グルタミン残基を含む炭水化物系腹膜透析液
本発明は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，Ｌ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，アラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液に関する。本発明の腹膜透析液は，腹膜透析治療を受けている人における技術的障害の抑制に有用である。
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，Ｌ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，アラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液に関する。本発明の腹膜透析液は，腹膜透析治療を受けている人における技術的障害の抑制に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，腹膜透析液（以下，"ＰＤＦ"と称する）に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜透析液は，尿毒症患者から溶質および水を除くものである。いくつかの臨床的および実験的観察から，ＰＤＦは細胞毒性を有することが示されており，これは長期腹膜透析（ＰＤ）治療の３０％までの技術的障害のリスクに関連している（６）。したがって，長期にわたるＰＤ治療では，しばしば腹膜の一体性に重篤な慢性的障害が生ずる。ＰＤＦの生体不適合性および腹膜炎症が主要な原因であると考えられている。ＰＤＦ暴露は，腹膜細胞代謝を損ない，増殖を低下させ，細胞死を増加させ，ならびに細胞骨格組織および細胞シグナリング，例えば，分化および炎症の制御を破壊する。このことにより，異常な治癒プロセス，上皮間葉細胞分化転換，血管新生，線維症および腹膜の慢性的瘢痕化が生ずる（７）。ＰＤを受けている患者からの一連の腹膜生検標本の分析から，有害な構造的変化が明らかになった。重症の場合には，中皮細胞が剥離し，腹膜が露出され，結合組織の厚い不定形の層で覆われる。これらの形態学的変化により，半透過性透析膜としての腹膜のバリア機能が大きく破壊される。ＰＤを受けている成人患者の１／３までが，腹膜障害のため，治療の経過中に技術的障害を患うことになる（６）。
【０００３】
したがって，最近の研究は，ＰＤＦの生体適合性を高め，このことによりＰＤの間の中皮細胞障害を低減させることを目的としている。新たな改良された製剤は，いくつかのインビトロおよびインビボ実験および臨床試験において実際に毒性が低いことが示されている（７，１０）。抗酸化剤／スカベンジャーであるカルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジンジペプチド），またはグルタチオン（ガンマ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン）および関連する化合物（例えば，システインプロドラッグであるＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレート）を添加することは，ＰＤＦの生体適合性に有益な影響を有し，ＰＤにおけるグルコース分解産物の有害な影響を受動的に低減することが示されている（２０−２２）。
【０００４】
しかし，ＰＤＦの主要な作用原理は，その高浸透圧のため，尿毒症患者から溶質および水を除去することである。したがって，ＰＤＦは，生理学的に不活性であるかまたは完全に生物適合性のある液体とはなりえず，腹腔への充填と腹腔からの排出の繰り返しは常にある程度の細胞傷害活性をもつ。
【０００５】
上述の欠点は，特に炭水化物系ＰＤＦにあてはまる。"炭水化物系"ＰＤＦとは，浸透圧剤としてのグルコースまたはグルコース−オリゴマーおよびグルコース−ポリマーに基づく腹膜透析液であることが，当業者には理解される。本発明においては，好ましくはグルコースに基づくＰＤＦが用いられ，これは典型的には１０から４５ｇ／ｌのグルコースを含む（ＥＰ１１６６７８７を参照）。炭水化物系ＰＤＦのさらに別の例は，ＷＯ８２／０３７７３Ａ１，ＵＳ４，９７６，６８３Ａ，ＷＯ０１／０２００４Ａ１，ＵＳ２００３／０２３２０９３Ａ１，ＥＰ１３６９，４３２Ａ２，ＫＲ２００１／００８６５９，ＷＯ９４／１４４６８Ａ１，ＷＯ９９／０１１４４Ａ１，ＵＳ６，０７７，８３６Ａ，ＷＯ９５／１９７７８Ａ１，ＵＳ２００５／００７４４８５Ａ１，ＥＰ０２０７６７６Ａ２およびＷＯ９３／１４７９６に開示されている。
【０００６】
最近，特にグルコース系ＰＤＦの細胞傷害活性は，細胞傷害を引き起こすのみならず，すべての細胞に見いだされる内因性の機構である中皮細胞中の熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）を活性化することが，ＰＤのインビトロ，エクスビボ，およびインビボモデルで示された（１−４，１６）。いずれの研究も，ＰＤＦの生体適合性のマーカーとしてのＨＳＰアップレギュレーションに焦点を当てているが，より最近のデータは，ＨＳＰが実験的ＰＤの間に中皮細胞を保護することを明らかにした（３，５，９）。
【０００７】
ＨＳＰの過剰発現は，ＰＤのインビトロモデルにおいて，通常は致死的であるＰＤＦ暴露からの生存を引き起こし，およびＰＤのインビボモデルにおいて中皮細胞が腹膜ライニングから剥離することを防止する（５，９）。
【０００８】
しかし，ＨＳＰの過剰発現を誘導するために用いられているプロトコル，例えば，温熱療法または過渡的トランスフェクションのいずれも，ＰＤの臨床設定では魅力的な方法ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は，これまでに知られている製品より細胞傷害活性の低い炭水化物系腹膜透析液を提供することである。特に，本発明の目的は，ＰＤＦ暴露の際の病態生理学的ストレスに対する細胞応答を積極的に最適化することにより，ＰＤ治療を受けている患者における技術的障害を抑制する炭水化物系腹膜透析液を提供することである。
【００１０】
"技術的障害"との用語は，当業者にはよく知られており，腹膜透析を打ち切り，血液透析等の代替の腎臓置換治療への切り替えを必要とすることを意味する（６）。特に，技術的障害を抑制することは，腹膜障害を予防し，バリア機能障害を軽減させ，中皮細胞剥離を防止する工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液により解決される。
【００１２】
さらに，この課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物であって，炭水化物系腹膜透析液を用いる腹膜透析治療における技術的障害を抑制する特定の用途のための化合物により解決される。
【００１３】
また，本発明の課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される，技術的障害を抑制するための特定の用途のための化合物を含む炭水化物系腹膜透析液により解決される。
【００１４】
驚くべきことに，グルタミンが中皮細胞においてＨＳＰの発現を誘導することが見いだされた。さらに，グルタミン，またはグルタミンを遊離形で放出しうるジペプチド，例えばグルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンを含む炭水化物系透析液は，先に知られている製品より細胞傷害活性が低いことが見いだされた。グルタミン含有ジペプチド，例えばグルタミニル−グリシンおよびグリシニル−グルタミンの，グルタミンの前駆体としての用途もまた有益である。
