ヒドロキシル化カロテノイドの生成に有用な、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３から単離された新しいＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素が提供される。さらにノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からの以前同定された仮説的タンパク質が、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素活性を有することが分かった。どちらのヒドロキシラーゼ酵素遺伝子も以前報告された他のＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素と比べて、低い相同性を示す。異種の宿主細胞中でのヒドロキシラーゼ酵素の発現は、ヒドロキシル化カロテノイドの生成を可能にした。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は、２００４年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／６０１９４７号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、環状ヒドロキシル化カロテノイド化合物の微生物による生産に有用な酵素をコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイドは、自然界全体に遍在性で、全ての光合成生物体によって、そして一部の従属栄養性生育細菌および真菌において合成される顔料である。カロテノイドは、花、野菜、昆虫、魚、および鳥に色を提供する。カロテノイドの色は黄色から赤に及び、褐色および紫のバリエーションがある。ビタミンＡの前駆物質として、カロテノイドは、本発明者らの食餌の基礎的構成要素であり、それらはヒトの健康において追加的な重要な役割を果たす。動物は、カロテノイドを新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できないので、それらを食餌の手段によって得なくてはならない。したがって植物または細菌におけるカロテノイド生成および組成の操作は、新しいまたは改善されたカロテノイド源を提供できる。カロテノイドの工業的使用の例としては、医薬品、食品サプリメント、動物飼料添加剤、および化粧品の着色剤などが挙げられる。
【０００４】
自然界で同定された６００を越える異なるカロテノイドの存在にもかかわらず、工業的には、食物色素、動物飼料、医薬品、および化粧品のためにわずかなカロテノイドが使用されるのみである。これは生産の困難さが主因である。現在、工業目的で使用されるほとんどのカロテノイドは化学合成によって生産されるが、これらの化合物は化学的に製造することが非常に困難である（非特許文献１）。天然カロテノイドは、植物材料の抽出または微生物合成のいずれかによって得ることができる。しかし商業的なカロテノイド生産にはわずかな植物種のみが広く使用され、これらの植物におけるカロテノイド合成の生産性は比較的低い。その結果、これらの植物から生成されるカロテノイドは非常に高価である。
【０００５】
カロテノイド生合成の生産能力を増大させる一方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである（非特許文献２でレビューされている）。したがって非カロテン産生性細菌および酵母菌中でカロテノイドを生成することにより、最も適切で効率的な産生生物体の質、量、および選択のコントロールを可能にすることが望ましい。後者は、消費者にとって商業的生産経済（ひいては入手可能性）のために、特に重要である。
【０００６】
ＣｒｔＺ−タイプのカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素は、β−カロテンまたはカンタキサンチンなどの環状カロテノイドのβ−イオノン環に水酸基を導入して、ヒドロキシル化カロテノイドを生成する酵素のクラスである。このようなカロテノイドの例としては、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、アドニキサンチン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、およびルテインが挙げられる。
【０００７】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、多様な細菌、真菌、藻類、および植物種から報告されている。いくつかの種の例としては、パントエア・スティワート（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔ）（特許文献１、特許文献２）、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）（特許文献３、非特許文献３）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、および特許文献４）、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（非特許文献７、特許文献５）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種（特許文献５）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、および非特許文献８）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）種（ＣＮ １３８０４１５）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（特許文献１０、非特許文献９）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（非特許文献１０、特許文献１１）などの植物種が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらのβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の多くは、微生物の宿主細胞中で組換え的に発現されている。しかしアスタキサンチンおよびゼアキサンチンなどのヒドロキシル化カロテノイド生成のための商業的に適切な微生物を遺伝改変するのに有用な、さらに別の新しいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子を同定する必要性がある。
【０００８】
さらに、高度に相同的な遺伝子は組み入れるのが困難であり、遺伝的不安定性（すなわち望ましくない相同的な遺伝子組換え）をもたらす傾向があるので、複数のヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の安定発現のために、比較的低から中程度の核酸配列同一性（すなわち＜７０％のヌクレオチド配列同一性）を有するＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素を同定する特に重要な必要性がある。多岐にわたるヌクレオチド配列（相互に）を有するＣｒｔＺ遺伝子は、単一組換え宿主細胞内で、複数のヒドロキシラーゼ酵素を発現するのに最も適している。これはヒドロキシラーゼ酵素活性がカロテノイド生合成経路中の律速段階になる場合に、特に重要である。利用できる基質のプールに制限がないと仮定すれば、産生宿主中で同時に発現できるｃｒｔＺ遺伝子数を増やすことは、カロテノイド生成を増大させると予測される。これは所望の生成物（すなわちカロテノイド）の組換え生成を最適化する際に、特に重要である。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０３／０１６５０３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０７９３９５号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第３９３６９０ Ｂ１号明細書
【特許文献４】米国特許第５６８４２３８号明細書
【特許文献５】米国特許第５８１１２７３号明細書
【特許文献６】米国特許第６６７７１３４号明細書
【特許文献７】米国特許第６２９１２０４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００２１４７３７１号明細書
【特許文献９】国際公開第２００４０２９２７５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第００／０６１７６４号パンフレット
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００２１０２６３１号明細書
【非特許文献１】ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびレーンヒール（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１〜１９１頁（１９９１年）
【非特許文献２】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５９：１６９〜１８１頁（１９９８年）
【非特許文献３】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２（１２）：６７０４〜６７１２頁（１９９０年）
【非特許文献４】ハンドル（Ｈｕｎｄｌｅ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、２４５（４）：４０６〜４１６頁（１９９４年）
【非特許文献５】ハンドル（Ｈｕｎｄｌｅ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３１５（３）：３２９〜３３４頁（１９９３年）
【非特許文献６】シュヌアー（Ｓｃｈｎｕｒｒ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、７８（２〜３）：１５７〜１６１頁（１９９１年）
【非特許文献７】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）ら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７（２２）：６５７５〜６５８４頁（１９９５年）
【非特許文献８】パサモンテス（Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１８５（１）：３５〜４１頁（１９９７年）
【非特許文献９】リンデン（Ｌｉｎｄｅｎ），Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４４６（３）：２０３〜２１２頁（１９９９年）
【非特許文献１０】ティアン（Ｔｉａｎ），Ｌ．およびデラ・ペンナ（Ｄｅｌｌａ Ｐｅｎｎａ），Ｄ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７（３）：３７９〜３８８頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって解決すべき問題は、カロテノイド（すなわちゼアキサンチンおよびアスタキサンチン）の遺伝子工学生産に有用な新しいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３から単離された、組換え宿主細胞中でのカロテノイド生成に有用な新しいｃｒｔＺ遺伝子を提供することで、既述の問題を解決した。さらに未知の機能がある仮説的タンパク質をコードするとして以前同定されたノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からの遺伝子は、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードすることが発見された。本ＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素を使用して、ヒドロキシル化カロテノイドを生成する方法もまた提供される。
【００１２】
したがって本発明は、
（ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）配列番号１７によって表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
さらに本発明によって、本核酸分子によってコードされるポリペプチド、ならびに遺伝的キメラとそれを含んでなる形質転換された宿主が提供される。
【００１４】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１６で表される配列の一部に相当する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
増幅されたインサートがカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする、
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法を提供する。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）少なくとも１つのβ−イオノン環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を本発明のカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を適切な条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイドを生成せしめること
を含んでなる、ヒドロキシル化カロテノイド化合物の製造方法を提供する。
【００１６】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）カロテノイド生合成経路を含んでなり、少なくとも１つのβ−イオノン環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を本発明のカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイド生合成を制御すること
を含んでなる、生物体中での環状ヒドロキシル化カロテノイド生合成の制御方法を提供する。
【００１７】
配列説明、および生物学的寄託
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＣおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１８】
配列番号１は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングのために使用されるプライマー（「ＨＫ１２」）のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号２は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングのために使用されるプライマー（「ＪＣＲ１４」）のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号３は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングのために使用されるプライマー（「ＪＣＲ１５」）のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号４は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号５は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号６は、腸内細菌科ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＸＹＩＢＺカロテノイド合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）。
【００２４】
配列番号７は、プライマーｐＷＥＢ２６０Ｆのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号８は、プライマーｐＷＥＢ２６０Ｒのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号９は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１０は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｒのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１１は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢカロテノイド合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書）。
【００２９】
配列番号１２は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ ｃｒｔＷケトラーゼのヌクレオチド配列である（米国特許仮出願第６０／５３１３１０号明細書）。
【００３０】
配列番号１３は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ｃｒｔＷケトラーゼのヌクレオチド配列である（米国特許仮出願第６０／５３１３１０号明細書）。
【００３１】
配列番号１４は、プライマーｐＥＺ２６３−Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１５は、プライマーｐＥＺ２６３−Ｒのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１６は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ｃｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１７は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ ＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素の推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１８は、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１９は、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＺＰ＿０００９４８３６．１）ＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２０は、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＺＰ＿０００９４８３６．１）ＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２１は、プライマーｃｒｔＺ−ＤＣ２６３＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号２２は、プライマーｃｒｔＺ−ＤＣ２６３＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２３は、プライマー４１ＺＳＰＨ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２４は、プライマーＳＰＨ＿ＺＲのヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２５は、プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号２６は、プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号２７は、プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号２８は、プライマーｃｒｔ−２６０ＲＩ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号２９は、プライマーｃｒｔ−２６０ＲＩ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号３０は、プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３１は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号３２は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３３は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｆ２のヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号３４は、プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｒ２のヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３５は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのｐｈｐｓ１プロモーターを増幅するのに使用される、第１のプライマーのヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号３６は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのｐｈｐｓ１プロモーターを増幅するのに使用される、第２のプライマーのヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号３７はプライマーｃｒｔＷ＿ｓｐｈｉｎｇｏ＿Ｆのヌクレオチド配列である。
【００５５】
配列番号３８はプライマーｃｒｔＷ＿ｓｐｈｉｎｇｏ＿Ｒのヌクレオチド配列である。
【００５６】
以下の生物学的寄託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って行った。
【００５７】
【表１】

【００５８】
ここでの用法では、「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０−２２０９マナッサスのユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１のＡＴＣＣに所在する米国微生物系統保存機関国際寄託局を指す。「国際寄託名」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の登録番号である。
【００５９】
列挙した寄託株は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本ｃｒｔＺ遺伝子およびそれらの発現生成物、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素は、ヒドロキシル化カロテノイド化合物を生成する能力を有する組換え生物体の創造のために有用である。ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３と命名された細菌株から、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする新しい核酸分子が単離された。さらにノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＺＰ＿０００９４８３６．１）からの仮説的タンパク質が、本法を使用してヒドロキシル化カロテノイド生成するのに有用なカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素として同定された。
【００６１】
本ｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、適切な基質（例えばβ−カロテンまたはカンタキサンチン）を生成するように操作されたトランスジェニック微生物の宿主中で発現された。異種の宿主中でのヒドロキシル化カロテノイド（例えばゼアキサンチンまたはアスタキサンチン）生成によって、遺伝子の機能的発現が測定された。
【００６２】
