びアミド結合と相互作用する。図１７（ｂ）は、Ｚｎ（ＩＩ）の存在下での酵素−基質複合体（ＲｇｐＢ−ＢＡｐＮＡ）と結合するκ−カゼイン（１０９〜１３７）の提唱された分子モデルを示す。このモデルは相乗的阻害の実験上の証拠と一致している。
組成物及び製剤
治療又は予防を目的とする本発明の態様を具体化する組成物の例示を助けるために、以下の試料製剤を調製する。
【０１３７】
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
グリセロール ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン（Chlorohexidine gluconate） ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
水 残り
【０１３８】
以下は更なる歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウロイルジエタノールアミド １．０
モノラウリン酸スクロース ２．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．１
水 残り
【０１３９】
以下は更なる歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール ２２．０
アイリッシュモス １．０
水酸化ナトリウム（５０％） １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ １９．０
水（脱イオン水） ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７６
サッカリンナトリウム ０．３
ピロホスフェート ２．０
アルミナ水和物 ４８．０
香料オイル ０．９５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００
【０１４０】
以下は液体歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
エタノール ３．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
リノール酸 ０．０５
水 残り
【０１４１】
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
エタノール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．３
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
水 残り
【０１４２】
以下は更なる洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓ−９７ ２．５
グリセリン １０．０
香料オイル ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．２
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４３】
以下はロゼンジ製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
糖 ７５〜８０
トウモロコシシロップ １〜２０
香料オイル １〜２
ＮａＦ ０．０１〜０．０５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
ステアリン酸Ｍｇ １〜５
水 残り
【０１４４】
以下は歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン ８．０
プロピレングリコール ４．０
ステアリルアルコール ８．０
ポリエチレングリコール４０００ ２５．０
ポリエチレングリコール４００ ３７．０
モノステアリン酸スクロース ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４５】
以下は歯周ゲル製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（BASF製） ２０．０
ステアリルアルコール ８．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ３．０
コロイド二酸化ケイ素（例えばＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標）２００（商標））１．０
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
水 残り
【０１４６】
以下はチューイングガム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤 ３０．０
炭酸カルシウム ２．０
結晶性ソルビトール ５３．０
グリセリン ０．５
香料オイル ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４７】
本発明は本明細書中で詳細に説明しているが、実施例は単に例示目的にすぎないと理解すべきである。分子生物学、歯の治療及び関連の関連分野の当業者にとって明らかな本発明の実施形態の他の修正形態が本発明の範囲内であることが意図される。
【０１４８】
【表８−１】
【０１４９】
【表８−２】
【配列表フリーテキスト】
【０１５０】
配列番号１２：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１３：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１４：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１５：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１６：Ｘａａはリン酸化セリン
配列番号２４：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２５：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２６：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２７：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２８：Ｘａａはリン酸化セリン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害する、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物と、病態を治療又は予防するためのこれらの化合物、ペプチド、ペプチド模倣物及び医薬組成物の使用とに関する。特に病態は歯周病であり得る。
【０００２】
本願はオーストラリア仮出願第２００９９０２８４１号（この出願はその全体が参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
歯周病は歯の支持組織の細菌関連の炎症性疾患であり、重大な公衆衛生上の問題である。ヒト集団のほぼ全てが或る程度歯周病に罹患している。１９８９年の米国の歯科衛生調査によると、研究対象の集団の８５％が歯周病を有するという報告があった。歯周病の主形態は歯肉縁での歯垢の非特異的な集積に関連する歯肉炎である。歯周病のより破壊的な形態（歯周炎）は特定のグラム陰性細菌による歯肉縁下感染に関連する。この疾患に関与する主な細菌性病原体は「レッドコンプレックス」としても知られ、該レッドコンプレックスは、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）及びトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）からなる。ポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）は慢性歯周炎における主要病因である。
【０００４】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要病原性因子は、その細胞外システインプロテアーゼ（まとめてジンジパインとして知られる）であると考えられている。最も一般的なものはＲｇｐＡ及びＲｇｐＢ（Ａｒｇ−ジンジパイン）及びＫｇｐ（Ｌｙｓ−ジンジパイン）である。Ａｒｇ−ジンジパインはＡｒｇ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断し、Ｌｙｓ−ジンジパインはＬｙｓ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断する。
【０００５】
これらの細胞結合型システインプロテアーゼは、増殖並びに生存及び病原性に関する他の内因性機能及び外因性機能のためのペプチドをもたらすタンパク質の分解に重要であると考えられている。生存及び病原性に関するこれらの機能の幾つかは、宿主組織への細菌付着、血球凝集、並びに細菌の細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質のプロセシングであり得る。ＲｇｐＡ及びＫｇｐの触媒ドメインは一連の非共有的に結合した配列関連の血液凝集因子／付着因子ドメインを有する細胞表面上で複合体として結合することができるが、ＲｇｐＢはプロテアーゼ付着因子複合体の一部として存在するのではないことが分かっており、触媒ドメインのみからなっている可能性がある。
【０００６】
ジンジパインを阻害することが見出されている天然由来型及び合成型の両方の分子が幾つか存在する。ジンジパインの天然阻害剤は生物活性産物のスクリーニングにより見出されており、幾つかの合成阻害剤はプロテアーゼ活性部位及びプロテアーゼ阻害剤の構造に基づき合成されている。例えば、Ａｒｇ−ジンジパイン阻害剤及びＬｙｓ−ジンジパイン阻害剤はクランベリー果汁［具体的にはポリフェノール、及び高分子量の非透析性成分（ＮＤＭ）］、緑茶カテキン及びニンニクから単離されている。これらの阻害剤は、合成型であるか、生産するのにコストがかかるか、許容できない風味があるか、又はヒトでの使用が認可されていない等といった１つ又は複数の問題を抱えている。
【０００７】
様々な疾患、特に歯周病の発病に関与する細菌酵素のより良好な又は代替となる阻害剤が必要とされている。
【０００８】
本明細書における任意の従来技術に対する参考文献は、この従来技術がオーストラリアにおける共通の一般知識若しくは権限（jurisdiction）の一部を形成するという、又はこの従来技術が当業者によって関連があるものと確認され、理解され、かつみなされることを合理的に期待することができるという承認又は任意の形態の示唆ではなく、またそのように解釈すべきでないものとする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物がカゼイン又はその断片のアミノ酸配列を含む、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が提供される。１つの実施の形態では、酵素は細胞外プロテアーゼであり得る。特定の実施の形態では、細胞外プロテアーゼはシステインプロテアーゼ、例えばジンジパインである。或る特定の実施の形態では、プロテアーゼはＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ又はＫｇｐである。
【００１０】
或る特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号１）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ（配列番号２）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号４）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
更なる実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号６）、
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号７）、
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号８）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ（配列番号９）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号１０）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１１）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１２）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１３）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号１４）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１５）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１６）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１７）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１８）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１９）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２０）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２１）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号２２）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２３）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２４）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２５）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号２６）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２７）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２８）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２９）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３０）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３１）、及び
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３２）
からなる更なる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は配列番号１〜配列番号３２における保存的置換体を含む。これらの置換は以下で更に記載する。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣物の長さは少なくとも１３アミノ酸である。他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは７０アミノ酸以下である。或る特定の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは１５アミノ酸〜６１アミノ酸である。他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物の長さは２０アミノ酸〜３０アミノ酸である。
