カチオン性アルファアミノ酸を含有する生分解性ポリマー遺伝子導入組成物
本発明は、アルギニンまたはアグマチンなどの１つまたは複数のカチオン性アルファアミノ酸を含有する生分解性ポリマーを遺伝子キャリアとして用いる遺伝子導入組成物を提供する。組成物は、標的細胞をトランスフェクトするのに適したポリ核酸とのタイトな溶解性複合体を形成して、標的細胞によるカーゴポリ核酸の翻訳をもたらす。従って、このような化合物は、インビトロおよびインビボの両方において有用である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
遺伝子治療は、被験者の特定の細胞に遺伝子材料を導入することによる疾患の処置であると定義することができる。人間の遺伝子治療の概念は、１９７０年代初期に最初に統合された。１９７０年代後半および１９８０年代を通しての分子生物学の進歩は、１９９０年に承認されたＦＤＡプロトコールに従う遺伝子導入技術を用いた最初の患者の処置をもたらした。これらの研究からの楽観的な結果により、遺伝子治療は多くの人間の病気の処置および治療のために急速に一般的になることが期待された。しかしながら、１１３１の遺伝子治療の臨床試験が１９８９年から世界中で承認されたことを考慮すれば、成功した数が少ないのは残念なことである。
【０００２】
遺伝子治療において使用される遺伝子構築物は、３つの成分：特定の治療用タンパク質をコードする遺伝子、標的細胞内の遺伝子の機能を制御するプラスミドベースの遺伝子発現系、および体内の特定の位置への遺伝子発現プラスミドの送達を制御する遺伝子導入系からなる。人間の遺伝子治療の発展に対する重要な制限によって、安全、効率的および制御可能な遺伝子導入方法は欠如したままである。
【０００３】
人間の臨床的使用のためのウイルスベクターの使用は、歴史的に、限られたペイロード容量および一般的な産生問題から、免疫および毒性反応ならびに望ましくないウイルス組換えの可能性まで様々であり得る制限に遭遇している。ポリマーおよび脂質は最も一般的な非ウイルス合成導入ベクターであり、このような制限の可能性を回避することを目指して開発されてきた。従って、非ウイルス系、特に合成ＤＮＡ送達系は、研究所および臨床設定の両方においてますます望ましくなっている。
【０００４】
しかしながら、非ウイルス遺伝子導入分野における研究は、ウイルスベースの遺伝子導入系の研究と比較してその初期段階にある。近年、多数のグループが、カーゴ（ｃａｒｇｏ）の細胞内送達を高めるためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＤＴ）を使用しており、よく研究された例は、ＨＩＶ−１の転写のトランスアクチベーター、ＴＡＴのアルギニンに富んだセグメントである。関連の研究において、ＴＡＴ配列はアルギニンのモノマーによって置換され得ることが分かり、これにより、アルギニンのグアニジウム残基が異種遺伝子を標的細胞内に導入するＴＡＴの能力にとって不可欠であることが示された。この発見以来、多数のグループが、グアニジンに富んだＰＴＤと、薬物、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ナノ粒子、およびリポソームとの化学的な結合体を調製し、これらを広範な種類の細胞型へうまく送達している。さらに、分子アルギニンは薬理学的使用のために抗凝固薬として提唱されており、天然ポリマーキトサンに結合されたアルギニンも報告されている（ＷＧ Ｌｉｕら、Ｊ．Ｍａｔ．Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４年）１５）。
【０００５】
非ウイルス遺伝子導入剤として評価されている一般的なカチオン性ポリマーの中で、最もよく知られているのはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。非ウイルスベクターとして開発されたその他の合成および天然ポリカチオンとしては、ポリアミドアミンデンドリマー（Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ（１９９０年）２９（２）”１３８−１７５）および変性キトサン（Ｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）１５（９）：１３３２−１３３９）が挙げられる。
【０００６】
遺伝子導入効率を改善するために特異的に設計されたポリマーとしては、プロトンスポンジ効果を有するイミダゾール含有ポリマー、膜分裂ペプチドおよびポリマー、例えばポリエチルアクリル酸（ＰＥＡＡ）およびポリプロピルアクリル酸（ＰＰＡＡ）などと、シクロデキストリン含有ポリマーおよび分解性ポリカチオン、例えばポリ［アルファ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）およびポリ（アミノ酸）などと、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などの非イオン性の水溶性ポリマーに結合されたポリカチオンとが挙げられる。ほとんどの場合、これらのポリマーは、安定性、生体適合性またはエンドソームエスケープなどの特定の細胞内障害に対処するために設計されたものである。結果は様々であり、いくつかのポリマーは、市販の最良のポリマーと同程度に機能するか、あるいはわずかに優れていた。しかしながら、どれも遺伝子導入ベクターとしてのウイルスの効率には到達していない。
【０００７】
過去１０年間、生物医学的用途のための生分解性で生体吸収性のポリマーは、ますます関心を集めている。最近記載されたαアミノ酸、脂肪族ジオール、および脂肪族ジカルボン酸に基づく脂肪族ＰＥＡは、その生体適合性、低毒性、および生分解性のために、生物医学的用途のための良好な候補であることが分かった（Ｋ．ＤｅＦｉｆｅら、Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ＴＣＴ ２００４ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．２００４年、Ｇ．Ｔｓｉｔｌａｎａｄｚｅら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｅｄｎ．（２００４年）．１５：１−２４）。
【０００８】
主に穏やかな温度の溶液中で実行される非常に用途の広い活性重縮合（ＡＰＣ）法は、高分子量を有する規則的な直鎖多官能性ＰＥＡ、ポリ（エステル−ウレタン）（ＰＥＵＲ）およびポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）の合成を可能にする。ＡＰＣの合成多様性のために、構成要素として使用される３つの成分（αアミノ酸、ジオールおよびジカルボン酸）を変えて巨大分子骨格を作ることによって、これらのポリマーにおいて広範な材料特性を達成することができる（Ｒ．Ｋａｔｓａｒａｖａら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ（１９９９年）３７：３９１−４０７）。近年、アルギニンをポリマー骨格に組み込んだカチオン性ＰＥＡは、非ウイルス遺伝子導入剤として使用可能であることが発見された（２００７年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９６１，８７６号明細書）。
【０００９】
上記の研究によって、効率的なＤＮＡ送達に対する３つの主な障害：細胞形質膜を横切る取込みが低いこと、放出されたＤＮＡ分子の不適切な放出および不安定性、ならびに核を標的とすることの困難が存在することが示された。従って、当該技術分野における上記の進歩にもかかわらず、新規のより優れた非ウイルス遺伝子導入系が必要とされている。
【００１０】
［発明の概要］
一実施形態では、本発明は、以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化１】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化２】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化３】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化４】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化７】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化８】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性ポリマーとの溶解性複合体に縮合された少なくとも１つのポリ核酸を含む生分解性遺伝子導入組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、縮合されたポリ核酸を標的細胞にトランスフェクトするために、本発明の遺伝子導入組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることによって標的細胞をトランスフェクトするための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】様々なポリマー濃度におけるＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡ、およびＰＥＡ−アグマチン．ＡＡの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。３つのポリマーのうち、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体は、ＦＬ８３Ｂ細胞に対する毒性が最も低かった。
【図２】様々な濃度のポリマーＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡおよびＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡだけが１ｍｇ／ｍＬにおいて毒性であった。
【図３】ポリアルギニンの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図４】様々な電荷比の本発明のポリマー：ＧＦＰをコードする核酸を含有するＤＮＡ複合体と、対照としてＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）のそれぞれ１つとの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図５】Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬による結果に対して規格化された、種々の本発明のポリマー複合体を用いてＧＦＰをコードするＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の割合を示すフローサイトメトリーデータを要約するグラフである。
【図６】市販のトランスフェクション試薬に対して規格化された、ＦＬ８３Ｂ細胞におけるＧＦＰ発現の割合を示すフローサイトメトリーデータを要約するグラフである。
【図７】本発明の組成物および種々の市販のトランスフェクション試薬とのＧＦＰプラスミドＤＮＡ複合体によりトランスフェクトされた３つの異なる細胞型からのＧＦＰ蛍光を示すグラフである。本発明の組成物だけがＧＦＰをＨｅＬａ細胞に効果的にトランスフェクトした。
【図８】本発明のカチオン性ＰＥＡポリマーおよび市販の遺伝子導入剤とのｓｉＲＮＡの複合体をトランスフェクトされたマウス肝細胞におけるシェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）遺伝子の発現パーセントを示すグラフである。
【図９】異なるトランスフェクション試薬と複合体を形成した１００ｎＭのＤＣ０３（ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされたＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは式Ｉ、Ｒ２＝ＯＨのＰＥＡ．ＨのＤＭＳＯ−ｄ６における５００ＭＨｚの１ＨＮＭＲスペクトルであり、図１０Ｂは式ＶＩのＰＥＡ−（ＯＭｅ）．ＨＣｌのＤＭＳＯ−ｄ６における５００ＭＨｚの１ＨＮＭＲスペクトルである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
ポリ（エステル−アミド）（ＰＥＡ）、ポリ（エステルウレタン）ＰＥＵＲおよびポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）は、その骨格中のエステルおよびアミド、ウレタンまたは尿素ブロックのいずれかで構成される生分解性ポリマー類を形成する。これらのポリマーはポリエステルおよびポリアミドの両方の有利な特性を兼ね備えるので、ＰＥＡは長年にわたって広く研究されている。必須のアルファアミノ酸が構成要素として使用される場合、これらのポリマーは、生体適合性であることに加えてタンパク質様の特性も有する。例えば、Ｌ−アルギニンは、全ての生命体のタンパク質中に存在するαアミノ酸である。Ｌ−アルギニンの脱カルボキシル化形態であるアグマチンとして知られる４−アミノブチルグアニジンは、多くの生理学的機能に関与する生体アミン類に属する。
【００１４】
アルギニンおよびアグマチンはいずれも、強塩基性グアニジノ基のために生理的ｐＨにおいて正電荷を帯びており、約１２のｐＫａ値を有する。（アグマチンのイオン化形態は、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−ＮＨ２と書くことができる。）本発明はアルギニン、アグマチンおよびその他のカチオン性αアミノ酸を用いて、本発明の組成物および方法で使用されるＰＥＡならびに関連のＰＥＵＲおよびＰＥＵのカチオン性ペンダント基を提供する。これらのペンダント基は、負に帯電したＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸配列を中和して、細胞膜に侵入し得る溶解性複合体に縮合させるために必要な強塩基特性を提供する。
【００１５】
従って、一実施形態では、本発明は、以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化９】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化１０】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１１】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化１２】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化１３】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１４】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化１５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性ポリマーとの溶解性複合体に縮合された少なくとも１つのポリ核酸を含む生分解性遺伝子導入組成物を提供する。
【００１６】
Ｒ７の好ましい例は、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニルであり、特に−（ＣＨ２）４−である。
【００１７】
本発明において使用するために合成されるポリマーの例は式ＩのＰＥＡであり、ｐモノマー単位中のＬ−リジン（Ｒ７＝（ＣＨ２）４）のＣ−末端は、アルギニンメチルエステル（ＶＩ）またはアグマチン（ＶＩＩ）のいずれかと共有結合しており、グアニジンペンダント部分は例えば塩酸からの酸性の対イオンと会合している。
【化１７】
【００１８】
アルファアミノ酸に基づくＰＥＡおよびＰＥＵＲの製造方法は米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書に開示されており、ＰＥＵの調製方法は（米国特許出願第１１／５８４，１４３号明細書）に記載されている。アルギニンおよびアグマチンのＰＥＡへの結合のための手順は、本明細書の実施例１に記載されている。
【００１９】
巨大分子に沿った電荷密度を変えるために、グアニジン誘導体を分枝状リンカーによってポリマーに結合させることができる。例えば、親和性リガンド６−アミノ−２−（ビス−カルボキシメチルアミノ）−へキサン酸（アミノブチル−、またはＡＢ−ＮＴＡ、その化学構造は式ＶＩＩＩで示される）が分枝状リンカーとして使用されている。
【化１８】
調製されるカチオン性ＰＥＡは、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（式ＩＸ）およびＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｇｔ（式Ｘ）と称され、その合成方法は以下の実施例１に開示されている。
【化１９】
ＰＥＡ−ＮＴＡ結合体の一般式は、式（ＸＩ）：
【化２０】
で示され、式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は、式（Ｉ）のＰＥＡについて上記で定義したとおりである。
【００２０】
ＡＢ−ＮＴＡリンカーはリジンのα−Ｎ誘導体を表す。本発明の遺伝子導入組成物に含有されるカチオン性ポリマーの製造において使用することができる相同リンカーの付加的な例はオルニチン誘導体であり、その化学構造は以下の一般構造式（ＸＩＩ）で表される。
【化２１】
式中、Ｒ１１は独立して（Ｃ２〜Ｃ８）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ８）アルキレンであり、例えば、（Ｃ３〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ６）アルケニレンであり、そしてＲ１２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、または（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニルである。このようなリンカーの調製およびその構造式（Ｉ）のＰＥＡとの結合は、米国特許出願公開第２００７０１６０６２２号明細書に例示されている。
【００２１】
電荷密度を増大させるためにＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーのＲ２置換基として使用することができるカチオン性残基の製造の付加的な例は、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーのｐ単位のアミノ酸のＣ−末端に、アルギニンに富んだオリゴマーまたは市販の低分子量のカチオン性ポリアミノ酸（オリゴアルギニンなど）をグラフトさせる方法によって成される。グラフト法は、式（ＸＩＩＩ）に示されるようにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）型カップリングを用いて実行することができ、式中、ｒは上記で定義したとおりである。
【化２２】
本発明のポリマーにグラフトさせることができるカチオン性オリゴアミノ酸およびカチオン性ポリアミノ酸のその他の例は、ポリリジン、ポリオルニチン、およびポリヒスチジンである。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、組成物を標的細胞に進入させて標的細胞をトランスフェクトするための条件下および時間で、ポリマーと縮合されたポリ核酸をその中に含む本発明の遺伝子導入組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることによって、標的細胞をトランスフェクトするための方法を提供する。
【００２３】
本発明の組成物および方法を記載するために本明細書中で使用される場合、「溶液中」および「溶解性複合体」という用語は生物学者の間で一般的に使用される意味を包含し、液体中に懸濁された粒子は溶液中にあると言われる。ポリマーおよびポリ核酸の電荷は中和されるので、本発明の組成物中のカチオン性ポリマーおよびポリ核酸の複合体は縮合されて水性環境中のポリマー粒子を形成する。このような粒子の液体中の懸濁液は、本明細書では、溶液中にあると見なされる。
【００２４】
本発明の方法の実施において使用するために適切な標的細胞には、哺乳類細胞、例えば、本発明の組成物の投与によって患者に送達されたポリ核酸の発現によって処置される患者の組織に属する細胞が含まれるがこれらに限定されない。適切な哺乳類の標的細胞としては、神経系の細胞（例えば、脳、脊髄および抹消神経系細胞）、循環系細胞（例えば、心臓、血管、ならびに赤血球および白血球細胞）、消化器系（例えば、胃および腸）、呼吸器系（例えば、鼻および肺）、生殖器系、内分泌系（例えば、肝臓、脾臓、甲状腺、および副甲状腺）、皮膚、筋肉、または結合組織が挙げられる。
【００２５】
あるいは、標的細胞は、任意の器官または組織に由来する癌細胞、例えば本発明の組成物の投与によって患者に送達されたポリ核酸の発現によって処置される患者の組織に属する癌細胞であってもよい。あるいはさらに、標的細胞は、患者に感染しているまたは被験者に感染し得る寄生虫、病原体またはウイルスの細胞でもあり得る。従って、本発明の遺伝子導入組成物は、インビトロ（標的細胞と、その中で発現される所望のポリ核酸との相互作用を研究するため）およびインビボ（生きている被験者における遺伝子治療用途のため）の両方において有用である。
【００２６】
４−メチレンイミダゾリニウムの構造式は次のとおりである。
【化２３】
【００２７】
特定の実施形態では、組成物中のポリマーは、ポリマー中の正に帯電した基と会合した１つまたは複数の対イオンおよび／またはポリマーに結合した１つまたは複数の保護基を有し得る。