【００１５】
グルタミンは無毒性であり，ＨＳＰ発現を増加させることにより細胞保護を媒介することが先に報告されている（１４，１８）。インビトロでは，薬理学的用量のグルタミンは，インドメタシンおよび他のＮＳＡＩＤについて記載されているものと同様に，ＨＳＦ−１のそのプロモーターへのＤＮＡ結合を増強する（１１，１２）。あるいは，グルタミン補充は，ストレスの多い条件下でＨＳＰ−７２ｍＲＮＡを安定化させ，このことによりＨＳＰ発現を増加させることが示されている（８）。しかし，ＰＤＦに暴露されたときに中皮細胞においてＨＳＰ発現を増強させるためにグルタミンを使用することは，これまでに提案されていない。
【００１６】
本発明にしたがえば，グルタミンは，単量体形で，および／または，グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドの形で，使用することができる。アミノ酸の哺乳動物への投与は，これをジペプチドまたはトリペプチドの形で投与すれば，より許容されることが知られている。特に，グルタミンは，水性溶液にあまり溶解せず，比較的不安定なアミノ酸であり，したがって臨床設定においては，好ましくはグルタミンおよび別のアミノ酸，好ましくはアラニンおよびグリシンから構成されるジペプチドとして用いる（２３）。Ｌ−グルタミンを成分として含むジペプチドは，例えば，ＵＳ５，１８９，０１６に開示されている。
【００１７】
かかるジペプチドは，好ましくは，アラニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，グルタミニル−グリシンおよびグリシニル−グルタミンからなる群より選択される。
【００１８】
好ましい態様においては，本発明にしたがうＰＤＦは，中皮細胞における熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の発現を増強するのに十分な量で前記化合物を含む。
【００１９】
液体中の前記化合物，特にＬ−グルタミンの濃度は，０．３ｍＭから３００ｍＭ，好ましくは２ｍＭから２５ｍＭの範囲であることができる。
【００２０】
本発明にしたがう腹膜透析液は，化合物（すなわち，単量体の形のグルタミンまたは上で定義したとおりオリゴペプチドの成分として）を炭水化物系腹膜透析液と混合する工程を含むプロセスにより製造することができる。本発明にしたがうＰＤＦを製造するために用いられる炭水化物系腹膜透析液は，現在市販されている標準的な製品であることができる。
【００２１】
好ましくは，化合物は，熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の中皮細胞における発現を増強するのに十分な量で炭水化物系腹膜透析液と混合する。
【００２２】
本発明はさらに，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物の，技術的障害を抑制するための炭水化物系腹膜透析液の製造における使用に関する。
【００２３】
すべての態様について，用いられるＰＤＦは，好ましくはグルコース系である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミン（ＧＬＮ）の暴露の影響を示す。
【図２】図１２は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミン（ＧＬＮ）の暴露の影響を示す。
【図３】図３は，培養ヒト中皮細胞のＰＤＦ暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。
【図４】図４は，培養ヒト中皮細胞のＰＤＦ暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。
【図５】図５は，腹膜透析のラットモデルにおいてＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作が中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。
【図６】図６は，腹膜透析のラットモデルにおいてＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作が中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に，本発明の好ましい態様を例示する実施例および図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００２６】
図１および２は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミンの暴露の影響を示す。生存率は，コントロール条件下で，増加する用量のグルタミン（ＧＬＮ）に暴露した後のＬＤＨ放出（図１）およびＨＳＰ−７２発現（図２）により評価した。Ｌ−グルタミンを２０ｍＭまで添加すると，生存率は変わらなかった。ＨＳＰ−７２発現は８および１０ｍＭのグルタミン濃度で増強された。データは３回の独立した実験の代表例である。
【００２７】
図３および４は，培養ヒト中皮細胞へのＰＤＦの暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。生存率は，グルタミン（ＧＬＮ）を添加または添加せずにＰＤＦに１２０分間暴露した後のＬＤＨ放出（図３）およびＨＳＰ−７２発現（図４）により評価した。データは箱（第２５および第７５），髭（第１０および第９０パーセンタイル）および中央値プロットで示される。Ｌ−グルタミンを添加すると，生存能力が有意に保護され，ＨＳＰ−７２発現が増加した。データは６回の実験から取得した。詳細な統計学は結果の節で説明する。
【００２８】
図５および６は，ＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）が腹膜透析のラットモデルにおける中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。標準的なＰＤＦ（ＰＤＦ）またはＬ−グルタミンを添加したＰＤＦ（ＧＬＮ−ＰＤＦ）のいずれかを用いる４時間残存（ｄｗｅｌｌ）の後に，トリプシン腹膜洗浄により回収したラット中皮細胞におけるＨＳＰ−７２発現を調べた。Ｌ−グルタミンの添加によりＨＳＰ−７２発現が増強された。中皮細胞剥離（図５）および腹膜蛋白質喪失（図６）は，箱（第２５および第７５），髭（第１０および第９０パーセンタイル）および中央値プロットで示される。Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加は，有意に低い中皮細胞（ＭＣ）数および透析液流出物への蛋白質喪失の低下を伴っていた。データは，６匹のラットから，各群につき３回の独立した実験から取得した。
【実施例】
【００２９】
材料および方法
ＰＤのインビトロモデル（出典：文献５）
不死化ヒト中皮細胞（Ｍｅｔ５Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９４４４）は，１００ユニット／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを補充したＭ１９９／ＭＣＤＢ１０５培地（１：１）で培養した。培養物は７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で３７℃，５％ＣＯ２で維持し，定期的にトリプシン処理することにより継代した。培地は２〜３日ごとに交換した。平均して６−７日後にコンフルエントに達した。次に，コンフルエントの培養物を，１．５％無水デキストロース（ｐＨ５．５）を含む標準的なグルコースモノマーおよび酸性の乳酸系ＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ ２，Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に，細胞保護化合物（４〜２０ｍＭのグルタミン）を添加してまたは添加せずに，１２０分間暴露し，通常の成長培地で１６時間回復させた。対照培養物は通常の培地で３７℃で維持し，"シャム培地交換"を行った，すなわち，ＰＤＦへの暴露と平行して対照培地に暴露した。