【００１４】
更なる実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はリン酸化又はグリコシル化されていない。別の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は翻訳後修飾されている。例えば、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はリン酸化のみ、又はグリコシル化のみ、又はリン酸化及びグリコシル化の両方を受けていてもよい。１つ又は複数の残基がこのように修飾されていてもよい。
【００１５】
特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号３２（端を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。これらの実施の形態では、配列番号１〜配列番号３２、及び更なるアミノ酸残基を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、配列番号１〜配列番号３２「から本質的になる」であろう。同様に、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、対応する配列番号より短くても配列番号１〜配列番号３２のうちの１つ「から本質的になる」。このようなときにはこれらの実施の形態は全長のカゼイン配列を含まない。
【００１６】
他の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物はこのようなアミノ酸配列から本質的になる。幾つかの実施の形態では、該群は配列番号１〜配列番号５からなる。
【００１７】
或る特定の実施の形態では、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物がヘリックス構造を形成することが可能であるアミノ酸配列を含み、細菌酵素の活性を非競合的に阻害、低減又は阻止する、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が提供される。
【００１８】
他の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、酵素が基質と相互作用する場合、酵素、基質又は酵素及び基質の両方と結合すること等により、酵素が基質から生成物を生成するのを阻害、低減又は阻止する。
【００１９】
別の実施の形態では、本発明は、必要とする患者の口腔においてポルフィロモナス・ジンジバリス酵素の活性を阻害、低減又は阻止するのに使用される治療用ペプチドであって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、又はそのグリコシル化変異体及びリン酸化変異体、並びにその欠失突然変異体及び置換突然変異体からなる群から選択される、治療用ペプチドを提供する。幾つかの実施の形態では、配列番号１の変異体及び突然変異体は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、配列番号２の変異体及び突然変異体は、配列番号４及び配列番号９からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、配列番号３の変異体及び突然変異体は、配列番号５及び配列番号１０〜配列番号３２からなる群から選択される。
【００２０】
或る特定の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、細菌酵素を阻害する組成物が提供される。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００２１】
１つの実施の形態では、１つ又は複数の病態を治療又は予防する方法であって、有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を、必要とする被験体に投与することを含む、１つ又は複数の病態を治療又は予防する方法が提供される。１つの実施の形態では、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物は被験体の歯茎に直接投与される。１つの実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品及び他の食品等の口に適用可能な組成物の一部であり得る。治療又は予防に好適な病態又は疾患の例としては歯周病及び齲蝕が挙げられる。ジンジパインの酵素活性により引き起こされる又はジンジパインの酵素活性に関連する任意の疾患又は病態は、本発明による治療又は予防に好適であり得る。
【００２２】
治療を必要とする又は歯周病若しくは齲蝕を発症する危険性のある被験体は動物である。幾つかの実施の形態では、被験体はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ又はウシである。
【００２３】
別の実施の形態では、被験体において歯周病の症状を治療又は緩和する方法であって、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を被験体に投与することを含む、被験体において歯周病の症状を治療又は緩和する方法が提供される。
【００２４】
幾つかの実施の形態によれば、細菌酵素を阻害する方法であって、酵素と、配列番号１〜配列番号５及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば配列番号１〜配列番号３２及びそれと少なくとも６０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物とを接触させることを含む、細菌酵素を阻害する方法が提供される。特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸配列は全長のカゼイン配列を含まない。これらの実施の形態のいずれかによれば、細菌酵素はジンジパインであってもよく、例えばジンジパインはポルフィロモナス・ジンジバリス由来である。
【００２５】
これらの実施の形態のいずれかによれば、接触する工程は、組成物を、それを必要とする被験体（例えばヒト）、例えば歯周病若しくは齲蝕を治療する必要がある、又は歯周病若しくは齲蝕を発症する危険性のある被験体に投与することを含み得る。これらの実施の形態のいずれかによれば、該方法は歯周病又は齲蝕の症状を治療又は緩和するのに効果的であり得る。
【００２６】
別の実施の形態では、本発明の方法は、抗炎症剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリスにより発現されるタンパク質と結合する抗体、抗生物質、及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を投与することを更に含む。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。抗炎症剤は非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。ＮＳＡＩＤの例としてはシクロオキシゲナーゼを阻害する化合物が挙げられる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、イブプロフェン及びナプロキセンが挙げられる。バイオフィルム抑制剤の一例はフマル酸レダクターゼの阻害剤、例えばオキサンテルである。
【００２７】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして本明細書中で特定された、他の病態の治療又は予防用の薬剤の調製における有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態）の治療又は予防用の医薬組成物も提供する。組成物は、抗炎症剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリス由来のタンパク質と結合する抗体、抗生物質、及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を更に含むことができる。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。
【００２９】
幾つかの実施の形態によれば、被験体において細菌酵素を阻害するのに有効な量の細菌酵素を阻害するカゼイン又はその断片のアミノ酸配列、例えば配列番号１〜配列番号５及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つ、又は配列番号１〜配列番号３２及びそれらと少なくとも６０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む医薬組成物が提供される。特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸配列は全長のカゼイン配列を含まない。
【００３０】
これらの実施の形態のいずれかによれば、組成物は、二価カチオン、例えば亜鉛、並びに／又は抗炎症剤、抗生物質、バイオフィルム抑制剤、及びポルフィロモナス・ジンジバリス又はポルフィロモナス・ジンジバリスにより発現されるタンパク質と結合する抗体からなる群から選択される作用物質を更に含み得る。
【００３１】
これらの実施の形態のいずれかによれば、組成物は歯茎への局所投与用に構築することができ、かつ／又は単位剤形で提供することができる。
【００３２】
別の実施の形態では、本発明は、活性成分として本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態）の治療又は予防用の組成物を提供する。組成物は二価カチオンを更に含むことができる。
【００３３】
別の実施の形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を主成分として含む医薬組成物を提供する。組成物は、例えば歯周病及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態の治療又は予防に使用することができる。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００３４】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された、他の病態の治療又は予防に使用される本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００３５】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病の治療又は予防に使用される、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物を提供する。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含む。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、（ａ）本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを備える部品のキットを提供する。
【００３７】
或る特定の実施の形態では、二価カチオンは、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｎ２＋及びＭｎ２＋からなる群から選択される。また、二価カチオンはＳｎＦ＋及びＣｕＦ＋のようなフッ化物に関連するものであり得る。幾つかの実施の形態では、二価カチオンはＣａ２＋又はＺｎ２＋である。
【００３８】
或る特定の実施の形態では、二価カチオンと化合物、ペプチド又はペプチド模倣物との比は１．０：２．０〜１．０：１０．０の範囲、例えば１．０：４．０の範囲である。
【００３９】
本明細書で使用されるように、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語及びその用語の変化形、例えば「含む（"comprising", "comprises" and "comprised"）」は、更なる添加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）
【化１】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０５）
【化２】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）
【化３】
ペプチド及びκ−カゼイン（１０９〜１３７）
【化４】
ペプチドの存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。アッセイにおける細胞の平均数は４．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬである。
【図２】合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）
【化５】
ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）
【化６】
ペプチド及びκ−カゼイン（１０９〜１３７）
【化７】
ペプチドの存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。アッセイにおける細胞の平均数は４．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬである。
【図３】１００μＭの合成型のカゼイン由来ペプチドの存在下における精製プロテアーゼ複合体のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性
【化８】
及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性
【化９】
を示す図である。６回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図４】幾つかの濃度のκ−カゼイン（１０９〜１３７）の存在下における精製ＲｇｐＢのタンパク質分解活性を示す図である。ＲｇｐＢの濃度は０．２３μｇ／ｍＬである。
【図５】蛍光ＢＳＡ基質（ＤＱＴＭ ＢＳＡ）及び５００μＭのカゼインペプチドを用いて測定されたポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なプロテイナーゼ活性及びＬｙｓ特異的なプロテイナーゼ活性を示す図である。κ−カゼイン（１０６〜１６９）は天然由来型であり、他のκ−カゼインペプチドは合成型であった。誤差バーを３つの技術的反復測定結果及び２つの生物学的反復測定結果の標準偏差として算出した。全てのペプチドが対照の値と有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。κ−カゼイン（１１７〜１２３）及びκ−カゼイン（１２７〜１３７）は互いに有意に（ｐ＜０．０５）異なっていないが、残りのペプチドとは有意に異なっている。κ−カゼイン（１０６〜１６９）はκ−カゼイン（１０６〜１３７）と有意に異なっていたが、κ−カゼイン（１０９〜１３７）又はκ−カゼイン（１１７〜１３７）とは有意に異なっていなかった。κ−カゼイン（１０６〜１３７）はκ−カゼイン（１１７〜１３７）を除く全てのペプチドと有意に異なっていた。κ−カゼイン（１０９〜１３７）はκ−カゼイン（１０６〜１６９）を除く全てのペプチドと有意に異なっていた。
