ガン幹細胞の作製方法
【課題】ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法の提供。
【解決手段】正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含するガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法。
【解決手段】正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含するガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原理的には、ガン幹細胞（ＣＳＣ）は、正常組織幹細胞、またはガン化変異によって幹細胞の特徴を獲得した前駆細胞または分化細胞から生じ得る。ＣＳＣは自己再生して、腫瘍中の細胞の大部分を形成する増幅ガン細胞を連続的に生じる（非特許文献１０）。いくつかのオンコジーンおよびガン抑制遺伝子の変異が腫瘍形成に関与していることが示されているが、ＣＳＣの根源細胞と遺伝子変化の関係は、いくつかの白血病以外では未だに解明されていない（非特許文献１〜４）。本発明者らおよび他の研究者らは、適切な条件下で培養すると、特定化されたオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）およびアストロサイト（ＡＳＴ）が神経幹様細胞に復帰し得ることを示している（非特許文献１１〜１４）。これは、ＯＰＣおよびＡＳＴならびに神経幹細胞（ＮＳＣ）が脳ＣＳＣの根源細胞である可能性を示唆する。ｐ５３はヒトグリオーマを含むヒトガンにおいて最も頻繁に変異している腫瘍抑制遺伝子である（非特許文献１５）。またＲａｓ活性の上昇がヒトグリオーマおよびグリオーマ細胞株で報告されている（非特許文献１６）。さらに、ＡＳＴにおけるＲａｓ活性化とｐ５３欠乏の組み合わせにより、マウスにおいて悪性グリオーマが引き起こされ得ることが示されている（非特許文献１７〜２０）。しかし、これらの組み合わせが培養ＮＳＣ、ＯＰＣおよびＡＳＴのＣＳＣへのトランスフォーメーションを誘導し得るかどうかは知られていなかった。
【０００３】
上記のように、近年の進歩により、悪性腫瘍が無限自己複製し腫瘍形成能を有するＣＳＣを含んでいることが示された。最近、白血病幹細胞が造血幹細胞または拘束性前駆細胞のいずれかから生じ得ることが示されたが（非特許文献１〜４）、固形ガン中のＣＳＣが組織特異的幹細胞、拘束性前駆細胞または分化細胞から生じるかどうかは不明である。例えば、非特許文献３および４では、オンコジーンＭＬＬ−ＡＦ９を正常前駆細胞に導入することによって白血病幹細胞が得られることが記載されている。一方、固形ガンにおけるＣＳＣ研究では、脳腫瘍、乳ガン等にＣＳＣの存在が報告されている段階であり（非特許文献２５〜２９）、ＣＳＣの根源細胞や、ＣＳＣへのトランスフォーメーションに関与するオンコジーンについての研究は十分ではなく、有効なガン治療法の開発のためにより多くの知見を得ることが望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】Cozzio, A. et al. Similar MLL-associated leukemias arising from self-renewing stem cells and short-lived myeloid progenitors. Genes Dev. 17, 3029-3035 (2003).
【非特許文献２】Huntly, B. J. et al. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell 6, 587-596 (2004).
【非特許文献３】Krivtsov, A. V. et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature 442, 818-822 (2006).
【非特許文献４】Somervaille, T. C. & Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell 10, 257-268 (2006).
【非特許文献５】Louis, D. N. The p53 gene and protein in human brain tumors. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 11-21 (1994).
【非特許文献６】Bogler, O., Huang, H. J., Kleihues, P. & Cavenee, W. K. The p53 gene and its role in human brain tumors. Glia 15, 308-327 (1995).
【非特許文献７】Feldkamp, M. M., Lau, N. & Guha, A. Signal transduction pathways and their relevance in human astrocytomas. J. Neurooncol. 35, 223-248 (1997).
【非特許文献８】Ohgaki, H. et al. Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study. Cancer Res. 64, 6892-6899 (2004).
【非特許文献９】Hulleman, E. & Helin, K. Molecular mechanisms in gliomagenesis. Adv. Cancer Res. 94, 1-27 (2005).
【非特許文献１０】Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F. & Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 414, 105-111 (2001).
【非特許文献１１】Kondo, T. & Raff, M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipoteintial CNS stem cells. Science 289, 1754-1757 (2000).
【非特許文献１２】Laywell, E. D. et al. Identification of a multipotent astrocytic stem cell in the immature and adult mouse brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13889-13894 (2000).
【非特許文献１３】Belachew, S. et al. Postnatal NG2 proteoglycanexpressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
【非特許文献１４】Nunes, M. C. et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature Med. 9, 439-447 (2003).
【非特許文献１５】Rasheed, B. K. et al. Alterations of the TP53 gene in human gliomas. Cancer Res. 54, 1324-1330 (1994).
【非特許文献１６】Guha, A. et al. Proliferation of human malignant astrocytomas is dependent on Ras activation. Oncogene 15, 2755-2765 (1997).
【非特許文献１７】Reilly, K. M. et al. Nf1;Trp53 mutant mice develop glioblastoma with evidence of strain-specific effects. Nature Genet. 26, 109-113 (2000).
【非特許文献１８】Zhu, Y. et al. Early inactivation of p53 tumor suppressor gene cooperating with NF1 loss induces malignant astrocytoma. Cancer Cell 8, 119-130 (2005).
【非特許文献１９】Bizub, D., Blair, D., Alvord, G. & Skalka, A. M. Correlation between H-ras p21TLeu61 protein content and tumorigenicity of NIH3T3 cells. Oncogene 3, 443-448 (1988).
【非特許文献２０】Barnett, S.C. & Crouch, D. H. The effect of oncogenes on the growth and differentiation of oligodendrocyte type 2 astrocyte progenitor cells. Cell Growth Differ. 6, 69-80 (1995).
【非特許文献２１】Tsukada, T., et al. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene 8, 3313-3322 (1993).
【非特許文献２２】Kondo, T. & Raff, M. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes Dev. 18, 2963-2972 (2004).
【非特許文献２３】Wang, S. et al. A role for the helix-loop-helix protein Id2 in the control of oligodendrocyte development. Neuron 29, 603-614 (2001).
【非特許文献２４】Bogler, O., Huang, H. J. & Cavenee, W. K. Loss of wild-type p53 bestows a growth advantage on primary cortical astrocytes and facilitates their in vitro transformation. Cancer Res. 55, 2746-2751 (1995).
【非特許文献２５】Singh, S. K. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396-401 (2004).
【非特許文献２６】Galli, R. et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res 64, 7011-7021 (2004).
【非特許文献２７】Bao, S. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444, 756-760 (2006).
【非特許文献２８】Piccirillo, S. G. et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature 444, 761-765 (2006).
【非特許文献２９】Hambardzumyan, D., Squatrito, M. & Holland, E. C. Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors. Cancer Cell 10, 454-456 (2006).
【非特許文献３０】Ligon, K. L. et al. Olig2-Regulated Lineage-Restricted Pathway Controls Replication Competence in Neural Stem Cells and Malignant Glioma. Neuron 53, 503-517 (2007).
【非特許文献３１】Al-Hajj, M. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3983-3988 (2003)
【非特許文献３２】Kawahara, A., et al. Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with death domain. J. Cell Biol. 143, 1353-60 (1998).
【非特許文献３３】Kondo, T. & Raff, M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipoteintial CNS stem cells. Science 289, 1754-1757 (2000).
【非特許文献３４】Li, C. & Wong, W. H. Model-based analysis of oligonucleotide arrays: expression index computation and outlier detection Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 3136 (2001).
【非特許文献３５】Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 3, article3 (2004).
【非特許文献３６】Srorey, J. D. A direct approach to false discovery rates. J. R. Satist. Soc. B 64, part3, 479-498 (2002).