【００３０】
細胞の生存率は，乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）分析により評価した。記載される実験設定の後に上清の５０μｌのアリコートを取り出し，４℃で保存して，４８時間以内に分析した。測定はＳｉｇｍａ ＴＯＸ−７ ＬＤＨ Ｋｉｔを用いて，製造元の指針にしたがって２回行った。ＬＤＨ排出（ｅｆｆｌｕｘ）は，各陰性対照実験において測定されたＬＤＨの値のパーセンテージとして計算した。ＨＳＰの誘導は，平行して行った培養物において，下記に説明するようにして評価した。
【００３１】
ＰＤのインビボ急性ラットモデル（出典：文献９）：
実験は，成人雄近交系スプラグドーリーラット（平均体重３１０ｇ）を用いて行った。動物を麻酔した後（１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジン，筋肉内），加熱小動物手術台に置いた。小さい腹部正中切開を通して滅菌カテーテルを腹腔内に挿入し，３５ｍｌの試験液体（４〜１０ｍＭのＬ−グルタミンを添加または添加しないＰＤＦ）を４５〜６０秒間かけてゆっくり注入した。動物を静かに動かし，少量の腹膜液体を吸引し，カテーテルを抜去し，腹部を縫合した。動物は処置から２０分以内に覚醒し，餌および水道水を自由に摂取させた。腹腔内注入の４時間後，動物を再び麻酔し，さらに別の少量の腹膜液体を吸引し，動物を心臓穿刺および放血により犠牲死させた。その後，正中切開により開腹し，腹膜内液体すべてを静かに回収した。回収した液体の容量を記録し，総細胞数および２つの時点（０および４時間）における数の相違を，ギムザ染色後に手動で，およびクールターカウンターで機械的に測定した。次に，各ラットについて，剥離した中皮細胞の総数を計算した。選択された動物においては，４時間ドウェル後，腹膜を０．１％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡを含む２０ｍＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で２０分間洗浄することにより，腹腔中の中皮細胞内膜を回収した。
【００３２】
腹膜のバリア機能を試験するために，プロトコルの最後に，透析液（Ｄ）サンプル中のクレアチニン，グルコースおよび総蛋白質，および血漿（Ｐ）中のクレアチニンを測定した。クレアチニンのＤ／Ｐ比およびグルコースのＤ／Ｄ０比を計算した。腹膜蛋白質喪失は，最終透析液濃度ｘ最終容量として計算した。すべての動物は，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより作成され，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより発行されている実験動物管理の原則にしたがって，人道的に取り扱った。
【００３３】
ＨＳＰ−７２検出および統計学：
ウエスタンブロッティング：中皮細胞回収物の蛋白質含量をブラッドフォード・アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により測定し，等量の蛋白質サンプル（５μｇ／レーン）をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩユニットを用いる標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。サイズ分画した蛋白質を，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ Ｎｏｖａｂｌｏｔユニットで半乾燥移動によりＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）中５％ドライミルクでブロッキングした。膜をＨＳＰ−７２抗体（ＳＰＡ８１０，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ）とともにインキュベーションした。検出は，ＥＣＬウエスタンブロッティング分析システムおよびプロトコル（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ，ＮＥＮ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて，ペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）および強化化学発光（ＥＣＬ）とともにインキュベーションすることにより行った。密度測定は画像分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＨＳＰ−７２の発現差異は，内部標準に対して正規化した蛋白質／シグナル強度相関の直線範囲における特異的シグナルの比率から求め，平行実験間で比較した。
【００３４】
統計学的分析：インビトロ実験においては，処置の影響（＋／−ＰＤＦ暴露，＋／−細胞保護添加物の添加（Ｌ−グルタミン）を多因子ＡＮＯＶＡにより比較した。インビボ実験においては，グルタミン添加または添加なしのＰＤＦ暴露の影響を，マンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ ＩＶ，Ａｂａｃｕｓ，ＵＳＡ）を用いて比較した。相違はｐ＜０．０５の場合に有意とした。データは平均±Ｓ．Ｄ．で表す。
【００３５】
結果
Ｌ−グルタミンの細胞保護効果
インビトロ実験により，Ｌ−グルタミンをＰＤＦに加えた後，中皮細胞におけるＨＳＰ媒介性細胞保護が示された。
【００３６】
図１および２は，培養ヒト中皮細胞をコントロール条件で，増加する用量のＬ−グルタミンに暴露した影響を示す。２０ｍＭまでのＬ−グルタミンの添加は，生存率を変化させず，８および１０ｍＭのレベルはＨＳＰ−７２発現の増加を伴った。
【００３７】
培養ヒト中皮細胞の標準的なＰＤＦ暴露の間のＬ−グルタミンの影響を図３および４に示す。ＰＤＦにＬ−グルタミンを添加すると，生存能力が保護され，ＨＳＰ−７２発現が増加した。ＬＤＨ放出は，コントロール条件下で細胞保護剤なしのＰＤＦに暴露した間に１００±３％から２２６±２９％に増加したのに対し，Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した間に９１±７から１９０±１９％に増加した（図３）。多因子ＡＮＯＶＡは，ＰＤＦ暴露の影響およびＬ−グルタミン添加の影響は両方とも有意であることを示した（ｐ＝０．０００１およびｐ＝０．００１）。これらの影響は相互依存的であった。すなわち，Ｌ−グルタミンの（細胞保護）効果は，（細胞傷害性）ＰＤＦ暴露の間に有意に高かった（ｐ＝０．０３７）。
【００３８】
ＨＳＰ−７２発現は，コントロール条件下で細胞保護剤なしのＰＤＦに暴露した間に１００±４３％から４２３±６６１％に増加したのに対し，Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した間に２３４±２２１から１８９５±１９２８に増加した（図４）。この場合にも，多因子ＡＮＯＶＡは，ＰＤＦ暴露の影響およびＬ−グルタミン添加の影響が両方とも有意であることを示した（ｐ＝０．００３およびｐ＝０．０２３）。さらに，これらの影響は相互依存的であった。すなわち，Ｌ−グルタミンの（ＨＳＰ共誘導）効果は，ＰＤＦ暴露の間に有意に高かった（ｐ＝０．０１１）。