【００２８】
本発明の組成物中のポリマーと会合するために適切な対イオンの既知の例は、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｂｒ−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＣｌ３ＣＯＯ−、ＴｏｓＯ−などの対アニオンである。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、本発明の遺伝子導入組成物に適用される「水溶性」および「水溶性の」という用語は、組成物の飽和点における脱イオン水１ミリリットルあたりの組成物の濃度を意味する。水溶性は、種々のポリマーそれぞれに対して異なり得るが、溶媒および溶質間の分子間力と、溶媒和に付随するエントロピー変化とのバランスによって決定される。ｐＨ、温度および圧力などの因子はこのバランスを変化させ、従って、水溶性を変化させ得る。水溶性はｐＨ、温度、および圧力にも依存する。
【００３０】
一般的に定義されるように、水溶性ポリマーはヒドロゲルへの真に水溶性のポリマーを含み得る（Ｇ．Ｓｗｉｆｔ、ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒ．Ｓｔａｂ．５９：（１９９８年）１９−２４）。本発明の組成物はかろうじて水溶性（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍＬから）であってもよいし、あるいは吸湿性であり、湿った大気にさらされたときに急速に水を吸収して、最終的には粘性溶液を形成してもよく、溶液中の組成物／水の比は無限に変えることができる。
【００３１】
本発明の遺伝子導入組成物中で使用されるポリマーの大気圧における脱イオン水への溶解性は、約１８℃〜約５５℃、好ましくは約２２℃〜約４０℃の範囲の温度で、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬの範囲である。本発明の組成物の定量的な溶解性は、Ｂｒａｕｎの方法に従って視覚的に評価することができる（Ｄ．Ｂｒａｕｎら、Ｐｒａｋｔｉｋｕｍ ｄｅｒ Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｎ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ、Ａｌｆｒｅｄ Ｈｕｔｈｉｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９６６年）。当業者には知られているように、Ｆｌｏｒｙ−Ｈｕｇｇｉｎｓ溶液理論は、ポリマーの溶解性を説明する理論モデルである。Ｈａｎｓｅｎ溶解性パラメータおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄ溶解性パラメータは、溶解性の予測のための経験的方法である。融解エンタルピーなどの他の物理定数から溶解性を予想することも可能である。
【００３２】
本明細書に記載されるＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵＲポリマーの脱イオン水溶液に低分子量の電解質を添加すると、４つの応答のうちの１つを引き起こすことができる。電解質は、鎖収縮、鎖伸張、キレート化による凝集（構造遷移）、または沈殿（相分離）を生じ得る。応答の正確な性質は、ポリマーの化学構造、濃度、および分子量、ならびに添加した電解質の性質などの種々の因子に依存し得る。それにもかかわらず、本発明の遺伝子導入組成物は、血液、血清、組織などの生理条件または水／アルコール溶媒系において見られるような条件を含む種々の水性条件下で溶解性であり得る。
【００３３】
本発明の組成物の水溶性は、当該技術分野において既知であるように、そして本明細書の実施例において説明されるように１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ゲル浸透クロマトグラフィ、およびＤＳＣなどのアッセイを用いて特徴付けることもできる。
【００３４】
全てのアミノ酸は、末端アミノおよびカルボキシレート基のために帯電種として存在することができるが、アミノ酸の一部だけが適切な条件下で帯電し得る側鎖を有する。「カチオン性αアミノ酸」を言う用語は、本発明の組成物において使用されるポリマーを記載するために本明細書中で使用される場合、Ｒ２基が、弱酸（水中に溶解されたときに完全にはイオン化しない）としてその側鎖が機能し得るアミノ酸残基であるか、またはそれを含有することを意味する。酸素、硫黄または窒素などのへテロ原子に共有結合したプロトンからなるイオン化可能な部分が存在することによって、Ｒ２基内のこのようなアミノ酸残基においてイオン化可能な特性が与えられる。別のイオン化可能な分子または基の近くなどの適切な水性条件下では、イオン化可能なプロトンは、供与性水素イオンとしてＲ２から解離し、Ｒ２置換基内の１つまたは複数のアミノ酸残基を塩基にし、次いでこれは水素イオンを受け取ることができる。酸形態からのプロトンの解離、または塩基形態によるプロトンの受け取りは、水性環境のｐＨに強く依存する。イオン化度も環境に敏感であり、水性環境の温度およびイオン強度ならびにポリマー内のイオン化可能な基の微小環境に依存する。
【００３５】
従って、「カチオン性αアミノ酸」という用語は、本発明の遺伝子導入組成物中の特定のポリマーを記載するために本明細書中で使用される場合、ポリマー内のアミノ酸残基のＲ２基中のアミノ酸残基が、適切な周囲の水性または溶媒条件下、特に血液および組織中などの生理条件下で正イオンを形成できることを意味する。このような正のアミノ酸の対イオンは、上記で記載したとおりであり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「二酸の残基」という用語は、ジカルボン酸の二酸の２つのカルボキシル基を除く部分を意味し、この部分は本発明のポリマー組成物の骨格に取り込まれる。本明細書中で使用される場合、「ジオールの残基」という用語は、残基が本発明のポリマー組成物の骨格に取り込まれた部位において、ジオールの２つのヒドロキシル基を除く部分を意味する。「残基」を含有する対応する二酸またはジオールは、本発明の遺伝子導入組成物の合成において使用される。
【００３７】
αアミノ酸およびジオールのジエステルのジアリールスルホン酸塩は、αアミノ酸、例えばｐ−アリールスルホン酸一水和物、およびジオールを、還流温度まで加熱したトルエン中で水の発生が終結するまで混ぜ合わせ、そして冷却することによって調製することができる。
【００３８】
ジカルボン酸の飽和ジ−ｐ−ニトロフェニルエステルおよびビス−αアミノ酸エステルの飽和ジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩は、米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書に記載されるように調製することができる。
【００３９】
カチオン性αアミノ酸を含有する式（Ｉ、ＩＶおよびＶ）のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは、保護基化学を用いて調製することができる。保護されたモノマーは、ＡＰＣの前か、またはポリマーの処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）の後のいずれかで脱保護され得る。保護基化学で使用される適切な保護試薬および反応条件は、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年）において見出すことができ、その内容は参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００４０】
本発明の組成物中のポリ核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ、アンチセンスポリ核酸、機能性ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、ポリ核酸はＲＮＡであり得る。別の実施形態では、ポリ核酸はＤＮＡであり得る。別の実施形態では、ポリ核酸はアンチセンスポリ核酸であり得る。別の実施形態では、ポリ核酸は、センスポリ核酸であり得る。別の実施形態では、ポリ核酸は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むことができる。別の実施形態では、ポリ核酸は、リン酸ジエステル結合３’−５’および５’−３’ポリ核酸骨格を含むことができる。あるいは、ポリ核酸は、ホスホチオエート型、ホスホルアミデートおよびペプチド−ヌクレオチド骨格などの非リン酸ジエステル結合を含むことができる。別の実施形態では、部分は、ポリ核酸の骨格糖に結合することができる。このような結合を形成する方法は当業者によく知られている。
【００４１】
ポリ核酸は、一本鎖ポリ核酸または二本鎖ポリ核酸であり得る。ポリ核酸は任意の適切な長さを有することができる。特に、ポリ核酸は約２〜約５，０００ヌクレオチドの長さであることができ、約２〜約１０００ヌクレオチドの長さが含まれ、約２〜約１００ヌクレオチドの長さが含まれ、あるいは約２〜約１０ヌクレオチドの長さが含まれる。
【００４２】
アンチセンスポリ核酸は、通常、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なポリ核酸である。例えば、ｍＲＮＡは、癌促進タンパク質、すなわち癌遺伝子の産物をコードすることができる。アンチセンスポリ核酸は一本鎖ｍＲＮＡに相補的であり、二重鎖を形成し、それにより標的遺伝子の発現を阻害し得る。すなわち、癌遺伝子の発現を阻害し得る。本発明のアンチセンスポリ核酸は、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡと二重鎖を形成することができ、標的タンパク質の発現を許さないであろう。
【００４３】
「機能性ＲＮＡ」は、リボザイムまたは他の翻訳されないＲＮＡを指す。
【００４４】
「ポリ核酸デコイ」は、細胞因子がポリ核酸デコイへ結合する際に、細胞因子の活性を阻害するポリ核酸である。ポリ核酸デコイは、細胞因子の結合部位を含有する。このような細胞因子の例としては、転写因子、ポリメラーゼおよびリボソームが挙げられるが、これらに限定されない。転写因子デコイとして使用するためのポリ核酸デコイの一例は、転写因子の結合部位を含有する二本鎖ポリ核酸であろう。あるいは、転写因子のためのポリ核酸デコイは、それ自体とハイブリッド形成して、標的転写因子の結合部位を含有するスナップバック二重鎖を形成する一本鎖核酸であってもよい。転写因子デコイの一例はＥ２Ｆデコイである。Ｅ２Ｆは、細胞周期調節に関連して細胞を増殖させる遺伝子の転写において役割を果たす。Ｅ２Ｆの制御は細胞増殖の調節を可能にする。例えば、外傷（例えば、血管形成、手術、ステント留置）の後、外傷に応答して平滑筋細胞が増殖する。増殖は、処置された領域の再狭窄（細胞増殖による動脈の閉鎖）を引き起こし得る。従って、Ｅ２Ｆ活性の調節は細胞増殖の制御を可能にし、増殖を低下させ、動脈の閉鎖を回避するために使用することができる。その他のこのようなポリ核酸デコイおよび標的タンパク質の例としては、ポリメラーゼを阻害するためのプロモーター配列、およびリボソームを阻害するためのリボソーム結合配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明が、任意の標的細胞因子を阻害するために構築されたポリ核酸デコイを含むことは理解される。
【００４５】
「遺伝子治療剤」は、遺伝子を標的細胞内に導入した後に遺伝子産物の発現を行うことによって、標的細胞において遺伝子産物の発現を引き起こす薬剤を指す。このような遺伝子治療剤の一例は、ＤＮＡベクターなどの細胞内に導入されたときにタンパク質の発現を引き起こす遺伝子構築物であろう。あるいは、遺伝子治療剤は、標的細胞における遺伝子の発現を低減することができる。このような遺伝子治療剤の一例は、標的遺伝子に統合され得るか、あるいは遺伝子の発現を妨害し得る、ポリ核酸セグメントの細胞内への導入であろう。このような薬剤の例としては、相同的組換えによって遺伝子を妨害することができるポリ核酸が挙げられる。細胞内の遺伝子の導入および妨害方法は当業者によく知られており、本明細書に記載されるとおりである。
【００４６】
一実施形態では、ポリ核酸は、一般に知られている化学方法に従って合成することができる。別の実施形態では、ポリ核酸は、商業的供給業者から得ることができる。ポリ核酸としては、ブロモ誘導体、アジド誘導体、蛍光誘導体またはこれらの組み合わせなどの少なくとも１つのヌクレオチド類似体が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチド類似体は当業者によく知られている。ポリ核酸は、連鎖停止剤を含むことができる。ポリ核酸は、例えば、架橋試薬または蛍光タグとして使用することもできる。多くの通常の結合は、ポリ核酸を別の部分、例えばホスファート、ヒドロキシルなどにカップリングさせるために使用することができる。さらに、部分は、ポリ核酸に取り込まれたヌクレオチド類似体によってポリ核酸に結合されてもよい。別の実施形態では、ポリ核酸は、リン酸ジエステル結合３’−５’および５’−３’ポリ核酸骨格を含むことができる。あるいは、ポリ核酸は、ホスホチオエート型、ホスホルアミデートおよびペプチド−ヌクレオチド骨格などの非リン酸ジエステル結合を含むことができる。別の実施形態では、部分は、ポリ核酸の骨格糖に結合することができる。このような結合を形成する方法は当業者によく知られている。
【００４７】
縮合したポリマー：ポリ核酸は、インビトロでα−キモトリプシンなどの酵素と接触して、あるいはインビボに注入されたときに分解して、適切で有効な量のポリ核酸の持続放出を提供することができる。任意の適切で有効な期間を選択することができる。通常、適切で有効な量のポリ核酸は、約２４時間、約２日または約７日で放出され得る。ポリ核酸が本発明の組成物から放出される時間の長さに通常影響を与える因子としては、例えば、ポリマーの性質および量、ポリ核酸の性質、サイズおよび量、組成物が導入される環境のｐＨ、温度および電解質または酵素含量が挙げられる。
【００４８】
式（Ｉ、ＩＶまたはＶ）のＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーの任意の適切なサイズを本発明の遺伝子送達組成物において用いることができる。例えば、ポリマーは、約１×１０−４メートル未満、約１×１０−５メートル未満、約１×１０−６メートル未満、約１×１０−７メートル未満、約１×１０−８メートル未満、または約１×１０−９メートル未満のサイズを有することができる。
【００４９】
本発明の遺伝子導入組成物および方法は、ポリ核酸、ポリ核酸およびポリ核酸を含む全てのタイプのＲＮＡおよびＤＮＡの使用および標的細胞への送達を包含する。より具体的には、核酸は、任意のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡは、治療分子をコードする遺伝子などの、その中に含有される遺伝子の発現のためのプラスミドを含む。ＲＮＡは、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）、転移（ｔＲＮＡ）、リボソーム（ｒＲＮＡ）、および干渉（ｉＲＮＡ）を含む。干渉ＲＮＡは転写後遺伝子サイレンシングに関与するＲＮＡであり、センスおよびアンチセンス鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない。ＲＮＡ干渉のメカニズムでは、ｄｓＲＮＡは細胞に進入し、その中の酵素ＤＩＣＥＲによって消化され２１−２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡになる。連続的な切断事象は、ＲＮＡをｓｉＲＮＡとして知られる１９−２１ヌクレオチドに分解する。ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖はヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、すなわちＲＩＳＣを形成する。活性化ＲＩＳＣは、塩基対合相互作用によって相同転写物を標的にして、ｍＲＮＡを切断し、それによって標的遺伝子の発現を抑制する。最近の証拠から、機構はｍｉＲＮＡとほぼ同一であることが示唆される（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２００４年）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１０２：３）。このようにして、ｉＲＮＡは、ポリマーと縮合したら、食作用または飲作用により細胞内に送達されて放出され、標的遺伝子の発現を抑制する手段として細胞の正常な生物学的処理経路に進入することができる。
【００５０】
遺伝子発現の新たな配列特異的阻害剤の小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は大きい治療可能性を有するが、このような分子の治療薬としての開発は、インビボでのｓｉＲＮＡの急速な分解によって妨害されている。従って、ｓｉＲＮＡの治療的使用における成功のための重要な要件は、遺伝子サイレンシング核酸の保護である。本発明において、このようなｓｉＲＮＡの保護は、ポリ核酸分子と、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーとの縮合によって提供される。
【００５１】
例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖の送達のための本発明の組成物の製造において、負に帯電したｉＲＮＡのアンチセンス鎖はカチオン性ポリマーと縮合される。ｄｓＲＮＡは、キャリアポリマーと縮合される。あるいは、センス鎖は１つのポリマー鎖と縮合され、アンチセンス鎖は別のポリマー鎖と縮合され得る。いずれの場合も、ポリマーの生分解の間に本発明の組成物から放出される二本鎖ＲＮＡ、およびセンス鎖から解放されるアンチセンス鎖は、ｉＲＮＡの正常な生物学的経路に進入するであろう。
【００５２】
本発明を説明するために、本明細書の実施例１に記載されるようにペンダントカチオン性グアニジン基を有するＰＥＡポリマーを調製し、本発明の遺伝子導入組成物のために十分なプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡに縮合させて、インビトロでマウス肝細胞に容易に進入させるために使用した。物理化学的試験（ゲル電気泳動、蛍光、緑色蛍光タンパク質発現アッセイ）により、本発明の組成物中のポリ核酸の成功した細胞トランスフェクションおよび発現を確認した。市販の遺伝子導入剤：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）、およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）と比較して、本発明の遺伝子導入組成物のトランスフェクション効率を評価するために、ＧＦＰ発現アッセイを行った。
【００５３】
より具体的には、式（ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のアルギニン結合ポリ（エステル−アミド）またはアグマチン結合ポリ（エステル−アミド）を、例えば遺伝子治療において使用される標的細胞のトランスフェクションをもたらすための非ウイルス遺伝子導入剤としての効率について評価した。
【００５４】
縮合をもたらすために本発明の方法において使用されるポリマー対ポリ核酸の比率は、場合により、従来技術の遺伝子導入剤の場合よりも大きいかもしれないので、ポリマーをマウス肝臓ＦＬ８３Ｂ細胞と共にインキュベートすることによって、ポリマーの細胞毒性を検査した。細胞毒性は、標準ルミノメーター細胞増殖アッセイを用いて２４時間および４８時間で測定した。図１〜３に要約されるこの細胞の生存率実験からのデータによって示されるように、ＰＥＡ−アグマチン．ＡＡだけが０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性を示した。その他の本発明のカチオン性ポリマーは全て、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性でなかった。ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡは、１ｍｇ／ｍＬの濃度においても毒性でなかった。全体として、全てのＰＥＡ結合体は、同様の濃度における市販のポリアルギニンよりも毒性が低かった（１３ｕＭのポリアルギニンは０．２ｍｇ／ｍＬである）。これらの研究で対照として使用された市販のトランスフェクション試薬と比較すると、本発明の遺伝子導入組成物（すなわち、ポリマー：ＤＮＡ複合体）と共にインキュベートされたＦＬ８３Ｂ細胞は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に生存可能であり、概して、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）の場合よりも６０％高く生存可能であった（図４）。
【００５５】
「電荷比」という用語は、本発明の遺伝子導入組成物を記載するために使用される場合、負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率を意味する。本発明を説明するために製造された本発明の組成物のそれぞれについて、記載した正電荷の総数は、１ＨＮＭＲデータによって推定したポリマーあたりのグアニジウム負荷の％に基づいて計算した。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方について、負電荷の数は塩基対あたりの２つの負電荷を基準とし、質量あたりの電荷の総数として計算した。負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率は、以下の表１および２に示されるような電荷比であると決定された。