本発明のカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、環状ヒドロキシル化カロテノイド化合物の生成または制御のために、多様なやり方で使用してもよい。本ｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、適切な基質を生成する能力を有する異種の宿主中でのカロテノイド生成のために使用できる。さらに本ｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、最適化されたヒドロキシル化カロテノイド生成のために、異種の宿主中の１個もしくはそれ以上の多岐にわたるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子と同時に共発現してもよい。本ｃｒｔＺ遺伝子の同時の発現は、他の知られているＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素に対するそれらの比較的低から中程度のヌクレオチド配列同一性のために、可能なはずである。比較的低／中程度のヌクレオチド配列同一性は、最適なカロテノイド生成のために、微生物産生宿主中における複数のＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素の安定発現の可能性を増大させる。
【００６３】
ここで述べる遺伝子および遺伝子配列は、ヒドロキシル化カロテノイドの生成を工業的に適切な微生物宿主細胞に直接組み込むことを可能にする。この側面によって、その中にこれらの遺伝子が組み込まれたあらゆる微生物の株は、より望ましい生成宿主になる。生成したカロテノイドは、動物飼料をはじめとする多様な用途で使用するために、生成宿主から単離できる。望ましい着色と健康上の利点を追加することが知られているカロテノイドの存在のために、任意に組換え微生物宿主細胞を動物飼料に直接に組み込むことができる（カロテノイド単離ステップなし）。魚（例えばサケおよびマス）およびエビの水産養殖は、カロテノイド着色がこれらの生物体の価値にとって決定的に重要であるので、本発明の特に有用な用途である（Ｆ．シャヒディ（Ｓｈａｈｉｄｉ）およびＪ．Ａ．ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８（１）：１〜６７頁（１９９８年））。具体的には、カロテノイドのアスタキサンチンは現在、水産養殖業で使用されている。
【００６４】
本開示中では、いくつかの用語および略語が使用される。次の定義が提供される。
【００６５】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００６６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００６７】
ここでの用法では、「単離された核酸分子」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸分子は、１個またはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。
【００６８】
ここでの用法では、「ｐＢＨＲ−ｃｒｔ１」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドはパントエア・スティワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ８１９９）からのｃｒｔＥＸＹＩＢカロテノイド遺伝子クラスターをｐＢＨＲ１中にクローンして構築された（ドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉｏＴｅｃｈ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および参照によってここに編入する米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書に相当する国際公開第０２／１８６１７号パンフレットを参照されたい）。得られるプラスミドは、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下で発現されるＰ．スティワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）遺伝子クラスターを含有した。
【００６９】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３００」という用語は、β−カロテン産生プラスミドを指す。プラスミドは、パントエア・ステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ番号８１９９）からのカロテノイド遺伝子クラスターｃｒｔＥＹＩＢをカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＴｒｃＨｉｓ２−Ｔｏｐｏベクター中にクローニングして構築された。
【００７０】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３０１」という用語は、ｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子クラスターを含有するｐＤＣＱ３００の４．５ｋＢ ＥｃｏＲＩ断片をモビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）からのベクターｐＢＨＲ１のユニークなＥｃｏＲＩ部位にクローニングして構築されたβ−カロテン産生プラスミドを指す。ｐＤＣＱ３０１では、ｃｒｔＥとｃｒｔＹの遺伝子間領域にユニークなＭｆｅＩ部位が遺伝子操作された。
【００７１】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３２９」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスターを広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）中にクローンして構築された。
【００７２】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３３０」という用語は、β−カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢカロテノイド遺伝子クラスターを広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１中にクローンして構築された（米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書および米国特許仮出願第６０／５２７０８３号明細書）。
【００７３】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３４０」という用語は、腸内細菌科ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子クラスターを発現するプラスミドを指す。天然遺伝子クラスター中のｃｒｔＸ遺伝子は削除された。遺伝子クラスターをベクターｐＢＨＲ１中にクローンした。
【００７４】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３４２」という用語は、ｃｒｔＷＥＹＩＢ遺伝子クラスターを発現するプラスミドを指す。ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）からのｃｒｔＷコード配列を腸内細菌科ＤＣ２６０からのｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子クラスター上流でｐＢＨＲ１にクローンした。
【００７５】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３４２ＴＡ」という用語は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされた、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子を発現するプラスミドを指す。
【００７６】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３４４」という用語は、ｃｒｔＺＷＥＹＩＢ遺伝子クラスターを発現するプラスミドを指す。ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺコード配列をｐＤＣＱ３４２のｃｒｔＷＥＹＩＢ遺伝子クラスター上流にクローンして、アスタキサンチン産生プラスミドを得た。
【００７７】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３５２」という用語は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされた、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するプラスミドを指す。
【００７８】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３６３」という用語は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａから増幅され、ｐＢＨＲ１中にクローンされた、ｐｈｐｓ１プロモーターを含んでなるプラスミドを指す。
【００７９】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３６４」という用語は、プラスミドｐＤＣＱ３６３中にクローンされた、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からのｃｒｔＺ遺伝子のコード配列を含んでなるプラスミドを指す。
【００８０】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３６５」という用語は、プラスミドｐＤＣＱ３６４中にクローンされた、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子のコード配列を含んでなるプラスミドを指す。スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子のコード配列、およびノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子のコード配列を１つの転写単位として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａからのｐｈｐｓ１プロモーターのコントロール下に共発現させた。
【００８１】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３６６」という用語は、ｐＤＣＱ３６５からのｃｒｔＷＺ転写単位を含んでなるプラスミドを指し、β−カロテン合成プラスミドｐＤＣＱ３３０中にクローンされて、アスタキサンチンを生成できるプラスミドが得られる。
【００８２】
ここでの用法では、「ｐＤＣＱ３７０ＴＡ」という用語は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされた、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するプラスミドを指す。それはｐＤＣＱ３５２と同じく、ｃｒｔＺ遺伝子の側面にある異なる制限部位を組み込む。
【００８３】
ここでの用法では、「ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ２−ｃｒｔＺ（スフィンゴ（Ｓｐｈｉｎｇｏ））」という用語は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター中にクローンされた、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子コード配列を発現するプラスミドを指す。
【００８４】
ここでの用法では、化合物について言及される「イソプレノイド」または「テルペノイド」という用語は、カロテノイドおよびキサントフィルなどの炭素１０個のテルペノイドおよびそれらの誘導体をはじめとする、イソプレノイド経路から誘導されるあらゆる分子である。
【００８５】
ここでの用法では、「カロテノイド」という用語は、炭素５個のイソプレン単位から縮合したポリエン主鎖から構成される化合物を指す。「カロテノイド」は、非環状であることができ、または１個（単環状）または２個（二環状）の環状末端基で終結することができる。「カロテノイド」という用語は、カロテンおよびキサントフィルの双方を含んでもよい。「カロテン」とは、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド官能基の形態で、あるいはグリコシド、グリコシドエステル、またはスルフェート内に１つ以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、まとめて「キサントフィル」として知られている。本発明で特に適切なカロテノイドは単環状および二環状カロテノイドである。
【００８６】
ここでの用法では、「カロテノイド生合成経路」という用語は、上流イソプレノイド経路、および／または下流カロテノイド生合成経路の構成要素を構成する遺伝子を指す。
【００８７】
ここでの用法では、「上流イソプレノイド経路」、「イソプレノイド経路」、および「上流経路」という用語は区別なく使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への転換に関与する酵素を指す。これらの酵素をコードする遺伝子としては、「ｄｘｓ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする）、「ｄｘｒ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする）、「ｉｓｐＤ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジル転移酵素をコードする、ｙｇｂＰとしても知られている）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼをコードする、ｙｃｈＢとしても知られている）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードする、ｙｇｂＢとしても知られている）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰシンターゼをコードする）、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与する「ｌｙｔＢ」遺伝子、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の合成に関与する「ｇｃｐＥ」遺伝子、「ｉｄｉ」遺伝子（ＩＰＰからジメチルアリルピロリン酸への分子内転換に関与する）、およびイソプレノイド経路中の「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニル転移酵素またはファルネシル二リン酸シンターゼをコードする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
ここでの用法では、用語「下流カロテノイド生合成経路」および「下流経路」は区別なく使用され、ＦＰＰを一連のカロテノイドに転換する酵素を指す。これらとしては（合成がＣ_３０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）ジアポフィトエン、または（合成がＣ_４０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）フィトエンのいずれかの合成に関与する、遺伝子および遺伝子産物が挙げられる。様々なＣ_３０〜Ｃ_４０カロテノイド生成をもたらす全ての引き続く反応は、下流カロテノイド生合成経路に含まれる。これらの遺伝子および遺伝子産物には、ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＡ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＦ、およびｃｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない「ｃｒｔ」遺伝子の全てが含まれる。最後に「下流カロテノイド生合成酵素」という用語は、ＣｒｔＭ、ＣｒｔＮ、ＣｒｔＮ２、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、およびＣｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない、下流経路中の酵素の全部または一部を指す包括的用語である。
【００８９】
「Ｃ_３０ジアポカロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合する６個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_３０カロテノイドは、（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせによって、接合二重結合の長い中央鎖を有する非環状Ｃ_３０Ｈ_４２構造から形式的に誘導されてもよい。
【００９０】
「テトラテルペン」または「Ｃ_４０カロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合した８個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_４０カロテノイドは、非環状Ｃ_４０Ｈ_５６構造から形式的に誘導されてもよい。Ｃ_４０カロテノイドの制限を意図しない例としては、フィトエン、リコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびカンタキサンチンが挙げられる。
【００９１】
ここでの用法では、「ＣｒｔＥ」という用語は、ｃｒｔＥ遺伝子によってコードされ、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸をピロリン酸とゲラニルゲラニル二リン酸に転換する、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを指す。
【００９２】
ここでの用法では、「Ｉｄｉ」という用語は、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．３．２）を指す。
【００９３】
ここでの用法では、「ＣｒｔＹ」という用語は、ｃｒｔＹ遺伝子によってコードされ、リコペンをβ−カロテンに転換するリコペン環化酵素を指す。
【００９４】
ここでの用法では、「ＣｒｔＩ」という用語は、ｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエン不飽和化酵素を指す。ＣｒｔＩは４個の二重結合の導入により、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンの中間物を通じて、フィトエンをリコペンに転換する。
【００９５】
ここでの用法では、「ＣｒｔＢ」という用語は、プレフィトエン二リン酸からフィトエンへの反応を触媒するｃｒｔＢ遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼを指す。
【００９６】
ここでの用法では、「ＣｒｔＺ」という用語は、ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされ、水酸化反応を触媒する、３、３’β−イオノンヒドロキシラーゼ酵素とも称されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素（例えばβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素）を指す。酸化反応は、３および／または３’位置にβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドに水酸基を付加する。この反応は、β−カロテンまたはカンタキサンチンなどの環状カロテノイドをヒドロキシル化カロテノイド、ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンにそれぞれ転換する。プロセスの中間体は、典型的にβ−クリプトキサンチンおよびアドニルビンを含む。ＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素は典型的に基質可撓性を示し、入手できる基質次第で多様なヒドロキシル化カロテノイドの生成を可能にすることが知られている。
【００９７】
ここでの用法では、「ＣｒｔＷ」という用語は、環状カロテノイドのβ−イオノンタイプ環上にケト基が導入される酸化反応を触媒するｃｒｔＷ遺伝子によってコードされる、β−カロテンケトラーゼ酵素を指す。「カロテノイドケトラーゼ」または「ケトラーゼ」という用語は、環状カロテノイドのイオノンタイプ環の４および／または４’位置にケト基を付加できる酵素群を指す。
【００９８】
ここでの用法では、「ＣｒｔＸ」という用語は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに転換し、ｃｒｔＸ遺伝子によってコードされるゼアキサンチングルコシル転移酵素酵素を指す。
【００９９】
ここでの用法では、「ヒドロキシル基」と言う用語は、1つの酸素および1つの水素原子よりなる１価のラジカルまたは基を指す（「−ＯＨ」）。
【０１００】
ここでの用法では、「ケト基」または「ケトン基」という用語は区別なく使用されて、その中でカルボニル基が２つの炭素原子に結合する群を指す：Ｒ_２Ｃ＝Ｏ（どちらがのＲがＨであってもよい）。
【０１０１】
ここでの用法では、「ケトカロテノイド」という用語は、環状カロテノイドのイオノン環上に少なくとも１つのケト基を有するカロテノイドを指す。ケトカロテノイドの例としては、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンが挙げられる。
【０１０２】
ここでの用法では、「環状カロテノイド」という用語は、本ＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素によってヒドロキシル化できる少なくとも１つのβ−イオノン環またはβ−イオノン環誘導体を有するカロテノイドを指す。
【０１０３】
ここでの用法では、「カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素」、「β−カロテンヒドロキシラーゼ酵素」、「ヒドロキシラーゼ酵素」、および「ＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素」という用語は同義的に使用され、環状カロテノイドのβ−イオノン環への水酸基の添加を触媒するｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素を指す。
【０１０４】
ここでの用法では、「ヒドロキシル化カロテノイド」という用語は、環状カロテノイドのイオノン環上に少なくとも１つの水酸基を有するカロテノイドを指す。ヒドロキシル化カロテノイドの例としては、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンが挙げられる。
【０１０５】
ここでの用法では、「実質的に類似した」とは、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の官能特性に影響しない核酸分子を指す。「実質的に類似した」とは、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術によって、遺伝子発現の変更を媒介する核酸分子の能力に影響しない核酸分子も指す。「実質的に類似した」とは、得られる転写物の官能特性に実質的に影響しない、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの本発明の核酸分子の修飾も指す。したがって本発明は、特定の例示的な配列以上のものを包含するものと理解される。
【０１０６】
例えば特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生産をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響しない遺伝子の変化が一般的であることは、技術分野でよく知られている。本発明の目的では、置換は以下の５つの群中の１つの交換として定義される。
１．小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１０７】
したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンは、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）または疎水性がより高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されてもよい。同様に、１つの負に帯電した残基を別のものにする（グルタミン酸からアスパラギン酸など）、または１つの正に帯電した残基を別のものにする（アルギニンからリジンになど）置換をもたらす変化も機能的に等しい生成物を生じることが期待できる。
【０１０８】
多くの場合、タンパク分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もタンパク活性を変更させるとは考えられない。
【０１０９】