【非特許文献３７】Storey, J. D. & Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 9440-9445 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｒａｓシグナル経路の活性化およびｐ５３の抑制（これらは、ヒトグリオーマにおいて頻繁に生じる（非特許文献５〜９））を神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および分化アストロサイト（ＡＳＴ）において同時に行うことによってグリオーマに関する上記課題に取り組んだ。本発明者らは、ＯＰＣおよびＮＳＣの両方が、これらの条件下で広範な遺伝子発現の再プログラムを伴ってグリオーマ幹細胞にトランスフォームするがＡＳＴはそうではないことを示した。３つ全ての細胞型は増殖促進を示したが、ヌードマウスの脳へ移植したところ、ＮＳＣおよびＯＰＣのみが神経膠芽腫を形成した。これらの知見はヒトにおいて神経膠芽腫がＯＰＣまたはＮＳＣのいずれかから生じる可能性を示唆する。これらの知見に基づき、本発明は完成した。
【０００７】
本発明は、以下に関する：
［１］正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法；
［２］ガン幹細胞がグリオーマ幹細胞である、［１］の方法；
［３］正常細胞が神経幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞である、［１］または［２］の方法；
［４］Ｒａｓ活性化がＨＲａｓＬ６１遺伝子の導入によって達成される、［１］〜［３］のいずれかの方法；
［５］ｐ５３欠乏がｐ５３欠損動物由来の細胞の使用によって達成される、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］［１］〜［５］のいずれかの方法により製造されたガン幹細胞；
［７］［６］のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法；
［８］［７］の方法によって得られたガン幹細胞標的化物質を含む、ガン治療用医薬組成物；
［９］候補物質を［６］のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法；
［１０］［９］の方法によって得られた抗ガン性物質を含む、ガン治療用医薬組成物；
［１１］［６］のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガンの診断方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法ならびに当該方法により製造されたガン幹細胞を提供する。
【００１０】
本明細書において幹細胞とは、自己再生能を有する細胞のことをいう。幹細胞のうち正常細胞へ分化する能力を有する幹細胞を正常幹細胞といい、ガン細胞へ分化する能力を有する幹細胞をガン幹細胞という。ガン幹細胞には任意のガン細胞に分化するものが含まれる。ガンは例えば固形ガン、好ましくはグリオーマである。
【００１１】
ガン幹細胞の自己再生能は、例えば、ガン幹細胞の移植によって形成された腫瘍を動物から切除し、その細胞を別の動物に再移植した際に同様に腫瘍を形成するかどうかを調べる連続移植実験によって確認することができる。
【００１２】
本発明の製造方法によって得られるガン幹細胞を含む細胞集団は、ヌードマウスに移植した場合、例えば１００個、好ましくは５０個、より好ましくは２０個、さらに好ましくは１０個の細胞によって腫瘍を形成する能力を有する。あるいは、本発明の製造方法によって得られたガン幹細胞を含む細胞集団は、例えば１００個中１個、好ましくは５０個中１個、より好ましくは２０個中１個、さらに好ましくは１０個中１個のガン幹細胞を含む。
【００１３】
グリオーマ（神経膠腫）を生じるガン幹細胞をグリオーマ幹細胞という。グリオーマは脳実質の神経外胚葉組織から発生した腫瘍の総称であって、アストロサイトーマ（星細胞腫）、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽種、脳室上衣腫、乏突起膠腫、脈絡叢乳頭腫などを含む。この中でＧＢＭは最も悪性のグリオーマであり、細胞過多、多形、多核巨細胞、有糸分裂、壊死および浸潤などによって特徴付けられる。
【００１４】
本明細書においてＲａｓ活性化とは、Ｒａｓシグナル経路が活性化されることをいう。Ｒａｓタンパク質にはＨ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓが含まれる。正常なＲａｓタンパク質はＧＴＰ／ＧＤＰ結合性のＧＴＰａｓｅ活性を有する。ＲａｓはＧＴＰと結合すると活性型となりシグナル伝達が起こる。一方、それ自体のＧＴＰａｓｅ活性によってＧＴＰがＧＤＰに加水分解されると不活性型となる。例えば、Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子に変異が生じてＧＴＰａｓｅ活性が失われると、常に活性化した状態となり、トランスフォーミング活性を示すようになる（すなわち、ガン化する）。トランスフォーミング活性を生じるｒａｓ遺伝子における変異の例としては１２番目、１３番目、６１番目のアミノ酸の置換が挙げられる。本発明の目的には、上記活性化が達成されるのであれば任意の手段を使用することができる。例えば、６１番目のグルタミンがロイシンへ置換する変異を有するＨ−Ｒａｓ（ＨＲａｓＬ６１）（非特許文献１９、２０）をコードする遺伝子を任意の発現ベクターなどに組み込んで導入することにより、Ｒａｓ活性化を達成することができる。ＨＲａｓＬ６１のアミノ酸配列を配列番号１に、ＨＲａｓＬ６１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。Ｈ−Ｒａｓの６１番目のアミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドンＣＡＡをＣＴＡに置換し（配列番号２の１８１位〜１８３位）、それによってコードされるアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）となっている（配列番号１の６１位）。
【００１５】
本明細書においてｐ５３欠乏とは、ｐ５３タンパク質の作用が欠損または低下することをいう。正常なｐ５３遺伝子はガン抑制遺伝子として機能し、ｐ５３遺伝子が異常をきたすと細胞の増殖、ガンの形成を導くと考えられている。本発明の目的には、上記欠乏が達成されるのであれば任意の手段を使用することができる。具体的には、ｐ５３欠乏は、ｐ５３タンパク質をコードするｐ５３遺伝子自体の変異などに加えて、ｐ５３遺伝子の発現を制御する遺伝子や、ｐ５３タンパク質による制御を受ける遺伝子における変異などによって達成することができる。遺伝子破壊やＲＮＡｉなど公知の技術をこの目的に使用することができる。例えば、Ｅ１４．５ｐ５３（−／−）マウス（非特許文献２１）のようなｐ５３欠損動物由来の細胞を使用することによってｐ５３欠乏を達成することができる。
【００１６】
本明細書において正常細胞とは、正常な（すなわち、ガン化していない）細胞をいう。正常細胞は、好ましくは拘束性の細胞であり、より好ましくは神経系の細胞である。正常な神経系の細胞の例としては、神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、アストロサイト（ＡＳＴ）、オリゴデンドロサイトが挙げられる。好ましくは、神経幹細胞（ＮＳＣ）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が使用される。
【００１７】
本発明は、上記のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法、および候補物質を上記のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法を提供する。さらに本発明は、これらの方法によって得られたガン幹細胞標的化物質または抗ガン性物質を含むガン治療用医薬組成物を提供する。
【００１８】
化学療法など従来のガン治療法では、腫瘍形成能のない非ガン幹細胞の中に存在する少数のガン幹細胞が生き残り、ガンの再発を導いていた可能性があった。腫瘍形成能を有するガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定することができれば、この分子を使用してガン幹細胞を標的としたガン治療法を開発することができる。ガン幹細胞標的化物質には、抗体またはそのフラグメント、あるいは対応するレセプターまたはリガンドなどを利用することができる。また、候補物質（例えば、低分子薬剤）をガン幹細胞に添加してガン幹細胞に作用する物質を同定することができれば、ガン幹細胞に対して作用する従来よりも効果的な抗ガン剤を開発することができる。本発明の製造方法によれば、従来の表面マーカーを利用した濃縮法よりも容易に多量のガン幹細胞を高純度で得ることができるので、このようなスクリーニングが可能となる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、上記方法で得られたガン幹細胞標的化物質または抗ガン性物質を含む。医薬組成物はこれらの物質に加えて、任意の一般的に医薬組成物に使用される担体などの成分を含有してもよい。投与の経路、用量などは当業者により適宜決定される。また、従来の制ガン剤などと併用してもよい。
【００２０】
本発明は、上記のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガン診断方法を提供する。このようなタンパク質は、例えば各種表面マーカーに対する抗体を用いて同定することができる。また、このようなｍＲＮＡは、例えばＤＮＡマイクロアレイを用いて同定することができる。これらの方法は当該分野において公知である。ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出することによって、自己再生能を有するガン幹細胞を特異的に検出することができ、それにより、より詳細なガンの診断が可能となる。タンパク質の検出には抗体またはそのフラグメント、あるいは対応するレセプターまたはリガンドなどを利用することができる。また、ｍＲＮＡの検出には核酸プローブとのハイブリダイゼーション、核酸増幅方法を用いた核酸の増幅、これらの組み合わせなどを使用することができる。
【００２１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
動物および化学物質
動物を理化学研究所発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）変異マウス開発チームおよび日本エスエルシーから得た。遺伝子型分析をＰＣＲによって行った。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：ノックアウトアレル用５’プライマーは５’−ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号３）であり、野生型アレル用５’プライマーは５’−ＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴ−３’（配列番号４）であり、３’プライマーは５’−ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡ−３’（配列番号５）であった。サイクルパラメーターは、９４℃４５秒、６０℃１分および７２℃３分を３０サイクルであった（非特許文献２１）。化学物質および増殖因子は個別に示した以外はそれぞれＳｉｇｍａおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
【００２３】
細胞培養
ＮＳＣを胎生期１３．５日のｐ５３欠損マウスの終脳から調製し、ｂＦＧＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）中で拡大した（非特許文献２２）。免疫染色のために、球をポリＤ−リジン（ＰＤＬ、１５μｇ／ｍｌ）、フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コート８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上、ｂＦＧＦの存在下で、１日まで培養した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３週間培養して、ＡＳＴをＮＳＣから誘導した。ウシインスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（６０ｎｇ／ｍｌ）、プトレシン（１６ｍｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（４０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチルシステイン（６０ｍｇ／ｍｌ）、フォルスコリン（５ｍＭ）、ＰＤＧＦＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、０．２５％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有する無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＯＰＣ培地）中で培養して、ＯＰＣをＮＳＣから誘導した。誘導したＯＰＣを拡大し、逐次的免疫パニングによって精製した（非特許文献２３）。
【００２４】
トランスフェクション
ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣ中へのトランスフェクションを、製造業者（ＡＭＡＸＡ）の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ手順を使用して実施した。簡潔に記載すると、２×１０６個の細胞を、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰコントロールベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＬ６１のいずれか１０μｇを含むＭｏｕｓｅ ＮＳＣ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μｌ）中に懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスを使用して細胞をベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をそれぞれの至適化培地中で培養した。
【００２５】
免疫染色
以前に記載のように免疫染色を行った（非特許文献２２）。抗原を検出するために以下の抗体を使用した：マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ラット抗ネスチン（１：１０００；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ＭＡＰ２（ａ＋ｂ）（１：２００；Ａｂｃａｍ）、マウスＡ２Ｂ５（１：２；ハイブリドーマ上清；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、マウス抗ガラクトセレブロシド（ＧＣ）（１：２；ハイブリドーマ上清；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、ラット抗ＧＦＰ（１：１０００；ナカライテスク）、ウサギ抗ＣＤ１３３（１：５０；Ａｂｃａｍ）。抗体を、ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。全ての核を可視化するために、細胞を４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ）で対比染色した。
【００２６】
ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植
コントロール細胞およびトランスフェクト細胞を５μｌの培養培地中に懸濁し、５〜８週齢雌性ヌードマウスの脳に、１０％ペントバルビタールで麻酔した後に注入した。注入点は定位的にラムダの前方２ｍｍ、矢状縫合の側方２ｍｍおよびマウス脳の深さ５ｍｍであった。
