ギャップ機能抑制剤、細胞増殖促進剤及び硫酸化ポリフコース
【課題】
ヒト繊維芽細胞表面のギャップジャンクション（ＧＪ）機能に対する強い抑制機能を有する硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコースを用いたＧＪ機能抑制剤等を提供する
【解決手段】
硫酸化フコース残基を有する多糖、詳しくは硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコース又はそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とするＧＪ機能抑制剤、これら多糖を有効成分とする細胞増殖促進剤、並びに新規硫酸化ポリフコース。
ヒト繊維芽細胞表面のギャップジャンクション（ＧＪ）機能に対する強い抑制機能を有する硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコースを用いたＧＪ機能抑制剤等を提供する
【解決手段】
硫酸化フコース残基を有する多糖、詳しくは硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコース又はそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とするＧＪ機能抑制剤、これら多糖を有効成分とする細胞増殖促進剤、並びに新規硫酸化ポリフコース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤及び細胞増殖促進剤に関する。より詳細には、硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースなどの多糖並びにそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤及び細胞増殖促進剤に関し、更に新規硫酸化ポリフコースに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞のシグナル伝達の一システムであるギャップ結合(ギャップジャンクション；略称ＧＪ)は、細胞同士の微細構造の連結によってなされると言われ、その細胞表面に局在する微細構造体は、カルシウムイオン（Ca２＋）、サイクリックアデノシン3’,5’−リン酸（cAMP）、グルタチオン、アミノ酸、単糖及びヌクレオチドなど分子量1,000以下の生理活性低分子や電気的なシグナルを隣接した細胞同士でやりとりする機能を有しており、多細胞動物が生命を維持していくために必須のシステムである。このような微細構造体（コネクソン）は、コネキシンというタンパク質の６量体からなり、２個の細胞の間でこの６量体の構造体が連結することにより、コネキシンの１２量体であるGJが完成する。このGJは常時細胞表面に発現しているわけではなく、細胞周期や発生の段階、組織の状態あるいは組織の差異によって発現レベルが異なり、細胞が癌化すると消失することもある。
【０００３】
ＧＪを介して細胞間を浸透する低分子のうち特に重要なものはカルシウムイオンであり脳内の神経細胞間でのこのイオンの瞬時の伝搬は”カルシウムウェイヴ”などとも呼称される。さらに、脳内、心臓平滑筋あるいは神経筋肉連結部位においては電気的なシグナル(電位)が固有組織を形成する細胞間で瞬時に伝達され、シンクロナイズされた組織の活動に寄与している。
したがって、ＧＪの機能異常(亢進あるいは抑制)があると、正常な組織の生理活動がさまたげられるので、様々な疾患の原因となっている。しかしながら、これまでＧＪの機能（ギャップ機能）を制御することのできる物質や組成物は、特許文献１，特許文献２に記載のヘパリン誘導体を除き、見出されていない。したがって、GJの機能異常に基づく疾患の治療法も未解決のまま残されてきた。
【０００４】
コンドロイチン硫酸(以下「ＣＳ」という)はグリコサミノグリカン(以下「ＧＡＧ」という)の一種であり、動物軟骨や結合組織中に存在することが広く知られている。またＣＳはＮ−アセチル-Ｄ-ガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃとも略称される)とＤ-グルクロン酸(ＧｌｃＡとも略称される)がβ１→３グリコシド結合により結合した二糖を構成単位とする直鎖多糖であり、重量平均分子量は通常、１０，０００〜８０，０００の範囲にある。Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンのＯ−４位またはＯ−６位に硫酸基が結合した構成糖を多く含むＣＳはそれぞれ、コンドロイチン硫酸Ａ(ＣＳ−Ａともいう)、またはコンドロイチン硫酸Ｃ(ＣＳ−Ｃともいう)と呼ばれる。これらは何れも構成単位あたり硫黄(以下Ｓという)がほぼ１モル含まれている。
【０００５】
これに対して川合らはスルメイカの軟骨中に構成単位あたりＳが1.55モル含まれているＣＳを見出し、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ−Ｅ）と命名した（非特許文献１）。このＣＳ−Ｅの構成単位は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸がβ１→３グリコシド結合した二糖であり、構成二糖単位当たりＳが２モル結合したもの(Ｏ−４位およびＯ−６位がともに硫酸化されたＧａｌＮＡｃを含む二糖単位)と、1モル結合したもの(Ｏ−４位またはＯ−６位が硫酸化されたＧａｌＮＡｃを含む二糖単位)の２種二糖単位があり、それらはほぼ等量ずつ存在する。
【０００６】
また、フクロナマコからＳが構成単位あたり1.6モル含まれているＣＳを単離した報告（非特許文献２）においても、構成単位成分はＤ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸であり、Ｓ含量からみてＣＳ−Ｅタイプと推定された。さらに橋本らはマナマコ(Stichopus japonicus)からＳ９．５％〜１３．０％及びフコース１２．０％〜２８．０％を含有するＣＳを得ているが（特許文献３）、このものも構成成分はＤ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸であり、Ｓ含量からみてＣＳ−Ｅタイプの基本骨格を有し、そこに硫酸化フコースの分岐構造を持つと推定された（非特許文献３）。
【０００７】
苅谷らはこの硫酸化フコース分岐を有するＣＳの構造につき、詳細な検討を行い（非特許文献４）、該ＣＳの主鎖構成単位はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸がβ１→３グリコシド結合したものであり、Ｄ−ガラクトサミンのＯ−４位及び/またはＯ−６位さらにはＤ−グルクロン酸のＯ−３位に、硫酸化フコースの２残基から成るフコース側鎖(フコビオシル硫酸基)がグリコシド結合した構造を有していることを示した。これら硫酸基を有するフコースから成る側鎖構造を有するＣＳは直鎖構造を有するＣＳと異なり、ＣＳ類の分解酵素であるコンドロイチナーゼ類によっても極めて消化されにくいことが知られている。
【０００８】
上述のようなナマコ類に含まれるグリコサミノグリカン（sea cucumber GAG;以下「ＳＣ−ＧＡＧ」という）については、特許文献４並びに非特許文献３及び５に示されるように、今までに二、三の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸Ｅが、単離精製されており、その生理活性としては主に抗凝固活性が報告されている（特許文献４、非特許文献６）。しかしながら、これらＳＣ−ＧＡＧのギャップ機能抑制活性についての報告はなく、また、これらを有効成分として利用したギャップ機能抑制剤についてはまだ知られていない。更に、これらを有効成分とする細胞増殖促進剤についても知られていない。
【０００９】
一方、硫酸化ポリフコース(一般にはフコイダンまたはフカン硫酸とも呼称される)は褐藻類植物或いは海産無脊椎動物由来のものが知られている。例えば、褐藻類植物から熱水抽出されたものが知られており、報告のある主要な硫酸化ポリフコース分子種には以下のようなものがある。
褐藻Fucus vesiculosus由来の硫酸化ポリフコース（非特許文献７）、褐藻Ascophyllum nodosum由来の硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献８）、褐藻Chorda filum由来硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献９）、褐藻Sargassum nodosum由来硫酸化ポリフコースの分子構造の部分構造（非特許文献１０）、及び褐藻Cladosiphon okamuranus由来硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献１１）がそれぞれに報告されている。更に、褐藻Ecklonia kurome由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、４種部分構造のみが非特許文献１２に報告されている。
【００１０】
海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースとしては、ナマコLudwigothurea grisea由来硫酸化ポリフコース、ウニArbacia lixula由来硫酸化ポリフコースおよびウニLytechinus variegatus由来硫酸化ポリフコースの分子構造が、いずれも非特許文献１３に報告されている。
更に、ごく最近海産無脊椎動物の一種であるマナマコ体壁からフコース側鎖を有する硫酸化ポリフコースが見出された（非特許文献１４）。これら硫酸化ポリフコースの生理活性としては、主に卵・精子反応阻害、ウィルス感染抑制、セレクチンを介する細胞接着阻害、抗凝固活性、繊維芽細胞増殖阻害などが報告されている（非特許文献１５，１６，１７，１８，１９）。しかしながら、ギャップ機能抑制活性についての報告はなく、これらを有効成分として利用したギャップ機能抑制剤についてはまだ知られていない。また、これらを有効成分とする細胞増殖促進剤についても知られていない。
【００１１】
また、細胞のギャップ結合細胞間連絡機能(ＧＪ機能：ギャップ機能)を制御するための体系的な手法に関する知見はこれまでほとんどなかった。しかしながら、細胞内シグナル伝達経路のうち、プロテインカイネースＣ(ＰＫＣ)がアップレギュレイトされるとＧＪを構成するタンパク質であるコネキシンのリン酸化が促進される結果として、ＧＪ機能が低下するという事実は知られており（非特許文献２０）、この現象を利用することによってＧＪ機能を制御できる可能性が考えられた。ただし、このような可能性を実現した研究例はこれまで知られていない。
【非特許文献１】Kawai et al.(1966)J.Biochem.,60,317
【非特許文献２】Katzman et al.(1969)Science,166,758
【非特許文献３】Kariya et al.(1990)J.Biol.Chem.,265,5081-5085
【非特許文献４】Kariya et al.(1997)Carbohydr.Res.,297,273-279
【非特許文献５】Vieira et al.(1991)J.Biol.Chem.,266,13530-13536
【非特許文献６】Moｕr▲a▼o et al.(2001)Thromb.Res.,102,167-176
【非特許文献７】Patankar,M.S. et al.(1993)J.Biol.Chem.,268,21770-21776
【非特許文献８】Chevolot et al.(2001)Carbohydr.Res.,330,529-535
【非特許文献９】Chizhov, A. O. et al.(1999)Carbohydr.Res.,320,108-119
【非特許文献１０】Duarte, M. E. et al.(2001)Carbohydr.Res.,333,281-293
【非特許文献１１】Nagaoka,M. et al.(1999)Glycoconj.J.,16,19-26
【非特許文献１２】Nishino, T. et al.(1991) Carbohydr.Res.,211,77-90
【非特許文献１３】Pereira, M. S. et al.(1999) J.Biol.Chem.,274, 7656-7667
【非特許文献１４】Kariya et al. (2004) Carbohydr. Res., 339,1339-1346
【非特許文献１５】J.Cell Biol(1982)94,123-128; Antiviral Res.(1988)9,335-343
【非特許文献１６】Antiviral Res.(1988)9,335-343
【非特許文献１７】J.Cell Biol.(1992)117,895-902
【非特許文献１８】Thromb.Res.(1991)64,143-154
【非特許文献１９】Biochim.Biophys.Acta(1993)1180,225-230
【非特許文献２０】J. Cell Biol. (2000) 149, 1503-1512
【特許文献１】特開2003-113090
【特許文献２】特開2003-119146
【特許文献３】特開昭63-10601
【特許文献４】特開2003-252906
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、ＧＪ機能の簡便な評価系を構築するとともにその評価系を用いて、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコースがヒト繊維芽細胞表面に発現しているＧＪの機能を強く抑制することを見出した。これに基づき、これらの硫酸化フコース残基を有する多糖をＧＪ機能抑制剤として用いれば、ＧＪ機能亢進に基づく様々な疾患の病態の改善が可能になると考え、かかるＧＪ機能抑制剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、本発明者らは、上記評価系として正常ヒト繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cellsと略称する)を用いたＧＪ機能測定系を用いて、ＧＪ機能を制御する物質を鋭意探索した結果、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースがＧＪ機能に対して抑制効果を有するとの知見を得、本発明を完成させるに至った。
更に、NHDF cellsを用いた細胞増殖測定系を用いて硫酸化フコース残基を有する多糖が細胞増殖促進効果を有することを見出し、かかる知見に基づき細胞増殖促進剤に係わる本発明も完成させ、更にこれらの効果を達成するのに有効な新規硫酸化ポリフコースを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、