【００３９】
ＰＤにおける薬理学的ＨＳＰ媒介性細胞保護の生物学的役割を確認するために，ＰＤのラットモデルにおいて，Ｌ−グルタミン補充ＰＤＦによるＨＳＰ−７２発現の増強が腹膜単層からの中皮細胞剥離に及ぼす影響を調べた。図５および６に示されるように，この細胞保護ＰＤＦを使用することにより，ＨＳＰ−７２が過剰発現され，４時間ドウェルの間にインビボでＰＤＦに暴露した後，中皮細胞剥離が有意に低下した（９３±３９細胞対３８±３８細胞，ｐ＝０．０４４；図５）。Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加はまた，透析液排出物への蛋白質喪失の低下を伴っていた（７５±７ｍｇ対６５±４ｍｇ，ｐ＝０．０４５；図６）。Ｌ−グルタミン補充は，正味の限外濾過量（６．８±１．１ｍｌ対５．４±２．７ｍｌ），Ｄ／Ｐクレアチニン（０．４１４±０．０８対０．３７５±０．１１）またはＤ／Ｄｏグルコース（０．４７３±０．０２対０．４６９±０．０４）には影響を及ぼさなかった。
【００４０】
上述の例にしたがえば，ＰＤのインビトロモデルにおいては，Ｌ−グルタミンを添加することにより，ＰＤＦ暴露の間の顕著なＨＳＰ過剰発現および中皮細胞生存の改善が見られた。
【００４１】
したがって，これらのインビトロの知見は，中皮細胞におけるＨＳＰ発現と細胞の結果とを結びつけ，薬学的添加剤がＰＤＦ暴露に対するＨＳＰ媒介性細胞保護を誘導しうるという概念を明確に裏付ける。
【００４２】
この研究の最後の部において，ＰＤのラットモデルにおけるＨＳＰ発現を，ＨＳＰの共誘導剤であるＬ−グルタミンをＰＤＦに加えることにより操作した。インビトロの結果から予測されたように，Ｌ−グルタミンの補充はインビボ暴露の間に中皮細胞におけるＨＳＰ発現を増強した。ＨＳＰ媒介性細胞保護の概念と一致して，Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加によって，中皮細胞の剥離の数も低下した。腹膜中皮単層の安定化とよく一致して，処置ラットのＰＤ排出液における蛋白質含量が少ないことから示されるように，バリア機能障害の軽減が認められた。すなわち，インビボ実験により，予備加熱処理後についての先の知見は，より実現可能な薬理学的介入モデルに拡張された（９）。
【００４３】
ＨＳＰ発現の増加と，改善された結果との間の相関は，グルタミン補充後の敗血症および温熱療法の動物生存モデルについても記載されている（１７）。ＩＣＵ患者における小規模のヒト無作為化比較試験において，非経口栄養法の間にグルタミンを補充した後の血清ＨＳＰ−７０の増加とＩＣＵ滞在の長さの減少との間に有意な相関が見られた（１９）。最後に，重症疾病を有する患者は，しばしばグルタミン枯渇を起こすことが示されており，このことは，この集団におけるグルタミン補充の潜在的可能性を裏付ける（１３）。
【００４４】
Ｌ−グルタミンを遊離型で放出しうるジペプチドの細胞保護効果
細胞保護ＰＤＦの原理の証明としてグルタミンについて記載された急性回復実験設定は，ＰＤＦの初期毒性効果の最も優れた代表物である。これは主として，低いｐＨおよび乳酸のためである。代替モデル，例えば，通常の培地で１：１に希釈した未使用ＰＤＦに長期暴露するモデルは，臨床的ＰＤにおいて生ずるような，より長期のＰＤＦへの暴露の際に腹膜において生ずる細胞プロセスを評価するための，よく受け入れられているツールである。
【００４５】
コンフルエントの培養物を，１０％ＦＣＳを含むＭ１９９培地で１：１に希釈した１．５％無水デキストロースを含み，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを０．５および１０．０ｇ／Ｌ（"低用量および高用量"）の濃度で添加したまたは添加していない慣用の酸性乳酸系ＰＤＦに２４時間暴露することにより，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンが細胞保護効果を与える可能性について試験した。追加の対照培養物は，純粋な通常の培地で３７℃で同じ時間で維持した。実験の最後に，細胞生存率および蛋白質発現を平行して評価して，細胞保護性ＰＤＦを同定した。
【００４６】
インビトロ実験により，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した後の，中皮細胞におけるＨＳＰ媒介性細胞保護は，グルタミンについて示されたものと類似していることが示された。ＬＤＨ放出およびＨＳＰ−７２発現の増加により評価して，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む細胞保護ＰＤＦにより，標準的なＰＤＦ暴露と比較して，生存能力が保護された。
【００４７】
これらを合わせると，本発明にしたがう新規ＰＤＦがＨＳＰ発現および細胞の結果に及ぼす調和した影響は，ＰＤにおけるＨＳＰ媒介性細胞保護の概念を明確に支持する。特に，インビトロおよびインビボＰＤＦ暴露の際の病態生理学的ストレスに対する中皮細胞応答の最適化における，ＰＤＦへの添加剤としてのＬ−グルタミンの高い潜在能力が明らかになった。ＰＤＦにグルタミンを添加したときのこのようなＨＳＰ媒介性細胞保護は，急性ＰＤＦ暴露後の中皮細胞剥離の低下および腹膜蛋白質喪失の低下と関連しているため，これはおそらく生物学的に重要であろう。慢性腎不全を有する患者ではグルタミン代謝の乱れが生じているため，グルタミン，およびグルタミンを遊離型で放出しうるジペプチドは，ＰＤＦへの"細胞保護添加剤"として非常に魅力的な候補である（１５）。
【００４８】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は，腹膜透析液（以下，"ＰＤＦ"と称する）に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜透析液は，尿毒症患者から溶質および水を除くものである。いくつかの臨床的および実験的観察から，ＰＤＦは細胞毒性を有することが示されており，これは長期腹膜透析（ＰＤ）治療の３０％までの技術的障害のリスクに関連している（６）。したがって，長期にわたるＰＤ治療では，しばしば腹膜の一体性に重篤な慢性的障害が生ずる。ＰＤＦの生体不適合性および腹膜炎症が主要な原因であると考えられている。ＰＤＦ暴露は，腹膜細胞代謝を損ない，増殖を低下させ，細胞死を増加させ，ならびに細胞骨格組織および細胞シグナリング，例えば，分化および炎症の制御を破壊する。このことにより，異常な治癒プロセス，上皮間葉細胞分化転換，血管新生，線維症および腹膜の慢性的瘢痕化が生ずる（７）。ＰＤを受けている患者からの一連の腹膜生検標本の分析から，有害な構造的変化が明らかになった。重症の場合には，中皮細胞が剥離し，腹膜が露出され，結合組織の厚い不定形の層で覆われる。これらの形態学的変化により，半透過性透析膜としての腹膜のバリア機能が大きく破壊される。ＰＤを受けている成人患者の１／３までが，腹膜障害のため，治療の経過中に技術的障害を患うことになる（６）。
【０００３】
したがって，最近の研究は，ＰＤＦの生体適合性を高め，このことによりＰＤの間の中皮細胞障害を低減させることを目的としている。新たな改良された製剤は，いくつかのインビトロおよびインビボ実験および臨床試験において実際に毒性が低いことが示されている（７，１０）。抗酸化剤／スカベンジャーであるカルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジンジペプチド），またはグルタチオン（ガンマ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン）および関連する化合物（例えば，システインプロドラッグであるＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシレート）を添加することは，ＰＤＦの生体適合性に有益な影響を有し，ＰＤにおけるグルコース分解産物の有害な影響を受動的に低減することが示されている（２０−２２）。