【図６】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。３つの別個の細菌培養物及び４回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図７】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図８】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド及びＺｎＣｌ２の存在下における精製プロテアーゼ複合体のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性
【化１０】
及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性
【化１１】
を示す図である。６回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図９】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド
【化１２】
、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド
【化１３】
及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図１０】アッセイにおける１ｍＭのシステイン濃度での合成型のαＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド
【化１４】
、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド
【化１５】
及びＺｎＣｌ２の存在下におけるポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７の全細胞のＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を示す図である。２つの別個の細菌培養物及び３回の技術的反復測定によりアッセイを実施した。
【図１１】０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び１．０ｍＭの濃度でのＢＡｐＮＡ基質を用いた０μＭ
【化１６】
、２５μＭ
【化１７】
、５０μＭ
【化１８】
、７５μＭ
【化１９】
及び１００μＭ
【化２０】
の濃度でのκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドによる精製ＲｇｐＢの阻害のラインウェーバー・バークプロットを示す図である。
【図１２】κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドによるＲｇｐＢの阻害に関する阻害定数（Ｋｉ）の評価のための二次プロットを示す図である。それぞれの点集合に関する直線は各データ集合の線形回帰分析結果を表す。Ｋｉを、回帰直線の負の切片として評価した。
【図１３】κ−カゼイン（１０９〜１３７）、並びにヒトセリン／システインプロテイナーゼ阻害剤クレードＧ成員１スプライス変異体３（Ｑ５ＵＧＩ５）、血漿セリンプロテアーゼＣ１阻害剤（Ｐ０５１５５）及び推定セリンプロテイナーゼ阻害剤（ＫＵファミリー）（Ａ３ＬＱ３０）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１４】ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５短鎖アイソフォーム（Ｑ３ＬＸ９５）、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５（Ｑ９ＮＱ３８）、ヒトエラフィン（エラスターゼ特異的阻害剤）（Ｐ１９９５７）及びヒトＰＩ３タンパク質（ペプチダーゼ阻害剤３、皮膚由来（ＳＫＡＬＰ）、アイソフォームＣＲＡ＿ａ）（Ｑ６ＦＧ７４）とのβ−カゼイン（１９３〜２０９）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１５】ＡＴＰ依存性ＣｌｐプロテアーゼＡＴＰ結合サブユニットｃｌｐＸ（Ｐ５０８６６）、セリンプロテアーゼ（Ｑ１ＮＥ６６）及びＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテイナーゼ（Ｑ７ＶＨＴ４）とのαＳ１−カゼイン（１１〜２３）のＢＬＡＳＴ配列アラインメントを示す図である。
【図１６】提唱された不競合的阻害モデルを示す図である。Ｅ＝Ａｒｇ−ジンジパイン又はＬｙｓ−ジンジパイン、Ｓ＝ＢＡｐＮＡ基質又はＧＰＫＮＡ基質、Ｉ＝κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド、及びＰ＝ｐ−ニトロアニリド生成物。
【図１７ａ】κ−カゼイン（１０９〜１３７）、Ｚｎ（ＩＩ）及び基質（ＢＡｐＮＡ）との相互作用に関与するＲｇｐＢ活性部位の残基を示す図である。ＲｇｐＢのＨｉｓ２１１及びＧｌｕ１５２、κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＡｓｐ１１５（Ａｓｐ７）及びＧｌｕ１１８（Ｇｌｕ１０）とＺｎ（ＩＩ）との間の静電相互作用を強調している。ペプチドのＩｌｅ１２２（Ｉｌｅ１４）とＢＡｐＮＡ基質との間の疎水性相互作用も強調している。ＲｇｐＢのＴｒｐ２８４及びＣｙｓ２４４がそれぞれ、基質のＡｒｇ残基及びアミド結合との相互作用を形成する。
【図１７ｂ】Ｚｎ（ＩＩ）の存在下でＲｇｐＢ：ＢＡｐＮＡ複合体と結合するκ−カゼイン（１０９〜１３７）の提唱された分子モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【００４２】
プロテアーゼ阻害作用を示す化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を口腔ケア製品、機能性食品及び医薬品に使用することができる。本発明により、ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞外プロテアーゼ阻害活性を特徴とする新たなミルクカゼインペプチドが同定された。これらのペプチドは、合成的に製造するか、又はミルクカゼインの酵素消化により得ることができる。ペプチドをヒト、ウシ、ヤギ及びヒツジを含む様々な種由来のミルクカゼインから得ることができる。
【００４３】
ウシのミルクカゼインは、更なるタンパク質分解に比較的耐性のあることが知られているタンパク質の天然供給源である。ウシのミルクカゼインは牛乳消化後のヒトの小腸末梢部及び血液で検出されている。
【００４４】
これらのペプチドには幾つかの利点があり、これには天然供給源から誘導することができること、感知可能なほどの風味を有しないこと、及び併用すると、亜鉛等の二価カチオンの風味を消すことができるといったことが含まれるが、これらに限定されない。ペプチドは、
αＳ１−カゼイン（１１〜２３） （配列番号１）
β−カゼイン（１９３〜２０９） （配列番号２）
κ−カゼイン（１０９〜１３７） （配列番号３）
β−カゼイン（１９３〜２０５） （配列番号４）
κ−カゼイン（１１７〜１３７） （配列番号５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明は配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列の機能的断片も含む。機能的断片は配列番号１〜配列番号５に対応するアミノ酸配列よりも短いが、配列番号１〜配列番号５に対応するアミノ酸配列の機能を維持しているアミノ酸配列である。機能的断片は、例えばエクソペプチダーゼを用いてアミノ酸配列を短くし、又はより長さの短いアミノ酸配列を合成し、その後以下の実施例に示される方法等により任意のプロテアーゼ阻害活性を試験することにより容易に求めることができる。
【００４６】
配列番号１〜配列番号５が誘導されるウシカゼインに対してオーソロガス及びパラロガスであるタンパク質の断片に対応する配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列の変異体も本発明の範囲内である。
【００４７】
配列が遺伝子重複事象により分離した場合、該配列は「パラロガス」である。すなわち同じゲノムの２つの異なる位置を占めるように、生物において遺伝子が重複する場合、２つのコピーはパラロガスである。
【００４８】
配列が種分化事象により分離した場合、該配列は「オーソロガス」である。すなわち種が２つの異なる種に分化する場合、得られる種の単一遺伝子の分化コピーはオーソロガスであるといえる。
【００４９】
本発明の範囲内にある別の変異体群は、翻訳後修飾を含有する配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列である。特定の翻訳後修飾はリン酸化及びグリコシル化である。これらの修飾を説明するために、以下のようにウシカゼインの多くの既知の遺伝的変異体が知られている：
Ａ．αＳ１−カゼイン類
１．αＳ１−カゼインＸａ−９Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）
２．αＳ１−カゼイン断片
Ｂ．αＳ２−カゼイン類
１．αＳ２−カゼインＸａ−１５Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）
２．αＳ２−カゼインＸａ−９Ｐ（ｆ５１〜２０７）（遺伝的変異体−Ａ、Ｃ）
３．αＳ２−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ６５〜２０３）（遺伝的変異体−Ａ、Ｃ）
Ｃ．β−カゼイン類
１．β−カゼインＸａ−５Ｐ（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
２．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
３．β−カゼインＸａ−（ｆ１０６〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ２）
４．β−カゼインＸａ−（ｆ１０８〜２０９）（遺伝的変異体−Ａ２、Ｂ、Ｆ、Ｇ及びＨ２）
５．β−カゼインＸａ−４Ｐ（ｆ１〜２８）（遺伝的変異体−Ａ２、Ｄ及びＨ１）
６．β−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ１〜１０５）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
７．β−カゼインＸａ−５Ｐ（ｆ１〜１０７）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
８．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜１０５）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
９．β−カゼインＸａ−１Ｐ（ｆ２９〜１０７）（遺伝的変異体−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ１、Ｈ２及びＩ）
Ｄ．κ−カゼイン類
１．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｈ、Ｉ及びＪ）
２．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（ｆ１０６〜１６９）（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２及びＪ）
３．κ−カゼインＸａ−２Ｐ（ｆ１１７〜１６９）（遺伝的変異体−Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ２及びＪ）
ａＸは遺伝的変異体を示し、遺伝的変異体は以下の括弧内で述べられた変異体のいずれか１つであり得る。
【００５０】
上記の名称はカゼインの既知の変異体を示している。例えばβ−カゼインＢ−１Ｐ（ｆ２９〜２０９）は、該タンパク質がβ−ファミリーのカゼインの一部であり、Ｂ遺伝的変異体であり、リン酸化することができるアミノ酸残基を含有し、残基２９〜残基２０９のβ−カゼインタンパク質の断片であることを示す。どのアミノ酸がこれらのタンパク質においてリン酸化を受けやすいかは既知である。カゼイン変異体の名称及び更なる説明は、Farrell et al. Nomenclature of Proteins of Cow's Milk - Sixth Revision. Journal of Dairy Science (2004)87:1641-1674に記載されている。したがって、配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列に対応するこれらの配列の断片は変異体であり、開示される本発明の一部を形成する。
【００５１】
ペプチドの特定の配列ではなくペプチドの物理的性質によりプロテアーゼ阻害活性がもたらされると考えられるため、活性を実質的に損うことなく、ペプチド配列においていわゆる保存的置換を行うことができる。本発明を限定するものではないが、幾つかの実施形態では、ペプチド又はペプチド模倣物のアミノ酸の最大２５％が保存的に置換される。活性の実質的な喪失をもたらさないこのような保存的置換が本発明に包含されることが意図される。上記で言及された保存的置換の概念は当業者に十分に理解されているが、明確化のために、保存的置換は以下に記載のものである。
【００５２】
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及び
Ｐｒｏ、Ｎα−アルカルアミノ酸（alkalamino acids）。
【００５３】
当業者にとって既知のように、アミノ酸の極性群、荷電（＋）群、荷電（−）群又は脂肪族群のうちの１つの成員の同じ群の別の成員による任意の置換は、保存的置換であり得る。
【００５４】
これらの付加的な実施形態を例示するために（本発明を限定しない）、以下の配列が与えられる：
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）、
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号１）（ボス・タウルス（Bos taurus）（ウシ））
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号６）（ブバルス・ブバリス（Bubalus bubalis）（アジアスイギュウ（家畜種）（Domestic water buffalo）））
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号７）（キャプラ・ヒルカス（Capra hircus）（ヤギ））
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ（配列番号８）（オービス・アリエス（Ovis aries）（ヒツジ））
β−カゼイン（１９３〜２０９）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ（配列番号２）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ（配列番号９）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
β−カゼイン（１９３〜２０５）、
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号４）（ボス・タウルス（ウシ））
κ−カゼイン（１０９〜１３７）、