１．硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤に関する、
２．多糖が硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである上記１に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
３．グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
４．グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
５．グリコサミノグリカンが、下記式（Ｉ）で示される構成二糖単位を有するコンドロイチン硫酸である上記４に記載のギャップ機能抑制剤に関するものである。
【００１５】
【化２】
【００１６】
更に、本発明は、
６．硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンが海産無脊椎動物由来のグリコサミノグリカンである上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
７．硫酸化ポリフコースが褐藻類植物由来または海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースである上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
８．海産無脊椎動物がナマコ類である上記６または７に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
９．硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする細胞増殖促進剤に関する、
１０．多糖が硫酸化フコース分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである上記９に記載の細胞増殖促進剤に関する、
１１．フコース同士がα１→３グリコシド結合により伸長した直鎖構造を基本骨格とし、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−４位のみ、あるいはＯ−２位およびＯ−４位の双方が部分的に硫酸化され、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−２位あるいはＯ−４位にフコース残基または硫酸化フコース残基の分岐を有し、該フコース残基または硫酸化フコース残基の分岐含有率が５〜２０％であり、重量平均分子量が８０，０００〜１２０，０００である硫酸化ポリフコースに関するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、硫酸化フコース残基を有する多糖、特に、未利用資源であるナマコ類由来の硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースを用いて、ＧＪ機能の亢進を発症の病因とする疾患に対する治療に有効なギャップ機能抑制剤を提供することができる。
更には硫酸化フコース残基を有する多糖を有効成分とする細胞増殖促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施する為の最良の形態により本発明を詳説するが、これらは一態様を示すものでありこれらに限定されるものではない。
以下に示す構造式中の下記の略号は、それぞれの右に示す意味である。
Ｆｕｃ：フコース
２Ｓ、３Ｓ、４Ｓ：それぞれ構成糖の２位、３位、４位ヒドロキシル基が硫酸化されていることを示す。
【００１９】
（１）本発明ギャップ機能抑制剤
本発明のギャップ機能抑制剤における有効成分は硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理的に許容される塩であり、該多糖は、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリフコースを包含する。
この硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンとは、グリコサミノグリカンのヒドロキシル基に硫酸化フコースのヒドロキシル基がグリコシド結合しているグリコサミノグリカンを意味し、グリコサミノグリカンはその構成二糖単位あたり硫酸化フコース残基の分岐鎖を０．８〜１．２分子有している。グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸が挙げられる。
【００２０】
硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンとして、好ましくは硫酸化フコ−ス残基の分岐鎖を有するコンドロイチン硫酸であり、より好ましくは下記式（Ｉ）の構成二糖単位を有する、硫酸化フコース残基の分岐鎖をもつコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくはナマコ類由来の、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するコンドロイチン硫酸（ＳＣ−ＣＳ）である。ＳＣ−ＣＳは、下記式（Ｉ）に示されるように、主鎖として、β−Ｄ−グルクロン酸（以下ＧｌｃＡという）の１位とＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン（以下ＧａｌＮＡｃという）の３位とがグリコシド結合したコンドロイチン硫酸タイプのポリマーを有しており、かつ、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が硫酸化されたＥタイプの二糖単位を主鎖構成糖として含有する。
【００２１】
【化３】
【００２２】
本発明のＳＣ−ＣＳは、上記基本構造の主鎖に、側鎖として、硫酸化フコース残基を２〜３残基、すなわち２個の硫酸化フコース残基からなる基（硫酸化フコビオシル基）及び／又は３個の硫酸化フコース残基からなる基（硫酸化フコトリオシル基）より成る分岐鎖構造を有し、二糖単位の構成単位あたり２〜３分子、好ましくは２．５〜３分子、特に好ましくは２．８〜３分子の硫酸化フコース残基を有している。また、二糖単位の構成単位あたり３〜６分子、好ましくは４〜６分子、特に好ましくは５〜６分子、最も好ましくは５．４〜５．８分子の硫酸基を有している。
ゲル濾過法により求めたこれらＳＣ−ＣＳの平均分子量は、４５〜５５kDa、好ましくは４７〜５３kDa、特に好ましくは４９〜５１kDaである。特筆すべき特徴として、ＳＣ−ＣＳはコンドロイチナーゼＡＢＣ及びＡＣのいずれによっても酵素消化されない。
【００２３】
このＳＣ−ＣＳの硫酸化フコース残基を部分的に脱離（部分脱分岐化）して得られるＳＣ−ＣＳをコンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、イオン交換高速液体クロマトグラフィーで分析した場合の不飽和二糖組成より本発明のＳＣ−ＣＳ主鎖の基本構造を特定することができる。
ＳＣ−ＣＳは、それが由来する海産無脊椎動物、例えばナマコ類、ウニ類等から単離でき、ナマコ類としては、マナマコ（Stichopus japonicus）、クロナマコ（Holthuria atra）、ニセクロナマコ（Holothuria leurospilota）、アラスカ産ナマコ（Parastichopus californicus）、ブラジル産ナマコ(Ludwigothurea grisea)などが挙げられる。尚、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
【００２４】
海産無脊椎動物からのＳＣ−ＣＳの取得は公知の方法で実施することが出来、例えば、ナマコ類の体壁の生体試料あるいは乾燥粉末を原料とし、ＧＡＧ類を生体組織から単離・精製するために用いられる公知の方法[Kariya et al.(1990)J.Biol.Chem.,265,5081-5085]に準拠して製造できる。また、特開２００３−２５２９０６公報に記載の方法に準拠して製造することもできる。
しかしながら、硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンの製法は上記に限定されず、グリコサミノグリカンに硫酸化フコースを化学的手法により結合させる方法によることもできる。
【００２５】
本発明のギャップ機能抑制剤における有効成分として使用される硫酸化ポリフコースは、フコイダンあるいはフカン硫酸とも呼ばれ、硫酸エステルを有するフコースのポリマーである。より具体的には種々の褐藻類植物から熱水抽出された下記の硫酸化ポリフコースが挙げられる。
褐藻Fucus vesiculosus由来の硫酸化ポリフコースは、これまで最もよく研究されてきたもので、既に市販されており、その分子構造が下記構造式１に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献７）。
【００２６】
【化４】
【００２７】
褐藻Ascophyllum nodosum由来の硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式２に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献８）。
【化５】
【００２８】
褐藻Chorda filum由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式３に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献９）。
【化６】
上記構造式１〜３に示した硫酸化ポリフコースは、構成糖としてフコースのみを含む点で共通性を有している。
【００２９】
褐藻Sargassum nodosum由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式４に示した部分構造のみが明らかにされており（前記非特許文献１０）、全構造の解明に至らない理由としては構造が高度にヘテロジーナスであるためと説明されている。また、この硫酸化ポリフコースは、マンノース（Ｍａｎ）やグルクロン酸（ＧｌｃＡ）などフコース以外の構成糖を有している。
【化７】
【００３０】
褐藻Cladosiphon okamuranus由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式５に示した繰り返し単位から成ることが、（前記非特許文献１１）に報告されている。この硫酸化ポリフコースは、側鎖にグルクロン酸（ＧｌｃＡ）を有している。
【化８】
【００３１】
褐藻Ecklonia kurome由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式６に示した４種の部分構造のみが明らかにされており（前記非特許文献１２）、全構造の解明に至らない理由としては構造が高度にヘテロジーナスであるためと説明されている。また、この硫酸化ポリフコースは、ガラクトース（Ｇａｌ）などフコース以外の構成糖を有している。
【００３２】
【化９】
【００３３】
更に、海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースとして、例えば下記のものが挙げられる。
ナマコLudwigothurea grisea由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式７に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１０】
【００３４】
ウニArbacia lixula由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式８に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１１】
【００３５】
ウニLytechinus variegatus由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式９に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１２】
【００３６】
上記の海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースは、硫酸基とフコース残基のみから成り、側鎖構造を有さない点で、褐藻類植物由来硫酸化ポリフコースとはその構造を異にする。
一方、ごく最近海産無脊椎動物の一種であるマナマコ体壁からフコース側鎖を有する下記の硫酸化ポリフコースが見出されている（前記非特許文献１４）。
これは、構造式１０に示すとおり主鎖結合が［→３Fucα１→］の結合からなり、その主鎖中には構成単位フコース残基の主として４位に、若干量が２位にFuc、Fuc(4S)、Fuc(2S)あるいはFuc(2S,4S)を側鎖として有する残基が全体の５０％程度存する。
【００３７】
【化１３】
【００３８】
本発明において上記公知の硫酸化ポリフコースも有効成分として用いられるが、本発明で好ましく用いられる新規な硫酸化ポリフコース（以下ＦＳと記載することもある）は、主鎖として、［→3Fucα1→］nのポリマーを有し、かつ、主鎖Fuc残基の１０％程度の残基の４位あるいは２位から、Fuc、Fuc(4S)あるいはFuc(2S,4S)が側鎖として伸展しており、また、主鎖Fuc残基は部分的に４位、または２位と４位が硫酸化されているものである。フコースを主要成分とする構成中性糖1残基あたり、平均して０．８〜１．２分子、好ましくは０．９〜１．１分子の硫酸基を有している。
【００３９】
本発明ＦＳ中には、フコース以外の単糖として、少量のガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び痕跡量のＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びウロン酸が含まれる。また、ゲル濾過法により求めた同物質の平均分子量は、８０〜１２０kDa、より好ましくは９０〜１１０kDaである。特筆すべき特徴として、ＦＳは、上記ナマコLudwigothurea griseaあるいはウニ由来の硫酸化ポリフコースとは異なり、上記のように硫酸化フコース残基の側鎖を有する。