【００５６】
水性懸濁液中の本発明の組成物の縮合物のゲル遅延度アッセイおよびゼータ電位を用いて、正に帯電したＰＥＡポリマーが負に帯電したプラスミドＤＮＡを中和して、標的細胞のトランスフェクションにおいて使用するのに適したコンパクトな複合体を形成できることを確認した。ｓｉＲＮＡを１：１、２：１、および４：１のポリマー対ｓｉＲＮＡの電荷比においてＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）と共に配合した。１：１の電荷比では、アガロースゲル中に結合していないｓｉＲＮＡが観察されたが、２：１、４：１、および６：１の電荷比では、以下の表２に示されるようにｓｉＲＮＡはポリマーと完全に複合体を形成した。従って、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは親和性を有してポリ核酸と複合体を形成し、形成された縮合物粒子の全体の電荷は、カチオン性ポリマーの過剰に従って変化することが分かった。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
標的細胞におけるポリ核酸カーゴの発現を説明するために、無血清培地中で作られたシェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）に対するカチオン性ＰＥＡおよびｓｉＲＮＡの複合体を含む本発明の組成物を用いて、本明細書の実施例３に記載されるように、無血清培地中で本発明の組成物と共に細胞をインキュベートすることによって、ＦＬ８３Ｂ細胞をトランスフェクトした。当業者は、細胞トランスフェクションにおける使用に適していることが当該技術分野において分かっている任意のトランスフェクション条件が使用され得ることを理解するであろう。
【００６０】
標的細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、標準方法を用いて定量的ＰＣＲにより遺伝子発現を測定すると、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌまたはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と複合体を形成したｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、標的細胞においてほぼ同等（すなわち、７０％）のＳＳＢ発現の下方制御をもたらすことが分かった（図９）。
【００６１】
以下の実施例は本発明を説明することが意図され、限定は意図されない。
【００６２】
［実施例１］
［Ａ．材料のキャラクタリゼーション］
モノマーおよびポリマーの化学構造は標準化学法によって特徴付けた。１ＨＮＭＲ分光法のために５００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００スペクトロメーター（Ｎｕｍｅｇａ Ｒ．Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によってＮＭＲスペクトルを記録した。テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として、重水素化溶媒ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を用いた。
【００６３】
合成されるモノマーの融点は、自動Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＦＰ６２融点測定装置（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）において決定した。合成したポリマーの数平均および重量平均分子量（ＭｗおよびＭｎ）ならびに分子量分布は、高圧液体クロマトグラフィーポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２４１４屈折率検出器を備えたモデル５１５ゲル浸透クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）によって決定した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）中の０．１％のＬｉＣｌ溶液を溶離液として使用した（１．０ｍＬ／分）。２本のＳｔｙｒａｇｅｌ（登録商標）ＨＲ ５Ｅ ＤＭＦ型カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を接続し、ポリスチレン標準で較正した。
【００６４】
［Ｂ．ＰＥＡ（ＰＥＡ−ＯＳｕ）の活性化のための一般手順］
５．０ｇ（２．７ｍｍｏｌ、重量平均Ｍｗ＝６５ｋＤａ、ＧＰＣ（ＰＳ））のＰＥＡポリマー（ＰＥＡ−ＯＳｕ）（式Ｉ、式中Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ２＝ＯＨ、およびＲ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、Ｒ７＝（ＣＨ２）４、米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書の方法に従って合成）を５０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。次に、０．６１５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．９８ｍｍｏｌ）および０．３７４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で約１２時間、アルゴン下で攪拌した。０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過することによって、形成した残渣を除去した。さらなる結合のために活性化ＰＥＡ−ＯＳｕの溶液をアルゴン下で保持した。１Ｈ−ＮＭＲ分析によって決定されるように、ＯＳｕとの結合によってＰＥＡの８０％〜１００％を活性化した。
【００６５】
［Ｃ．ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体（式ＶＩ）の合成］
ＰＥＡ−ＯＳｕの活性化エステルの予め調製した溶液（５．３ｇ、２．７ｍｍｏｌのポリマーを含有する）に、０．８４９ｇのＬ−アルギニンメチルエステル二塩酸塩（３．２５ｍｍｏｌ）、１．１３４ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６．５０ｍｍｏｌ）および５００ｍＬのＤＭＦをアルゴン下で添加した。得られた不均一な混合物を室温で約２４時間攪拌した。そのようにして形成されたＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ポリマー結合体を、３体積％の酢酸を含む５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を再度酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー沈殿物をエタノール中に再溶解させ（５．０ｇ、５０ｍＬ中）、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移し、ＤＩ水中で透析した。最後の透析溶液を凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣおよびＤＬＳによってゼータ電位および粒径について分析した。１Ｈ−ＮＭＲによって決定されるようにポリマーの６０％〜９０％をＡｒｇ（ＯＭｅ）に転化させた（図１０を参照）。精製後の生成物ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体の収率は８０〜９０％の範囲であり、重量平均分子量（Ｍｗ）は約７０ｋＤａであった（ＧＰＣ、ＰＳにより決定）。
【００６６】
［Ｄ．ＰＥＡ−アグマチン結合体（式ＶＩＩ）の合成］
０．５ｇの硫酸アグマチン（２．１９ｍｍｏｌ）および０．２１ｇの水酸化ナトリウム（８．７６ｍｍｏｌ）の懸濁液を１０ｍＬのＤＭＦ中、室温で１２時間攪拌し、形成した溶液を０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過した。５％（重量／体積）ＤＭＦ中の得られたアグマチン（遊離アミン形態、１８．７ｍｍｏｌ）５ｍＬと、２１．６ｍＬのＤＭＦ中の酢酸（９．３ｍｍｏｌ）０．５３ｍＬとを、活性化ＰＥＡ−ＯＳｕの予め調製した溶液（３．０ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）に添加した。形成された不均一な混合物をアルゴン下、室温で約２４時間攪拌した。ＰＥＡ−アグマチンポリマー結合体を２．５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー結合体をエタノール（３．０ｇ、１００ｍＬ）中に再溶解させた。溶解したポリマーを、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移し、ＤＩ水中で透析した。透析した生成物ＰＥＡ−アグマチン結合体を凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによってゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたアグマチンは、ＮＭＲによって決定されるように５０〜６０％の範囲であった。精製後の反応収率は７０〜８０％の範囲であり、重量平均分子量（Ｍｗ）は約７０ｋＤａであった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００６７】
［Ｅ．ＰＥＡ．Ｉ．ＮＴＡ（ＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕ）の活性化のための一般手順］
５．０ｇ（２．４０ｍｍｏｌ、重量平均Ｍｗ＝７７ｋＤａ、ＧＰＣ（ＰＳ））のＰＥＡポリマー（式Ｉ、式中Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ２＝式ＶＩＩＩのリンカー、およびＲ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、Ｒ７＝（ＣＨ２）４）を、アルゴン下で５０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。次に、１．５３５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、７．４４ｍｍｏｌ）および０．８８４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、７．６８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で約８時間攪拌した。０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過することによって、形成した残渣を除去した。ＰＥＡ−ＯＳｕ結合体の溶液を丸底フラスコ内に捕集し、アルゴン下で保持した。サンプルポリマー溶液を、１Ｈ−ＮＭＲによってＯＳｕ負荷について分析し、８０〜１００％の範囲であった。
【００６８】
［Ｆ．ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体（式ＩＸ）の合成］
ＤＭＦ中のＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕの活性化エステル（５．７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に、２．０８ｇのＬ−アルギニンメチルエステル二塩酸塩（Ａｒｇ（ＯＭｅ）、７．９６ｍｍｏｌ）、２．７７ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、７．２ｍｍｏｌ）および５００ｍＬのＤＭＦを添加した。得られた不均一な混合物を室温で約２４時間攪拌した。ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ポリマー結合体を、１％ｖ／ｖの酢酸を含む５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー結合体をエタノール中に再溶解させ（５．０ｇ、５０ｍＬ中）、２０ｍＬの水で希釈し、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移した。ポリマーを脱イオン水中で２日間透析し、次にろ過し、そして凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによって、生成物をゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたＡｒｇ（ＯＭｅ）は、１Ｈ−ＮＭＲによって決定されるように５０〜７０％の範囲であった。精製後の生成物の収率は８０〜９０％の範囲であった。重量平均分子量（Ｍｗ）は１５５〜１６０ｋＤａの範囲であった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００６９】
［Ｇ．ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン結合体（式Ｘ）の合成］
丸底フラスコ中のＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕの活性化エステル（４．５５ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）に、以下の試薬を添加した：５％（重量／体積）のＤＭＦ中の１８．４３ｍＬのアグマチン（６８．８ｍｍｏｌ）、１．９７ｍＬの酢酸（３４．４ｍｍｏｌ）および２０．５ｍＬのＤＭＦ。アグマチン溶液のアミン形態を以下のように調製した：０．５ｇの硫酸アグマチン（２．１９ｍｍｏｌ）および０．２１ｇの水酸化ナトリウム（８．７６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬＤＭＦ溶液中に分散させ、一晩（約１２時間）攪拌した。Ａ０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によって溶液をろ過した。
【００７０】
アグマチンのアミン形態の溶液を丸底フラスコ内の溶液に添加し、得られた懸濁液を室温で約２４時間攪拌した。得られたＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチンポリマー結合体を２．５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマーをエタノール（３．０ｇ、１００ｍＬ）中に溶解し、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移した。ポリマー結合体を３．５ＬのＤＩ水中で透析し、溶液をろ過して凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによって、生成物ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン結合体（式Ｘ）をゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたアグマチンは、１Ｈ−ＮＭＲにより８０〜９０％であった。精製後の反応収率は、５０〜６０％の範囲であった。重量平均分子量（Ｍｗ）は１５０〜１８０ｋＤａの範囲であった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００７１】
［実施例２］
［Ａ．材料］
臭化エチジウムはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）はＣｅｌｌｇｒｏ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）から購入し、ＨＥＰＥＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＤＮＡサイズマーカーＴＲＡＣＫ ＩＴＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を商業的供給源から購入した。他の化学薬品および試薬は、他で特定されなければ、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００７２】
［Ｂ．プラスミドＤＮＡの調製］
供給業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎエンドトキシンフリープラスミドｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。２６０ｎｍにおける分光光度分析および１％アガロースゲルにおける電気泳動法によって、精製プラスミドＤＮＡの量および質を評価した。精製プラスミドＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）中に再度懸濁させ、一定分量において凍結させた。
【００７３】
［Ｃ．細胞培養］
マウス肝細胞ＦＬ８３Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清が補充されたＫａｉｇｈｎのＦ１２Ｋ完全培地において５％のＣＯ２中３７℃で推奨されるようにＦＬ８３Ｂ細胞を増殖させた。
【００７４】
［Ｄ．本発明のＰＥＡストック懸濁液の調製］
上記の実施例１で調製されたポリマーを２００プルーフのエタノール中に１００ｍｇ／ｍＬで溶解させた。１００μＬの１００ｍｇ／ｍＬの種々のポリマーを９００μＬの水に添加することによって１０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液を作った。ロータリーエバポレーターによって、ポリマー懸濁液中のエタノールを一部除去した。水の添加によって懸濁液をその元の体積に戻した。以下の実験のために１０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液を用いた。あるいは、水中で１ｍｇ／ｍＬまでさらなる希釈を行った。
【００７５】
［Ｅ．ポリマー細胞毒性の評価］
本発明のＰＥＡポリマーの生体適合性をマウス肝細胞ＦＬ８３Ｂ細胞において試験した。細胞毒性研究のために以下の本発明のＰＥＡポリマーを使用した：ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ、ＰＥＡ−Ａｒｇ（Ｏｍｅ）．ＡＡ、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡ、ＰＥＡ−Ａｇｔ．ＡＡ、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｇｔ．ＡＡ（式ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、式中、Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、ＡＡ−酢酸、ｐ＝０．７５、ｍ＝０．２５）およびポリアルギニン塩酸塩（分子量５，０００〜１５，０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００７６】
ポリマーをＦＬ８３Ｂ細胞に添加し、ＶｉａＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて、細胞毒性を２４時間および４８時間で測定した。１０％ウシ胎児血清が補充された細胞培地に１００ｍｇ／ｍＬのポリマーを添加して０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。培地を取り出し、細胞溶解試薬を添加した。１０分後に、１００μｌの細胞溶解物を白壁のルミノメータープレートに移した。１００μｌのＡＴＰ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓを各ウェルに添加した。プレートを２分間インキュベートし、次にルミノメーターにおいて読み取った。生存％データは、サンプルの相対発光を対照の相対発光で割って１００をかけることによって計算されるように、対照に対して規格化された生存パーセントで表される。
【００７７】
図１〜３に要約されるこの実験からのデータによって示されるように、ＰＥＡ−アグマチン．ＡＡのみが０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性を示した。その他の本発明のカチオン性ポリマーは全て、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性でなかった。ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡは、１ｍｇ／ｍＬの濃度においても毒性でなかった。全体として、全てのＰＥＡ結合体は、同様の濃度における市販のポリアルギニンよりも毒性が低かった（１３ｕＭのポリアルギニンは０．２ｍｇ／ｍＬである）。
【００７８】
［Ｆ．電荷比の定義および測定］
記載されるポリマーのそれぞれについて、１ＨＮＭＲデータによって推定したポリマーあたりのグアニジウム負荷の％に基づいて正電荷の総数を計算した。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方について、負電荷の数は塩基対あたりの２つの負電荷を基準とし、質量あたりの電荷の総数として計算した。負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率を電荷比であると決定し、表１および２におけるカテゴリーとして記入した。
