グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物
本発明は、グルテンフリーの焼き製品の酵母添加のための乳酸菌の混合物に関する。詳細には、本発明は、セリアック病患者摂食のために設計された、官能特性及び栄養特性が改善されたグルテンフリーのパンを製造するための酵母添加剤としての、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物に関する。詳細には、本発明は、セリアック病患者によって用いられるグルテンフリーのパンの製造のための「酵母添加剤」としての、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の使用に関する。選択された乳酸菌及び提案された製造プロトコールを用いることによって、グルテンフリーの、醸造用酵母又は化学的酵母添加を用いて得られたパンと比較して、感覚受容性の栄養的特性及び貯蔵能力特性の改善が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
グルテン不耐性又はセリアック病は流行し続けている。欧州及び米国の集団に関する最近の調査によれば、１／１００個体という発生率が報告されている（Ｒｅｖｅｒｓ、２００５年、セリアック病の疫学：セリアック病の有病率、発生率及び進行はどのようなものであるのか？（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ：ｗｈａｔ ａｒｅ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ、ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ、ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ？）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２８：４７〜５１頁）。現在の知識によれば、この食物不耐性に対する唯一の有効な治療的療法は、生涯すべての間、厳しく維持される、グルテンを完全に欠く（グルテンフリーの）食事である（Ｈａｍｅｒ、２００５年、セリアック病：背景及び生化学的側面（Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖａｎｃ ２３：４０１〜４０８頁）。厳しい食事療法計画（ゼロトレランス）を受けたセリアック病患者は、多くの場合、正常な形態のビラス（ｖｉｌｌａｓ）及び腸の陰窩を回復する（Ｈａｍｅｒ、２００５年、セリアック病：背景及び生化学的側面（Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖａｎｃ ２３：４０１〜４０８頁）。
【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）及び食糧農業機関（ＦＡＯ）によって採用される標準コーデックスに報告されるように、グルテンフリーの食品は以下に従って規定されている：（ｉ）もともと含有しないコムギ成分（トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属のすべての種）、スペルト、カムート、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はそれらの交雑品種から調製されており、グルテン濃度が２０ｐｐｍより低い、（ｉｉ）コムギ、スペルト、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はそれらの交雑品種から抽出された成分を用いて調製されており、グルテンフリーになっており、グルテン濃度が２００ｐｐｍより高くない、及び（ｉｉｉ）項目（ｉ）及び（ｉｉ）の成分の混合物から調製されており、グルテン濃度が２００ｐｐｍよりも高くない。多種多様なグルテンフリーの製品が市販されている：パン、ピザ、ビスケット及びパスタ（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。一般に、グルテンフリーのパンの、官能特性及びレオロジー特性の点での品質は、コムギ粉又はライムギから調製されたパンよりも低い（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。グルテン、したがって、難置換性の構造特性がないこと、及び非従来成分に適合させた製造プロトコールの適用が、主に低い品質を決定する（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。最も最近の文献報告には、レオロジー特性及び貯蔵能力特性を改善するために実施された種々の研究が示されている。特に、異なって生じるデンプンを用いること（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００２年、グルテンフリーのパンにおける新規コメデンプン（Ｎｏｖｅｌ ｒｉｃｅｓ ｓｔａｒｃｈｅｓ ｉｎ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄ．）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．２４〜２６頁；Ｄｅｍｉａｔｅら、２０００年、ＦＴＩＲ分光法による修飾キャッサバデンプンの製パン挙動とデンプン化学構造の間の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｋｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｓｓａｖａ ｓｔａｒｃｈｅｓ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ ＦＴＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．）Ｃａｒｂｏｈｙｄ Ｐｏｌｙｍ ４２：１４９〜１５８頁）、ゴム及びその他の親水コロイド（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カラギーナン、キサンタン）（Ｋａｎｇら、１９９７年、Ｋｏｒ Ｊｏｕｒ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２９：７００〜７０４頁；Ｓｃｈｗａｒｚｌａｆｆら、１９９６年、パン中の中力粉の部分代替物としてのグアーガム及びローカストビーンガム：客観的評価及び官能評価（Ｇｕａｒ ａｎｄ ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍｓ ａｓ ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｐｌａｃｅｒｓ ｏｆ ａｌｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｆｌｏｕｒ ｉｎ ｂｒｅａｄ：ａｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．）