グランザイムＢプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．７９）を用いた融合タンパク質の酵素開裂により真正形態の興味のあるポリペプチドを調製する方法。興味のあるポリペプチドおよび融合パートナーを含む融合タンパク質も提供され、ここにおいて興味のあるポリペプチドと融合パートナーの間の結合領域は、興味のあるポリペプチドに隣接するグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位、およびシステイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに突然変異しているヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種を含む。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、グランザイムＢプロテアーゼの使用による組み換え産生された融合タンパク質の酵素開裂により真正形態の興味のあるポリペプチドを調製する方法に関する。さらに、本発明は、グランザイムＢ開裂部位を含む融合タンパク質、およびヒトグランザイムＢ変種に関する。
【０００２】
（背景技術）
高度に精製され、よく特徴づけられた形態における医薬タンパク質などの組み換えポリペプチドの製造および精製は、一般に蛋白質工学の分野、特に製薬業界における主な課題になっている。
このような組み換えポリペプチドの調製は、しばしば、融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質としてのポリペプチドの産生を含む技術に依存し、ここにおいて興味のあるタンパク質またはポリペプチドは担体または融合パートナー、例えばポリペプチドまたはタンパク質と融合する。
【０００３】
興味のあるポリペプチドと融合した融合パートナーまたは担体の存在は、前記融合タンパク質をタンパク質分解に対してさらに耐性にし、向上された発現および分泌を促進し、溶解度を改善し、融合タンパク質のその後のアフィニティー精製を可能にすることができるという利点を有する。さらに、融合タンパク質発現により、潜在的な生体有害物質、例えばペプチドホルモンを不活性形態において製造することができ、これを次いで融合パートナーの開裂によりインビトロで活性化することができる。
しかしながら、融合パートナーは、例えば興味のあるポリペプチドの生物学的活性または安定性に影響を及ぼし得、タンパク質が臨床的に使用されるならば、抗原性の問題を起こし得るので、このような融合タンパク質は通常最終生成物として好適でない。従って、融合タンパク質を開裂させて、興味のあるポリペプチドを放出する必要がある。
【０００４】
原則として、これは化学的または生化学的方法、例えば酵素開裂により達成することができる。しかしながら、例えば興味のあるポリペプチドの生体活性により非常に影響を及ぼし得るので、開裂は高度に特異性であり、興味のあるポリペプチドと融合パートナー間の開裂配列、すなわち接合領域においてのみ起こるが、好ましくは興味のあるポリペプチドそれ自体内では起こらないことが重要である。このような方法は、ペプチド結合の加水分解により作用する薬剤を使用し、開裂剤の特異性は、開裂されるペプチド結合またはその付近のアミノ酸残基の同一性により決定される。
融合タンパク質を開裂するための生化学的方法は、プロテアーゼ（タンパク分解酵素）の使用に基づく。しかしながら、融合タンパク質の酵素開裂は、開裂部位に特異的なアミノ酸が同時に興味のあるポリペプチドそれ自体においても存在し得る点で限定されている。従って、興味のあるポリペプチドと融合パートナー間の開裂部位に加えて、興味のあるポリペプチド中に特定のアミノ酸配列が再度存在する可能性は、開裂配列の認識および開裂に必要なアミノ酸の数が大きくなるほど低くなるので、開裂させるために、１つのアミノ酸だけでなく、アミノ酸の配列を認識する酵素が特に好適である。
【０００５】
現在までのところ、適当な条件下でプロテアーゼと融合タンパク質を接触させることにより融合タンパク質を酵素開裂するために多くのプロテアーゼが用いられてきた。
ＷＯ０３／０１０２０４は、この文献によると、ユビキチンなどのタンパク質のＣ末端でアミノ酸配列ＲＧＧの隣に結合したペプチドを開裂する酵素であるユビキチン開裂酵素の使用により、興味のあるポリペプチドを融合タンパク質から分離するための方法に関する。
米国特許第６０１０８８３号は、血液凝固因子Ｘａ（ＥＣ３．４．２１．６；限定されたタンパク分解によりプロ酵素因子Ｘから形成されるＳ１セリンタイプペプチダーゼ）が融合タンパク質から融合パートナーを開裂するために使用される方法を開示している。このプロテアーゼはアミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ここにおいてＸはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＡｌａであり、ＹはＧｌｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｓｎである）の後を切断する。Ｘａ因子は好ましくは開裂配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの後を切断する。
【０００６】
融合タンパク質を特異的に開裂するための方法において示唆され、使用されてきた他の先行技術の酵素は、タバコエッチウイルスＮｌａプロテイナーゼ、コラゲナーゼ、エンテロキナーゼ、サブチリシンおよびスロンビンを包含する。
しかしながら、融合タンパク質系においてタンパク分解開裂を用いる場合、いくつかの問題が生じる。１つの主な問題は、融合タンパク質の非特異性タンパク分解攻撃が起こり、その結果、いくつかの位置で開裂が起こり、その結果、生成物が失われ、汚染フラグメントが生じることである。また、融合タンパク質の非効率的または不完全な開裂に関する問題が現在公知の酵素に関してしばしば起こる。このような効率の悪い開裂は、収率を低下させ、精製されたタンパク質に不均一性を導入し、その結果、所望のタンパク質の小さなフラクションしか回収されない。
【０００７】
融合タンパク質開裂に現在適用される酵素のいくつかに関連するさらなる問題は、擬似または異質アミノ酸がしばしば開裂されたポリペプチド産物（興味のあるポリペプチド）に結合することである。これらのアミノ酸は典型的にはリンカーが開裂した場合に存在し、関係のないアミノ酸残基が結果として得られる興味のあるポリペプチドの性質に影響を及ぼし得る。これは人間の治療のために製造されるタンパク質について重大である。従って、異質アミノ酸短配列または残基のない純粋な真正ポリペプチドを製造できることが非常に望ましい。
開裂後の興味のあるポリペプチド上に残存する異質アミノ酸に関する問題は、米国特許第４５４３３２９号において説明されており、この特許はコラゲナーゼの使用により融合タンパク質を選択的に開裂する方法を記載する。しかしながら、この酵素の使用により、そのＮ末端に異質アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する興味のあるポリペプチドが産生される。真正形態における興味のあるポリペプチドを得るためには、これらの異質アミノ酸（ＧｌｙおよびＰｒｏ）はその後、１以上の異なるアミノペプチダーゼ（例えば、アミノアシルプロリンアミノペプチダーゼおよびプロリンアミノペプチダーゼ）の使用によりさらなる工程において除去されなければならない。
【０００８】
この問題は、米国特許第５４２７９２７号にも説明され、この特許は、ＩｇＡプロテアーゼの使用による融合タンパク質の配列特異的開裂の方法を記載し、ここにおいて、ＩｇＡプロテアーゼ認識部位は融合タンパク質の接合領域中に挿入され、これはその後ＩｇＡプロテアーゼで開裂される。ＩｇＡプロテアーゼの認識部位は、アミノ酸配列Ｙ−Ｐｒｏ↓Ｘ−Ｐｒｏであり、ここにおいて、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙは１またはいくつかの任意のアミノ酸であり、↓は開裂部位を示す。しかしながら、ＩｇＡプロテアーゼの開裂後に形成される興味のあるタンパク質は、そのＮ末端にＸ−Ｐｒｏ異質アミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。すなわち、結果として得られる興味のあるポリペプチドはその天然または真正形態でない。
現在、融合タンパク質開裂に最も広く用いられているタンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼＸａ因子およびスロンビンである。しかしながら、どちらの酵素も融合タンパク質の非特異的開裂を行うことが知られている。加えて、Ｘａ因子はウシ血清から単離されなければならず、その結果、これが治療用途のためにタンパク質を開裂するために用いられる場合、存在し得るウイルスおよびプリオンなどの病原性因子（例えば、プリオンは牛海綿状脳症を引き起こす）を検出するために高度の精製および分析がその後必要である。さらに、これらの酵素はかなり高価である。
【特許文献１】ＷＯ０３／０１０２０４
【特許文献２】米国特許第６０１０８８３号
【特許文献３】米国特許第４５４３３２９号
【特許文献４】米国特許第５４２７９２７号
【０００９】
従って、これらの従来技術の欠点および不利益を考慮して、本発明の目的は、融合タンパク質の酵素開裂のための改善された方法を提供することである。
前記の技術的問題は、融合タンパク質の酵素開裂にグランザイムＢプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．７９）を使用することにより克服できることが本発明者らにより見いだされた。かくして、グランザイムＢプロテアーゼが、高度の開裂特異性を有するグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を有する融合タンパク質の非常に効率のよい開裂を可能にすることが意外にも見いだされた。特に、グランザイムＢプロテアーゼは、現行の、広く用いられているプロテアーゼＸａ因子よりもさらに特異的な融合タンパク質開裂を行うことが証明された。さらに、Ｎ末端融合パートナーと興味のあるＣ末端ポリペプチドの間に位置するグランザイムＢ認識配列を含有する融合タンパク質のグランザイムＢ開裂（ここにおいて、開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接している）の結果、開裂部位に由来する異質アミノ酸を有さない興味のあるポリペプチド、すなわち真正形態のポリペプチドが得られることも証明された。従って、天然のアミノ酸配列を有する興味のある組み換えタンパク質を、グランザイムＢの融合タンパク質開裂の結果として得ることができる。また、グランザイムＢプロテアーゼは組み換えにより産生することができるという利点を有する。最後に、ヒトグランザイムＢにおいてシステインアミノ酸Ｎｏ．２２８（キモトリプシノゲンナンバリング）をフェニルアラニンで置換することにより、組み換えヒトグランザイムＢを産生する際に、さらに高い最終タンパク質回収率を得ることができることが見いだされた。
【００１０】
（発明の開示）
従って、本発明は、第一の態様において、真正形態における興味のあるポリペプチドの調製法に関する。この方法は：（ｉ）そのＮ末端からＣ末端までに、（ａ）融合パートナー、（ｂ）グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位、（ｃ）興味のあるポリペプチド（前記開裂部位が興味のあるポリペプチドに隣接している）を含む融合タンパク質を提供する工程、および（ｉｉ）前記融合タンパク質をグランザイムＢプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．７９）と接触させて、これを前記開裂部位で開裂させて、真正形態の興味のある前記ポリペプチドを得る工程を含む。
【００１１】
さらに別の態様において、そのＮ末端からＣ末端までに（ａ）融合パートナー、（ｂ）グランザイムＢ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位、および興味のあるポリペプチドを含む融合タンパク質が提供され、ここにおいて、前記開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接している。
システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに突然変異しているヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種も提供される。
さらに別の態様において、このような融合タンパク質またはヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種をエンコードする単離された核酸配列、単離された核酸配列を含む組み換えベクター、かかるベクターで形質転換された宿主細胞、および融合タンパク質またはヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種の産生法であって、（ｉ）プロモーターに操作可能に結合した、かかる組み換えベクターを提供する工程、（ｉｉ）前記組み換えベクターで宿主細胞を形質転換する方法、（ｉｉｉ）前記宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現する条件下で培養する工程、および（ｉｖ）所望により前記融合タンパク質またはヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種を単離する工程を含む方法が提供される。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
一態様において、本発明は融合タンパク質の酵素開裂により真正形態の興味のあるポリペプチドを形成する方法に関する。従って、この方法は、前記のように、そのＮ末端からＣ末端までに、融合パートナー、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位および興味のあるポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する工程を含み、ここにおいて開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接した位置にある。融合タンパク質をその後グランザイムＢプロテアーゼと接触させて、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位で融合タンパク質を開裂させ、真正形態の興味のあるポリペプチドを得る。本明細書において用いられる場合「融合タンパク質」なる用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを意味する。
【００１３】
本発明に従って、真正形態の興味のあるポリペプチドを産生する方法が提供される。本明細書において用いられる場合、「真正形態」なる用語は、任意の追加のアミノ酸残基がないアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。前記のように、融合タンパク質開裂に現在適用される酵素のいくつかに関連する主な問題は、擬似または異質アミノ酸がしばしば開裂したポリペプチド産物に結合したままであり、すなわちその結果、「真正形態」でないポリペプチドが得られることである。従って、この点に関して、真正形態の興味のあるポリペプチドとは、興味のあるポリペプチドをコードする天然の遺伝子配列によりエンコードされるものと同じ第一アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する、すなわち、任意の非天然のアミノ酸を含有しない。「天然の遺伝子配列」は必ずしも天然に存在する遺伝子配列でなくてもよいが、部分的または完全に人工的であってもよい。同様に、真正形態の興味のあるポリペプチドは必ずしも天然に存在するポリペプチドでなくてもよいが、部分的または完全に人工的であってもよい。対照的に、「非真正」ポリペプチドは、興味のあるポリペプチドをコードする天然の遺伝子配列によりエンコードされない少なくとも１つのアミノ酸を含有する。
【００１４】
本発明によると、興味のあるポリペプチドと融合パートナー間の接合領域は、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を有するグランザイムＢプロテアーゼ認識部位を含む。このような認識部位とは、グランザイムＢに融合パートナーと興味のあるポリペプチド間の接合領域を認識させ、開裂させる所定のアミノ酸配列を意味する。開裂部位は従って、融合タンパク質の開裂が起こるアミノ酸配列の２つのアミノ酸間の部位として理解される。接合領域は、興味のあるポリペプチドの一部でない任意の適当な長さのリンカー配列の形態であってもよい。しかしながら、真正形態の興味のあるポリペプチドを得るためには、グランザイムＢ開裂部位は、その結果として得られる興味のあるポリプチドに結合したままである擬似または異質アミノ酸が生じないでそのＮ末端での融合タンパク質の特異的開裂を可能にするために、興味のあるポリペプチドのＮ末端に隣接した位置にある。従って、「隣接する」なる用語は、数例においてはリンカー配列の後にあるか、またはリンカー配列の一部であるグランザイムＢ認識配列は、グランザイムＢ開裂部位が興味のあるポリペプチドのＮ末端に隣接する様な位置にあることを意味する。
【００１５】
グランザイムは、標的細胞認識後、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞による細胞傷害性防御反応に関与する顆粒貯蔵セリンプロテアーゼである。グランザイムの主な機能は、ウイルスに感染した細胞および他の潜在的に有害な細胞の死を誘発することである。グランザイムＢはグランザイムの１種であり、標的細胞と接触すると、方向的に開口分泌され、パーフォリン（細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞により発現される細胞溶解性タンパク質）により助けられて標的細胞に侵入する。グランザイムＢは様々なプロカスパーゼを処理し、活性化させ、これにより標的細胞におけるアポトーシスを誘発する。本発明によると、「グランザイムＢプロテアーゼ（本明細書においてはＧｒＢとも言う）」なる用語は、酵素命名データベース、Ｒｅｌｅａｓｅ３４（２００４年２月）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｅｎｚｙｍｅ）において酵素寄託番号ＥＣ３．４．２１．７９で分類されるかまたは分類することができる酵素を包含する。従って、本発明によると、ヒトグランザイムＢプロテアーゼ、マウスグランザイムＢプロテアーゼおよびラットグランザイムＢプロテアーゼをはじめとする任意の好適なグランザイムＢプロテアーゼを用いることができる。本発明の方法が人間の治療用タンパク質生成物の調製に用いられる場合、ヒトグランザイムＢを使用するのが一般に好ましい。ヒトグランザイムＢプロテアーゼは、生物学的機能がよく知られているほとんどのヒト組織において存在する。従って、最終治療用タンパク質生成物における微量の残留グランザイムＢの存在は、治療用タンパク質生成物が投与される患者に対して最小の危険性しか示さない。従って、活性なグランザイムＢプロテアーゼが人間の血流中に注入されるならば、これはアルファ−２−マクログロブリンにより迅速にトラップされ、複合体はＬＲＰ除去レセプターにより除去される。グランザイムＢプロテアーゼは、別の名前「細胞傷害性ｔ−リンパ球プロテイナーゼ２”」でも呼ばれる。
【００１６】
グランザイムＢプロテアーゼはアスパルテート残基（Ｄ）後の開裂に対して優先傾向を有することが知られ、グランザイムＢはＰ１−タンパク質分解特異性を有することが知られている唯一の哺乳動物セリンプロテアーゼである。従って、本発明によると、有用な具体例におけるグランザイムＢ開裂部位は、前記開裂部位に対してＮ末端に位置するＰ１位でアスパルテート残基を少なくとも含むと考えられる。現在公知のグランザイムＢプロテアーゼ認識部位のいくつかは、Ｈａｒｒｉｓら（１９９８）において開示されている。従って、有用な具体例において、認識部位は開裂部位に対してＮ末端に位置する一般式：Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓のアミノ酸配列を有し、ここにおいて、Ｐ４は好ましくはアミノ酸ＩまたはＶであり、Ｐ３は好ましくはアミノ酸Ｅ、ＱまたはＭであり、Ｐ２はＸであり、ここにおいてＸは任意のアミノ酸であり、Ｐ１は好ましくはアミノ酸Ｄであり、↓はグランザイムＢプロテアーゼの開裂部位である。
【００１７】
本発明者らにより、グランザイムＢプロテアーゼは、興味のあるポリペプチド上に非天然アミノ酸が残留することなく、融合タンパク質から興味のあるポリペプチドを開裂させることができることが見いだされた。特に、グランザイムＢは、Ｐ１’−Ｐ４’位、すなわち、開裂部位後のアミノ酸位で特定のアミノ酸残基について厳密な要件なしにＰ１位後の融合タンパク質からポリペプチドを認識し、開裂させることが意外にも見いだされた。これは、従来技術における知見と反対である。例えば、Ｓｕｎら（２００１）において、グランザイムＢ基質のＰ１’−Ｐ４’残基は基質結合に重要であると結論づけられ、基質に対する最高の親和性は、酸性Ｐ４’残基が存在する場合（すなわち、アスパルテートまたはグルタミン酸のいずれか）に観察される。さらに、Ｈａｒｒｉｓら（１９９８）は、グランザイムＢがＰ２’位のグリシン残基に対して強力な優先性を有すると結論づけた。これらの従来技術の知見にもかかわらず、グランザイムＢプロテアーゼは一般に、Ｐ１’−Ｐ４’位で特定のアミノ酸残基を必要とせず、融合タンパク質から興味のあるポリペプチドを開裂させるために用いることができる。
【００１８】
前述のように、本発明のさらなる具体的な利点は、グランザイムＢプロテアーゼが、高度の開裂特異性を有する興味のあるポリペプチドに対してＮ末端に位置するグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を有する融合タンパク質の非常に有効な開裂を可能にするという知見である。特に、グランザイムＢプロテアーゼは現在、融合タンパク質開裂に広く使用されているプロテアーゼ、すなわちＸａ因子よりもさらに特異的な融合タンパク質開裂を行うことが見いだされた。従って、以下の実施例から明らかになるように、Ｘａ因子開裂可能な融合タンパク質としてあらかじめ調製された５つの異なる融合タンパク質がグランザイムＢプロテアーゼにより開裂された場合、その結果、Ｘａ因子に関して見られるのと同程度、またはさらにはより特異的である開裂性能が得られる。これは、例えば実施例８および融合タンパク質Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰおよびＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰのそれぞれＸａ因子およびグランザイムＢでの消化の長時間にわたるＰＡＧＥ分析を示す関連する図１１からわかる。この実験から、３０分後に、両プロテアーゼでの融合タンパク質の本質的に完全な開裂が起こったことが明らかにわかる。しかしながら、グランザイムＢと比較してより多くの分解生成物がＸａ因子の使用により生じた。これは、グランザイムＢが非常に特異的であり、さらには広く用いられるプロテアーゼＸａ因子よりもさらに特異的であることを明らかに示す。グランザイムＢの高度のバーサティリティーおよび柔軟性は、グランザイムＢが比較的短いＮ末端タグ、例えばｈｅｘａ−Ｈｉｓテールを興味のあるポリペプチドから開裂させることができ、かつ短いリンカー配列により非常に近接して連結された融合パートナーと興味のあるポリペプチドを開裂させることができるという発見により本明細書においてさらに実証される。
【００１９】
必要ではないが、ある実施形態において、興味のあるポリペプチドが融合タンパク質の一部である場合に、Ｎ末端でアミノ酸Ｐ１’およびＰ２’を含み、その結果、式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’（式中、Ｐ１’はＸであり、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｐ２’はＧである）の一般的なグランザイムＢ認識部位を得るように興味のあるポリペプチドを選択するのが有利である。グランザイムＢプロテアーゼはＰ１’位に関して厳密なアミノ酸選択性を有さないが、この位置で、Ｔｒｐ（Ｔ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）およびＩｌｅ（Ｉ）をはじめとする大きな疎水性アミノ酸について一般的な優先傾向がある。従って、有用な一実施形態において、Ｐ１’位のアミノ酸は、Ｔ、Ｌ、ＦおよびＩから選択される。ある実施形態において、Ｐ２’位でＰｒｏ（Ｐ）を含まないのが有利である。本発明のさらに別の態様において、興味のあるポリペプチドが融合タンパク質の一部である場合、Ｎ末端がＰ４’位で酸性アミノ酸、例えばＤまたはＥを含むように選択されるのが有利である。
【００２０】
本発明の状況において、「アミノ酸」および「アミノ酸残基」なる用語は、あらゆる天然に存在するＬ−アルファ−アミノ酸を意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを包含することを意味する。アミノ酸は、３文字または１文字表示のいずれかにより識別される：
Ａｓｐ、Ｄ：アスパラギン酸 Ｉｌｅ、Ｉ：イソロイシン
Ｔｈｒ、Ｔ：スレオニン Ｌｅｕ、Ｌ：ロイシン
Ｓｅｒ、Ｓ：セリン Ｔｙｒ、Ｙ：チロシン
Ｇｌｕ、Ｅ：グルタミン酸 Ｐｈｅ、Ｆ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ、Ｐ：プロリン Ｈｉｓ、Ｈ：ヒスチジン
Ｇｌｙ、Ｇ：グリシン Ｌｙｓ、Ｋ：リシン
Ａｌａ、Ａ：アラニン Ａｒｇ、Ｒ：アルギニン
Ｃｙｓ、Ｃ：システイン Ｔｒｐ、Ｗ：トリプトファン
Ｖａｌ、Ｖ：バリン Ｇｌｎ、Ｑ：グルタミン
Ｍｅｔ、Ｍ：メチオニン Ａｓｎ、Ｎ：アスパラギン
Ｎｌｅ、Ｊ：ノルロイシン Ｏｒｎ、Ｏ：オルニチン
Ｈｃｙ、Ｕ：ホモシステイン Ｘｘｘ、Ｘ：任意のＬ−アルファ−アミノ酸
【００２１】
さらに有用な実施形態において、グランザイムＢプロテアーゼ認識部位は、ＩＣＰＤ↓、ＩＥＡＤ↓、ＩＥＰＤ↓、ＩＥＴＤ↓、ＩＱＡＤ↓、ＩＳＡＤ↓、ＩＳＳＤ↓、ＩＴＰＤ↓、ＶＡＰＤ↓、ＶＡＴＤ↓、ＶＣＴＤ↓、ＶＤＰＤ↓、ＶＤＳＤ↓、ＶＥＫＤ↓、ＶＥＱＤ↓、ＶＧＰＤ↓、ＶＥＩＤ↓、ＶＲＰＤ↓、ＶＴＰＤ↓、ＬＥＥＤ↓、ＬＥＩＤ↓、ＬＧＮＤ↓、ＬＧＰＤ↓、ＡＱＰＤ↓から選択されるアミノ酸配列を有する（ここにおいて、↓はグランザイムＢの開裂部位である）。これらの認識部位および開裂部位は、Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら（１９９９）により既に記載されている。