【００７９】
ポリマー：ＤＮＡ複合体の形成は、動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ５．００を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において測定したゼータ電位によっても確認した。結果は、本明細書の表１および２において見ることができる。ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）懸濁液はＧＦＰプラスミドと複合体を形成した。サンプルは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中に１ｍＬまでとし、次に、１ｍＬの体積全体を、生成物プロトコールに従って使い捨てのキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＤＴＳ１０６０）に負荷した。
【００８０】
［Ｇ．ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性］
ポリマーのみについての前の実施例において記載されるように、ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性を測定した。簡潔に言うと、２４ウェルプレートの各ウェルに対して、１μｇのＧＦＰプラスミドＤＮＡの最終濃度のために、１：１、２：１、および４：１の電荷比で、無血清培地中の１ｍｇ／ｍＬの体積のＧＦＰプラスミドに１０ｍｇ／ｍＬの体積のポリマー懸濁液を添加することによって、ポリマー：ＤＮＡ複合体を作った。溶液を混ぜた後、直ちに懸濁液を数秒間ボルテックスし、次に周囲条件で４０分間、平衡化させた。５％ＣＯ２下、３７℃で１８〜２４時間、これらの複合体を細胞に添加した。ポリマー：ＤＮＡ複合体溶液を含む細胞培地を取り出し、新鮮な培地に取り換えた。ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性は、Ｖｉａｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイ（Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）によって２４時間および４８時間で測定した。図４に要約されるデータにより示されるように、ポリマー：ＤＮＡ複合体の存在下でＦＬ８３Ｂ細胞は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に生存可能であり、概して、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔの場合よりも６０％高く生存可能であった。
【００８１】
［［Ｈ］緑色蛍光タンパク質プラスミド（ＧＦＰ）によるトランスフェクション］
ＤＮＡは、上記のように１：１、２：１、および４：１のポリマー対ＤＮＡの電荷比で、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ（式ＶＩ）と複合体を形成した。トランスフェクション効率を顕微鏡でモニターできるように、緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡを用いた。ポリマー：ＤＮＡ複合体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液または無血清細胞培地中で作った。ポリマー：ＤＮＡ複合体は、アガロースゲル遅延度アッセイを行うことによって確認した。簡潔に言うと、ＴＡＥ（トリス酢酸ＥＤＴＡ）緩衝液中の臭化エチジウムにより染色した１％アガロースゲルにおける１００Ｖで１５〜２０分間の電気泳動法によって、上記のプロトコールを用いて形成されたポリマー：ＤＮＡ複合体を分析した。ＵＶ照明によってＤＮＡを視覚化した。遊離ＤＮＡはゲルを通って移動して臭化エチジウム染色により視覚化され得るが、ポリマー：ＤＮＡ縮合物はゲルを通って移動しないであろう。図５は、４つの電荷比のポリマー：ＤＮＡ縮合物を示す。０．５：１および１：１の電荷比では、未結合ＤＮＡがまだゲル上で視覚化され得る。完全な中和は、およそ２：１以上の電荷比で達成された。２：１および４：１の電荷比によって、未結合ＤＮＡは見ることができず、十分なポリマーがＤＮＡと複合体を形成して電荷を中和し、移動を妨げることが示唆される。
【００８２】
マウス肝細胞ＦＬ８３Ｂ細胞を３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。無血清培地中で作られた上記電荷比のポリマー：ＤＮＡ複合体をＦＬ８３Ｂ細胞に添加した。複合体を３７℃で１８〜２４時間、細胞上で放置した。次に、１０％ウシ胎児血清を補充した新鮮な培地を細胞に再供給し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。緑色蛍光タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）の発現に陽性の細胞を顕微鏡で観察し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）におけるフローサイトメトリーによって定量した。ＧＦＰ発現は図５に示される。意外にも、ＭＶＰＥＡ−Ａｒｇ（Ｏｍｅ）．ＨＣｌは、試験した全てのポリマーのうち最高のトランスフェクション効率を有した。しかしながら、このような効率は市販の試薬により達成される効率のわずか２０％であった。トランスフェクション時間を短縮し、培地に血清を含ませることにより、図６に示されるようにトランスフェクション効率が改善され、市販の試薬のＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と比較して８０％まで改善された。
【００８３】
［ヒト子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ）およびヒト冠動脈内皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）におけるＧＦＰによるトランスフェクション効率の比較］
ヒト冠動脈内皮細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＤＮＡは、上記のように６：１のポリマー対ＤＮＡの電荷比でＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌ（式ＶＩ）と複合体を形成させた。ポリマー：ＤＮＡ複合体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７中で作った。市販のトランスフェクション試薬Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、およびＬＴ−１（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と、トランスフェクション能力を比較した。
【００８４】
ＨｅＬａ、ヒト子宮頸癌細胞、ＨＣＡＥＣ、ヒト冠動脈内皮細胞およびＦＬ８３Ｂ、マウス肝細胞をそれぞれ、１０，０００、１０，０００および３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。１０％ウシ胎児血清を補充した培地において１μｇＤＮＡ／ウェルの濃度でポリマー：ＤＮＡ複合体を細胞に添加した。複合体を３７℃で７２時間、細胞上で放置した。緑色蛍光タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）の発現に陽性の細胞を顕微鏡で観察し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔＴＭにおけるフローサイトメトリーによって定量した。ＧＦＰの発現は図７に示される。市販の試薬と比較して、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌは、ＨｅＬａ細胞に対して有利なトランスフェクション効率を有し、トランスフェクション効率はＦＬ８３Ｂ細胞の場合に匹敵した。ＨＣＡＥＣは、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌ、ＪｅｔＰＥＩおよびＬＴ−１によってのみトランスフェクトされた。
【００８５】
［実施例３］
［ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび発現］
シェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）に対するｓｉＲＮＡのパネルは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ａｎｄ Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液（６ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、ｓｉＲＮＡを２０μＭに戻し、−２０℃で貯蔵した。パネルをＳＳＢ遺伝子発現の下方制御についてスクリーニングし、市販のトランスフェクション試薬Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と比較した。
【００８６】
ｓｉＲＮＡは、１：１、２：１、および４：１のポリマー対ｓｉＲＮＡの電荷比においてＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）と共に配合した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の形成はアガロースゲル遅延度アッセイを行うことによって確認し、以下のように４つの電荷比において、ポリマー：ｓｉＲＮＡ縮合物の形成が検出された：レーン１＝１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー、レーン２＝０．６μｇのｓｉＲＮＡのみ、レーン３＝６：０電荷比のＰＥＡのみ、レーン４＝１：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン５＝２：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン６＝４：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン７＝６：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ。種々の電荷比においてｓｉＲＮＡと複合体を形成したＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌのゲル遅延度アッセイの結果の顕微鏡写真の観察によって、１：１電荷比においてアガロースゲル中に未結合ｓｉＲＮＡが観察されることが明らかになった。しかしながら、２：１、４：１、および６：１の電荷比では、ｓｉＲＮＡはポリマーと完全に複合体を形成し、移動は観察されなかった。中和したポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の形成は、本明細書の表２に示されるように、ゼータ電位アッセイおよびＤＬＳによっても確認した。
【００８７】
ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体を無血清培地中で作り、４０分間複合体を形成させた後、新鮮な培地を添加した。複合体をＦＬ８３Ｂ細胞に添加し、１００ｎＭの最終ＤＣ０３濃度で１８〜２４時間、３７℃でトランスフェクトさせた。２４時間後に、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離した。定量的ＰＣＲにより遺伝子発現を測定した。この実験の結果、（図８）は、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌまたはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と複合体を形成したｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、ＳＳＢ発現の約７０％の下方制御をもたらすことを示した。
【００８８】
［市販のトランスフェクション試薬に対するＰＥＡポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性］
ポリマー：ＤＮＡ複合体についての先行実施例において記載したように、ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性を測定した。簡潔に言うと、１０ｍｇ／ｍＬの体積のポリマー懸濁液を多量のｓｉＲＮＡに添加し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７中の１００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度を得ることによって、ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体を作った。これらの複合体を５％ＣＯ２下、３７℃で２４ウェルプレート内の細胞に添加した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性は、ＶｉａｌｉｇｈＴＭアッセイによって２４および４８時間で測定した。図９に要約されるデータにより示されるように、本発明のポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の存在下でのＦＬ８３Ｂ細胞の生存率は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に有利であった。
【００８９】
全ての刊行物、特許、および特許文献は、個々に参照により援用されたかのように、参照によって本明細書に援用される。本発明は、種々の特定の好ましい実施形態および技術を参照して説明された。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内に留まりながら多くの変化および変更が成され得ることは理解されるべきである。
【００９０】
本発明は上記実施例を参照して説明されたが、変更および変化が本発明の趣旨および範囲内に包含されることは理解されるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
遺伝子治療は、被験者の特定の細胞に遺伝子材料を導入することによる疾患の処置であると定義することができる。人間の遺伝子治療の概念は、１９７０年代初期に最初に統合された。１９７０年代後半および１９８０年代を通しての分子生物学の進歩は、１９９０年に承認されたＦＤＡプロトコールに従う遺伝子導入技術を用いた最初の患者の処置をもたらした。これらの研究からの楽観的な結果により、遺伝子治療は多くの人間の病気の処置および治療のために急速に一般的になることが期待された。しかしながら、１１３１の遺伝子治療の臨床試験が１９８９年から世界中で承認されたことを考慮すれば、成功した数が少ないのは残念なことである。
【０００２】
遺伝子治療において使用される遺伝子構築物は、３つの成分：特定の治療用タンパク質をコードする遺伝子、標的細胞内の遺伝子の機能を制御するプラスミドベースの遺伝子発現系、および体内の特定の位置への遺伝子発現プラスミドの送達を制御する遺伝子導入系からなる。人間の遺伝子治療の発展に対する重要な制限によって、安全、効率的および制御可能な遺伝子導入方法は欠如したままである。
【０００３】
人間の臨床的使用のためのウイルスベクターの使用は、歴史的に、限られたペイロード容量および一般的な産生問題から、免疫および毒性反応ならびに望ましくないウイルス組換えの可能性まで様々であり得る制限に遭遇している。ポリマーおよび脂質は最も一般的な非ウイルス合成導入ベクターであり、このような制限の可能性を回避することを目指して開発されてきた。従って、非ウイルス系、特に合成ＤＮＡ送達系は、研究所および臨床設定の両方においてますます望ましくなっている。
【０００４】
しかしながら、非ウイルス遺伝子導入分野における研究は、ウイルスベースの遺伝子導入系の研究と比較してその初期段階にある。近年、多数のグループが、カーゴ（ｃａｒｇｏ）の細胞内送達を高めるためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＤＴ）を使用しており、よく研究された例は、ＨＩＶ−１の転写のトランスアクチベーター、ＴＡＴのアルギニンに富んだセグメントである。関連の研究において、ＴＡＴ配列はアルギニンのモノマーによって置換され得ることが分かり、これにより、アルギニンのグアニジウム残基が異種遺伝子を標的細胞内に導入するＴＡＴの能力にとって不可欠であることが示された。この発見以来、多数のグループが、グアニジンに富んだＰＴＤと、薬物、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ナノ粒子、およびリポソームとの化学的な結合体を調製し、これらを広範な種類の細胞型へうまく送達している。さらに、分子アルギニンは薬理学的使用のために抗凝固薬として提唱されており、天然ポリマーキトサンに結合されたアルギニンも報告されている（ＷＧ Ｌｉｕら、Ｊ．Ｍａｔ．Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４年）１５）。
【０００５】
非ウイルス遺伝子導入剤として評価されている一般的なカチオン性ポリマーの中で、最もよく知られているのはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。非ウイルスベクターとして開発されたその他の合成および天然ポリカチオンとしては、ポリアミドアミンデンドリマー（Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ（１９９０年）２９（２）”１３８−１７５）および変性キトサン（Ｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８年）１５（９）：１３３２−１３３９）が挙げられる。
【０００６】
遺伝子導入効率を改善するために特異的に設計されたポリマーとしては、プロトンスポンジ効果を有するイミダゾール含有ポリマー、膜分裂ペプチドおよびポリマー、例えばポリエチルアクリル酸（ＰＥＡＡ）およびポリプロピルアクリル酸（ＰＰＡＡ）などと、シクロデキストリン含有ポリマーおよび分解性ポリカチオン、例えばポリ［アルファ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）およびポリ（アミノ酸）などと、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などの非イオン性の水溶性ポリマーに結合されたポリカチオンとが挙げられる。ほとんどの場合、これらのポリマーは、安定性、生体適合性またはエンドソームエスケープなどの特定の細胞内障害に対処するために設計されたものである。結果は様々であり、いくつかのポリマーは、市販の最良のポリマーと同程度に機能するか、あるいはわずかに優れていた。しかしながら、どれも遺伝子導入ベクターとしてのウイルスの効率には到達していない。
【０００７】
過去１０年間、生物医学的用途のための生分解性で生体吸収性のポリマーは、ますます関心を集めている。最近記載されたαアミノ酸、脂肪族ジオール、および脂肪族ジカルボン酸に基づく脂肪族ＰＥＡは、その生体適合性、低毒性、および生分解性のために、生物医学的用途のための良好な候補であることが分かった（Ｋ．ＤｅＦｉｆｅら、Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ＴＣＴ ２００４ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．２００４年、Ｇ．Ｔｓｉｔｌａｎａｄｚｅら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｅｄｎ．（２００４年）．１５：１−２４）。
【０００８】
主に穏やかな温度の溶液中で実行される非常に用途の広い活性重縮合（ＡＰＣ）法は、高分子量を有する規則的な直鎖多官能性ＰＥＡ、ポリ（エステル−ウレタン）（ＰＥＵＲ）およびポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）の合成を可能にする。ＡＰＣの合成多様性のために、構成要素として使用される３つの成分（αアミノ酸、ジオールおよびジカルボン酸）を変えて巨大分子骨格を作ることによって、これらのポリマーにおいて広範な材料特性を達成することができる（Ｒ．Ｋａｔｓａｒａｖａら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ（１９９９年）３７：３９１−４０７）。近年、アルギニンをポリマー骨格に組み込んだカチオン性ＰＥＡは、非ウイルス遺伝子導入剤として使用可能であることが発見された（２００７年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９６１，８７６号明細書）。
【０００９】
上記の研究によって、効率的なＤＮＡ送達に対する３つの主な障害：細胞形質膜を横切る取込みが低いこと、放出されたＤＮＡ分子の不適切な放出および不安定性、ならびに核を標的とすることの困難が存在することが示された。従って、当該技術分野における上記の進歩にもかかわらず、新規のより優れた非ウイルス遺伝子導入系が必要とされている。
【００１０】
［発明の概要］