それぞれの提案される変更は、十分に技術分野のルーチン技術の範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性保持の判定も同様である。さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した配列が、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、ここで例証する配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。本発明の好ましい実質的に類似した核酸分子は、そのＤＮＡ配列が、ここで報告する核酸分子のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一の核酸断片である。より好ましい核酸分子は、ここで報告する核酸分子のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、ここで報告する核酸分子のＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一の核酸分子である。
【０１１０】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件についてはよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的配列などの中程度に類似の分子をスクリーニングするため、そして機能性酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの高度に類似した分子をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい１組の条件は、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好ましい１組の条件はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。さらに別の好ましい１組の条件では、高度にストリンジェントな条件は、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、技術分野でよく知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個のヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ら、前述１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【０１１１】
ここでの用法では、「かなりの部分」と言う熟語は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる、アミノ酸またはヌクレオチド配列について述べるために使用される。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して約１０個以上の隣接するアミノ酸、または約３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、約２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸分子を得るために、塩基約１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸分子を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、１つまたはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に知られている目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【０１１２】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的である単離された核酸分子も含む。
【０１１３】
技術分野で既知の「パーセント同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８年）、「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３年）、「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第一部」、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４年）、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（フォン・ハインェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）、「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１年）で述べられたものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定するために使用される好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合および同一性百分率の計算は、ウィスコンシンマディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算パッケージのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム、またはメリーランド州ベセズダのインフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））からのベクターＮＴＩｖ．７．０のアラインＸ（ＡｌｉｇｎＸ）プログラムを使用して実施してもよい。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）整合法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁（１９８９年））を使用して、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の整合を実施できる。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、典型的にＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。
【０１１４】
適切な核酸分子（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。より好ましい核酸分子は、ここで報告されるアミノ酸配列と約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。さらにより好ましい核酸分子は、ここで報告されるアミノ酸配列と約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。本発明の適切な核酸分子は上の相同体を有するだけでなく、典型的に約１６１個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１１５】
ここでの用法では、「多岐にわたる遺伝子」、「多岐にわたるヒドロキシラーゼ酵素」、および「多岐にわたる配列」という用語は互換性に使用され、ＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素間の核酸分子配列同一性欠如を指す。２つ以上のｃｒｔＺ遺伝子間のヌクレオチド配列の比較は、配列同一性の相対程度に関する関連性の分類を可能にする。高度に相同的な（すなわち高いヌクレオチド配列同一性を有する）遺伝子の同時発現は、遺伝的不安定性をもたらす傾向がある。中程度または高度に多岐にわたる遺伝子の発現は、安定した共発現をもたらす可能性が高い。共発現に有用な好ましいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、配列比較によって比較すると約７５％未満の同一性があるものである。共発現のためにより好ましいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、配列比較によって比較すると約６５％未満の同一性があるものである。共発現のためにさらにより好ましいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、配列比較によって比較すると約６０％未満の同一性があるものである。共発現のために最も好ましいｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、配列比較によって比較すると約５５％未満の同一性があるものである。
【０１１６】
ここでの用法では、「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード中の性質を指す。したがって本発明は、配列番号１７および２０で示される本微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸分子に関する。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【０１１７】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成してもよい。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが生体外で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好まれるコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１１８】
「遺伝子」とは、特異的タンパクを発現する核酸分子を指す。ここでの用法では、それはコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含んでも含まなくてもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【０１１９】
「遺伝子コンストラクト」という用語は、生物体の遺伝子型を調節するために有用な一連の近接する核酸を指す。遺伝子コンストラクトの非限定的な例としては、核酸分子、および読み取り枠、遺伝子、プラスミドなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２０】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。ここでの用法では、「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【０１２１】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはそっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構築プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【０１２２】
「３’非翻訳配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（常態では真核細胞に限られる）およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加（常態では真核細胞に限られる）に影響することで特徴づけられる。
【０１２３】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５０，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあってもよい。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮＡを指す。
【０１２４】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸分子上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結できる。
【０１２５】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸分子から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【０１２６】
「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体ゲノム中への核酸分子の転移を指す。本発明では宿主細胞のゲノムは、染色体および染色体外（例えばプラスミド）遺伝子を含む。形質転換核酸分子を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【０１２７】
「接合」とは、１つの細菌細胞（すなわち「供与体」）から別の（すなわち「受容体」）細菌細胞への一方向性のＤＮＡ転位（例えば細菌プラスミドからの）が起きる、特定のタイプの形質転換を意味する。プロセスは直接的な細胞と細胞の接触を伴う。
【０１２８】
「炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物体によって代謝されることができる炭素源、特に単糖類、二糖類、多糖類、および一炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。用語「Ｃ_１炭素基質」は、炭素−炭素結合を欠くあらゆる炭素含有分子を指す。制限を意図しない例は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルマート、メチル化アミン（例えばモノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、および二酸化炭素である。特に好ましいのは、メタンおよび／またはメタノールを代謝できる生物体である。
【０１２９】
「Ｃ_１代謝個体」という用語は、その唯一のエネルギーおよび生物体量源として、単一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ_１代謝個体は、典型的にメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。「Ｃ_１代謝細菌」という用語は、それらの唯一のエネルギーおよび生物体量源として単一炭素基質を使用する能力を有する細菌を指す。Ｃ_１代謝個体のサブセットであるＣ_１代謝細菌は、典型的にメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。
【０１３０】
「メチロトローフ」という用語は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できる生物体を意味する。メチロトローフがＣＨ_４を酸化できる場合、メチロトローフはメタノトローフでもある。一態様では、微生物の宿主細胞は主要炭素源として、メタンおよび／またはメタノールで生育させたメチロトローフである。
【０１３１】
「メタノトローフ」または「メタノトローフ細菌」という用語は、その主要な炭素およびエネルギー源として、メタンを利用できる原核生物を意味する。メタンから二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解経路によって起きる。本発明で有用な典型的なメタノトローフの例としては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびメチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられる（が、これに限定されるものではない）。一態様では、メタノトローフは、メタンおよび／またはメタノールで生育させた高成長メタノトローフ細菌株である。別の態様では、メタノトローフはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０２）およびその誘導体である。
【０１３２】
「高生育メタノトローフ細菌株」という用語は、メタンまたはメタノールを唯一の炭素およびエネルギー源として生育でき、機能的エムデンマイヤーホフ炭素流束経路を有して、高い生育速度と、代謝されるＣ_１基質のグラム当たりの高細胞量生成量とが得られる細菌を指す（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）。ここで述べられる特定の「高生育メタノトローフ細菌株」は、「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」、「１６ａ」または「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ」と称され、それらの用語は区別なく使用されて、本発明で使用されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株（メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０２）を指す。
【０１３３】
ここでの用法では、「ＣｒｔＮ１」という用語は、ｃｒｔＮ１遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ２およびａｌｄを含んでなるオペロン内に位置する。
【０１３４】
ここでの用法では、「ＡＬＤ」という用語は、ａｌｄ遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ１およびｃｒｔＮ２を含んでなるオペロン内に位置する。
【０１３５】
ここでの用法では、「ＣｒｔＮ２」という用語は、ｃｒｔＮ２遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、ｃｒｔＮ１およびａｌｄを含んでなるオペロン内に位置する。
【０１３６】
ここでの用法では、「ＣｒｔＮ３」という用語は、ｃｒｔＮ３遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの天然カロテノイド生合成に影響する酵素を指す。この遺伝子はｃｒｔ遺伝子クラスター内に位置せず、代わりにこの遺伝子はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムの異なる位置に存在する。
【０１３７】
ここでの用法では、「ＭＷＭ１２００（Δｃｒｔクラスタープロモーター＋ΔｃｒｔＮ３）」または「ＭＷＭ１２００」という用語は、その中でｃｒｔクラスタープロモーターおよびｃｒｔＮ３遺伝子が中断されているメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの変異株を指す。天然Ｃ_３０カロテノイド生合成経路の中断は、Ｃ_４０カロテノイド生成を操作するための適切な背景（無着色）をもたらす。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＭＷＭ１２００株が以前作り出されており、適切なカロテノイド生成宿主である（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書）。「無着色」または「白色変異体」という用語は、その中で天然ピンク顔料（例えばＣ_３０カロテノイド）が生成されないメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ細菌を指す。したがって細菌細胞は、色がピンクとは対照的に白色であるように見える。
【０１３８】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、多くは細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を保有して、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状の自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列はユニークな構造に結合または組み込まれ、それは選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳の配列に沿って細胞中に導入できる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主におけるその遺伝子の増強された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１３９】
ここでの用法では、「改変された生物学的活性」という用語は、微生物のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に付随する活性を指し、それはアッセイ法によって測定でき、そこでは活性は、天然微生物の配列に付随する活性を超えるまたはそれ未満のいずれかである。「増強した生物学的活性」とは、天然配列に付随するものを超える改変された活性を指す。「減少した生物学的活性」とは、天然配列に付随するもの未満の改変された活性である。
【０１４０】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＧＣＧパッケージプログラム（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ））バージョン９．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））、および米国ウィスコンシン州５３７１５マディソン、サウスパーク通り１２２８のＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、およびスミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［国際シンポジウム議事録］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０頁、編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、メリーランド州ベセズダのインフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））からのベクターＮＴＩ、そしてシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）^ＴＭｖ．４．０５が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、製造業者によって設定されるあらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【０１４１】
本発明は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３から単離された、新たに発見されたＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素を提供する（米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書）。さらに本願明細書で、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００７２８（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＺＰ＿０００９４８３６．１、配列番号２０）からの仮説的タンパク質の機能は、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素活性を有するとして特性決定された。どちらのカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素も本方法によって、ヒドロキシル化カロテノイドを生成することが示された。本配列は、環状カロテノイド化合物からのヒドロキシル化カロテノイド生成のために、組換え宿主の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用してもよい。
【０１４２】
ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３ｃｒｔＺのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、ＢＬＡＳＴＰ検索のＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、最も類似した既知の配列が１６１個のアミノ酸長にわたり、ここで報告されるアミノ酸配列に対して約５１％の同一性を有することが明らかにされた（表３）。表４で報告するペアワイズ比較値は、ベクター（Ｖｅｃｔｏ）ＮＴＩ中のアラインＸ（ＡｌｉｇｎＸ）を使用して得られた。したがって好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約８０％同一であり、より好ましいアミノ酸配列はここで報告されるアミノ酸断片と少なくとも約９０％同一であり、さらにより好ましいアミノ酸配列はここで報告されるアミノ酸断片と少なくとも約９５％同一であり、および最も好ましいのはここで報告されるアミノ酸分子と少なくとも９９％同一の核酸分子である。
【０１４３】