【００２２】
本発明によると、「興味のあるポリペプチド」または「所望のポリペプチド」は、その発現が融合タンパク質内であるのが望ましいポリペプチドを意味する。本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」なる用語は、必ずしも興味のある所望のポリペプチドのサイズに関する制限を示すものではない。従って、この用語は、その広義において解釈されるべきであり、従って、ジ、トリ、テトラ、ペンタおよびヘキサペプチドなどのオリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含するおよそ５０までまたはそれ以上のペプチドを包含する。興味のあるポリペプチドは、中間体生成物または最終生成物であってもよく、例えば医療分野、研究、環境保護、または工業プロセスまたは生成物において用いることができる。既に記載されているように、融合タンパク質において、興味のあるポリペプチドは、もう一つのタンパク質またはタンパク質ドメイン、融合パートナーと結合または融合して、例えば興味のあるポリペプチドの安定性を向上させ、融合タンパク質の精製を容易にする。有用な実施形態において、興味のあるポリペプチドは、例えば分泌されたタンパク質などのタンパク質である。分泌されたタンパク質は、医薬および診断薬を包含する様々な工業用途を有する。現在利用可能なほとんどのタンパク質薬、例えば血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、および様々な他のサイトカインは分泌されたタンパク質である。有用な実施形態において、興味のあるポリペプチドは、ポリペプチドホルモン、たとえば、ソマトトロフィン、グルカゴン、インシュリンまたはインターフェロン、単鎖抗体可変領域フラグメント（ｓｃｆｖ）、またはアポリポタンパク質、例えばアポリポタンパク質ａ−ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶである。
【００２３】
本発明のさらにもう一つの態様において、興味のあるポリペプチドは、酵素、例えばグランザイムＢである。従って、本発明に従って融合タンパク質を提供し、グランザイムＢプロテアーゼを興味のあるポリペプチドとして選択することにより、自己活性化グランザイムＢプロテアーゼが提供され、これは不活性プログランザイムＢを提供する可能性をもたらし、これはその後、主に活性グランザイムＢプロテアーゼの一分子を添加することにより活性化することができる。これにより、例えばその活性化に関して外部アクチベーター生物製剤の添加に依存しないプログランザイムＢが提供される。以下の実施例から明らかになるように、グランザイムＢ自己活性化は、定量的に進行して完了し、さらに数日間インキュベーションに付されたグランザイムＢプロテアーゼの自己活性化サンプルは、安定な活性レベルを保持し、最小量の自己分解生成物を生じることが判明した。これは明らかに、自己活性化グランザイムＢプロテアーゼは、実施例５および図３に示すように、自己分解（カニバリズム）に対して非常に安定であるという利点を有することを示す。
【００２４】
融合パートナーは、本発明によると、テトラペプチド、ペンタペプチドおよびヘキサペプチドを包含するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であるとするならば、任意の安定な種類のものである。融合タンパク質をタンパク質分解に対してさらに耐性にし、融合タンパク質の向上された発現および分泌を促進し、溶解度を向上させ、その後の融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にするように選択することができる。
本発明の融合タンパク質は、有用な実施形態においてはアフィニティータグである融合パートナーを含む。このようなアフィニティータグは、例えばアフィニティー樹脂上での融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインである。アフィニティータグは、ヘキサヒスタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、またはマルトース結合タンパク質を包含するポリヒスチジンタグでもある。
【００２５】
前述のように、ヒトグランザイムＢプロテアーゼ、マウスグランザイムＢプロテアーゼおよびラットグランザイムＢプロテアーゼをはじめとする任意の適当なグランザイムＢプロテアーゼは、本発明に従って用いることができる。しかしながら、以下の実施例から明らかになるように、ヒトグランザイムＢプロテアーゼにおいてシステイン残基Ｎｏ．２２８（キモトリプシノゲンナンバリング）をフェニルアラニンで置換することにより、ヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種が提供され、その結果、ヒトグランザイムＢを産生する場合に、開裂特異性または結果として得られるグランザイムＢの活性に目立った程度に影響を及ぼすことなく最終タンパク質収率が高くなることが判明した。この知見は、アミノ酸フェニルアラニン（芳香族アミノ酸）はシステイン（親水性アミノ酸）と化学的に非常に異なり、従ってシステイン置換について通常選択されないので、予想されるものと反対である。従って、本発明の好ましい実施形態において、本発明のグランザイムＢプロテアーゼは、システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに突然変異しているヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種である。「ヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種」なる用語は、システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）突然変異に加えて、天然のヒトグランザイムＢプロテアーゼの完全長配列において、あるいは様々なドメインにおいてさらなる変化を有する変種、例えば完全長天然グランザイムＢプロテアーゼのＮまたはＣ末端で１以上のアミノ酸残基が付加されているか、または欠失しているグランザイムＢプロテアーゼ変種も包含する。このようなさらなる変化は、例えば当該分野において公知の保存的または非保存的突然変異についての技術およびガイドラインの任意のものを用いて行うことができる。変化は、ヒトグランザイムＢプロテアーゼをエンコードし、その結果、好ましくはヒトグランザイムＢプロテアーゼ特異性および／または活性に悪影響を及ぼすことなくヒトグランザイムＢプロテアーゼの天然の配列と比較してヒトグランザイムＢプロテアーゼのアミノ酸配列に変化をもたらす１以上のコドンの置換、欠失または挿入である。また、完全長天然グランザイムＢアミノ酸配列のフラグメント、例えばシステイン残基２２８番の突然変異を有する活性化形態は、「ヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種」の意味するものに含まれる。有用な実施形態において、グランザイムＢプロテアーゼ変種は、配列番号５７に示される変種である。
【００２６】
一般に、融合パートナーは、簡単な単離に寄与する特徴に基づいて典型的には選択され、最も望ましくは、融合タンパク質を産生する微生物により容易に分泌されるものである。例えば、ポリヒスチジン配列、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびマルトース結合タンパク質は、これらが結合でき、溶出できる容易に入手可能なアフィニティーカラムがあるので一般に好ましい。
本発明の方法は、有用な実施形態において、融合タンパク質の酵素開裂により形成される興味のあるポリペプチドを単離するためのその後の単離工程を含む。この単離工程は、イオン交換、サイズによる分画およびアフィニティー精製の使用を包含するタンパク質単離の分野において公知の任意の適当な手段により行うことができ、その選択は、興味のあるポリペプチドの性質に依存する。従って、興味のあるポリペプチドは、アフィニティー精製の目的で、例えば前記アフィニティータグシステムを用いて、結果として得られる興味のあるポリペプチドの単離に備えるためにＣ末端結合したアフィニティータグをさらに含むことができる。
【００２７】
本発明にしたがって、融合タンパク質をグランザイムＢプロテアーゼと接触させて、興味のあるポリペプチドと隣接するグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位で融合タンパク質を開裂させて、真正形態において興味のあるポリペプチドを得る。この反応は、グランザイムＢを用いてバッチごとに行うことができるか、あるいは例えば吸着、共有結合、エントラップメントまたは膜コンファインメントにより、固定化形態においてグランザイムＢプロテアーゼを用いることにより行うことができる。固定化グランザイムＢプロテアーゼの適当な担体は、通常の担体、例えば、ポリアクリルアミド、キチン、デキストラン、カッパカラギーナン、セライトおよびセルロースを包含する。不溶性マトリックスに対する共有結合による酵素の固定化は、広く用いられている技術である。リシン残基は、その広範囲におよぶ表面暴露および高い反応性のために、不溶性支持体に酵素を共有結合させるために最も一般的に有用な基であることが判明している。従って、有用な実施形態において、グランザイムＢプロテアーゼは、リシンアミノ酸残基により固定化される。さらに別の態様において、グランザイムＢプロテアーゼはそのＣ末端で、例えばヘキサヒスチジンタグをはじめとするポリヒスチジンタグにより固定化される。反応は、遊離グランザイムＢプロテアーゼを膜型のバイオリアクターと組み合わせて用いることによるか、または連続型バイオリアクターを固定化グランザイムＢプロテアーゼと共に用いることにより行うこともできる。
【００２８】
以下の実施例から明らかになるが、ヘキサヒスチジンなどのポリヒスチジン融合パートナーを含む遊離融合タンパク質（すなわち固定化されていないもの）の開裂に必要な時間は、融合タンパク質をＮｉ^２＋イオンおよびニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）の存在下でグランザイムＢプロテアーゼと接触させる場合に著しく減少することが意外にも判明した。この開裂速度の顕著な増加の主な理由は、Ｎｉ^２＋イオンが融合タンパク質のＮ末端ポリヒスチジン融合パートナーと結合し、グランザイムＢプロテアーゼが開裂部位に接近するのを促進するためであると考えられる。さらに、ＮＴＡの添加は、溶液中のＮｉ^２＋イオンをＮｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム上と同様にシールドし、これにより融合タンパク質および得られるタンパク質の両方の沈殿を回避すると考えられる。このような開裂プロセスを行う場合、Ｎｉ^２＋の濃度が１〜２０ｍＭの範囲であり、ＮＴＡの濃度が１〜２０ｍＭの範囲であるのが一般的に好ましい。さらに、温度は好ましくは１５〜５０℃の範囲（２０〜４５℃の範囲を含む）である。好ましい実施形態において、温度は２０〜３０℃の範囲、例えば約２３℃である。別のあまり好ましくない実施形態において、温度は３０〜４５℃の範囲、例えば約３７℃である。しかしながら、最適温度範囲は異なる温度での融合タンパク質の安定性に一部依存するので、各融合蛋白質について決定されなければならない。
【００２９】
本発明に従って、既に記載したように、そのＮ末端からそのＣ末端までに、（ａ）融合パートナー、（ｂ）グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位、および（ｃ）興味のあるポリペプチドを含む融合タンパク質も提供され、ここにおいて開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接する。有用な実施形態において、興味のあるポリペプチドはグランザイムＢであり、これは自己活性化グランザイムＢプロテアーゼを提供する。特に、そのＮ末端からそのＣ末端までに、グランザイムＢ認識部位および開裂部位とそれに続いて活性化ヒトグランザイムＢのアミノ酸配列、そして最後にグランザイムＢのＣ末端に融合したヘキサ−ヒスチジンタグ（Ｈ６）を有する７のアミノ酸残基プロ配列を含む自己活性化ヒトプログランザイムＢ融合タンパク質が提供される。従って、グランザイムＢ開裂部位は、活性化グランザイムＢのアミノ酸配列のＩｌｅ１６（キモトリプシノゲンナンバリング）に隣接した位置にある。さらに詳細には、ヒト自己活性化グランザイムＢ融合タンパク質ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号２）およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号３）が提供される。既に記載されるように、システイン残基（キモトリプシノゲンナンバリング）をアラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、またはフェニルアラニン（Ｐ）と部位指向性突然変異により置換することが有利であることが判明している。従って、さらに有用な実施形態において、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ（配列番号５）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ（配列番号６）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖ（配列番号７）、およびｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ（配列番号８）からなる群から選択される自己活性化融合タンパク質が提供される。
【００３０】
本発明の融合タンパク質またはグランザイムＢプロテアーゼ変種は、融合タンパク質をエンコードするベクターで形質転換された宿主を融合タンパク質が発現される条件下で培養することにより、任意の適当な標準的タンパク質発現系において発現することができる。好ましくは、発現系は、それから所望の融合タンパク質が容易に単離され、インビトロでリホールドされ得る系である。一般的問題として、高収率のタンパク質を得ることができ、有効な精製およびリホールディング法が利用可能であるので、原核生物発現系が好ましい。しかしながら、特に望ましい哺乳動物、昆虫、真菌および細菌宿主細胞を包含する多くの宿主細胞を記載された融合タンパク質の形質転換および発現に適切に選択することができる。通常用いられる細菌種としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をはじめとするエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）が挙げられる。従って、当業者らは実験を行わずに適当な、または好ましい宿主および発現系を選択することができる。同様に、本発明の融合タンパク質の第一アミノ酸配列が一旦選択されると、当業者らは、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの因子を考慮して、本発明の融合タンパク質またはグランザイムＢプロテアーゼ変種をエンコードする適当な組み換え核酸配列またはＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。これらの組み換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に対して適切な多くの発現ベクターの任意のものにフレーム内に挿入することができる。適当または好ましい発現ベクターの選択も当業者の能力および裁量の範囲内である。好ましくは、発現ベクターは組み換え構築物の発現を行うための強力なプロモーターを含む。
【００３１】
最後に、本発明の融合タンパク質またはグランザイムＢプロテアーゼ変種の製造法であって、（ｉ）プロモーターに操作可能に結合した本発明の融合タンパク質またはグランザイムＢプロテアーゼ変種をエンコードする単離された核酸配列を含む組み換えベクターを提供する工程、（ｉｉ）宿主細胞をこの組み換えベクターで形質転換する工程、（ｉｉｉ）融合タンパク質を発現する条件下で宿主細胞を培養する工程、および（ｉｖ）任意に融合タンパク質またはグランザイムＢプロテアーゼ変種を単離する工程を含む方法が提供される。
【００３２】
本発明を例として以下の非制限的実施例および図面において説明する。
（図面の記載）
図１は、以下の比色検定を用いて数日間追跡したＧｒＢ−Ｈ６のＦＸ_ａとのインキュベーションの活性を示す：５００μｌの緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、４μｌの１００ｍＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡおよび５μｌのＧｒＢ−Ｈ６。１００μｌのＧｒＢ−Ｈ６（約１０μｇ）と１μｌのＦＸ_ａとの混合物をインキュベーションの間４℃に維持し、活性を０時間、２時間、５時間、１９時間、２日および５日後に測定した。
【００３３】
図２は、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの両方のいくつかの発色性基質：Ａｃ−ＩＥＰＤ−ρＮＡ、Ａｃ−ＬＥＥＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ｐＮＡ、およびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡに対する活性を示す。活性検定は、５００μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７５）中、基質濃度４００μＭで、各測定について１μｇのプロテアーゼを添加して行った。測定はすべて２３℃で３回行い、得られた活性は、Ａｃ−ＩＥＰＤ−ρＮＡに関して測定された活性を１００％に設定することにより標準化した。
【００３４】
図３、パネル（Ａ）は、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、４℃、２３℃、および３７℃でインキュベーションして得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
レーンＡ〜Ｎの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、インキュベーション前
Ｃ：４℃で１日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｄ：４℃で３日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｅ：４℃で６日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｆ：４℃で１５日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｇ：２３℃で１日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｈ：２３℃で３日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｉ：２３℃で６日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｊ：２３℃で１５日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｋ：３７℃で１日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｌ：３７℃で３日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｍ：３７℃で６日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
Ｎ：３７℃で１５日インキュベートしたＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
【００３５】
レーンＢはそのままのＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを示す。そのままのプロテアーゼのこのバンドは、全てのレーンにおいて見られる（１）。レーンＩ〜Ｎにおいて、別のバンドが出現し（２）、これはプロテアーゼの分解生成物であり、おそらくは配列ＩＱＤＤ↓ＦＶにおけるＡｓｐ５０およびＰｈｅ５１間の自動開裂により生じたものである。
【００３６】
図３、パネル（Ｂ）は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、４℃、２３℃、および３７℃でインキュベートし、０、６、（１０）、および１５日後に測定したＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆのサンプルの活性を示す。活性は、５００μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および４００μＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ中、各測定についてインキュベーションから得られる０．２μｇのＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを添加して測定した。
【００３７】
図４は、ＧｒＢ−Ｈ６と１２時間インキュベーションした後のＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３インキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
レーンＡ〜Ｊの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：１２時間インキュベーションした後のＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ単独
Ｃ：１２時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｄ：１２時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｅ：ＦＸ_ａと共にインキュベートしたＨ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＵＢ
Ｆ：１２時間インキュベーションした後のＦ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独
Ｇ：１２時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｈ：１２時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｉ：レーンＤおよびＨにおけるのと同じ濃度でのＧｒＢ−Ｈ６単独
Ｊ：ＦＸ_ａで開裂されたネズミＨ６−ＦＸ−ＴＮ１２３
【００３８】
レーンＢは、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ（１）であって、ＧｒＢ−Ｈ６が添加されていないものを示し、一方、レーンＣおよびＤは、１および１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６が添加された２つのインキュベーションを示す。これらのレーンのどちらにおいても、開裂反応の生成物；正しく開裂されたＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ（２）が非開裂融合タンパク質に加えて見られる。レーンＥにおいて、ＧｒＢ認識部位ＩＥＰＤの代わりにＦＸ_ａ認識部位ＩＱＧＲを含有する構築物Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＵＢをＦＸ_ａにより開裂させて、ＧｒＢ−Ｈ６開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰと同じサイズの生成物を得る。
【００３９】
レーンＦ〜Ｊは１２時間後のＧｒＢ−Ｈ６＋Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３インキュベーションを示す。レーンＦにおいて、非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３（３）が示される。レーンＧおよびＨは、Ｃａ^２＋が存在しない場合にＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３がどれくらいＧｒＢ−Ｈ６により開裂されるかを示す（４）。バンドパターンを図１２において示す。レーンＪにおいて、ネズミＨ６−ＦＸ−ＴＮ１２３構築物は、ＦＸ_ａにより開裂され、正しく開裂された生成物のサイズを示す。
図において（５）により示したのは、１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６が添加されたサンプルにおいてと同じ濃度のＧｒＢ−Ｈ６の位置である。
【００４０】
図５は、インキュベーションの１２、１９および２４時間後のＧｒＢ−Ｈ６＋Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰインキュベーションからのサンプル、ならびにＧｒＢ−Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３インキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
レーンＡ〜Ｋの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：１２時間インキュベーション後のＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ単独
Ｃ：１２時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｄ：１９時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｅ：２４時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｆ：１９時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｇ：２４時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｈ：ＦおよびＧにおけるように希釈されたＧｒＢ−Ｈ６単独