一実施形態では、本発明は、以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化１】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化２】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化３】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化４】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化７】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化８】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性ポリマーとの溶解性複合体に縮合された少なくとも１つのポリ核酸を含む生分解性遺伝子導入組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、縮合されたポリ核酸を標的細胞にトランスフェクトするために、本発明の遺伝子導入組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることによって標的細胞をトランスフェクトするための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】様々なポリマー濃度におけるＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡ、およびＰＥＡ−アグマチン．ＡＡの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。３つのポリマーのうち、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体は、ＦＬ８３Ｂ細胞に対する毒性が最も低かった。
【図２】様々な濃度のポリマーＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡおよびＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡだけが１ｍｇ／ｍＬにおいて毒性であった。
【図３】ポリアルギニンの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図４】様々な電荷比の本発明のポリマー：ＧＦＰをコードする核酸を含有するＤＮＡ複合体と、対照としてＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）のそれぞれ１つとの存在下での、ＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図５】Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬による結果に対して規格化された、種々の本発明のポリマー複合体を用いてＧＦＰをコードするＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の割合を示すフローサイトメトリーデータを要約するグラフである。
【図６】市販のトランスフェクション試薬に対して規格化された、ＦＬ８３Ｂ細胞におけるＧＦＰ発現の割合を示すフローサイトメトリーデータを要約するグラフである。
【図７】本発明の組成物および種々の市販のトランスフェクション試薬とのＧＦＰプラスミドＤＮＡ複合体によりトランスフェクトされた３つの異なる細胞型からのＧＦＰ蛍光を示すグラフである。本発明の組成物だけがＧＦＰをＨｅＬａ細胞に効果的にトランスフェクトした。
【図８】本発明のカチオン性ＰＥＡポリマーおよび市販の遺伝子導入剤とのｓｉＲＮＡの複合体をトランスフェクトされたマウス肝細胞におけるシェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）遺伝子の発現パーセントを示すグラフである。
【図９】異なるトランスフェクション試薬と複合体を形成した１００ｎＭのＤＣ０３（ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされたＦＬ８３Ｂ細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは式Ｉ、Ｒ２＝ＯＨのＰＥＡ．ＨのＤＭＳＯ−ｄ６における５００ＭＨｚの１ＨＮＭＲスペクトルであり、図１０Ｂは式ＶＩのＰＥＡ−（ＯＭｅ）．ＨＣｌのＤＭＳＯ−ｄ６における５００ＭＨｚの１ＨＮＭＲスペクトルである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
ポリ（エステル−アミド）（ＰＥＡ）、ポリ（エステルウレタン）ＰＥＵＲおよびポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）は、その骨格中のエステルおよびアミド、ウレタンまたは尿素ブロックのいずれかで構成される生分解性ポリマー類を形成する。これらのポリマーはポリエステルおよびポリアミドの両方の有利な特性を兼ね備えるので、ＰＥＡは長年にわたって広く研究されている。必須のアルファアミノ酸が構成要素として使用される場合、これらのポリマーは、生体適合性であることに加えてタンパク質様の特性も有する。例えば、Ｌ−アルギニンは、全ての生命体のタンパク質中に存在するαアミノ酸である。Ｌ−アルギニンの脱カルボキシル化形態であるアグマチンとして知られる４−アミノブチルグアニジンは、多くの生理学的機能に関与する生体アミン類に属する。
【００１４】
アルギニンおよびアグマチンはいずれも、強塩基性グアニジノ基のために生理的ｐＨにおいて正電荷を帯びており、約１２のｐＫａ値を有する。（アグマチンのイオン化形態は、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−ＮＨ２と書くことができる。）本発明はアルギニン、アグマチンおよびその他のカチオン性αアミノ酸を用いて、本発明の組成物および方法で使用されるＰＥＡならびに関連のＰＥＵＲおよびＰＥＵのカチオン性ペンダント基を提供する。これらのペンダント基は、負に帯電したＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸配列を中和して、細胞膜に侵入し得る溶解性複合体に縮合させるために必要な強塩基特性を提供する。
【００１５】
従って、一実施形態では、本発明は、以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化９】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化１０】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１１】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化１２】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化１３】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１４】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化１５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化１６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性ポリマーとの溶解性複合体に縮合された少なくとも１つのポリ核酸を含む生分解性遺伝子導入組成物を提供する。
【００１６】
Ｒ７の好ましい例は、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニルであり、特に−（ＣＨ２）４−である。
【００１７】
本発明において使用するために合成されるポリマーの例は式ＩのＰＥＡであり、ｐモノマー単位中のＬ−リジン（Ｒ７＝（ＣＨ２）４）のＣ−末端は、アルギニンメチルエステル（ＶＩ）またはアグマチン（ＶＩＩ）のいずれかと共有結合しており、グアニジンペンダント部分は例えば塩酸からの酸性の対イオンと会合している。
【化１７】
【００１８】
アルファアミノ酸に基づくＰＥＡおよびＰＥＵＲの製造方法は米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書に開示されており、ＰＥＵの調製方法は（米国特許出願第１１／５８４，１４３号明細書）に記載されている。アルギニンおよびアグマチンのＰＥＡへの結合のための手順は、本明細書の実施例１に記載されている。
【００１９】
巨大分子に沿った電荷密度を変えるために、グアニジン誘導体を分枝状リンカーによってポリマーに結合させることができる。例えば、親和性リガンド６−アミノ−２−（ビス−カルボキシメチルアミノ）−へキサン酸（アミノブチル−、またはＡＢ−ＮＴＡ、その化学構造は式ＶＩＩＩで示される）が分枝状リンカーとして使用されている。
【化１８】
調製されるカチオン性ＰＥＡは、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（式ＩＸ）およびＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｇｔ（式Ｘ）と称され、その合成方法は以下の実施例１に開示されている。
【化１９】
ＰＥＡ−ＮＴＡ結合体の一般式は、式（ＸＩ）：
【化２０】
で示され、式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は、式（Ｉ）のＰＥＡについて上記で定義したとおりである。
【００２０】
ＡＢ−ＮＴＡリンカーはリジンのα−Ｎ誘導体を表す。本発明の遺伝子導入組成物に含有されるカチオン性ポリマーの製造において使用することができる相同リンカーの付加的な例はオルニチン誘導体であり、その化学構造は以下の一般構造式（ＸＩＩ）で表される。
【化２１】
式中、Ｒ１１は独立して（Ｃ２〜Ｃ８）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ８）アルキレンであり、例えば、（Ｃ３〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ６）アルケニレンであり、そしてＲ１２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、または（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニルである。このようなリンカーの調製およびその構造式（Ｉ）のＰＥＡとの結合は、米国特許出願公開第２００７０１６０６２２号明細書に例示されている。
【００２１】
電荷密度を増大させるためにＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーのＲ２置換基として使用することができるカチオン性残基の製造の付加的な例は、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーのｐ単位のアミノ酸のＣ−末端に、アルギニンに富んだオリゴマーまたは市販の低分子量のカチオン性ポリアミノ酸（オリゴアルギニンなど）をグラフトさせる方法によって成される。グラフト法は、式（ＸＩＩＩ）に示されるようにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）型カップリングを用いて実行することができ、式中、ｒは上記で定義したとおりである。
【化２２】
本発明のポリマーにグラフトさせることができるカチオン性オリゴアミノ酸およびカチオン性ポリアミノ酸のその他の例は、ポリリジン、ポリオルニチン、およびポリヒスチジンである。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、組成物を標的細胞に進入させて標的細胞をトランスフェクトするための条件下および時間で、ポリマーと縮合されたポリ核酸をその中に含む本発明の遺伝子導入組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることによって、標的細胞をトランスフェクトするための方法を提供する。
【００２３】
本発明の組成物および方法を記載するために本明細書中で使用される場合、「溶液中」および「溶解性複合体」という用語は生物学者の間で一般的に使用される意味を包含し、液体中に懸濁された粒子は溶液中にあると言われる。ポリマーおよびポリ核酸の電荷は中和されるので、本発明の組成物中のカチオン性ポリマーおよびポリ核酸の複合体は縮合されて水性環境中のポリマー粒子を形成する。このような粒子の液体中の懸濁液は、本明細書では、溶液中にあると見なされる。
【００２４】
本発明の方法の実施において使用するために適切な標的細胞には、哺乳類細胞、例えば、本発明の組成物の投与によって患者に送達されたポリ核酸の発現によって処置される患者の組織に属する細胞が含まれるがこれらに限定されない。適切な哺乳類の標的細胞としては、神経系の細胞（例えば、脳、脊髄および抹消神経系細胞）、循環系細胞（例えば、心臓、血管、ならびに赤血球および白血球細胞）、消化器系（例えば、胃および腸）、呼吸器系（例えば、鼻および肺）、生殖器系、内分泌系（例えば、肝臓、脾臓、甲状腺、および副甲状腺）、皮膚、筋肉、または結合組織が挙げられる。
【００２５】
あるいは、標的細胞は、任意の器官または組織に由来する癌細胞、例えば本発明の組成物の投与によって患者に送達されたポリ核酸の発現によって処置される患者の組織に属する癌細胞であってもよい。あるいはさらに、標的細胞は、患者に感染しているまたは被験者に感染し得る寄生虫、病原体またはウイルスの細胞でもあり得る。従って、本発明の遺伝子導入組成物は、インビトロ（標的細胞と、その中で発現される所望のポリ核酸との相互作用を研究するため）およびインビボ（生きている被験者における遺伝子治療用途のため）の両方において有用である。
【００２６】
４−メチレンイミダゾリニウムの構造式は次のとおりである。
【化２３】
【００２７】
特定の実施形態では、組成物中のポリマーは、ポリマー中の正に帯電した基と会合した１つまたは複数の対イオンおよび／またはポリマーに結合した１つまたは複数の保護基を有し得る。
【００２８】
本発明の組成物中のポリマーと会合するために適切な対イオンの既知の例は、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｂｒ−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＣｌ３ＣＯＯ−、ＴｏｓＯ−などの対アニオンである。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、本発明の遺伝子導入組成物に適用される「水溶性」および「水溶性の」という用語は、組成物の飽和点における脱イオン水１ミリリットルあたりの組成物の濃度を意味する。水溶性は、種々のポリマーそれぞれに対して異なり得るが、溶媒および溶質間の分子間力と、溶媒和に付随するエントロピー変化とのバランスによって決定される。ｐＨ、温度および圧力などの因子はこのバランスを変化させ、従って、水溶性を変化させ得る。水溶性はｐＨ、温度、および圧力にも依存する。
【００３０】
一般的に定義されるように、水溶性ポリマーはヒドロゲルへの真に水溶性のポリマーを含み得る（Ｇ．Ｓｗｉｆｔ、ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒ．Ｓｔａｂ．５９：（１９９８年）１９−２４）。本発明の組成物はかろうじて水溶性（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍＬから）であってもよいし、あるいは吸湿性であり、湿った大気にさらされたときに急速に水を吸収して、最終的には粘性溶液を形成してもよく、溶液中の組成物／水の比は無限に変えることができる。
【００３１】
本発明の遺伝子導入組成物中で使用されるポリマーの大気圧における脱イオン水への溶解性は、約１８℃〜約５５℃、好ましくは約２２℃〜約４０℃の範囲の温度で、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬの範囲である。本発明の組成物の定量的な溶解性は、Ｂｒａｕｎの方法に従って視覚的に評価することができる（Ｄ．Ｂｒａｕｎら、Ｐｒａｋｔｉｋｕｍ ｄｅｒ Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｎ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ、Ａｌｆｒｅｄ Ｈｕｔｈｉｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９６６年）。当業者には知られているように、Ｆｌｏｒｙ−Ｈｕｇｇｉｎｓ溶液理論は、ポリマーの溶解性を説明する理論モデルである。Ｈａｎｓｅｎ溶解性パラメータおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄ溶解性パラメータは、溶解性の予測のための経験的方法である。融解エンタルピーなどの他の物理定数から溶解性を予想することも可能である。
【００３２】
本明細書に記載されるＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵＲポリマーの脱イオン水溶液に低分子量の電解質を添加すると、４つの応答のうちの１つを引き起こすことができる。電解質は、鎖収縮、鎖伸張、キレート化による凝集（構造遷移）、または沈殿（相分離）を生じ得る。応答の正確な性質は、ポリマーの化学構造、濃度、および分子量、ならびに添加した電解質の性質などの種々の因子に依存し得る。それにもかかわらず、本発明の遺伝子導入組成物は、血液、血清、組織などの生理条件または水／アルコール溶媒系において見られるような条件を含む種々の水性条件下で溶解性であり得る。
【００３３】
本発明の組成物の水溶性は、当該技術分野において既知であるように、そして本明細書の実施例において説明されるように１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ゲル浸透クロマトグラフィ、およびＤＳＣなどのアッセイを用いて特徴付けることもできる。
【００３４】
全てのアミノ酸は、末端アミノおよびカルボキシレート基のために帯電種として存在することができるが、アミノ酸の一部だけが適切な条件下で帯電し得る側鎖を有する。「カチオン性αアミノ酸」を言う用語は、本発明の組成物において使用されるポリマーを記載するために本明細書中で使用される場合、Ｒ２基が、弱酸（水中に溶解されたときに完全にはイオン化しない）としてその側鎖が機能し得るアミノ酸残基であるか、またはそれを含有することを意味する。酸素、硫黄または窒素などのへテロ原子に共有結合したプロトンからなるイオン化可能な部分が存在することによって、Ｒ２基内のこのようなアミノ酸残基においてイオン化可能な特性が与えられる。別のイオン化可能な分子または基の近くなどの適切な水性条件下では、イオン化可能なプロトンは、供与性水素イオンとしてＲ２から解離し、Ｒ２置換基内の１つまたは複数のアミノ酸残基を塩基にし、次いでこれは水素イオンを受け取ることができる。酸形態からのプロトンの解離、または塩基形態によるプロトンの受け取りは、水性環境のｐＨに強く依存する。イオン化度も環境に敏感であり、水性環境の温度およびイオン強度ならびにポリマー内のイオン化可能な基の微小環境に依存する。
【００３５】
従って、「カチオン性αアミノ酸」という用語は、本発明の遺伝子導入組成物中の特定のポリマーを記載するために本明細書中で使用される場合、ポリマー内のアミノ酸残基のＲ２基中のアミノ酸残基が、適切な周囲の水性または溶媒条件下、特に血液および組織中などの生理条件下で正イオンを形成できることを意味する。このような正のアミノ酸の対イオンは、上記で記載したとおりであり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「二酸の残基」という用語は、ジカルボン酸の二酸の２つのカルボキシル基を除く部分を意味し、この部分は本発明のポリマー組成物の骨格に取り込まれる。本明細書中で使用される場合、「ジオールの残基」という用語は、残基が本発明のポリマー組成物の骨格に取り込まれた部位において、ジオールの２つのヒドロキシル基を除く部分を意味する。「残基」を含有する対応する二酸またはジオールは、本発明の遺伝子導入組成物の合成において使用される。
【００３７】
αアミノ酸およびジオールのジエステルのジアリールスルホン酸塩は、αアミノ酸、例えばｐ−アリールスルホン酸一水和物、およびジオールを、還流温度まで加熱したトルエン中で水の発生が終結するまで混ぜ合わせ、そして冷却することによって調製することができる。
【００３８】
ジカルボン酸の飽和ジ−ｐ−ニトロフェニルエステルおよびビス−αアミノ酸エステルの飽和ジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩は、米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書に記載されるように調製することができる。
【００３９】
カチオン性αアミノ酸を含有する式（Ｉ、ＩＶおよびＶ）のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは、保護基化学を用いて調製することができる。保護されたモノマーは、ＡＰＣの前か、またはポリマーの処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）の後のいずれかで脱保護され得る。保護基化学で使用される適切な保護試薬および反応条件は、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年）において見出すことができ、その内容は参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００４０】