同様に、好ましいｃｒｔＺ遺伝子は活性タンパク質をコードする核酸配列を含んでなり、それはここで報告される本核酸配列と少なくとも８０％同一である。より好ましいｃｒｔＺ核酸分子は、ここでの核酸配列と少なくとも９０％同一である。さらにより好ましいｃｒｔＺ核酸分子は、ここでの核酸配列と少なくとも９５％同一である。最も好ましいのは、ここで報告される核酸分子と少なくとも９９％同一のｃｒｔＺ核酸分子である。
【０１４４】
相同体の単離
本発明の核酸分子を使用して、同一または他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野でよく知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。核酸ハイブリダイゼーション法、および様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボール（Ｔａｂｏｒ）Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２（１９９２年））。
【０１４５】
例えば、本発明のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸分子の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の細菌からのライブラリーをスクリーニングして直接単離できる。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインして合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前出）。さらに利用できる生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、末端標識技術またはＲＮＡプローブなどの当業者に知られている方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部または全長を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切な厳密さ条件下で完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１４６】
典型的にＰＣＲタイプ増幅技術ではプライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、技術分野でよく知られている（「ヒト遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編から、テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）著、「遺伝病における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、（１９８６年）、３３〜５０頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編、「分子生物学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第１５巻、３１〜３９頁よりリュクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．（１９９３年）「ＰＣＲプロトコル：現行の方法と応用：（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｈｕｍａｎｉａ Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１４７】
概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短いセグメントを使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的遺伝子をコードするより長い核酸分子を増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応は、１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、別のプライマーの配列が真核生物遺伝子のｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸のトラクトの存在を利用する、クローニングされた核酸分子のライブラリーにおいて実施してもよい。ポリアデニル化ｍＲＮＡを欠く微生物遺伝子の場合、ランダムプライマーを使用してもよい。ランダムプライマーはまた、ＤＮＡからの増幅にも有用かもしれない。
【０１４８】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５６７３（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１４９】
代案としては、相同体の同定のために、ハイブリダイゼーション試薬として本配列を用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよく、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的である必要がある。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１５０】
ハイブリダイゼーション法はよく定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブのセンシティブでストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１頁（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１５１】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％、好ましくは３０容積％の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ範囲約６〜９）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％の界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなどの断片化核ＤＮＡ、および場合により約０．５〜２％重量／容積のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールなどの多様な極性水溶性剤または膨潤剤をはじめとする容積排除剤、例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性糖ポリマーなど他の添加剤を含めてもよい。
【０１５２】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ様式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補的な固定核酸プローブを有する。
【０１５３】
本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本アミノ酸配列の一部を代表する合成ペプチドを合成してもよい。これらのペプチドを用いて、動物を免疫し、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリノクローナルまたはモノクローナル抗体を生成できる。次にこれらの抗体を使用して、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長ＤＮＡクローンを単離する（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ），Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。
【０１５４】
組換え発現−微生物
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種の宿主細胞中、特に微生物宿主の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物宿主中での発現は、様々な経路中間体の発現のため、宿主中に既存の経路の調節のため、またはこれまで宿主を使用して可能でなかった新しい生成物の合成のために有用かもしれない。
【０１５５】
本遺伝子および核酸分子の発現のために好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、ｐＨ価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。例えばあらゆる細菌、酵母菌、および糸状菌が、本核酸分子の発現のための適切な宿主であることが考察された。転写、翻訳およびタンパク質生合成器官は、それぞれの細胞供給原料に関係なく同一であるので、細胞バイオマスを生成するのに使用される炭素供給材料に関係なく、機能性遺伝子が発現される。大規模微生物生育および機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール（すなわちメタノール）、光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用してもよい。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育条件によって、阻止または抑圧され制御されてもよい。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されてもよい。生育速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であってもよい。宿主株の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの真菌または酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい細菌宿主株としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。最も好ましい細菌宿主株としては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａおよびその突然変異体誘導体（すなわちメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０２に由来する突然変異体）が挙げられる。
【０１５６】
外来性タンパクの高レベル発現を導く制御配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者にはよく知られている。本カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素の発現のために、これらのいずれでも使用してキメラ遺伝子を構築できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１５７】
したがって例えば適切なプロモーター制御下にある本細菌酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、増大または改変されたヒドロキシル化カロテノイド生成を実証することが期待される。本遺伝子を天然宿主細胞、ならびに異種の宿主の双方において発現することが有用であることが考察された。本ｃｒｔＺ遺伝子の天然宿主中への導入は、ヒドロキシル化カロテノイドの改変されたレベルの生成をもたらす。さらに本遺伝子はまた、既存のカロテノイド経路が操作されていてもよい非天然宿主細菌中に導入してもよい。
【０１５８】
本発明によって生成される具体的なヒドロキシル化カロテノイドとしては、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、アドニキサンチン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、およびルテインが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に関心が高いのは、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンの生成であり、その合成を図１に示す。本ＣｒｔＺ酵素のための具体的な基質は、少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドである。環状カロテノイドは、技術分野でよく知られており、市販される。好ましいＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素基質としては、β−カロテン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、エキネノン、アドニルビン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、デオキシ−フレキシキサンチン、およびα−カロテンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５９】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野でよく知られている。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくてよいものと理解される。
【０１６０】
所望の宿主細胞において本ＯＲＦの発現を駆動させるのに有用なイニシエーション調節領域、またはプロモーターは多数有り、当業者にはよく知られている。実質的にこれらの遺伝子を駆動できる、以下をはじめとするが、これに限定されるものではないあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰ_Ｌ、ｌＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびに例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、および様々なファージプロモーター、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／６８９２００号明細書）における発現に有用な、ｎｒｔＡ、ｇｌｎＢ、ｍｏｘＦ、ｇｌｙｏｘＩＩ、ｈｔｐＧ、およびｈｐｓ遺伝子から単離されたプロモーター。さらにクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーター（Ｐｃａｔ）などのプロモーターもまた、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中での発現において有用かもしれない。
【０１６１】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により、終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１６２】
本遺伝子の配列の知識は、このような経路を有するあらゆる生物体中で、特にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａおよび大腸菌中でカロテノイド生合成経路を操作する上で有用である。遺伝的経路を操作する方法は一般的であり、技術分野でよく知られている。特定の経路中で選択された遺伝子は、種々の方法によって上方制御または下方制御されてもよい。さらに競合経路生物体は、遺伝子中断および類似した技術によって除外または昇華してもよい。
【０１６３】
ひとたび重要な遺伝的経路が同定および配列決定されると、特定の遺伝子を上方制御して経路の産出量を増大できる。例えばｐＢＲ３２２などの多コピー型プラスミド上で、標的遺伝子の追加的コピーを宿主細胞に導入してもよい。場合により、ＣｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素をコードする複数遺伝子が染色体性に発現されて、カロテノイド生成を増大させてもよい。しかし複数のｃｒｔＺ遺伝子の安定した染色体の発現は、概して使用する遺伝子のコード配列が、互いに低から中程度の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなることを必要とする。本カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、以前報告された全てのｃｒｔＺ遺伝子に対して、低から中程度のヌクレオチド配列同一性を示す。
【０１６４】
代案としては、非天然プロモーターの調節下におかれるように、標的遺伝子を変性してもよい。経路が、細胞サイクル中または発酵生産中の特定点で作動することが所望される場合、制御されたまたは誘導性プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置き換えてもよい。同様に場合によっては、天然または内在性プロモーターを変性させて、遺伝子発現を増大させてもよい。例えば内在性プロモーターは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で突然変異、欠失、および／または置換によって変性できる（クミーク（Ｋｍｉｅｃ）に付与されたの米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）らのＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号明細書を参照されたい）。
【０１６５】
代案としては、標的経路、またはエネルギーまたは炭素の競合シンクとして役割を果たすかもしれない競合経路における特定の遺伝子の発現を低下させるまたは除外することが必要かもしれない。この目的で遺伝子を下方制御する方法が探求された。中断する遺伝子配列が知られている場合、遺伝子下方制御の最も効果的な方法の１つは、外来性ＤＮＡを構造的な遺伝子に挿入して転写を中断する、標的を定めた遺伝子中断である。これは中断する遺伝子の一部に対して高度な相同性を有する配列で両脇を挟まれた、挿入するＤＮＡ（遺伝子マーカーであることが多い）を含んでなる遺伝子カセットの製造によってもたらされる。カセットの宿主細胞への導入は、細胞の天然ＤＮＡ複製機序を通じた構造的遺伝子への外来性ＤＮＡの挿入をもたらす（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２頁（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１〜２１３頁（１９９３年）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４頁（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７頁（１９９６年））。
【０１６６】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローニングして、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関わることを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者に知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１６７】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではない他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、ＨＮＯ_２およびＮＨ_２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響する化学物質、ならびにフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響する薬剤が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野でよく文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（以下「ブロック（Ｂｒｏｃｋ）」）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２年）（以下「デシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）」）を参照されたい。
【０１６８】
別の非特異的遺伝子中断方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンはＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後から配列に基づいて検索して挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸分子に接触すると、転移因子が核酸分子中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されてもよいので、技術はランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットが市販される。（例えばニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１因子に基づく、プライマー・アイランド転位キット、マサチューセッツ州のニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、およびウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移因子に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい）。
【０１６９】
微生物宿主としてのメチロトローフおよびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ
組換え微生物源からいくつかのカロテノイドが生成されている（例えばリコペン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ），Ｗ．Ｒ．およびリヤオ（Ｌｉａｏ）Ｌ．Ｃ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：５７〜６１頁（２００１年）；ワング（Ｗａｎｇ），Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：９２２〜９２６頁（２０００年）；ミサワ（Ｍｉｓａｗａ），Ｎ．およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ），Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９〜１８１頁（１９９８年）；シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ），Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６７６〜２６８０頁（１９９８年））；βカロテン生成のための大腸菌、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ），Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１：７９１〜７９５頁（１９９９年）；ミウラ（Ｍｉｕｒａ），Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６〜１２２９頁（１９９８年）；米国特許第５，６９１，１９０号明細書）；ゼアキサンチン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ），Ｍ．ら、前出；ミウラ（Ｍｉｕｒａ），Ｙ．ら、前出）；アスタキサンチン生成のための大腸菌およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（米国特許第５，４６６，５９９号明細書、米国特許第６，０１５，６８４号明細書、米国特許第５，１８２，２０８号明細書、米国特許第５，９７２，６４２号明細書；米国特許第５，６５６，４７２号明細書、米国特許第５，５４５，８１６号明細書、米国特許第５，５３０，１８９号明細書、米国特許第５，５３０，１８８号明細書、米国特許第５，４２９，９３９、および米国特許第６，１２４，１１３号明細書もまた参照されたい））が、異なるｃｒｔ遺伝子の様々な組み合わせを使用したこれらのカロテノイド生成法には、低い収率と比較的高価な供給材料への依存という欠点がある。したがって微生物宿主中でメタンまたはメタノールなどの安価な供給材料から、高収率のカロテノイドを製造する方法を同定することが望ましい。
【０１７０】
単一エネルギー源として一炭素基質を利用する、いくつかの微生物がある。このような微生物はここで「Ｃ_１代謝個体」と称される。これらの生物体は、単一エネルギーおよびバイオマス源として炭素−炭素結合が欠如している炭素基質を使用する能力によって特徴付けられる。これらの炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルメート、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、二酸化炭素、および他の様々なあらゆる炭素−炭素結合が欠如している還元炭素化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい基質としては、メタンおよび／またはメタノールが挙げられる。