Ｊ Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌ １９：２１７〜２２９頁）、ダイズタンパク質（Ｒａｎｈｏｒｔａら、１９７５年、ダイズ強化されたグルテンフリーのパンの調製及び強化（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙ−ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄ．）Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ ４０：６２〜６４頁）及び粉乳及び米（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００３年、改変雰囲気において保存されたグルテンフリーのパンの、ローフ及びクラム特徴に対する、また保存期間（中期及び長期）に対する乳製品及び粉末添加の効果（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄａｉｒｙ ａｎｄ ｐｏｗｄｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏａｆ ａｎｄ ｃｒｕｍｂ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、ａｎｄ ｏｎ ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ （ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ） ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄｓ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ．）Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１８：４４〜４８頁）が報告されており、これらは、種々の配合において、グルテンフリーの製品の構造及び保存期間の改善に寄与し得る。セリアック病患者は、正常な食事計画を受けている個体と比較して、繊維、ミネラル及びその他の栄養素の低い吸収にさらされている（Ｇｒｅｈｎら、２００１年、グルテンフリーの食事によって１０年間治療されたスウェーデン人の成人セリアック病患者の食生活（Ｄｉｅｔａｒｙ ｈａｂｉｔｓ ｏｆ Ｓｗｅｄｉｓｈ ａｄｕｌｔ ｃｅｌｉａｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｔｏ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ ｆｏｒ １０ ｙｅａｒｓ．） Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｎｕｔｒ ４５：１７８〜１８２頁；Ｍａｒｉａｎｉら、１９９８年、グルテンフリーの食事：セリアック病の青年期の若者に対する栄養上の危険因子（Ｔｈｅ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ：ａ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）Ｊ Ｐｅｄｉａｒｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔ ２７：５１９〜５２３頁）ということが実証されているので、グルテンフリーの製品に種々の起源の繊維（例えば、イヌリン）を豊富にすることも、種々の研究グループによって考慮されている（Ｇｉｂｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、１９９５年、ヒト結腸微生物群の食事療法による調節：プロバイオティクスという概念の導入（Ｄｉｅｔａｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ： ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ．）Ｊ Ｎｕｔ １２５：１４０１〜１４１２頁；Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｒｋｅｒ、２００２年、キノア、擬似穀物及びあまり一般的でない穀物、コムギ特性及び利用の可能性（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ ｌｅｓｓ ｃｏｍｍｏｎ ｃｅｒｅａｌｓ、ｗｈｅａｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）９３〜１２２頁；Ｔｏｓｉら、１９９６年、セリアック病のためのビスケットの製造における全粒アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）粉の利用（Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ａｍａｒａｎｔｈｕｓ（Ａｍａｒａｎｔｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ） ｆｌｏｕｒ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｉｓｃｕｉｔｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃｓ．）Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉａ ３４：４９〜５１頁）。グルテンフリーの製品についての技術は、主に、酵母添加化学物質又は醸造用酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の使用に基づいている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。現在の知識によれば、特に、グルテンフリーの、パン及び焼き製品の製造のためのスターターに関する特許出願ＷＯ０２０６５８４２（前記スターターはファーメンタム菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に基づいている）が知られている。さらに、一研究が知られており（Ｋａｔｉｎａら、２００５年、より健康な穀物製品のためのサワー種の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈｉｅｒ ｃｅｒｅａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １６：１０４〜１１２頁におけるアーレントの公開されていないデータ）、これには、風味及び芳香を高め、保存期間を延長するための、米、ダイズ、サラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）及びキサンタンをベースとするグルテンフリーのパン製造のための、生物学的及び天然酵母添加剤としての「天然酵母」の使用が記載されている。