上記一連の公知硫酸化ポリフコースの構造とＦＳの構造を比較すると、ＦＳの構造は構造式１及び構造式３に近いものであるが、フコース分岐の様式が一部異なり、主鎖の硫酸化部位も異なる。また、ＦＳの主鎖の構造は、構造式７及び構造式９に似ているが、それらはフコース分岐を有さない点でこのＦＳの構造とは異なる。よって、ＦＳは従来公知の構造とは異なる新たな構造を有するものであり、この新規ＦＳはアラスカ産ナマコ(Parastichopus californicus)より抽出され、公知の硫酸化ポリフコースとはFuc分岐含有率が大きく異なり、非特許文献１４に開示された公知の硫酸化ポリフコースのFuc分岐含有率が約５０％であるのに比し、本発明ＦＳのFuc分岐含有率は、５〜２０％、好ましくは８〜１５％、より好ましくは９〜１１％である。ここで、Fuc分岐含有率は、主鎖骨格のフコースに対する分岐を有するフコースの割合を表す。
【００４０】
上記、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースは、後述の実施例に記載の通り、NHDF cellsを用いたギャップ機能測定系においてギャップ機能を有意に抑制する作用を発現した。
【００４１】
（ギャッップ機能抑制剤）
本発明のギャップ機能抑制剤（以下ＧＪ抑制剤ということもある）は、in vivo又はin vitroにおいて隣り合う細胞同士の連絡、特にＧＪを介した細胞間連絡を抑制する細胞間連絡抑制剤である。本発明ＧＪ抑制剤の効果は、例えばEnviron. Sci.Technol.29,2923-2928(1995)に記載された、色素（蛍光色素）移行(Scrape-loading and dye transfer：SLDT)法により、容易に確認することが可能である。
このような細胞間連絡抑制剤の有効成分が「硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン」である場合は、生体内に存在するグリコサミノグリカンと近似した構造を有するため、あるいは「硫酸化ポリフコース」である場合は、体によい成分で、健康食品または機能性食品として用いられている成分であるため、生体に対し極めて高い安全性を有していると考えられる。従って、本発明のＧＪ抑制剤は、たとえばてんかん、血管内再狭窄、糸球体腎炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び動脈硬化症等の予防または治療薬としての使用可能性を有する。
【００４２】
本発明ＧＪ抑制剤を上記疾患の予防や治療に用いる場合、有効成分である上記硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン及び硫酸化ポリフコースの有するギャップ機能抑制作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、これらの多糖はその薬理学的に許容されうる塩の形で用いる事も可能である。薬理学的に許容されうる塩としては前述の条件を満たしていれば特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またピリジン塩、ジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などのうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、特にナトリウム塩が好ましい。
【００４３】
また同様に、本発明の有効成分である上記硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン及び硫酸化ポリフコースを上記疾患の予防や治療に用いる場合、これらの有するギャップ機能抑制作用を実質的に損なわず、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。本発明有効成分を含有するギャップ機能抑制剤の剤型及び投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、軟膏剤等に製剤化して、経口、注射、塗布等の投与経路のうち、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能である。
尚、本発明ギャップ機能抑制剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、投与対象患者の体重や具体的症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、本発明の有効成分物質として１日当たり概ね０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度を、１日１回〜数回に分けて投与する事が考えられる。
【００４４】
（細胞増殖促進剤）
本発明のＧＪ抑制剤は後述の実施例６により明らかなように細胞増殖活性が認められるため、細胞増殖促進剤としても使用することが可能である。
本発明の細胞増殖促進剤は、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン又は硫酸化ポリフコースを有効成分とする細胞増殖促進剤である。
この細胞増殖促進剤の有効成分としての上記「硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコース」は上記本発明のＧＪ機能抑制剤に記載した物質と同義である。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、これらの実施例により限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの製造
原料のアラスカ産ナマコ(Parastichopus californicus)乾燥粉末５４０ｇを４Ｌの蒸留水に懸濁して１２０℃、３０分条件下のオートクレーブ処理を施した後、１００ｍＭリン酸緩衝液 (ｐＨ８．０)中に溶解した。得られた懸濁液に対し、蛋白質１ｇあたり５０ｍｇの蛋白分解酵素Actinase E（科研製薬（株）製）を加えて、５５℃にて８ｈｒ、攪拌下コラーゲンやコアプロテイン等の共存タンパク質を消化した。同様の消化をさらに３回繰り返した後、酵素消化物を０．４Ｍ ＮａＯＨ水溶液、次いで１０％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)で順次処理した。反応混液から遠心分離により上清を回収し、流水透析を行った。適度に濃縮した透析内液を凍結乾燥することにより粗精製物を得た。
【００４７】
こうして得られた粗精製物２．０ｇを少量の０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液に溶解し、同溶媒で平衡化したSepharose CL-6B（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム(φ８．０×９５ｃｍ)に付し、溶出液を７０ｍｌ毎に回収した。得られた各フラクションにつき波長２１０ｎｍにおける吸光度［ＯＤ(Optical Density)］の測定、カルバゾール法によるウロン酸含量の測定［ＯＤ：波長５３０ｎｍ］およびアンスロン法による中性糖含量の測定（ＯＤ：波長６２０ｎｍ）を行った結果、高分子域に硫酸化ポリフコースと目されるアンスロン陽性、カルバゾール陰性のピークが見出されたのでこれに相当する画分を合一回収し(画分Ｉ)、凍結乾燥によりパウダー(２８２ｍｇ)を得た。また、そのすぐ後にＳＣ−ＣＳと目されるアンスロン陽性、カルバゾール陽性のピークが見出されたのでこれに相当する画分を合一回収し(画分ＩＩ)、凍結乾燥によりパウダー(５５５ｍｇ)を得た。
各フラクションの波長２１０ｎｍ、５３０ｎｍ、６２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）をそれぞれ○、□、●で図１に示した。
【００４８】
［実施例２］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの物理化学的性状解析
実施例１で調製した二種の画分（Ｉ、ＩＩ）につき、ヘキソサミン含量、ウロン酸含量、硫酸イオン含量ならびに中性糖含量をそれぞれ下記化学組成分析法に従った定量分析によって分析した。
ヘキソサミン含量：ＭＢＴＨ法[Hurst&Settine(1981)Anal.Biochem.,115,88-92]、
ウロン酸含量：カルバゾール法[Bitter&Muir(1962)Anal.Biochem.,4,330-334]、
硫酸イオン含量：イオンクロマトグラフィー法、
中性糖含量：アンスロン法[Dimler,R.L et al.(1952)Anal.Chem.,24,1411-1414]
各構成成分のモル存在量(ｍｍｏｌ／ｇ)を算出したうえ、中性糖あるいはヘキソサミンを１として各成分のモル比を算出し、表１に示した。
【００４９】
画分Iでは、硫酸基及び中性糖を各々、４．１０ｍｍｏｌ／ｇ及び３．７９ｍｍｏｌ／ｇ 含み、中性糖に対する硫酸基の割合は１．０８（モル比）であり、ヘキソサミンを若干量、ウロン酸を痕跡量含んでいた(表1参照)。画分IIでは、硫酸基及び中性糖を各々、４．５２ｍｍｏｌ／ｇ 及び２．３６ｍｍｏｌ／ｇ 含み、ヘキソサミンとウロン酸をほぼ等モルづつ含んでいた(表１参照)。
これらの画分の分析結果と文献値を比較すると、前者(画分Ｉ)は公知マナマコ硫酸化ポリフコース（非特許文献１４）とやや異なるのに対し、後者(画分ＩＩ)は公知マナマコＳＣ−ＣＳ（非特許文献３；非特許文献４）とほぼ同等の組成を示した。
【００５０】
対比した公知マナマコ硫酸化ポリフコースの糖鎖骨格はフコースがα1→3グリコシド結合したコアポリマーであり、主としてＯ−４位から、微量にはＯ−２位から１残基のフコース側鎖が分岐している。また、各フコース残基はＯ−２位及び／またはＯ−４位に於いて硫酸化されている。一方、公知マナマコＳＣ−ＣＳの構成単位はＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合したものであり、Ｄ−ガラクトサミンのＯ−４位及び／またはＯ−６位、さらにはＤ−グルクロン酸のＯ−３位に硫酸化フコース２残基より成るフコース側鎖(硫酸化フコビオシル基)がグリコシド結合した構造を有している。
従って、構成単位成分において画分Ｉは、公知のマナマコ硫酸化ポリフコースと差異があり、画分ＩＩは公知のマナマコＳＣ−ＣＳと同等である。
【００５１】
次いで、画分Ｉ及び画分ＩＩにつき、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行い、分子量を測定した。その結果、画分Ｉの分子量は、１０５ｋＤａ、画分ＩＩの分子量は、５０ｋＤａであることが判明した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
次いで、画分Ｉ及び画分ＩＩにつき、それらを構成する中性糖を同定するためにYasuno,S. et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,1353-1359 に記載された方法に従って単糖組成分析を行った。すなわち、１０ｍｇ／ｍｌに調製した画分Ｉ及び画分ＩＩの２００倍希釈液からそれぞれ５０μｌをとり、５０μｌの８Ｍ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加して封管した。反応混液を１００℃にて３ｈｒ加熱することにより、グリコシド結合ならびに硫酸エステル結合を開裂させた。冷却後、遠心分離して反応混液を反応管の底に集め、開管した。ドライエアーを吹き付けて溶媒を飛ばした後、４０μｌの２−プロパノールを添加・撹拌した。次いで、再度ドライエアーを吹き付けて溶媒を除去した。
こうして得られた単糖試料につき、２０μｌの蒸留水及び８０μｌの４−アミノ安息香酸エチルエステル(ＡＢＥＥ)試薬を添加した後、封管し８０℃にて１ｈｒ加温することにより還元アミノ化反応を進行させた。こうして還元端がＡＢＥＥ標識された単糖誘導体（以下、ＡＢＥＥ化単糖ということもある）を生成した。反応終了後、開管し２００μｌの蒸留水並びに２００μｌのクロロホルムを添加した。この溶液を激しく撹拌した後、遠心分離を行い上清中に上記単糖誘導体を得た。
【００５４】
７％アセトニトリルを含む０．２Ｍ ホウ酸緩衝液(ｐＨ８．９)で平衡化した Honenpak-C18（生化学工業（株）販売）カラム(φ４．６×７５ｍｍ)を装着したＨＰＬＣに、上記ＡＢＥＥ化単糖試料をアプライし、同溶媒のアイソクラティック溶出条件により分析を実施した。なお、用いた単糖標品は、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、アラビノース（Ａｒａ）、リボース（Ｒｉｂ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミンン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ） (溶出順)である。表２に示したように、画分Ｉ及び画分ＩＩ由来の主要ＡＢＥＥ化単糖試料は、いずれもＦｕｃであった。ただし、画分Iでは、Ｆｕｃに加え、少量のＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ及び痕跡量のＧａｌＮＡｃが検出された。画分ＩＩでは、Ｆｕｃに加え少量のＧａｌＮＡｃが検出された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
次いで、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の４０ｍｇを０．０５Ｍ Ｈ２ＳＯ４水溶液４ｍｌに溶解し、８０℃にて６ｈｒの加水分解反応に付した。反応混液を室温まで冷却することによって反応を停止させ、１Ｍ ＮａＯＨを添加して中和した後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したCellulofine GCL-90m（生化学工業（株）販売）カラム(φ３．４×１１０ｃｍ)に付し、溶出液を１０ｍｌごとに分取した。そして、高分子画分を分取した後、透析して脱塩し凍結乾燥することにより部分的脱分岐化ＳＣ−ＣＳを調製した[Kariya et al.(2002)J.Biochem.,132,335-343]。
こうして得た部分的脱分岐化ＳＣ−ＣＳにつき、コンドロイチナーゼＡＢＣによる酵素消化物の不飽和二糖組成分析を実施した。すなわち、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製）酵素消化物につき、上清をYMC-PA120S5（YMC社製）カラム(φ４．０×２５０ｍｍ)を装着した強塩基性陰イオン交換(SAX-)HPLCに付し、MIlliQ Waterと０．８Ｍ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４溶液の直線的濃度勾配システム(16mM→520mM/38min)で溶出し、２３０ｎｍの吸光度で検出した。不飽和二糖スタンダードとしてコンドロイチン硫酸タイプのDDi-0S, DDi-6S, DDi-4S, DDi-SD [DDi-(2,6)S], DDi-SE [DDi-(4,6)S]およびDDi-triS [DDi-(2,4,6)S]を用いた。これらの記号は、下記式ＩＩで示される二糖組成中の各置換基が下表３の通りであるものを示す。