【０００４】
しかし，ＰＤＦの主要な作用原理は，その高浸透圧のため，尿毒症患者から溶質および水を除去することである。したがって，ＰＤＦは，生理学的に不活性であるかまたは完全に生物適合性のある液体とはなりえず，腹腔への充填と腹腔からの排出の繰り返しは常にある程度の細胞傷害活性をもつ。
【０００５】
上述の欠点は，特に炭水化物系ＰＤＦにあてはまる。"炭水化物系"ＰＤＦとは，浸透圧剤としてのグルコースまたはグルコース−オリゴマーおよびグルコース−ポリマーに基づく腹膜透析液であることが，当業者には理解される。本発明においては，好ましくはグルコースに基づくＰＤＦが用いられ，これは典型的には１０から４５ｇ／ｌのグルコースを含む（ＥＰ１１６６７８７を参照）。炭水化物系ＰＤＦのさらに別の例は，ＷＯ８２／０３７７３Ａ１，ＵＳ４，９７６，６８３Ａ，ＷＯ０１／０２００４Ａ１，ＵＳ２００３／０２３２０９３Ａ１，ＥＰ１３６９，４３２Ａ２，ＫＲ２００１／００８６５９，ＷＯ９４／１４４６８Ａ１，ＷＯ９９／０１１４４Ａ１，ＵＳ６，０７７，８３６Ａ，ＷＯ９５／１９７７８Ａ１，ＵＳ２００５／００７４４８５Ａ１，ＥＰ０２０７６７６Ａ２およびＷＯ９３／１４７９６に開示されている。
【０００６】
最近，特にグルコース系ＰＤＦの細胞傷害活性は，細胞傷害を引き起こすのみならず，すべての細胞に見いだされる内因性の機構である中皮細胞中の熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）を活性化することが，ＰＤのインビトロ，エクスビボ，およびインビボモデルで示された（１−４，１６）。いずれの研究も，ＰＤＦの生体適合性のマーカーとしてのＨＳＰアップレギュレーションに焦点を当てているが，より最近のデータは，ＨＳＰが実験的ＰＤの間に中皮細胞を保護することを明らかにした（３，５，９）。
【０００７】
ＨＳＰの過剰発現は，ＰＤのインビトロモデルにおいて，通常は致死的であるＰＤＦ暴露からの生存を引き起こし，およびＰＤのインビボモデルにおいて中皮細胞が腹膜ライニングから剥離することを防止する（５，９）。
【０００８】
しかし，ＨＳＰの過剰発現を誘導するために用いられているプロトコル，例えば，温熱療法または過渡的トランスフェクションのいずれも，ＰＤの臨床設定では魅力的な方法ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は，これまでに知られている製品より細胞傷害活性の低い炭水化物系腹膜透析液を提供することである。特に，本発明の目的は，ＰＤＦ暴露の際の病態生理学的ストレスに対する細胞応答を積極的に最適化することにより，ＰＤ治療を受けている患者における技術的障害を抑制する炭水化物系腹膜透析液を提供することである。
【００１０】
"技術的障害"との用語は，当業者にはよく知られており，腹膜透析を打ち切り，血液透析等の代替の腎臓置換治療への切り替えを必要とすることを意味する（６）。特に，技術的障害を抑制することは，腹膜障害を予防し，バリア機能障害を軽減させ，中皮細胞剥離を防止する工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液により解決される。
【００１２】
さらに，この課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物であって，炭水化物系腹膜透析液を用いる腹膜透析治療における技術的障害を抑制する特定の用途のための化合物により解決される。
【００１３】
また，本発明の課題は，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される，技術的障害を抑制するための特定の用途のための化合物を含む炭水化物系腹膜透析液により解決される。
【００１４】
驚くべきことに，グルタミンが中皮細胞においてＨＳＰの発現を誘導することが見いだされた。さらに，グルタミン，またはグルタミンを遊離形で放出しうるジペプチド，例えばグルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンを含む炭水化物系透析液は，先に知られている製品より細胞傷害活性が低いことが見いだされた。グルタミン含有ジペプチド，例えばグルタミニル−グリシンおよびグリシニル−グルタミンの，グルタミンの前駆体としての用途もまた有益である。
【００１５】
グルタミンは無毒性であり，ＨＳＰ発現を増加させることにより細胞保護を媒介することが先に報告されている（１４，１８）。インビトロでは，薬理学的用量のグルタミンは，インドメタシンおよび他のＮＳＡＩＤについて記載されているものと同様に，ＨＳＦ−１のそのプロモーターへのＤＮＡ結合を増強する（１１，１２）。あるいは，グルタミン補充は，ストレスの多い条件下でＨＳＰ−７２ｍＲＮＡを安定化させ，このことによりＨＳＰ発現を増加させることが示されている（８）。しかし，ＰＤＦに暴露されたときに中皮細胞においてＨＳＰ発現を増強させるためにグルタミンを使用することは，これまでに提案されていない。
【００１６】
本発明にしたがえば，グルタミンは，単量体形で，および／または，グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドの形で，使用することができる。アミノ酸の哺乳動物への投与は，これをジペプチドまたはトリペプチドの形で投与すれば，より許容されることが知られている。特に，グルタミンは，水性溶液にあまり溶解せず，比較的不安定なアミノ酸であり，したがって臨床設定においては，好ましくはグルタミンおよび別のアミノ酸，好ましくはアラニンおよびグリシンから構成されるジペプチドとして用いる（２３）。Ｌ−グルタミンを成分として含むジペプチドは，例えば，ＵＳ５，１８９，０１６に開示されている。
【００１７】
かかるジペプチドは，好ましくは，アラニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，グルタミニル−グリシンおよびグリシニル−グルタミンからなる群より選択される。
【００１８】
好ましい態様においては，本発明にしたがうＰＤＦは，中皮細胞における熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の発現を増強するのに十分な量で前記化合物を含む。
【００１９】
液体中の前記化合物，特にＬ−グルタミンの濃度は，０．３ｍＭから３００ｍＭ，好ましくは２ｍＭから２５ｍＭの範囲であることができる。
【００２０】
本発明にしたがう腹膜透析液は，化合物（すなわち，単量体の形のグルタミンまたは上で定義したとおりオリゴペプチドの成分として）を炭水化物系腹膜透析液と混合する工程を含むプロセスにより製造することができる。本発明にしたがうＰＤＦを製造するために用いられる炭水化物系腹膜透析液は，現在市販されている標準的な製品であることができる。
【００２１】
好ましくは，化合物は，熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の中皮細胞における発現を増強するのに十分な量で炭水化物系腹膜透析液と混合する。
【００２２】
本発明はさらに，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物
からなる群より選択される化合物の，技術的障害を抑制するための炭水化物系腹膜透析液の製造における使用に関する。
【００２３】
