グリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法
【課題】 簡便な操作で高感度にかつ迅速に分析を行うことができ、かつ、希釈された検体を用いても正確にグリコヘモグロビン及びヘモグロビンを定量できるグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法を提供すること。
【解決手段】 検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
【解決手段】 検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコヘモグロビン（ＨｂＡ1、糖化ヘモグロビンとも称される。）量とヘモグロビン（Ｈｂ）量とを分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いたグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法に関する。好適には、グリコヘモグロビン量としてグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）量と総ヘモグロビン（Ｈｂ）量とを同時に分析してヘモグロビン糖化度を算定するヘモグロビン糖化度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は赤血球中に含まれ、酸素の運搬にあずかる呼吸色素であり、蛋白のグロビンと鉄錯化合物であるヘムとが結合して構成されている。グロビンは４つのサブユニット（それぞれ２本のα鎖系とβ鎖系）からなっている。成人溶血液中の９０％以上を占める主成分はサブユニット組成α2 β2 の成人ヘモグロビン（Ｈｂ：後記するグリコヘモグロビンＨｂＡ1などと区別するためＨｂＡ0とも称される）であり、微量成分としてＨｂＡ2（α2 δ2）などがある。
【０００３】
Ｈｂ中には、イオン交換樹脂によりＨｂＡ1a1，ＨｂＡ1a2，ＨｂＡ1ｂ，ＨｂＡ1ｃに分画されるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1、グリコシル化ヘモグロビンとも呼ばれる）が存在する。これらはいずれも同じ一次構造を持つが、正常ヘモグロビンＨｂＡのβ鎖のＮ末端バリンのアミノ基がグルコース（またはグルコース−６−燐酸やフルクトースなど）とアルドイミン（シッフの塩基）を形成し、さらにアマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）転位により、ケトアミンを形成して安定となったものである。
【０００４】
特にグルコースが結合したグリコヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）は、ＨｂＡ1ｃ（グルコヘモグロビン，以下ヘモグロビンＡ1ｃとも称する）と呼ばれ、グリコヘモグロビンの大部分を占める。その含量は血糖値に比例し、正常人で総ヘモグロビンＨｂの３％〜６％を占めるが、糖尿病患者では１５％まで上昇することがある。このため、グルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）量の測定は、糖代謝のコントロールのための良好な指標と考えられている。また、血糖との非酵素的反応により生じたケトアミンは安定であるので、このグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）は赤血球寿命（平均１２０日間）中に分解することはない。従って、血中ＨｂＡ1ｃ量は過去１か月〜２か月の血糖レベルを記録していると解釈される。そのため、総ヘモグロビン（Ｈｂ）に対するＨｂＡ1ｃの割合から過去２か月間程度の血中糖レベルを推定することができる。このように血中ヘモグロビンＡ1ｃの分析は、食事後に一時的に短時間上昇する血糖値のような短期的血糖値指標とは異なり、長期的な血糖管理を可能にする指標として利用されている。
【０００５】
従来、ＨｂＡ1ｃの分析は、ＨＰＬＣやミニカラムを用いたカラムクロマトグラフィーで行われていたが、カラム法では専用の高価な測定機器が必要であるばかりか、分析に時間がかかり、多数の検体を処理する臨床検査には適していなかった。
【０００６】
近年では免疫比濁法やＥＬＩＳＡ法によるＨｂＡ1ｃの分析方法も提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。しかし、この方法は測定操作が煩雑であり、分析に熟練を要求された。また、ＨｂＡ1ｃ量を分析することはできても、総ヘモグロビンＨｂの量は別の方法で測定しなければならないという不都合があった。この点はＨｂＡ1ｃ以外の他のグリコヘモグロビンも同様であり、ＨｂＡ1ｃや他のグリコヘモグロビンの総ヘモグロビンに対する含有比を簡便かつ迅速に分析できる方法が望まれていた。
【０００７】
多層乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビンを検出する方法が提案されている。例えば、特許文献３には、グリコヘモグロビンに対する抗体と酵素との結合物（酵素標識抗体）を用いる方法が開示されている。また、特許文献４には、リガンド標識酵素法）を用いて、糖化ヘモグロビンβ鎖のＮ末端グルコシル化ペプチドで標識された酵素及びグリコヘモグロビンに対する抗体を用いることによりグリコヘモグロビンを測定する方法が開示されている。このような多層乾式分析要素は、グリコヘモグロビンの測定を著しく簡便化することに成功している。