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号１０）（アカスイギュウ（Syncerus caffer nanus）（フォーレストバッファロー（Forest Buffalo）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１１）（ボス・インディカス（Bos indicus）（コブウシ（Zebu）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１２）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１３）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号１４）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１６）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１７）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１８）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号１９）（オレアムノス・アメリカヌス（Oreamnos americanus）（シロイワヤギ（Mountain goat）））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２０）（オレアムノス・アメリカヌス（シロイワヤギ））
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２１）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
κ−カゼイン（１１７〜１３７）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ（配列番号２２）（アカスイギュウ（フォーレストバッファロー））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２３）（ボス・インディカス（コブウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２４）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２５）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｇｌｕ（配列番号２６）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ） Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２７）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ（Ｐ） Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２８）（ボス・タウルス（ウシ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号２９）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３０）（ブバルス・ブバリス（アジアスイギュウ（家畜種）））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３１）（オレアムノス・アメリカヌス（シロイワヤギ））
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ（配列番号３２）（キャプラ・ヒルカス（ヤギ）、オービス・アリエス（ヒツジ））
（Ｐ）は前述のアミノ酸がリン酸化されていることを指す。すなわちＳｅｒ（Ｐ）はリン酸化されたセリンアミノ酸である。
【００５５】
（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ）は、前述のアミノ酸がアミノ酸側鎖のヒドロキシ酸素と結合したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有することを指す。すなわちＴｈｒ（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ）はその側鎖のヒドロキシ酸素と結合したＮ−アセチルガラクトサミンを有するトレオニンアミノ酸である。他のグリカンはＧａｌＮＡｃと結合し、グリカン鎖長を増大することにより、二糖類、例えばＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ、三糖類、例えばＮｅｕＡｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌ（β１−３）［ＮｅｕＡｃ（α２−６）］ＧａｌＮＡｃ、及び四糖類、例えばＮｅｕＡｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−３）［ＮｅｕＡｃ（α２−６）］ＧａｌＮａｃを含むようにすることができる。
【００５６】
本発明は、ＤＥＰＴＸＰＴＴＥ（式中、Ｘ＝ＴＱ又はＳＴ）、ＱＥＰＶＸ１ＧＰＶＲＧＰＸ２ＰＩＩＸ３Ｉ（式中、Ｘ１＝Ｌ、Ｎ又はＫ、Ｘ２＝Ｆ、Ｙ又はＣ、及びＸ３＝Ｌ、Ｈ又はＶ）及びＥＶＬＮＥＮＬＬＲＦからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物も提供する。
【００５７】
これらの実施形態では本発明は、配列番号１〜配列番号３２（端を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になるが、全長カゼイン配列を含まない、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００５８】
配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つにより規定されるアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の欠失を、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のプロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する能力を損わずに行うことができることが当業者に理解されるであろう。或る特定の実施形態では、配列番号１〜配列番号３２を含むペプチド又はペプチド模倣物の最大２５％が欠失され得るが、得られるペプチド又はペプチド模倣物はプロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する能力を維持していなければならない。配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つと１つ又は複数のアミノ酸欠失によって異なるアミノ酸配列を有する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が依然として、プロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載のものを含む実験を実施することができる。
【００５９】
本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を、歯周病の治療又は予防を必要とする被験体の歯茎に直接投与することができる。幾つかの実施形態では、本発明の組成物を局所的に投与するが、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を非経口的に、例えば注射により静脈内に、腹腔内に、筋内に、髄腔内に又は皮下にも投与することができることが当業者に理解されるであろう。
【００６０】
代替的には、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物を、経口投与（舌下投与及び口腔投与を含む）、経肺投与（鼻内投与及び吸入投与）、経皮投与、又は直腸投与用の組成物として構築することができる。
【００６１】
治療を必要とする被験体は歯周病の亜臨床（subclinical：無症候性）症状又は臨床症状を示す被験体であり得る。歯周病の亜臨床兆候又は臨床兆候は、歯肉の急性又は慢性の炎症を含む。血漿及び白血球の血液から損傷組織への移動の増大を含む急性炎症の特質が存在し得る。発赤（紅化）、発熱（熱増大）、腫瘍（腫脹）、痛み（疼痛）及び機能喪失（機能低下）を含む歯肉の急性感染の臨床徴候も存在し得る。慢性炎症は白血球細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞）の浸潤を特徴とし得る。組織及び骨量の減少が観察される場合もある。治療を必要とする被験体は、歯周部位に存在するポルフィロモナス・ジンジバリス細菌レベルが、歯周病ではない個体で観察される正常な範囲を超えて増大していることも特徴とし得る。
【００６２】
投与経路は、投与するアンタゴニスト又は組成物の性質、及び被験体の病態の重症度を含む多くの因子に応じて異なり得る。本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物の投与頻度、及び本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物の投与量は、特に被験体における歯周病の発症又は進行の段階に応じて被験体ごとに異なり得ることが理解される。投与頻度は臨床医が決定することができる。
【００６３】
ジンジパイン又は関連のプロテアーゼ（例えば他のシステインプロテアーゼ）のプロテアーゼ活性の結果として起こる、又はそれに関連する任意の疾患、病態又は症状は、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物により予防又は治療することができることも考慮する。さらに、歯周病の結果として起こる、若しくはそれに関連する他の疾患、病態若しくは症状も治療することができるか、又はこれらの疾患、病態若しくは症状を発症する危険性を低減することができる。例えば、歯周病は個体が心疾患を発症する危険性を増大させ得る。この心疾患を発症する増大した危険性は、歯周病の個体に本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を投与することにより歯周病を治療することによって低減させることができる。
【００６４】
「ペプチド模倣物」は、本発明のペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能的特性を有する合成化合物である（機能的特性を本明細書で更に記載する）。通常、ペプチド模倣物は本発明のペプチドと同じ又は類似の構造、例えばカゼイン又はその断片と同じ又は類似の配列を有する。ペプチド模倣物は一般的に、自然には合成されない残基を少なくとも１つ含有する。ペプチド模倣化合物の非天然構成要素は、ａ）天然型のアミド結合（「ペプチド結合」）による連結以外の残基連結基、ｂ）自然発生的なアミノ酸残基の代わりとなる非天然型の残基、又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわち二次構造、例えばβターン構造（turn）、γターン構造、βシート構造、αヘリックス構造等を誘導又は安定させる残基のうちの１つ又は複数によるものであり得る。
【００６５】
ペプチド模倣物は、科学文献及び特許文献、例えばOrganic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223、Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119、Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27、Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234に記載の多様な手順及び方法論を用いて合成することができる。
【００６６】
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物を、ＧＭＰ条件下で、又は幾つかの実施形態では従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和（levigating）、乳化、カプセル封入、封入若しくは凍結乾燥のプロセスにより製造することができる。
【００６７】
医薬組成物を、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いて構築することができる。これらの成分により、ペプチド又はペプチド模倣物を薬学的に使用することができる調製物へと加工処理するのが容易となり得る。
【００６８】
治療のための投与は非経口投与、静脈内投与、経口投与、皮下投与、動脈内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、局所投与、鼻内投与又は筋内投与であり得る。
【００６９】
非経口投与用の医薬組成物は一般的に滅菌されており、実質的に等張である。ハンクス液、リンガー液、又は生理食塩バッファー若しくは酢酸バッファー等の生理学的に相溶性のバッファーを使用することができる。該溶液には、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤が含有されていてもよい。ペプチド又はペプチド模倣物を粉末形態で準備し、使用前に発熱性物質除去滅菌水等の溶媒に溶解させてもよい。
【００７０】
ペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本明細書で規定の本発明のペプチドに対する「アミノ酸配列の同一性のパーセント（％）」又は「パーセント（％）同一な」は、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、特定のペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本発明のペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される（配列同一性の一部としてはいずれの保存的置換も考慮しない）。
【００７１】
当業者は、比較対象の配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要となる任意のアルゴリズム（非限定的な例が以下に記載される）を含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを求めることができる。アミノ酸配列をアラインメントする場合、所定のアミノ酸配列Ｂに対する（to, with, or against）所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（代替的には所定のアミノ酸配列Ｂに対して或る特定のアミノ酸配列同一性パーセントを有するか又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表すことができる）は、アミノ酸配列同一性パーセント＝Ｘ／Ｙ×１００（式中、ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアラインメントにより完全な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）として算出することができる。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性パーセントと等しくない。
【００７２】