Ｊ：１２時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独
Ｊ：１２時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｋ：１２時間インキュベーション後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
【００４１】
レーンＢは、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰを示す（１）。レーンＣ〜Ｅにおいて、正しく開裂された生成物はすべてのレーンにおいて見られ、図において（２）により示される。より多くのＧｒＢ−Ｈ６が添加され、インキュベーション時間がより長いほど、レーンにおいてより多くの開裂生成物が出現する。
図３におけるレーンＩ、Ｊ、およびＫは、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションについての図２におけるレーンＦ、Ｇ、およびＨと同じであるが、図３においては、より大きなサンプルをゲル上にかけた。バンドは従って図２よりもずっと明瞭である。（３）で示したバンドは、非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３であり、（４）、（５）、（６）および（７）で示されたバンドパターンを図１２において説明する。
【００４２】
図６は、図２および３におい観察される単純なバンドパターンを説明する。ＧｒＢ−Ｈ６が添加されない場合、開裂は起こらず、非開裂融合タンパク質からのバンドのみがゲルにおいて見られる。ＧｒＢ−Ｈ６が添加される場合、小さなＮ末端配列が開裂し、ゲルにおいて、残存する非開裂融合タンパク質に加えて正しく開裂された生成物が出現する。ＧｒＢ−Ｈ６により開裂される小さなＮ末端配列は小さすぎるのでＳＤＳゲル上では見ることができない。
【００４３】
図７、８および９は、添加無し（１）、４．２ｍＭのＮｉ^２＋を添加（２）、および４．２ｍＭのＮｉ^２＋＋５ｍＭのＮＴＡを添加（３）した、２３℃（図５）、３７℃（図６）および４２℃（図７）でのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
レーンＡ〜Ｋの説明（全ての温度について同じ）：
【００４４】
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ
Ｃ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、添加無し
Ｄ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、添加無し
Ｅ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、添加無し
Ｆ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋
Ｇ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋
Ｈ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋
Ｉ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋および５ｍＭのＮＴＡ
Ｊ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋および５ｍＭのＮＴＡ
Ｋ：２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌのＧｒＢ−Ｈ６、４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋および５ｍＭのＮＴＡ
【００４５】
Ｎｉ^２＋またはＮＴＡが添加されていない３つの図全てにおけるーンＣ〜Ｅにおいて（１）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ融合タンパク質は、異なる温度について異なる割合で開裂される。２３℃で２２時間後、融合タンパク質の約４０％が開裂した。３７℃および４２℃では２２時間後に２３℃よりも多くが開裂し、３７℃で約６０％、４２℃で５０％であった。
４．２ｍＭのＮｉ^２＋で、３７℃および４２℃で観察されるタンパク質の沈殿のために、２時間インキュベーションした後の融合タンパク質のさらなる開裂はゲルにおいて見られなかった。従って、図６（３７℃）および７（４２℃）におけるレーンＦ〜Ｈ（２）においては、図５（２３℃）におけるレーンＦ〜Ｈ（２）よりも少ないタンパク質が見られ、２２時間インキュベーションした後、融合タンパク質の約５０％が開裂して生成物になり、これはＮｉ^２＋を添加しないで開裂したものより多い。
４．２ｍＭ のＮｉ^２＋＋５ｍＭのＮＴＡをインキュベーションに添加すると、沈殿は観察されなかった。図５レーンＩ〜Ｋ（３）において、レーンＣ〜Ｅ（１）およびＦ〜Ｈ（２）よりも多くの生成物が見られ、従って、添加無しでわずか約４０％、Ｎｉ^２＋単独で５０％であるのに比較して、２３℃で、Ｎｉ^２＋およびＮＴＡの両方の存在下で２２時間インキュベーションした後に、融合タンパク質の約６０％が開裂した。
温度をさらに３７℃（図６レーンＩ〜Ｋ（３））および４２℃（図７レーンＩ〜Ｋ（３））まで上昇させることにより、開裂の速度においてさらに大きな増加が見られる。３７℃で２２時間インキュベーション後、ほとんど全ての融合タンパク質が開裂して正しい生成物になる。４２℃では２２時間後にほとんど開裂しない。
【００４６】
図１０は、１または１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６と共にＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰをインキュベーションしたものからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。レーン（Ａ〜Ｌ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：５時間インキュベーションした後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ単独
Ｃ：５時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｄ：５時間インキュベーションした後の２００μ；のＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｅ：２３時間インキュベーションした後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ単独
Ｆ：２３時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｇ：２３時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｈ：ＦＸ_ａで部分的に切断されたＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ、精製
Ｉ：ＦＸ_ａでほぼ完全に切断されたＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ、精製
Ｊ：２６時間インキュベーションした後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ単独
Ｋ：２６時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１μｌのＧｒＢ−Ｈ６
Ｌ：２６時間インキュベーションした後の２００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６
【００４７】
非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ（１）をレーンＢ、Ｅ、およびＪに示す。レーンＣおよびＤにおいて、前記のように１または１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６のいずれかとともにわずか５時間インキュベーションした後に全てのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰが開裂されて、最終生成物（２）が得られることは明らかである。これらのレーンに出現する２つの低い側のバンドを生じさせるＲＡＰにおける少なくとも１つの内部開裂部位があることも明らかである。すなわち、最終生成物はゲル上で２つのどちらも可視の断片に開裂される（３）。レーンＦおよびＧならびにレーンＫおよびＬは本質的にレーンＣおよびＤと同じであるが、ＲＡＰにおける見かけの内部部位においてより多くの開裂を生じさせるサンプルは後に（ＧｒＢ−Ｈ６とのインキュベーションの２３および２６時間後）採取された。
レーンＨおよびＩは、最終ＲＡＰ生成物を得るために、ＦＸ_ａにより部分的（レーンＨ）または完全（レーンＩ）に開裂されたＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰの精製されたサンプルを示す。これらのレーンにおいて、ＦＸ_ａによる内部開裂から得られる分解生成物を精製により除去した。
【００４８】
図１１は、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋ＧｒＢ−Ｈ６およびＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋ＦＸ_ａインキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。レーン（Ａ〜Ｏ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ単独 ２７時間インキュベーション後
Ｃ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ １／２時間インキュベーション後
Ｄ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ １時間インキュベーション後
Ｅ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ ３時間インキュベーション後
Ｆ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ ５時間インキュベーション後
Ｇ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ ７時間インキュベーション後
Ｈ：４００μｌのＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋１μｌのＦＸ_ａ ２７時間インキュベーション後
Ｉ：Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ単独 ２７時間インキュベーション後
Ｊ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ １／２時間インキュベーション後
Ｋ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ １時間インキュベーション後
Ｌ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ ３時間インキュベーション後
Ｍ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ ５時間インキュベーション後
Ｎ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ ７時間インキュベーション後
Ｏ：４００μｌのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋２μｌのＦＸ_ａ ２７時間インキュベーション後
【００４９】
レーンにおいて、Ｂ〜ＨはＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰインキュベーションからのサンプルであり（１）、ここにおいてレーンＢは非開裂Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰを示す。レーンＣ〜Ｈは、わずか半時間後にほとんど全ての融合タンパク質がＦＸ_ａにより開裂されて正しい生成物が得られることを示す。レーンＤ〜Ｇにおいて、いくつかの分解生成物が出現し、レーンＨにおいてはインキュベーションの２７時間後に融合タンパク質の全てが分解して、様々な小さな断片になり、正しく開裂された生成物は残っていない。
【００５０】
レーンＩ〜Ｏは、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰインキュベーションからのサンプル（２）を示す。レーンＩは、非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰを示し、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰに関しては、レーンＪに関して見られるように、わずか１／２時間ＧｒＢ−Ｈ６と共にインキュベーションした後にほとんど全てのＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰが正しく開裂された。レーンＫ〜Ｎにおいて、分解生成物が出現するが、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰインキュベーションほど多くない。レーンＯにおいて、２７時間のインキュベーション後、かなり多くの正しく開裂された生成物が残っている。
【００５１】
図１２は、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１＋ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦおよびＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋ＦＸ_ａインキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。レーン（Ａ〜Ｍ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１単独、０時間インキュベーション
Ｃ：４００μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、１時間インキュベーション
Ｄ：４００μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、３時間インキュベーション
Ｅ：４００μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、６時間インキュベーション
Ｆ：４００μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、２４時間インキュベーション
Ｇ：４００μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、４８時間インキュベーション
Ｈ：Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１単独、０時間インキュベーション
Ｉ：３５０μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、１時間インキュベーション
Ｊ：３５０μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、３時間インキュベーション
Ｋ：３５０μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、６時間インキュベーション
Ｌ：３５０μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、２４時間インキュベーション
Ｍ：３５０μｇ Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８、４８時間インキュベーション
【００５２】
レーンにおいて、Ｂ〜ＧはＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１インキュベーションからのサンプルであり（１）、ここにおいてレーンＢは非開裂Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１調製物を示す。レーンＨ〜Ｍは、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１インキュベーションからのサンプルを示し（２）、ここにおいてレーンＨは非開裂Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−Ａｐｏ１調製物を示す。そのままの、非開裂融合タンパク質の位置は、（３）により示される。（４）により示されるバンドは、正しく開裂されたＡｐｏＡ１生成物であり、一方、（５）により示されるバンドはＨ６Ｕｂｉ融合パートナーである。
【００５３】
図１３は、Ｃａ^２＋を添加せずに１２時間および５日間Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションして得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥである。一部のサンプルは還元されていた。レーン（Ａ〜Ｎ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ ５日のインキュベーション後
Ｃ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ ５日のインキュベーション後、サンプルは還元された
Ｄ＋Ｅ：Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独 ５日のインキュベーション後
Ｆ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ ５日のインキュベーション後
Ｇ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ ５日のインキュベーション後
Ｈ：ＧｒＢ−Ｈ６単独 ＣおよびＧにおいてと同様に希釈
Ｉ：Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独 １２時間インキュベーション後
Ｊ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ １２時間インキュベーション後
Ｋ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ １２時間インキュベーション後
Ｌ：Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独 １２時間インキュベーション後、サンプルは還元された
Ｍ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ １２時間インキュベーション後、サンプルは還元された
Ｎ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ １２時間インキュベーション後、サンプルは還元された
【００５４】
レーンＩ〜Ｋは、図２におけるレーンＦ〜ｈＨおよび図３におけるＩ〜Ｋ、すなわち０、０．２または２μｇのいずれかのＧｒＢ−Ｈ６ととも１２時間インキュベーションした後のサンプルと同じである。バンドパターン（１）は、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３のＴＮ１２３部分の内部開裂を示し、このパターンは図１２においてさらに説明する。レーンＤ〜Ｇは、５日後のインキュベーションを示し、ほとんどの融合タンパク質は開裂している。レーンＧ（１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６が添加されている）において、融合タンパク質のほとんど全ては２回；ＩＥＰＤ↓配列ならびに配列ＡＱＰＤ↓を有するＴＮ１２３における内部部位で開裂された（２）。
【００５５】
レーンＬ〜ＮおよびＢ〜Ｄは、それぞれ１２時間および５日後の同じサンプルを示すが、サンプルは還元されている。このバンドパターン（３）も図１２において説明され、ここでも融合タンパク質のほとんど全ては１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６で５日後に２回開裂された（レーンＣ）（４）。
【００５６】
図１４は、５ｍＭ Ｃａ^２＋を添加して１２時間および２日後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。一部のサンプルは還元された。レーン（Ａ〜Ｋ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６および５ｍＭ ＣａＣｌ_２、サンプルは還元された
Ｃ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６および５ｍＭ ＣａＣｌ_２、サンプルは還元された
Ｄ：Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３単独
Ｅ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６および５ｍＭ ＣａＣｌ_２
Ｆ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６およびＣａＣｌ_２無し
Ｇ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６および５ｍＭ ＣａＣｌ_２
Ｈ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６およびＣａＣｌ_２無し
Ｉ：ＧｒＢ−Ｈ６単独 ＧおよびＨにおいてと同様に希釈
Ｊ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１μｇ ＧｒＢ−Ｈ６およびＣａＣｌ_２無し、２日インキュベーション後
Ｋ：２００μｌ Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋１０μｇ ＧｒＢ−Ｈ６およびＣａＣｌ_２無し、２日インキュベーション後
【００５７】
レーンＢ〜ＨおよびＪ〜Ｋは、それぞれ１２時間および２日後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３とＧｒＢ−Ｈ６のインキュベーションを示す。
レーンＤは非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３を示す。レーンＥおよびＧ（＋５ｍＭ Ｃａ^２＋）をレーンＦおよびＨ（Ｃａ^２＋無し）と比較すると、５ｍＭ Ｃａ^２＋が存在すると２つのバンドしか出現しないが（１）、Ｃａ^２＋が存在しないと、図２、３、１０および１２に関して記載したように４つのバンドが出現する（２）。１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６とともに１２時間インキュベーション後、Ｃａ^２＋が存在する場合、融合タンパク質の約４０％が正しく開裂するが（レーンＧ）、Ｃａ^２＋が存在しない場合、２つの部位の開裂は少し速く起こる（レーンＨは１２時間後、Ｋは２日後）。レーンＫにおいて、融合タンパク質のほとんど全ては２回開裂された（３）。レーンＢおよびＣにおけるサンプルは還元され、依然として２つのバンド；非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３およびＨ６が除去された正しく開裂された生成物しか出現しない（４）。
【００５８】
図１５は、図２、３、１０および１１におけるＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で観察されるバンドパターンの概略図を示す。
【００５９】
（Ａ）：Ｃａ^２＋が存在しない場合、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３構築物は「ＧｒＢ−Ｈ６→」により示される２つの異なる部位で開裂される。開裂された小さなＮ末端部分は小さすぎるのでゲル上で見ることはできない。結果として得られる分子は、ジスルフィド結合によりつなげられた２つのポリペプチド鎖からなる。
【００６０】
（１）および（２）：非還元ゲルにおいて、（２）におけるバンドパターンは、開裂が完全でない場合に得られる。（１）は非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３であり、（２）において残存する非開裂融合タンパク質は、一番上から２番目のバンドである。（２）における一番上のバンドは内部部位、ＡＱＰＤ↓で開裂されたＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３であり、非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３と同じサイズであるが、それほど密でない分子を得る。一番下のバンドは、正しく開裂された融合タンパク質であり、一番上から三番目のバンドは２回；正しいＩＥＰＤ↓部位および内部ＡＱＰＤ↓部位の両方で開裂された融合タンパク質である。内部部位で開裂されると、分子はあまり密ではなく、従って正しく開裂された融合タンパク質よりもゲルにおいて移動距離が短い。
【００６１】
（３）および（４）：サンプルが還元されるならば、（４）におけるバンドパターンが観察される。任意のジスルフィド結合は破断され、ゲルにおいて１つのポリペプチド鎖しか見られない。（３）は、非開裂・還元Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３の位置を示す。（４）における一番上のバンドは、残存する非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３であるが、一番上から２番目のバンドは正しく開裂され、還元されたＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３である。還元条件下で、内部部位で開裂される分子は、ジスルフィド結合により連結されず、内部開裂後の２つのポリペプチドのうち大きい方のみをゲルにおいて見ることができる。従って、一番上から３番目のバンドは、内部開裂した融合タンパク質の大きい方の部分であり、一番下のバンドは、内部部位および正しいＩＥＰＤ↓部位の両方での開裂後のこの大きい方の部分である。