【０００８】
さらに、特許文献５には、多層乾式分析要素により、グリコヘモグロビン量、総ヘモグロビン量を同時に測定し、グリコヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する含有比を分析する方法が開示されている。この方法では、多層乾式分析要素内にとどめられたヘモグロビンをヘモグロビンの吸収波長により測定することにより目的を達している。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６３−２７７９６７号公報
【特許文献２】特開平３−４６５６６号公報
【特許文献３】特開平９−１６６５９４号公報
【特許文献４】特開２０００−３１０６３８号公報
【特許文献５】特開平８−１２２３３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上記の特許文献５に記載の方法では、グリコヘモグロビンの測定において、赤血球を破壊することによりヘモグロビン及びグリコヘモグロビンを溶出させること（血球破壊）が必須であり、通常は検体（全血）を血球破壊液等で希釈することにより行っている。この時ヘモグロビン及びグリコヘモグロビン濃度は希釈よって見掛け上低下し、総ヘモグロビン量の測定が困難になることがあった。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、簡便な操作で高感度にかつ迅速に分析を行うことができ、かつ、希釈された検体を用いても正確にグリコヘモグロビン及びヘモグロビンを定量できるグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような本発明の目的は、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを１つの乾式分析要素で検出できる一体型乾式多層分析要素を用いて分析する際、総ヘモグロビン量を、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することにより始めて可能となった。
すなわち、グリコヘモグロビン測定時には、溶血試薬等で検体（全血）を希釈して溶血することが必須となる。このように、希釈された検体においては、測定対象であるヘモグロビン濃度が低下し、比色測定が困難になる。本発明においては、総ヘモグロビン量を３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することで、精度よく測定することを可能としている。
【００１３】
すなわち、上記目的は以下の発明により達成される。
１． 検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
２． 前記検体の希釈倍率が４０倍以上１００倍以下であることを特徴とする上記１に記載の分析方法。
３． 前記グリコヘモグロビン量と前記総ヘモグロビン量からヘモグロビン中のグリコヘモグロビンの割合を算出することを特徴とする上記１又は２に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る分析方法よれば、総ヘモグロビン量を３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することで、ヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を精度よく測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（分析対象）
本発明の測定対象は、検体に含まれるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）及びヘモグロビン（Ｈｂ）であり、好ましくは、ヒトのグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）である。
検体としては、ヒト又はヒト以外の動物の検体を用いることができる。また、糖尿病患者などの被検者から採血した全血液を対象とすることにより、ヘモグロビン糖化度の測定することができる。
【００１６】
（乾式分析要素）
本発明における乾式分析要素としては、グリコヘモグロビンとグリコシル化していないヘモグロビンとを同時に分別分析できる一体型乾式分析要素であればいずれのものでもよく、公知の乾式分析要素を用いることができる。具体的には、特開平９−１６６５９４号、特開２０００−３１０６３８号、特開平８−１２２３３５号公報等に記載の乾式分析要素を用いることができる。
【００１７】
本発明に係る分析方法に好適な乾式分析要素の一例を図１に示す。図１に示す乾式分析要素では、光透過性支持体１０の上に、試薬層１２、基質層１４が積層されている。基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗グリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）抗体に標識として結合された酵素と、その基質である非拡散性基質とを含有する。試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散・移行してきた酵素反応生成物（拡散性物質）を検出する試薬組成物を含有する。