すべての態様について，用いられるＰＤＦは，好ましくはグルコース系である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミン（ＧＬＮ）の暴露の影響を示す。
【図２】図１２は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミン（ＧＬＮ）の暴露の影響を示す。
【図３】図３は，培養ヒト中皮細胞のＰＤＦ暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。
【図４】図４は，培養ヒト中皮細胞のＰＤＦ暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。
【図５】図５は，腹膜透析のラットモデルにおいてＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作が中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。
【図６】図６は，腹膜透析のラットモデルにおいてＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作が中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に，本発明の好ましい態様を例示する実施例および図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００２６】
図１および２は，培養ヒト中皮細胞に対するＬ−グルタミンの暴露の影響を示す。生存率は，コントロール条件下で，増加する用量のグルタミン（ＧＬＮ）に暴露した後のＬＤＨ放出（図１）およびＨＳＰ−７２発現（図２）により評価した。Ｌ−グルタミンを２０ｍＭまで添加すると，生存率は変わらなかった。ＨＳＰ−７２発現は８および１０ｍＭのグルタミン濃度で増強された。データは３回の独立した実験の代表例である。
【００２７】
図３および４は，培養ヒト中皮細胞へのＰＤＦの暴露中のＬ−グルタミンの影響を示す。生存率は，グルタミン（ＧＬＮ）を添加または添加せずにＰＤＦに１２０分間暴露した後のＬＤＨ放出（図３）およびＨＳＰ−７２発現（図４）により評価した。データは箱（第２５および第７５），髭（第１０および第９０パーセンタイル）および中央値プロットで示される。Ｌ−グルタミンを添加すると，生存能力が有意に保護され，ＨＳＰ−７２発現が増加した。データは６回の実験から取得した。詳細な統計学は結果の節で説明する。
【００２８】
図５および６は，ＨＳＰ−７２発現の薬理学的操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）が腹膜透析のラットモデルにおける中皮細胞剥離および腹膜蛋白質喪失に及ぼす影響を示す。標準的なＰＤＦ（ＰＤＦ）またはＬ−グルタミンを添加したＰＤＦ（ＧＬＮ−ＰＤＦ）のいずれかを用いる４時間残存（ｄｗｅｌｌ）の後に，トリプシン腹膜洗浄により回収したラット中皮細胞におけるＨＳＰ−７２発現を調べた。Ｌ−グルタミンの添加によりＨＳＰ−７２発現が増強された。中皮細胞剥離（図５）および腹膜蛋白質喪失（図６）は，箱（第２５および第７５），髭（第１０および第９０パーセンタイル）および中央値プロットで示される。Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加は，有意に低い中皮細胞（ＭＣ）数および透析液流出物への蛋白質喪失の低下を伴っていた。データは，６匹のラットから，各群につき３回の独立した実験から取得した。
【実施例】
【００２９】
材料および方法
ＰＤのインビトロモデル（出典：文献５）
不死化ヒト中皮細胞（Ｍｅｔ５Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９４４４）は，１００ユニット／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを補充したＭ１９９／ＭＣＤＢ１０５培地（１：１）で培養した。培養物は７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で３７℃，５％ＣＯ２で維持し，定期的にトリプシン処理することにより継代した。培地は２〜３日ごとに交換した。平均して６−７日後にコンフルエントに達した。次に，コンフルエントの培養物を，１．５％無水デキストロース（ｐＨ５．５）を含む標準的なグルコースモノマーおよび酸性の乳酸系ＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ ２，Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に，細胞保護化合物（４〜２０ｍＭのグルタミン）を添加してまたは添加せずに，１２０分間暴露し，通常の成長培地で１６時間回復させた。対照培養物は通常の培地で３７℃で維持し，"シャム培地交換"を行った，すなわち，ＰＤＦへの暴露と平行して対照培地に暴露した。
【００３０】
細胞の生存率は，乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）分析により評価した。記載される実験設定の後に上清の５０μｌのアリコートを取り出し，４℃で保存して，４８時間以内に分析した。測定はＳｉｇｍａ ＴＯＸ−７ ＬＤＨ Ｋｉｔを用いて，製造元の指針にしたがって２回行った。ＬＤＨ排出（ｅｆｆｌｕｘ）は，各陰性対照実験において測定されたＬＤＨの値のパーセンテージとして計算した。ＨＳＰの誘導は，平行して行った培養物において，下記に説明するようにして評価した。
【００３１】
ＰＤのインビボ急性ラットモデル（出典：文献９）：
実験は，成人雄近交系スプラグドーリーラット（平均体重３１０ｇ）を用いて行った。動物を麻酔した後（１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジン，筋肉内），加熱小動物手術台に置いた。小さい腹部正中切開を通して滅菌カテーテルを腹腔内に挿入し，３５ｍｌの試験液体（４〜１０ｍＭのＬ−グルタミンを添加または添加しないＰＤＦ）を４５〜６０秒間かけてゆっくり注入した。動物を静かに動かし，少量の腹膜液体を吸引し，カテーテルを抜去し，腹部を縫合した。動物は処置から２０分以内に覚醒し，餌および水道水を自由に摂取させた。腹腔内注入の４時間後，動物を再び麻酔し，さらに別の少量の腹膜液体を吸引し，動物を心臓穿刺および放血により犠牲死させた。その後，正中切開により開腹し，腹膜内液体すべてを静かに回収した。回収した液体の容量を記録し，総細胞数および２つの時点（０および４時間）における数の相違を，ギムザ染色後に手動で，およびクールターカウンターで機械的に測定した。次に，各ラットについて，剥離した中皮細胞の総数を計算した。選択された動物においては，４時間ドウェル後，腹膜を０．１％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡを含む２０ｍＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で２０分間洗浄することにより，腹腔中の中皮細胞内膜を回収した。
【００３２】
腹膜のバリア機能を試験するために，プロトコルの最後に，透析液（Ｄ）サンプル中のクレアチニン，グルコースおよび総蛋白質，および血漿（Ｐ）中のクレアチニンを測定した。クレアチニンのＤ／Ｐ比およびグルコースのＤ／Ｄ０比を計算した。腹膜蛋白質喪失は，最終透析液濃度ｘ最終容量として計算した。すべての動物は，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより作成され，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより発行されている実験動物管理の原則にしたがって，人道的に取り扱った。