【００６２】
（Ｂ）：５ｍＭ Ｃａ^２＋がインキュベーションに添加される場合、内部開裂は観察されない。Ｃａ^２＋イオンは、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３分子と、ＧｒＢ−Ｈ６が内部ＡＱＰＡＤ↓部位で融合タンパク質から開裂するのを防止するような方法で結合する。ＡＱＰＤ↓部位を接近不可能にすると、開裂は正しいＩＥＰＤ↓部位でのみ起こる。
（５）および（６）：正しいＩＥＰＤ↓部位での開裂のみが起こる場合、（６）におけるバンドパターンが観察される。非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３の位置を（５）に示し、（６）における一番上のバンドは、残存する非開裂Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３である。一番下のバンドは、正しい部位で１回だけ開裂された融合タンパク質である。小さなＮ末端ペプチドは小さすぎてゲルにおいては見ることができない。
【００６３】
図１６は、５つのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種ののうちの３つとＧｒＢ−Ｈ６のインキュベーションから得られるサンプルである。３つの変種はＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧである。レーン（Ａ〜Ｐ）の説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ単独 ２４時間インキュベーション後
Ｃ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２時間インキュベーション後
Ｄ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ６時間インキュベーション後
Ｅ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２４時間インキュベーション後
Ｆ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ４８時間インキュベーション後
Ｇ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ単独 ２４時間インキュベーション後
Ｈ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２時間インキュベーション後
Ｉ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ６時間インキュベーション後
Ｊ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２４時間インキュベーション後
Ｋ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ４８時間インキュベーション後
Ｌ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ単独 ２４時間インキュベーション後
Ｍ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２時間インキュベーション後
Ｎ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ６時間インキュベーション後
Ｏ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２４時間インキュベーション後
Ｐ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ４８時間インキュベーション後
【００６４】
レーンＢにおいては、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰが示され、レーンＣ〜ＦにおいてはＧｒＢ−Ｈ６と共にインキュベーションした後、より多くの正しく開裂された生成物が出現する。レーンＦにおいて、４８時間インキュベーション後、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰのもとの量の約２／３が正しく開裂された。レーンＧ〜Ｋにおいては、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰサンプルが示され、レーンＧにおける非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰとレーンＨ〜Ｋにおける正しく開裂された生成物の量を増加させたＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰについては事実上同じ図が得られる。しかしながら、開裂は、ＩＥＰＤ↓ＳＰ配列の開裂よりもずっと遅く、４８時間インキュベーション後にごく少量しか開裂されなかった。レーンＬ〜ＰにおけるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰサンプルに関して、開裂はＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰのどちらについてよりもずっと速いことは明らかである。レーンＬは、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧを示し、わずか２時間インキュベーション後に、融合タンパク質の大部分が開裂されて、正しい生成物が得られる。
【００６５】
図１７は、５つのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種のうちの２つとＧｒＢ−Ｈ６のインキュベーションから得られるサンプルを示す。２つの残存する変種は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧである。レーン（Ａ〜Ｋ）の説明：
Ａ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ単独 ２４時間インキュベーション後
Ｂ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２時間インキュベーション後
Ｃ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ６時間インキュベーション後
Ｄ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２４時間インキュベーション後
Ｅ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ４８時間インキュベーション後
Ｆ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ単独 ２４時間インキュベーション後
Ｇ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２時間インキュベーション後
Ｈ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ６時間インキュベーション後
Ｉ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ２４時間インキュベーション後
Ｊ：２００μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ＋５μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ ４８時間インキュベーション後
Ｋ：分子量マーカー
【００６６】
レーンにおいて、Ａは非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ↓ＳＰであり、レーンＢ〜Ｅにおいて、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ（レーンＢ〜Ｆ、図１６）においてみられるようにより多くの正しく開裂された生成物が出現する。融合タンパク質のほぼ半分の量が４８時間後に開裂される。レーンＦにおいて、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧが示され、レーンＧ〜Ｊにおいて、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧの正しく開裂された生成物が出現する。わずか２時間インキュベーション後に、融合タンパク質の全てが正しく開裂される。
【００６７】
図１８は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶをＧｒＢ−Ｈ６とプロテアーゼ：融合タンパク質比が１：５００で、２３℃でインキュベーションして得られるサンプルを示す。
レーンＡ〜Ｍの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、０時間インキュベーション
Ｃ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、４時間インキュベーション後
Ｄ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２４時間インキュベーション後
Ｅ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、９６時間インキュベーション後
Ｆ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ、０時間インキュベーション
Ｇ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、４時間インキュベーション後
Ｈ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２４時間インキュベーション後
Ｉ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、９６時間インキュベーション後
Ｊ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ、０時間インキュベーション後
Ｋ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、４時間インキュベーション後
Ｌ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２４時間インキュベーション後
Ｍ：２５０μｌ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ＋１μｌ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、９６時間インキュベーション後
【００６８】
レーンＢ〜Ｅにおいて、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰを示し（１）、開裂は９６時間後でほとんど１００％完了する。レーンＦ〜Ｉは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱの開裂であり（２）、これはわずか２４時間後でほぼ１００％完了する。これは、レーンＪ〜Ｍにおいて示されるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶの開裂に関してと同様である。Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰの欠失突然変種であるので、そのままの開裂したＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱのバンドはすべてゲルにおいてＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰのバンドよりも若干低い位置にある。もう一つ別の欠失突然変種であるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶのバンドは、欠失がＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱよりも大きいので、さらに低い位置にある。
【００６９】
図１９、パネルＡは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰとＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆをプロテアーゼ：融合タンパク質比１：５００、合計体積２００μｌで、２１℃と３７℃の両方でインキュベーションして得られるサンプルを示す。
レーンＡ〜Ｏの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、０時間インキュベーション
Ｃ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、４時間
Ｄ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、２４時間
Ｅ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、４８時間
Ｆ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、４時間
Ｇ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、２４時間
Ｈ：２４μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋０．０４８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、４８時間
Ｉ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ、０時間インキュベーション
Ｊ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、４時間
Ｋ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、２４時間
Ｌ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、２１℃、４８時間
Ｍ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、４時間
Ｎ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、２４時間
Ｏ：３６μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０７２μｇ ＧｒＢ−Ｈ６、３７℃、４８時間
【００７０】
未反応の非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰをレーンＢ（１）に示し、２１℃および３７℃での開裂をそれぞれレーンＣ〜Ｅ（２）およびレーンＦ〜Ｈ（３）に示す。２つの温度にはほとんど差はない。４８時間後、ほぼ４０％が２１℃で開裂した。非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰをレーンＩ（４）に示し、２１℃および３７℃での開裂反応をそれぞれレーンＪ〜Ｌ（５）およびレーンＭ〜Ｏ（６）に示す。ここでも２つの温度にほとんど差はなく、２１℃で４８時間後、約３５〜４０％が開裂した。すなわち、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆは両基質を等しく開裂させる。
【００７１】
図１９、パネルＢは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰとＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆをプロテアーゼ：融合タンパク質比が１：５００、合計体積２００μｌで、２２℃と３７℃の両方でインキュベーションして得られるサンプルを示す。
レーンＡ〜Ｏの説明：
Ａ：分子量マーカー
Ｂ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ、０時間インキュベーション
Ｃ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、６時間
Ｄ：４０μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、２４時間
Ｅ：４０μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、５０時間
Ｆ：４０μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、６時間
Ｇ：４０μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、２４時間
Ｈ：４０μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、５０時間
Ｉ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ、０時間インキュベーション
Ｊ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、６時間
Ｋ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、２４時間
Ｌ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、２３℃、５０時間
Ｍ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、６時間
Ｎ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、２４時間
Ｏ：３８μｇ Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ＋０．０８μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、３７℃、５０時間
【００７２】
そのままの非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧをレーンＢ（１）に示し、２１℃および３７℃での開裂をそれぞれレーンＣ〜Ｅ（２）およびレーンＦ〜Ｈ（３）に示す。２つの温度でほとんど差はなく、わずか６時間後に開裂は完了した。非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰをレーンＩ（４）に示し、２１℃および３７℃での開裂反応をそれぞれレーンＪ〜Ｌ（５）およびレーンＭ〜Ｏ（６）に示す。図１９パネルＡに示すように、２１℃で５０時間後にほぼ４０％が開裂した。驚くべきことに、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦはＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＩＥＰＤ↓ＥＰよりもずっと良好にＩＥＰＤ↓ＥＧ基質を開裂させる。
【００７３】
図２０は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰまたはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧのいずれかと固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの６つの異なる調製物（実験Ａ〜Ｆ（実施例９に記載））とのインキュベーションから得られるサンプルを示す。
レーンＡ〜Ｍの説明：
Ａ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ａ
Ｂ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｂ
Ｃ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｃ
Ｄ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｄ
Ｅ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｅ
Ｆ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｆ
Ｇ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ａ
Ｈ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｂ
Ｉ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｃ
Ｊ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｄ
Ｋ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｅ
Ｌ：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ＋固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ、実験Ｆ
Ｍ：分子量マーカー
【００７４】
Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰとのインキュベーションをレーンＡ〜Ｆ（１）に示し、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧインキュベーションをレーンＧ〜Ｌ（２）に示す。非開裂融合タンパク質（Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰまたはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ）を表すバンドを（３）により示し、正しく開裂された生成物のバンドの位置を（４）により示す。
【００７５】
（実施例）
実施例１
ヒトグランザイムＢ発現ベクターの設計および構築
不活性プログランザイムＢ構築物を調製するために、活性化ヒトグランザイムＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．７９）をエンコードする配列、すなわちＩｌｅ２１（キモトリプシノゲンナンバリングにおけるＩｌｅ１６）からＴｙｒ２４６を、Ｃ末端にｈｅｘａ−Ｈｉｓタグ（Ｈ６）を含有するｐＴ７クローニングベクター（ｐＴ７Ｃ−ｔｅｒｍＨ６）中にクローンし、その結果、発現ベクターｐＴ７−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６を得た。血激凝固因子Ｘ_ａ（ＦＸ_ａ）認識配列ＩＥＧＲを含有する配列ＭＧＳＩＥＧＲは従ってグランザイムＢのＩｌｅ２１に対してＮ末端に位置し、Ａｒｇ（Ｒ）とＩｌｅ２１の間にＦＸ_ａ開裂部位を提供する。結果として得られる、ＦＸ_ａ認識配列およびＣ末端ｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを含有する融合タンパク質プログランザイムＢは以下、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６と称し、配列番号１に示される。
【００７６】
自己活性化プログランザイムＢタンパク質を形成するために、発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐＴ７−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６を構築し、ここにおいて、ＩＥＧＲのＦＸ_ａ認識配列をグランザイムＢ認識部位ＩＥＰＤまたはＩＥＡＤとそれぞれ置換した。結果として得られる自己活性化ＧｒＢタンパク質は以下それぞれｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６と称し、配列番号２および３に示される。ベクターのデザインおよびクローニングを次の節で概要を述べる。
【００７７】
ヒトグランザイムＢ、特に前記グランザイムＢタンパク質、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６、およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６におけるアミノ酸位２２８（確立された標準的キモトリプシノゲンアミノ酸ナンバリングシステムを使用）での遊離システインの存在は、実施例２に記載されるリホールディングプロセスの間に複雑な問題を引き起こす可能性があり、活性化酵素の安定性を低下させ、ジスルフィド含有基質に対してさらに高い非酵素反応性をもたらす。従って、構築物ｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の部位指向性突然変異により、Ｃｙｓ２２８アミノ酸残基（キモトリプシノゲンアミノ酸ナンバリング）がセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６に基づく多くの組み換え突然変異タンパク質が生じ、発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓ、ｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ、ｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ、ｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖ、およびｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆをそれぞれ得た。結果として得られる突然変異タンパク質は以下それぞれｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓ（配列番号４）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ（配列番号５）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ（配列番号６）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖ（配列番号７）、およびｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ（配列番号８）と称し、まとめてｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種と称する。これらの突然変種はすべて自己活性化グランザイムＢプロテアーゼとして構築された。