【００５７】
【化１４】
【００５８】
【表３】
【００５９】
上記二糖組成分析の結果を下記表４に示した。この結果は公知マナマコ体壁ＳＣ−ＣＳの場合にほぼ匹敵しており、本実施例で製造したＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)は実際に硫酸化フコースの側鎖を有するコンドロイチン硫酸Ｅであることを確認した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
［実施例３］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの構造解析
画分Ｉ(硫酸化ポリフコース)及び画分ＩＩ(ＳＣ−ＣＳ)から各５ｍｇをとり、それぞれを蒸留水で平衡化したAmberlite （ローム・アンド・ハース社、登録商標）IR-120カラム(φ１．５×１２ｃｍ)にアプライした。得られた溶出画分のうちの酸性画分につき、適量のピリジンを添加して中和した後、凍結乾燥に付して、画分Ｉ及び画分ＩＩのピリジン塩を得た。それぞれにつき、１ｍｌの１０％蒸留水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、８０℃にて５時間ソルボリシス反応を進行させた。反応は、室温まで冷却することにより停止させ、３倍量の蒸留水を添加した後、２Ｍ ＮａＯＨを適量添加してｐＨを９〜９．５に調整した。これを流水に対し一晩透析した後、凍結乾燥することにより、画分Ｉ及び画分ＩＩの脱硫酸化物をそれぞれ３ｍｇ及び３．３ｍｇ得た。
【００６２】
硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びその脱硫酸化物、さらにＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)及びその脱硫酸化物の計４画分から、それぞれ１ｍｇ をとりHakomoriの方法[Hakomori, S.(1964)J.Biochem.(Tokyo),55, 205-208]を一部改変したSanfordとConradの方法[Sanford,P.A. & Conrad,H.E.(1966)Biochemistry,5, 1508-1517]に従ってメチル化誘導体を合成した。得られたメチル化誘導体は、Waegheらの方法[Waeghe et al.(1983)Carbohydr.Res.,123, 281-304]に従って脱塩した。さらに、これらを２Ｍ ＴＦＡを用い１２１℃で加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）を用いて還元した。最後に、還元処理により出現したヒドロキシル基をアセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト(ＰＭＡＡ)を合成した。得られたＰＭＡＡを５０μｌのアセトンに溶解し、そのうちの１μｌをガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）に付した。ＧＣ−ＭＳ分析は、Supelco社製SP2330キャピラリーカラム(f0.25 mm x 30 m)を装着したShimadzu社製QP5,000型マススペクトロメーターを用いて、スプリットレスモードで行った。カラムオーヴンは、５０℃に２分間保ち、次いで３０℃／分の勾配で１７０℃まで昇温、さらに４℃／分の勾配で２３５℃まで昇温させ、この温度に１５分保った。
【００６３】
硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)のクロマトグラムに於いては、下記７種類のＰＭＡＡが観察された(表５)。
2,3,4-tri-O-methyl-fucitol(T-Fuc)、
2,4-di-O-methyl-fucitol(3-Fuc)、
2,3-di-O-methyl-fucitol(4-Fuc)、
4-O-methyl-fucitol(2,3-Fuc)、
3-O-methyl-fucitol(2,4-Fuc)、
4-O-methyl-fucitol(3,4-Fuc)、
fucitol(2,3,4-Fuc)
3,4-di-O-methyl-fucitol(2-Fuc)は観察されなかった。以下の記載に於いては、上記括弧内に示したＰＭＡＡの略称を用いて説明をする。
【００６４】
硫酸化ポリフコースの脱硫酸化物のクロマトグラムは、硫酸化ポリフコースのクロマトグラムとは大きく様相を異にした（表５）。すなわち、出現したＰＭＡＡは、3-Fucが主要であり、ほぼ等量のT-Fuc、2,3-Fuc及び3,4-Fucの三種類のマイナー成分も検出された。従って、これらの結果より、硫酸化ポリフコースの構造は、［→3Fucα1→］ｎの主鎖の２位または４位からFucが枝分かれしているものであり、各Fuc残基に対し硫酸基が４位または２位と４位に配位しているものと考えられた。
【００６５】
ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)のクロマトグラムに於いては、４種類のＰＭＡＡが観察された(表５)。それらは、3-Fuc、2,3-Fuc、3,4-Fuc、及び2,3,4-Fucである。ＳＣ−ＣＳの脱硫酸化物のクロマトグラムは、ＳＣ−ＣＳのクロマトグラムとは大きく様相を異にしていた。すなわち、出現したＰＭＡＡは、少量のT-Fucと主要な3-Fucのみから成っていた。これらの結果より、ＳＣ−ＣＳの構造は、コンドロイチン硫酸ＥのコアポリマーからFucα1→3FucまたはFucα1→3Fucα1→3Fucの側鎖が分岐しており、それらの２位及び／または４位の水酸基が硫酸化されているものと推察された。
【００６６】
【表５】
【００６７】
［実施例５］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースのギャップ機能抑制活性測定
ヒト皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cells)の細胞間連絡機能に及ぼす硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の効果は、被検物質を培地中に添加し、Scrape-Loading and Dye Transfer(SLDT)法に従って評価した。一方、ヒト間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cell; hMSC cells）の細胞間連絡機能に及ぼす上記物質の効果についても同様の方法により評価した。
【００６８】
具体的には、まずNHDF cellsあるいはヒト間葉系幹細胞（1 x10５/ml; 2 ml medium/dish）をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）(35mm dish)に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて４時間培養した後、培地中に2 mg/ml濃度の硫酸化ポリフコース(画分Ｉ：ＦＳ)、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)、褐藻フコイダン(Sigma社製)あるいはコンドロイチン硫酸Ｅ(生化学工業社製：ＣＳＥ)をそれぞれ添加(1 ml/dish)した。これらの無添加のものをコントロールとした。その後、引き続き細胞を４日間継続培養し、100%コンフルエント状態を維持した。次いで、リン酸緩衝生理的食塩水［PBS(+)］で４回洗浄した後、そのコンフルエント細胞層の表面にカミソリで直線的に切れ目をつけた。そして、１ｍｌの０．１％濃度の蛍光物質(Lucifer yellow)をdishに入れて５分間培養した後、PBS(+)で４回洗浄した。この状態に於いて、dishを蛍光顕微鏡で観察・測定し、蛍光強度につきNIH画像解析法を用いて分析・数値化した。ここで得られる数値が大きければ、ＧＪを介した細胞間連絡が亢進され、小さければ抑制されていることを示す。ＧＪ機能抑制能のアッセイ結果を示す図２中、＊Ｐは有為差を示す統計用語で、例えば＊Ｐ＜０．０１は「有為水準片側 １％」を意味し、以下の図においても同様の意味を表す。
【００６９】
その結果、培養４日目のNHDF cells培地の場合(図２)には、ＳＣ−ＣＳはコントロールと比較してギャップ機能を約半分にまで抑制した。一方、硫酸化ポリフコース（ＦＳ）はＳＣ−ＣＳよりはやや弱いもののやはりギャップ機能を抑制した。フコイダンもギャップ機能を抑制したが、その程度はＳＣ−ＣＳや硫酸化ポリフコースよりもやや低かった。コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）は、ほとんどギャップ機能の抑制効果を示さなかった。
ヒト間葉系幹細胞培地の場合(図３)には、NHDF cells培地の場合と様相を異にした。すなわち、フコイダンが約２０％程度、ＳＣ−ＣＳが約１０％程度ギャップ機能を抑制する傾向にあったものの、その抑制の程度はNHDF cells培地に於ける抑制に比較してずっと弱かった。
【００７０】
［実施例６］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの細胞増殖活性測定
ヒト皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cells)の細胞増殖に及ぼす硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の効果は、被検物質を培地中に添加し、Alamar blue-staining法に従って評価した。一方、ヒト間葉系幹細胞の細胞増殖能に及ぼす上記物質の効果についても同様の方法により評価した。
【００７１】
具体的には、まずNHDF cellsあるいはヒト間葉系幹細胞(1 x10５/ml; 2 ml medium/dish)をDMEM培地(35mm dish)に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて４時間培養した後、培地中に２ｍｇ／ｍｌ濃度の硫酸化ポリフコース(画分Ｉ：ＦＳ)、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)、褐藻フコイダン(Sigma社製)あるいはコンドロイチン硫酸Ｅ(生化学工業社製：ＣＳＥ)を添加(1 ml/dish)した。これらの無添加のものをコントロールとした。その後、引き続き細胞を４日間継続培養した後、Alamar blue-staining法に従って細胞増殖につき数値化して評価した。
【００７２】
その結果、NHDF cellsの場合(図４)、ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコース（ＦＳ）は、コントロールに比較して４倍以上細胞増殖を促進した。フコイダンではそれらよりやや劣るもののやはり増殖を促進した。コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）の増殖促進はコントロールの２．５倍程度に留まった。一方、ヒト間葉系幹細胞培地の場合(図５)、ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコース（ＦＳ）は、コントロールに比較して８倍以上と大変強く細胞増殖を促進した。フコイダンでは７倍弱の増殖促進であり、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）でも６倍強の増殖促進を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Sehparose CL-6Bカラムクロマトグラフィーの溶出パターン
【図２】SLDT法によるNHDF細胞のギャップ機能抑制能のアッセイ結果
【図３】SLDT法によるヒト間葉系幹細胞のギャップ機能抑制能のアッセイ結果
【図４】Alamer blue染色法によるNHDF細胞の増殖能のアッセイ結果
【図５】Alamer blue染色法によるヒト間葉系幹細胞の増殖能のアッセイ結果
【技術分野】
【０００１】
本発明は硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤及び細胞増殖促進剤に関する。より詳細には、硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースなどの多糖並びにそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤及び細胞増殖促進剤に関し、更に新規硫酸化ポリフコースに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞のシグナル伝達の一システムであるギャップ結合(ギャップジャンクション；略称ＧＪ)は、細胞同士の微細構造の連結によってなされると言われ、その細胞表面に局在する微細構造体は、カルシウムイオン（Ca２＋）、サイクリックアデノシン3’,5’−リン酸（cAMP）、グルタチオン、アミノ酸、単糖及びヌクレオチドなど分子量1,000以下の生理活性低分子や電気的なシグナルを隣接した細胞同士でやりとりする機能を有しており、多細胞動物が生命を維持していくために必須のシステムである。このような微細構造体（コネクソン）は、コネキシンというタンパク質の６量体からなり、２個の細胞の間でこの６量体の構造体が連結することにより、コネキシンの１２量体であるGJが完成する。このGJは常時細胞表面に発現しているわけではなく、細胞周期や発生の段階、組織の状態あるいは組織の差異によって発現レベルが異なり、細胞が癌化すると消失することもある。
【０００３】
ＧＪを介して細胞間を浸透する低分子のうち特に重要なものはカルシウムイオンであり脳内の神経細胞間でのこのイオンの瞬時の伝搬は”カルシウムウェイヴ”などとも呼称される。さらに、脳内、心臓平滑筋あるいは神経筋肉連結部位においては電気的なシグナル(電位)が固有組織を形成する細胞間で瞬時に伝達され、シンクロナイズされた組織の活動に寄与している。