【０１７１】
全てのＣ_１代謝微生物は、概してメチロトローフとして分類される。メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できるあらゆる生物体として定義されてもよい。しかし通性メチロトローフ、絶対メチロトローフ、絶対メタノトローフは、全てメチロトローフの様々なサブセットである。具体的には次のようである。
・通性メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーおよびバイオマスのために、糖および複合炭水化物などの他の炭素基質を使用してもよい。通性メチロトローフ細菌は多くの環境中に見られるが、最も一般には土壌、ごみ埋め立て、および廃棄物処理場から単離される。多くの通性メチロトローフは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβおよびγ亜群のメンバーである（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｃ１化合物上での微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）［国際シンポジウム］第７回（１９９３年）、２８５〜３０２頁、マレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）およびドンＰ．ケリー（Ｄｏｎ Ｐ．Ｋｅｌｌｙ）編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ；マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、ブロックの微生物生物学（Ｂｒｏｃｋ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、第８版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ：Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ（１９９７年））。
・絶対メチロトローフは、エネルギー生成が、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物の使用に限定された生物体である。
・絶対メタノトローフは、メタンを酸化する特徴的能力を有する絶対メチロトローフである。
【０１７２】
さらに一炭素基質を利用する能力は細菌に限定されず、酵母菌および真菌にも及ぶ。いくつかの酵母菌属は、エネルギー源としてより複雑な材料に加えて一炭素基質を使用できる（すなわちメチロトローフ酵母菌）。
【０１７３】
数多くのこれらのメチロトローフ生物体が知られているが、これらの微生物のわずかなものだけが材料合成のための工業プロセスにおいて成功裏に利用されている。そして一炭素基質は対費用効果の高いエネルギー源であるが、これらの微生物の遺伝子操作における困難さ、ならびにそれらの遺伝的機構に関する情報不足が、主に天然生成物合成のためのそれらの使用を制限している。
【０１７４】
これらの困難さにもかかわらず、多くのメタノトローフはこれらの生物体が色素を合成できるようにする固有のイソプレノイド経路を含有し、様々な非内在性イソプレノイド化合物を生成するために、これらの微生物を遺伝子操作する構想の可能性を提供する。メタノトローフは一炭素基質（すなわちメタンおよび／またははメタノール）をエネルギー源として使用できるので、これらの生物体においてカロテノイドを安価に生成することが可能であろう。メタノトローフがβ−カロテン生成のために遺伝子操作される実施例の１つは、参照によってここに編入する米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書で述べられる。
【０１７５】
一炭素基質を唯一のエネルギー源として使用できる微生物における、カロテノイド化合物生合成に関与する遺伝子発現のための方法が提供される。宿主微生物は、カロテノイドのための代謝前駆物質として、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を合成する能力を有するあらゆるＣ_１代謝個体であってもよい。より具体的には、本発明で適切な通性メチロトローフ細菌としては、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用な具体的なメチロトローフ酵母菌としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。例示的なメタノトローフとしては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシクティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７６】
本発明で特に興味深いのは、エネルギー的に好ましい炭素流経路を有する高生育絶対メタノトローフである。例えばメタノトローフの特定の株はいくつかの経路特性を有し、それを炭素流束操作のために特に有用なものにする。この株はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ２４０２）（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）として知られている。この特定の株および他の近縁メチロトローフは、本発明の遺伝子産物発現のための好ましい微生物宿主である（すなわちＣ_４０カロテノイド生成に有用である）。
【０１７７】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａの最適化されたバージョンが作りされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書）と命名された。内在性Ｃ_３０カロテノイド経路がノックアウトされ（Δｃｒｔクラスタープロモーター＋ΔｃｒｔＮ３）、Ｃ_４０カロテノイド発現のための最適化されたプラットフォームが作り出された。内在性ｃｒｔクラスター（ｃｒｔＮ１−ａｌｄ−ｃｒｔＮ２クラスター）の発現に関与するプロモーターの欠失は、無着色株をもたらした（野生型株はＣ_３０カロテノイドの天然生成のために常態ではピンク色）。この最適化された宿主内のＣ_４０カロテノイド生合成遺伝子発現は、所望のＣ_４０カロテノイドの生成増大を可能にした。
【０１７８】
Ｃ_１代謝細菌の形質転換
メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ），Ｈ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１〜７頁（１９９８年））、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１（キム（Ｋｉｍ），Ｃ．Ｓ．およびＴ．Ｋ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５〜１０８頁（１９９７年））、およびメチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種１２Ｓ株（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ），Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２３：７８７〜７９１頁（２００１年））の形質転換のために、電気穿孔が成功裏に使用されている。１つの特定のＣ_１代謝利用生物体から別の生物体への具体的電気穿孔パラメーターの推定は、困難かもしれない。
【０１７９】
供与細胞と受容細胞の直接接触に依存する細菌接合は、Ｃ_１代謝細菌中への遺伝子の転位のために、より容易に受け入れられることが多い。簡単に述べると、この細菌接合プロセスは、「供与」細胞と「受容」細胞を互いに密接に接触させて一緒に混合することを伴う。接合は、新たに合成された供与ＤＮＡの受容細胞中への直接転位を伴う、「供与」細菌と「受容」細菌間の細胞質連絡の形成によって起きる。技術分野でよく知られているように、接合の受容体は、供与細菌からの水平転位を通じてＤＮＡを受容できるあらゆる細胞として定義される。接合転位中の供与体は、接合プラスミド、接合トランスポゾン、または可動性プラスミドを含有する細菌である。供与体プラスミドの物理的転位は、下で述べられる２つの様式の１つによって起きることができる。
１．場合によっては、供与体と受容体のみが接合にとって必要とされる。これは転位されるプラスミドが接合性かつ可動性である自己伝播性のプラスミドの場合（すなわちｔｒａ遺伝子と、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子の双方を保有する）に起きる。一般にプロセスは、１．）ｏｒｉＴ中の特定部位で二本鎖プラスミドＤＮＡにニックが入れられるステップと、２．）ｐｏｒｅまたはｐｉｌｕｓ構造を通じて、一本鎖ＤＮＡが受容体に放出されるステップと、３．）ＤＮＡリラクセース酵素が二本鎖ＤＮＡをｏｒｉＴで開裂して、放出された５’末端に結合する（中間体構造としてリラクソゾームを形成する）ステップと、４．）引き続いて、補助タンパク質の複合体がｏｒｉＴでアセンブルして、ＤＮＡ転位プロセスを容易にするステップを伴う。
２．代案としては、供与体プラスミドの受容体への転位のために「三親交雑」接合が必要とされる。このタイプの接合には、供与細胞、受容細胞、および「ヘルパー」プラスミドが関与する。供与細胞は、可動性プラスミドまたは接合トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッケースをコードする遺伝子であるｏｒｉＴを含有し、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしＭｏｂタンパク質は、単独ではゲノムの転位達成するのに十分でない。したがって可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド（供与体内または「ヘルパー」細胞内に位置する）によって適切な接合システムが提供されない限り、それら自体の転位を促進できない。プラスミドは、ｐｏｒｅまたはｐｉｌｕｓの形成に関与する転位タンパク質（Ｔｒａ）をコードするので、接合プラスミドは対合形成およびＤＮＡ転位のために必要とされる。
【０１８０】
Ｃ_１代謝細菌が関与する成功裏の接合の例としては、ストリアー（Ｓｔｏｌｙａｒ）ら（Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ ６４（５）：６８６〜６９１頁（１９９５年））；モトヤマ（Ｍｏｔｏｙａｍａ），Ｈ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２（１）：６７〜７２頁（１９９４年））；ロイド（Ｌｌｏｙｄ），Ｊ．Ｓ．ら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １７１（６）：３６４〜３７０頁（１９９９年））；およびオドム（Ｏｄｏｍ），Ｊ．Ｍ．ら（それぞれ参照によってここに編入する米国特許出願第１０／９９７３０８号明細書、米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書、および米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書）の研究が挙げられる。
【０１８１】
工業生産
本ｃｒｔＺ遺伝子を使用した環状ヒドロキシル化カロテノイド化合物の商業的生産が所望される場合、多様な培養方法を応用してもよい。例えば組換え微生物宿主から過剰発現する特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチおよび連続の培養方法の双方で生産してもよい。
【０１８２】
古典的なバッチ培養法は閉鎖システムであり、そこでは培地の組成が発酵の最初に設定され、培養プロセス中の人為的変化を受けない。したがって培養プロセス開始時に培地に所望の生物体または生物体群を接種し、生育または代謝活動を生じさせながらシステムには何も添加しない。しかし典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。システムによっては対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。他のシステムでは、静止または対数期後生成を得ることができる。
【０１８３】
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ培養プロセスも本発明において適切であり、培養の進行と共に基質が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ培養法は、技術分野で一般的であり周知であって、実例はブロック（Ｂｒｏｃｋ）（前出）、およびデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（前出）にある。
【０１８４】
カロテノイドの商業生産は、連続培養によって達成してもよい。連続の培養は開放システムであり、規定の培地をバイオリアクターに連続的に添加して、等量の慣熟培地を工程から同時に除去する。連続培養は、概して細胞を恒常的な高い液相密度に維持し、そこでは細胞が主に対数増殖期にある。代案としては連続培養を固定細胞で実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料から構成される広範囲の固体担体を使用して実施してもよい。
【０１８５】
連続または半連続培養は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を固定された割合に維持し、他の全パラメーターの調節ができるようにする。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、培養中の細胞生育率に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野でよく知られており、多様な方法が前出のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０１８６】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類と、ラクトースまたはスクロースなどの二糖類と、デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖類と、乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物とが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている、二酸化炭素、メタンまたはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。一または二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物体はまた、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための多様なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｃ１化合物上での微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．）［国際シンポジウム］第７回（１９９３年）、４１５〜３２頁。編集者：マレル，Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー，ドンＰ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．）、出版社：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ：Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９頁（１９９０年））。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。
【０１８７】
植物における組換え発現
植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を製造することが知られている。本発明の核酸分子を使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作り出してもよい。好ましい植物宿主は、本タンパク質の高生成レベルを支えるいずれかの品種であることができる。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、コショウ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐｓ）、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、堅木、軟木、および飼料としての草が挙げられるが、これに限定されるものではない。商業的に重要な宿主としては、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコックス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの藻類の種が挙げられるが、これに限定されるものではない。カロテノイド化合物の生成は、最初に本発明のキメラ遺伝子を構築することによって達成されてもよく、その中でコード領域は、所望の発生段階で所望の組織中の遺伝子の発現を導くプロモーターに作動可能に連結される。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなってもよい。転写終止シグナルをコードする３’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために１個もしくはそれ以上のイントロンも含んでなる。
【０１８８】
コード領域の発現を誘導できるあらゆるプロモーターとあらゆるターミネーターのあらゆる組み合わせをキメラ遺伝子配列で使用してもよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用してもよい効率的な植物プロモーターの一タイプは、高等植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と機能的に連結するこのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できなくてはならない。本発明で使用してもよい高等植物プロモーターとしては、例えばダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小型サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３〜４９８頁（１９８２年））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導されることが知られている（例えば「植物の遺伝子操作、農業における展望（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、Ｐｌｅｎｕｍ：ＮＹ（１９８３年）、２９〜３８頁；コルッジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ），Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３年）；およびダンスミア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ），Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３年）参照）。
【０１８９】
次に本キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築できる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素をよく知っている。当業者はまた、異なる独立した形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことを認識する（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８頁（１９８５年）；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８〜８６頁（１９８９年））。したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数イベントをスクリーニングしなくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって達成してもよい。
【０１９０】
用途によっては、本タンパク質を異なる細胞区画に方向付けることが有用であろう。したがってトランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ），Ｋ．、Ｃｅｌｌ、５６：２４７〜２５３頁（１９８９年））、シグナル配列または小胞体局在化をコードする配列（クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３頁（１９９１年））、または核局在化シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ），Ｎ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２頁（１９９２年））などの適切な細胞内標的配列を添加することで、および／または既存の標的配列を除去することで、酵素をコードするコード配列を変更して上述のキメラ遺伝子をさらに補完してもよいことが想定された。引用した参考文献はこれらの各例を示すが、リストは網羅的でなく、有用なさらに多くの標的シグナルが将来発見されるかもしれない。
【０１９１】
タンパク質操作
本ヌクレオチドを使用して、向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察された。誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２７巻（４）：１０５６〜１０６２頁（１９９９年））、部位特異的変異誘発（クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２５９〜３１１頁、アンジェレッティ，ルース・ホーグ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ Ｈｏｇｕｅ）編、出版社：Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（１９９８年）、および「遺伝子シャフリング」（参照によってここに編入する米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書、および米国特許出願第１０／３７４３６６号明細書）をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。
【０１９２】
遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発と容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、関心のある遺伝子と類似したまたは違っているＤＮＡ領域の追加的集団存在下における、関心のある遺伝子の特定サイズの断片への制限エンドヌクレアーゼ開裂を伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。
【０１９３】