【００７８】
ｐＴ７ Ｃ−ｔｅｒｍＨ６クローニングベクターの構築
オリゴヌクレオチドプライマーＨ６Ｃ−ｔｅｒｍ ｆｗ（配列番号９）およびＨ６Ｃ−ｔｅｒｍ ｒｅｖ（配列番号１０）から調製されたＤＮＡフラグメントをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ切断ベクター、ｐＴ７（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＨら、１９９１）中に標準的手順を用いて結紮することによりクローニングベクターｐＴ７Ｃ−ｔｅｒｍＨ６を構築した。
ヒトグランザイムＢのｐＴ７Ｃ−ｔｅｒｍＨ６クローニングベクター中へのクローニング
ｃＤＮＡの混合物から増幅し、ヒト骨髄、ヒト白血球、ヒトリンパ節、およびリンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ カタログ番号７１８１−１、７１８１−２、７１６４−１、７１６７−１）（オリゴヌクレオチドプライマーＧｒＢｆｗ（配列番号１１）およびＧｒＢｒｅｖＥｃｏＲＩ（配列番号１２））から単離されたＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限ＤＮＡフラグメントＧｒＢＥｃｏＲＩをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ切断ベクター、ｐＴ７Ｃ−ｔｅｒｍＨ６中に標準的手順を用いて結紮することにより発現ベクターｐＴ７−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６を構築した。結果として得られるＧｒＢ ＥｃｏＲＩのヌクレオチド配列の概要を配列番号１３に示す。
【００７９】
自己活性化ヒトグランザイムＢ、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の発現ベクターの構築
自己活性化プログランザイムＢタンパク質をエンコードする発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐＴ７−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６を、製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指向性突然変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、カタログ番号２００５１８）を用いることにより構築した。発現ベクターｐＴ７−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６をテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドプライマーＧｒＢ ＧＲ−ＰＤｆｗおよびＧｒＢ ＧＲ−ＰＤｒｅｖ（配列番号１４および１５）をｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の構築に使用し、オリゴヌクレオチドプライマーＧｒＢ ＧＲ−ＡＤ ｆｗおよびＧｒＢ ＧＲ−ＡＤ ｒｅｖ（配列番号１６および１７）をｐＴ７−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の構築に使用した。
【００８０】
自己活性化ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種の発現ベクターの構築
自己活性化ｐｒｏ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変異タンパク質をエンコードする発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＸはすべてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指向性突然変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、カタログ番号２００５１８）を用い、製造業者のプロトコルに従って構築された。発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６をテンプレートとして使用した。変性オリゴヌクレオチドプライマーＧｒＢ ＳＡＴ ｆｗおよびＧｒＢ ＳＡＴ ｒｅｖ（配列番号１８および１９）をｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓ、ｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ、およびｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓの構築に使用し、ここにおいて、表１に示されるＧｒＢ ＳＡＴ ｆｗおよびＧｒＢ ＳＡＴ ｒｅｖプライマー配列において、Ｄ＝Ａ、Ｇ、またはＴであり、Ｈ＝Ｔ、Ｃ、またはＡである。変成オリゴヌクレオチドプライマーＧｒＢ ＶＦ ｆｗおよびＧｒＢ ＶＦ ｒｅｖ（配列番号２０および２１）をｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＶおよびｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの構築に使用し、ここにおいて、表１に示すＧｒＢ ＶＦ ｆｗ および ＧｒＢ ＶＦ ｒｅｖプライマー配列において、Ｋ＝ＧまたはＴであり、Ｍ＝ＡまたはＣである。
【００８１】
【表１】

【００８２】
実施例２
自己活性化ヒトグランザイムＢの発現およびリホールディング
ＦＸ_ａ活性化可能な組み換えＰｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６
Ｓｔｕｄｉｅｒ ＦＷら（１９９０）により記載されているようにして中程度のスケール（３×１リットル）で、イー・コリＢＬ２１細胞において実施例１で調製された発現ベクターｐＴ７−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６を成長させ、発現することにより、ＦＸ_ａ活性化可能な組み換えプログランザイムＢ融合タンパク質ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号１）を産生した。３７℃で指数関数的に成長する培養物はＯＤ_６００＝０．８で約５の多重度でバクテリオファージλＣＥ６に感染した。培養物を３７℃成長させ、感染後５０分に、０．１ｇ／Ｌリファンピシン（メタノール中０．１ｇ／ｍＬとして溶解させる）を添加した。３７℃でさらに３時間後、細胞を遠心分離により収穫した。細胞を浸透圧衝撃および音波処理により溶解させ、全細胞タンパク質をフェノール中に抽出した（Ｔｒｉｓｍａ塩基でｐＨ８に調節）。２．５体積のエタノールを添加し、遠心分離することによりタンパク質をフェノール相から沈殿させた。タンパク質ペレットを、６Ｍグアニジウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１００ｍＭジチオトレイトールを含有する緩衝液中に溶解させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および５ｍＭ ２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、粗タンパク質調製物をＮｉ^２＋活性化ＮＴＡ−アガロースカラム（Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロース、Ｑｕｉａｇｅｎ）上に適用した。
【００８３】
粗タンパク質抽出物をＮｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムにかけて、融合タンパク質ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６を、１カラム体積のローディング緩衝液、次いで１カラム体積の８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．３および５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１／２カラム体積の６Ｍグアニジウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および５ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび最後に１／２カラム体積の８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および３ｍＭ還元グルタチオンで洗浄することにより大部分のイー・コリおよびλファージタンパク質から精製した。
Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎら（国際特許出願番号ＷＯ９４１８２２７）に記載されているような環状リホールディング処理を用いて、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６融合タンパク質をＮｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラム上でリホールドさせた。勾配管理プロフィールを以下の表２に示し、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、２ｍＭ還元グルタチオン、および０．２ｍＭ酸化グルタチオンを緩衝液Ａとして、そして６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および３ｍＭ還元グルタチオンを緩衝液Ｂとして使用した。
【００８４】
【表２−１】


【表２−２】

【００８５】
環状リホールディング処理が完了した後、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６融合タンパク質をＮｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムから０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する緩衝液で溶出させた。
Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出させた後、ＨＣｌでｐＨを７に調節する前に、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６タンパク質を１体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈した。タンパク質を次いでＳＰセファロースファーストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）イオン交換カラム上にかけた。タンパク質を２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０から１Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０の直線的勾配で１０カラム体積で溶出した。溶出プロフィールからのサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において１つの独立したバンドとして出現し、モノマーｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６の予想分子量２７．４ｋＤａで移動した。
【００８６】
自己活性化ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６
実施例１において調製されたベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐＴ７−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６からの発現により自己活性化組み換えグランザイムＢ融合タンパク質ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号２）およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号３）を生成させた。ここにおいて、発現、リホールディング、および精製は、本質的に前記ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６８に関して記載されたのと同様にして行った。
２つの酵素、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の自己活性化は次の実施例３において記載する通りである。
自己活性化ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種
全てのｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種（配列番号４、５、６、７および８）を、本質的に前記ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６の発現に関して記載したのと同様にしてｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ Ｃ２２８Ｘ発現ベクターから発現した。ｐｒｏ―ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種のリホールディングも、本質的には前記ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６と同様に行い、カチオン交換カラム上での活性化は、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６に関して記載されているのと同様にして行った。
【００８７】
自己活性化ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種の精製および完全な活性化は、リホールドされたタンパク質をプロ形態でカチオン交換カラムＳＰセファロースファーストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０で４時間洗浄し、最後に活性化タンパク質を７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０で溶出することによりわずか４時間で行われた。溶出後、活性化突然変種はＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓ、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖ、およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆと称する。
【００８８】
ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｘ突然変種の発現レベルは、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６発現レベルと類似していた。しかしながら、リホールディング効率はｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６と比較して最高９０％異なっていた。１つの突然変種ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｓは非常に低いリホールディング効率を有し、従ってさらに分析しなかった。セリンはタンパク質において天然に存在する全てのアミノ酸のうち、大きさ、親水性および化学的にシステインと最もよく類似しているので、システインの置換の明らかな保守的な選択はセリンであると予想されることに反している。
３つの他の突然変種ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ、およびｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖのリホールディング効率は、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６と類似していた。
【００８９】
非常に興味深い知見は、Ｃｙｓ２２８アミノ酸残基を含む非突然変異ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の場合よりも、システインがフェニルアラニンで置換されているｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ突然変種についてリホールディングおよび精製後により高いタンパク質回収が得られることである。従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ検定（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ （登録商標） Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりタンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用して推定された７０ｍｇのｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆまたは非突然変異ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６のいずれかを前記リホールディングおよび精製法に適用した場合、最終収率（タンパク質回収率）はそれぞれ１．５％および０．５％であることが判明した。これから明らかに、突然変異ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆは改善された最終タンパク質回収率をもたらすことがわかる。低い回収率についての推論は、非突然変異ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６タンパク質がカチオンクロマトグラフィーによる精製および活性化に適用された場合、タンパク質は沈殿する傾向にあり、従って活性な酵素の最終収率（回収率）が減少する。ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆについては顕著な沈殿は観察されなかった。従って、システイン２２８のフェニルアラニンでの置換は、グランザイムＢについて、特に自己活性化グランザイムＢについて好ましいようである。アミノ酸フェニルアラニンはシステインと化学的に非常に異なり、通常システイン置換に選択されないので、これは非常に驚くべきことである。
次の実施例において、本発明者らはＣ２２８Ｆ突然変種、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを比較のためにｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６とあわせて重点的に取り組んだ。
【００９０】
実施例３
精製ウシＸ_ａ因子を用いたｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６融合タンパク質の活性化ならびにｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の自己活性化
Ｘ_ａ因子によるｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６の活性化
実施例２において記載されるようにして産生されたモノマー不活性ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６のサンプルをＳＰセファロースイオン交換からの溶出液から直接採取した。５０μｇのＦＸ_ａ（１ｍｇ／ｍｌを５０μｇ）を添加することにより１ｍｇのｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６（約１０ｍｌ）を活性化し、室温で数日間インキュベートした。ＧｒＢ−Ｈ６が得られるｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６のＦＸ_ａによる開裂／活性化の程度をＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。
加えて、ｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６をＦＸ_ａとともにインキュベーションする間のグランザイムＢ活性を、次の比色検定を用いて数日間追跡した：５００μｌの緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）、４μｌの１００ｍＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ、および５μｌのインキュベーション混合物。１００μｌのｐｒｏ−ＩＥＧＲ−ＧｒＢ−Ｈ６（約１０μｇ）を１μｌのＦＸ_ａ（１ｍｇ／ｍｌ）と混合することによりインキュベーション混合物を調製し、インキュベーションの間４℃に保持した。結果を表３および図１にまとめる。
【００９１】
【表３】

添加されたＦＸ_ａを除去するために、インキュベーション混合物を、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０中で洗浄したＳＰセファロースファーストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イオン交換カラムにかけた。ＦＸ_ａはカラム物質に結合せず、結果として得られるＧｒＢ−Ｈ６は７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０でカラムから溶出された。
【００９２】
比色活性測定
添加されたＦＸ_ａが適切にインキュベーション混合物から除去されたかどうかを確認するために、ＧｒＢ−Ｈ６およびＦＸ_ａ活性の両方を添加されたＦＸ_ａの除去の前後で基質Ｓ２２２２（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（イタリア）、カタログ番号Ｓ２２２２）およびＡｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アスパラチル−ｐ−ニトロアニリン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ラ・ホーヤ、アメリカ合衆国）、カタログ番号３６８０６７）での比色検定を用いて測定した。ここにおいて、吸光度は４０５ｎｍで約３分間測定し、ΔＯＤ_４０５／分を計算した。次のミックスを用いてＦＸ_ａ活性を測定した：５００μｌの緩衝液、２５μｌの３ｍＭ Ｓ２２２２および５μｌのＦＸ_ａ。ＧｒＢ−Ｈ６活性を次のミックスを用いて測定した：５００μｌの緩衝液、２μｌの１００ｍＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ、および５μｌのＧｒＢ−Ｈ６。
【００９３】
使用した緩衝液は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０または１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４のいずれかであった。１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液を使用する例を以下の表３に示す。ここにおいて、ＦＸａ除去後のＳＰセファロース溶出液からのトップフラクションを使用した：
【００９４】
【表４】

前記表４からわかるように、添加されたＦＸ_ａはＳＰセファロースファーストフローカラム上でのイオン交換により活性化混合物から完全に除去された。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４を含む緩衝液で同じ結果が得られた。
【００９５】
ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６の自己活性化
組み換え自己活性化ヒトグランザイムＢ誘導体ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６を実施例２に記載されているようにして、実施例１において記載される発現ベクターｐＴ７−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐＴ７−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６を用いて産生した。ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６タンパク質をＳＰセファロースカラムから溶出させ、４℃で２日間保存した後、比色検定を用いてそれぞれのトップフラクションの活性を測定した。この目的のために、次のものを混合した：５００μｌの緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）、２μｌの１００ｍＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ、および５μｌのタンパク質溶液。吸光度における変化を次いで４０５ｎｍで３分間測定した。さらに１日および２日間４℃でインキュベーションした後に活性をさらに測定した。結果を表５にまとめる。
【００９６】
【表５】