したがって、ＧＪの機能異常(亢進あるいは抑制)があると、正常な組織の生理活動がさまたげられるので、様々な疾患の原因となっている。しかしながら、これまでＧＪの機能（ギャップ機能）を制御することのできる物質や組成物は、特許文献１，特許文献２に記載のヘパリン誘導体を除き、見出されていない。したがって、GJの機能異常に基づく疾患の治療法も未解決のまま残されてきた。
【０００４】
コンドロイチン硫酸(以下「ＣＳ」という)はグリコサミノグリカン(以下「ＧＡＧ」という)の一種であり、動物軟骨や結合組織中に存在することが広く知られている。またＣＳはＮ−アセチル-Ｄ-ガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃとも略称される)とＤ-グルクロン酸(ＧｌｃＡとも略称される)がβ１→３グリコシド結合により結合した二糖を構成単位とする直鎖多糖であり、重量平均分子量は通常、１０，０００〜８０，０００の範囲にある。Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンのＯ−４位またはＯ−６位に硫酸基が結合した構成糖を多く含むＣＳはそれぞれ、コンドロイチン硫酸Ａ(ＣＳ−Ａともいう)、またはコンドロイチン硫酸Ｃ(ＣＳ−Ｃともいう)と呼ばれる。これらは何れも構成単位あたり硫黄(以下Ｓという)がほぼ１モル含まれている。
【０００５】
これに対して川合らはスルメイカの軟骨中に構成単位あたりＳが1.55モル含まれているＣＳを見出し、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ−Ｅ）と命名した（非特許文献１）。このＣＳ−Ｅの構成単位は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸がβ１→３グリコシド結合した二糖であり、構成二糖単位当たりＳが２モル結合したもの(Ｏ−４位およびＯ−６位がともに硫酸化されたＧａｌＮＡｃを含む二糖単位)と、1モル結合したもの(Ｏ−４位またはＯ−６位が硫酸化されたＧａｌＮＡｃを含む二糖単位)の２種二糖単位があり、それらはほぼ等量ずつ存在する。
【０００６】
また、フクロナマコからＳが構成単位あたり1.6モル含まれているＣＳを単離した報告（非特許文献２）においても、構成単位成分はＤ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸であり、Ｓ含量からみてＣＳ−Ｅタイプと推定された。さらに橋本らはマナマコ(Stichopus japonicus)からＳ９．５％〜１３．０％及びフコース１２．０％〜２８．０％を含有するＣＳを得ているが（特許文献３）、このものも構成成分はＤ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸であり、Ｓ含量からみてＣＳ−Ｅタイプの基本骨格を有し、そこに硫酸化フコースの分岐構造を持つと推定された（非特許文献３）。
【０００７】
苅谷らはこの硫酸化フコース分岐を有するＣＳの構造につき、詳細な検討を行い（非特許文献４）、該ＣＳの主鎖構成単位はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸がβ１→３グリコシド結合したものであり、Ｄ−ガラクトサミンのＯ−４位及び/またはＯ−６位さらにはＤ−グルクロン酸のＯ−３位に、硫酸化フコースの２残基から成るフコース側鎖(フコビオシル硫酸基)がグリコシド結合した構造を有していることを示した。これら硫酸基を有するフコースから成る側鎖構造を有するＣＳは直鎖構造を有するＣＳと異なり、ＣＳ類の分解酵素であるコンドロイチナーゼ類によっても極めて消化されにくいことが知られている。
【０００８】
上述のようなナマコ類に含まれるグリコサミノグリカン（sea cucumber GAG;以下「ＳＣ−ＧＡＧ」という）については、特許文献４並びに非特許文献３及び５に示されるように、今までに二、三の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸Ｅが、単離精製されており、その生理活性としては主に抗凝固活性が報告されている（特許文献４、非特許文献６）。しかしながら、これらＳＣ−ＧＡＧのギャップ機能抑制活性についての報告はなく、また、これらを有効成分として利用したギャップ機能抑制剤についてはまだ知られていない。更に、これらを有効成分とする細胞増殖促進剤についても知られていない。
【０００９】
一方、硫酸化ポリフコース(一般にはフコイダンまたはフカン硫酸とも呼称される)は褐藻類植物或いは海産無脊椎動物由来のものが知られている。例えば、褐藻類植物から熱水抽出されたものが知られており、報告のある主要な硫酸化ポリフコース分子種には以下のようなものがある。
褐藻Fucus vesiculosus由来の硫酸化ポリフコース（非特許文献７）、褐藻Ascophyllum nodosum由来の硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献８）、褐藻Chorda filum由来硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献９）、褐藻Sargassum nodosum由来硫酸化ポリフコースの分子構造の部分構造（非特許文献１０）、及び褐藻Cladosiphon okamuranus由来硫酸化ポリフコースの分子構造（非特許文献１１）がそれぞれに報告されている。更に、褐藻Ecklonia kurome由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、４種部分構造のみが非特許文献１２に報告されている。
【００１０】
海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースとしては、ナマコLudwigothurea grisea由来硫酸化ポリフコース、ウニArbacia lixula由来硫酸化ポリフコースおよびウニLytechinus variegatus由来硫酸化ポリフコースの分子構造が、いずれも非特許文献１３に報告されている。
更に、ごく最近海産無脊椎動物の一種であるマナマコ体壁からフコース側鎖を有する硫酸化ポリフコースが見出された（非特許文献１４）。これら硫酸化ポリフコースの生理活性としては、主に卵・精子反応阻害、ウィルス感染抑制、セレクチンを介する細胞接着阻害、抗凝固活性、繊維芽細胞増殖阻害などが報告されている（非特許文献１５，１６，１７，１８，１９）。しかしながら、ギャップ機能抑制活性についての報告はなく、これらを有効成分として利用したギャップ機能抑制剤についてはまだ知られていない。また、これらを有効成分とする細胞増殖促進剤についても知られていない。
【００１１】
また、細胞のギャップ結合細胞間連絡機能(ＧＪ機能：ギャップ機能)を制御するための体系的な手法に関する知見はこれまでほとんどなかった。しかしながら、細胞内シグナル伝達経路のうち、プロテインカイネースＣ(ＰＫＣ)がアップレギュレイトされるとＧＪを構成するタンパク質であるコネキシンのリン酸化が促進される結果として、ＧＪ機能が低下するという事実は知られており（非特許文献２０）、この現象を利用することによってＧＪ機能を制御できる可能性が考えられた。ただし、このような可能性を実現した研究例はこれまで知られていない。
【非特許文献１】Kawai et al.(1966)J.Biochem.,60,317
【非特許文献２】Katzman et al.(1969)Science,166,758
【非特許文献３】Kariya et al.(1990)J.Biol.Chem.,265,5081-5085
【非特許文献４】Kariya et al.(1997)Carbohydr.Res.,297,273-279
【非特許文献５】Vieira et al.(1991)J.Biol.Chem.,266,13530-13536
【非特許文献６】Moｕr▲a▼o et al.(2001)Thromb.Res.,102,167-176
【非特許文献７】Patankar,M.S. et al.(1993)J.Biol.Chem.,268,21770-21776
【非特許文献８】Chevolot et al.(2001)Carbohydr.Res.,330,529-535
【非特許文献９】Chizhov, A. O. et al.(1999)Carbohydr.Res.,320,108-119
【非特許文献１０】Duarte, M. E. et al.(2001)Carbohydr.Res.,333,281-293
【非特許文献１１】Nagaoka,M. et al.(1999)Glycoconj.J.,16,19-26
【非特許文献１２】Nishino, T. et al.(1991) Carbohydr.Res.,211,77-90
【非特許文献１３】Pereira, M. S. et al.(1999) J.Biol.Chem.,274, 7656-7667
【非特許文献１４】Kariya et al. (2004) Carbohydr. Res., 339,1339-1346
【非特許文献１５】J.Cell Biol(1982)94,123-128; Antiviral Res.(1988)9,335-343
【非特許文献１６】Antiviral Res.(1988)9,335-343
【非特許文献１７】J.Cell Biol.(1992)117,895-902
【非特許文献１８】Thromb.Res.(1991)64,143-154
【非特許文献１９】Biochim.Biophys.Acta(1993)1180,225-230
【非特許文献２０】J. Cell Biol. (2000) 149, 1503-1512
【特許文献１】特開2003-113090
【特許文献２】特開2003-119146
【特許文献３】特開昭63-10601
【特許文献４】特開2003-252906
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、ＧＪ機能の簡便な評価系を構築するとともにその評価系を用いて、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンや硫酸化ポリフコースがヒト繊維芽細胞表面に発現しているＧＪの機能を強く抑制することを見出した。これに基づき、これらの硫酸化フコース残基を有する多糖をＧＪ機能抑制剤として用いれば、ＧＪ機能亢進に基づく様々な疾患の病態の改善が可能になると考え、かかるＧＪ機能抑制剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、本発明者らは、上記評価系として正常ヒト繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cellsと略称する)を用いたＧＪ機能測定系を用いて、ＧＪ機能を制御する物質を鋭意探索した結果、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースがＧＪ機能に対して抑制効果を有するとの知見を得、本発明を完成させるに至った。
更に、NHDF cellsを用いた細胞増殖測定系を用いて硫酸化フコース残基を有する多糖が細胞増殖促進効果を有することを見出し、かかる知見に基づき細胞増殖促進剤に係わる本発明も完成させ、更にこれらの効果を達成するのに有効な新規硫酸化ポリフコースを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、
１．硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤に関する、
２．多糖が硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである上記１に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
３．グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
４．グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
５．グリコサミノグリカンが、下記式（Ｉ）で示される構成二糖単位を有するコンドロイチン硫酸である上記４に記載のギャップ機能抑制剤に関するものである。
【００１５】
【化２】
【００１６】
更に、本発明は、
６．硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンが海産無脊椎動物由来のグリコサミノグリカンである上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
７．硫酸化ポリフコースが褐藻類植物由来または海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースである上記２に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
８．海産無脊椎動物がナマコ類である上記６または７に記載のギャップ機能抑制剤に関する、
９．硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする細胞増殖促進剤に関する、
１０．多糖が硫酸化フコース分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである上記９に記載の細胞増殖促進剤に関する、
１１．フコース同士がα１→３グリコシド結合により伸長した直鎖構造を基本骨格とし、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−４位のみ、あるいはＯ−２位およびＯ−４位の双方が部分的に硫酸化され、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−２位あるいはＯ−４位にフコース残基または硫酸化フコース残基の分岐を有し、該フコース残基または硫酸化フコース残基の分岐含有率が５〜２０％であり、重量平均分子量が８０，０００〜１２０，０００である硫酸化ポリフコースに関するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、硫酸化フコース残基を有する多糖、特に、未利用資源であるナマコ類由来の硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースを用いて、ＧＪ機能の亢進を発症の病因とする疾患に対する治療に有効なギャップ機能抑制剤を提供することができる。
更には硫酸化フコース残基を有する多糖を有効成分とする細胞増殖促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施する為の最良の形態により本発明を詳説するが、これらは一態様を示すものでありこれらに限定されるものではない。
以下に示す構造式中の下記の略号は、それぞれの右に示す意味である。