【００２７】
脳の固定および組織病理学
切開したマウスの脳を４％パラホルムアルデヒド中４℃で一晩固定した。固定後、脳をＰＢＳ中１２〜１８％スクロースを用いて凍結保護し、ＯＣＴ化合物中に包埋した。冠状切片（１０μｍの厚さ）を大脳皮質から調製し、標準的な組織病理学的技法を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００２８】
フローサイトメトリー
細胞をプロミニン１（１：２００；Ａｂｃａｍ）について標識し、次いでＪＳＡＮセルソーター（Ｂａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、二重波長分析（４８８ｎｍ固相レーザーおよび６３８ｎｍ半導体レーザー）を使用して分析した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（すなわち、死滅）細胞を分析から除外した。
【００２９】
ベクター構築
マウスＨＲａｓの全長を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＦＩＮＮＺＹＭＥ、Ｅｓｐｏｏ）を製造業者の説明書に従って使用してＲＴ−ＰＣＲによりマウス神経幹細胞から増幅し、ｐＤｒｉｖｅベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中にクローン化した。ＰＣＲによりコドン６１のグルタミンをロイシンに置換してＨＲａｓＬ６１を得た。ヌクレオチド配列をＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）およびＡＢＩシーケンサー（ｍｏｄｅｌ３１３０ｘｌ）を使用して確認した。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：マウスＨＲａｓの全長用：５’プライマー、５’−ＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号６）、３’プライマー、５’−ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号７）；ＨＲａｓＬ６１用：５’プライマー、５’−ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡ−３’（配列番号８）、３’プライマー、５’−ＴＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号９）。
【００３０】
増殖アッセイ
２０００個の細胞を、１００μｌの培養培地を用いて、９６ウェルプレートの各ウェル中で培養した。細胞増殖を検討するためにＷＳＴ−１アッセイを以前に記載のように実施した（非特許文献３２）。すなわち、ＷＳＴ−１（同仁化学研究所）およびＰＭＳ（同仁化学研究所）の混合物１０μｌを培養０日目、２または３日目、および４日目に各ウェルに添加した。細胞を１時間インキュベートし、生存細胞をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により吸光スペクトル５９５ｎｍで定量した。
【００３１】
ソフトアガーアッセイ
トランスフェクトした細胞が足場非依存性に増殖できるかどうかを検討するためにソフトアガーアッセイを実施した。トランスフェクト細胞を至適化培地を含有する０．３％トップアガー中に懸濁し、同じ培地を含有するボトムアガー上に重層した。トップアガーが凝固した後、培養培地をアガー上に添加し、細胞を２０日間３日毎に培地を交換しながら培養した。次いで、プレートを０．００５％クリスタルバイオレットで１時間室温で染色した。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを以前に記載のように実施した（非特許文献３３）。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５％）をｏｌｉｇｏ１、ｏｌｉｇｏ２、コンタクチン１、ｓｏｘ８およびネスチン用の反応混合物に添加した。サイクルパラメーターは、９４℃２０秒、５８℃４０秒および７２℃４５秒を３５サイクルであった。ｇａｐｄｈについては、サイクルパラメーターは、９４℃１５秒、５３℃３０秒および７２℃９０秒を２２サイクルであった。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：外因性ｈｒａｓ用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１０）、３’プライマー、５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１１）；ｓ１００ａ６用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）、３’プライマー、５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１３）；ｐｒｏｍ１用：５’プライマー、５’−ＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１４）、３’プライマー、５’−ＧＧＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１５）；コンタクチン１用：５’プライマー、５’−ＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号１６）、３’プライマー、５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号１７）；ｍｂｐ用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴ−３’（配列番号１８）、３’プライマー、５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号１９）；ｐｌｐ用、５’プライマー、５’−ＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）、３’プライマー、５’−ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号２１）；ｓｏｘ８用、５’プライマー、５’−ＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２２）、３’プライマー、５’−ＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＴ−３’（配列番号２３）。ネスチン、ｍｕｓａｓｈｉ１、ｏｌｉｇｏ１、ｏｌｉｇｏ２、およびｇａｐｄｈ用のプライマーは以前に記載したとおりである（非特許文献２２、３３）。
【００３３】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ処理
５μｇの全ＲＮＡをインビトロ転写（ＩＶＴ）によるビオチン標識のためにＯｎｅ−Ｃｙｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ手順に供した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。次いで、ｃＲＮＡを断片化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に製造業者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。マイクロアレイ画像データをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて処理して、ＣＥＬデータを得た。次いで、ＣＥＬデータをｄＣｈｉｐソフトウエアを用いた分析に供した（非特許文献３４）。これにより多重データセットの正規化および処理が同時に行われる。データをそれぞれの群内で、プログラムの省略時設定に従って正規化した。統計的検定を２および３試料比較についてそれぞれｅＢａｙｅｓ法（非特許文献３５）およびＡＮＯＶＡによって検討した。「ＦＤＲ（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）」と呼ばれる量の外延であるｑ値を、有意性のゲノム規模の検定のための有意性の尺度として検討した（非特許文献３６、３７）。
【００３４】
実施例１
胎性期１３．５日（Ｅ１３．５）のｐ５３（−／−）マウス（非特許文献２１）の脳から細胞を分離し、神経上皮細胞をｂＦＧＦおよびＥＧＦを含むＮＳＣ培地中で拡大した（非特許文献２２）。この条件下で９５％以上の細胞がネスチン（良く知られたＮＳＣマーカー）陽性であった（図１ａ左パネルおよび図１ｂ）。
【００３５】
ＡＳＴの分化を誘導するために、ＮＳＣを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で３週間以上培養した。その結果、細胞の９８％が、ネスチン免疫反応性を失っており、ＡＳＴのマーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について免疫染色された（図１ａ中央パネルおよび図１ｂ）。
【００３６】
ＯＰＣの成長を誘導するために、ＮＳＣをＰＤＧＦの存在下かつｂＦＧＦおよびＥＧＦの非存在下で２週間以上培養し、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトを標識するＯ４モノクローナル抗体を用いてＯＰＣを免疫精製した（非特許文献２３）。これらの細胞の９５％がＡ２Ｂ５（ＯＰＣのマーカー）陽性であり、９８％がネスチン陽性であった（図１ａ右パネルおよび図１ｂ）。ＰＤＧＦを除去することによって、精製したＯＰＣの９０％以上においてガラクトセレブロシド（ＧＣ）陽性オリゴデンドロサイトへの分化が誘導された。このことは、ＯＰＣの純度を示す。
【００３７】
次に、コントロールベクター（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（コドン６１においてグルタミンがロイシンに置換されたガン化ＨＲａｓ（非特許文献１８、１９）およびＧＦＰの両方をコードする）を用いて種々の細胞集団をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を２〜３週間培養し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによって精製した。
【００３８】
次いで、これらのＧＦＰ陽性トランスフェクト細胞をネスチン、Ａ２Ｂ５、ＧＦＡＰ、ＧＣおよびＭＡＰ２（神経マーカー）について免疫標識した。コントロールベクタートランスフェクトＮＳＣ（ＮＳＣ−Ｃ）の９９％およびＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＮＳＣ（ＮＳＣ−Ｌ６１）の５１％がネスチンについて標識された。ＮＳＣ−Ｃの６％およびＮＳＣ−Ｌ６１の５％がＡ２Ｂ５陽性であった。ＮＳＣ−Ｃの３４％はＧＦＡＰについても標識されたが、ＮＳＣ−Ｌ６１で標識されたのは５％未満であった。ＮＳＣ−ＣおよびＮＳＣ−Ｌ６１の３％未満がＧＣまたはＭＡＰ２について陽性であった（図１ｃ、ｄ、図５）。１０％ＦＣＳ中で培養した場合、コントロールベクタートランスフェクトＡＳＴ（ＡＳＴ−Ｃ）またはＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＡＳＴ（ＡＳＴ−Ｌ６１）はＧＦＡＰ免疫反応性を失ったが、分化アストロサイトの代表的な形態的特徴を保持した（図１ｃ、ｄ、図６）。このことは、ｐ５３（−／−）アストロサイトにおけるＧＦＡＰ発現の喪失がＦＣＳ中での継代中に進行するという以前の知見と一致する（非特許文献２４）。さらに、ＡＳＴ−Ｃの４３％およびＡＳＴ−Ｌ６１の５０％はネスチンについて標識されたが他のいずれのマーカーについても陽性ではなかった。コントロールベクタートランスフェクトＯＰＣ（ＯＰＣ−Ｃ）またはＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＯＰＣ（ＯＰＣ−Ｌ６１）の９８％以上がネスチン陽性であった（図１ｃ、ｄ、図７）。ＯＰＣ−Ｃの９５％および３５％がそれぞれＡ２Ｂ５およびＧＣについて標識され、一方ＯＰＣ−Ｌ６１の５１％および９０％はそれぞれＡ２Ｂ５およびＧＣについて陽性であった。ＯＰＣ−ＣまたはＯＰＣ−Ｌ６１は、他のいずれのマーカーについても標識されなかった。トランスフェクトしたオリゴデンドロサイトは増殖せず、２週間以内に死滅した。これらのデータは、ＯＰＣ−Ｌ６１はその本来の表現型を維持し、一方ＮＳＣ−Ｌ６１およびＡＳＴ−Ｌ６１はそれらの特異的抗原マーカーの発現を部分的に失ったことを示す。
【００３９】
実施例２
次に、Ｒａｓ活性化がＮＳＣ、ＡＳＴまたはＯＰＣのトランスフォーメーションを誘導し得るかどうかを検討した。細胞の増殖および生存率を測定するＷＳＴ−１アッセイを使用して、Ｒａｓ活性化が全てのトランスフェクト細胞の増殖を有意に促進することが見出された（図２ａ）。さらに、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方はソフトアガーにおいてコロニーを形成するが、ＡＳＴ−Ｌ６１はコロニーを形成しないことが見出された（図８）。これらの知見から、Ｒａｓ活性化とｐ５３欠乏との組み合わせがＮＳＣおよびＯＰＣをトランスフォームし得るがＡＳＴをトランスフォームしないことが示唆された。
【００４０】
これらのトランスフェクト細胞の腫瘍形成能およびＣＳＣの頻度を調べるために、１０〜１，０００個のトランスフェクト細胞をヌードマウスの脳に注入した。１，０００個のＮＳＣ−Ｌ６１または１，０００個のＯＰＣ−Ｌ６１のいずれかを投与した全てのマウスは３０日以内に脳腫瘍で死亡し、一方１，０００個のＡＳＴ−Ｌ６１、１０５個のＮＳＣ−Ｃ、１０５個のＡＳＴ−Ｃまたは１０５個のＯＰＣ−Ｃを注入したマウスは、脳腫瘍形成の証拠を示さなかった（図２ｂ）。さらに、１００個のＮＳＣ−Ｌ６１を注入したマウスの７匹中５匹および１０個のＮＳＣ−Ｌ６１を注入したマウスの６匹中３匹が脳腫瘍を形成した。このことは、ＮＳＣ−Ｌ６１のほぼ２０個中１個がＣＳＣであることを示唆する（図２ｂ左）。ＯＰＣ−Ｌ６１の場合、１００個の細胞を注入したマウスの全て（５匹中５匹）および１０個の細胞を注入したマウスの４匹中３匹が脳腫瘍を有し、死亡した。このことは、ＯＰＣ−Ｌ６１の４０個中３個がＣＳＣであることを示唆する（図２ｂ中央）。
【００４１】
実施例３
ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の性質を決定するために、その腫瘍の病理組織学を検討した。脳を固定し、凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で、またはトランスフェクト細胞を同定するためにＧＦＰについて、染色した。
【００４２】
図３ａおよび３ｅに示すように、腫瘍はＧＦＰ陽性細胞から構成されており、その多くは浸潤した隣接脳組織のようであった。Ｈ＆Ｅ染色よって、これらの腫瘍がヒト多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の特徴（細胞過多、多形、多核巨細胞、有糸分裂、壊死および隣接脳組織の浸潤を含む）を示すことが明らかになった（図３ｂ〜ｄ、ｆ〜ｈ）。
【００４３】
腫瘍をさらに特徴付けるために、腫瘍を分離し、分散した細胞をＧＦＰおよび神経マーカーの両方について直ちに免疫標識した（図３ｉ）。ＮＳＣ−Ｌ６１によって形成された腫瘍において、ＧＦＰ陽性細胞の９５％および２０％がそれぞれネスチンおよびＡ２Ｂ５について陽性であり、一方ＧＦＰ陽性細胞の１０％未満がＧＦＡＰ陽性またはＧＣ陽性であった。ＯＰＣ−Ｌ６１によって形成された腫瘍において、ＧＦＰ陽性細胞の９５％および９３％がそれぞれネスチン陽性およびＡ２Ｂ５陽性であった。２５％はＧＣ陽性でもあったが、５％未満はＧＦＡＰ陽性であった。これらの腫瘍のいずれにおいても、ＭＡＰ２陽性細胞はなかった。従って、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から形成された腫瘍はＮＳＣ、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトについてのマーカーを発現する細胞の混合物を含むことが示唆された。