表５からわかるように、自己活性化誘導体ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６をあらかじめ活性化されたグランザイムＢを添加せずに活性化し、自己活性化は４℃で少なくとも３または４日後に完了しなかった。
【００９７】
実施例４
小発色性ペプチド基質に関して測定されたグランザイムＢ活性
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ基質を用いて異なる緩衝液中で活性化され、精製されたＧｒＢ−Ｈ６の活性を測定した：５００μｌの緩衝液、２μｌの１００ｍＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ、および５μｌのＧｒＢ−Ｈ６。特に記載しない限り、ΔＯＤ_４０５／分を最初の０．７５分から計算した。
【００９８】
【表６】

ＴＮ ＝１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
前記表６からわかるように、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４〜７．５は評価された緩衝液のＧｒＢ−Ｈ６活性の最良の緩衝液である。
【００９９】
ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆに関して行った後のｐＨスキャニング実験において、基質Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡに対する活性の最適ｐＨは１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ中ｐＨ７．５〜７．８の範囲で見られた。
定常状態速度パラメーターＫ_Ｍおよびｋ_ｃａｔを評価するために、検定キュベット中合計体積５００μｌで前記と同じ比色検定を用いた。検定緩衝液は１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．７５であり、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆのどちらも各測定において２０ｎＭの濃度で使用した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを作成するために、次の基質濃度を使用した：５、４０、１５０、３００、および６００μＭ。得られた結果を以下の表７に示す。
【０１００】
【表７】

ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆについて前記表７に示すＫ_Ｍに関して得られた値ｋ_ｃａｔおよびｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍは、組み換えラットＧｒＢについて見られる値と非常に類似している（Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｌ．ら、１９９８)。
【０１０１】
実施例５
ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの特異性およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの安定性の評価
ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの特異性
発色性基質Ａｃ−ＬＥＥＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ｐＮＡ、およびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡを、実施例４において適用したＡｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ基質に加えて使用して、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼの両方の特異性を調べた。５００μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．７５と４００μＭの濃度の基質中で活性検定を再び行った。各測定に関して、１μｇのプロテアーゼを検定キュベットに添加した。測定は全て３回行い、得られた活性は、Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡで測定された活性を１００％に設定することにより標準化した。結果を図２に示す。ＧｒＢ−Ｈ６プロテアーゼは少なくともＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼと同程度に特異性であることがわかる。
【０１０２】
ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの安定性
ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼの安定性を測定するために、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆのサンプルを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中で１５日間４℃、２３℃および３７℃でインキュベートした。自己開裂および変性を調べるために１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を選択したが、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価すると顕著な「カニバリズム」は観察されなかった（図３Ａ参照）。発色性基質Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡに対する加水分解活性もインキュベーション期間中に測定した。図３Ｂ参照。
ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼは４℃および２３℃で著しく安定である。活性は１５日間２３℃で約１０％若干減少し、ゲルにおいて変性フラグメントはほとんど見られなかった。３７℃でも、１５日後に依然として約２０％の活性があり、ゲルにおいてごくわずかしか変性フラグメントは出現しなかった。
１０分の短期間スケールでＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼは５０℃まで安定であることが判明した（ここでは省略）。この実験において、プロテアーゼのサンプルを１０分間所定の温度でインキュベートし、次いで２３℃で１０分インキュベートすることにより室温に戻した。Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡに対する活性を次いで２３℃で測定した。５０℃のインキュベーション温度まで、室温（２３℃）でインキュベーションした後、プロテアーゼはほとんど１００％活性に戻すことができるが、５０℃を越える温度に曝された後は、プロテアーゼはもはや活性形態に戻ることができず、ごくわずかの活性しか検出できない。
【０１０３】
実施例６
ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆにより開裂可能な認識配列を含有する融合タンパク質の発現ベクターの設計および構築

ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの基質として適当な融合タンパク質を調製するために、ＦＸ_ａ開裂可能な融合タンパク質Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＢＵＢ、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１、およびＨ６−ＦＸ−ＴＮ１２３（それぞれｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＢＵＢ、ｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＲＡＰ、ｐＴ７Ｈ６Ｕｂｉ−ＦＸ−ＡｐｏＡ１、およびｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＴＮ１２３によりエンコードされる）におけるＦＸ_ａ認識配列を、ＩＥＧＲまたはＩＱＧＲのいずれかからＩＥＰＤに変更し、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ（配列番号２２）、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ（配列番号２３）、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１（配列番号２４）、およびＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３（配列番号２５）の構築物を得た。
【０１０４】
Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰの構築物において、グランザイムＢ認識配列はＩＥＰＤ↓ＳＰであり、ここにおいて↓は開裂部位を示す。この認識配列は、構築物のＨ６とＴｒｉｐＵＢ部分の間に位置し、ここにおいて、２つの残基ＳＰ、切断可能な結合に対するＣ末端はＴｒｉｐＵＢ部分のＮ末端部分である。
次のＨ６−ＴｒｉｐＵＢ融合タンパク質（Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ変種と称する）の認識配列は、ＸＸＸＸ↓ＹＹ（ここにおいて、ＸＸＸＸはｈｅｘａ−Ｈｉｓ部分Ｈ６とＴｒｉｐＵＢ部分の間のグランザイムＢ認識配列の一部であり、ＹＹ残基はＴｒｉｐＵＢ部分の一部である）のようにその名前の最後の部分として表示される。
【０１０５】
Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ構築物におけるＩＥＰＤ↓ＳＰ開裂部位を８つの他の開裂部位に変更して、次の変種を得た：Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ（配列番号２６）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ（配列番号２７）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ（配列番号２８）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ（配列番号２９）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ（配列番号３０）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ（配列番号３１）、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ（配列番号３２）、およびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ（配列番号３３）（ここにおいて、↓は開裂部位を示す）。これらの８つの構築物のうち６つにおいて、すなわち、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ、およびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧにおいて、融合タンパク質のＰ_１’およびＰ_２’部位（どちらもＴｒｉｐＵＢ部分の一部）が変更された。
【０１０６】
融合タンパク質発現ベクターの構築
製造業者のプロトコルに従って、テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＢＵＢ（国際特許出願番号ＷＯ９８５６９０６）およびオリゴヌクレオチドプライマー：ＴｒｉｐＵＢ ＧｒＢ ｆｗ（配列番号３４）およびＴｒｉｐＵＢ ＧｒＢ ｒｅｖ（配列番号３５）を用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指向性突然変異キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、カタログ番号２００５１８）を用いることにより発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰを構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＲＡＰ（Ｎｙｋｊａｅｒら、１９９２）およびオリゴヌクレオチドプライマー：ＲＡＰ ＧｒＢ ｆｗ（配列番号３６）およびＲＡＰ ＧｒＢ ｒｅｖ（配列番号３７）を用いて、前記のような部位指向性突然変異誘発によりベクターｐＴ７Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰを構築した。
【０１０７】
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６Ｕｂｉ−ＦＸ−ＡｐｏＡ１（国際特許出願番号ＷＯ０２３８６０９）およびオリゴヌクレオチドプライマー：Ｍｕｔ−ＧｒＢ ｆｗ（配列番号３８）およびＭｕｔ−ＧｒＢ ｒｗ（配列番号３９）を用いて前記のような突然変異誘発によりベクターｐＴ７Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１を構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＴＮ１２３（Ｈｏｌｔｅｔら、１９９７）およびオリゴヌクレオチドプライマー：ＴＮ ＧｒＢ ｆｗ（配列番号４０）および ＴＮ ＧｒＢ ｒｅｖ（配列番号４１）を用いて前記のような部位指向性突然変異誘発により、発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３を構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＢＵＢ（ＷＯ９８５６９０６）およびオリゴヌクレオチドプライマー：ＰＣ７ＴｒｉｐＵＢ ＧＲ−ＡＤ ｆｗ（配列番号４２）およびＰＣ７ＴｒｉｐＵＢ ＧＲ−ＡＤ ｒｅｖ（配列番号４３）を使用して、前記のような突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰを構築した。
【０１０８】
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：ＰＣ７ＴｒｉｐＵＢ Ｐ−Ｇ ｆｗ（配列番号４４）およびＰＣ７ＴｒｉｐＵＢ Ｐ−Ｇ ｒｅｖ（配列番号４５）を使用して、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧを構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＮＡＴｒｉｐ ＩＥ−ＶＧ ｆｗ（配列番号４６）およびＤＮＡＴｒｉｐ ＩＥ−ＶＧ ｒｅｖ（配列番号４７）を用いて、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰを構築した。
【０１０９】
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：ＤＮＡＴｒｉｐ ＳＰ−ＦＧ ｆｗ（配列番号４８）およびＤＮＡＴｒｉｐ ＳＰ−ＦＧ ｒｅｖ（配列番号４９）を使用して、前記のような突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧを構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：Ｔｒｉｐ ＩＥＰＤ−ＴＱ（配列番号５０）およびＵＢ３（配列番号５２）を使用して、ＰＣＲ反応により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱを構築した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断ｐＴ７Ｈ６（ＧＳ）３ベクター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ．Ｈら、１９９１）中に結紮した。
【０１１０】
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：Ｔｒｉｐ ＩＥＰＤ−ＩＶ（配列番号５１）およびＵＢ３（配列番号５２）を使用して、ＰＣＲ反応により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶを構築した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断ｐＴ７Ｈ６（ＧＳ）３ベクター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ．Ｈら、１９９１）中に結紮した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：ＴｒｉｐＵＢ ＥＰ ｆｗ（配列番号５３）およびＴｒｉｐＵＢ ＥＰ ｒｅｖ（配列番号５４）を使用して、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰを構築した。
テンプレートとしてベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー：ＴｒｉｐＵＢ ＥＧ ｆｗ（配列番号５５）およびＴｒｉｐＵＢ ＥＧ ｒｅｖ（配列番号５６）を使用して、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧを構築した。
【０１１１】
【表８】

【０１１２】
実施例７
ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆにより開裂可能な認識配列を含有する融合タンパク質の発現、精製およびリホールディング
融合タンパク質の発現
キメラ融合タンパク質Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３およびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種を調製するために、発現ベクターｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、ｐＴ７Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ、ｐＴ７Ｈ６−ＦＸ−ＲＡＰ、ｐＴ７Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１、ｐＴ７Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１、ｐＴ７Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶ、ｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰ、およびｐＴ７Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧ（最後の８つはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種と称する）を、Ｓｔｕｄｉｅｒ ＦＷら（１９９０）により記載されているようにして、イー・コリＢＬ２１細胞中中程度のスケールで成長させた（３リットル；２ｘＴＹ培地、５ｍＭ ＭｇＳＯ_４および０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン）。３７℃で指数関数的に成長する培養物をＯＤ_６００＝０．８でバクテリオファージλＣＥ６で、約５の多重度で感染させた。培養物を３７℃でさらに４時間成長させ、遠心分離により細胞を収穫した。細胞を１００ｍｌの７５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８中に懸濁させた。フェノール（１５０ｍｌ、Ｔｒｉｓｏｍａ塩基でｐＨ８に調節）をそれぞれに添加し、混合物を音波処理して、全タンパク質を抽出した。遠心分離（１０．０００ｇで２５分）により清澄化した後、２．５体積の９６％エタノールを添加し、遠心分離することにより、粗タンパク質フラクションをフェノール相から沈殿させた。タンパク質ペレットを７５ｍｌの６Ｍグアニジウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中に溶解させた。
【０１１３】
Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１およびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種の精製
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴｒｉｐＵＢおよびＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ融合タンパク質の粗タンパク質調製物をバッチ吸着により、精製のために、Ｎｉ^２＋活性化ＮＴＡ−アガロース（Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロース、Ｑｕｉａｇｅｎ）カラム（通常５０〜７５ｍｌカラム体積）にかけた（Ｈｏｃｈｕｌｉ Ｅら、１９８８）。カラムを次のもので洗浄した：
１．２ｘカラム体積の８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
２．１ｘカラム体積の８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．３、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
３．１ｘカラム体積の６Ｍグアニジウムクロリド、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
４．２ｘカラム体積の５００Ｍ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
精製された融合タンパク質を次いで５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ＥＤＴＡで溶出した。
【０１１４】
Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３融合タンパク質の精製およびリホールディング
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３融合タンパク質の粗タンパク質調製物を、精製およびインビトロリホールディングのためにバッチ吸着によりＮｉ^２＋活性化ＮＴＡ−アガロース（Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロース、Ｑｕｉａｇｅｎ）カラム（通常、５０〜７５ｍｌカラム体積）にかけた。カラムを次のもので洗浄した：
１．２ｘカラム体積の８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
２．１ｘカラム体積の８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．３、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
３．１ｘカラム体積の６Ｍグアニジウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
各融合タンパク質を次いで、Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎら（国際特許出願番号ＷＯ９４１８２２７）によりプラスミノーゲンクリングル４について記載されているような反復リホールディング処理に付した。リホールディング処理が完了した後、それぞれのリホールドされた融合タンパク質を次いで５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースから溶出させた。
【０１１５】
それぞれのリホールドされた融合タンパク質を５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０、および１ｍＭ ＣａＣｌ_２中にゲル濾過し、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０および１ｍＭ ＣａＣｌ_２から１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ５．０、１ｍＭ ＣａＣｌ_２の塩勾配を使用して、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１．６（内径）×２０センチメートルカラム）イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。
それぞれの正しくホールドされたタンパク質生成物の最終精製を次いで、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８、および１ｍＭ ＣａＣｌ_２中にゲル濾過し、続いて２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１ ｍＭ ＣａＣｌ_２から５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、および１ｍＭ ＣａＣｌ_２の塩勾配を使用して、Ｑセファロースファーストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１．６（内径）×２０センチメートルカラム）上イオン交換クロマトグラフィーにより行った。
【０１１６】
実施例８
ＧｒＢ−Ｈ６、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦおよびＦＸａによる調製された融合タンパク質の開裂
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰの開裂
Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出された融合タンパク質Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ（実施例７において記載するようにして調製）を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中にゲル濾過し、トップフラクションの２００μｌのサンプルを室温で０、１または１０μｌのいずれかの活性化ＧｒＢ−Ｈ６（約０、０．２および２μｇのＧｒＢ−Ｈ６）と共にインキュベートした。