本発明の組成物中のポリ核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ、アンチセンスポリ核酸、機能性ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、ポリ核酸はＲＮＡであり得る。別の実施形態では、ポリ核酸はＤＮＡであり得る。別の実施形態では、ポリ核酸はアンチセンスポリ核酸であり得る。別の実施形態では、ポリ核酸は、センスポリ核酸であり得る。別の実施形態では、ポリ核酸は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むことができる。別の実施形態では、ポリ核酸は、リン酸ジエステル結合３’−５’および５’−３’ポリ核酸骨格を含むことができる。あるいは、ポリ核酸は、ホスホチオエート型、ホスホルアミデートおよびペプチド−ヌクレオチド骨格などの非リン酸ジエステル結合を含むことができる。別の実施形態では、部分は、ポリ核酸の骨格糖に結合することができる。このような結合を形成する方法は当業者によく知られている。
【００４１】
ポリ核酸は、一本鎖ポリ核酸または二本鎖ポリ核酸であり得る。ポリ核酸は任意の適切な長さを有することができる。特に、ポリ核酸は約２〜約５，０００ヌクレオチドの長さであることができ、約２〜約１０００ヌクレオチドの長さが含まれ、約２〜約１００ヌクレオチドの長さが含まれ、あるいは約２〜約１０ヌクレオチドの長さが含まれる。
【００４２】
アンチセンスポリ核酸は、通常、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なポリ核酸である。例えば、ｍＲＮＡは、癌促進タンパク質、すなわち癌遺伝子の産物をコードすることができる。アンチセンスポリ核酸は一本鎖ｍＲＮＡに相補的であり、二重鎖を形成し、それにより標的遺伝子の発現を阻害し得る。すなわち、癌遺伝子の発現を阻害し得る。本発明のアンチセンスポリ核酸は、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡと二重鎖を形成することができ、標的タンパク質の発現を許さないであろう。
【００４３】
「機能性ＲＮＡ」は、リボザイムまたは他の翻訳されないＲＮＡを指す。
【００４４】
「ポリ核酸デコイ」は、細胞因子がポリ核酸デコイへ結合する際に、細胞因子の活性を阻害するポリ核酸である。ポリ核酸デコイは、細胞因子の結合部位を含有する。このような細胞因子の例としては、転写因子、ポリメラーゼおよびリボソームが挙げられるが、これらに限定されない。転写因子デコイとして使用するためのポリ核酸デコイの一例は、転写因子の結合部位を含有する二本鎖ポリ核酸であろう。あるいは、転写因子のためのポリ核酸デコイは、それ自体とハイブリッド形成して、標的転写因子の結合部位を含有するスナップバック二重鎖を形成する一本鎖核酸であってもよい。転写因子デコイの一例はＥ２Ｆデコイである。Ｅ２Ｆは、細胞周期調節に関連して細胞を増殖させる遺伝子の転写において役割を果たす。Ｅ２Ｆの制御は細胞増殖の調節を可能にする。例えば、外傷（例えば、血管形成、手術、ステント留置）の後、外傷に応答して平滑筋細胞が増殖する。増殖は、処置された領域の再狭窄（細胞増殖による動脈の閉鎖）を引き起こし得る。従って、Ｅ２Ｆ活性の調節は細胞増殖の制御を可能にし、増殖を低下させ、動脈の閉鎖を回避するために使用することができる。その他のこのようなポリ核酸デコイおよび標的タンパク質の例としては、ポリメラーゼを阻害するためのプロモーター配列、およびリボソームを阻害するためのリボソーム結合配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明が、任意の標的細胞因子を阻害するために構築されたポリ核酸デコイを含むことは理解される。
【００４５】
「遺伝子治療剤」は、遺伝子を標的細胞内に導入した後に遺伝子産物の発現を行うことによって、標的細胞において遺伝子産物の発現を引き起こす薬剤を指す。このような遺伝子治療剤の一例は、ＤＮＡベクターなどの細胞内に導入されたときにタンパク質の発現を引き起こす遺伝子構築物であろう。あるいは、遺伝子治療剤は、標的細胞における遺伝子の発現を低減することができる。このような遺伝子治療剤の一例は、標的遺伝子に統合され得るか、あるいは遺伝子の発現を妨害し得る、ポリ核酸セグメントの細胞内への導入であろう。このような薬剤の例としては、相同的組換えによって遺伝子を妨害することができるポリ核酸が挙げられる。細胞内の遺伝子の導入および妨害方法は当業者によく知られており、本明細書に記載されるとおりである。
【００４６】
一実施形態では、ポリ核酸は、一般に知られている化学方法に従って合成することができる。別の実施形態では、ポリ核酸は、商業的供給業者から得ることができる。ポリ核酸としては、ブロモ誘導体、アジド誘導体、蛍光誘導体またはこれらの組み合わせなどの少なくとも１つのヌクレオチド類似体が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチド類似体は当業者によく知られている。ポリ核酸は、連鎖停止剤を含むことができる。ポリ核酸は、例えば、架橋試薬または蛍光タグとして使用することもできる。多くの通常の結合は、ポリ核酸を別の部分、例えばホスファート、ヒドロキシルなどにカップリングさせるために使用することができる。さらに、部分は、ポリ核酸に取り込まれたヌクレオチド類似体によってポリ核酸に結合されてもよい。別の実施形態では、ポリ核酸は、リン酸ジエステル結合３’−５’および５’−３’ポリ核酸骨格を含むことができる。あるいは、ポリ核酸は、ホスホチオエート型、ホスホルアミデートおよびペプチド−ヌクレオチド骨格などの非リン酸ジエステル結合を含むことができる。別の実施形態では、部分は、ポリ核酸の骨格糖に結合することができる。このような結合を形成する方法は当業者によく知られている。
【００４７】
縮合したポリマー：ポリ核酸は、インビトロでα−キモトリプシンなどの酵素と接触して、あるいはインビボに注入されたときに分解して、適切で有効な量のポリ核酸の持続放出を提供することができる。任意の適切で有効な期間を選択することができる。通常、適切で有効な量のポリ核酸は、約２４時間、約２日または約７日で放出され得る。ポリ核酸が本発明の組成物から放出される時間の長さに通常影響を与える因子としては、例えば、ポリマーの性質および量、ポリ核酸の性質、サイズおよび量、組成物が導入される環境のｐＨ、温度および電解質または酵素含量が挙げられる。
【００４８】
式（Ｉ、ＩＶまたはＶ）のＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーの任意の適切なサイズを本発明の遺伝子送達組成物において用いることができる。例えば、ポリマーは、約１×１０−４メートル未満、約１×１０−５メートル未満、約１×１０−６メートル未満、約１×１０−７メートル未満、約１×１０−８メートル未満、または約１×１０−９メートル未満のサイズを有することができる。
【００４９】
本発明の遺伝子導入組成物および方法は、ポリ核酸、ポリ核酸およびポリ核酸を含む全てのタイプのＲＮＡおよびＤＮＡの使用および標的細胞への送達を包含する。より具体的には、核酸は、任意のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡは、治療分子をコードする遺伝子などの、その中に含有される遺伝子の発現のためのプラスミドを含む。ＲＮＡは、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）、転移（ｔＲＮＡ）、リボソーム（ｒＲＮＡ）、および干渉（ｉＲＮＡ）を含む。干渉ＲＮＡは転写後遺伝子サイレンシングに関与するＲＮＡであり、センスおよびアンチセンス鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない。ＲＮＡ干渉のメカニズムでは、ｄｓＲＮＡは細胞に進入し、その中の酵素ＤＩＣＥＲによって消化され２１−２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡになる。連続的な切断事象は、ＲＮＡをｓｉＲＮＡとして知られる１９−２１ヌクレオチドに分解する。ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖はヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、すなわちＲＩＳＣを形成する。活性化ＲＩＳＣは、塩基対合相互作用によって相同転写物を標的にして、ｍＲＮＡを切断し、それによって標的遺伝子の発現を抑制する。最近の証拠から、機構はｍｉＲＮＡとほぼ同一であることが示唆される（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２００４年）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１０２：３）。このようにして、ｉＲＮＡは、ポリマーと縮合したら、食作用または飲作用により細胞内に送達されて放出され、標的遺伝子の発現を抑制する手段として細胞の正常な生物学的処理経路に進入することができる。
【００５０】
遺伝子発現の新たな配列特異的阻害剤の小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は大きい治療可能性を有するが、このような分子の治療薬としての開発は、インビボでのｓｉＲＮＡの急速な分解によって妨害されている。従って、ｓｉＲＮＡの治療的使用における成功のための重要な要件は、遺伝子サイレンシング核酸の保護である。本発明において、このようなｓｉＲＮＡの保護は、ポリ核酸分子と、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーとの縮合によって提供される。
【００５１】
例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖の送達のための本発明の組成物の製造において、負に帯電したｉＲＮＡのアンチセンス鎖はカチオン性ポリマーと縮合される。ｄｓＲＮＡは、キャリアポリマーと縮合される。あるいは、センス鎖は１つのポリマー鎖と縮合され、アンチセンス鎖は別のポリマー鎖と縮合され得る。いずれの場合も、ポリマーの生分解の間に本発明の組成物から放出される二本鎖ＲＮＡ、およびセンス鎖から解放されるアンチセンス鎖は、ｉＲＮＡの正常な生物学的経路に進入するであろう。
【００５２】
本発明を説明するために、本明細書の実施例１に記載されるようにペンダントカチオン性グアニジン基を有するＰＥＡポリマーを調製し、本発明の遺伝子導入組成物のために十分なプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡに縮合させて、インビトロでマウス肝細胞に容易に進入させるために使用した。物理化学的試験（ゲル電気泳動、蛍光、緑色蛍光タンパク質発現アッセイ）により、本発明の組成物中のポリ核酸の成功した細胞トランスフェクションおよび発現を確認した。市販の遺伝子導入剤：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）、およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）と比較して、本発明の遺伝子導入組成物のトランスフェクション効率を評価するために、ＧＦＰ発現アッセイを行った。
【００５３】
より具体的には、式（ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のアルギニン結合ポリ（エステル−アミド）またはアグマチン結合ポリ（エステル−アミド）を、例えば遺伝子治療において使用される標的細胞のトランスフェクションをもたらすための非ウイルス遺伝子導入剤としての効率について評価した。
【００５４】
縮合をもたらすために本発明の方法において使用されるポリマー対ポリ核酸の比率は、場合により、従来技術の遺伝子導入剤の場合よりも大きいかもしれないので、ポリマーをマウス肝臓ＦＬ８３Ｂ細胞と共にインキュベートすることによって、ポリマーの細胞毒性を検査した。細胞毒性は、標準ルミノメーター細胞増殖アッセイを用いて２４時間および４８時間で測定した。図１〜３に要約されるこの細胞の生存率実験からのデータによって示されるように、ＰＥＡ−アグマチン．ＡＡだけが０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性を示した。その他の本発明のカチオン性ポリマーは全て、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性でなかった。ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡは、１ｍｇ／ｍＬの濃度においても毒性でなかった。全体として、全てのＰＥＡ結合体は、同様の濃度における市販のポリアルギニンよりも毒性が低かった（１３ｕＭのポリアルギニンは０．２ｍｇ／ｍＬである）。これらの研究で対照として使用された市販のトランスフェクション試薬と比較すると、本発明の遺伝子導入組成物（すなわち、ポリマー：ＤＮＡ複合体）と共にインキュベートされたＦＬ８３Ｂ細胞は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に生存可能であり、概して、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）の場合よりも６０％高く生存可能であった（図４）。
【００５５】
「電荷比」という用語は、本発明の遺伝子導入組成物を記載するために使用される場合、負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率を意味する。本発明を説明するために製造された本発明の組成物のそれぞれについて、記載した正電荷の総数は、１ＨＮＭＲデータによって推定したポリマーあたりのグアニジウム負荷の％に基づいて計算した。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方について、負電荷の数は塩基対あたりの２つの負電荷を基準とし、質量あたりの電荷の総数として計算した。負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率は、以下の表１および２に示されるような電荷比であると決定された。
【００５６】
水性懸濁液中の本発明の組成物の縮合物のゲル遅延度アッセイおよびゼータ電位を用いて、正に帯電したＰＥＡポリマーが負に帯電したプラスミドＤＮＡを中和して、標的細胞のトランスフェクションにおいて使用するのに適したコンパクトな複合体を形成できることを確認した。ｓｉＲＮＡを１：１、２：１、および４：１のポリマー対ｓｉＲＮＡの電荷比においてＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）と共に配合した。１：１の電荷比では、アガロースゲル中に結合していないｓｉＲＮＡが観察されたが、２：１、４：１、および６：１の電荷比では、以下の表２に示されるようにｓｉＲＮＡはポリマーと完全に複合体を形成した。従って、本明細書において記載されるカチオン性ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは親和性を有してポリ核酸と複合体を形成し、形成された縮合物粒子の全体の電荷は、カチオン性ポリマーの過剰に従って変化することが分かった。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
標的細胞におけるポリ核酸カーゴの発現を説明するために、無血清培地中で作られたシェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）に対するカチオン性ＰＥＡおよびｓｉＲＮＡの複合体を含む本発明の組成物を用いて、本明細書の実施例３に記載されるように、無血清培地中で本発明の組成物と共に細胞をインキュベートすることによって、ＦＬ８３Ｂ細胞をトランスフェクトした。当業者は、細胞トランスフェクションにおける使用に適していることが当該技術分野において分かっている任意のトランスフェクション条件が使用され得ることを理解するであろう。
【００６０】
標的細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、標準方法を用いて定量的ＰＣＲにより遺伝子発現を測定すると、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌまたはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と複合体を形成したｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、標的細胞においてほぼ同等（すなわち、７０％）のＳＳＢ発現の下方制御をもたらすことが分かった（図９）。
【００６１】
以下の実施例は本発明を説明することが意図され、限定は意図されない。
【００６２】
［実施例１］
［Ａ．材料のキャラクタリゼーション］
モノマーおよびポリマーの化学構造は標準化学法によって特徴付けた。１ＨＮＭＲ分光法のために５００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００スペクトロメーター（Ｎｕｍｅｇａ Ｒ．Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によってＮＭＲスペクトルを記録した。テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として、重水素化溶媒ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を用いた。
【００６３】
合成されるモノマーの融点は、自動Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＦＰ６２融点測定装置（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）において決定した。合成したポリマーの数平均および重量平均分子量（ＭｗおよびＭｎ）ならびに分子量分布は、高圧液体クロマトグラフィーポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２４１４屈折率検出器を備えたモデル５１５ゲル浸透クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）によって決定した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）中の０．１％のＬｉＣｌ溶液を溶離液として使用した（１．０ｍＬ／分）。２本のＳｔｙｒａｇｅｌ（登録商標）ＨＲ ５Ｅ ＤＭＦ型カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を接続し、ポリスチレン標準で較正した。
【００６４】
［Ｂ．ＰＥＡ（ＰＥＡ−ＯＳｕ）の活性化のための一般手順］
５．０ｇ（２．７ｍｍｏｌ、重量平均Ｍｗ＝６５ｋＤａ、ＧＰＣ（ＰＳ））のＰＥＡポリマー（ＰＥＡ−ＯＳｕ）（式Ｉ、式中Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ２＝ＯＨ、およびＲ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、Ｒ７＝（ＣＨ２）４、米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１号明細書の方法に従って合成）を５０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。次に、０．６１５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．９８ｍｍｏｌ）および０．３７４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で約１２時間、アルゴン下で攪拌した。０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過することによって、形成した残渣を除去した。さらなる結合のために活性化ＰＥＡ−ＯＳｕの溶液をアルゴン下で保持した。１Ｈ−ＮＭＲ分析によって決定されるように、ＯＳｕとの結合によってＰＥＡの８０％〜１００％を活性化した。
【００６５】
［Ｃ．ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体（式ＶＩ）の合成］
ＰＥＡ−ＯＳｕの活性化エステルの予め調製した溶液（５．３ｇ、２．７ｍｍｏｌのポリマーを含有する）に、０．８４９ｇのＬ−アルギニンメチルエステル二塩酸塩（３．２５ｍｍｏｌ）、１．１３４ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６．５０ｍｍｏｌ）および５００ｍＬのＤＭＦをアルゴン下で添加した。得られた不均一な混合物を室温で約２４時間攪拌した。そのようにして形成されたＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ポリマー結合体を、３体積％の酢酸を含む５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を再度酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー沈殿物をエタノール中に再溶解させ（５．０ｇ、５０ｍＬ中）、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移し、ＤＩ水中で透析した。最後の透析溶液を凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣおよびＤＬＳによってゼータ電位および粒径について分析した。１Ｈ−ＮＭＲによって決定されるようにポリマーの６０％〜９０％をＡｒｇ（ＯＭｅ）に転化させた（図１０を参照）。精製後の生成物ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体の収率は８０〜９０％の範囲であり、重量平均分子量（Ｍｗ）は約７０ｋＤａであった（ＧＰＣ、ＰＳにより決定）。