この乾式分析要素では、基質層１４内に留められた総ヘモグロビン量をヘモグロビン吸収波長で比色測定することにより算定することができる。また、試薬層１２において、ヘモグロビン吸収波長と異なる波長領域で酵素反応性生物を比色測定することによりグリコヘモグロビン量を算定することができる。
このように、グリコヘモグロビンに対応する生成色素と、ヘモグロビン固有の色とを、異なる波長領域で測定することにより、試料中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）と総ヘモグロビン量を同時に分別測定し、グリコヘモグロビン含有比（ＨｂＡ1／総Ｈｂ）の算定を容易にするものである。
以下では、上記の乾式分析要素を用いた場合を一例として本発明に係る分析方法を説明する。
【００１８】
（分析方法）
血液検体は、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンが溶液中に可溶化されたものを使用する。このためには、市販の溶血剤や界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で溶血させてもよいし、非等張希釈液を使用して浸透圧ショックで溶血させてもよい。必要に応じて、超音波処理で赤血球膜を破壊してもよい。凍結融解により溶血させてもよい。
【００１９】
溶血試薬として使用できる界面活性剤としては、特開平６−１１５１０号公報に記載された、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やジオクチルスルホ琥珀酸ナトリウム（ＤＯＮＳ）などのアニオン性界面活性剤、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）やセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型などの両性界面活性剤等が挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、アルキルフェノキシポリグリシドール（例えば、Ｓｕｒｆａｃｔｎａｔ １０Ｇ）などが使用できる。
【００２０】
また、血液検体は、希釈して用いることが好ましい。血液検体を希釈することにより、血中成分（ヘモグロビン、グルコース、アミラーゼ、多糖など）が検出への影響を除去することができるという効果が得られる。
希釈液としては、精製水の他、緩衝液などを使用することができる。上記の溶血剤や溶血試薬としての界面活性剤等を混合した希釈液を用いて血液検体を希釈してもよい。
血液検体の希釈倍率としては、２０倍以上であることが好ましく、３０倍〜２００倍の範囲であることがより好ましく、４０倍〜１００倍の範囲であることがさらに好ましい。
【００２１】
上記のようにして調製した血液検体を乾式分析要素に点着する。この際、その点着量は乾式分析要素のサイズ・材質等によって適宜変更することができるが、例えば、上記のように基質層１４に酵素標識抗体を含有させてある場合は、例えば約５μＬ〜約３０μＬ、好ましくは８μＬ〜１５μＬの範囲の検体試料（溶血処理した血液などの水性液体試料液）を、この基質層に点着する。
【００２２】
なお、上記の乾式分析要素では、血液検体の点着後に基質内での免疫反応及び酵素反応を促進させるために乾式分析要素をインキュベーションすることが望ましい。インキュベーションの条件としては、約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１分間〜１０分間の範囲で設定することができる。
【００２３】
グリコヘモグロビンは基質層１４内に含まれる酵素標識抗体と反応し、抗原抗体マトリックス構造を作る。このため同じ基質層１４に含有されている非拡散性基質に対する標識酵素の酵素活性は抑制される。検体中のグリコヘモグロビン量と反比例する酵素活性により生じた酵素反応生成物（拡散性生成物）は、試薬層１２に拡散・移行し、検出試薬組成物により発色または変色を生じる。この発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成しておいた検量線を用いて、比色測定法の原理により検体中のグリコヘモグロビンの量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
グリコヘモグロビン量を測定する際の測定波長としては、酵素反応生成物（拡散性生成物）を用いて適宜設定することができる。ただし、できるだけ誤差を少なくするためには、ヘモグロビン量を測定する際の波長領域と重ならないように設定することが好ましい。
【００２４】
一方、グリコヘモグロビン以外のヘモグロビン（ＨｂＡ0など）は、抗体と結合しているグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）と同様、試薬層１２内には移行することがなく、基質層１４内にとどまり、基質層１４をヘモグロビン特有の色に着色する。この着色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成しておいた検量線を用いて、比色測定法の原理により検体中の総ヘモグロビン（Ｈｂ）の量を求めることができる。
【００２５】
グリコヘモグロビン分析に使用する試薬組成物による発色または変色の吸収波長を、ヘモグロビン固有の色調による吸収波長とは異なるように設定しておけば、グリコヘモグロビンと総ヘモグロビンとを同一の分析要素上で同時に測定することができる。