得られた結果から、「天然酵母」の使用が、グルテンフリーの製品においても技術的に可能であり、特に、貯蔵能力及び風味が、醸造用酵母又は化学的酵母添加を用いて得られた同様の製品と比較して改善されるということが実証された。酵母添加される焼き製品の技術では、「天然酵母」、生物質を起源とする乳酸菌及び酵母のカクテルが用いられることが多い。過去１０年で種々の研究が行われ（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、２００５年、サワー種乳酸菌の細菌生化学及び生理学（Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １６：５７〜６９頁）、天然酵母の乳酸菌によってもたらされる酸性化プロセス及びペプチダーゼ活性は、焼成された酵母添加された製品の風味、レオロジー特性、栄養特性及び貯蔵能力特性を改善するのに適しているということが実証された。最近の研究（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００２年、サワー種乳酸菌によるタンパク質分解：ヒト穀物不耐性に関与しているコムギ粉タンパク質画分及びグリアジンペプチドに対する効果（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａｄｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅａｌ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８：６２３〜６３３頁；Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００４年、コムギ及び非毒性粉から製造され、選択された乳酸桿菌を用いて開始されたサワー種パンは、セリアック病において耐容性を示す（Ａ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｂｒｅａｄ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｆｌｏｕｒｓ ａｎｄ ｓｔａｒｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｉｓ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：１０８８〜１０９６頁；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら、２００５年、ＶＳＬ．＃３プロバイオティック調製物は、セリアック病の原因であるグリアジンポリペプチドを加水分解する能力を有する（ＶＳＬ＃３ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｈｙｄｒｏｌｙｓｅ ｇｌｉａｄｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ １７６２：８０〜９３頁）によって、「天然酵母」の乳酸菌が、そのタンパク質分解活性について選択される場合には、セリアック病変の原因であるグルテン画分を著しく分解できるということが実証された。これに関連して、北欧
において市販の製品に対して実施されたいくつかの研究（Ｓｔｏｒｓｒｕｄら、２００３年、オートムギ製品及び天然にグルテンを含まない製品におけるグルテン混入（Ｇｌｕｔｅｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｏａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔｅｎ）Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１７：２８１〜４８５頁）によって、注目すべきパーセンテージ（約３０％）のグルテンフリーの製品が、微量のグルテン（１００〜３００ｐｐｍ）によって汚染されている可能性があり、これはこの不耐性を受けている個体にとって危険の可能性となり得るということが実証された。
【０００４】
報告された文献及び上記のデータに基づいて、いくつかの問題がグルテンフリー製品の品質に関してより重要であると思われる：（ｉ）従来製品からあまりにも異なっているので官能的品質を改善すること；（ｉｉ）セリアック病患者の吸収欠乏を減じるために栄養価を高めること；（ｉｉｉ）屋外又は変換過程の間に起きる可能性のあるグルテンの混入の危険を減じること；（ｉｖ）貯蔵能力を延長すること。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、上記を考慮して、既知のものの不利点を示さない焼き製品の調製のための材料及び方法を提供する必要があることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の著者は、ここで、選択された乳酸菌の混合物からなる「天然酵母」を発見し、風味及び栄養特性を増強するために適した製造プロトコールを提供し、これは、グルテンフリーのパンの品質に関する優先問題を解決するのに適したよく考えられた技術機器であり得る。本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属し、中央及び南イタリアの代表的なパンの製造のための「天然酵母」からこれまでに単離されている。選択は、タンパク質分解、酸性化、フィターゼ活性に基づいて、より一般的には、最適官能特性を決定する能力に基づいて単離された５５種のパンの間で実施した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５）を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及び（ＤＳＭ１８４２９）種に属する株から放出されたアルブミン及びグロブリンポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。各株は、加水分解プロフィールを代表するものである。Ｓｔ、標準；Ａ／Ｇ、非加水分解タンパク質。
【図３】それぞれ、Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ、Ｆｏｒ−ｐ−ＮＡ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ及びＦｏｒ−Ｇｌｙ合成基質に対する、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株のＮ型アミノペプチダーゼ活性（ａ）、プロリンイミノペプチダーゼ（ｂ）、ジペプチダーゼ（ｃ）、トリペプチダーゼ（ｄ）、プロリダーゼ（ｅ）及びプロリナーゼ（ｆ）を示す図である。酵素活性は、ジ及びトリペプチダーゼ活性について、１μｍｏｌ／分のｐ−ニトロアニリド又は１μｍｏｌ／分のアミノ酸を放出するのに必要な酵素量である活性単位（ｕ）として表されている。