【００４４】
実施例４
ＣＳＣを含む全ての幹細胞の主な特徴は無限自己再生能である。ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１がこの能力を有するかどうかを検討するために、１００個のＮＳＣ−Ｌ６１または１００個のＯＰＣ−Ｌ６１のいずれかによって形成された腫瘍由来の細胞を使用して連続移植実験を行った。初代腫瘍をマウスの脳から切除し、１００個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより精製し、第２のマウスの脳に再注入した。４週間後、これらのマウスの各々の３匹中３匹が、初代腫瘍の表現型に非常に類似した脳腫瘍を形成した（図９）。このことは、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１のインビボ自己再生能を示す。これらのデータは、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方が実質的な割合のグリオーマ幹細胞を含んでいることを示唆する。
【００４５】
ＮＳＣおよびＯＰＣのトランスフォーメーションの間に生じた遺伝子発現の変化を特徴付けるために、遺伝子発現プロファイリングを使用した。ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から全ＲＮＡを精製し、それらを増幅し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｕｒｉｎｅ ４３０Ａ ２．０マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズさせた。分析により、ＯＰＣ−Ｌ６１の遺伝子発現プロフィールはＮＳＣおよびＮＳＣ−Ｌ６１両方のものと非常に類似しているが、ＯＰＣのものとは異なることが示された（図４ａ）。ＯＰＣにおいて高度に発現している一群の遺伝子のＯＰＣ−Ｌ６１における発現の低下およびその逆が示された。このことは、ＯＰＣ−Ｌ６１へのトランスフォーメーションにおいてＯＰＣが遺伝子発現の包括的再プログラムを経たことを示唆する（図４ｂ）。次いで、ＯＰＣ−Ｌ６１がＮＳＣ特異的遺伝子の発現を獲得し、ＯＰＣ特異的遺伝子の発現を失ったかどうかをＲＴ−ＰＣＲによって試験した。図４ｃに示すように、幹細胞マーカーであるプロミニン１（ｐｒｏｍ１）およびｓ１００ａ６はＯＰＣ−Ｌ６１において発現されていたが、ＯＰＣにおいては発現されておらず、対照的にＯＰＣ−Ｌ６１はＯＰＣ特異的遺伝子（コンタクチン（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ）／Ｆ３、ｏｌｉｇ２、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｂｐ）およびプロテオリピドタンパク質（ｐｌｐ））の発現を失っていた。ｏｌｉｇｏ１およびｓｏｘ８（これらもまたＯＰＣ系列遺伝子である）の発現はＯＰＣ−Ｌ６１において有意に低下していた。これらの知見は、ＯＰＣ−Ｌ６１へのトランスフォーメーションの間に、ＯＰＣがＮＳＣ特異的遺伝子の発現を獲得し、ＯＰＣ特異的遺伝子の発現を失ったことを示唆す。
【００４６】
神経膠芽腫および髄芽腫由来のＣＤ１３３（ヒトＰｒｏｍ１）陽性ガン細胞において脳ＣＳＣが富化されていることの証拠が蓄積されている（非特許文献２５〜２９）。ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方はｐｒｏｍ１ ｍＲＮＡを高発現しているので（図４ｃ）、これらのトランスフォーマントにおけるＰｒｏｍ１陽性細胞の頻度を評価した。ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１をＰｒｏｍ１について標識し、それらをフローサイトメトリーによって分析した。ＮＳＣ−Ｌ６１の７６％およびＯＰＣ−Ｌ６１の４４％がＰｒｏｍ１陽性であり、一方ＮＳＣの３％およびＯＰＣの１％がＰｒｏｍ１陽性であった（図４ｄ）。このことは、Ｐｒｏｍ１がＣＳＣにおいて高発現しているという以前の知見と一致している。
【００４７】
本発明者らは、Ｒａｓ活性化とｐ５３欠乏との組み合わせによってＮＳＣおよびＯＰＣの両方を、遺伝子発現の包括的な変化を伴って神経膠芽腫細胞にトランスフォームすることができることを実証した。本発明者らの結果は、ガン化変異が特定化したグリア前駆細胞（ＯＰＣ）をＣＳＣにトランスフォームすることができることを示唆する。このことは、少なくともいくつかのヒト神経膠芽腫がＯＰＣから生じる可能性を示し、これはＬｉｇｏｎらの最近の知見と一致する（非特許文献３０）。現在の主な挑戦は、ヒト神経膠芽腫におけるＣＳＣを明白に同定してそれらを死滅させる方法を見出すことにある。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣの特徴付けを示す図である。ａ、ｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣを神経系列マーカーおよびＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）で免疫標識した。バー：１５μｍ。ｂ〜ｄ、非トランスフェクト細胞であるＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣ（ｂ）、コントロールベクタートランスフェクト細胞であるＮＳＣ−Ｃ、ＡＳＴ−ＣおよびＯＰＣ−Ｃ（ｃ）ならびにＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクト細胞であるＮＳＣ−Ｌ６１、ＡＳＴ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１（ｄ）における神経系列マーカー陽性細胞の割合を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。
【図１Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣの特徴付けを示す図である。
【図２】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ―Ｌ６１においては脳ＣＳＣが富化されているがＡＳＴ−Ｌ６１においては富化されていないことを示す図である。ａ、非トランスフェクト細胞（○）およびＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクト細胞（●）両方の増殖をＷＳＴ−１アッセイによって測定した。結果を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。ｂ、ＮＳＣ−Ｌ６１（左パネル）、ＯＰＣ−Ｌ６１（中央パネル）およびＡＳＴ−Ｌ６１（右パネル）の限界希釈物を感染させたマウスについての生存曲線。実験を少なくとも２回繰り返し、同様な結果を得た。
【図３Ａ】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の病理学的特徴を示す図である。ａ〜ｈ、ＮＳＣ−Ｌ６１誘導腫瘍（ａ〜ｄ）およびＯＰＣ−Ｌ６１誘導腫瘍（ｅ〜ｈ）を有する脳の切片。両方の腫瘍は、実質中への浸潤（ａ、ｅ）、壊死（ｂ、ｆ中の矢印）、細胞過多および血管過多（ｃ、ｇ）、多核巨細胞（ｄ、ｈ中の白矢印）および有糸分裂細胞（ｄ、ｈ中の黒矢印）を示す。これらの病理学的特徴は、ヒトＧＢＭに類似している。拡大率４０×（ｂ、ｆ）、２００×（ｃ、ｇ）および４００×（ｄ、ｈ）。ｉ、腫瘍中の神経系列マーカー陽性細胞の割合を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。
【図３Ｂ】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の病理学的特徴を示す図である。
【図４Ａ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。ａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｕｒｉｎｅ ４３０Ａ ２．０マイクロアレイを使用した階層クラスタリングは、ＯＰＣ−Ｌ６１がＮＳＣ−Ｌ６１に最も類似した遺伝子発現プロフィールを有することを示す。ｂ、ＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１において発現増加を示す遺伝子についての上位６０個のプローブセットを示す。ｃ、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１におけるＮＳＣおよびＯＰＣ特異的遺伝子の発現分析。ｄ、プロミニン１についてのＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１の免疫反応性をＦＡＣＳ分析によって示す。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【図４Ｂ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図４Ｃ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図４Ｄ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図５Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣの免疫反応性を示す図である。ＮＳＣをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図５Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣの免疫反応性を示す図である。
【図６Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＡＳＴの免疫反応性を示す図である。ＡＳＴをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図６Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＡＳＴの免疫反応性を示す図である。
【図７Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＯＰＣの免疫反応性を示す図である。ＯＰＣをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図７Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＯＰＣの免疫反応性を示す図である。
【図８】ソフトアガーにおけるＨＲａｓＬ６１トランスフェクト神経細胞についてのコロニー形成アッセイを示す図である。ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣをコントロールベクターまたはＨＲａｓＬ６１発現ベクターでトランスフェクトし、ソフトアガー中で２０日間培養した。次いで、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。
【図９】二次脳腫瘍が初代腫瘍に非常に類似していることを示す図である。ＮＳＣ−Ｌ６１（ａ）およびＯＰＣ−Ｌ６１（ｂ）によって生じた初代腫瘍を分離し、１，０００個のＧＦＰ陽性細胞を二次マウス脳に移植した。二次腫瘍のＨ＆Ｅ染色（右パネル）はヒトＧＢＭの特徴（壊死、細胞過多および血管過多、多核巨細胞（白矢印）および有糸分裂細胞（黒矢印）を含む）を示し、初代腫瘍に類似している（左パネル）。拡大率×２００。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
SEQ ID NO:3: 5’ primer for knockout allele
SEQ ID NO:4: 5’ primer for wild-type allele
SEQ ID NO:5: 3’ primer
SEQ ID NO:6: 5' primer for HRas
SEQ ID NO:7: 3' primer for HRas
SEQ ID NO:8: 5' primer for HRasL61
SEQ ID NO:9: 3' primer for HRasL61
SEQ ID NO:10: 5' primer for hras
SEQ ID NO:11: 3' primer for hras
SEQ ID NO:12: 5' primer for s100a6
SEQ ID NO:13: 3' primer for s100a6
SEQ ID NO:14: 5' primer for prom1
SEQ ID NO:15: 3' primer for prom1
SEQ ID NO:16: 5' primer for contactin
SEQ ID NO:17: 3' primer for contactin
SEQ ID NO:18: 5' primer for mbp
SEQ ID NO:19: 3' primer for mbp
SEQ ID NO:20: 5' primer for plp
SEQ ID NO:21: 3' primer for plp
SEQ ID NO:22: 5' primer for sox8
SEQ ID NO:23: 3' primer for sox8
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原理的には、ガン幹細胞（ＣＳＣ）は、正常組織幹細胞、またはガン化変異によって幹細胞の特徴を獲得した前駆細胞または分化細胞から生じ得る。ＣＳＣは自己再生して、腫瘍中の細胞の大部分を形成する増幅ガン細胞を連続的に生じる（非特許文献１０）。いくつかのオンコジーンおよびガン抑制遺伝子の変異が腫瘍形成に関与していることが示されているが、ＣＳＣの根源細胞と遺伝子変化の関係は、いくつかの白血病以外では未だに解明されていない（非特許文献１〜４）。本発明者らおよび他の研究者らは、適切な条件下で培養すると、特定化されたオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）およびアストロサイト（ＡＳＴ）が神経幹様細胞に復帰し得ることを示している（非特許文献１１〜１４）。これは、ＯＰＣおよびＡＳＴならびに神経幹細胞（ＮＳＣ）が脳ＣＳＣの根源細胞である可能性を示唆する。ｐ５３はヒトグリオーマを含むヒトガンにおいて最も頻繁に変異している腫瘍抑制遺伝子である（非特許文献１５）。またＲａｓ活性の上昇がヒトグリオーマおよびグリオーマ細胞株で報告されている（非特許文献１６）。さらに、ＡＳＴにおけるＲａｓ活性化とｐ５３欠乏の組み合わせにより、マウスにおいて悪性グリオーマが引き起こされ得ることが示されている（非特許文献１７〜２０）。しかし、これらの組み合わせが培養ＮＳＣ、ＯＰＣおよびＡＳＴのＣＳＣへのトランスフォーメーションを誘導し得るかどうかは知られていなかった。
【０００３】
上記のように、近年の進歩により、悪性腫瘍が無限自己複製し腫瘍形成能を有するＣＳＣを含んでいることが示された。最近、白血病幹細胞が造血幹細胞または拘束性前駆細胞のいずれかから生じ得ることが示されたが（非特許文献１〜４）、固形ガン中のＣＳＣが組織特異的幹細胞、拘束性前駆細胞または分化細胞から生じるかどうかは不明である。例えば、非特許文献３および４では、オンコジーンＭＬＬ−ＡＦ９を正常前駆細胞に導入することによって白血病幹細胞が得られることが記載されている。一方、固形ガンにおけるＣＳＣ研究では、脳腫瘍、乳ガン等にＣＳＣの存在が報告されている段階であり（非特許文献２５〜２９）、ＣＳＣの根源細胞や、ＣＳＣへのトランスフォーメーションに関与するオンコジーンについての研究は十分ではなく、有効なガン治療法の開発のためにより多くの知見を得ることが望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】Cozzio, A. et al. Similar MLL-associated leukemias arising from self-renewing stem cells and short-lived myeloid progenitors. Genes Dev. 17, 3029-3035 (2003).