ヘモグロビン量を測定する際の吸収波長としては、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲にあるヘモグロビン吸収波長を用いる。ヘモグロビン吸収波長としては、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲のものが好ましく、４００ｎｍ〜４３０ｎｍの範囲のものがより好ましい。
上記範囲内のヘモグロビン吸収波長は非常に大きな吸収ピークであるため、血液検体を溶出させた場合にも、精度よくヘモグロビン量を検出することができる。
【００２６】
得られたＨｂＡ1量と、総ヘモグロビン量（Ｈｂ）から、下記式によりグリコヘモグロビン含有比（％）を求めることができる。ＨｂＡ1としてグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）の量を測定した場合求められた含有比は糖化度を意味する。
（ＨｂＡ1／Ｈｂ）×１００ （％）
【００２７】
以上の測定操作は、特開昭６０−１２５５４３、同６０−２２０８６２、同６１−２９４３６７、同５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお分析要素内に、酵素標識抗体を含有させていない場合には、要素に点着する前に、試料溶液を酵素標識抗体を含む溶液と混和して、結合反応を十分行なわせてから、基質層１４（図１）に点着すればよい。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
特開平８−１２２３３５号公報に記載の実施例２と同様の方法で、ヘモグロビンＡ1ｃ用多層乾式スライドを作製した。
このスライドに、既知量のヒトＨｂＡ1ｃを含有するｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬを点着し、３７℃に保って、分光光度計（ＭＣＰＤ−２０００（大塚電子））でＰＥＴ支持体側から中心波長６５０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6−4）を求めて、検量線を作成した。図２に示すように、このヘモグロビンＡ1ｃ分析用乾式免疫分析要素はヘモグロビンＡ1ｃの定量を精度良く行えることが明らかである。
同時に、同スライドの支持体側から、中心波長４２０ｎｍと５４０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から０．５分後の反射光学濃度ＯＤから、吸収波長が５４０ｎｍと４２０ｎｍにおける総ヘモグロビンＨｂの検量線を作成した（図３）。
図３から、同じヘモグロビンＨｂ濃度に対して、吸収波長が５４０ｎｍの場合と比べて、４２０ｎｍのほうが高いＯＤ値が得られた。特に血液が高倍率希釈される時、ヘモグロビンＨｂの濃度が低くなることから、この時、５４０ｎｍに比べて４２０ｎｍを測定波長とする場合が有利であることがわかる。
【００２９】
［実施例２］
先ず、参照実験として、ヒト全血検体を自動分析装置（日立７１７０）で従来方法によってヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を測定した。総ヘモグロビン量（Ｈｂ）は１３．０ ｇ／dＬ、ヘモグロビンＡ1ｃ量は１．１０ ｇ／dＬ（グルコヘモグロビン含有比（ＨｂＡ1ｃ／総Ｈｂ）に換算すると８．５％）である。
このヒト全血１体積を、ｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液で２０と１００体積で混合、希釈して溶血させた。この希釈液の１０μＬを実施例１のスライドに点着し、３７℃に保って、中心波長がそれぞれ６５０ｎｍ、４２０ｎｍと５４０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。求めた反射光学濃度で実施例１の検量線から、ヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を換算した（測定回数、Ｎ＝３）（表１）。
表１より、１００倍希釈された検体において、５４０ｎｍの吸収でＨｂを測定した場合、バラツキも多く、測定値も不正確であることがわかる。一方、本発明の４２０ｎｍ測定では、１００倍希釈においても正確な値を示している。
この結果より、本発明の方法により、高度希釈された検体においても、グリコヘモグロビン量と総ヘモグロビン量が同時に測定できることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る分析方法に好適な乾式分析要素の一例の断面模式図である。
【図２】実施例１のヘモグロビンＡ1ｃ測定用分析要素の検量線を示す図である。免疫反応、酵素反応のいずれも要素内で行われている。試料はヒトＨｂＡ1ｃ溶液である。