【図４】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株を用いて３０℃で７時間発酵された捏ね物のΔｐＨ（初期及び最終ｐＨ値の間の差）（ａ）及びμｍａｘ（酸性化の最大速度）（ｂ）を示す図である。
【図５】選択された乳酸菌の配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物のΔｐＨ（初期及び最終ｐＨ値の間の差）（ａ）及びμｍａｘ（酸性化の最大速度）（ｂ）を示す図である。
【図６】選択された乳酸菌の配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物の総遊離アミノ酸の濃度を示す図である。
【図７】選択された乳酸菌のｎ．２配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物の、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０によって測定された、遊離アミノ酸プロフィールを示す図である。
【図８】選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の使用によるグルテンフリーのパンの製造プロトコールを示す図である。この図では、量的及び質的な意味で４種の混合物への言及が純粋に示されており、二次発酵では、先に明記されるように、その他の成分の添加が考慮される。
【図９】醸造用酵母によって発酵した対照（Ｃ）と比較した、新鮮な「天然酵母」（ｎ．１、２、４及び５配合）を用いて得られたグルテンフリーのパンの官能分析から得られたデータの主成分（ＰＣＡ）の分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の乳酸菌は、２００６年７月１１日にＤＳＭＺ認定コレクションセンター（ＤＳＭＺ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｅ）に寄託されており、以下の対応に従って、細菌毎に以下の寄託番号が割り当てられた：
ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４０＝ＤＳＭ１８４２６
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ） ＬＳ４１＝ＤＳＭ１８４２７
ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）ＬＲ１５＝ＤＳＭ１８４２８
ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）Ｃｉ３５＝ＤＳＭ１８４２９
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＦ１＝ＤＳＭ１８４３０
ラクトバチルス・カルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）１Ｈｄ＝ＤＳＭ１８４３１
ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）２ＸＡ３＝ＤＳＭ１８４３２
【０００９】
しかし、ＤＳＭＺに発送した後に、この機関に、実際には、ラクトバチルス・カルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）１Ｈｄ及びラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）２ＸＡ３の正確な名称は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）１Ｈｄ及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）２ＸＡ３であることが伝えられた。
【００１０】
したがって、本開示内容の継続では、本発明の細菌、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４０、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４１、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）ＬＲ１５、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）Ｃｉ３５、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＦ１、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）１Ｈｄ、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）２ＸＡ３は、以下、それぞれ、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）と命名される。
【００１１】
特に、「天然酵母」の形で用いられる以下の混合物は、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）が選択された。図１には、ＬｐｉｇＦ／ＬｉＰＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得られた、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列が示されている。
（ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧ／ＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴ、それぞれ、配列番号１及び配列番号２）。
【００１２】
グルテンフリー成分からなる捏ね物中での８〜２４時間の天然酵母の増殖とその連続使用とを含む「天然酵母」の増殖プロトコールは、天然スターター又は短時間酵母添加（約１〜３時間）とその後のパン焼成用の成分と同様の所望の特性に従って種々のパーセンテージで、標準化され、最適化されている。
【００１３】
本発明の「天然酵母」を用いる発酵方法によって、（ｉ）グルテンフリー成分における混入として生じるグルテンのグルテン解毒（約３００ｐｐｍ）の可能性が可能となり、（ｉｉ）酵母添加剤としての醸造用酵母の使用と比較した、用量及び使用種類に応じて、遊離アミノ酸の濃度を３〜１０倍増大し、したがって、パンの栄養価を改善し、（ｉｉｉ）酵母添加剤として醸造用酵母を用いるよりも約１０倍高いフィターゼ活性を特徴とし、したがって、原子吸光分光分析法を用いてＣａ２＋及びＺｎ２＋に関して実証されるように、パンミネラル塩の生物学的利用率を高め、（ｉｖ）酵母添加剤としての醸造用酵母の使用と比較した官能特性の改善を可能にし、従来のパンに特有の風味及び芳香を付与し、（ｖ）化学的保存物質の使用を避けながら、より良好なパンの保存期間を決定する。さらに、本発明の株混合物は、先行技術において用いられたＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を用いて得られたものよりも、かなり高いペプチダーゼ型活性及び酸性化力を示す。本発明の混合物の酵素活性は、アミノ酸のより多い放出に有利に働き、したがって、その栄養上の利用率を高める；焼成プロセスの間に生じる、より多量の揮発性化合物の前駆体を遊離させ、パンに特有の芳香の原因となり；グルテンフリー製品汚染のような、あり得るグルテンの痕跡の解毒に寄与するという栄養上の利点を有する。