【００３３】
ＨＳＰ−７２検出および統計学：
ウエスタンブロッティング：中皮細胞回収物の蛋白質含量をブラッドフォード・アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により測定し，等量の蛋白質サンプル（５μｇ／レーン）をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩユニットを用いる標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。サイズ分画した蛋白質を，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ Ｎｏｖａｂｌｏｔユニットで半乾燥移動によりＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）中５％ドライミルクでブロッキングした。膜をＨＳＰ−７２抗体（ＳＰＡ８１０，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ）とともにインキュベーションした。検出は，ＥＣＬウエスタンブロッティング分析システムおよびプロトコル（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ，ＮＥＮ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて，ペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）および強化化学発光（ＥＣＬ）とともにインキュベーションすることにより行った。密度測定は画像分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＨＳＰ−７２の発現差異は，内部標準に対して正規化した蛋白質／シグナル強度相関の直線範囲における特異的シグナルの比率から求め，平行実験間で比較した。
【００３４】
統計学的分析：インビトロ実験においては，処置の影響（＋／−ＰＤＦ暴露，＋／−細胞保護添加物の添加（Ｌ−グルタミン）を多因子ＡＮＯＶＡにより比較した。インビボ実験においては，グルタミン添加または添加なしのＰＤＦ暴露の影響を，マンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ ＩＶ，Ａｂａｃｕｓ，ＵＳＡ）を用いて比較した。相違はｐ＜０．０５の場合に有意とした。データは平均±Ｓ．Ｄ．で表す。
【００３５】
結果
Ｌ−グルタミンの細胞保護効果
インビトロ実験により，Ｌ−グルタミンをＰＤＦに加えた後，中皮細胞におけるＨＳＰ媒介性細胞保護が示された。
【００３６】
図１および２は，培養ヒト中皮細胞をコントロール条件で，増加する用量のＬ−グルタミンに暴露した影響を示す。２０ｍＭまでのＬ−グルタミンの添加は，生存率を変化させず，８および１０ｍＭのレベルはＨＳＰ−７２発現の増加を伴った。
【００３７】
培養ヒト中皮細胞の標準的なＰＤＦ暴露の間のＬ−グルタミンの影響を図３および４に示す。ＰＤＦにＬ−グルタミンを添加すると，生存能力が保護され，ＨＳＰ−７２発現が増加した。ＬＤＨ放出は，コントロール条件下で細胞保護剤なしのＰＤＦに暴露した間に１００±３％から２２６±２９％に増加したのに対し，Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した間に９１±７から１９０±１９％に増加した（図３）。多因子ＡＮＯＶＡは，ＰＤＦ暴露の影響およびＬ−グルタミン添加の影響は両方とも有意であることを示した（ｐ＝０．０００１およびｐ＝０．００１）。これらの影響は相互依存的であった。すなわち，Ｌ−グルタミンの（細胞保護）効果は，（細胞傷害性）ＰＤＦ暴露の間に有意に高かった（ｐ＝０．０３７）。
【００３８】
ＨＳＰ−７２発現は，コントロール条件下で細胞保護剤なしのＰＤＦに暴露した間に１００±４３％から４２３±６６１％に増加したのに対し，Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した間に２３４±２２１から１８９５±１９２８に増加した（図４）。この場合にも，多因子ＡＮＯＶＡは，ＰＤＦ暴露の影響およびＬ−グルタミン添加の影響が両方とも有意であることを示した（ｐ＝０．００３およびｐ＝０．０２３）。さらに，これらの影響は相互依存的であった。すなわち，Ｌ−グルタミンの（ＨＳＰ共誘導）効果は，ＰＤＦ暴露の間に有意に高かった（ｐ＝０．０１１）。
【００３９】
ＰＤにおける薬理学的ＨＳＰ媒介性細胞保護の生物学的役割を確認するために，ＰＤのラットモデルにおいて，Ｌ−グルタミン補充ＰＤＦによるＨＳＰ−７２発現の増強が腹膜単層からの中皮細胞剥離に及ぼす影響を調べた。図５および６に示されるように，この細胞保護ＰＤＦを使用することにより，ＨＳＰ−７２が過剰発現され，４時間ドウェルの間にインビボでＰＤＦに暴露した後，中皮細胞剥離が有意に低下した（９３±３９細胞対３８±３８細胞，ｐ＝０．０４４；図５）。Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加はまた，透析液排出物への蛋白質喪失の低下を伴っていた（７５±７ｍｇ対６５±４ｍｇ，ｐ＝０．０４５；図６）。Ｌ−グルタミン補充は，正味の限外濾過量（６．８±１．１ｍｌ対５．４±２．７ｍｌ），Ｄ／Ｐクレアチニン（０．４１４±０．０８対０．３７５±０．１１）またはＤ／Ｄｏグルコース（０．４７３±０．０２対０．４６９±０．０４）には影響を及ぼさなかった。
【００４０】
上述の例にしたがえば，ＰＤのインビトロモデルにおいては，Ｌ−グルタミンを添加することにより，ＰＤＦ暴露の間の顕著なＨＳＰ過剰発現および中皮細胞生存の改善が見られた。
【００４１】
したがって，これらのインビトロの知見は，中皮細胞におけるＨＳＰ発現と細胞の結果とを結びつけ，薬学的添加剤がＰＤＦ暴露に対するＨＳＰ媒介性細胞保護を誘導しうるという概念を明確に裏付ける。
【００４２】
この研究の最後の部において，ＰＤのラットモデルにおけるＨＳＰ発現を，ＨＳＰの共誘導剤であるＬ−グルタミンをＰＤＦに加えることにより操作した。インビトロの結果から予測されたように，Ｌ−グルタミンの補充はインビボ暴露の間に中皮細胞におけるＨＳＰ発現を増強した。ＨＳＰ媒介性細胞保護の概念と一致して，Ｌ−グルタミンのＰＤＦへの添加によって，中皮細胞の剥離の数も低下した。腹膜中皮単層の安定化とよく一致して，処置ラットのＰＤ排出液における蛋白質含量が少ないことから示されるように，バリア機能障害の軽減が認められた。すなわち，インビボ実験により，予備加熱処理後についての先の知見は，より実現可能な薬理学的介入モデルに拡張された（９）。
【００４３】
ＨＳＰ発現の増加と，改善された結果との間の相関は，グルタミン補充後の敗血症および温熱療法の動物生存モデルについても記載されている（１７）。ＩＣＵ患者における小規模のヒト無作為化比較試験において，非経口栄養法の間にグルタミンを補充した後の血清ＨＳＰ−７０の増加とＩＣＵ滞在の長さの減少との間に有意な相関が見られた（１９）。最後に，重症疾病を有する患者は，しばしばグルタミン枯渇を起こすことが示されており，このことは，この集団におけるグルタミン補充の潜在的可能性を裏付ける（１３）。
【００４４】
Ｌ−グルタミンを遊離型で放出しうるジペプチドの細胞保護効果
細胞保護ＰＤＦの原理の証明としてグルタミンについて記載された急性回復実験設定は，ＰＤＦの初期毒性効果の最も優れた代表物である。これは主として，低いｐＨおよび乳酸のためである。代替モデル，例えば，通常の培地で１：１に希釈した未使用ＰＤＦに長期暴露するモデルは，臨床的ＰＤにおいて生ずるような，より長期のＰＤＦへの暴露の際に腹膜において生ずる細胞プロセスを評価するための，よく受け入れられているツールである。