【図３】実施例１の分析要素によるヒト総Ｈｂの検量線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコヘモグロビン（ＨｂＡ1、糖化ヘモグロビンとも称される。）量とヘモグロビン（Ｈｂ）量とを分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いたグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法に関する。好適には、グリコヘモグロビン量としてグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）量と総ヘモグロビン（Ｈｂ）量とを同時に分析してヘモグロビン糖化度を算定するヘモグロビン糖化度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は赤血球中に含まれ、酸素の運搬にあずかる呼吸色素であり、蛋白のグロビンと鉄錯化合物であるヘムとが結合して構成されている。グロビンは４つのサブユニット（それぞれ２本のα鎖系とβ鎖系）からなっている。成人溶血液中の９０％以上を占める主成分はサブユニット組成α2 β2 の成人ヘモグロビン（Ｈｂ：後記するグリコヘモグロビンＨｂＡ1などと区別するためＨｂＡ0とも称される）であり、微量成分としてＨｂＡ2（α2 δ2）などがある。
【０００３】
Ｈｂ中には、イオン交換樹脂によりＨｂＡ1a1，ＨｂＡ1a2，ＨｂＡ1ｂ，ＨｂＡ1ｃに分画されるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1、グリコシル化ヘモグロビンとも呼ばれる）が存在する。これらはいずれも同じ一次構造を持つが、正常ヘモグロビンＨｂＡのβ鎖のＮ末端バリンのアミノ基がグルコース（またはグルコース−６−燐酸やフルクトースなど）とアルドイミン（シッフの塩基）を形成し、さらにアマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）転位により、ケトアミンを形成して安定となったものである。
【０００４】
特にグルコースが結合したグリコヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）は、ＨｂＡ1ｃ（グルコヘモグロビン，以下ヘモグロビンＡ1ｃとも称する）と呼ばれ、グリコヘモグロビンの大部分を占める。その含量は血糖値に比例し、正常人で総ヘモグロビンＨｂの３％〜６％を占めるが、糖尿病患者では１５％まで上昇することがある。このため、グルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）量の測定は、糖代謝のコントロールのための良好な指標と考えられている。また、血糖との非酵素的反応により生じたケトアミンは安定であるので、このグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）は赤血球寿命（平均１２０日間）中に分解することはない。従って、血中ＨｂＡ1ｃ量は過去１か月〜２か月の血糖レベルを記録していると解釈される。そのため、総ヘモグロビン（Ｈｂ）に対するＨｂＡ1ｃの割合から過去２か月間程度の血中糖レベルを推定することができる。このように血中ヘモグロビンＡ1ｃの分析は、食事後に一時的に短時間上昇する血糖値のような短期的血糖値指標とは異なり、長期的な血糖管理を可能にする指標として利用されている。
【０００５】
従来、ＨｂＡ1ｃの分析は、ＨＰＬＣやミニカラムを用いたカラムクロマトグラフィーで行われていたが、カラム法では専用の高価な測定機器が必要であるばかりか、分析に時間がかかり、多数の検体を処理する臨床検査には適していなかった。
【０００６】
近年では免疫比濁法やＥＬＩＳＡ法によるＨｂＡ1ｃの分析方法も提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。しかし、この方法は測定操作が煩雑であり、分析に熟練を要求された。また、ＨｂＡ1ｃ量を分析することはできても、総ヘモグロビンＨｂの量は別の方法で測定しなければならないという不都合があった。この点はＨｂＡ1ｃ以外の他のグリコヘモグロビンも同様であり、ＨｂＡ1ｃや他のグリコヘモグロビンの総ヘモグロビンに対する含有比を簡便かつ迅速に分析できる方法が望まれていた。
【０００７】
多層乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビンを検出する方法が提案されている。例えば、特許文献３には、グリコヘモグロビンに対する抗体と酵素との結合物（酵素標識抗体）を用いる方法が開示されている。また、特許文献４には、リガンド標識酵素法）を用いて、糖化ヘモグロビンβ鎖のＮ末端グルコシル化ペプチドで標識された酵素及びグリコヘモグロビンに対する抗体を用いることによりグリコヘモグロビンを測定する方法が開示されている。このような多層乾式分析要素は、グリコヘモグロビンの測定を著しく簡便化することに成功している。
【０００８】
さらに、特許文献５には、多層乾式分析要素により、グリコヘモグロビン量、総ヘモグロビン量を同時に測定し、グリコヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する含有比を分析する方法が開示されている。この方法では、多層乾式分析要素内にとどめられたヘモグロビンをヘモグロビンの吸収波長により測定することにより目的を達している。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６３−２７７９６７号公報
【特許文献２】特開平３−４６５６６号公報
【特許文献３】特開平９−１６６５９４号公報
【特許文献４】特開２０００−３１０６３８号公報