【００１４】
乳酸菌ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）を、上記の混合物と比較して、主に官能の観点で異なっている種々の配合において使用できる。
【００１５】
したがって、本発明の具体的な目的は、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）からなる群から選択される少なくとも２種、好ましくは、少なくとも３種の乳酸菌株を含む、又はからなるグルテンフリーの粉の酵母添加のための乳酸菌株の混合物である。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、種又は株間で等比の、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）又はＬ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）を含む、又はからなる以下の混合物を使用できる。
【００１７】
本発明の微生物混合物は、例えば、トウモロコシ、米、サラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）、タピオカデンプン、ヒマワリ、リネン、テフ、サトウモロコシ、キノア、ジャガイモ、キャッサバ、アマランサス及び雑穀由来の粉のようなグルテンフリーの粉の酵母添加のために用いることができる。
【００１８】
上記で定義される株混合物を用いる、グルテンフリーの焼き製品のスターター又は同様のグルテンフリーの焼き製品を調製するための２つの発酵プロセスにおいて使用されるグルテンフリーの粉組成物が、本発明のさらなる目的を構成し、前記粉組成物は、トウモロコシデンプン１０〜３０％、好ましくは１２％、タピオカデンプン２〜１０％、好ましくは４％、米粉２０〜６０％、好ましくは３２％、サラセンホウィート粉１〜１０％、好ましくは６％を含み、又はからなり、前記パーセンテージは、粉組成物総重量の重量％として表される。グルテンフリーの焼き製品の調製のために使用される混合物には、製品の種類に応じて、種々のパーセンテージ（０．５〜３．０％）で用いられる、グアーガム、キサンタン、グリセリン、イヌリン、ソルビトール、ダイズタンパク質加水分解物、ダイズレシチン、オリーブオイル、ヒマワリ油、糖、塩、乳清及びスキムミルク粉末のようなその他の成分が加えられる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、以下のステップを含む、グルテンフリーの焼き製品のための、イーストスターター（実験の項では、本発明の「天然酵母」とも呼ばれる）の調製方法を指す：
ａ）前記で定義される乳酸菌株混合物を培養増殖させるステップと、
ｂ）５０〜６５％濃度の前記で定義される粉組成物を、約１０８ｕｆｃ／ｇの細胞密度を有するステップａ）において定義される菌株混合物を含有する３５〜５０％の水と混合するステップと、
ｃ）２０〜３０℃で８〜２４時間発酵させるステップ。
【００２０】
さらに、本方法は、ｄ）ステップｃ）において得られたスターターを乾燥又は凍結させるステップをさらに含み得る。
【００２１】
さらに、本発明は、以下のステップを含む、グルテンフリーの焼き製品の調製方法に関する：
ａ）４０〜６０％、好ましくは４４％のパーセンテージの前記で定義される粉組成物と、醸造用酵母１〜３％を含有する水１０〜３０％、好ましくは２６％と、塩０．１〜１．２％と、５〜３０％、好ましくは３０％の量の前記の方法に従って得ることができる新鮮なスターター種菌（パーセンテージが３０％より低い場合は、粉及び水の量を比例的に増大させる）、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージであるステップと、
ｂ）３０℃で約１〜３時間発酵させるステップと、
ｃ）２２０℃で５０分間調理するステップ。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記で定義される方法を用いて得ることができるスターター混合物である。さらに、本発明は、例えば、パンのような、前記で定義される方法を用いて得ることができる焼き製品に関する。
【００２３】
以下、本発明を、その好ましい実施形態に従って、制限ではなく例示として記載し、特に同封の図面を参照する：
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
本発明の株の選択及び分析
「天然酵母」からこれまでに単離された、Ｃｏｌｌｅｚｉｏｎｅ ｄｉ Ｃｏｌｔｕｒｅ ｄｅｌ Ｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ ｄｉ Ｐｒｏｔｅｚｉｏｎｅ ｄｅｌｌｅ Ｐｉａｎｔｅ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ Ａｐｐｌｉｃａｔａ ｄｅｌｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ ｄｅｇｌｉ Ｓｔｕｄｉ ｄｉ Ｂａｒｉに属する５５種の乳酸菌の株を、通常成分に加えて、５％マルトース及び１０％のイースト水を含有する改変ＭＲＳ（ｍＭＲＳ）−最終ｐＨ５．６において３０℃で２４時間増殖させた。表１には、「天然酵母」から単離され、本発明において使用されている乳酸菌種の一覧。
表１
【表１】
【００２５】
本発明の好ましい乳酸菌Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）は、図１に示されるように配列決定によって特徴付けられている。
【００２６】
（１）タンパク質分解活性
タンパク質分解活性に基づいた選択を、２４時間培養し、遠心分離（１０，０００ｇ×１０分、４℃）によって回収し、リン酸バッファー５０ｍＭ、ｐＨ７．０で２回洗浄し、同バッファーで、１０８ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度に対応する、２．５光学密度（Ａ６２０ｎｍ）に再懸濁した細胞を用いて実施した。プロテイナーゼ活性は、小麦粉から抽出されたアルブミン及びグロブリンに対して試験した（Ｗｅｉｓｓら、１９９３年、パン屋喘息に関与する種々の栽培品種に由来するコムギ粒アレルゲンの電気泳動による特徴付け（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｇｒａｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂａｋｅｒ’ｓ ａｓｔｈｍａ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４：８０５〜８１６頁）。０．