本発明の本微生物の配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしてもよい。配列は二本鎖であるべきで、５０ｂｐ〜１０ｋｂ範囲の様々な長さであることができる。配列は技術分野でよく知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に無作為に消化されてもよい（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。本微生物の配列に加えて、微生物の配列の全部または部分とハイブリダイズ可能な断片集団を添加してもよい。同様に本配列とハイブリダイズ可能でない断片集団を添加してもよい。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約１０〜２０倍過剰に添加される。通常はこのプロセスに従えば、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約１００〜約１０００個になる。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されてもよい。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは温度は８０℃〜１００℃である。核酸断片を冷却によって再アニールしてもよい。好ましくは温度は２０℃〜７５℃である。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速できる。適切な塩濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であってもよい。次にアニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは技術分野で知られているあらゆる他のＤＮＡポリメラーゼであってもよい。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加してもよい。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは２〜５０回反復され、より好ましくは手順は１０〜４０回反復される。得られる核酸は約５０ｂｐ〜約１００ｋｂの範囲のより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローニングおよび発現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしてもよい（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。
【０１９４】
さらにハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を使用した、機能性領域の融合によってアセンブルできる（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、９４：１０６９〜１０７３頁（１９９７年））。本遺伝子の機能性領域は、他の遺伝子の機能性領域と組み合わせて、所望の触媒機能を有する新しい酵素作り出すことができる。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用してハイブリッド酵素を構築し、当業者によく知られている技術を使用して様々な発現ベクター中にクローニングしてもよい。
【０１９５】
カロテノイド生成に関与する遺伝子
カロテノイドの生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への転換を提供する上流イソプレノイド経路、およびフィトエンの合成と、全ての引き続いて生成されるカロテノイドを提供する下流カロテノイド生合成経路の２つの部分に都合よく分けることができる。上流経路は多くの非カロテノイド産生性微生物に遍在性であり、これらの場合、所望のカロテノイド生合成のための下流経路を含んでなる遺伝子を導入することだけが必要である。２つの経路間の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸塩の合成に関わる。ＦＰＰが天然に存在する場合、下流カロテノイド経路の要素のみが必要である。しかしカロテノイド生成において下流経路カロテノイド遺伝子が効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのＦＰＰを有することが必要なことが理解される。ＦＰＰ合成が宿主細胞によって提供されない場合、ＦＰＰの生成に必要な遺伝子を導入することが必要である。これらの各経路について下で詳細に述べる。
【０１９６】
上流イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、一般的なＣ５イソプレンサブユニットであるイソペンテニルピロリン酸塩（ＩＰＰ）を生じる２つの経路のどちらかを通じて起きる。最初によく知られている酢酸／メバロン酸経路を通じてＩＰＰを合成してもよい。しかし最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物体で作動しているわけではないことを実証している。ＩＰＰ生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されている（ホルバック（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５〜１４０頁（１９９３年）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７〜５２４頁（１９９３年）；シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３〜８０頁（１９９６年）；およびアイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１〜６４３６頁（１９９６年））。
【０１９７】
メバロン酸非依存イソプレノイド経路中の多くのステップが知られている。例えばＩＰＰの生成をもたらす代案の経路の最初のステップは、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７〜５４４頁（１９９８年））によって結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において研究されている。経路の第１のステップは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られている五炭素化合物を生じる、２つの三炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の縮合を伴う。この反応はｄｘｓ遺伝子によってコードされるＤＸＳ酵素によって起きる。次にＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元から、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸が生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒによってコードされるＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）（ｉｓｐＣ）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸を引き続いて、注釈なしの遺伝子ｙｇｂＰでコードされる酵素によって、ＣＴＰ−依存反応において４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに転換する。しかし最近ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと改名された（スイス・プロテイン登録番号Ｑ４６８９３）。
【０１９８】
次にｙｃｈＢ遺伝子によってコードされる酵素によって、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの第２位のヒドロキシ基をＡＴＰ−依存反応においてリン酸化できる。ＹｃｈＢは４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをリン酸化して、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸が得られる。ｙｃｈＢ遺伝子もまたｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと改名された（スイス・プロテイン登録番号Ｐ２４２０９）。ＹｇｂＢはＣＴＰ−依存様式で、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸に転換する。この遺伝子は最近改名され、ｉｓｐ遺伝子クラスターに属する。具体的には、ｙｇｂＢ遺伝子の新名称はｉｓｐＦ（スイス・プロテイン登録番号Ｐ３６６６３）である。
【０１９９】
ｇｃｐＥ（ｉｓｐＧ）およびｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）（およびおそらくは他の）遺伝子によってコードされる酵素はイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成をもたらす反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるＩＰＰイソメラーゼを通じてＤＭＡＰＰに異性化してもよい。しかしこの酵素は生存には必須ではなく、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用するいくつかの細菌では不在でもよい。最近の証拠はＭＥＰ経路がＩＰＰの前に分岐して、ｌｙｔＢ遺伝子産物を通じてＩＰＰとＤＭＡＰＰを別個に生成することを示唆する。ｌｙｔＢノックアウト変異は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの双方を補った培地中以外では、大腸菌に対して致死性である。
【０２００】
ＦＰＰの合成は、ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸への異性化を通じて起きる。この反応に、ｉｓｐＡによって触媒される２つのプレニル転移酵素反応手順が続き、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ、炭素数１０の分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、炭素数１５の分子）の生成をもたらす。
【０２０１】
上流経路の要素をコードする遺伝子は、表１に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。
【０２０２】
【表２】

【０２０３】
【表３】

【０２０４】
【表４】

【０２０５】
下流カロテノイド生合成経路
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、いくぶん主観的である。ＦＰＰ合成はカロテン産生性および非カロテン産生性細菌の双方において一般的であるので、下流カロテノイド生合成経路中の第１のステップは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に転換するプレニル転移酵素反応によって開始すると考えられる。ＧＧＰＰ合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥは、ＩＰＰをＦＰＰに付加して炭素数２０の分子であるＧＧＰＰを生成する、このプレニル転移酵素反応に関与する。２つのＧＧＰＰ分子の縮合反応が起きて、下流カロテノイド生合成経路における第１の炭素数４０の分子であるフィトエン（ＰＰＰＰ）が形成する。この酵素的反応は、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢによって触媒される。
【０２０６】
リコペンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）によって触媒される８個の水素原子の除去によって、４回の逐次脱水素化反応を通じてフィトエンから生成する。この反応の中間体は、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンである。
【０２０７】
リコペン環化酵素（ｃｒｔＹ）はリコペンをβ−カロテンに転換する。しかし追加的遺伝子を使用して、多様な他のカロテノイドを作り出してもよい。例えばβ−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ酵素（ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる）の活性がもたらす水酸化反応を通じて、ゼアキサンチンに転換される。β−クリプトキサンチンはこの反応の中間体である。
【０２０８】
β−カロテンは、ｃｒｔＷ、ｂｋｔまたはｃｒｔＯ遺伝子のどちらかによってコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、カンタキサンチンに転換されることができる。エキネノンは典型的にこの反応の中間体である。次にカンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素によってアスタキサンチンに転換できる。アドンビルブリンはこの反応の中間体である。
【０２０９】
ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに転換できる。この反応はゼアキサンチングルコシル転移酵素（ｃｒｔＸ）によって触媒される。
【０２１０】
下流カロテノイド生合成経路の要素をコードする遺伝子は、表２に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。
【０２１１】
【表５】

【０２１２】
【表６】

【０２１３】
【表７】

【０２１４】
【表８】

【０２１５】
好ましい非−ｃｒｔＺカロテノイド遺伝子源は、パントエア・ステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ８１９９、国際公開第０２／０７９３９５号パンフレット）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書）、腸内細菌科ＤＣ２６０（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３（参照によってここに編入する米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書）、およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８（参照によってここに編入する米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書）からのものである。本方法を使用したヒドロキシル化カロテノイドの生成のための好ましいｃｒｔＺ遺伝子源は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３（配列番号１６）またはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８（配列番号１９）からのものである。
【０２１６】
宿主生物体中で十分なＦＰＰ源が利用できれば、本発明の方法を使用して、表２に示す遺伝子と、本発明の好ましいｃｒｔＺ遺伝子との様々な組み合わせを使用することで、多数の異なるカロテノイドおよびカロテノイド誘導体を作ることができる。例えば遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢは、β−カロテンの生成を可能にする。ｃｒｔＥＸＹＩＢへのｃｒｔＺの添加は、ゼアキサンチンの生成を可能にする。
【実施例】
【０２１７】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。
【０２１８】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野でよく知られており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（前出）およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられている。
【０２１９】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはブロック（Ｂｒｏｃｋ）（前出）およびデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（前出）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのディフコ・ラボラトリーズ／ＢＤダイアグノスティックス（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、マサチューセッツ州ベヴァリーのニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））、カリフォルニア州カールズバッドのギブコ／ＢＲＬライフテクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【０２２０】
配列編集および位置合わせは、シーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）プログラムを使用して実施した。ｎｒデータベース内の配列の検索は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用してＢＬＡＳＴＰで実施した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のペアワイズ配列比較は、ベクターＮＴＩ中のアラインＸ（ＡｌｉｇｎＸ）を使用して実施した。いずれにしてもこれらのまたはあらゆる他のプログラムでプログラムパラメーターが指示されない場合、デフォルト値を使用した。
【０２２１】
略語の意味は次のとおり。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１部を意味する。
【０２２２】
実施例１
カロテノイド産生細菌株の単離および特性決定
本実施例は、２つの細菌株ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８の単離、およびそれらの天然カロテノイドの予備分析について述べる
【０２２３】
株単離および分類
新しいカロテノイド生成細菌株を単離するために、環境サンプルのコレクションからから着色微生物を単離した。デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）の庭からのおよそ１ｇの表面土壌を１０ｍＬの水道水に再懸濁した。１０μＬの白金耳を満たす水をルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）プレート上に画線し、プレートを３０℃でインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に２回ＬＢプレートに画線して、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーから、オレンジ〜ピンクのコロニーを形成したものをＤＣ２６３株と命名した（米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書）。ＤＣ１８株は、ペンシルベニア州の河川から単離した。水性サンプルの連続希釈（１０^−２、１０^−４、および１０^−６）をトリプトンおよび酵母で栄養強化した基礎培地の大型２４５×２４５ｍｍ １５％寒天プレート上に播種した。基礎培地構成要素（１リットルあたり）は次のようであった。ＮＨ_４Ｃｌ ０．８ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５ｇ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２０ ０．２ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２０ ０．１ｇ、ＮａＮＯ_３ １．３ｇ、およびＮａ_２ＳＯ_４ ０．５ｇ。原液１の構成要素（１リットルあたり）は次のようであった。ニトリロ三酢酸１２．８ｇ、ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２５４ｇ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．３１２ｇ、ＺｎＣｌ_２ ０．１ｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０１ｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０１ｇ、およびＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．１８４ｇ。１リットルの基礎培地あたり１０ミリリットルの原液１を添加した。培地を濃度１０ｇ／Ｌのトリプトンおよび５ｇ／Ｌの酵母抽出物で強化した。培地のｐＨを７に調節した。プレートを室温でインキュベートし、単一コロニーを同一プレートに２回画線した。オレンジコロニーを形成した１つの株を選択して、ＤＣ１８株と命名した（米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書）。
【０２２４】
ＤＣ２６３およびＤＣ１８によって１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を実施した。具体的には、プライマーＨＫ１２：５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）およびＪＣＲ１４：５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２）を使用して、株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。製造業者、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））の使用説明書に従ってキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用し、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を精製して、カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からの自動化ＡＢＩシーケンサー上で配列決定した。プライマーＨＫ１２、ＪＣＲ１４、およびＪＣＲ１５：５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ−３’（配列番号３）で、シーケンス反応を開始した。アセンブリされたＤＣ２６３の１２６８ｂｐ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号４）およびＤＣ１８の１２９１ ｂｐ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号５）をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）に対するＢＬＡＳＴＮ検索（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））のクエリー配列として使用した。ＤＣ２６３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ブレバンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）株のそれに対して相同性を示し、トップヒットはブレバンジモナスブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）と９９％同一であった。したがってこの株をブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３と命名した。ＤＣ１８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）株のそれと相同性を示し、トップヒットはスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）と９８％同一であった。したがってこの株をブレバンジモナス・ベシクラリススフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８と命名した。
【０２２５】
カロテノイド分析
ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３を１００ｍＬのＬＢ中で生育させた。スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８を株単離について述べたのと同一の１００ｍＬの培地中で生育させた。双方の株を振盪して３０℃で一晩生育させた。４０００ｇで１５分の遠心分離によって細胞をペレットにし、細胞ペレットを１０ｍＬのアセトンで抽出した。抽出物を窒素下で乾燥させ、１〜２ｍＬのアセトンに再溶解した。抽出物をミシガン州アナーバーのパル・コーポレーション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）ＣＲ２５ｍｍシリンジフィルターで濾過した。次にそれをカリフォルニア州フォスター・シティのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのアジレント・シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ）１１００ＬＣ／ＭＳＤ ＳＩを使用して、ＨＰＬＣ分析用０．１ｍＬ １０％アセトン＋９０％アセトニトリル中で濃縮した。
【０２２６】
サンプル（２０μＬ）をアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）からの１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ＺＯＲＢＡＸ Ｃ１８（３．５μｍ粒子）カラムに装入した。カラム温度を４０℃に維持した。流速は１ｍＬ／分であり、使用した通過溶剤プログラムは次のとおりであった。