ＳＤＳ ＰＡＧＥのサンプルを１２、１９、および２４時間のインキュベーション後に採取し、ゲルを図４および５に示す。
図４中レーンＣ〜Ｄおよび図５中レーンＣ〜Ｇにおいて正しく開裂された生成物のみが出現し、１および１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６の両方の添加について、インキュベーション時間が長くなるほど、レーンにおいてより多くの開裂生成物が出現した。観察される簡単なバンドパターンを図６において説明する。ＩＥＰＤ配列後の正しい部位での開裂は図４中レーンＥにおいて確認され、ここにおいて、ＧｒＢ認識部位ＩＥＰＤの代わりにＦＸ_ａ認識部位ＩＱＧＲを含有する構築物Ｈ６−ＦＸ−ＴｒｉｐＵＢをＦＸ_ａにより開裂させて、ＧｒＢ−Ｈ６開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰと同じ大きさの生成物を得る。
【０１１７】
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰの開裂に対する温度ならびにＮｉ^２＋およびＮＴＡの添加の影響
各インキュベーションについて２００μｌのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよび５μｌのＧｒＢ−Ｈ６（約１μｇのＧｒＢ−Ｈ６）を用いてＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ融合タンパク質を用いて、次の９種のインキュベーション（表９）を準備した。
【０１１８】
【表９】

【０１１９】
インキュベーションの２、７および２２時間後にＳＤＳ ＰＡＧＥ用のサンプルを採取した。図７、８およに９参照。
Ｎｉ^２＋イオンは融合タンパク質のｈｅｘａ−Ｈｉｓテール（Ｈ６）のＮ末端に結合し、ＧｒＢ−Ｈ６により認識される開裂部位への接近を促進すると考えられる。加えて、Ｎｉ^２＋イオンは、ＧｒＢ−Ｈ６構築物のＣ末端ｈｅｘａ−Ｈｉｓテールに結合する。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースビーズ上と同様に溶液中のＮＴＡのＮｉ^２＋イオンをシールドするために、すなわち、Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム上の状態を刺激するためにＮＴＡの添加を行った。
図７は２３℃、図８は３７℃、図９は４２℃でのインキュベーションを示す。Ｎｉ^２＋またはＮＴＡが添加されない場合、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ融合タンパク質は図４および５においてみられるのと同様に開裂したが、２２時間後、３７℃でのインキュベーションが試験された３種の温度のうち最適であるようである。
【０１２０】
４．２ｍＭ Ｎｉ^２＋を添加すると、一部のタンパク質は３７℃および４２℃の高温で沈殿するが、２３℃では沈殿は見られなかった。このために、これらの２種の温度では２時間インキュベーション後に融合タンパク質の開裂はゲルにおいて見られず、この場合、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＧｒＢ−Ｈ６のどちらも一部沈殿するようである。２３℃で、Ｎｉ^２＋を添加しないよりも２２時間後に多くの融合タンパク質が開裂した。
観察される沈殿の問題は、インキュベーションに５ｍＭのＮＴＡを添加することにより解消された。２３℃で２２時間インキュベーション後、Ｎｉ^２＋またはＮＴＡを添加しないよりも多くの融合タンパク質が開裂し、したがってＮｉ^２＋およびＮＴＡの添加は開裂反応を促進するようである。さらに温度を３７℃および４２℃に上昇させることにより、開裂速度のさらなる増大が見られる。３７℃で２２時間インキュベーション後に、融合タンパク質のほとんど全てが開裂して正しい生成物になった。４２℃で２２時間後にはほとんど開裂しなかった。
図４および６において示される実験において当初推定される開裂速度を、ここで観察される開裂速度と比較すると、Ｎｉ^２＋およびＮＴＡの添加ならびに３７℃でのインキュベーションはＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰの特異的開裂を劇的に促進することは明らかである。
【０１２１】
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰの開裂
Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出される融合タンパク質Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ（実施例７に記載するようにして調製）を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中にゲル濾過し、トップフラクションの２００μｌのサンプルを室温で、０、１または１０μｌのいずれかの活性化ＧｒＢ−Ｈ６（約０、０．２および２μｇのＧｒＢ−Ｈ６）と共に室温でインキュベートした。５、２３および２６時間インキュベーション後にＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを採取した。図１０参照。
前記のような１または１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６とわずか５時間インキュベーション後に、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰの全部が開裂して、最終生成物を得た。ＲＡＰにおいて少なくとも１つの内部開裂部位が存在するが、この内部部位はＩＥＰＤ配列よりもずっと遅く開裂することは明らかである。このＩＥＰＤ配列でＧｒＢ−Ｈ６がＨ６を正しく開裂させたことは、生成物の大きさを、ＦＸ_ａにより部分的（レーンＨ）または完全（レーンＩ）に開裂されたＨ６−ＦＸ−ＲＡＰの精製されたサンプルと生成物のサイズを比較することによりわかる。これらのレーンにおいて、ＦＸ_ａによる任意の内部開裂から得られる変性生成物を精製により除去した。
【０１２２】
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ開裂とＦＸ_ａによるＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ開裂の比較
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰの開裂を、ＦＸ_ａによるＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰの開裂と比較した。Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰおよびＨ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰのどちらも１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中溶液であり、プロテアーゼ：融合タンパク質比１：１０００、室温（２３℃）で次のインキュベーションを準備した：
１．４００μｌ（約５００μｇ）Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋０．５μｌ ＦＸ_ａ（１ｍｇ／ｍｌ）（約０．５μｇ）
２．４００μｌ（約４００μｇ）Ｈ６−ＧｒＢ−ＲＡＰ＋２μｌ ＧｒＢ−Ｈ６（約０．４μｇ）
【０１２３】
インキュベーションの０、１／２、１、３、５、７および２７時間後にＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを採取した。図１１参照。
両融合タンパク質がそのそれぞれのプロテアーゼにより非常に迅速に開裂したことは明らかである。わずか１／２時間後にほとんど全ての融合タンパク質が開裂して、両インキュベーションについて正しい生成物が得られた。
しかしながら、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋ＦＸ_ａインキュベーションについて、融合タンパク質の全ては分解して、２７時間後に様々なより小さなフラグメントが得られ、正しく開裂された生成物は残っていなかった。
Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションにおいて、分解フラグメントも見られるが、Ｈ６−ＩＥＧＲ−ＲＡＰ＋ＦＸ_ａインキュベーションにおけるほど多くない。１９の可能な部位（ＲＡＰ生成物における１９Ａｓｐ残基）のうちＲＡＰにおけるＧｒＢ−感受性部位の１つだけしかないようであるが、いくつかのＦＸ_ａ感受性部位（２６の可能な部位、２６Ａｒｇ残基）があるようである。これはＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰの分解を遅くし、これによりかなり多くの正しく開裂された生成物（約２５％）がインキュベーションの２７時間後にも依然として存在する。
まとめると、ＧｒＢ−Ｈ６によるＲＡＰ融合タンパク質の正しい開裂はＦＸ_ａによるのとちょうど同じくらい速いが、ＧｒＢ−Ｈ６によるＲＡＰ融合タンパク質の分解は、ＦＸ_ａによる分解よりもずっと遅い。この実施例において、ＧｒＢ−Ｈ６プロテアーゼは従ってＦＸ_ａよりも優れ、ＧｒＢ−Ｈ６は非常に特異的なプロテアーゼであることが示される。
【０１２４】
ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦによるＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１開裂およびＦＸ_ａによるＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１開裂の比較
Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１＋ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦおよびＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋ＦＸ_ａの開裂反応のために、プロテアーゼ：基質比はここでも１：１０００であり、２３℃、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．７５中で行った：
１．２５０μｌ（約４００μｇ）Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１＋０．４μｇ ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ
２．２５０μｌ（約３５０μｇ）Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋０．３５μｇ ＦＸ_ａ
【０１２５】
０、１、３、６、２４および４８時間２３℃でインキュベーション後にＳＤＳ ＰＡＧＥ用にサンプルを採取した。図１２参照。
ＧｒＢ基質、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１は２３℃でわずか６時間インキュベーション後に約１００％が開裂するが、ＦＸ_ａ基質、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１は６時間後に小フラクションしか開裂しなかった。ＦＸ_ａは、ＦＸ_ａ基質の開裂を完了するために４８時間以上を必要とすることもわかる。
前記の２つおｎ実施例において、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆプロテアーゼは、精製されたウシＦＸ_ａ（ここにおいて、Ｘは認識部位ＩＥＰＤまたはＩＥＧＲを示す）より速く（Ｈ６Ｕｂｉ−Ｘ−ＡｐｏＡ１の場合）またはより特異的に（Ｈ６−Ｘ−ＲＡＰの場合）開裂するので、どちらも上記のようにＦＸ_ａよりも優れている。これらの２つの実施例で、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆはどちらもｈｅｘａ−Ｈｉｓテール（Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰにおけるＨ６）のような短いＮ末端タグを開裂でき、かつ興味のあるポリペプチドに隣接するＧｒＢ開裂部位を含む短リンカー配列（ここにおいて、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１におけるＡｐｏＡ１、リンカー配列ＧＧＳＩＥＰＤを有する、ここにおいて、ＩＥＰＤはＧｒＢ認識部位である）により非常に近接して結合した２つのタンパク質ドメイン間を開裂できる。上記の場合のどちらにおいてもＮ末端シーケンシングによりＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆは正しく開裂された生成物を生成することが立証された。
【０１２６】
ＧｒＢ−Ｈ６によるＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３の開裂
Ｑセファロースから溶出される融合タンパク質Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３（実施例７に記載されるようにして調製）は最終精製後、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中にゲル濾過され、トップフラクションの２００μｌのサンプルを室温で、０、１、または１０μｌのいずれかの活性化ＧｒＢ−Ｈ６（約０、０．２および２μｇのＧｒＢ−Ｈ６）と共にインキュベートした（どちらも５ｍＭ ＣａＣｌ_２の存在下および不在下で）。ＣａＣｌ_２が存在しないインキュベーションから１２、１９および２４時間ならびに５日インキュベーション後にＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを採取した。図４、５および１３参照。ＣａＣｌ_２の存在下および不在下の両方でのインキュベーションからのＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを約２０および４８時間インキュベーション後に採取した。図１４参照。
【０１２７】
Ｃａ^２＋無し：
図４、５および１３においてみられるように、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３がＣａ^２＋の不在下でＧｒＢ−Ｈ６で開裂された場合に、サンプルは独立したバンドパターンを示した。Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３はＩＥＰＤ配列で正しく開裂されたが、配列ＡＱＰＤの内部部位と同程度に迅速であった。バンドパターンを図１５に示す。Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３が正しいＩＥＰＤ↓部位で開裂されたことは図４のレーンＪからわかり、ここにおいてネズミＨ６−ＦＸ−ＴＮ１２３はＦＸ_ａにより開裂され、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３のＧｒＢ−Ｈ６開裂からの生成物と同じ大きさの生成物が得られ、内部開裂はなく、すなわち、パターンにおいて４つのバンドの最低のバンドである。
図１３のレーンＢ〜ＤおよびＬ〜Ｎにおけるようにサンプルが還元された場合、異なるバンドパターンが出現する。このパターンも図１５において説明され、特異的内部開裂部位ＡＱＰＤの概念を支持する。
【０１２８】
Ｃａ^２＋有り：
図１１はＧｒＢ−Ｈ６を用いたＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３のインキュベーションを示し、ここにおいて、５ｍＭ ＣａＣｌ_２をインキュベーションの一部に添加した。Ｃａ^２＋が存在する場合、２つのバンドしか出現せず（レーンＥおよびＧ）、一方、図４、５、１３および１５に示すように、Ｃａ^２＋が存在しない場合、４つのバンドが出現する。これは、Ｃａ^２＋をインキュベーションに添加することにより、テトラネクチン（ＴＮｑ１２３）における内部開裂部位ＡＱＰＤはＧｒＢ−Ｈ６に接近できなくなることを示す。これは、ＡＱＰＤ配列がループ内に位置するためであり、この場合、ＱおよびＤ残基はテトラネクチンにおけるＣａ^２＋−イオン結合に関与する。従って、融合タンパク質において特定のＩＥＰＤ部位で正しい開裂のみが起こり、ＴＮ１２３における内部開裂部位はＣａ^２＋の添加により「停止」される。
【０１２９】
Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ変種の開裂
Ｎｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムから溶出される融合タンパク質のそれぞれを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中にゲル濾過し、５つの異なるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種のほぼ同じ濃度のフラクションを使用した。５つの変種は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧであった。それぞれの融合タンパク質のうち、２００μｌを室温、２３℃で、５μｌの活性化ＧｒＢ−Ｈ６（約１μｇのＧｒＢ−Ｈ６）と共にインキュベートした。プロテアーゼ：融合タンパク質比は従って１：５００であった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを２、６、２４および４８時間インキュベーション後に採取し、ゲルを図１６および１７に示す。
【０１３０】
図１６において、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧのサンプルを示す。４８時間インキュベーション後、非開裂Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰのもとの量のおよそ２／３が正しく開裂された。比較して、配列ＩＱＡＤ↓ＳＰの開裂は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰにおけるＩＥＰＤ↓ＳＰ配列の開裂よりもずっと遅かった。２時間インキュベーション後に見ることができる生成物は無く、ごく少量が４８時間インキュベーション後に開裂した。Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧサンプルから、開裂はＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰのどちらについてよりもずっと速いことは明らかであった。２時間インキュベーション後、融合タンパク質の大部分は開裂して、正しい生成物を得た。認識配列におけるＰ２’部位でＰｒｏ（Ｐ）がＧｌｙ（Ｇ）に１回突然変異することは、開裂速度におけるこの劇的な変化に十分であった。
【０１３１】
図１７において、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＦＧインキュベーションからのサンプルを示す。ＶＧＰＤ↓ＳＰ配列の開裂は、図１６におけるＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰとほとんど同程度に速かった。２時間後に少量の生成物が形成され、融合タンパク質の量のほぼ半分は４８時間後に開裂した。反応速度における劇的な変化は、Ｐ１’およびＰ２’部位がＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＶＧＰＤ↓ＳＰにおいてＳＰからＦＧに変化した場合に起こった。わずか２時間インキュベーション後に、融合タンパク質の全部が正しく開裂された。
図１８は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰと比較したＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶの開裂のサンプルを示す。Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶの２つの構築物は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰのＴｒｉｐ部分の欠失突然変種であり、この場合、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱにおいて最初の７つの残基が欠失し、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶにおいて最初の１３の残基が欠失している。
【０１３２】
ここでもプロテアーゼ：融合タンパク質比は１：５００であり、反応は２３℃で行われた。ＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを、４、２４、および９６時間インキュベーション後に採取した。
図１８において示されるゲルから、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶのどちらの開裂もＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰについてよりずっと速いことは明かである。次の図１９に示すように、これはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰのＰ２’部位におけるＰｒｏのためである。
図１９、パネルＡは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰの開裂を示し、パネルＢはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧの開裂を示す。ここでもプロテアーゼ：融合タンパク質比は１：５００であり、開裂反応ミックスを２３℃および３７℃の両方でインキュベートした。パネルＡにおけるゲルについて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ用サンプルを０、４、２４および４８時間後、パネルＢにおけるゲルについては０、６、２４および５０時間後に採取した。
これらのゲルから、Ｐ２’部位におけるＰｒｏはＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆによる開裂の速度について不利であることは明らかである。しかし驚くべきことに、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦはＩＥＰＤ↓ＥＰ部位を含有する基質を開裂させることができる。これはこの部位をＩＥＰＤ↓ＳＰ部位と同じ低効率で開裂させるが、Ｐ_１’部位におけるＧｌｕ（Ｅ）などの酸性残基は、ほとんどのセリンプロテアーゼ、例えば精製されたウシＦＸ_ａなどによる開裂を廃することで有名である。
【０１３３】
本発明者らは、ＩＥＰＤ↓ＳＰ、ＩＱＡＤ↓ＳＰ、ＩＱＡＤ↓ＳＧ、ＩＥＰＤ↓ＥＰ、およびＩＥＰＤ↓ＥＧにおけるＰ_１’Ｐ_２’部位を考慮するならば、プロリンからグリシンへのＰ_２’部位における変化は開裂を劇的に向上させることを示す。このＰ_２’位におけるＧについての優先性は、Ｈａｒｒｉｓ ＪＬら、１９９８により、ｗｔ ｒａｔ ＧｒＢについて、ファージ粒子上に提示されたペプチド基質を用いて見いだされた。ここでも、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆは、Ｐ_１’におけるＥの代わりにＩＥＰＤ↓ＥＧ部位での驚くほど有効な開裂を示し、これは前記のように、ほとんどのセリンプロテアーゼによる開裂の妨害について当該分野において周知である。プロテアーゼ：基質比が１：５００で、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦがＨ６−ＴｒｉｐＵｂｉ ＩＥＰＤ↓ＥＧの開裂を完了するのに５時間未満かかる。この点に関しても、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦはＦＸ_ａより優れている。
これらの観察に加えて、４８時間ＧｒＢ−Ｈ６またはＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆと共にインキュベーションした後でさえも、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ変種のいずれにおいても内部開裂は起こらず、このことは、ＴｒｉｐＵＢ配列が７の他のＡｓｐ（Ｄ）残基を含有していても、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆが操作された認識部位で非常に特異的に開裂することを示す。
【０１３４】
実施例９
グランザイムＢの固定化
開裂混合物からグランザイムＢを容易に除去できるようにするために、以下に記載するような６つの実験においてゲルマトリックス上に固定化するために、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ変種を使用した。
固定化は、０．３Ｍ ＮａＨＣＯ_３／ＮａＯＨ、ｐＨ８．６中、Ｍｉｎｉ−Ｌｅａｋ（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ）と呼ばれるジビニルスルホン活性化マトリックスを使用して行われた。２レベルの活性化を使用した；１リットルの沈殿したビーズあたりそれぞれ２〜５ミリモルおよび１０〜５０ミリモルのビニル基、活性化の各レベルについて、異なるタンパク質濃度およびＰＥＧ２００００の存在下または不在下で３回の実験を行った。６回の実験を表１０にまとめる。固定化のために、０．３Ｍ ＮａＨＣＯ_３／ＮａＯＨ；ｐＨ８．６中ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用したＢｒａｄｆｏｒｄ検定から推定すると４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で使用した。ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ溶液の酵素活性を、緩衝液０．３Ｍ ＮａＨＣＯ_３／ＮａＯＨ；ｐＨ８．６および３０％ＰＥＧ２００００；０．３Ｍ ＮａＨＣＯ_３を検定緩衝液として使用して、実施例４に記載するようにして測定した。固定化は、流出ゲル、タンパク質溶液、および緩衝液を混合することにより行い、表１０に記載した体積および濃度を得、続いて室温で４８時間混合した。