９ｍｌのアルブミン−グロブリン画分（約４ｍｇ／１ｍｌのタンパク質）と、０．１ｍｌの細胞懸濁液を含有する反応混合物を、撹拌下（１５０ｒｐｍ）、３０℃で４８時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ一次元電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉシステムに従って実施した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、バクテリオファージＴ４の頭部の組み立ての間の構造タンパク質の切断（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４）、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０〜６８５頁）。Ｎ型アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）及びプロリンイミノペプチダーゼ（ＰｅｐＩ）活性を、合成基質、それぞれ、Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ及びＦｏｒ−ｐ−ＮＡを用いて調べた。反応混合物は、合成基質が溶解している（最終濃度２ｍＭ）、０．９ｍｌのＫ−リン酸バッファー５０ｍＭ、ｐＨ７．０と、１００μλの細胞懸濁液とを含んでいた。１μｍｏｌ／分のｐ−ニトロアニリドを放出するのに必要な酵素量に対応する、活性単位（Ｕ）として表される酵素活性（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、１９９６年、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＣＢ１のタンパク質分解系：プロテイナーゼ、ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの精製及び特徴付け（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＣＢ１：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ａｎｄ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｚｓｅ．）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３２２０〜３２２６頁）。プロリダーゼ（ＰｅｐＱ）及びプロリナーゼ（ＰｅｐＲ）は、Ｄｉ Ｃａｇｎｏ及び共同研究者（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００４年、コムギ及び非毒性粉及び選択された乳酸菌を含むスターターから製造されたサワー種パンは、セリアック病患者において耐容性を示す（Ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｂｒｅａｄ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｎｏｎｔｏｘｉｃ ｆｌｏｕｒｓ ａｎｄ ｓｔａｒｔｅｒ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｉｓ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：１０８８〜１０９６頁）によって記載されるように、それぞれＶａｌ−Ｐｒｏ及びＦｏｒ−Ｇｌｙに対して調べた。ジペプチダーゼ（ＰｅｐＶ）及びトリペプチダーゼ（ＰｅｐＴ）は、それぞれ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕを用い、Ｃｄ−ニニドリン（Ｃｄ−ｎｉｎｉｄｒｉｎｅ）法（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、１９９９年、二次応答曲面法によるチーズ関連乳酸菌のタンパク質分解及び脂肪分解活性に対する温度、ｐＨ、ＮａＣｌ及びａｗの作用についての研究（Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ＮａＣｌ，ａｎｄ ａｗ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｅｅｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２５：７９５〜８０９頁）に従って調べた。活性単位（Ｕ）は、１μｍｏｌのアミノ酸／分を放出するのに必要な酵素量として定義した。
【００２７】
（２）酸性化力
酸性化力に基づく選択は、１５、１５、６５及び５重量％のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉のような６２．５１ｇの粉混合物と、最終細胞密度１０８ｕｆｃ／ｇの捏ね物の単一の乳酸菌の細胞懸濁液を含有する３７．５ｍｌの水とを用いる１００ｇの捏ね物（捏ね物収量１６０）で実施した。捏ね物の酸性化動態は、オンラインでｐＨを測定して検出した（ｐＨメーター５０７、Ｃｒｉｓｏｎ、Ｉｔａｌｙ）。データは、Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇと共同研究者によって改変されたＧｏｍｐｅｒｔｚ方程式を用いてモデル化した（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０年、細菌増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ．）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１８７５〜１８８１頁）。
【００２８】
（３）グルテン解毒
グルテン解毒試験は、１５、１５、６５及び５％のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉のような６２．５１ｇの粉混合物と、最終細胞密度１０８ｕｆｃ／ｇの捏ね物の、より高いタンパク質分解活性のために選択された乳酸菌（ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、（ＤＳＭ１８４２７）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、（ＤＳＭ１８４２８）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１））の細胞懸濁液を含有する３７．５ｍｌの水とを用いる１００ｇの捏ね物（捏ね物収量１６０）で実施した。捏ね物に５００又は１０００ｐｐｍというグルテン量を加えた。それぞれ、５００及び１０００ｐｐｍのグルテンと、０．１５ｇのＮａＮ３（ｐ／ｐ）を含有する２種の対照捏ね物を、細菌種菌を用いずに製造し、ｐＨ３．６に化学的に酸性化した。捏ね物は、３０℃で５、２４及び４８時間インキュベートした。発酵の最後に、グルテン定量のためにＥＬＩＳＡ試験を用いた（Ｔｒａｎｓｉａ Ｐｌａｔｅ、Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）。