０〜２分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ、
２〜１０分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂから６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配、
１０〜１２分：６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂから５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配、
１２〜１８分：５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂ、および
１８〜２０分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ。
【０２２７】
緩衝液Ａは９５％アセトニトリルおよび５％ ｄＨ_２Ｏであり、緩衝液Ｂは１００％テトラヒドロフランであった。
【０２２８】
図２はそれぞれＤＣ２６３およびＤＣ１８中で生成したカロテノイドのＨＰＬＣのプロフィールを示す。ＬＣ−ＭＳ分析は、ＤＣ２６３中の主要カロテノイドの分子量が６２８、およびＤＣ１８中の主要カロテノイドの分子量が６１４と判定した。ＨＰＬＣ溶出時間、吸収スペクトル、および分子量に基づいて、ＤＣ２６３中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオンと予測された。ＤＣ１８中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オンと予測された。ＤＣ２６３およびＤＣ１８中の主要カロテノイドについて本発明者らが判定した特性は、これらのカロテノイドに関する文献で報告されたものと一致した（ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０：２００〜２０３頁（１９９６年）；クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）ら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、６０：２５４〜２５８頁（１９７７年））。
【０２２９】
実施例２
β−カロテン合成プラスミドの構築
この応用では、２つのβ−カロテン合成プラスミドを使用した。小型インサートライブラリーのスクリーニングのために、プラスミドｐＤＣＱ３２９をリポータープラスミドとして使用して、ヒドロキシラーゼ酵素遺伝子をクローンした。それはカロテノイド産生株ＤＣ２６０（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）から単離されたｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスターを含有した。腸内細菌科株ＤＣ２６０からのカロテノイド遺伝子クラスターの単離、およびプラスミドｐＤＣＱ３２９の構築は、参照によってここに編入する米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書で既述される。
【０２３０】
プラスミドｐＤＣＱ３３０を使用して、新しい遺伝子のカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素活性を確認した。それはＰ．アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４から単離されたｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子クラスターを含有した。パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）株ＤＣ４０４からのカロテノイド遺伝子クラスターの単離、およびプラスミドｐＤＣＱ３３０の構築については、参照によってここに編入する米国特許出願第１０／８０８８０７号明細書で既述される。
【０２３１】
ＤＣ２６０およびＤＣ４０４は、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）の環境から単離されたカロテノイド産生株であった。腸内細菌科株ＤＣ２６０は、住宅の西方に面した壁の煉瓦表面から単離された。パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）株ＤＣ４０４は、住宅の野菜畑の土壌から単離された。サンプルを洗浄し、１０μＬの白金耳を満たす再懸濁液をルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）プレート上に画線し、プレートを３０℃でインキュベートした。様々なコロニー外見の着色細菌を拾って、ＬＢプレート上に均一に２回画線し、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーからＤＣ２６０およびＤＣ４０４が単離され、それらは淡黄色で平滑半透明なコロニーを形成した。
【０２３２】
ＤＣ２６０およびＤＣ４０４のためにコスミドライブラリーを構築し、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＷＥＢコスミドクローニングキットを使用して、製造業者の使用説明書に従ってβ−カロテン合成遺伝子クラスターをクローンした。シリンジニードルを通過させてゲノムＤＮＡを剪断した。剪断ＤＮＡを末端修復し、４０ｋＢ標準物質と比較して低融点アガロース上でサイズ選択した。大きさがおよそ４０ｋＢのＤＮＡ断片を精製し、ブラントエンドクローニング−レディｐＷＥＢコスミドベクター中にライゲートした。ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの高性能マックスプラックス（ＭａｘＰｌａｘ）^ＴＭラムダ・パッケージング・エキストラクツ（Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ）を使用して、ライブラリーをパッケージ化し、ＥＰＩ１００大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞上に播種した。コスミドライブラリーのそれぞれから２つの黄色コロニーが同定され、ここでｐＷＥＢ−２６０（ｃｒｔＥＸＹＩＢＺ遺伝子クラスターを含有する、配列番号６）およびｐＷＥＢ−４０４と称する。
【０２３３】
２つのコスミド上のカロテノイド遺伝子クラスターを配列決定して、ドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からのｐＢＨＲ１ベクター上にサブクローンした。プライマーｐＷＥＢ２６０Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号７）およびｐＷＥＢ２６０Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号８）を使用して、ｐＷＥＢ−２６０からのｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子を含有する断片を増幅した。プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号９）およびｐＷＥＢ４０４Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号１０）を使用して、ｐＷＥＢ−４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子（配列番号１１）を含有する断片を増幅した。カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのＰｆｕターボ（Ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼを次の熱サイクル条件でＰＣＲのために使用した。９２℃（５分）と、９４℃（１分）、６０℃（１分）、７２℃（９分）を２５サイクル、そして７２℃（１０分）。カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）中へのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングのために、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）からのＴａｑポリメラーゼを１０分間７２℃の反応中で使用して、追加的３’アデノシンヌクレオチドを断片に付加した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞への形質転換に続いて、いくつかのコロニーの色が黄色になり、それらがカロテノイド化合物を生成していることが示唆された。次に遺伝子クラスターを広域宿主範囲ベクターｐＢＨＲ１中にサブクローンしウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，ＷＩ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇ細胞中に電気穿孔した。ｐＤＣＱ３２９またはｐＤＣＱ３３０のいずれかの得られた各プラスミドを含有する形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択した。これらを制限酵素消化で確認して、β−カロテンを生成することが示された。
【０２３４】
実施例３
ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのカロテノイドケトラーゼ遺伝子の単離
本実施例は、細菌株ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からの小型インサートライブラリー構築、および各株からのケトラーゼ遺伝子のクローニングについて述べる（米国特許出願第１１／０１５４３３号明細書参照）。
【０２３５】
ライブラリー構築およびスクリーニング
ＤＣ２６３およびＤＣ１８の細胞を実施例１で述べらるようにして生育させた。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲノムＤＮＡ調製キットを使用して、細胞からゲノムＤＮＡを調製した。ランダム剪断法によって、株ＤＣ２６３およびＤＣ１８の小型インサートライブラリーを調製した。ニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））からの２９１／２Ｇインシュリンシリンジを約３００回通過させて、ＤＣ２６３およびＤＣ１８のゲノムＤＮＡを剪断し、０．８％アガロース・ゲル上で分離した。４〜６ｋｂ画分をゲルから切除し、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアジェン・ミネリュート（Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ）^ＴＭゲル抽出キット使用して抽出した。ルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ）ＤＮＡターミネーター（登録商標）修復キットを使用して、抽出したＤＮＡの末端を修復した。ルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ）からのｐＥＺＳｅｑ^ＴＭブラント（Ｂｌｕｎｔ）クローニングキットを使用して、修復ＤＮＡインサートをｐＥＺｓｅｑ^ＴＭベクターにライゲートした。β−カロテン産生プラスミドｐＤＣＱ３２９（米国特許出願第１０／８０８９７９号明細書）を含有する新鮮に調製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇのコンピテント細胞中に、ライゲーション混合物を電気穿孔した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＬＢプレート上に播種した。各ライブラリーについておよそ５０，０００〜１００，０００個の形質転換体が得られた。各ライブラリーの数万の黄色コロニーから、いくつかのオレンジ色のコロニーが同定された。これらの陽性クローンが、β−カロテンをケトカロテノイドに転換したケトラーゼ遺伝子をおそらく含有すると同定された。
【０２３６】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子の単離
アンピシリン抵抗性およびカナマイシン感応性クローンを選択して、ｐＥＺベースのプラスミドをβ−カロテンリポータープラスミドから分離した。ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＥＺ−ＴＮ＜ＴＥＴ−１＞キットおよび／またはプライマー歩行を使用して、ランダムトランスポゾン挿入によって、ｐＥＺベースのプラスミド上のインサートを配列決定した。ミシガン州アナーバーのジーン・コード社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）^ＴＭプログラムによって、配列をアセンブルした。ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンクから誘導される配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含有される配列への類似性に対するＢＬＡＳＴ（基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））検索を行って、ＣｒｔＷケトラーゼをコードする遺伝子を同定した。ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷ遺伝子のコード配列をそれぞれ配列番号１２および配列番号１３として列挙する。
【０２３７】
実施例４
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の単離
本実施例は、２つの細菌株ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８（旧名スフィンゴモナス・アロマチシボランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からのカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子単離について述べる。
【０２３８】
ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の単離
ＤＣ２６３からのｃｒｔＷ遺伝子（配列番号１２）を含有するｐＥＺベースのプラスミドを配列決定し、ｐＥＺベースのプラスミドの３ｋｂインサート上にカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は同定されなかった。側方領域をより多く配列決定するために、先にＤＣ２６３について述べたようにして、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＷＥＢコスミドクローニングキットを使用して、製造業者の使用説明書に従ってコスミドライブラリーを構築した。マイクロタイタープレート中で１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する１００μＬのＬＢにおよそ６００個のコスミドクローンが生育した。プレートを７００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２４時間インキュベートした。ｐＥＺベースのプラスミドのｃｒｔＷ領域周囲にデザインされたプライマーｐＥＺ２６３−Ｆ：５’−ＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＣ−３’（配列番号１４）およびｐＥＺ２６３−Ｒ：５’−ＣＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣＣＧ−３’（配列番号１５）を使用して、ＰＣＲによってコスミドライブラリーをスクリーンした。ｃｒｔＷ領域に伸びるおよそ４０ｋｂのインサートを含有する陽性コスミドクローンＦ３−４を単離した。コスミドＤＮＡを調製し、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＥＺ−ＴＮ＜ＴＥＴ−１＞キットおよび／またはプライマー歩行を使用して、ランダムトランスポゾン挿入によって配列決定した。ミシガン州アナーバーのジーン・コード社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）^ＴＭプログラムｖ４．０５によって、配列をアセンブルした。
【０２３９】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンクから誘導される配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含有される配列への類似性に対するＢＬＡＳＴ（基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））検索を行って、ｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子コード配列（配列番号１６）を同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる一般公開されているＤＮＡ配列に対する類似性について配列を分析した。ＤＮＡ配列を全ての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩが提供するＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６〜２７２頁（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる全ての一般公開されているタンパク質配列との類似性について比較した。ＢＬＡＳＴ分析は、β−カロテンヒドロキシラーゼ酵素に相同性があるＯＲＦを同定した。トップヒットはアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号Ｑ４４２６２）からのβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素に対するもので、５１％アミノ酸同一性であった。表３は値を期待値で報告したＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを示す。
【０２４０】
スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８のｃｒｔＷ含有コスミドもまた、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３について上で述べたようにして単離し、配列決定した。しかしＤＣ１８のｃｒｔＺヒドロキシラーゼ酵素遺伝子は、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８ｃｒｔＷを含有するコスミド中に見つからなかった。
【０２４１】
ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ ７００２７８からのカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の単離
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子をさらに同定するために、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８の部分的ゲノム配列データベースを検索した。アグロバクテリウム・オーランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（配列番号１８）からのβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素（ＣｒｔＺ）を使用して、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）のゲノムデータベースをＢＬＡＳＴした。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣｒｔＺと５２％のアミノ酸同一性を示すノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）タンパク質整理番号ＺＰ＿０００９４８３６．１、配列番号１９および２０）からの仮説的タンパク質を同定した。この仮説的タンパク質をｎｒデータベースをＢＬＡＳＴするのに使用した。トップヒットはパントエア・アグロメランス病原型ミレティアエ（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ｐｖ．Ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）からのＣｒｔＺに５７％同一性であった。ＢＬＡＳＴ分析からの他の「ヒット」の大部分は、異なる生物体からのβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素に対してであった。ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からの仮説的タンパク質をβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素活性についてアッセイした。
【０２４２】
ここで同定した２つのＣｒｔＺカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ベクターＮＴＩ中の複数配列比較アルゴリズムを使用して、いくつかの既知のカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子とも比較した。表４はペアワイズ比較のためのヌクレオチド配列同一性、およびアミノ酸配列同一性の百分率を示す。２つの単離されたｃｒｔＺ遺伝子は、既知のｃｒｔＺ遺伝子と低から中程度の相同性のみを共有し、また互いに非常に異なる。
【０２４３】
【表９】

【０２４４】
【表１０】

【０２４５】
実施例５
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素機能の確認
本実施例は、β−カロテンを生成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中の新しいカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の発現について述べる。β−カロテンからゼアキサンチンへの転換によって、各ヒドロキシラーゼ酵素遺伝子の機能が実証された。
【０２４６】
この研究で使用したβ−カロテン産生株は、プラスミドｐＤＣＱ３３０を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であった。２つの細菌株からの推定上のヒドロキシラーゼ酵素遺伝子をＰＣＲで増幅した。プライマーｃｒｔＺ−ＤＣ２６３＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＣ’（配列番号２１）およびｃｒｔＺ−ＤＣ２６３＿Ｒ：５’−ＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２２）を使用して、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺを増幅した。プライマー４１ＺＳＰＨ＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＴＴＧＣＣＧＣＧ−３’（配列番号２３）およびＳＰＨ＿ＺＲ：５’−ＧＣＴＡＧＣＣＣＴＡＧＧＴＴＡＧＣＣＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣ−３’（配列番号２４）を使用して、ＡＴＣＣ ７００２７８からのｃｒｔＺを増幅した。ＰＣＲ生成物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にクローンし、インサートを順方向に含有するクローンについてスクリーンした。これらはＤＣ２６３からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するｐＤＣＱ３７０ＴＡ、およびノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するｐＴｒｃＨｉｓ２−ＺＳ（スフィンゴ（Ｓｐｈｉｎｇｏ））をもたらした。これらのコンストラクトをｐＤＣＱ３３０を含有するβ−カロテン蓄積大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。実施例１で述べるようにして、形質転換体中のカロテノイドをＨＰＬＣによって分析した（図３）。主ピークは５．９６分に溶出し、吸収スペクトル（４５６ｎｍ、４８０ｎｍ）および５６９の分子量ｍ／ｚ、を有して、それはゼアキサンチン合成標準物質のそれらと同一であった。ゼアキサンチン標準物質はスイス国ルプシンゲンのカロテナチュア（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。ゼアキサンチンの合成は２つの新しいｃｒｔＺ遺伝子のヒドロキシラーゼ酵素機能を明白に実証した。