Ｆｕｃ：フコース
２Ｓ、３Ｓ、４Ｓ：それぞれ構成糖の２位、３位、４位ヒドロキシル基が硫酸化されていることを示す。
【００１９】
（１）本発明ギャップ機能抑制剤
本発明のギャップ機能抑制剤における有効成分は硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理的に許容される塩であり、該多糖は、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリフコースを包含する。
この硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンとは、グリコサミノグリカンのヒドロキシル基に硫酸化フコースのヒドロキシル基がグリコシド結合しているグリコサミノグリカンを意味し、グリコサミノグリカンはその構成二糖単位あたり硫酸化フコース残基の分岐鎖を０．８〜１．２分子有している。グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸が挙げられる。
【００２０】
硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンとして、好ましくは硫酸化フコ−ス残基の分岐鎖を有するコンドロイチン硫酸であり、より好ましくは下記式（Ｉ）の構成二糖単位を有する、硫酸化フコース残基の分岐鎖をもつコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくはナマコ類由来の、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するコンドロイチン硫酸（ＳＣ−ＣＳ）である。ＳＣ−ＣＳは、下記式（Ｉ）に示されるように、主鎖として、β−Ｄ−グルクロン酸（以下ＧｌｃＡという）の１位とＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン（以下ＧａｌＮＡｃという）の３位とがグリコシド結合したコンドロイチン硫酸タイプのポリマーを有しており、かつ、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が硫酸化されたＥタイプの二糖単位を主鎖構成糖として含有する。
【００２１】
【化３】
【００２２】
本発明のＳＣ−ＣＳは、上記基本構造の主鎖に、側鎖として、硫酸化フコース残基を２〜３残基、すなわち２個の硫酸化フコース残基からなる基（硫酸化フコビオシル基）及び／又は３個の硫酸化フコース残基からなる基（硫酸化フコトリオシル基）より成る分岐鎖構造を有し、二糖単位の構成単位あたり２〜３分子、好ましくは２．５〜３分子、特に好ましくは２．８〜３分子の硫酸化フコース残基を有している。また、二糖単位の構成単位あたり３〜６分子、好ましくは４〜６分子、特に好ましくは５〜６分子、最も好ましくは５．４〜５．８分子の硫酸基を有している。
ゲル濾過法により求めたこれらＳＣ−ＣＳの平均分子量は、４５〜５５kDa、好ましくは４７〜５３kDa、特に好ましくは４９〜５１kDaである。特筆すべき特徴として、ＳＣ−ＣＳはコンドロイチナーゼＡＢＣ及びＡＣのいずれによっても酵素消化されない。
【００２３】
このＳＣ−ＣＳの硫酸化フコース残基を部分的に脱離（部分脱分岐化）して得られるＳＣ−ＣＳをコンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、イオン交換高速液体クロマトグラフィーで分析した場合の不飽和二糖組成より本発明のＳＣ−ＣＳ主鎖の基本構造を特定することができる。
ＳＣ−ＣＳは、それが由来する海産無脊椎動物、例えばナマコ類、ウニ類等から単離でき、ナマコ類としては、マナマコ（Stichopus japonicus）、クロナマコ（Holthuria atra）、ニセクロナマコ（Holothuria leurospilota）、アラスカ産ナマコ（Parastichopus californicus）、ブラジル産ナマコ(Ludwigothurea grisea)などが挙げられる。尚、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
【００２４】
海産無脊椎動物からのＳＣ−ＣＳの取得は公知の方法で実施することが出来、例えば、ナマコ類の体壁の生体試料あるいは乾燥粉末を原料とし、ＧＡＧ類を生体組織から単離・精製するために用いられる公知の方法[Kariya et al.(1990)J.Biol.Chem.,265,5081-5085]に準拠して製造できる。また、特開２００３−２５２９０６公報に記載の方法に準拠して製造することもできる。
しかしながら、硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンの製法は上記に限定されず、グリコサミノグリカンに硫酸化フコースを化学的手法により結合させる方法によることもできる。
【００２５】
本発明のギャップ機能抑制剤における有効成分として使用される硫酸化ポリフコースは、フコイダンあるいはフカン硫酸とも呼ばれ、硫酸エステルを有するフコースのポリマーである。より具体的には種々の褐藻類植物から熱水抽出された下記の硫酸化ポリフコースが挙げられる。
褐藻Fucus vesiculosus由来の硫酸化ポリフコースは、これまで最もよく研究されてきたもので、既に市販されており、その分子構造が下記構造式１に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献７）。
【００２６】
【化４】
【００２７】
褐藻Ascophyllum nodosum由来の硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式２に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献８）。
【化５】
【００２８】
褐藻Chorda filum由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式３に示した繰り返し単位から成ることが報告されている（前記非特許文献９）。
【化６】
上記構造式１〜３に示した硫酸化ポリフコースは、構成糖としてフコースのみを含む点で共通性を有している。
【００２９】
褐藻Sargassum nodosum由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式４に示した部分構造のみが明らかにされており（前記非特許文献１０）、全構造の解明に至らない理由としては構造が高度にヘテロジーナスであるためと説明されている。また、この硫酸化ポリフコースは、マンノース（Ｍａｎ）やグルクロン酸（ＧｌｃＡ）などフコース以外の構成糖を有している。
【化７】
【００３０】
褐藻Cladosiphon okamuranus由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式５に示した繰り返し単位から成ることが、（前記非特許文献１１）に報告されている。この硫酸化ポリフコースは、側鎖にグルクロン酸（ＧｌｃＡ）を有している。
【化８】
【００３１】
褐藻Ecklonia kurome由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式６に示した４種の部分構造のみが明らかにされており（前記非特許文献１２）、全構造の解明に至らない理由としては構造が高度にヘテロジーナスであるためと説明されている。また、この硫酸化ポリフコースは、ガラクトース（Ｇａｌ）などフコース以外の構成糖を有している。
【００３２】
【化９】
【００３３】
更に、海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースとして、例えば下記のものが挙げられる。
ナマコLudwigothurea grisea由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式７に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１０】
【００３４】
ウニArbacia lixula由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式８に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１１】
【００３５】
ウニLytechinus variegatus由来硫酸化ポリフコースの分子構造は、下記構造式９に示した繰り返し単位から成ることが（前記非特許文献１３）に報告されている。
【化１２】
【００３６】
上記の海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースは、硫酸基とフコース残基のみから成り、側鎖構造を有さない点で、褐藻類植物由来硫酸化ポリフコースとはその構造を異にする。
一方、ごく最近海産無脊椎動物の一種であるマナマコ体壁からフコース側鎖を有する下記の硫酸化ポリフコースが見出されている（前記非特許文献１４）。
これは、構造式１０に示すとおり主鎖結合が［→３Fucα１→］の結合からなり、その主鎖中には構成単位フコース残基の主として４位に、若干量が２位にFuc、Fuc(4S)、Fuc(2S)あるいはFuc(2S,4S)を側鎖として有する残基が全体の５０％程度存する。
【００３７】
【化１３】
【００３８】
本発明において上記公知の硫酸化ポリフコースも有効成分として用いられるが、本発明で好ましく用いられる新規な硫酸化ポリフコース（以下ＦＳと記載することもある）は、主鎖として、［→3Fucα1→］nのポリマーを有し、かつ、主鎖Fuc残基の１０％程度の残基の４位あるいは２位から、Fuc、Fuc(4S)あるいはFuc(2S,4S)が側鎖として伸展しており、また、主鎖Fuc残基は部分的に４位、または２位と４位が硫酸化されているものである。フコースを主要成分とする構成中性糖1残基あたり、平均して０．８〜１．２分子、好ましくは０．９〜１．１分子の硫酸基を有している。
【００３９】
本発明ＦＳ中には、フコース以外の単糖として、少量のガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び痕跡量のＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びウロン酸が含まれる。また、ゲル濾過法により求めた同物質の平均分子量は、８０〜１２０kDa、より好ましくは９０〜１１０kDaである。特筆すべき特徴として、ＦＳは、上記ナマコLudwigothurea griseaあるいはウニ由来の硫酸化ポリフコースとは異なり、上記のように硫酸化フコース残基の側鎖を有する。
上記一連の公知硫酸化ポリフコースの構造とＦＳの構造を比較すると、ＦＳの構造は構造式１及び構造式３に近いものであるが、フコース分岐の様式が一部異なり、主鎖の硫酸化部位も異なる。また、ＦＳの主鎖の構造は、構造式７及び構造式９に似ているが、それらはフコース分岐を有さない点でこのＦＳの構造とは異なる。よって、ＦＳは従来公知の構造とは異なる新たな構造を有するものであり、この新規ＦＳはアラスカ産ナマコ(Parastichopus californicus)より抽出され、公知の硫酸化ポリフコースとはFuc分岐含有率が大きく異なり、非特許文献１４に開示された公知の硫酸化ポリフコースのFuc分岐含有率が約５０％であるのに比し、本発明ＦＳのFuc分岐含有率は、５〜２０％、好ましくは８〜１５％、より好ましくは９〜１１％である。ここで、Fuc分岐含有率は、主鎖骨格のフコースに対する分岐を有するフコースの割合を表す。
【００４０】
上記、硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン並びに硫酸化ポリフコースは、後述の実施例に記載の通り、NHDF cellsを用いたギャップ機能測定系においてギャップ機能を有意に抑制する作用を発現した。
【００４１】
（ギャッップ機能抑制剤）
本発明のギャップ機能抑制剤（以下ＧＪ抑制剤ということもある）は、in vivo又はin vitroにおいて隣り合う細胞同士の連絡、特にＧＪを介した細胞間連絡を抑制する細胞間連絡抑制剤である。本発明ＧＪ抑制剤の効果は、例えばEnviron. Sci.Technol.29,2923-2928(1995)に記載された、色素（蛍光色素）移行(Scrape-loading and dye transfer：SLDT)法により、容易に確認することが可能である。
このような細胞間連絡抑制剤の有効成分が「硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン」である場合は、生体内に存在するグリコサミノグリカンと近似した構造を有するため、あるいは「硫酸化ポリフコース」である場合は、体によい成分で、健康食品または機能性食品として用いられている成分であるため、生体に対し極めて高い安全性を有していると考えられる。従って、本発明のＧＪ抑制剤は、たとえばてんかん、血管内再狭窄、糸球体腎炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び動脈硬化症等の予防または治療薬としての使用可能性を有する。
【００４２】
本発明ＧＪ抑制剤を上記疾患の予防や治療に用いる場合、有効成分である上記硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン及び硫酸化ポリフコースの有するギャップ機能抑制作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、これらの多糖はその薬理学的に許容されうる塩の形で用いる事も可能である。薬理学的に許容されうる塩としては前述の条件を満たしていれば特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またピリジン塩、ジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などのうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、特にナトリウム塩が好ましい。
【００４３】
また同様に、本発明の有効成分である上記硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン及び硫酸化ポリフコースを上記疾患の予防や治療に用いる場合、これらの有するギャップ機能抑制作用を実質的に損なわず、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。本発明有効成分を含有するギャップ機能抑制剤の剤型及び投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、軟膏剤等に製剤化して、経口、注射、塗布等の投与経路のうち、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能である。