【００２９】
（４）発酵させた捏ね物の特徴付け
選択された乳酸菌を、ネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉からなる粉混合物をベースとする捏ね物の製造に用いられる５種の異なる配合に用いた（表２）。
表２
【表２】
【００３０】
先に示されたように製造された捏ね物を、３０℃で２４時間インキュベートした。醸造用酵母（１．５％）を用いて、３０℃で２時間発酵させた細菌種菌を用いない捏ね物を対照として用いた。種々の配合を用いて発酵させた捏ね物及び対応する対照の特徴付けは、以下を含んでいた：（ｉ）酸性化動態（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０年、細菌増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１８７５〜１８８１頁）；（ｉｉ）酵素キット（ＤＨＦＦ ＣＨＡＭＢ Ｉｔａｌｙ Ｓｒｉ、Ｉｔａｌｙ）による、発酵の間に生成した有機酸（Ｄ−及びＬ−乳酸及び酢酸）の測定；（ｉｉｉ）ｍＭＲＳアガーでのプレート計数による細胞密度（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、（ｉｖ）Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａｒｏｗ（Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａｒｏｗ、１９２５年、リンの比色定量（Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：６６：３７５頁）並びにＳｈｉｍｉｚｕ（Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９２年、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｎａｔｔｏ）ｎ−７７由来のフィターゼの精製及び特徴付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｎａｔｔｏ）ｎ−７７．）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１２６６〜１２６９頁）によって記載された方法を用いる、放出された無機オルトホスフェートの検出によるフィターゼ活性；及び（ｖ）陽イオン交換カラム（Ｎａ Ｏｘｉｄｉｓｅｄ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ、２０ｃｍ×４．６ｍｍ）を用いる、「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０」（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）による総アミノ酸含量の測定。
【００３１】
（５）グルテンフリーのパンの製造
選択した「天然酵母」の種々の配合を、種々の技術的な解決策を考慮する、グルテンフリーのパンの製造に用いた。２４時間発酵させた後、（ｉ）前記で報告された成分からなる５〜３０％ベース捏ね物で播種することによる新鮮な天然スターター又は予備乾燥の場合には、同様の（ｉｉ）成分（１５％）として用いた。この捏ね物に醸造用酵母（１％）及びＮａＣｌ（０．３％）を加え、３０℃で２時間インキュベートし、その後、実験室オーブンで焼成した（２２０℃で５０分）。対照パン対照は、醸造用酵母（２％）を用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物を用いて製造した。以下の測定は、製造されたパンで実施した：（ｉ）水抽出と、原子吸光分光分析法によるその後の測定による生物学的に利用可能な無機養素含量の分析；（ｉｉ）６人の訓練を受けていない試験者によって（Ｈａｇｌｕｎｄら、１９９８年、生態学的に栽培された、及び伝統的な方法で栽培されたコムギから得た全粒パンの官能評価（Ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅｍｅａｌ ｂｒｅａｄ ｆｒｏｍ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ ｇｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ．）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．２７：１９９〜２０７頁）、各特性について、０〜１００の値範囲の漸増する強度の連続的尺度を用いて実施されたパネル試験による官能分析；（ｉｉｉ）ＡＡＣＣ１０−１０及びＡＡＣＣ７４−０９公定法に従う比容積及び硬度の分析（Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｘ版、ＡＡＣＣ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ−Ｕ．Ｓ．Ａ．編）；及び（ｉｖ）工業規模でのパン製造、改変雰囲気（４０％Ｎ２及び６０％ＣＯ２）における包装及び保存性化合物の不在下での６カ月間の継続保存による保存期間試験。
【００３２】
結果
（１）プロテイナーゼ活性
不均一加水分解プロフィールが証明される、基質としてアルブミン及びグロブリンを用いて測定されるプロテイナーゼ活性。図２では、より顕著なプロテイナーゼ活性を代表するＬ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及び（ＤＳＭ１８４２９）のプロフィールが報告されている。グルテンフリーの食品の製造に用いられる内因性粉酵素のものに対して補完的であり得るこのような酵素活性は、タンパク質分解過程の初期段階を構成する。ペプチダーゼ活性は、比較的特異的な合成基質でアッセイした。図３では、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株に関する結果が報告されている。トリペプチダーゼ型活性を除く、すべての考慮される酵素活性について、株（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）が、その他の株よりも著しく高い活性を有することを観察することができる。同じ基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。スクリーニングのためにＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを利用できること及び多数のアッセイされる酵素活性が、通常は得られない選択された株を得るための前提をなす。プロテイナーゼ及びペプチダーゼ活性に基づいて、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＰ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）が選択された。特に、選択された種及び株のペプチダーゼ型活性の、初期スクリーニングに用いた２種のラクトバチル・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株との比較は、すべての試験した基質についてより高いペプチダーゼ活性（平均で４０〜８０％）を常に指し示した。それに基づいて選択が実施された酵素活性は、（ｉ）アミノ酸のより多い放出に有利に働き、したがって、栄養上の利用率を高め；（ｉｉ）焼成プロセスの間に生じたより多量の揮発性化合物前駆体を放出し、典型的なパンの芳香の原因となり；（ｉｉｉ）グルテンフリー製品の混入のような、あり得るグルテンの痕跡の解毒に寄与する多様な価値を有し得る。