【００６６】
［Ｄ．ＰＥＡ−アグマチン結合体（式ＶＩＩ）の合成］
０．５ｇの硫酸アグマチン（２．１９ｍｍｏｌ）および０．２１ｇの水酸化ナトリウム（８．７６ｍｍｏｌ）の懸濁液を１０ｍＬのＤＭＦ中、室温で１２時間攪拌し、形成した溶液を０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過した。５％（重量／体積）ＤＭＦ中の得られたアグマチン（遊離アミン形態、１８．７ｍｍｏｌ）５ｍＬと、２１．６ｍＬのＤＭＦ中の酢酸（９．３ｍｍｏｌ）０．５３ｍＬとを、活性化ＰＥＡ−ＯＳｕの予め調製した溶液（３．０ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）に添加した。形成された不均一な混合物をアルゴン下、室温で約２４時間攪拌した。ＰＥＡ−アグマチンポリマー結合体を２．５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー結合体をエタノール（３．０ｇ、１００ｍＬ）中に再溶解させた。溶解したポリマーを、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移し、ＤＩ水中で透析した。透析した生成物ＰＥＡ−アグマチン結合体を凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによってゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたアグマチンは、ＮＭＲによって決定されるように５０〜６０％の範囲であった。精製後の反応収率は７０〜８０％の範囲であり、重量平均分子量（Ｍｗ）は約７０ｋＤａであった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００６７】
［Ｅ．ＰＥＡ．Ｉ．ＮＴＡ（ＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕ）の活性化のための一般手順］
５．０ｇ（２．４０ｍｍｏｌ、重量平均Ｍｗ＝７７ｋＤａ、ＧＰＣ（ＰＳ））のＰＥＡポリマー（式Ｉ、式中Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ２＝式ＶＩＩＩのリンカー、およびＲ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、Ｒ７＝（ＣＨ２）４）を、アルゴン下で５０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。次に、１．５３５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、７．４４ｍｍｏｌ）および０．８８４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、７．６８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で約８時間攪拌した。０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によりろ過することによって、形成した残渣を除去した。ＰＥＡ−ＯＳｕ結合体の溶液を丸底フラスコ内に捕集し、アルゴン下で保持した。サンプルポリマー溶液を、１Ｈ−ＮＭＲによってＯＳｕ負荷について分析し、８０〜１００％の範囲であった。
【００６８】
［Ｆ．ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）結合体（式ＩＸ）の合成］
ＤＭＦ中のＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕの活性化エステル（５．７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に、２．０８ｇのＬ−アルギニンメチルエステル二塩酸塩（Ａｒｇ（ＯＭｅ）、７．９６ｍｍｏｌ）、２．７７ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、７．２ｍｍｏｌ）および５００ｍＬのＤＭＦを添加した。得られた不均一な混合物を室温で約２４時間攪拌した。ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ポリマー結合体を、１％ｖ／ｖの酢酸を含む５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマー結合体をエタノール中に再溶解させ（５．０ｇ、５０ｍＬ中）、２０ｍＬの水で希釈し、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移した。ポリマーを脱イオン水中で２日間透析し、次にろ過し、そして凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによって、生成物をゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたＡｒｇ（ＯＭｅ）は、１Ｈ−ＮＭＲによって決定されるように５０〜７０％の範囲であった。精製後の生成物の収率は８０〜９０％の範囲であった。重量平均分子量（Ｍｗ）は１５５〜１６０ｋＤａの範囲であった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００６９】
［Ｇ．ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン結合体（式Ｘ）の合成］
丸底フラスコ中のＰＥＡ−ＮＴＡ−ＯＳｕの活性化エステル（４．５５ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）に、以下の試薬を添加した：５％（重量／体積）のＤＭＦ中の１８．４３ｍＬのアグマチン（６８．８ｍｍｏｌ）、１．９７ｍＬの酢酸（３４．４ｍｍｏｌ）および２０．５ｍＬのＤＭＦ。アグマチン溶液のアミン形態を以下のように調製した：０．５ｇの硫酸アグマチン（２．１９ｍｍｏｌ）および０．２１ｇの水酸化ナトリウム（８．７６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬＤＭＦ溶液中に分散させ、一晩（約１２時間）攪拌した。Ａ０．４５ミクロン孔径フリット（ＰＴＦＥシリンジフィルタ）によって溶液をろ過した。
【００７０】
アグマチンのアミン形態の溶液を丸底フラスコ内の溶液に添加し、得られた懸濁液を室温で約２４時間攪拌した。得られたＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチンポリマー結合体を２．５Ｌの酢酸エチル中に沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、ペーパータオルで乾燥させた。捕集したポリマーをエタノール（３．０ｇ、１００ｍＬ）中に溶解し、３５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに移した。ポリマー結合体を３．５ＬのＤＩ水中で透析し、溶液をろ過して凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＤＳＣ、およびＤＬＳによって、生成物ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン結合体（式Ｘ）をゼータ電位および粒径について分析した。ポリマーに負荷されたアグマチンは、１Ｈ−ＮＭＲにより８０〜９０％であった。精製後の反応収率は、５０〜６０％の範囲であった。重量平均分子量（Ｍｗ）は１５０〜１８０ｋＤａの範囲であった（ＧＰＣ、ＰＳ）。
【００７１】
［実施例２］
［Ａ．材料］
臭化エチジウムはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）はＣｅｌｌｇｒｏ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）から購入し、ＨＥＰＥＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＤＮＡサイズマーカーＴＲＡＣＫ ＩＴＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を商業的供給源から購入した。他の化学薬品および試薬は、他で特定されなければ、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００７２】
［Ｂ．プラスミドＤＮＡの調製］
供給業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎエンドトキシンフリープラスミドｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。２６０ｎｍにおける分光光度分析および１％アガロースゲルにおける電気泳動法によって、精製プラスミドＤＮＡの量および質を評価した。精製プラスミドＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）中に再度懸濁させ、一定分量において凍結させた。
【００７３】
［Ｃ．細胞培養］
マウス肝細胞ＦＬ８３Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎児血清が補充されたＫａｉｇｈｎのＦ１２Ｋ完全培地において５％のＣＯ２中３７℃で推奨されるようにＦＬ８３Ｂ細胞を増殖させた。
【００７４】
［Ｄ．本発明のＰＥＡストック懸濁液の調製］
上記の実施例１で調製されたポリマーを２００プルーフのエタノール中に１００ｍｇ／ｍＬで溶解させた。１００μＬの１００ｍｇ／ｍＬの種々のポリマーを９００μＬの水に添加することによって１０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液を作った。ロータリーエバポレーターによって、ポリマー懸濁液中のエタノールを一部除去した。水の添加によって懸濁液をその元の体積に戻した。以下の実験のために１０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液を用いた。あるいは、水中で１ｍｇ／ｍＬまでさらなる希釈を行った。
【００７５】
［Ｅ．ポリマー細胞毒性の評価］
本発明のＰＥＡポリマーの生体適合性をマウス肝細胞ＦＬ８３Ｂ細胞において試験した。細胞毒性研究のために以下の本発明のＰＥＡポリマーを使用した：ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ、ＰＥＡ−Ａｒｇ（Ｏｍｅ）．ＡＡ、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＡＡ、ＰＥＡ−Ａｇｔ．ＡＡ、ＰＥＡ−ＮＴＡ−Ａｇｔ．ＡＡ（式ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、式中、Ｒ１＝（ＣＨ２）８、Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、ＡＡ−酢酸、ｐ＝０．７５、ｍ＝０．２５）およびポリアルギニン塩酸塩（分子量５，０００〜１５，０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００７６】
ポリマーをＦＬ８３Ｂ細胞に添加し、ＶｉａＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて、細胞毒性を２４時間および４８時間で測定した。１０％ウシ胎児血清が補充された細胞培地に１００ｍｇ／ｍＬのポリマーを添加して０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。培地を取り出し、細胞溶解試薬を添加した。１０分後に、１００μｌの細胞溶解物を白壁のルミノメータープレートに移した。１００μｌのＡＴＰ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓを各ウェルに添加した。プレートを２分間インキュベートし、次にルミノメーターにおいて読み取った。生存％データは、サンプルの相対発光を対照の相対発光で割って１００をかけることによって計算されるように、対照に対して規格化された生存パーセントで表される。
【００７７】
図１〜３に要約されるこの実験からのデータによって示されるように、ＰＥＡ−アグマチン．ＡＡのみが０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性を示した。その他の本発明のカチオン性ポリマーは全て、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において毒性でなかった。ＰＥＡ−ＮＴＡ−アグマチン．ＡＡは、１ｍｇ／ｍＬの濃度においても毒性でなかった。全体として、全てのＰＥＡ結合体は、同様の濃度における市販のポリアルギニンよりも毒性が低かった（１３ｕＭのポリアルギニンは０．２ｍｇ／ｍＬである）。
【００７８】
［Ｆ．電荷比の定義および測定］
記載されるポリマーのそれぞれについて、１ＨＮＭＲデータによって推定したポリマーあたりのグアニジウム負荷の％に基づいて正電荷の総数を計算した。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方について、負電荷の数は塩基対あたりの２つの負電荷を基準とし、質量あたりの電荷の総数として計算した。負のポリ核酸電荷に対する正のポリマー電荷の比率を電荷比であると決定し、表１および２におけるカテゴリーとして記入した。
【００７９】
ポリマー：ＤＮＡ複合体の形成は、動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ５．００を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において測定したゼータ電位によっても確認した。結果は、本明細書の表１および２において見ることができる。ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）懸濁液はＧＦＰプラスミドと複合体を形成した。サンプルは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中に１ｍＬまでとし、次に、１ｍＬの体積全体を、生成物プロトコールに従って使い捨てのキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＤＴＳ１０６０）に負荷した。
【００８０】
［Ｇ．ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性］
ポリマーのみについての前の実施例において記載されるように、ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性を測定した。簡潔に言うと、２４ウェルプレートの各ウェルに対して、１μｇのＧＦＰプラスミドＤＮＡの最終濃度のために、１：１、２：１、および４：１の電荷比で、無血清培地中の１ｍｇ／ｍＬの体積のＧＦＰプラスミドに１０ｍｇ／ｍＬの体積のポリマー懸濁液を添加することによって、ポリマー：ＤＮＡ複合体を作った。溶液を混ぜた後、直ちに懸濁液を数秒間ボルテックスし、次に周囲条件で４０分間、平衡化させた。５％ＣＯ２下、３７℃で１８〜２４時間、これらの複合体を細胞に添加した。ポリマー：ＤＮＡ複合体溶液を含む細胞培地を取り出し、新鮮な培地に取り換えた。ポリマー：ＤＮＡ複合体の細胞毒性は、Ｖｉａｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイ（Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）によって２４時間および４８時間で測定した。図４に要約されるデータにより示されるように、ポリマー：ＤＮＡ複合体の存在下でＦＬ８３Ｂ細胞は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に生存可能であり、概して、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔの場合よりも６０％高く生存可能であった。
【００８１】
［［Ｈ］緑色蛍光タンパク質プラスミド（ＧＦＰ）によるトランスフェクション］
ＤＮＡは、上記のように１：１、２：１、および４：１のポリマー対ＤＮＡの電荷比で、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌ（式ＶＩ）と複合体を形成した。トランスフェクション効率を顕微鏡でモニターできるように、緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡを用いた。ポリマー：ＤＮＡ複合体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液または無血清細胞培地中で作った。ポリマー：ＤＮＡ複合体は、アガロースゲル遅延度アッセイを行うことによって確認した。簡潔に言うと、ＴＡＥ（トリス酢酸ＥＤＴＡ）緩衝液中の臭化エチジウムにより染色した１％アガロースゲルにおける１００Ｖで１５〜２０分間の電気泳動法によって、上記のプロトコールを用いて形成されたポリマー：ＤＮＡ複合体を分析した。ＵＶ照明によってＤＮＡを視覚化した。遊離ＤＮＡはゲルを通って移動して臭化エチジウム染色により視覚化され得るが、ポリマー：ＤＮＡ縮合物はゲルを通って移動しないであろう。図５は、４つの電荷比のポリマー：ＤＮＡ縮合物を示す。０．５：１および１：１の電荷比では、未結合ＤＮＡがまだゲル上で視覚化され得る。完全な中和は、およそ２：１以上の電荷比で達成された。２：１および４：１の電荷比によって、未結合ＤＮＡは見ることができず、十分なポリマーがＤＮＡと複合体を形成して電荷を中和し、移動を妨げることが示唆される。
【００８２】
マウス肝細胞ＦＬ８３Ｂ細胞を３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。無血清培地中で作られた上記電荷比のポリマー：ＤＮＡ複合体をＦＬ８３Ｂ細胞に添加した。複合体を３７℃で１８〜２４時間、細胞上で放置した。次に、１０％ウシ胎児血清を補充した新鮮な培地を細胞に再供給し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。緑色蛍光タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）の発現に陽性の細胞を顕微鏡で観察し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）におけるフローサイトメトリーによって定量した。ＧＦＰ発現は図５に示される。意外にも、ＭＶＰＥＡ−Ａｒｇ（Ｏｍｅ）．ＨＣｌは、試験した全てのポリマーのうち最高のトランスフェクション効率を有した。しかしながら、このような効率は市販の試薬により達成される効率のわずか２０％であった。トランスフェクション時間を短縮し、培地に血清を含ませることにより、図６に示されるようにトランスフェクション効率が改善され、市販の試薬のＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と比較して８０％まで改善された。
【００８３】
［ヒト子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ）およびヒト冠動脈内皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）におけるＧＦＰによるトランスフェクション効率の比較］
ヒト冠動脈内皮細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＤＮＡは、上記のように６：１のポリマー対ＤＮＡの電荷比でＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌ（式ＶＩ）と複合体を形成させた。ポリマー：ＤＮＡ複合体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７中で作った。市販のトランスフェクション試薬Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、およびＬＴ−１（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と、トランスフェクション能力を比較した。
【００８４】
ＨｅＬａ、ヒト子宮頸癌細胞、ＨＣＡＥＣ、ヒト冠動脈内皮細胞およびＦＬ８３Ｂ、マウス肝細胞をそれぞれ、１０，０００、１０，０００および３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。１０％ウシ胎児血清を補充した培地において１μｇＤＮＡ／ウェルの濃度でポリマー：ＤＮＡ複合体を細胞に添加した。複合体を３７℃で７２時間、細胞上で放置した。緑色蛍光タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）の発現に陽性の細胞を顕微鏡で観察し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔＴＭにおけるフローサイトメトリーによって定量した。ＧＦＰの発現は図７に示される。市販の試薬と比較して、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌは、ＨｅＬａ細胞に対して有利なトランスフェクション効率を有し、トランスフェクション効率はＦＬ８３Ｂ細胞の場合に匹敵した。ＨＣＡＥＣは、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌ、ＪｅｔＰＥＩおよびＬＴ−１によってのみトランスフェクトされた。