尚、本発明ギャップ機能抑制剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、投与対象患者の体重や具体的症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、本発明の有効成分物質として１日当たり概ね０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度を、１日１回〜数回に分けて投与する事が考えられる。
【００４４】
（細胞増殖促進剤）
本発明のＧＪ抑制剤は後述の実施例６により明らかなように細胞増殖活性が認められるため、細胞増殖促進剤としても使用することが可能である。
本発明の細胞増殖促進剤は、硫酸化フコース残基を有する多糖、より詳細には硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカン又は硫酸化ポリフコースを有効成分とする細胞増殖促進剤である。
この細胞増殖促進剤の有効成分としての上記「硫酸化フコース残基の分岐鎖を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコース」は上記本発明のＧＪ機能抑制剤に記載した物質と同義である。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、これらの実施例により限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの製造
原料のアラスカ産ナマコ(Parastichopus californicus)乾燥粉末５４０ｇを４Ｌの蒸留水に懸濁して１２０℃、３０分条件下のオートクレーブ処理を施した後、１００ｍＭリン酸緩衝液 (ｐＨ８．０)中に溶解した。得られた懸濁液に対し、蛋白質１ｇあたり５０ｍｇの蛋白分解酵素Actinase E（科研製薬（株）製）を加えて、５５℃にて８ｈｒ、攪拌下コラーゲンやコアプロテイン等の共存タンパク質を消化した。同様の消化をさらに３回繰り返した後、酵素消化物を０．４Ｍ ＮａＯＨ水溶液、次いで１０％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)で順次処理した。反応混液から遠心分離により上清を回収し、流水透析を行った。適度に濃縮した透析内液を凍結乾燥することにより粗精製物を得た。
【００４７】
こうして得られた粗精製物２．０ｇを少量の０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液に溶解し、同溶媒で平衡化したSepharose CL-6B（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム(φ８．０×９５ｃｍ)に付し、溶出液を７０ｍｌ毎に回収した。得られた各フラクションにつき波長２１０ｎｍにおける吸光度［ＯＤ(Optical Density)］の測定、カルバゾール法によるウロン酸含量の測定［ＯＤ：波長５３０ｎｍ］およびアンスロン法による中性糖含量の測定（ＯＤ：波長６２０ｎｍ）を行った結果、高分子域に硫酸化ポリフコースと目されるアンスロン陽性、カルバゾール陰性のピークが見出されたのでこれに相当する画分を合一回収し(画分Ｉ)、凍結乾燥によりパウダー(２８２ｍｇ)を得た。また、そのすぐ後にＳＣ−ＣＳと目されるアンスロン陽性、カルバゾール陽性のピークが見出されたのでこれに相当する画分を合一回収し(画分ＩＩ)、凍結乾燥によりパウダー(５５５ｍｇ)を得た。
各フラクションの波長２１０ｎｍ、５３０ｎｍ、６２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）をそれぞれ○、□、●で図１に示した。
【００４８】
［実施例２］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの物理化学的性状解析
実施例１で調製した二種の画分（Ｉ、ＩＩ）につき、ヘキソサミン含量、ウロン酸含量、硫酸イオン含量ならびに中性糖含量をそれぞれ下記化学組成分析法に従った定量分析によって分析した。
ヘキソサミン含量：ＭＢＴＨ法[Hurst&Settine(1981)Anal.Biochem.,115,88-92]、
ウロン酸含量：カルバゾール法[Bitter&Muir(1962)Anal.Biochem.,4,330-334]、
硫酸イオン含量：イオンクロマトグラフィー法、
中性糖含量：アンスロン法[Dimler,R.L et al.(1952)Anal.Chem.,24,1411-1414]
各構成成分のモル存在量(ｍｍｏｌ／ｇ)を算出したうえ、中性糖あるいはヘキソサミンを１として各成分のモル比を算出し、表１に示した。
【００４９】
画分Iでは、硫酸基及び中性糖を各々、４．１０ｍｍｏｌ／ｇ及び３．７９ｍｍｏｌ／ｇ 含み、中性糖に対する硫酸基の割合は１．０８（モル比）であり、ヘキソサミンを若干量、ウロン酸を痕跡量含んでいた(表1参照)。画分IIでは、硫酸基及び中性糖を各々、４．５２ｍｍｏｌ／ｇ 及び２．３６ｍｍｏｌ／ｇ 含み、ヘキソサミンとウロン酸をほぼ等モルづつ含んでいた(表１参照)。
これらの画分の分析結果と文献値を比較すると、前者(画分Ｉ)は公知マナマコ硫酸化ポリフコース（非特許文献１４）とやや異なるのに対し、後者(画分ＩＩ)は公知マナマコＳＣ−ＣＳ（非特許文献３；非特許文献４）とほぼ同等の組成を示した。
【００５０】
対比した公知マナマコ硫酸化ポリフコースの糖鎖骨格はフコースがα1→3グリコシド結合したコアポリマーであり、主としてＯ−４位から、微量にはＯ−２位から１残基のフコース側鎖が分岐している。また、各フコース残基はＯ−２位及び／またはＯ−４位に於いて硫酸化されている。一方、公知マナマコＳＣ−ＣＳの構成単位はＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合したものであり、Ｄ−ガラクトサミンのＯ−４位及び／またはＯ−６位、さらにはＤ−グルクロン酸のＯ−３位に硫酸化フコース２残基より成るフコース側鎖(硫酸化フコビオシル基)がグリコシド結合した構造を有している。
従って、構成単位成分において画分Ｉは、公知のマナマコ硫酸化ポリフコースと差異があり、画分ＩＩは公知のマナマコＳＣ−ＣＳと同等である。
【００５１】
次いで、画分Ｉ及び画分ＩＩにつき、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行い、分子量を測定した。その結果、画分Ｉの分子量は、１０５ｋＤａ、画分ＩＩの分子量は、５０ｋＤａであることが判明した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
次いで、画分Ｉ及び画分ＩＩにつき、それらを構成する中性糖を同定するためにYasuno,S. et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,1353-1359 に記載された方法に従って単糖組成分析を行った。すなわち、１０ｍｇ／ｍｌに調製した画分Ｉ及び画分ＩＩの２００倍希釈液からそれぞれ５０μｌをとり、５０μｌの８Ｍ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加して封管した。反応混液を１００℃にて３ｈｒ加熱することにより、グリコシド結合ならびに硫酸エステル結合を開裂させた。冷却後、遠心分離して反応混液を反応管の底に集め、開管した。ドライエアーを吹き付けて溶媒を飛ばした後、４０μｌの２−プロパノールを添加・撹拌した。次いで、再度ドライエアーを吹き付けて溶媒を除去した。
こうして得られた単糖試料につき、２０μｌの蒸留水及び８０μｌの４−アミノ安息香酸エチルエステル(ＡＢＥＥ)試薬を添加した後、封管し８０℃にて１ｈｒ加温することにより還元アミノ化反応を進行させた。こうして還元端がＡＢＥＥ標識された単糖誘導体（以下、ＡＢＥＥ化単糖ということもある）を生成した。反応終了後、開管し２００μｌの蒸留水並びに２００μｌのクロロホルムを添加した。この溶液を激しく撹拌した後、遠心分離を行い上清中に上記単糖誘導体を得た。
【００５４】
７％アセトニトリルを含む０．２Ｍ ホウ酸緩衝液(ｐＨ８．９)で平衡化した Honenpak-C18（生化学工業（株）販売）カラム(φ４．６×７５ｍｍ)を装着したＨＰＬＣに、上記ＡＢＥＥ化単糖試料をアプライし、同溶媒のアイソクラティック溶出条件により分析を実施した。なお、用いた単糖標品は、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、アラビノース（Ａｒａ）、リボース（Ｒｉｂ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミンン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ） (溶出順)である。表２に示したように、画分Ｉ及び画分ＩＩ由来の主要ＡＢＥＥ化単糖試料は、いずれもＦｕｃであった。ただし、画分Iでは、Ｆｕｃに加え、少量のＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ及び痕跡量のＧａｌＮＡｃが検出された。画分ＩＩでは、Ｆｕｃに加え少量のＧａｌＮＡｃが検出された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
次いで、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の４０ｍｇを０．０５Ｍ Ｈ２ＳＯ４水溶液４ｍｌに溶解し、８０℃にて６ｈｒの加水分解反応に付した。反応混液を室温まで冷却することによって反応を停止させ、１Ｍ ＮａＯＨを添加して中和した後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したCellulofine GCL-90m（生化学工業（株）販売）カラム(φ３．４×１１０ｃｍ)に付し、溶出液を１０ｍｌごとに分取した。そして、高分子画分を分取した後、透析して脱塩し凍結乾燥することにより部分的脱分岐化ＳＣ−ＣＳを調製した[Kariya et al.(2002)J.Biochem.,132,335-343]。
こうして得た部分的脱分岐化ＳＣ−ＣＳにつき、コンドロイチナーゼＡＢＣによる酵素消化物の不飽和二糖組成分析を実施した。すなわち、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製）酵素消化物につき、上清をYMC-PA120S5（YMC社製）カラム(φ４．０×２５０ｍｍ)を装着した強塩基性陰イオン交換(SAX-)HPLCに付し、MIlliQ Waterと０．８Ｍ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４溶液の直線的濃度勾配システム(16mM→520mM/38min)で溶出し、２３０ｎｍの吸光度で検出した。不飽和二糖スタンダードとしてコンドロイチン硫酸タイプのDDi-0S, DDi-6S, DDi-4S, DDi-SD [DDi-(2,6)S], DDi-SE [DDi-(4,6)S]およびDDi-triS [DDi-(2,4,6)S]を用いた。これらの記号は、下記式ＩＩで示される二糖組成中の各置換基が下表３の通りであるものを示す。
【００５７】
【化１４】
【００５８】
【表３】
【００５９】
上記二糖組成分析の結果を下記表４に示した。この結果は公知マナマコ体壁ＳＣ−ＣＳの場合にほぼ匹敵しており、本実施例で製造したＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)は実際に硫酸化フコースの側鎖を有するコンドロイチン硫酸Ｅであることを確認した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
［実施例３］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの構造解析
画分Ｉ(硫酸化ポリフコース)及び画分ＩＩ(ＳＣ−ＣＳ)から各５ｍｇをとり、それぞれを蒸留水で平衡化したAmberlite （ローム・アンド・ハース社、登録商標）IR-120カラム(φ１．５×１２ｃｍ)にアプライした。得られた溶出画分のうちの酸性画分につき、適量のピリジンを添加して中和した後、凍結乾燥に付して、画分Ｉ及び画分ＩＩのピリジン塩を得た。それぞれにつき、１ｍｌの１０％蒸留水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、８０℃にて５時間ソルボリシス反応を進行させた。反応は、室温まで冷却することにより停止させ、３倍量の蒸留水を添加した後、２Ｍ ＮａＯＨを適量添加してｐＨを９〜９．５に調整した。これを流水に対し一晩透析した後、凍結乾燥することにより、画分Ｉ及び画分ＩＩの脱硫酸化物をそれぞれ３ｍｇ及び３．３ｍｇ得た。
【００６２】
硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びその脱硫酸化物、さらにＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)及びその脱硫酸化物の計４画分から、それぞれ１ｍｇ をとりHakomoriの方法[Hakomori, S.(1964)J.Biochem.(Tokyo),55, 205-208]を一部改変したSanfordとConradの方法[Sanford,P.A. & Conrad,H.E.(1966)Biochemistry,5, 1508-1517]に従ってメチル化誘導体を合成した。得られたメチル化誘導体は、Waegheらの方法[Waeghe et al.(1983)Carbohydr.Res.,123, 281-304]に従って脱塩した。さらに、これらを２Ｍ ＴＦＡを用い１２１℃で加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）を用いて還元した。最後に、還元処理により出現したヒドロキシル基をアセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト(ＰＭＡＡ)を合成した。得られたＰＭＡＡを５０μｌのアセトンに溶解し、そのうちの１μｌをガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）に付した。ＧＣ−ＭＳ分析は、Supelco社製SP2330キャピラリーカラム(f0.25 mm x 30 m)を装着したShimadzu社製QP5,000型マススペクトロメーターを用いて、スプリットレスモードで行った。カラムオーヴンは、５０℃に２分間保ち、次いで３０℃／分の勾配で１７０℃まで昇温、さらに４℃／分の勾配で２３５℃まで昇温させ、この温度に１５分保った。