【０１３５】
【表１０】

【０１３６】
遠心分離によりゲルを抜き取り、上清を除去した後に６００μｌの０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０を添加することにより過剰の活性基をブロックし、続いて室温で一夜混合した。ゲルを３回１Ｍ ＮａＣｌで洗浄することにより未結合タンパク質を除去し（遠心分離、それに続いて上清を除去）、最後にゲルを２５０ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。抜き取られたゲルマトリックスを秤量し、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７５；４００μＭ Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する３００μｌの基質溶液と混合することにより固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの酵素活性を推定し、次いである期間インキュベーションした後の上清のΔＯＤ_{４０５ｎｍ}を測定して、抜き取ったゲル１グラムあたりの基質溶液１ミリリットルあたりのΔＯＤ_{４０５ｎｍ}／分を決定した。適用された酵素の全てがカップリングし、活性である場合の計算された酵素活性のパーセンテージとしてカップリング効率を決定するために固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの酵素活性を使用した。
【０１３７】
カップリング効率も表１０に記載し、２つの活性化レベル間にカップリング効率の有意な差は無く、効率も２つのタンパク質濃度について同じ範囲内であり、固定化混合物において高いタンパク質濃度を使用する場合に最高のカップリングレベルが得られる。ＰＥＧ２００００をカップリング混合物に添加することが固定化に好ましいかどうかを推定することはできず、高いタンパク質濃度についても評価しなかった。
固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの尿素およびグアニジウムクロリド（ＧｄｍＣｌ）に対する安定性を、高いタンパク質濃度での２つの固定化について決定した（実験ＣおよびＦ）。実験ＣおよびＦからのゲルマトリックスをそれぞれ３つの小スピンカラム中アリコートに分け、８Ｍ尿素；０．５Ｍ ＮａＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（尿素）と６Ｍグアニジウムクロリド；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（ＧｄｍＣｌ）、または１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７５（ＨＥＰＥＳ）のいずれかと３０分間室温でインキュベートした後、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７５中で洗浄し、平衡化した。固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの酵素活性を次いで前記のようにして測定した。
得られた酵素活性を以下の表１１に示す。非変性ＨＥＰＥＳ緩衝液とともにインキュベーションした場合と比較してインキュベーション後に酵素活性は増大するので、尿素での変性は固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆに好ましいようであるが、グアニジウムクロリドでの変性は酵素活性を若干減少させる効果を有するようである。
【０１３８】
【表１１】

固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの機能は、実施例６に記載されるようにして調製された融合タンパク質Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧの開裂により証明された。開裂実験は、６つの固定化実験からの５０μｌの各ゲルマトリックスで行った。ゲルマトリックスを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７５を含有する２００μｌの緩衝液中に再懸濁させ、２つの融合タンパク質のそれぞれの１００μｌタンパク質溶液とともに室温で一夜振とうしながらインキュベートした。上清のサンプルを抜き取り、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２０参照。
１２の開裂実験の全てについて、融合タンパク質を開裂させて、これからＨ６融合タンパク質が開裂されるＴｒｉｐＵｂｉ部分に対応する１つの生成物を得る。予想されるように、若干多くの融合タンパク質が実験ＣおよびＦからのゲルマトリックスにより開裂され、これは最高のカップリングレベルを有する。開裂効率は評価しなかった。
【０１３９】
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【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、以下の比色検定を用いて数日間追跡したＧｒＢ−Ｈ６のＦＸ_ａとのインキュベーションの活性を示す。
【図２】図２は、ＧｒＢ−Ｈ６およびＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの両方のいくつかの発色性基質：Ａｃ−ＩＥＰＤ−ρＮＡ、Ａｃ−ＬＥＥＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ｐＮＡ、およびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡに対する活性を示す。
【図３】図３、パネル（Ａ）は、ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、４℃、２３℃、および３７℃でインキュベーションして得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。図３、パネル（Ｂ）は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、４℃、２３℃、および３７℃でインキュベートし、０、６、（１０）、および１５日後に測定したＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆのサンプルの活性を示す。
【図４】図４は、ＧｒＢ−Ｈ６と１２時間インキュベーションした後のＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３インキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図５】図５は、インキュベーションの１２、１９および２４時間後のＧｒＢ−Ｈ６＋Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰインキュベーションからのサンプル、ならびにＧｒＢ−Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３インキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６は、図２および３におい観察される単純なバンドパターンを説明する。
【図７−９】図７、８および９は、添加無し（１）、４．２ｍＭのＮｉ^２＋を添加（２）、および４．２ｍＭのＮｉ^２＋＋５ｍＭのＮＴＡを添加（３）した、２３℃（図５）、３７℃（図６）および４２℃（図７）でのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図１０】図１０は、１または１０μｌのＧｒＢ−Ｈ６と共にＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰをインキュベーションしたものからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図１１】図１１は、Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋ＧｒＢ−Ｈ６およびＨ６−ＩＥＰＤ−ＲＡＰ＋ＦＸ_ａインキュベーションから得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図１２】図１２は、Ｈ６Ｕｂｉ−ＩＥＰＤ−ＡｐｏＡ１＋ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８ＦおよびＨ６Ｕｂｉ−ＩＥＧＲ−ＡｐｏＡ１＋ＦＸ_ａインキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。
【図１３】図１３は、Ｃａ^２＋を添加せずに１２時間および５日間Ｈ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションして得られるサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥである。
【図１４】図１４は、５ｍＭ Ｃａ^２＋を添加して１２時間および２日後のＨ６−ＩＥＰＤ−ＴＮ１２３＋ＧｒＢ−Ｈ６インキュベーションからのサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。一部のサンプルは還元された。
【図１５】図１５は、図２、３、１０および１１におけるＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で観察されるバンドパターンの概略図を示す。
【図１６】図１６は、５つのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種ののうちの３つとＧｒＢ−Ｈ６のインキュベーションから得られるサンプルである。
【図１７】図１７は、５つのＨ６−ＴｒｉｐＵＢ変種のうちの２つとＧｒＢ−Ｈ６のインキュベーションから得られるサンプルを示す。
【図１８】図１８は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰ、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＴＱおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＩＶをＧｒＢ−Ｈ６とプロテアーゼ：融合タンパク質比が１：５００で、２３℃でインキュベーションして得られるサンプルを示す。
【図１９】図１９、パネルＡは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＳＰおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰとＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆをプロテアーゼ：融合タンパク質比１：５００、合計体積２００μｌで、２１℃と３７℃の両方でインキュベーションして得られるサンプルを示す。 図１９、パネルＢは、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＧおよびＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＥＰＤ↓ＥＰとＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆをプロテアーゼ：融合タンパク質比が１：５００、合計体積２００μｌで、２２℃と３７℃の両方でインキュベーションして得られるサンプルを示す。
【図２０】図２０は、Ｈ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＰまたはＨ６−ＴｒｉｐＵＢ ＩＱＡＤ↓ＳＧのいずれかと固定化ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆの６つの異なる調製物（実験Ａ〜Ｆ（実施例９に記載））とのインキュベーションから得られるサンプルを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
真正形態における興味のあるポリペプチドの調製法であって：
（ｉ）そのＮ末端からＣ末端までに、（ａ）融合パートナー、（ｂ）グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位、（ｃ）興味のあるポリペプチド（前記開裂部位が興味のあるポリペプチドに隣接している）を含む融合タンパク質を提供する工程、および
（ｉｉ）前記融合タンパク質をグランザイムＢプロテアーゼと接触させて、これを前記開裂部位で開裂させて、真正形態の興味のある前記ポリペプチドを得る工程を含む方法。
【請求項２】
グランザイムＢプロテアーゼ認識部位が、一般式：
Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓
（式中、
Ｐ４はアミノ酸ＩまたはＶであり
Ｐ３はアミノ酸Ｅ、ＱまたはＭであり
Ｐ２はＸ（ここにおいて、Ｘは任意のアミノ酸である）であり
Ｐ１はアミノ酸Ｄであり
↓は前記グランザイムＢプロテアーゼの開裂部位である）
のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
グランザイムＢプロテアーゼ認識部位が、ＩＣＰＤ↓、ＩＥＡＤ↓、ＩＥＰＤ↓、ＩＥＴＤ↓、ＩＱＡＤ↓、ＩＳＡＤ↓、ＩＳＳＤ↓、ＩＴＰＤ↓、ＶＡＰＤ↓、ＶＡＴＤ↓、ＶＣＴＤ↓、ＶＤＰＤ↓、ＶＤＳＤ↓、ＶＥＫＤ↓、ＶＥＱＤ↓、ＶＧＰＤ↓、ＶＥＩＤ↓、ＶＲＰＤ↓、ＶＴＰＤ↓、ＬＥＥＤ↓、ＬＥＩＤ↓、ＬＧＮＤ↓、ＬＧＰＤ↓、ＡＱＰＤ↓からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここにおいて↓が前記グランザイムＢプロテアーゼの開裂部位を表す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
一般式がさらに、アミノ酸Ｐ１’およびＰ２’を含み、その結果、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’（式中、Ｐ１’はＸであり、ここにおいてＸは任意のアミノ酸を表し、Ｐ２’はＧであり、ここにおいてＰ１’およびＰ２’は興味のあるポリペプチドの一部である）になる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
一般式がさらに、アミノ酸Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’を含み、その結果、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’Ｐ４’（式中、Ｐ４’はＤまたはＥであり、ここにおいてＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’は興味のあるポリペプチドの一部である）になる、請求項２記載の方法。
【請求項６】
興味のあるポリペプチドが、酵素、ポリペプチドホルモン、単鎖抗体可変領域フラグメント、およびアポリポタンパク質Ａからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドホルモンが、ソマトトロフィン、グルカゴン、インシュリンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
酵素がグランザイムＢである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
融合パートナーがアフィニティータグである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
アフィニティータグが、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
グランザイムＢプロテアーゼが、ヒトグランザイムＢプロテアーゼ、マウスグランザイムＢプロテアーゼおよびラットグランザイムＢプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
グランザイムＢプロテアーゼが、システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに変異している、配列番号５７に示されるヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
グランザイムＢプロテアーゼが固定化形態である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
グランザイムＢプロテアーゼがＣ末端を介して固定化される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
グランザイムＢプロテアーゼがリシンアミノ酸残基により固定化される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
アフィニティータグがポリヒスチジンタグであり、融合タンパク質がＮｉ^２＋イオンおよびニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）の存在下でグランザイムＢプロテアーゼと接触する、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
Ｎｉ^２＋の濃度が１〜２０ｍＭの範囲であり、ＮＴＡの濃度が１〜２０ｍＭの範囲である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
そのＮ末端からＣ末端までに、（ａ）融合パートナー、（ｂ）グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムＢプロテアーゼ認識部位、および（ｃ）興味のあるポリペプチド（ここにおいて、前記開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接している）を含む、融合タンパク質。
【請求項１９】
グランザイムＢプロテアーゼ認識部位が、一般式：
Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓
（式中
Ｐ４はアミノ酸ＩまたはＶであり
Ｐ３はアミノ酸Ｅ、ＱまたはＭであり
Ｐ２はＸである（ここにおいて、Ｘは任意のアミノ酸である）
Ｐ１はアミノ酸Ｄであり
↓はグランザイムＢプロテアーゼの開裂部位である）
のアミノ酸配列を有する、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
グランザイムＢプロテアーゼ認識部位が、ＩＣＰＤ↓、ＩＥＡＤ↓、ＩＥＰＤ↓、ＩＥＴＤ↓、ＩＱＡＤ↓、ＩＳＡＤ↓、ＩＳＳＤ↓、ＩＴＰＤ↓、ＶＡＰＤ↓、ＶＡＴＤ↓、ＶＣＴＤ↓、ＶＤＰＤ↓、ＶＤＳＤ↓、ＶＥＫＤ↓、ＶＥＱＤ↓、ＶＧＰＤ↓、ＶＥＩＤ↓、ＶＲＰＤ↓、ＶＴＰＤ↓、ＬＥＥＤ↓、ＬＥＩＤ↓、ＬＧＮＤ↓、ＬＧＰＤ↓、ＡＱＰＤ↓からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここにおいて↓は前記グランザイムＢプロテアーゼの開裂部位である、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
一般式がさらに、アミノ酸Ｐ１’およびＰ２’を含み、その結果、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’（式中、Ｐ１’はＸであり、ここにおいてＸは任意のアミノ酸を表し、Ｐ２’はＧであり、ここにおいてＰ１’およびＰ２’は興味のあるポリペプチドの一部である）になる、請求項１９記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
一般式がさらに、アミノ酸Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’を含み、その結果、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’ Ｐ３’Ｐ４’（式中、Ｐ４’はＤまたはＥであり、ここにおいてＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’は興味のあるポリペプチドの一部である）になる、請求項１９記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
興味のあるポリペプチドが、酵素、ポリペプチドホルモン、単鎖抗体可変領域フラグメント、およびアポリポタンパク質Ａからなる群から選択される、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ポリペプチドホルモンが、ソマトトロフィン、グルカゴン、インシュリンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
酵素がグランザイムＢである、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
グランザイムＢがＣ末端ポリヒスチジンタグを含む、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号２）およびｐｒｏ−ＩＥＡＤ−ＧｒＢ−Ｈ６（配列番号３）からなる群から選択される、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ａ（配列番号５）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｔ（配列番号６）、ｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｖ（配列番号７）、およびｐｒｏ−ＩＥＰＤ−ＧｒＢ−Ｈ６ Ｃ２２８Ｆ（配列番号８）からなる群から選択される、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
酵素グランザイムＢが、システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに変異している、ヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種である、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
ヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種が配列番号５７に示される通りである、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
融合パートナーがアフィニティータグである、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
アフィニティータグが、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項３１記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
システイン残基２２８番（キモトリプシノゲンナンバリング）がフェニルアラニンに変異しているヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種。
【請求項３４】
配列番号５７に示される、請求項３３記載のヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載のヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種の使用。
【請求項３６】
請求項１９〜３２のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項３３または３４のいずれかに記載のヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種をコード化する単離された核酸配列。
【請求項３７】
請求項３６に記載の単離された核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３９】
請求項１８に記載の融合タンパク質または請求項３３または３４に記載のヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種の製造法であって：
（ｉ）プロモーターに操作可能に結合した請求項３６に記載の単離された核酸配列を含む組換えベクターを提供する工程、
（ｉｉ）前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記融合タンパク質またはヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種を発現する条件下で培養する工程、および
（ｉｖ）所望により前記融合タンパク質またはヒトグランザイムＢプロテアーゼ変種を単離する工程を含む方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】


【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【公表番号】特表２００７−５２４３６４（Ｐ２００７−５２４３６４Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４３６５（Ｐ２００６−５０４３６５）
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００４／０００２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４７８
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５０５１６１９０９）ボレアン・ファルマ・アクティーゼルスカブ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＲＥＡＮ　ＰＨＡＲＭＡ　Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】