【００８５】
［実施例３］
［ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび発現］
シェーグレン症候群Ｂ（ＳＳＢ）に対するｓｉＲＮＡのパネルは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ａｎｄ Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液（６ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、ｓｉＲＮＡを２０μＭに戻し、−２０℃で貯蔵した。パネルをＳＳＢ遺伝子発現の下方制御についてスクリーニングし、市販のトランスフェクション試薬Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と比較した。
【００８６】
ｓｉＲＮＡは、１：１、２：１、および４：１のポリマー対ｓｉＲＮＡの電荷比においてＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）と共に配合した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の形成はアガロースゲル遅延度アッセイを行うことによって確認し、以下のように４つの電荷比において、ポリマー：ｓｉＲＮＡ縮合物の形成が検出された：レーン１＝１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー、レーン２＝０．６μｇのｓｉＲＮＡのみ、レーン３＝６：０電荷比のＰＥＡのみ、レーン４＝１：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン５＝２：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン６＝４：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ、レーン７＝６：１電荷比のＰＥＡ：ｓｉＲＮＡ。種々の電荷比においてｓｉＲＮＡと複合体を形成したＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）ＨＣｌのゲル遅延度アッセイの結果の顕微鏡写真の観察によって、１：１電荷比においてアガロースゲル中に未結合ｓｉＲＮＡが観察されることが明らかになった。しかしながら、２：１、４：１、および６：１の電荷比では、ｓｉＲＮＡはポリマーと完全に複合体を形成し、移動は観察されなかった。中和したポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の形成は、本明細書の表２に示されるように、ゼータ電位アッセイおよびＤＬＳによっても確認した。
【００８７】
ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体を無血清培地中で作り、４０分間複合体を形成させた後、新鮮な培地を添加した。複合体をＦＬ８３Ｂ細胞に添加し、１００ｎＭの最終ＤＣ０３濃度で１８〜２４時間、３７℃でトランスフェクトさせた。２４時間後に、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離した。定量的ＰＣＲにより遺伝子発現を測定した。この実験の結果、（図８）は、ＰＥＡ−Ａｒｇ（ＯＭｅ）．ＨＣｌまたはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）と複合体を形成したｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、ＳＳＢ発現の約７０％の下方制御をもたらすことを示した。
【００８８】
［市販のトランスフェクション試薬に対するＰＥＡポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性］
ポリマー：ＤＮＡ複合体についての先行実施例において記載したように、ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性を測定した。簡潔に言うと、１０ｍｇ／ｍＬの体積のポリマー懸濁液を多量のｓｉＲＮＡに添加し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７中の１００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度を得ることによって、ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体を作った。これらの複合体を５％ＣＯ２下、３７℃で２４ウェルプレート内の細胞に添加した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性は、ＶｉａｌｉｇｈＴＭアッセイによって２４および４８時間で測定した。図９に要約されるデータにより示されるように、本発明のポリマー：ｓｉＲＮＡ複合体の存在下でのＦＬ８３Ｂ細胞の生存率は、市販の最良のトランスフェクション試薬の場合と同程度に有利であった。
【００８９】
全ての刊行物、特許、および特許文献は、個々に参照により援用されたかのように、参照によって本明細書に援用される。本発明は、種々の特定の好ましい実施形態および技術を参照して説明された。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内に留まりながら多くの変化および変更が成され得ることは理解されるべきである。
【００９０】
本発明は上記実施例を参照して説明されたが、変更および変化が本発明の趣旨および範囲内に包含されることは理解されるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化１】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化２】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化３】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化４】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化７】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化８】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性生分解性ポリマーとの溶解性複合体中に少なくとも１つのポリ核酸を含む遺伝子導入組成物。
【請求項２】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨ−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＡポリマーが、以下の一般構造式：
【化９】
で表される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＡポリマーが、以下の一般構造式：
【化１０】
で表される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒであり、ｒが約２〜約２５の範囲である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ７が−（ＣＨ２）４−を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、ヒスチジンメチルエステルの残基としての４−メチレンイミダゾリニウムイオン：
【化１１】
である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ポリマーに会合した少なくとも１つの酸性対イオンをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記会合した酸性対イオンが、約−７〜＋５のｐＫａを有する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリ核酸が、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリ核酸が、前記遺伝子を発現するのに適したプラスミドＤＮＡをさらに含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プラスミドＤＮＡが、哺乳類の標的細胞における前記遺伝子の発現に適している請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリ核酸に対する前記ポリマーの電荷比が、約２：１〜約４：１である請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリ核酸がＲＮＡを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＮＡが、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスポリ核酸を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリ核酸が、標的細胞内の標的遺伝子の抑制のためのｉＲＮＡを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを形成する請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＤＮＡが、治療用ポリペプチドをコードするｃＤＮＡである請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
約１：１〜約２０００．１であるポリマー：ポリ核酸の重量比が存在する請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の組成物を標的細胞に進入させて、前記組成物中のポリ核酸を標的細胞にトランスフェクトするために適切な条件下および時間で、前記組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることを含む、標的細胞のトランスフェクション方法。
【請求項２２】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨ−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ２が、
【化１２】
を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリ核酸が、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリ核酸が、前記遺伝子を発現するのに適したプラスミドＤＮＡをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスミドＤＮＡが、哺乳類の標的細胞における前記遺伝子の発現に適している請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
以下の：
一般構造式（Ｉ）で表される化学式を有するＰＥＡポリマー
【化１】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化２】
式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、そして式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化３】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、
【化４】
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（ＩＶ）で表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマー
【化５】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、α，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８）アルカン、および構造式（ＩＩ）のα，ω−アルキレンジカルボキシラート、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ５は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、および（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンから独立して選択され、式（ＩＩ）中のＲ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、および（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化６】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ６はそれぞれ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
または一般構造式（Ｖ）で表される化学式を有するＰＥＵポリマー
【化７】
［式中、ｎは約１５〜約１５０の範囲であり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり、ｐは約０．９〜０．１の範囲であり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１２）オキシアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択されるが、ただし、ポリ核酸の電荷を中和するために十分なＲ２は、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、−Ｒ８−Ｒ９−ＮＨ２＋、−Ｒ８−Ｒ９−（４−メチレンイミダゾリニウム）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリアルギニン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリリジン）、−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）−ＣＯ−）ｒ−ＯＨ、（ポリオルニチン）および
【化８】
（ポリヒスチジン）からなるカチオン性残基の群から選択され、ここでｒは約２〜約５０の範囲であり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ１０−であり、Ｒ１０は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、−ＣＨ（ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルオキシ）−、−ＣＨ（ＣＯ（ＰＧ））−からなる群から選択され、Ｒ９は、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ１２）アルケニレンであり、そしてＰＧは保護基であり、
Ｒ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片からなる群から独立して選択され、そして
Ｒ７は独立して（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルである］
のうちの少なくとも１つを含むカチオン性生分解性ポリマーとの溶解性複合体中に少なくとも１つのポリ核酸を含む遺伝子導入組成物。
【請求項２】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨ−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＡポリマーが、以下の一般構造式：
【化９】
で表される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＡポリマーが、以下の一般構造式：
【化１０】
で表される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが−（ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２）ＣＯ−）ｒであり、ｒが約２〜約２５の範囲である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ７が−（ＣＨ２）４−を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、ヒスチジンメチルエステルの残基としての４−メチレンイミダゾリニウムイオン：
【化１１】
である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ポリマーに会合した少なくとも１つの酸性対イオンをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記会合した酸性対イオンが、約−７〜＋５のｐＫａを有する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリ核酸が、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリ核酸が、前記遺伝子を発現するのに適したプラスミドＤＮＡをさらに含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プラスミドＤＮＡが、哺乳類の標的細胞における前記遺伝子の発現に適している請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリ核酸に対する前記ポリマーの電荷比が、約２：１〜約４：１である請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリ核酸がＲＮＡを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＮＡが、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスポリ核酸を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリ核酸が、標的細胞内の標的遺伝子の抑制のためのｉＲＮＡを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを形成する請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＤＮＡが、治療用ポリペプチドをコードするｃＤＮＡである請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
約１：１〜約２０００．１であるポリマー：ポリ核酸の重量比が存在する請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の組成物を標的細胞に進入させて、前記組成物中のポリ核酸を標的細胞にトランスフェクトするために適切な条件下および時間で、前記組成物と共に標的細胞を溶液中でインキュベートすることを含む、標的細胞のトランスフェクション方法。
【請求項２２】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カチオン性残基の少なくとも１つが、−ＮＨ−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ２が、
【化１２】
を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリ核酸が、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリ核酸が、前記遺伝子を発現するのに適したプラスミドＤＮＡをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスミドＤＮＡが、哺乳類の標的細胞における前記遺伝子の発現に適している請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ）】
【図１０Ｂ）】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ）】
【図１０Ｂ）】
【公表番号】特表２０１０−５３６８８４（Ｐ２０１０−５３６８８４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２２０７６（Ｐ２０１０−５２２０７６）
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４０６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６５４３
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０５３２３３１２）メディバス エルエルシー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４０６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６５４３
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０５３２３３１２）メディバス エルエルシー (12)
【Ｆターム（参考）】
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