同一性パーセントを算出する際には、通常正確な一致数を数える。数学アルゴリズムを用いて２つの配列間の同一性パーセントの測定を達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズム（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように修正）である。このようなアルゴリズムをAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込む。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０）をAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように利用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係を検出する反復サーチ（iterated search）を行うのに使用することができる。上記のAltschul et al. (1997)を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用することができる。アラインメントを手検測（manually by inspection）により行うこともできる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例はＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸配列又はＤＮＡ配列全体をアライメントすることにより、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを幾つかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールに使用する。ＣｌｕｓｔａｌＷによるアミノ酸配列のアラインメントの後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例はＧＥＮＥＤＯＣ（商標）又はＪａｌＶｉｅｗ（http://www.jalview.org/）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）により、多数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性の評価が可能になる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムを、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。
【００７３】
本発明はヒトでの適用が見出されているが、本発明は獣医学的目的にも有用である。本発明は、本明細書に記載のように、ウシ、ヒツジ、ウマ及びトリ等の家畜動物、ネコ及びイヌ等のペット、並びに動物園の動物における疾患又は病態の治療又は予防に有用である。
【００７４】
上述の医薬組成物を含有する本発明の経口組成物を、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品、並びに他の食品等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用することができる。本発明による経口組成物は特定の経口組成物の種類及び形態に応じて更なる既知の成分を更に含んでいてもよい。
【００７５】
任意で組成物は、グラム陰性の嫌気性細菌にとって毒性であるか、又はグラム陰性の嫌気性細菌の増殖を阻害する１つ又は複数の抗生物質を更に含んでいてもよい。潜在的に任意の静菌性又は殺菌性の抗生物質を本発明の組成物に使用することができる。好適な抗生物質としては、アモキシシリン、ドキシサイクリン又はメトロニダゾールが挙げられる。
【００７６】
本発明の或る特定の形態において、経口組成物は性質が実質的に液体のもの、例えば洗口液又はリンス剤であり得る。このような調製物において、ビヒクルは通常、望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は通常、調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは通常、エタノール又はイソプロパノールである。或る特定の実施形態では、アルコールはエタノールである。
【００７７】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して、約５〜約９、通常約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（例えばクエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【００７８】
本発明の他の望ましい形態において、組成物は、性質が実質的に固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はゲル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に、歯科的に許容される研磨材料を含有する。
【００７９】
歯磨きペーストにおいて、液体ビヒクルは、通常調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なゲルにおいて、約２．５％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールが通常用いられる。
【００８０】
歯磨きペースト、クリーム及びゲルは通常、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、例えば約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然型又は合成型の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は、合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として利用可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ Ｄはおよそ５８．００重量％のＳｉＯ２、２５．４０重量％のＭｇＯ、３．０５重量％のＮａ２Ｏ、０．９８重量％のＬｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【００８１】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【００８２】
従来通り経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売又はそうでなくとも流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、歯磨きペースト、クリーム又はゲルは通常、それを実質的に歯磨きペースト、ゲル又は歯科用クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、若しくはプラスチック製の）、又は内容物を測り出すための他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサーに入っている。
【００８３】
治療作用又は予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物をより化粧品として許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料はその性質がアニオン性、非イオン性又は両性であってもよく、幾つかの実施形態では活性剤と相互作用しない。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが通常である。アニオン性界面活性剤の好適な例は、高級脂肪酸モノ硫酸モノグリセリドの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、スルホン酸１，２−ジヒドロキシプロパンの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキルラジカル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないとされるＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト（sarconite）化合物の使用は、これらの材料が酸溶液中での歯のエナメル質の溶解性を或る程度低減させることに加えて、炭水化物分解による口腔での酸形成の阻害における長期にわたる顕著な効果を示すために特に有益である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有し、エチレンオキシドと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物（該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」)は親水性ポリオキシエチレン部分を含有する）、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物である。
【００８４】
界面活性剤は通常、約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の活性剤の溶解を助け、それにより必要となる可溶化保湿剤の量を減らすことができることは注目に値する。
【００８５】
増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【００８６】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤はそれぞれ又はともに、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含まれ得る。
【００８７】
本発明の組成物の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を、例えば加温したガム基剤中に攪拌すること又はガム基剤の外面をコーティングすることによりロゼンジに、又はチューイングガム若しくは他の製品に組み込むこともできる。ガム基剤の例は、望ましくは従来の可塑剤若しくは柔軟剤、糖類、又は例えばグルコース、ソルビトール等の他の甘味料を含むジェルトン、ゴム乳液、ビニライト樹脂等である。
【００８８】
更なる態様では、本発明は、（ａ）化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを備える部品のキットを提供する。望ましくは該キットは、このような治療を必要とする患者における歯周病の治療又は予防に使用される取扱説明書を更に含む。
【００８９】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効な（elegant）口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有してもよい。
【００９０】
錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管での崩壊及び吸収を遅らせ、それによりより長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料を利用してもよい。
【００９１】
経口使用のための製剤を、硬ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）、又は軟ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）提示してもよい。
【００９２】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【００９３】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料、例えばベンゾエート、例えばエチルｐ−ヒドロキシベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【００９４】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより構築してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【００９５】
本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例を記載し、本発明の幾つかの態様及び実施形態を説明する。
【実施例】
【００９６】
材料及び方法
【００９７】
ペプチドの酵素消化及び精製
カゼイネート−ＨＣｌ（Bonlac Foods, Melbourne Australia）を、最終濃度が２１．５ｇ／Ｌになるまで常時攪拌しながら、５０℃、ｐＨ８．０の脱イオン水にゆっくりと添加することにより溶解させた。カゼイネートが溶解したら、温度を３７℃まで下げ、１ＭのＨＣｌをゆっくりと添加することによりｐＨを６．３まで調整して、カゼインの沈殿を回避した。加水分解を開始するために、レンネット（９０％キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）、１４５ＩＭＣＵ／ｍｌ、単一濃度（Single Strength）、Chr. Hanson）を、カゼイン１ｇ当たり１．２ＩＭＣＵの最終濃度となるまで添加し、溶液を３７℃で１時間攪拌した。１ＭのＨＣｌ及び１ＭのＮａＯＨを添加することにより、溶液のｐＨを６．３±０．２に維持した。最終濃度が４％になるまでトリクロロ酢酸を添加することにより、加水分解を停止させ、沈殿したタンパク質を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、４℃）によりペレット状にした。カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含有する上清を、３０００Ｄａのカットオフ膜（Ｓ１０Ｙ３、Amicon）を用いた透析濾過により濃縮した。それからこの材料を凍結乾燥した。調製物をＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Amersham Pharmacia Biotech, USA）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Amersham Biosciences, USA）を用いて分画し、流速０．５ｍｌ／分で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて溶出した。溶出液を２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長でモニタリングした。２分毎に画分を回収した。全ての試料をＣｈｒｉｓｔ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ（Osterode am Harz, Germany）で凍結乾燥し、−７０℃で保存した。Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより画分を更に分画し、９０％アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを用いて溶出した。溶出液を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００Ｓダイオードアレイ及び多波長検出器（Agilent Tech., Palo Alto, California）を用いて２１４ｎｍの一次波長でモニタリングした。回収した全ての画分を凍結乾燥し、−７０℃で保存した。それぞれの画分の同一性を質量分光分析により確認した。
【００９８】
グリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）を、前に記載のように（Malkoski et al., 2001）キモシン消化により得た。κ−カゼイン（１０６〜１３７）を、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｖ８株（Roche, Penzberg Germany）由来のエンドプロテアーゼ−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｅ：Ｓ；１：２００）を用いた、３７℃、２４時間での５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）バッファーに溶解したグリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）の加水分解により得た。２ＭのＮａＯＨを添加することによりｐＨを６．０まで増大させることにより、加水分解を終わらせ、分析（Ｃ１８）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてペプチドを分離した。回収した画分を分析し、ＭＳ／ＭＳ分析を用いてペプチドを同定した。
【００９９】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ
ペプチド試料を、標準的なバッファー（５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）中で飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）マトリクスを用いたＭＴＰ ３８４ターゲットグラウンド鋼板上で同時に結晶化させた（１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））。試料をＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker, Bremen, Germany）で分析した。ローカルＭＡＳＣＯＴサーバーでインストールしたカゼインデータベースに適合させた分画スペクトルを用いたBruker DaltonicsのｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ２．４及びBruker DaltonicsのＢｉｏＴｏｏｌｓ３．０ソフトウェアを用いて、分析を行った。
【０１００】
固相ペプチド合成
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０５）ペプチド、β−カゼイン（１９３〜２０９）ペプチド、κ−カゼイン（１０６〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１１７〜１３７）ペプチド、κ−カゼイン（１１７〜１２３）ペプチド及びκ−カゼイン（１２７〜１３７）ペプチドを、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチドシンセサイザー（CEM Corporation, North Carolina）で標準的なＦｍｏｃ−ケミストリプロトコルを用いて調製した。ペプチド合成は各Ｃ末端アミノ酸に結合したＷａｎｇ樹脂上のアミド末端から進行した。Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。
【０１０１】
エレクトロスプレーＭＳ
ＲＰ−ＨＰＬＣにより回収された画分を、エレクトロスプレー質量分析モードで操作するＥｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステム（Bruker Daltonics）を用いて分析した。試料の注入を３４０μＬ／時間で行い、窒素流は５Ｌ／分、乾燥ガス温度は３００℃であった。
【０１０２】
細菌株及び増殖条件
グリセロール又はポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０及びＡＴＣＣ ３３２７７細胞の凍結乾燥培養物を、ウマ血液アガー（ＨＢＡ、Oxoid）上で３７℃で嫌気的に増殖させた。ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞を継代培養により維持し、第３代〜第７代のの細胞だけを用いて、へミン（５ｍｇ／Ｌ）及びシステイン（０．５ｇ／Ｌ）、並びにＡＴＣＣ ３３２７７ではビタミンＫ３（メナジオン）（５ｍｇ／Ｌ）を添加したブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）（３７ｇ／Ｌ）２０ｍＬ及び２００ｍＬに接種した。６５０ｎｍの波長での培養物の光学密度（ＯＤ）の測定により増殖を求めた。培養物のグラム染色を任意のコンタミネーションを確認するために行った。ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞を遠心分離（８０００×ｇ、２０分、４℃）により指数増殖期で回収し、０．５ｇ／Ｌのシステインを含有するＴＣ１５０バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））で１回洗浄した。洗浄した細胞を２ｍＬのＴＣ１５０バッファー（０．５ｇ／Ｌのシステインを有する）で再懸濁し、４℃で維持し、すぐにタンパク質分解アッセイに使用した。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体及びＲｇｐＢの精製
【０１０３】
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を後期指数増殖期まで２Ｌのバッチ培養物中で増殖させ、前に記載された手順（Pathirana et al., 2006）に基づき、Ａｒｇ−セファロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４抽出物からＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体を精製した。前に公開された手順（Chen et al., 2002、Pike et al., 1994）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＨＧ６６株からＲｇｐＢを精製した。
【０１０４】
発色基質を用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の測定
インキュベーション容量を減らして９６ウェルプレートを用いて行うように修正し、適合させたポルフィロモナス・ジンジバリスの全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性のために開発したアッセイを用いて細菌のプロテアーゼ阻害活性を求めた（O'Brien-Simpson et al., 1998、O'Brien-Simpson et al., 2001）。合成発色基質；Ｎ−α−ベンゾイル−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−ＢＡｐＮＡ）及びＮ−（ｐ−トシル）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ４−ニトロアニリド酢酸塩（ＧＰＫ−ＮＡ）（Sigma Aldrich）を用いてＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を求めた。Ａｒｇ特異的な反応バッファー及びＬｙｓ特異的な反応バッファーは、３０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、０．９３ｍＭのＬ−システイン、４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌに溶解した２ｍＭのＬ−ＢＡｐＮＡ又はＧＰＫ−ＮＡをそれぞれ含有していた。要求される濃度に応じて、カゼインペプチドをＴＣ１５０バッファーで希釈した。１０ｍＭのＬ−システイン（ｐＨ８．０）１０μＬ及びポルフィロモナス・ジンジバリス全細胞懸濁液、精製ＲｇｐＡ−Ｋｇｐプロテイナーゼ付着因子複合体（０．０１μｇ／μＬ）又は精製ＲｇｐＢ（０．００１１６μｇ／μＬ）のいずれかを最終容量が１００μＬとなるまで添加した。それから試料を３７℃で１５分間インキュベートした後、Ａｒｇ特異的な反応バッファー又はＬｙｓ特異的な反応バッファーを添加した（総容量２００μＬ）。PerkinElmerの１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＶＩＣＴＯＲ３（商標）（Waltham, MA）を用いて、３７℃で１０秒間隔で約２０分間、ｐＨ８．０で、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより、活性を求めた。８ｍＭのＺｎＣｌ２のストック溶液を脱イオン水で調製し、特定のアッセイで要求される濃度で凍結乾燥したカゼインペプチドを溶解させるのに使用した。対照試料は、あらゆるプロテアーゼ阻害物質、すなわちペプチド及び／又は亜鉛を欠いていた以外は（however）試験試料と同一であった。
【０１０５】
インキュベーション後、分析（Ｃ１８）カラム及びバッファーＢが０％〜１００％という線形勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、アッセイ内容物を分析し、アッセイ中、カゼインペプチド分解が起こったか判定した。溶出した画分をＥＳＩ−ＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
【０１０６】
蛍光標識したウシ血清アルブミンを用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのタンパク質分解活性の測定
前に公開された手順（Grenier et al., 2002、Yoshioka et al., 2003）を修正してＤＱ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＢＳＡ（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて、細菌のプロテアーゼ阻害活性も求めた。指数増殖（Ｏ．Ｄ６５０ｎｍ＝０．６）中に回収したポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７の全細胞を、１つのウェル当たり５．６×１０９ｃｆｕ／ｍＬでアッセイに使用した。アッセイ混合物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞（１００μＬ培養物）、ＴＣ１５０及び阻害剤（最終容量８０μｌ）、並びにＤＱ ＢＳＡ（２０μＬ、２００μｇ／ｍＬ）を含有していた。１ｍＭのＮ−α−ｐ−トシル−ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で処理した細胞を対照として使用した。ＴＬＣＫはＲｇｐ活性及びＫｇｐ活性の両方を阻害するとことが知られている（Fletcher et al., 1994、Pike et al., 1994）。アッセイ混合物を３７℃で２時間暗所でインキュベートし、その後蛍光光度計（PerkinElmerの１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＶＩＣＴＯＲ３（商標））を用いて、蛍光を測定した（Ｅｍ ５３５ｎｍ、Ｅｘ ４８５ｎｍ）。陰性対照（ＴＬＣＫ処理細胞）から得られた蛍光値を全ての値から減算した。特に明記しない限り、三連で２〜３回の生物学的反復測定により全てのアッセイを実施した。
【０１０７】
部分阻害濃度指数
部分阻害濃度指数（ＦＩＣ指数）は、２つ以上の阻害剤又は抗菌剤の相互作用（相乗的、相加的、又は拮抗的）を規定する尺度である（Berenbaum, 1978）。ＦＩＣ指数をＦＩＣ指数＝［（Ａ＋Ｂ）／Ａ］＋［（Ａ＋Ｂ）／Ｂ］（式中、Ａはκ−カゼイン（１０９〜１３７）の効果を表し、Ｂは塩化亜鉛の効果を表し、Ａ＋Ｂは両方の組合せの効果を表す）として算出する。１を超えるＦＩＣ指数は拮抗効果を示し、１に等しいＦＩＣ指数は相加効果を示し、１未満のＦＩＣ指数は相乗効果を示す。
【０１０８】
阻害の種類及び阻害定数（Ｋｉ）の測定
０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び１ｍＭの基質（ＢＡｐＮＡ）濃度でのＯＤ４０５／秒として初期反応速度を得た。阻害剤（ペプチド）濃度は０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μ及び１００μＭの範囲であった。データをラインウェーバー・バーク（二重逆数）プロットとしてグラフにし、傾きを一次線形回帰により求めた。ラインウェーバー・バークプロットを用いて、Ｋｍ（酵素親和性）及びＶｍａｘ（最大反応速度）値、並びに酵素阻害の種類を求めて、競合阻害剤と、非競合阻害剤と、不競合阻害剤とを区別することができる（Stryer et al., 2002）。阻害剤濃度に対してラインウェーバー・バークプロットの傾きをプロットすることにより、阻害定数（Ｋｉ）を求めた。
【０１０９】
分子モデリング
ＦＵＧＵＥプログラム（Shi et al., 2001）を用いて、１０３４個のタンパク質ファミリーと１０２３０個のアラインメント構造とを含有するキュレーション（curated）タンパク質データベース、ＨＯＭＳＴＲＡＤ（Mizuguchi et al., 1998）に対して阻害剤ペプチドで起こり得る構造モチーフを特定した。ＦＵＧＵＥは、構造プロファイルのデータベースをスキャンし、配列構造適合性スコアを算出し、潜在的なホモログ及びアラインメントのリストを作成する。特異性、感受性及びランク付けをＺスコアに従って算出する。Ｚスコア閾値６は９９％の特異性を示し、Ｚスコア閾値５は９５％の特異性を示す。阻害剤ペプチドモデルを、ＳＹＢＹＬ／Ｔｒｉｐｏｓを用いて構築した。社内（in-house）ソフトウェアを用いて、阻害剤ペプチドにおける潜在的な金属結合部位を、骨格に対する金属原子位置及びモデルペプチドのＣ□原子位置の軌跡により特定した。
【０１１０】
結果
【０１１１】
発色基質を用いたポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の測定
２００μＭのペプチド濃度で、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を約９０％阻害する最も有効な結果を示したが、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）はそれぞれ、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の約７０％及び約６０％の阻害を示した（図１、図２及び表１、表２；陰影セル（shading key）に関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。β-カゼイン（１９３〜２０９）は、全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の両方を５０％阻害したが、より短いβ−カゼインペプチド（１９３〜２０５）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を１５％しか阻害しなかった（図１、図２及び表１、表２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。ペプチドを様々な濃度で分析し、タンパク質分解活性の阻害率（％）により、ペプチド濃度に対する用量応答性が実証された（図１、図２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。続いて、精製された外膜プロテアーゼ複合体（ＲｇｐＡ及びＫｇｐを含む）をタンパク質分解アッセイに使用して、観察されるタンパク質分解の阻害が全細胞に存在し得る他のプロテアーゼによるものではないことが確認された。したがって、ペプチドはＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を阻害し、更には僅か１００μＭのペプチドで阻害能の増大を示した（図３、表１、表２；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。
【０１１２】
Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の最も有意な阻害を示すκ−カゼイン（１０９〜１３７）を更に評価した。ペプチドを精製ＲｇｐＢに対して評価し、ペプチドの結合位置を求めた。ＲｇｐＢのタンパク質分解活性の阻害は、ペプチドがプロテアーゼ複合体ではなく、プロテアーゼ自体と結合することを示した（図４、表１）。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
阻害に必須の残基を明らかにするため、ＬｙｓリッチＮ末端領域を有しない一連のペプチドを合成した；κ−カゼイン（１１７〜１２３）、κ−カゼイン（１２７〜１３７）及びκ−カゼイン（１１７〜１３７）。蛍光ＢＳＡによる全細胞アッセイにおいて、及び発色基質による精製ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を用いたタンパク質分解アッセイにおいて、ポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテイナーゼの阻害に関して、これらの合成ペプチドをスクリーニングした（表３、表４、図５）。κ−カゼイン（１１７〜１３７）だけがより長いκ−カゼイン（１０９〜１３７）と同程度の阻害能を有する阻害活性を示した。このことにより、プロテイナーゼ阻害に関してＮ末端領域のＬｙｓ残基は重要ではないことが実証された。精製κ−カゼイン（１０６−１６９）は、蛍光ＢＳＡによる全細胞アッセイで試験した場合、より短いκ−カゼイン（１０９〜１３７）と同程度の有効性を示した（図５）。
【０１１６】
また蛍光基質であるＤＱ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＢＳＡを、ポルフィロモナス・ジンジバリスの全細胞のプロテイナーゼ活性に対するカゼインペプチドの阻害活性を測定するのに使用した。ペプチドを添加する前に、アッセイを、１つのウェルあたりの細胞数及びインキュベーション時間に関して最適化した。アッセイに関して、１つのウェル当たり１０９個の細胞との２時間のインキュベーション期間を選択したが、これはタンパク質の加水分解速度がこれらの条件下で線形であったためであった。カゼインに由来するグリコシル化されていないκ−カゼイン（１０６〜１６９）ペプチドは、アッセイにおいて５００μＭのペプチド濃度でＢＳＡに対するプロテイナーゼ活性を６０％阻害した。より短い合成断片であるκ−カゼイン（１０６〜１３７）は、発色アッセイにおいて２００μＭの濃度ではＡｒｇ特異的なプロテアーゼ活性及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼ活性に対する効果をほとんど有しなかったが、蛍光アッセイにおいて５００μＭのペプチド濃度でプロテアーゼ活性を約３７％阻害した（表４及び図５）。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
補助阻害剤（Co-inhibitor）としての塩化亜鉛
ＺｎＣｌ２は、ベンズアミジン及びクロルヘキシジン等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤の阻害能を増大させることが分かっている潜在的な補助阻害剤である。補助阻害剤としての亜鉛の可能性を調べるために、全細胞のＡｒｇ特異的なプロテアーゼアッセイ及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイを、ペプチド［κ−カゼイン（１０９〜１３７）／β−カゼイン（１９３〜２０９）／αＳ１−カゼイン（１１〜２３）］とＺｎＣｌ２とを１：４の比で用いて行った。
【０１２０】
１００μＭでは、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は全細胞のＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を６０％阻害し、４００μＭのＺｎＣｌ２は３０％の阻害を示した。しかしながら、κ−カゼイン（１０９〜１３７）及びＺｎＣｌ２を１：４の比で組み合せると、阻害は９０％まで増大した（図６）。ペプチドと亜鉛との混合物は、精製プロテアーゼ複合体を用いて分析した場合でも、Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性の阻害の増大を示した（図８；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。同様の結果がκ−カゼイン（１０９〜１３７）を用いたＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイにおいて観察された。すなわち、ＺｎＣｌ２の添加により、個々で分析した場合のペプチドの阻害能と比較して９０％まで阻害能が増大した（図７）。ＦＩＣ指数に基づくと、Ｚｎ２＋の効果は相乗的である（表５）。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
１００μＭのβ−カゼイン（１９３〜２０９）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を３０％阻害したが、４００μＭのＺｎＣｌ２は５０％の阻害を示した。１：４の比で組み合わせると、タンパク質分解の阻害は７０％まで増大した（図９；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。Ｌｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイでは、β−カゼイン（１９３〜２０９）：ＺｎＣｌ２の混合物により、個々で分析した場合のペプチドの阻害剤の阻害能と比較して９０％まで阻害能が増大した（図１０；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。β−カゼイン（１９３〜２０９）及びＺｎＣｌ２のＦＩＣ値は、阻害が相乗的であることを示している（表６）。
【０１２３】
【表６】
【０１２４】
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）は１００μＭでＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を４０％阻害したが、ＺｎＣｌ２は４００μＭでＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性を５０％阻害した。阻害剤を１：４の比で組み合わせると、タンパク質分解の阻害は７０％まで増大した（図９；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。Ｌｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイでは、阻害剤の混合物により、８５％まで阻害能が増大した（図１０；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。これとは対照的に、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）及びＺｎＣｌ２に関して算出されたＦＩＣ値は、両方の阻害剤の混合物が相乗的ではなく、相加的であることを示している（表７）。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
阻害定数（Ｋｉ）及び阻害機構の測定
κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドの阻害定数及び阻害機構を求めるために精製ＲｇｐＢを用いて、酵素反応速度アッセイを行なった。作成したラインウェーバー・バークプロットは、κ−カゼイン（１０９〜１３７）による不競合阻害を示している（図１１；陰影セルに関しては「図面の簡単な説明」での上記の図の説明文を参照されたい）。不競合阻害の場合、Ｋｉ値は５０％阻害に要求される阻害剤濃度（ＩＣ５０）の値に等しい。Ｋｉ値は阻害剤とＥＳ複合体との結合に関する解離定数を表し、この場合Ｋｉ値は４０．２μＭである（図１２）。
【０１２７】
カゼイン由来ペプチドのＢＬＡＳＴサーチ及び配列アラインメント
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）配列は、ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡプロテアーゼサブユニット（シャペロン様プロテアーゼ）との配列類似性を示す（図１５）。ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡは、微生物におけるストレス応答に重要なＡＴＰ依存性セリンプロテアーゼ複合体（それぞれＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＡＰと呼ばれる）のサブユニットである。黄色ブドウ球菌では、ＣｌｐＸＰは浸透圧ストレス、酸化ストレス及び低温下での生存に一定の役割を果たす。ポルフィロモナス・ジンジバリスでは、ＣｌｐＸＰの喪失は酸化ストレス耐性に影響しないが、宿主の上皮細胞の浸潤、熱耐性及びバイオフィルム形成に重要であると考えられる。ＣｌｐＡＰ及びＣｌｐＸＰは同一の活性を有してはいないが、類似している。カゼイン配列は、ＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテアーゼ（ＦｔｓＨ １）（これもポルフィロモナス・ジンジバリスにおけるバイオフィルム形成に一定の役割を果たす）とも類似性を示す。カゼイン配列は既知のプロテアーゼ阻害剤とは類似性を全く示さない。
【０１２８】
β−カゼイン（１９３〜２０９）は、幾つかのプロテアーゼ阻害剤との配列類似性を示す（図１４）。セリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５又はＬＥＫＴＩ（リンパ上皮カザールタイプ関連阻害剤）は、複数の異なる阻害剤単位を含有するセリンプロテアーゼ阻害剤である。該阻害剤は粘膜上皮の抗炎症保護及び／又は抗菌保護に重要であると考えられ、トリプシン１、カテプシンＧ、プラスミン、サブチリシン−Ａ及びエラスターゼ−２を阻害することが分かっている。エラフィン（又は別名ＳＫＡＬＰ（皮膚由来抗ロイコプロテアーゼ）としても知られている）は更に、エラスターゼ、アルギニルペプチダーゼ、プロテイナーゼ３及びミエロブラスチンを阻害するが、トリプシン、α−キモトリプシン、カテプシンＧ及びプラスミンを阻害しないセリンプロテアーゼ阻害剤である。エラフィンは主にセリンプロテアーゼ阻害剤として作用するが、抗炎症機能にも関与する。エラフィンはそのプロテアーゼ阻害機能とは関係なく、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗菌性及び抗真菌性も示す。
【０１２９】
ＢＬＡＳＴサーチにより、幾つかのプロテアーゼ阻害剤とのκ−カゼイン（１０９〜１３７）の配列類似性が明らかになった（図１３）。これらの中でも、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｑ５ＵＧＩ５及びＰ０５１５５）又はセルピンＧ１が血管透過性の調節及び炎症の抑制；第ＸＩＩａ因子及び血漿カリクレイン（血漿カリクレイン−キニン系のプロテアーゼ）、Ｃ１ｒ又はＣ１ｓプロテアーゼ（相補系）、プラスミン及び組織プラスミノーゲン活性化因子（線溶系）、並びに第ＸＩ因子及びトロンビン（凝固系）を阻害するのに重要である可能性があると考えられている。
【０１３０】
２００μＭの濃度では、κ−カゼイン（１０９〜１３７）は全細胞アッセイにおいて、Ａｒｇ特異的なタンパク質分解活性の約９３％の阻害、及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の９８％の阻害を示した。またペプチドは、２００μＭ濃度で精製ＲｇｐＢプロテアーゼを８０％超阻害した（表１及び表２）。これらの結果は、ペプチドが３つのリシル残基を有するがアルギニル残基を有さず、そのためＲｇｐＢプロテアーゼにより切断されないため特に重要である。
【０１３１】
αＳ１−カゼイン（１１〜２３）は全細胞のプロテアーゼ活性を約６０％阻害し、β−カゼイン（１９３〜２０９）はＡｒｇ特異的なタンパク質分解活性及びＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性の両方の約４０％〜５０％の阻害を示した。この結果は精製プロテアーゼ複合体に対するプロテアーゼ阻害機能の改善も示している。しかしながら、β−カゼイン（１９３〜２０５）は、僅かに長いペプチドと比較して、両方のジンジパインに対して、さほど効力を有しなかった。このことは、追加の残基又はペプチドの長さがペプチドの阻害機能に重要な役割を果たすことを示していると考えられる。
【０１３２】
ＺｎＣｌ２は、ベンズアミジン及びクロルヘキシジン等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤の阻害能を増大させることが示されている潜在的な補助阻害剤である。様々なペプチド対亜鉛の比の効果を、両方の阻害剤の間に相乗効果があるかどうかを判定するために調べた。ＦＩＣ指数を相乗効果を算出するのに用いている。阻害剤の組合せが相加的である場合、ＦＩＣ指数は１に等しくなる。阻害剤同士が拮抗的である場合、同じ効果を得るのにより多くの阻害剤が必要とされ、合計が１より大きくなるのに対し、２つの阻害剤の組合せが別々の場合よりも効果的である場合、相乗効果により合計は１未満になる。全細胞のＡｒｇ特異的なプロテアーゼアッセイの結果及びＬｙｓ特異的なプロテアーゼアッセイの結果から算出されたＦＩＣ指数に基づき、κ−カゼイン（１０９〜１３７）とＺｎＣｌ２との混合物及びβ−カゼイン（１９３〜２０９）とＺｎＣｌ２との混合物は相乗的であったが、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）とＺｎＣｌ２との混合物は相加的であった（表５、表６及び表７）。
【０１３３】
ジンジパイン活性の反応速度のラインウェーバー・バーク分析により、酵素阻害の種類を求めて、競合阻害剤と、非競合阻害剤と、不競合阻害剤とを区別することができる。競合阻害剤は、阻害されていない酵素と同じｙ切片を有する（Ｖｍａｘが同じである）が、それぞれの阻害剤濃度に対して異なる傾き及びｘ切片を有する（Ｋｍが異なる）。非競合阻害は、阻害されていない酵素と同じｘ切片を有するプロットをもたらす（Ｋｍが同じままである）が、異なる傾き及びｙ切片を有する（Ｖｍａｘを低減させる）。不競合阻害により、ｙ軸及びｘ軸の両方で異なる切片が生じるが、同じ傾きがもたらされる。酵素反応速度アッセイ及びラインウェーバー・バークプロットに基づくと、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドは不競合阻害剤である。いずれの理論又は作用機構にも縛られるものではないが、不競合阻害剤は、ペプチドが酵素−基質複合体とだけ結合し、生成物の形成を妨げることを意味し得る。Ｋｍ値及びＶｍａｘ値の両方が低減する。基質の結合は酵素の構造変化を誘導すると考えられている。新たな構造により、阻害剤の結合が可能になる（図１６）。これは、酵素及び酵素−基質複合体の両方と結合することができる非競合阻害剤（Ｖｍａｘを低減させる（阻害剤が触媒作用を妨げる）が、Ｋｍ値は変化しない（酵素に対する基質の親和性には影響がない））とは異なる。
【０１３４】
ペプチドの阻害定数は４０．２μＭであり、不競合阻害剤の場合、Ｋｉ値はＩＣ５０値と等しい。ＲｇｐＢの他の阻害剤とのＫｉ値の比較により、このペプチド阻害剤が同程度のＫｉ値を有し、クロルヘキシジン（２．６２×１０−４Ｍ）及びドキシサイクリン（不競合阻害剤）と同様のＲｇｐＢに対するＫｉ値を有するＲｇｐＢの中程度の阻害剤であり、３μＭのＲｇｐＢに対するＩＣ５０を有することが明らかになる。
【０１３５】