【特許文献５】特開平８−１２２３３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上記の特許文献５に記載の方法では、グリコヘモグロビンの測定において、赤血球を破壊することによりヘモグロビン及びグリコヘモグロビンを溶出させること（血球破壊）が必須であり、通常は検体（全血）を血球破壊液等で希釈することにより行っている。この時ヘモグロビン及びグリコヘモグロビン濃度は希釈よって見掛け上低下し、総ヘモグロビン量の測定が困難になることがあった。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、簡便な操作で高感度にかつ迅速に分析を行うことができ、かつ、希釈された検体を用いても正確にグリコヘモグロビン及びヘモグロビンを定量できるグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような本発明の目的は、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを１つの乾式分析要素で検出できる一体型乾式多層分析要素を用いて分析する際、総ヘモグロビン量を、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することにより始めて可能となった。
すなわち、グリコヘモグロビン測定時には、溶血試薬等で検体（全血）を希釈して溶血することが必須となる。このように、希釈された検体においては、測定対象であるヘモグロビン濃度が低下し、比色測定が困難になる。本発明においては、総ヘモグロビン量を３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することで、精度よく測定することを可能としている。
【００１３】
すなわち、上記目的は以下の発明により達成される。
１． 検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
２． 前記検体の希釈倍率が４０倍以上１００倍以下であることを特徴とする上記１に記載の分析方法。
３． 前記グリコヘモグロビン量と前記総ヘモグロビン量からヘモグロビン中のグリコヘモグロビンの割合を算出することを特徴とする上記１又は２に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る分析方法よれば、総ヘモグロビン量を３５０ｎｍ〜４５０ｎｍにあるヘモグロビンの吸収波長により比色測定することで、ヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を精度よく測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（分析対象）
本発明の測定対象は、検体に含まれるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）及びヘモグロビン（Ｈｂ）であり、好ましくは、ヒトのグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）である。
検体としては、ヒト又はヒト以外の動物の検体を用いることができる。また、糖尿病患者などの被検者から採血した全血液を対象とすることにより、ヘモグロビン糖化度の測定することができる。
【００１６】
（乾式分析要素）
本発明における乾式分析要素としては、グリコヘモグロビンとグリコシル化していないヘモグロビンとを同時に分別分析できる一体型乾式分析要素であればいずれのものでもよく、公知の乾式分析要素を用いることができる。具体的には、特開平９−１６６５９４号、特開２０００−３１０６３８号、特開平８−１２２３３５号公報等に記載の乾式分析要素を用いることができる。
【００１７】
本発明に係る分析方法に好適な乾式分析要素の一例を図１に示す。図１に示す乾式分析要素では、光透過性支持体１０の上に、試薬層１２、基質層１４が積層されている。基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗グリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）抗体に標識として結合された酵素と、その基質である非拡散性基質とを含有する。試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散・移行してきた酵素反応生成物（拡散性物質）を検出する試薬組成物を含有する。
この乾式分析要素では、基質層１４内に留められた総ヘモグロビン量をヘモグロビン吸収波長で比色測定することにより算定することができる。また、試薬層１２において、ヘモグロビン吸収波長と異なる波長領域で酵素反応性生物を比色測定することによりグリコヘモグロビン量を算定することができる。
このように、グリコヘモグロビンに対応する生成色素と、ヘモグロビン固有の色とを、異なる波長領域で測定することにより、試料中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）と総ヘモグロビン量を同時に分別測定し、グリコヘモグロビン含有比（ＨｂＡ1／総Ｈｂ）の算定を容易にするものである。
以下では、上記の乾式分析要素を用いた場合を一例として本発明に係る分析方法を説明する。
【００１８】
（分析方法）
血液検体は、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンが溶液中に可溶化されたものを使用する。このためには、市販の溶血剤や界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で溶血させてもよいし、非等張希釈液を使用して浸透圧ショックで溶血させてもよい。必要に応じて、超音波処理で赤血球膜を破壊してもよい。凍結融解により溶血させてもよい。