【０２４７】
実施例６
アスタキサンチン産生プラスミドのクローニング
本実施例は、ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３またはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子をｃｒｔＷ遺伝子およびβ−カロテン合成遺伝子クラスターと共に発現させることによる、アスタキサンチン産生プラスミドの構築について述べる。
【０２４８】
ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺを含有するアスタキサンチン産生プラスミドのクローニング
最初に、ｃｒｔＸ遺伝子を除去して、ｐＤＣＱ３２９からβ−カロテン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＹＩＢを構築した。引き続くクローニングを容易にするために、ｃｒｔＹ遺伝子末端のＥｃｏＲＩ部位もまた除去した。プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２５）およびｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｒ：５’−ＡＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２６）を使用して、ｃｒｔＥ遺伝子を増幅した。プライマーｃｒｔ−２６０ＳＯＥ＿Ｆ：５’−ＣＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２７）およびｃｒｔ−２６０ＲＩ＿Ｒ：５’−ＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＣＧＣＴＴ−３’（配列番号２８）を使用して、ｃｒｔＹ遺伝子を増幅した。ＥｃｏＲＩ部位中のＡＡＴコドンを代替えのＡＡＣコドンで置き換えてＥｃｏＲＩ部位を除去した。プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆおよびｃｒｔ−２６０ＲＩ＿Ｒを使用して、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲによってｃｒｔＥＹ遺伝子を共に結合した。プライマーｃｒｔ−２６０ＲＩ＿Ｆ：５’−ＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号２９）、およびｃｒｔ−２６０＿Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号３０）によってｃｒｔＩＢ断片を増幅した。プライマーｃｒｔ−２６０＿Ｆおよびｃｒｔ−２６０＿Ｒを使用して、別のＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲによってｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子を共に結合した。ｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子を含有する４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＢＨＲ１のＥｃｏＲＩ部位にクローンしてｐＤＣＱ３４０を得た。ｐＤＣＱ３４０を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、β−カロテンを生成することが示された。
【０２４９】
次にＤＣ２６３からのｃｒｔＷおよびｃｒｔＺ遺伝子をｐＤＣＱ３４０上のｃｒｔＥＹＩＢクラスターの上流にクローンした。プライマーｃｒｔＷ−２６３＿Ｆ：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号３１）、およびｃｒｔＷ−２６３＿Ｒ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号３２）を使用してＤＣ２６３からのｃｒｔＷを増幅した。プライマーｃｒｔＺ−２６３＿Ｆ２：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号３３）およびｃｒｔＺ−２６３＿Ｒ２：５’−ＡＣＴＡＧＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号３４）を使用してＤＣ２６３からのｃｒｔＺを増幅した。ＰＣＲ生成物をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローンして、それぞれｐＤＣＱ３４２ＴＡおよびｐＤＣＱ３５２を得た。ｃｒｔＷを含有するｐＤＣＱ３４２ＴＡからの０．８ｋｂのＳｐｅＩ−ＸｂａＩ断片をｐＤＣＱ３４０のＳｐｅＩ部位にクローンした。得られたｐＤＣＱ３４２はｃｒｔＥＹＩＢ遺伝子クラスター上流のｃｒｔＷを含有した。次にｃｒｔＺを含有するｐＤＣＱ３５２からの０．５ｋｂのＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＤＣＱ３４２上のｃｒｔＷ上流のＳｐｅＩ部位にクローンした。これによってｐＢＨＲ１ベクター上のクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーター（Ｐｃａｔ）から発現されたｃｒｔＺＷＥＹＩＢ遺伝子クラスターを含有する、アスタキサンチン産生プラスミドｐＤＣＱ３４４を得た。
【０２５０】
ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺを含有するアスタキサンチン産生プラスミドのクローニング
内在性メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）プロモーターＰｈｐｓ１（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／６８９２００号明細書）の下で、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）からのｃｒｔＺをスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷと共に共発現した。上流プライマー５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＣＧＴ−３’（配列番号３５）および下流プライマー５’−ＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号３６）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａゲノムＤＮＡからＰｈｐｓ１プロモーターを増幅した。Ｐｈｐｓ１を含有する２８８ｂｐのＮｃｏＩ断片をｐＢＨＲ１のＮｃｏＩ部位にクローンしてｐＤＣＱ３６３を得た。ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺをｐＴｒｃＨｉｓ２−ＺＳ（スフィンゴ（Ｓｐｈｉｎｇｏ））からのＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＤＣＱ３６３のＳｐｅＩ部位にクローンしてｐＤＣＱ３６４を得た。プライマーｃｒｔＷ＿ｓｐｈｉｎｇｏ＿Ｆ５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号３７）およびｃｒｔＷ＿ｓｐｈｉｎｇｏ＿Ｒ５’−ＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＡＡＣＧＡＣＣＧ−３’（配列番号３８）を使用して、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷを増幅した。ｃｒｔＷを含有するＳｐｅＩ−ＸｂａＩ断片をｐＤＣＱ３６４のＳｐｅＩおよびＸｂａＩ部位にクローンした。得られたコンストラクトｐＤＣＱ３６５中で、スフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８からのｃｒｔＷ、およびノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺを内在性メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）プロモーターＰｈｐｓ１下で、１つの転写単位として共発現した。次にこのｃｒｔＷＺ転写単位を含有するＮｃｏＩ断片をβ−カロテン合成プラスミドｐＤＣＱ３３０のＮｃｏＩ部位にクローンして、アスタキサンチン産生プラスミドｐＤＣＱ３６６を得た。
【０２５１】
実施例７
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中でのアスタキサンチンの生成
本実施例は、以前報告された方法（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書）に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０２）などの２つの無関係の微生物の宿主細胞中にアスタキサンチン産生プラスミドを形質転換して、アスタキサンチンを生成するのに使用されるプロセスについて述べる。
【０２５２】
簡単に述べると三親接合交配（米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書）によって、プラスミドをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ中に転移する。ｐＲＫ２０１３（ＡＴＣＣ番号３７１５９）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヘルパー株、およびプラスミドｐＤＣＱ３４４またはｐＤＣＱ３６６を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０ＧまたはＤＨ１０Ｂ供与体株をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地で一晩生育させ、ＬＢ中で３回洗浄し、元の培養容積のおよそ６０倍の濃度に相当する容積のＬＢに再懸濁した。
【０２５３】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００株は、ｃｒｔＮ１ａｌｄｃｒｔＮ２遺伝子クラスターの二重交差ノックアウトを含有して、それは天然Ｃ_３０カロテノイド（米国特許出願第１０／９９７８４４号明細書）の合成を中断した。ＭＷＭ１２００株は、米国特許出願第０９／９４１９４７号明細書で述べられる一般条件を使用して、受容株として生育された。簡単に述べると、少なくとも８：１の気体／液体比（すなわち総容積１６０ｍＬ中の２０ｍＬの硝酸塩液体「ＢＴＺ−３」培地）を使用して、３０℃で絶え間なく振盪しながら、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００株をイリノイ州ホイートンのホイートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ））からの血清ストッパーホイートン・ボトル（Ｗｈｅａｔｏｎ ｂｏｔｔｌｅｓ）中で生育させた。
【０２５４】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６Ａのための硝酸塩培地
ここで「合成培地」または「ＢＴＺ−３」培地とも称される硝酸塩液体培地は、下で示されるように（表５および６）溶液１と混合された様々な塩を含んでなり、明記される場合は、硝酸塩は１５ｍＭ塩化アンモニウムで置き換えられる。溶液１は、微量元素の１００倍濃縮原液のための組成を提供する。
【０２５５】
【表１１】

【０２５６】
【表１２】

【０２５７】
培養のための標準気相は、空気中に２５％のメタンを含有する。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ ＭＷＭ１２００受容株をこれらの条件下で４８時間ＢＴＺ−３培地中で培養し、ＢＴＺ−３で３回洗浄し、元の培養容積のおよそ１５０倍の濃度に相当する容積のＢＴＺ−３に再懸濁した。
【０２５８】
０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を含有するＢＴＺ−３寒天プレート表面で、供与細胞、ヘルパー細胞、および受容細胞のペーストをそれぞれ１：１：２の比率で合わせた。プレートを２５％メタン中で３０℃に１６〜７２時間維持して接合を生じさせ、その後細胞ペーストを収集してＢＴＺ−３に再懸濁した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＴＺ−３寒天に希釈溶液を播種して、２５％メタン中で３０℃で１週間までインキュベートした。橙赤色の接合完了体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と共にＢＴＺ−３寒天上に画線した。
【０２５９】
カロテノイド組成物の分析のために、各ウェルにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＢＴＺ−３を１ｍＬ含有するキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からの２４−ウェルブロック内でメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）接合完了体を培養した。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのエアポア（Ａｉｒｐｏｒｅ）^ＴＭフィルムでブロックを覆い、唯一の炭素源として２５％メタンを充填した日本国三菱ガス化学株式会社からのアナエロパック（ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ）^ＴＭシステム中でインキュベートした。アナエロパック（ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ）^ＴＭを３０℃で２〜３日間２５０ｒｐｍで振盪した。アスタキサンチンプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する２５ｍｌのＬＢ中で、３０℃で２〜３日間２５０ｒｐｍで振盪して生育させた。実施例１で述べるように細胞を遠心分離して収集し、ペレットを抽出してＨＰＬＣによってカロテノイド含量を分析した。
【０２６０】
ｐＤＣＱ３４４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇまたはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００からの抽出物のＨＰＬＣ分析を図４に示す。アスタキサンチンは、ｐＤＣＱ３４４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中で生成された総カロテノイドのおよそ８０％を含んでなった。５．２〜５．３分で溶出したアスタキサンチンピークは４８０ｎｍの最大吸収、および５９７の分子量ｍ／ｚを有し、それはアスタキサンチンの合成標準物質のそれらと同一であった。５．８〜５．９分溶出したマイナーピークは、４６４ｎｍの吸収最大および５８３の分子量ｍ／ｚを有し、それはアドニキサンチンの合成標準物質のそれらと同一であった。合成アスタキサンチンおよびアドニキサンチン標準物質は、スイス国ルプシンゲンのカロテナチュア（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。ｐＤＣＱ３６６を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂまたはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１２００からの抽出物のＨＰＬＣ分析を図５に示す。アスタキサンチンは、この試行で４．４〜４．６分に溶出する主カロテノイドとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）の双方から生成した。いくつかのマイナーピークに加えて、１１．２分に溶出するピークは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中の総カロテノイドの１０％を含んでなった。このピークは４４８ｎｍ、４７４ｎｍ、５０４ｎｍの最大吸収、および５３６の分子量ｍ／ｚを有し、これはアスタキサンチン生合成中間体のリコペンのそれらと一致する。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】β−カロテンからケトラーゼおよびヒドロキシラーゼ酵素反応を経た、多様な可能な前駆物質からのアスタキサンチン生成の生合成経路を示す。
【図２】ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３およびスフィンゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）ＤＣ１８によって生成される天然カロテノイドのＨＰＬＣ分析を示す。
【図３】ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３またはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するゼアキサンチン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって生成されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析を示す。
【図４】ブレバンジモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＣ２６３からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するアスタキサンチン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ株によって生成されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析を示す。
【図５】ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００２７８からのｃｒｔＺ遺伝子を発現するアスタキサンチン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａ株によって生成されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）配列番号１７によって表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１６によって表される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
適切な調節配列に作動可能に結合する請求項１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
請求項４に記載のキメラ遺伝子コンストラクトを含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７】
宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞がダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐｓ）、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、広葉樹、針葉樹、および牧草よりなる群から選択される請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）配列番号１６で表される配列の一部に相当する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
増幅されたインサートがカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする、
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項１０】
（ａ）少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）請求項１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして、
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を適切な条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイドを生成せしめること
を含んでなるヒドロキシル化カロテノイド化合物の製造方法。
【請求項１１】
ヒドロキシル化カロテノイドがアスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、アドニキサンチン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオン、テトラヒドロキシ−β，β’−カロテン−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、およびルテインよりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
環状カロテノイドがβ−カロテン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、エキネノン、アドニルビン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、デオキシ−フレキシキサンチン、およびα−カロテンよりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
形質転換された宿主が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
形質転換宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
形質転換宿主細胞がダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、広葉樹、針葉樹、および牧草よりなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
形質転換宿主細胞がメチロトローフである請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
メチロトローフがメタノトローフである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
メタノトローフがメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）カロテノイド生合成経路を含んでなり、少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）請求項１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイド生合成を制御すること
を含んでなる生物体中での環状ヒドロキシル化カロテノイド生合成の制御方法。
【請求項２０】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が上方制御される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がマルチコピープラスミド上で過剰発現する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が、誘導可能プロモーターまたは制御プロモーターに作動可能に結合する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が下方制御される請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がアンチセンス方向で発現される請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がコード領域への外来性ＤＮＡの挿入によって中断される請求項１９に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【公表番号】特表２００８−５０９７０６（Ｐ２００８−５０９７０６Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７９４７（Ｐ２００７−５２７９４７）
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９１２１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２３４９５
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】