【非特許文献２】Huntly, B. J. et al. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell 6, 587-596 (2004).
【非特許文献３】Krivtsov, A. V. et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature 442, 818-822 (2006).
【非特許文献４】Somervaille, T. C. & Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell 10, 257-268 (2006).
【非特許文献５】Louis, D. N. The p53 gene and protein in human brain tumors. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 11-21 (1994).
【非特許文献６】Bogler, O., Huang, H. J., Kleihues, P. & Cavenee, W. K. The p53 gene and its role in human brain tumors. Glia 15, 308-327 (1995).
【非特許文献７】Feldkamp, M. M., Lau, N. & Guha, A. Signal transduction pathways and their relevance in human astrocytomas. J. Neurooncol. 35, 223-248 (1997).
【非特許文献８】Ohgaki, H. et al. Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study. Cancer Res. 64, 6892-6899 (2004).
【非特許文献９】Hulleman, E. & Helin, K. Molecular mechanisms in gliomagenesis. Adv. Cancer Res. 94, 1-27 (2005).
【非特許文献１０】Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F. & Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 414, 105-111 (2001).
【非特許文献１１】Kondo, T. & Raff, M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipoteintial CNS stem cells. Science 289, 1754-1757 (2000).
【非特許文献１２】Laywell, E. D. et al. Identification of a multipotent astrocytic stem cell in the immature and adult mouse brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13889-13894 (2000).
【非特許文献１３】Belachew, S. et al. Postnatal NG2 proteoglycanexpressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
【非特許文献１４】Nunes, M. C. et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature Med. 9, 439-447 (2003).
【非特許文献１５】Rasheed, B. K. et al. Alterations of the TP53 gene in human gliomas. Cancer Res. 54, 1324-1330 (1994).
【非特許文献１６】Guha, A. et al. Proliferation of human malignant astrocytomas is dependent on Ras activation. Oncogene 15, 2755-2765 (1997).
【非特許文献１７】Reilly, K. M. et al. Nf1;Trp53 mutant mice develop glioblastoma with evidence of strain-specific effects. Nature Genet. 26, 109-113 (2000).
【非特許文献１８】Zhu, Y. et al. Early inactivation of p53 tumor suppressor gene cooperating with NF1 loss induces malignant astrocytoma. Cancer Cell 8, 119-130 (2005).
【非特許文献１９】Bizub, D., Blair, D., Alvord, G. & Skalka, A. M. Correlation between H-ras p21TLeu61 protein content and tumorigenicity of NIH3T3 cells. Oncogene 3, 443-448 (1988).
【非特許文献２０】Barnett, S.C. & Crouch, D. H. The effect of oncogenes on the growth and differentiation of oligodendrocyte type 2 astrocyte progenitor cells. Cell Growth Differ. 6, 69-80 (1995).
【非特許文献２１】Tsukada, T., et al. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene 8, 3313-3322 (1993).
【非特許文献２２】Kondo, T. & Raff, M. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes Dev. 18, 2963-2972 (2004).
【非特許文献２３】Wang, S. et al. A role for the helix-loop-helix protein Id2 in the control of oligodendrocyte development. Neuron 29, 603-614 (2001).
【非特許文献２４】Bogler, O., Huang, H. J. & Cavenee, W. K. Loss of wild-type p53 bestows a growth advantage on primary cortical astrocytes and facilitates their in vitro transformation. Cancer Res. 55, 2746-2751 (1995).
【非特許文献２５】Singh, S. K. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396-401 (2004).
【非特許文献２６】Galli, R. et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res 64, 7011-7021 (2004).
【非特許文献２７】Bao, S. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444, 756-760 (2006).
【非特許文献２８】Piccirillo, S. G. et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature 444, 761-765 (2006).
【非特許文献２９】Hambardzumyan, D., Squatrito, M. & Holland, E. C. Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors. Cancer Cell 10, 454-456 (2006).
【非特許文献３０】Ligon, K. L. et al. Olig2-Regulated Lineage-Restricted Pathway Controls Replication Competence in Neural Stem Cells and Malignant Glioma. Neuron 53, 503-517 (2007).
【非特許文献３１】Al-Hajj, M. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3983-3988 (2003)
【非特許文献３２】Kawahara, A., et al. Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with death domain. J. Cell Biol. 143, 1353-60 (1998).
【非特許文献３３】Kondo, T. & Raff, M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipoteintial CNS stem cells. Science 289, 1754-1757 (2000).
【非特許文献３４】Li, C. & Wong, W. H. Model-based analysis of oligonucleotide arrays: expression index computation and outlier detection Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 3136 (2001).
【非特許文献３５】Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 3, article3 (2004).
【非特許文献３６】Srorey, J. D. A direct approach to false discovery rates. J. R. Satist. Soc. B 64, part3, 479-498 (2002).
【非特許文献３７】Storey, J. D. & Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 9440-9445 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｒａｓシグナル経路の活性化およびｐ５３の抑制（これらは、ヒトグリオーマにおいて頻繁に生じる（非特許文献５〜９））を神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および分化アストロサイト（ＡＳＴ）において同時に行うことによってグリオーマに関する上記課題に取り組んだ。本発明者らは、ＯＰＣおよびＮＳＣの両方が、これらの条件下で広範な遺伝子発現の再プログラムを伴ってグリオーマ幹細胞にトランスフォームするがＡＳＴはそうではないことを示した。３つ全ての細胞型は増殖促進を示したが、ヌードマウスの脳へ移植したところ、ＮＳＣおよびＯＰＣのみが神経膠芽腫を形成した。これらの知見はヒトにおいて神経膠芽腫がＯＰＣまたはＮＳＣのいずれかから生じる可能性を示唆する。これらの知見に基づき、本発明は完成した。
【０００７】
本発明は、以下に関する：
［１］正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法；
［２］ガン幹細胞がグリオーマ幹細胞である、［１］の方法；
［３］正常細胞が神経幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞である、［１］または［２］の方法；
［４］Ｒａｓ活性化がＨＲａｓＬ６１遺伝子の導入によって達成される、［１］〜［３］のいずれかの方法；
［５］ｐ５３欠乏がｐ５３欠損動物由来の細胞の使用によって達成される、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］［１］〜［５］のいずれかの方法により製造されたガン幹細胞；
［７］［６］のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法；
［８］［７］の方法によって得られたガン幹細胞標的化物質を含む、ガン治療用医薬組成物；
［９］候補物質を［６］のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法；
［１０］［９］の方法によって得られた抗ガン性物質を含む、ガン治療用医薬組成物；
［１１］［６］のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガンの診断方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法ならびに当該方法により製造されたガン幹細胞を提供する。
【００１０】
本明細書において幹細胞とは、自己再生能を有する細胞のことをいう。幹細胞のうち正常細胞へ分化する能力を有する幹細胞を正常幹細胞といい、ガン細胞へ分化する能力を有する幹細胞をガン幹細胞という。ガン幹細胞には任意のガン細胞に分化するものが含まれる。ガンは例えば固形ガン、好ましくはグリオーマである。
【００１１】
ガン幹細胞の自己再生能は、例えば、ガン幹細胞の移植によって形成された腫瘍を動物から切除し、その細胞を別の動物に再移植した際に同様に腫瘍を形成するかどうかを調べる連続移植実験によって確認することができる。
【００１２】
本発明の製造方法によって得られるガン幹細胞を含む細胞集団は、ヌードマウスに移植した場合、例えば１００個、好ましくは５０個、より好ましくは２０個、さらに好ましくは１０個の細胞によって腫瘍を形成する能力を有する。あるいは、本発明の製造方法によって得られたガン幹細胞を含む細胞集団は、例えば１００個中１個、好ましくは５０個中１個、より好ましくは２０個中１個、さらに好ましくは１０個中１個のガン幹細胞を含む。
【００１３】
グリオーマ（神経膠腫）を生じるガン幹細胞をグリオーマ幹細胞という。グリオーマは脳実質の神経外胚葉組織から発生した腫瘍の総称であって、アストロサイトーマ（星細胞腫）、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽種、脳室上衣腫、乏突起膠腫、脈絡叢乳頭腫などを含む。この中でＧＢＭは最も悪性のグリオーマであり、細胞過多、多形、多核巨細胞、有糸分裂、壊死および浸潤などによって特徴付けられる。
【００１４】