【００１９】
溶血試薬として使用できる界面活性剤としては、特開平６−１１５１０号公報に記載された、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やジオクチルスルホ琥珀酸ナトリウム（ＤＯＮＳ）などのアニオン性界面活性剤、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）やセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型などの両性界面活性剤等が挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、アルキルフェノキシポリグリシドール（例えば、Ｓｕｒｆａｃｔｎａｔ １０Ｇ）などが使用できる。
【００２０】
また、血液検体は、希釈して用いることが好ましい。血液検体を希釈することにより、血中成分（ヘモグロビン、グルコース、アミラーゼ、多糖など）が検出への影響を除去することができるという効果が得られる。
希釈液としては、精製水の他、緩衝液などを使用することができる。上記の溶血剤や溶血試薬としての界面活性剤等を混合した希釈液を用いて血液検体を希釈してもよい。
血液検体の希釈倍率としては、２０倍以上であることが好ましく、３０倍〜２００倍の範囲であることがより好ましく、４０倍〜１００倍の範囲であることがさらに好ましい。
【００２１】
上記のようにして調製した血液検体を乾式分析要素に点着する。この際、その点着量は乾式分析要素のサイズ・材質等によって適宜変更することができるが、例えば、上記のように基質層１４に酵素標識抗体を含有させてある場合は、例えば約５μＬ〜約３０μＬ、好ましくは８μＬ〜１５μＬの範囲の検体試料（溶血処理した血液などの水性液体試料液）を、この基質層に点着する。
【００２２】
なお、上記の乾式分析要素では、血液検体の点着後に基質内での免疫反応及び酵素反応を促進させるために乾式分析要素をインキュベーションすることが望ましい。インキュベーションの条件としては、約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１分間〜１０分間の範囲で設定することができる。
【００２３】
グリコヘモグロビンは基質層１４内に含まれる酵素標識抗体と反応し、抗原抗体マトリックス構造を作る。このため同じ基質層１４に含有されている非拡散性基質に対する標識酵素の酵素活性は抑制される。検体中のグリコヘモグロビン量と反比例する酵素活性により生じた酵素反応生成物（拡散性生成物）は、試薬層１２に拡散・移行し、検出試薬組成物により発色または変色を生じる。この発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成しておいた検量線を用いて、比色測定法の原理により検体中のグリコヘモグロビンの量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
グリコヘモグロビン量を測定する際の測定波長としては、酵素反応生成物（拡散性生成物）を用いて適宜設定することができる。ただし、できるだけ誤差を少なくするためには、ヘモグロビン量を測定する際の波長領域と重ならないように設定することが好ましい。
【００２４】
一方、グリコヘモグロビン以外のヘモグロビン（ＨｂＡ0など）は、抗体と結合しているグリコヘモグロビン（ＨｂＡ1）と同様、試薬層１２内には移行することがなく、基質層１４内にとどまり、基質層１４をヘモグロビン特有の色に着色する。この着色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成しておいた検量線を用いて、比色測定法の原理により検体中の総ヘモグロビン（Ｈｂ）の量を求めることができる。
【００２５】
グリコヘモグロビン分析に使用する試薬組成物による発色または変色の吸収波長を、ヘモグロビン固有の色調による吸収波長とは異なるように設定しておけば、グリコヘモグロビンと総ヘモグロビンとを同一の分析要素上で同時に測定することができる。
ヘモグロビン量を測定する際の吸収波長としては、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲にあるヘモグロビン吸収波長を用いる。ヘモグロビン吸収波長としては、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲のものが好ましく、４００ｎｍ〜４３０ｎｍの範囲のものがより好ましい。
上記範囲内のヘモグロビン吸収波長は非常に大きな吸収ピークであるため、血液検体を溶出させた場合にも、精度よくヘモグロビン量を検出することができる。
【００２６】
得られたＨｂＡ1量と、総ヘモグロビン量（Ｈｂ）から、下記式によりグリコヘモグロビン含有比（％）を求めることができる。ＨｂＡ1としてグルコヘモグロビン（ＨｂＡ1ｃ）の量を測定した場合求められた含有比は糖化度を意味する。
（ＨｂＡ1／Ｈｂ）×１００ （％）
【００２７】
以上の測定操作は、特開昭６０−１２５５４３、同６０−２２０８６２、同６１−２９４３６７、同５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお分析要素内に、酵素標識抗体を含有させていない場合には、要素に点着する前に、試料溶液を酵素標識抗体を含む溶液と混和して、結合反応を十分行なわせてから、基質層１４（図１）に点着すればよい。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