ＢＬＡＳＴサーチにより、αＳ１−カゼイン（１１〜２３）の、ＡＴＰ及び基質と結合するＣｌｐＸ及びＣｌｐＡプロテアーゼサブユニット（シャペロン様プロテアーゼ）、並びにポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルム形成に一定の役割を果たすＡＴＰ依存性亜鉛メタロプロテアーゼ（ＦｔｓＨ１）との配列類似性が明らかになった。β−カゼイン（１９３〜２０９）配列は、セリンプロテアーゼ阻害剤カザールタイプ５又はＬＥＫＴＩ（リンパ上皮カザールタイプ関連阻害剤）等の幾つかのプロテアーゼ阻害剤、及びエラフィンとの配列類似性を示す。これらのセリンプロテアーゼ阻害剤は両方ともそのプロテアーゼ阻害機能とは関係なく、抗菌機能も示す。κ−カゼイン（１０９〜１３７）も幾つかのプロテアーゼ阻害剤との部分的な配列類似性を示す。それらのプロテアーゼ阻害剤の中には、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｑ５ＵＧＩ５及びＰ０５１５５）又はセルピンＧ１が含まれる。
【０１３６】
Ｆｕｇｕｅプログラムを用いて、キュレーションタンパク質データベース、ＨＯＭＳＴＲＡＤに対してペプチドで起こり得る構造モチーフを特定した。３．８７のＺスコアがκ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドで得られ、α−ヘリックス構造に関する９０％の信頼性を示す。κ−カゼイン（１０９〜１３７）で起こり得る構造モチーフは、α−ヘリックス貫通残基１０９〜１２６、ターン構造、及び別のα−ヘリックス貫通残基１２９〜１３７とを含む。これらのモチーフに基づき、κ−カゼイン（１０９〜１３７）ペプチドのモデルをＳＹＢＹＬソフトウェアを用いて構築した。ＲｇｐＢを阻害するκ−カゼイン（１０９〜１３７）のモデルを、ＲｇｐＢの結晶構造（ＰＤＢ １ｃｖｒ）、及び潜在的な金属結合部位を有する提唱されたκ−カゼイン（１０９〜１３７）のモデルに基づき展開した。図１７（ａ）は、ペプチド阻害剤であるκ−カゼイン（１０９〜１３７）、Ｚｎ（ＩＩ）、及び合成基質（ＢＡｐＮＡ）との相互作用に関与するＲｇｐＢ活性部位の残基を強調する提唱されたモデルを示す。このモデルはＲｇｐＢのＨｉｓ２１１残基及びＧｌｕ１５２残基、κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＡｓｐ１１５残基及びＧｌｕ１１８残基とＺｎ（ＩＩ）との間の静電相互作用を強調している。κ−カゼイン（１０９〜１３７）のＩｌｅ１２２残基はＢＡｐＮＡ基質との疎水性相互作用を形成する。またＲｇｐＢのＴｒｐ２８４残基及びＣｙｓ２４４残基はそれぞれ、ＢＡｐＮＡ基質のＡｒｇ残基及びアミド結合と相互作用する。図１７（ｂ）は、Ｚｎ（ＩＩ）の存在下での酵素−基質複合体（ＲｇｐＢ−ＢＡｐＮＡ）と結合するκ−カゼイン（１０９〜１３７）の提唱された分子モデルを示す。このモデルは相乗的阻害の実験上の証拠と一致している。
組成物及び製剤
治療又は予防を目的とする本発明の態様を具体化する組成物の例示を助けるために、以下の試料製剤を調製する。
【０１３７】
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
グリセロール ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン（Chlorohexidine gluconate） ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
水 残り
【０１３８】
以下は更なる歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウロイルジエタノールアミド １．０
モノラウリン酸スクロース ２．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．１
水 残り
【０１３９】
以下は更なる歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール ２２．０
アイリッシュモス １．０
水酸化ナトリウム（５０％） １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ １９．０
水（脱イオン水） ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７６
サッカリンナトリウム ０．３
ピロホスフェート ２．０
アルミナ水和物 ４８．０
香料オイル ０．９５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００
【０１４０】
以下は液体歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
エタノール ３．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
リノール酸 ０．０５
水 残り
【０１４１】
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
エタノール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．３
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．２
水 残り
【０１４２】
以下は更なる洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓ−９７ ２．５
グリセリン １０．０
香料オイル ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．２
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４３】
以下はロゼンジ製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
糖 ７５〜８０
トウモロコシシロップ １〜２０
香料オイル １〜２
ＮａＦ ０．０１〜０．０５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
ステアリン酸Ｍｇ １〜５
水 残り
【０１４４】
以下は歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン ８．０
プロピレングリコール ４．０
ステアリルアルコール ８．０
ポリエチレングリコール４０００ ２５．０
ポリエチレングリコール４００ ３７．０
モノステアリン酸スクロース ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４５】
以下は歯周ゲル製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（BASF製） ２０．０
ステアリルアルコール ８．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ３．０
コロイド二酸化ケイ素（例えばＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標）２００（商標））１．０
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
水 残り
【０１４６】
以下はチューイングガム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤 ３０．０
炭酸カルシウム ２．０
結晶性ソルビトール ５３．０
グリセリン ０．５
香料オイル ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物 ０．３
水 残り
【０１４７】
本発明は本明細書中で詳細に説明しているが、実施例は単に例示目的にすぎないと理解すべきである。分子生物学、歯の治療及び関連の関連分野の当業者にとって明らかな本発明の実施形態の他の修正形態が本発明の範囲内であることが意図される。
【０１４８】
【表８−１】
【０１４９】
【表８−２】
【配列表フリーテキスト】
【０１５０】
配列番号１２：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１３：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１４：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１５：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号１６：Ｘａａはリン酸化セリン
配列番号２４：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２５：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２６：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２７：Ｘａａはグリコシル化トレオニン
配列番号２８：Ｘａａはリン酸化セリン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びにそれらにおける保存的置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が配列番号５である、請求項１に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列からなる、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項５】
前記細菌酵素がジンジパインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項６】
前記ジンジパインがポルフィロモナス・ジンジバリス由来である、請求項５に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項７】
カゼイン又はその断片のアミノ酸配列を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、細菌酵素を阻害する医薬組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５、及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つ又は複数から本質的になる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
二価カチオンを更に含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記二価カチオンが亜鉛である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、歯周病の治療に使用される医薬組成物。
【請求項１２】
二価カチオンを更に含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記二価カチオンが亜鉛である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
歯周病の治療用の薬剤の調製における請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の使用。
【請求項１５】
歯周病を予防又は治療する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物を、必要とする被験体に投与することを含む、歯周病を予防又は治療する方法。
【請求項１６】
細菌酵素を阻害する方法であって、該酵素と、配列番号１〜配列番号３２、及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物とを接触させることを含む、細菌酵素を阻害する方法。
【請求項１】
細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びにそれらにおける保存的置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が配列番号５である、請求項１に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号３２のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列からなる、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項５】
前記細菌酵素がジンジパインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項６】
前記ジンジパインがポルフィロモナス・ジンジバリス由来である、請求項５に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項７】
カゼイン又はその断片のアミノ酸配列を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、細菌酵素を阻害する医薬組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５、及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つ又は複数から本質的になる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
二価カチオンを更に含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記二価カチオンが亜鉛である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容される担体とを含む、歯周病の治療に使用される医薬組成物。
【請求項１２】
二価カチオンを更に含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記二価カチオンが亜鉛である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
歯周病の治療用の薬剤の調製における請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の使用。
【請求項１５】
歯周病を予防又は治療する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物を、必要とする被験体に投与することを含む、歯周病を予防又は治療する方法。
【請求項１６】
細菌酵素を阻害する方法であって、該酵素と、配列番号１〜配列番号３２、及びそれらにおける保存的置換体のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物とを接触させることを含む、細菌酵素を阻害する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５３００７３（Ｐ２０１２−５３００７３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５２９０（Ｐ２０１２−５１５２９０）
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４９６８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１０００７６１０）オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４９６８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１０００７６１０）オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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