本明細書においてＲａｓ活性化とは、Ｒａｓシグナル経路が活性化されることをいう。Ｒａｓタンパク質にはＨ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓが含まれる。正常なＲａｓタンパク質はＧＴＰ／ＧＤＰ結合性のＧＴＰａｓｅ活性を有する。ＲａｓはＧＴＰと結合すると活性型となりシグナル伝達が起こる。一方、それ自体のＧＴＰａｓｅ活性によってＧＴＰがＧＤＰに加水分解されると不活性型となる。例えば、Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子に変異が生じてＧＴＰａｓｅ活性が失われると、常に活性化した状態となり、トランスフォーミング活性を示すようになる（すなわち、ガン化する）。トランスフォーミング活性を生じるｒａｓ遺伝子における変異の例としては１２番目、１３番目、６１番目のアミノ酸の置換が挙げられる。本発明の目的には、上記活性化が達成されるのであれば任意の手段を使用することができる。例えば、６１番目のグルタミンがロイシンへ置換する変異を有するＨ−Ｒａｓ（ＨＲａｓＬ６１）（非特許文献１９、２０）をコードする遺伝子を任意の発現ベクターなどに組み込んで導入することにより、Ｒａｓ活性化を達成することができる。ＨＲａｓＬ６１のアミノ酸配列を配列番号１に、ＨＲａｓＬ６１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。Ｈ−Ｒａｓの６１番目のアミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドンＣＡＡをＣＴＡに置換し（配列番号２の１８１位〜１８３位）、それによってコードされるアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）となっている（配列番号１の６１位）。
【００１５】
本明細書においてｐ５３欠乏とは、ｐ５３タンパク質の作用が欠損または低下することをいう。正常なｐ５３遺伝子はガン抑制遺伝子として機能し、ｐ５３遺伝子が異常をきたすと細胞の増殖、ガンの形成を導くと考えられている。本発明の目的には、上記欠乏が達成されるのであれば任意の手段を使用することができる。具体的には、ｐ５３欠乏は、ｐ５３タンパク質をコードするｐ５３遺伝子自体の変異などに加えて、ｐ５３遺伝子の発現を制御する遺伝子や、ｐ５３タンパク質による制御を受ける遺伝子における変異などによって達成することができる。遺伝子破壊やＲＮＡｉなど公知の技術をこの目的に使用することができる。例えば、Ｅ１４．５ｐ５３（−／−）マウス（非特許文献２１）のようなｐ５３欠損動物由来の細胞を使用することによってｐ５３欠乏を達成することができる。
【００１６】
本明細書において正常細胞とは、正常な（すなわち、ガン化していない）細胞をいう。正常細胞は、好ましくは拘束性の細胞であり、より好ましくは神経系の細胞である。正常な神経系の細胞の例としては、神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、アストロサイト（ＡＳＴ）、オリゴデンドロサイトが挙げられる。好ましくは、神経幹細胞（ＮＳＣ）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が使用される。
【００１７】
本発明は、上記のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法、および候補物質を上記のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法を提供する。さらに本発明は、これらの方法によって得られたガン幹細胞標的化物質または抗ガン性物質を含むガン治療用医薬組成物を提供する。
【００１８】
化学療法など従来のガン治療法では、腫瘍形成能のない非ガン幹細胞の中に存在する少数のガン幹細胞が生き残り、ガンの再発を導いていた可能性があった。腫瘍形成能を有するガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定することができれば、この分子を使用してガン幹細胞を標的としたガン治療法を開発することができる。ガン幹細胞標的化物質には、抗体またはそのフラグメント、あるいは対応するレセプターまたはリガンドなどを利用することができる。また、候補物質（例えば、低分子薬剤）をガン幹細胞に添加してガン幹細胞に作用する物質を同定することができれば、ガン幹細胞に対して作用する従来よりも効果的な抗ガン剤を開発することができる。本発明の製造方法によれば、従来の表面マーカーを利用した濃縮法よりも容易に多量のガン幹細胞を高純度で得ることができるので、このようなスクリーニングが可能となる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、上記方法で得られたガン幹細胞標的化物質または抗ガン性物質を含む。医薬組成物はこれらの物質に加えて、任意の一般的に医薬組成物に使用される担体などの成分を含有してもよい。投与の経路、用量などは当業者により適宜決定される。また、従来の制ガン剤などと併用してもよい。
【００２０】
本発明は、上記のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガン診断方法を提供する。このようなタンパク質は、例えば各種表面マーカーに対する抗体を用いて同定することができる。また、このようなｍＲＮＡは、例えばＤＮＡマイクロアレイを用いて同定することができる。これらの方法は当該分野において公知である。ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出することによって、自己再生能を有するガン幹細胞を特異的に検出することができ、それにより、より詳細なガンの診断が可能となる。タンパク質の検出には抗体またはそのフラグメント、あるいは対応するレセプターまたはリガンドなどを利用することができる。また、ｍＲＮＡの検出には核酸プローブとのハイブリダイゼーション、核酸増幅方法を用いた核酸の増幅、これらの組み合わせなどを使用することができる。
【００２１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
動物および化学物質
動物を理化学研究所発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）変異マウス開発チームおよび日本エスエルシーから得た。遺伝子型分析をＰＣＲによって行った。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：ノックアウトアレル用５’プライマーは５’−ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号３）であり、野生型アレル用５’プライマーは５’−ＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴ−３’（配列番号４）であり、３’プライマーは５’−ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡ−３’（配列番号５）であった。サイクルパラメーターは、９４℃４５秒、６０℃１分および７２℃３分を３０サイクルであった（非特許文献２１）。化学物質および増殖因子は個別に示した以外はそれぞれＳｉｇｍａおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
【００２３】
細胞培養
ＮＳＣを胎生期１３．５日のｐ５３欠損マウスの終脳から調製し、ｂＦＧＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）中で拡大した（非特許文献２２）。免疫染色のために、球をポリＤ−リジン（ＰＤＬ、１５μｇ／ｍｌ）、フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コート８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上、ｂＦＧＦの存在下で、１日まで培養した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３週間培養して、ＡＳＴをＮＳＣから誘導した。ウシインスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（６０ｎｇ／ｍｌ）、プトレシン（１６ｍｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（４０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチルシステイン（６０ｍｇ／ｍｌ）、フォルスコリン（５ｍＭ）、ＰＤＧＦＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、０．２５％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有する無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＯＰＣ培地）中で培養して、ＯＰＣをＮＳＣから誘導した。誘導したＯＰＣを拡大し、逐次的免疫パニングによって精製した（非特許文献２３）。
【００２４】
トランスフェクション
ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣ中へのトランスフェクションを、製造業者（ＡＭＡＸＡ）の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ手順を使用して実施した。簡潔に記載すると、２×１０６個の細胞を、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰコントロールベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＬ６１のいずれか１０μｇを含むＭｏｕｓｅ ＮＳＣ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μｌ）中に懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスを使用して細胞をベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をそれぞれの至適化培地中で培養した。
【００２５】
免疫染色
以前に記載のように免疫染色を行った（非特許文献２２）。抗原を検出するために以下の抗体を使用した：マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ラット抗ネスチン（１：１０００；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ＭＡＰ２（ａ＋ｂ）（１：２００；Ａｂｃａｍ）、マウスＡ２Ｂ５（１：２；ハイブリドーマ上清；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、マウス抗ガラクトセレブロシド（ＧＣ）（１：２；ハイブリドーマ上清；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、ラット抗ＧＦＰ（１：１０００；ナカライテスク）、ウサギ抗ＣＤ１３３（１：５０；Ａｂｃａｍ）。抗体を、ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ４８８（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。全ての核を可視化するために、細胞を４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ）で対比染色した。
【００２６】
ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植
コントロール細胞およびトランスフェクト細胞を５μｌの培養培地中に懸濁し、５〜８週齢雌性ヌードマウスの脳に、１０％ペントバルビタールで麻酔した後に注入した。注入点は定位的にラムダの前方２ｍｍ、矢状縫合の側方２ｍｍおよびマウス脳の深さ５ｍｍであった。
【００２７】
脳の固定および組織病理学
切開したマウスの脳を４％パラホルムアルデヒド中４℃で一晩固定した。固定後、脳をＰＢＳ中１２〜１８％スクロースを用いて凍結保護し、ＯＣＴ化合物中に包埋した。冠状切片（１０μｍの厚さ）を大脳皮質から調製し、標準的な組織病理学的技法を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００２８】
フローサイトメトリー
細胞をプロミニン１（１：２００；Ａｂｃａｍ）について標識し、次いでＪＳＡＮセルソーター（Ｂａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、二重波長分析（４８８ｎｍ固相レーザーおよび６３８ｎｍ半導体レーザー）を使用して分析した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（すなわち、死滅）細胞を分析から除外した。
【００２９】
ベクター構築
マウスＨＲａｓの全長を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＦＩＮＮＺＹＭＥ、Ｅｓｐｏｏ）を製造業者の説明書に従って使用してＲＴ−ＰＣＲによりマウス神経幹細胞から増幅し、ｐＤｒｉｖｅベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中にクローン化した。ＰＣＲによりコドン６１のグルタミンをロイシンに置換してＨＲａｓＬ６１を得た。ヌクレオチド配列をＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）およびＡＢＩシーケンサー（ｍｏｄｅｌ３１３０ｘｌ）を使用して確認した。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：マウスＨＲａｓの全長用：５’プライマー、５’−ＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号６）、３’プライマー、５’−ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号７）；ＨＲａｓＬ６１用：５’プライマー、５’−ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡ−３’（配列番号８）、３’プライマー、５’−ＴＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号９）。
【００３０】
増殖アッセイ
２０００個の細胞を、１００μｌの培養培地を用いて、９６ウェルプレートの各ウェル中で培養した。細胞増殖を検討するためにＷＳＴ−１アッセイを以前に記載のように実施した（非特許文献３２）。すなわち、ＷＳＴ−１（同仁化学研究所）およびＰＭＳ（同仁化学研究所）の混合物１０μｌを培養０日目、２または３日目、および４日目に各ウェルに添加した。細胞を１時間インキュベートし、生存細胞をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により吸光スペクトル５９５ｎｍで定量した。
【００３１】
ソフトアガーアッセイ