【００６３】
硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)のクロマトグラムに於いては、下記７種類のＰＭＡＡが観察された(表５)。
2,3,4-tri-O-methyl-fucitol(T-Fuc)、
2,4-di-O-methyl-fucitol(3-Fuc)、
2,3-di-O-methyl-fucitol(4-Fuc)、
4-O-methyl-fucitol(2,3-Fuc)、
3-O-methyl-fucitol(2,4-Fuc)、
4-O-methyl-fucitol(3,4-Fuc)、
fucitol(2,3,4-Fuc)
3,4-di-O-methyl-fucitol(2-Fuc)は観察されなかった。以下の記載に於いては、上記括弧内に示したＰＭＡＡの略称を用いて説明をする。
【００６４】
硫酸化ポリフコースの脱硫酸化物のクロマトグラムは、硫酸化ポリフコースのクロマトグラムとは大きく様相を異にした（表５）。すなわち、出現したＰＭＡＡは、3-Fucが主要であり、ほぼ等量のT-Fuc、2,3-Fuc及び3,4-Fucの三種類のマイナー成分も検出された。従って、これらの結果より、硫酸化ポリフコースの構造は、［→3Fucα1→］ｎの主鎖の２位または４位からFucが枝分かれしているものであり、各Fuc残基に対し硫酸基が４位または２位と４位に配位しているものと考えられた。
【００６５】
ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)のクロマトグラムに於いては、４種類のＰＭＡＡが観察された(表５)。それらは、3-Fuc、2,3-Fuc、3,4-Fuc、及び2,3,4-Fucである。ＳＣ−ＣＳの脱硫酸化物のクロマトグラムは、ＳＣ−ＣＳのクロマトグラムとは大きく様相を異にしていた。すなわち、出現したＰＭＡＡは、少量のT-Fucと主要な3-Fucのみから成っていた。これらの結果より、ＳＣ−ＣＳの構造は、コンドロイチン硫酸ＥのコアポリマーからFucα1→3FucまたはFucα1→3Fucα1→3Fucの側鎖が分岐しており、それらの２位及び／または４位の水酸基が硫酸化されているものと推察された。
【００６６】
【表５】
【００６７】
［実施例５］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースのギャップ機能抑制活性測定
ヒト皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cells)の細胞間連絡機能に及ぼす硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の効果は、被検物質を培地中に添加し、Scrape-Loading and Dye Transfer(SLDT)法に従って評価した。一方、ヒト間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cell; hMSC cells）の細胞間連絡機能に及ぼす上記物質の効果についても同様の方法により評価した。
【００６８】
具体的には、まずNHDF cellsあるいはヒト間葉系幹細胞（1 x10５/ml; 2 ml medium/dish）をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）(35mm dish)に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて４時間培養した後、培地中に2 mg/ml濃度の硫酸化ポリフコース(画分Ｉ：ＦＳ)、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)、褐藻フコイダン(Sigma社製)あるいはコンドロイチン硫酸Ｅ(生化学工業社製：ＣＳＥ)をそれぞれ添加(1 ml/dish)した。これらの無添加のものをコントロールとした。その後、引き続き細胞を４日間継続培養し、100%コンフルエント状態を維持した。次いで、リン酸緩衝生理的食塩水［PBS(+)］で４回洗浄した後、そのコンフルエント細胞層の表面にカミソリで直線的に切れ目をつけた。そして、１ｍｌの０．１％濃度の蛍光物質(Lucifer yellow)をdishに入れて５分間培養した後、PBS(+)で４回洗浄した。この状態に於いて、dishを蛍光顕微鏡で観察・測定し、蛍光強度につきNIH画像解析法を用いて分析・数値化した。ここで得られる数値が大きければ、ＧＪを介した細胞間連絡が亢進され、小さければ抑制されていることを示す。ＧＪ機能抑制能のアッセイ結果を示す図２中、＊Ｐは有為差を示す統計用語で、例えば＊Ｐ＜０．０１は「有為水準片側 １％」を意味し、以下の図においても同様の意味を表す。
【００６９】
その結果、培養４日目のNHDF cells培地の場合(図２)には、ＳＣ−ＣＳはコントロールと比較してギャップ機能を約半分にまで抑制した。一方、硫酸化ポリフコース（ＦＳ）はＳＣ−ＣＳよりはやや弱いもののやはりギャップ機能を抑制した。フコイダンもギャップ機能を抑制したが、その程度はＳＣ−ＣＳや硫酸化ポリフコースよりもやや低かった。コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）は、ほとんどギャップ機能の抑制効果を示さなかった。
ヒト間葉系幹細胞培地の場合(図３)には、NHDF cells培地の場合と様相を異にした。すなわち、フコイダンが約２０％程度、ＳＣ−ＣＳが約１０％程度ギャップ機能を抑制する傾向にあったものの、その抑制の程度はNHDF cells培地に於ける抑制に比較してずっと弱かった。
【００７０】
［実施例６］
ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコースの細胞増殖活性測定
ヒト皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast; NHDF cells)の細胞増殖に及ぼす硫酸化ポリフコース(画分Ｉ)及びＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)の効果は、被検物質を培地中に添加し、Alamar blue-staining法に従って評価した。一方、ヒト間葉系幹細胞の細胞増殖能に及ぼす上記物質の効果についても同様の方法により評価した。
【００７１】
具体的には、まずNHDF cellsあるいはヒト間葉系幹細胞(1 x10５/ml; 2 ml medium/dish)をDMEM培地(35mm dish)に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて４時間培養した後、培地中に２ｍｇ／ｍｌ濃度の硫酸化ポリフコース(画分Ｉ：ＦＳ)、ＳＣ−ＣＳ(画分ＩＩ)、褐藻フコイダン(Sigma社製)あるいはコンドロイチン硫酸Ｅ(生化学工業社製：ＣＳＥ)を添加(1 ml/dish)した。これらの無添加のものをコントロールとした。その後、引き続き細胞を４日間継続培養した後、Alamar blue-staining法に従って細胞増殖につき数値化して評価した。
【００７２】
その結果、NHDF cellsの場合(図４)、ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコース（ＦＳ）は、コントロールに比較して４倍以上細胞増殖を促進した。フコイダンではそれらよりやや劣るもののやはり増殖を促進した。コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）の増殖促進はコントロールの２．５倍程度に留まった。一方、ヒト間葉系幹細胞培地の場合(図５)、ＳＣ−ＣＳ及び硫酸化ポリフコース（ＦＳ）は、コントロールに比較して８倍以上と大変強く細胞増殖を促進した。フコイダンでは７倍弱の増殖促進であり、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）でも６倍強の増殖促進を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Sehparose CL-6Bカラムクロマトグラフィーの溶出パターン
【図２】SLDT法によるNHDF細胞のギャップ機能抑制能のアッセイ結果
【図３】SLDT法によるヒト間葉系幹細胞のギャップ機能抑制能のアッセイ結果
【図４】Alamer blue染色法によるNHDF細胞の増殖能のアッセイ結果
【図５】Alamer blue染色法によるヒト間葉系幹細胞の増殖能のアッセイ結果
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤。
【請求項２】
多糖が硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである請求項１に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項４】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項５】
グリコサミノグリカンが、下記式（Ｉ）で示される構成二糖単位を有するコンドロイチン硫酸である請求項４に記載のギャップ機能抑制剤。
【化１】
【請求項６】
硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンが海産無脊椎動物由来のグリコサミノグリカンである請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項７】
硫酸化ポリフコースが褐藻類植物由来または海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースである請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項８】
海産無脊椎動物がナマコ類である請求項６または７に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項９】
硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする細胞増殖促進剤。
【請求項１０】
多糖が硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである請求項９に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
フコース同士がα１→３グリコシド結合により伸長した直鎖構造を基本骨格とし、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−４位のみ、あるいはＯ−２位およびＯ−４位の双方が部分的に硫酸化され、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−２位あるいはＯ−４位にフコース残基または硫酸化フコース残基の分岐を有し、該フコース残基または硫酸化フコース残基の分岐含有率が５〜２０％であり、重量平均分子量が８０，０００〜１２０，０００である硫酸化ポリフコース。
【請求項１】
硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするギャップ機能抑制剤。
【請求項２】
多糖が硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである請求項１に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項４】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項５】
グリコサミノグリカンが、下記式（Ｉ）で示される構成二糖単位を有するコンドロイチン硫酸である請求項４に記載のギャップ機能抑制剤。
【化１】
【請求項６】
硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンが海産無脊椎動物由来のグリコサミノグリカンである請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項７】
硫酸化ポリフコースが褐藻類植物由来または海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースである請求項２に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項８】
海産無脊椎動物がナマコ類である請求項６または７に記載のギャップ機能抑制剤。
【請求項９】
硫酸化フコース残基を有する多糖またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする細胞増殖促進剤。
【請求項１０】
多糖が硫酸化フコース残基の分岐を有するグリコサミノグリカンまたは硫酸化ポリフコースである請求項９に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
フコース同士がα１→３グリコシド結合により伸長した直鎖構造を基本骨格とし、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−４位のみ、あるいはＯ−２位およびＯ−４位の双方が部分的に硫酸化され、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−２位あるいはＯ−４位にフコース残基または硫酸化フコース残基の分岐を有し、該フコース残基または硫酸化フコース残基の分岐含有率が５〜２０％であり、重量平均分子量が８０，０００〜１２０，０００である硫酸化ポリフコース。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１６３１３（Ｐ２００６−１６３１３Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９３２３３（Ｐ２００４−１９３２３３）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（５０１３９３７７１）
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（５０１３９３７７１）
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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