【００４５】
コンフルエントの培養物を，１０％ＦＣＳを含むＭ１９９培地で１：１に希釈した１．５％無水デキストロースを含み，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを０．５および１０．０ｇ／Ｌ（"低用量および高用量"）の濃度で添加したまたは添加していない慣用の酸性乳酸系ＰＤＦに２４時間暴露することにより，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンが細胞保護効果を与える可能性について試験した。追加の対照培養物は，純粋な通常の培地で３７℃で同じ時間で維持した。実験の最後に，細胞生存率および蛋白質発現を平行して評価して，細胞保護性ＰＤＦを同定した。
【００４６】
インビトロ実験により，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを添加したＰＤＦに暴露した後の，中皮細胞におけるＨＳＰ媒介性細胞保護は，グルタミンについて示されたものと類似していることが示された。ＬＤＨ放出およびＨＳＰ−７２発現の増加により評価して，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む細胞保護ＰＤＦにより，標準的なＰＤＦ暴露と比較して，生存能力が保護された。
【００４７】
これらを合わせると，本発明にしたがう新規ＰＤＦがＨＳＰ発現および細胞の結果に及ぼす調和した影響は，ＰＤにおけるＨＳＰ媒介性細胞保護の概念を明確に支持する。特に，インビトロおよびインビボＰＤＦ暴露の際の病態生理学的ストレスに対する中皮細胞応答の最適化における，ＰＤＦへの添加剤としてのＬ−グルタミンの高い潜在能力が明らかになった。ＰＤＦにグルタミンを添加したときのこのようなＨＳＰ媒介性細胞保護は，急性ＰＤＦ暴露後の中皮細胞剥離の低下および腹膜蛋白質喪失の低下と関連しているため，これはおそらく生物学的に重要であろう。慢性腎不全を有する患者ではグルタミン代謝の乱れが生じているため，グルタミン，およびグルタミンを遊離型で放出しうるジペプチドは，ＰＤＦへの"細胞保護添加剤"として非常に魅力的な候補である（１５）。
【００４８】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物を含む，炭水化物系腹膜透析液。
【請求項２】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物であって，
炭水化物系腹膜透析液を用いる腹膜透析治療における技術的障害を抑制する特定の用途のための化合物。
【請求項３】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，
および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液であって，
技術的障害を抑制する特定の用途のための炭水化物系腹膜透析液。
【請求項４】
前記オリゴペプチドは，アラニル−グルタミンおよびグルタミニル−アラニンからなる群より選択される，請求項１−３のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項５】
液体中の前記化合物の濃度は０．３ｍＭから３００ｍＭ，好ましくは２ｍＭから２５ｍＭである，請求項１−４のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項６】
前記透析液はグルコース系である，請求項１−５のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項７】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，アラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物の，技術的障害を抑制するための炭水化物系腹膜透析液の製造における使用。
【請求項１】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物を含む，炭水化物系腹膜透析液。
【請求項２】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物であって，
炭水化物系腹膜透析液を用いる腹膜透析治療における技術的障害を抑制する特定の用途のための化合物。
【請求項３】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニンおよびアラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，
および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物を含む炭水化物系腹膜透析液であって，
技術的障害を抑制する特定の用途のための炭水化物系腹膜透析液。
【請求項４】
前記オリゴペプチドは，アラニル−グルタミンおよびグルタミニル−アラニンからなる群より選択される，請求項１−３のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項５】
液体中の前記化合物の濃度は０．３ｍＭから３００ｍＭ，好ましくは２ｍＭから２５ｍＭである，請求項１−４のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項６】
前記透析液はグルコース系である，請求項１−５のいずれかに記載の腹膜透析液および／または化合物。
【請求項７】
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミン，
−グルタミン，好ましくはＬ−グルタミンを遊離形で放出しうるジペプチドであって，好ましくはグルタミニル−グリシン，グリシニル−グルタミン，グルタミニル−アラニン，アラニル−グルタミンからなる群より選択されるジペプチド，
−２から７個のグルタミン，好ましくはＬ−グルタミン残基から構成されるオリゴペプチド，および
−これらの混合物，
からなる群より選択される化合物の，技術的障害を抑制するための炭水化物系腹膜透析液の製造における使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２０１５５（Ｐ２０１０−５２０１５５Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１０７７（Ｐ２００９−５５１０７７）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００８／００００７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０６７０２
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９２４２０１５）シュトプロテック ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００８／００００７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０６７０２
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９２４２０１５）シュトプロテック ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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