トランスフェクトした細胞が足場非依存性に増殖できるかどうかを検討するためにソフトアガーアッセイを実施した。トランスフェクト細胞を至適化培地を含有する０．３％トップアガー中に懸濁し、同じ培地を含有するボトムアガー上に重層した。トップアガーが凝固した後、培養培地をアガー上に添加し、細胞を２０日間３日毎に培地を交換しながら培養した。次いで、プレートを０．００５％クリスタルバイオレットで１時間室温で染色した。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを以前に記載のように実施した（非特許文献３３）。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５％）をｏｌｉｇｏ１、ｏｌｉｇｏ２、コンタクチン１、ｓｏｘ８およびネスチン用の反応混合物に添加した。サイクルパラメーターは、９４℃２０秒、５８℃４０秒および７２℃４５秒を３５サイクルであった。ｇａｐｄｈについては、サイクルパラメーターは、９４℃１５秒、５３℃３０秒および７２℃９０秒を２２サイクルであった。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：外因性ｈｒａｓ用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１０）、３’プライマー、５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１１）；ｓ１００ａ６用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）、３’プライマー、５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１３）；ｐｒｏｍ１用：５’プライマー、５’−ＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１４）、３’プライマー、５’−ＧＧＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１５）；コンタクチン１用：５’プライマー、５’−ＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号１６）、３’プライマー、５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号１７）；ｍｂｐ用：５’プライマー、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴ−３’（配列番号１８）、３’プライマー、５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号１９）；ｐｌｐ用、５’プライマー、５’−ＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）、３’プライマー、５’−ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号２１）；ｓｏｘ８用、５’プライマー、５’−ＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２２）、３’プライマー、５’−ＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＴ−３’（配列番号２３）。ネスチン、ｍｕｓａｓｈｉ１、ｏｌｉｇｏ１、ｏｌｉｇｏ２、およびｇａｐｄｈ用のプライマーは以前に記載したとおりである（非特許文献２２、３３）。
【００３３】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ処理
５μｇの全ＲＮＡをインビトロ転写（ＩＶＴ）によるビオチン標識のためにＯｎｅ−Ｃｙｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ手順に供した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。次いで、ｃＲＮＡを断片化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に製造業者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。マイクロアレイ画像データをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて処理して、ＣＥＬデータを得た。次いで、ＣＥＬデータをｄＣｈｉｐソフトウエアを用いた分析に供した（非特許文献３４）。これにより多重データセットの正規化および処理が同時に行われる。データをそれぞれの群内で、プログラムの省略時設定に従って正規化した。統計的検定を２および３試料比較についてそれぞれｅＢａｙｅｓ法（非特許文献３５）およびＡＮＯＶＡによって検討した。「ＦＤＲ（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）」と呼ばれる量の外延であるｑ値を、有意性のゲノム規模の検定のための有意性の尺度として検討した（非特許文献３６、３７）。
【００３４】
実施例１
胎性期１３．５日（Ｅ１３．５）のｐ５３（−／−）マウス（非特許文献２１）の脳から細胞を分離し、神経上皮細胞をｂＦＧＦおよびＥＧＦを含むＮＳＣ培地中で拡大した（非特許文献２２）。この条件下で９５％以上の細胞がネスチン（良く知られたＮＳＣマーカー）陽性であった（図１ａ左パネルおよび図１ｂ）。
【００３５】
ＡＳＴの分化を誘導するために、ＮＳＣを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で３週間以上培養した。その結果、細胞の９８％が、ネスチン免疫反応性を失っており、ＡＳＴのマーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について免疫染色された（図１ａ中央パネルおよび図１ｂ）。
【００３６】
ＯＰＣの成長を誘導するために、ＮＳＣをＰＤＧＦの存在下かつｂＦＧＦおよびＥＧＦの非存在下で２週間以上培養し、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトを標識するＯ４モノクローナル抗体を用いてＯＰＣを免疫精製した（非特許文献２３）。これらの細胞の９５％がＡ２Ｂ５（ＯＰＣのマーカー）陽性であり、９８％がネスチン陽性であった（図１ａ右パネルおよび図１ｂ）。ＰＤＧＦを除去することによって、精製したＯＰＣの９０％以上においてガラクトセレブロシド（ＧＣ）陽性オリゴデンドロサイトへの分化が誘導された。このことは、ＯＰＣの純度を示す。
【００３７】
次に、コントロールベクター（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（コドン６１においてグルタミンがロイシンに置換されたガン化ＨＲａｓ（非特許文献１８、１９）およびＧＦＰの両方をコードする）を用いて種々の細胞集団をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を２〜３週間培養し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによって精製した。
【００３８】
次いで、これらのＧＦＰ陽性トランスフェクト細胞をネスチン、Ａ２Ｂ５、ＧＦＡＰ、ＧＣおよびＭＡＰ２（神経マーカー）について免疫標識した。コントロールベクタートランスフェクトＮＳＣ（ＮＳＣ−Ｃ）の９９％およびＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＮＳＣ（ＮＳＣ−Ｌ６１）の５１％がネスチンについて標識された。ＮＳＣ−Ｃの６％およびＮＳＣ−Ｌ６１の５％がＡ２Ｂ５陽性であった。ＮＳＣ−Ｃの３４％はＧＦＡＰについても標識されたが、ＮＳＣ−Ｌ６１で標識されたのは５％未満であった。ＮＳＣ−ＣおよびＮＳＣ−Ｌ６１の３％未満がＧＣまたはＭＡＰ２について陽性であった（図１ｃ、ｄ、図５）。１０％ＦＣＳ中で培養した場合、コントロールベクタートランスフェクトＡＳＴ（ＡＳＴ−Ｃ）またはＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＡＳＴ（ＡＳＴ−Ｌ６１）はＧＦＡＰ免疫反応性を失ったが、分化アストロサイトの代表的な形態的特徴を保持した（図１ｃ、ｄ、図６）。このことは、ｐ５３（−／−）アストロサイトにおけるＧＦＡＰ発現の喪失がＦＣＳ中での継代中に進行するという以前の知見と一致する（非特許文献２４）。さらに、ＡＳＴ−Ｃの４３％およびＡＳＴ−Ｌ６１の５０％はネスチンについて標識されたが他のいずれのマーカーについても陽性ではなかった。コントロールベクタートランスフェクトＯＰＣ（ＯＰＣ−Ｃ）またはＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクトＯＰＣ（ＯＰＣ−Ｌ６１）の９８％以上がネスチン陽性であった（図１ｃ、ｄ、図７）。ＯＰＣ−Ｃの９５％および３５％がそれぞれＡ２Ｂ５およびＧＣについて標識され、一方ＯＰＣ−Ｌ６１の５１％および９０％はそれぞれＡ２Ｂ５およびＧＣについて陽性であった。ＯＰＣ−ＣまたはＯＰＣ−Ｌ６１は、他のいずれのマーカーについても標識されなかった。トランスフェクトしたオリゴデンドロサイトは増殖せず、２週間以内に死滅した。これらのデータは、ＯＰＣ−Ｌ６１はその本来の表現型を維持し、一方ＮＳＣ−Ｌ６１およびＡＳＴ−Ｌ６１はそれらの特異的抗原マーカーの発現を部分的に失ったことを示す。
【００３９】
実施例２
次に、Ｒａｓ活性化がＮＳＣ、ＡＳＴまたはＯＰＣのトランスフォーメーションを誘導し得るかどうかを検討した。細胞の増殖および生存率を測定するＷＳＴ−１アッセイを使用して、Ｒａｓ活性化が全てのトランスフェクト細胞の増殖を有意に促進することが見出された（図２ａ）。さらに、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方はソフトアガーにおいてコロニーを形成するが、ＡＳＴ−Ｌ６１はコロニーを形成しないことが見出された（図８）。これらの知見から、Ｒａｓ活性化とｐ５３欠乏との組み合わせがＮＳＣおよびＯＰＣをトランスフォームし得るがＡＳＴをトランスフォームしないことが示唆された。
【００４０】
これらのトランスフェクト細胞の腫瘍形成能およびＣＳＣの頻度を調べるために、１０〜１，０００個のトランスフェクト細胞をヌードマウスの脳に注入した。１，０００個のＮＳＣ−Ｌ６１または１，０００個のＯＰＣ−Ｌ６１のいずれかを投与した全てのマウスは３０日以内に脳腫瘍で死亡し、一方１，０００個のＡＳＴ−Ｌ６１、１０５個のＮＳＣ−Ｃ、１０５個のＡＳＴ−Ｃまたは１０５個のＯＰＣ−Ｃを注入したマウスは、脳腫瘍形成の証拠を示さなかった（図２ｂ）。さらに、１００個のＮＳＣ−Ｌ６１を注入したマウスの７匹中５匹および１０個のＮＳＣ−Ｌ６１を注入したマウスの６匹中３匹が脳腫瘍を形成した。このことは、ＮＳＣ−Ｌ６１のほぼ２０個中１個がＣＳＣであることを示唆する（図２ｂ左）。ＯＰＣ−Ｌ６１の場合、１００個の細胞を注入したマウスの全て（５匹中５匹）および１０個の細胞を注入したマウスの４匹中３匹が脳腫瘍を有し、死亡した。このことは、ＯＰＣ−Ｌ６１の４０個中３個がＣＳＣであることを示唆する（図２ｂ中央）。
【００４１】
実施例３
ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の性質を決定するために、その腫瘍の病理組織学を検討した。脳を固定し、凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で、またはトランスフェクト細胞を同定するためにＧＦＰについて、染色した。
【００４２】
図３ａおよび３ｅに示すように、腫瘍はＧＦＰ陽性細胞から構成されており、その多くは浸潤した隣接脳組織のようであった。Ｈ＆Ｅ染色よって、これらの腫瘍がヒト多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の特徴（細胞過多、多形、多核巨細胞、有糸分裂、壊死および隣接脳組織の浸潤を含む）を示すことが明らかになった（図３ｂ〜ｄ、ｆ〜ｈ）。
【００４３】
腫瘍をさらに特徴付けるために、腫瘍を分離し、分散した細胞をＧＦＰおよび神経マーカーの両方について直ちに免疫標識した（図３ｉ）。ＮＳＣ−Ｌ６１によって形成された腫瘍において、ＧＦＰ陽性細胞の９５％および２０％がそれぞれネスチンおよびＡ２Ｂ５について陽性であり、一方ＧＦＰ陽性細胞の１０％未満がＧＦＡＰ陽性またはＧＣ陽性であった。ＯＰＣ−Ｌ６１によって形成された腫瘍において、ＧＦＰ陽性細胞の９５％および９３％がそれぞれネスチン陽性およびＡ２Ｂ５陽性であった。２５％はＧＣ陽性でもあったが、５％未満はＧＦＡＰ陽性であった。これらの腫瘍のいずれにおいても、ＭＡＰ２陽性細胞はなかった。従って、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から形成された腫瘍はＮＳＣ、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトについてのマーカーを発現する細胞の混合物を含むことが示唆された。
【００４４】
実施例４
ＣＳＣを含む全ての幹細胞の主な特徴は無限自己再生能である。ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１がこの能力を有するかどうかを検討するために、１００個のＮＳＣ−Ｌ６１または１００個のＯＰＣ−Ｌ６１のいずれかによって形成された腫瘍由来の細胞を使用して連続移植実験を行った。初代腫瘍をマウスの脳から切除し、１００個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより精製し、第２のマウスの脳に再注入した。４週間後、これらのマウスの各々の３匹中３匹が、初代腫瘍の表現型に非常に類似した脳腫瘍を形成した（図９）。このことは、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１のインビボ自己再生能を示す。これらのデータは、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方が実質的な割合のグリオーマ幹細胞を含んでいることを示唆する。
【００４５】
ＮＳＣおよびＯＰＣのトランスフォーメーションの間に生じた遺伝子発現の変化を特徴付けるために、遺伝子発現プロファイリングを使用した。ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から全ＲＮＡを精製し、それらを増幅し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｕｒｉｎｅ ４３０Ａ ２．０マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズさせた。分析により、ＯＰＣ−Ｌ６１の遺伝子発現プロフィールはＮＳＣおよびＮＳＣ−Ｌ６１両方のものと非常に類似しているが、ＯＰＣのものとは異なることが示された（図４ａ）。ＯＰＣにおいて高度に発現している一群の遺伝子のＯＰＣ−Ｌ６１における発現の低下およびその逆が示された。このことは、ＯＰＣ−Ｌ６１へのトランスフォーメーションにおいてＯＰＣが遺伝子発現の包括的再プログラムを経たことを示唆する（図４ｂ）。次いで、ＯＰＣ−Ｌ６１がＮＳＣ特異的遺伝子の発現を獲得し、ＯＰＣ特異的遺伝子の発現を失ったかどうかをＲＴ−ＰＣＲによって試験した。図４ｃに示すように、幹細胞マーカーであるプロミニン１（ｐｒｏｍ１）およびｓ１００ａ６はＯＰＣ−Ｌ６１において発現されていたが、ＯＰＣにおいては発現されておらず、対照的にＯＰＣ−Ｌ６１はＯＰＣ特異的遺伝子（コンタクチン（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ）／Ｆ３、ｏｌｉｇ２、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｂｐ）およびプロテオリピドタンパク質（ｐｌｐ））の発現を失っていた。ｏｌｉｇｏ１およびｓｏｘ８（これらもまたＯＰＣ系列遺伝子である）の発現はＯＰＣ−Ｌ６１において有意に低下していた。これらの知見は、ＯＰＣ−Ｌ６１へのトランスフォーメーションの間に、ＯＰＣがＮＳＣ特異的遺伝子の発現を獲得し、ＯＰＣ特異的遺伝子の発現を失ったことを示唆す。
【００４６】