特開平８−１２２３３５号公報に記載の実施例２と同様の方法で、ヘモグロビンＡ1ｃ用多層乾式スライドを作製した。
このスライドに、既知量のヒトＨｂＡ1ｃを含有するｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬを点着し、３７℃に保って、分光光度計（ＭＣＰＤ−２０００（大塚電子））でＰＥＴ支持体側から中心波長６５０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6−4）を求めて、検量線を作成した。図２に示すように、このヘモグロビンＡ1ｃ分析用乾式免疫分析要素はヘモグロビンＡ1ｃの定量を精度良く行えることが明らかである。
同時に、同スライドの支持体側から、中心波長４２０ｎｍと５４０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から０．５分後の反射光学濃度ＯＤから、吸収波長が５４０ｎｍと４２０ｎｍにおける総ヘモグロビンＨｂの検量線を作成した（図３）。
図３から、同じヘモグロビンＨｂ濃度に対して、吸収波長が５４０ｎｍの場合と比べて、４２０ｎｍのほうが高いＯＤ値が得られた。特に血液が高倍率希釈される時、ヘモグロビンＨｂの濃度が低くなることから、この時、５４０ｎｍに比べて４２０ｎｍを測定波長とする場合が有利であることがわかる。
【００２９】
［実施例２］
先ず、参照実験として、ヒト全血検体を自動分析装置（日立７１７０）で従来方法によってヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を測定した。総ヘモグロビン量（Ｈｂ）は１３．０ ｇ／dＬ、ヘモグロビンＡ1ｃ量は１．１０ ｇ／dＬ（グルコヘモグロビン含有比（ＨｂＡ1ｃ／総Ｈｂ）に換算すると８．５％）である。
このヒト全血１体積を、ｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液で２０と１００体積で混合、希釈して溶血させた。この希釈液の１０μＬを実施例１のスライドに点着し、３７℃に保って、中心波長がそれぞれ６５０ｎｍ、４２０ｎｍと５４０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。求めた反射光学濃度で実施例１の検量線から、ヘモグロビンＡ1ｃ量及び総ヘモグロビン量を換算した（測定回数、Ｎ＝３）（表１）。
表１より、１００倍希釈された検体において、５４０ｎｍの吸収でＨｂを測定した場合、バラツキも多く、測定値も不正確であることがわかる。一方、本発明の４２０ｎｍ測定では、１００倍希釈においても正確な値を示している。
この結果より、本発明の方法により、高度希釈された検体においても、グリコヘモグロビン量と総ヘモグロビン量が同時に測定できることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る分析方法に好適な乾式分析要素の一例の断面模式図である。
【図２】実施例１のヘモグロビンＡ1ｃ測定用分析要素の検量線を示す図である。免疫反応、酵素反応のいずれも要素内で行われている。試料はヒトＨｂＡ1ｃ溶液である。
【図３】実施例１の分析要素によるヒト総Ｈｂの検量線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、
グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記検体の希釈倍率が４０倍以上１００倍以下であることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記グリコヘモグロビン量と前記総ヘモグロビン量からヘモグロビン中のグリコヘモグロビンの割合を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項１】
検体中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを同時に分別分析可能な一体型乾式分析要素を用いてグリコヘモグロビン量及び総ヘモグロビン量を分析する分析方法であって、
グリコヘモグロビン及びヘモグロビンを含む検体を２０倍以上に希釈し、これを前記一体型乾式分析要素に接触させ、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲のヘモグロビンの吸収波長により総ヘモグロビン量を比色測定することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記検体の希釈倍率が４０倍以上１００倍以下であることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記グリコヘモグロビン量と前記総ヘモグロビン量からヘモグロビン中のグリコヘモグロビンの割合を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２６６８１１（Ｐ２００６−２６６８１１Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−８４０２１（Ｐ２００５−８４０２１）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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