神経膠芽腫および髄芽腫由来のＣＤ１３３（ヒトＰｒｏｍ１）陽性ガン細胞において脳ＣＳＣが富化されていることの証拠が蓄積されている（非特許文献２５〜２９）。ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１の両方はｐｒｏｍ１ ｍＲＮＡを高発現しているので（図４ｃ）、これらのトランスフォーマントにおけるＰｒｏｍ１陽性細胞の頻度を評価した。ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１をＰｒｏｍ１について標識し、それらをフローサイトメトリーによって分析した。ＮＳＣ−Ｌ６１の７６％およびＯＰＣ−Ｌ６１の４４％がＰｒｏｍ１陽性であり、一方ＮＳＣの３％およびＯＰＣの１％がＰｒｏｍ１陽性であった（図４ｄ）。このことは、Ｐｒｏｍ１がＣＳＣにおいて高発現しているという以前の知見と一致している。
【００４７】
本発明者らは、Ｒａｓ活性化とｐ５３欠乏との組み合わせによってＮＳＣおよびＯＰＣの両方を、遺伝子発現の包括的な変化を伴って神経膠芽腫細胞にトランスフォームすることができることを実証した。本発明者らの結果は、ガン化変異が特定化したグリア前駆細胞（ＯＰＣ）をＣＳＣにトランスフォームすることができることを示唆する。このことは、少なくともいくつかのヒト神経膠芽腫がＯＰＣから生じる可能性を示し、これはＬｉｇｏｎらの最近の知見と一致する（非特許文献３０）。現在の主な挑戦は、ヒト神経膠芽腫におけるＣＳＣを明白に同定してそれらを死滅させる方法を見出すことにある。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、ガン幹細胞の製造方法、当該方法によって製造されたガン幹細胞、当該ガン幹細胞を用いたガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法および抗ガン性物質のスクリーニング方法、当該方法によって得られる物質を含む医薬組成物、ならびに当該ガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含するガンの診断方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣの特徴付けを示す図である。ａ、ｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣを神経系列マーカーおよびＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）で免疫標識した。バー：１５μｍ。ｂ〜ｄ、非トランスフェクト細胞であるＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣ（ｂ）、コントロールベクタートランスフェクト細胞であるＮＳＣ−Ｃ、ＡＳＴ−ＣおよびＯＰＣ−Ｃ（ｃ）ならびにＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクト細胞であるＮＳＣ−Ｌ６１、ＡＳＴ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１（ｄ）における神経系列マーカー陽性細胞の割合を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。
【図１Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣの特徴付けを示す図である。
【図２】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ―Ｌ６１においては脳ＣＳＣが富化されているがＡＳＴ−Ｌ６１においては富化されていないことを示す図である。ａ、非トランスフェクト細胞（○）およびＨＲａｓＬ６１ベクタートランスフェクト細胞（●）両方の増殖をＷＳＴ−１アッセイによって測定した。結果を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。ｂ、ＮＳＣ−Ｌ６１（左パネル）、ＯＰＣ−Ｌ６１（中央パネル）およびＡＳＴ−Ｌ６１（右パネル）の限界希釈物を感染させたマウスについての生存曲線。実験を少なくとも２回繰り返し、同様な結果を得た。
【図３Ａ】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の病理学的特徴を示す図である。ａ〜ｈ、ＮＳＣ−Ｌ６１誘導腫瘍（ａ〜ｄ）およびＯＰＣ−Ｌ６１誘導腫瘍（ｅ〜ｈ）を有する脳の切片。両方の腫瘍は、実質中への浸潤（ａ、ｅ）、壊死（ｂ、ｆ中の矢印）、細胞過多および血管過多（ｃ、ｇ）、多核巨細胞（ｄ、ｈ中の白矢印）および有糸分裂細胞（ｄ、ｈ中の黒矢印）を示す。これらの病理学的特徴は、ヒトＧＢＭに類似している。拡大率４０×（ｂ、ｆ）、２００×（ｃ、ｇ）および４００×（ｄ、ｈ）。ｉ、腫瘍中の神経系列マーカー陽性細胞の割合を３回の培養の平均±ＳＤとして示す。
【図３Ｂ】ＮＳＣ−Ｌ６１およびＯＰＣ−Ｌ６１から誘導された脳腫瘍の病理学的特徴を示す図である。
【図４Ａ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。ａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｕｒｉｎｅ ４３０Ａ ２．０マイクロアレイを使用した階層クラスタリングは、ＯＰＣ−Ｌ６１がＮＳＣ−Ｌ６１に最も類似した遺伝子発現プロフィールを有することを示す。ｂ、ＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１において発現増加を示す遺伝子についての上位６０個のプローブセットを示す。ｃ、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１におけるＮＳＣおよびＯＰＣ特異的遺伝子の発現分析。ｄ、プロミニン１についてのＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣおよびＯＰＣ−Ｌ６１の免疫反応性をＦＡＣＳ分析によって示す。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【図４Ｂ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図４Ｃ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図４Ｄ】ＯＰＣ−Ｌ６１における遺伝子発現の包括的な変化の証拠を示す図である。
【図５Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣの免疫反応性を示す図である。ＮＳＣをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図５Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＮＳＣの免疫反応性を示す図である。
【図６Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＡＳＴの免疫反応性を示す図である。ＡＳＴをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図６Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＡＳＴの免疫反応性を示す図である。
【図７Ａ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＯＰＣの免疫反応性を示す図である。ＯＰＣをコントロールベクター（ａ）またはＨＲａｓＬ６１発現ベクター（ｂ）でトランスフェクトし、２〜３週間培養し、神経系列マーカーおよびＧＦＰについて免疫標識した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１５μｍ。
【図７Ｂ】ＨＲａｓＬ６１トランスフェクトｐ５３欠損ＯＰＣの免疫反応性を示す図である。
【図８】ソフトアガーにおけるＨＲａｓＬ６１トランスフェクト神経細胞についてのコロニー形成アッセイを示す図である。ＮＳＣ、ＡＳＴおよびＯＰＣをコントロールベクターまたはＨＲａｓＬ６１発現ベクターでトランスフェクトし、ソフトアガー中で２０日間培養した。次いで、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。
【図９】二次脳腫瘍が初代腫瘍に非常に類似していることを示す図である。ＮＳＣ−Ｌ６１（ａ）およびＯＰＣ−Ｌ６１（ｂ）によって生じた初代腫瘍を分離し、１，０００個のＧＦＰ陽性細胞を二次マウス脳に移植した。二次腫瘍のＨ＆Ｅ染色（右パネル）はヒトＧＢＭの特徴（壊死、細胞過多および血管過多、多核巨細胞（白矢印）および有糸分裂細胞（黒矢印）を含む）を示し、初代腫瘍に類似している（左パネル）。拡大率×２００。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
SEQ ID NO:3: 5’ primer for knockout allele
SEQ ID NO:4: 5’ primer for wild-type allele
SEQ ID NO:5: 3’ primer
SEQ ID NO:6: 5' primer for HRas
SEQ ID NO:7: 3' primer for HRas
SEQ ID NO:8: 5' primer for HRasL61
SEQ ID NO:9: 3' primer for HRasL61
SEQ ID NO:10: 5' primer for hras
SEQ ID NO:11: 3' primer for hras
SEQ ID NO:12: 5' primer for s100a6
SEQ ID NO:13: 3' primer for s100a6
SEQ ID NO:14: 5' primer for prom1
SEQ ID NO:15: 3' primer for prom1
SEQ ID NO:16: 5' primer for contactin
SEQ ID NO:17: 3' primer for contactin
SEQ ID NO:18: 5' primer for mbp
SEQ ID NO:19: 3' primer for mbp
SEQ ID NO:20: 5' primer for plp
SEQ ID NO:21: 3' primer for plp
SEQ ID NO:22: 5' primer for sox8
SEQ ID NO:23: 3' primer for sox8
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法。
【請求項２】
ガン幹細胞がグリオーマ幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
正常細胞が神経幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｒａｓ活性化がＨＲａｓＬ６１遺伝子の導入によって達成される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ｐ５３欠乏がｐ５３欠損動物由来の細胞の使用によって達成される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により製造されたガン幹細胞。
【請求項７】
請求項６記載のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法によって得られたガン幹細胞標的化物質を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項９】
候補物質を請求項６記載のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法によって得られた抗ガン性物質を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６記載のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガンの診断方法。
【請求項１】
正常細胞をＲａｓ活性化およびｐ５３欠乏に供する工程を包含する、ガン幹細胞の製造方法。
【請求項２】
ガン幹細胞がグリオーマ幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
正常細胞が神経幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｒａｓ活性化がＨＲａｓＬ６１遺伝子の導入によって達成される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ｐ５３欠乏がｐ５３欠損動物由来の細胞の使用によって達成される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により製造されたガン幹細胞。
【請求項７】
請求項６記載のガン幹細胞に特異的に発現する分子を決定してガン幹細胞標的化物質を同定する工程を包含する、ガン幹細胞標的化物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法によって得られたガン幹細胞標的化物質を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項９】
候補物質を請求項６記載のガン幹細胞に添加する工程を包含する、抗ガン性物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法によって得られた抗ガン性物質を含む、ガン治療用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６記載のガン幹細胞に特異的に発現するタンパク質またはｍＲＮＡを検出する工程を包含する、ガンの診断方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２６３８２４（Ｐ２００８−２６３８２４Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０９５３９（Ｐ２００７−１０９５３９）
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年（平成１９年）３月３０日（発行日） Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ２４・Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２００７ 第２５回日本脳腫瘍病理学会 ２００７年４月１９日（木）〜２０日（金） プログラム・抄録（シュプリンガー・ジャパン株式会社発行）において発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年（平成１９年）３月３０日（発行日） Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ２４・Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２００７ 第２５回日本脳腫瘍病理学会 ２００７年４月１９日（木）〜２０日（金） プログラム・抄録（シュプリンガー・ジャパン株式会社発行）において発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]