【００３３】
（２）酸性化力
乳酸菌単離物の酸性化力は、単一の微生物を用いて３０℃で７時間発酵させた酸性捏ね物で直接調べた。図４には、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株に関する結果が報告されている。（ＤＳＭ１８４２６）株、特に、（ＤＳＭ１８４２７）はまた、ΔｐＨ及びμｍａｘを用いて表される、良好な酸性化力も特徴とするということを観察することができる。同一の基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。２．３より高いΔｐＨ値を特徴とする酸性化力に基づいて、特に、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）が選択された。すべての選択された種又は株が、スクリーニングにおいて考慮された２種のＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株について求められたものより高い酸性化力及び速度を示した。
【００３４】
（３）グルテン解毒
最初に、タンパク質分解活性に基づいて選択されたプール乳酸菌 （Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＰ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２））を、混入をシミュレートするためにグルテンフリーの捏ね物に意図的に加えた５００又は１０００ｐｐｍのグルテンの解毒に用いた。捏ね物を４８時間インキュベートした後、両グルテン濃度の存在において約４０％の減少が観察された。より短いインキュベーション時間、すなわち、２４時間も、同様の解毒パーセンテージを示したが、５時間のインキュベーションはグルテン濃度の実質的な減少を可能にしなかった。組み合わせた、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）は、より多数の単離物からなるプールと同様のグルテンの加水分解活性を示した。同じ組合せの乳酸菌が、グルテンフリー出発材料の妥当な混入値である約３００ｐｐｍの初期グルテン濃度を、２０ｐｐｍという閾値で低下させるのに適していた。グルテンに対する同様の活性によって、発酵プロセスの間のグルテン生物学的混入除去を含むグルテンフリー成分のより高い安全使用が可能となり得る。
【００３５】
（４）発酵させた捏ね物の特徴付け
表２には、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の配合が報告されている。各配合を、捏ね物の３０℃で１２時間の発酵に用いた。醸造用酵母のみを用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物を、対照として用いた。すべての製造された捏ね物は、１２時間発酵させた後に、常に、２．４より高いΔｐＨ値（捏ね物の最終ｐＨ約３．４）に達し（図４）、このことは、すべての配合について、顕著な酸性化を引き起こす能力を示す。特に、ｎ．５の組合せ（Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９））を用いて得られた捏ね物は、約２．６に匹敵する最大のΔｐＨ値を示したのに対し、ｎ．３の組合せ（Ｐ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８））は、約２．４５に匹敵する最低のΔｐＨ値を示した。最大酸性化速度（μｍａｘ）の点では、ｎ．３、４（Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９））並びに５の組合せを用いて得られた捏ね物は、約１．３時間−１に匹敵する最高のΔｐＨ値を示した。必ずしも最大の酸性化力が常に良好なパン構造及び／又は芳香とともにあるわけではないが、特に、グルテンフリーの粉を用いる場合には、酸性化力は、酵母添加された製品の感覚受容性特性を改善するために考慮されるパラメータの１つに相当する。対照捏ね物を除く、すべての捏ね物において、有機酸の存在が検出され、特に、変動は以下のとおりであった：２１〜８２ｍＭのＬ−乳酸、５１〜７５ｍＭのＤ−乳酸及び１０〜３０ｍＭの酢酸（表３は、選択された乳酸菌の配合を用いて３０℃で１２時間発酵させた捏ね物の、Ｌ−及びＤ−乳酸、酢酸の濃度及び発酵指数を示す）。
表３
【表３】
ａ 醸造用酵母を用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物
ｂ ｎｄ、測定せず
ｃ 発酵指数、乳酸と酢酸間のモル比
【００３６】
３種の酸の検出される濃度及び乳酸と酢酸の比は、組合せ中に存在する乳酸菌の代謝プロフィールを反映する。有機酸比は、ｎ．３の組合せを用いて得られた捏ね物を除いて、酸性捏ね物中に通常見られるものに相当している（４：１に匹敵）。有機酸の濃度は、乳酸菌に起因し得る最終製品への芳香の点での寄与に関する有用な情報を提供し得る。一般に、発酵指数を規定する乳酸と酢酸のモル比の値は、より良好な寄与を提供するには極めて低い値の傾向でなければならない。ｎ．３の組合せを除く、すべての製造された捏ね物は、最適発酵指数を示した。１２時間の発酵後に製造された捏ね物の細胞密度は、９．１〜９．４７ｌｏｇ１０ ｕｆｃ／ｇの捏ね物である。天然酵母の使用が、パンにおけるミネラルの生物学的利用率のような栄養上の観点から与え得る寄与を推定するために、報告される５種の組合せを用いて得られた捏ね物をフィターゼ活性について特徴付けた。表４には、選択された乳酸菌の配合を用いて３０℃で１２時間発酵させた捏ね物のフィターゼ活性の値が報告されており、７００ｎｍでの吸光度として表されている。
表４
【表４】
ａ対照１：１％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
ｂ対照２：０．５％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
ｃ対照３：０．２５％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
【００３７】
１の配合を除いて、その他のすべて（特に、２及び４の組合せ）が、対照捏ね物においてよりも約３０倍高いフィターゼ活性の値を示した。図５には、遊離アミノ酸の総濃度が報告されており、「天然酵母」の５種の配合について、７２６．５４〜２４１５．９７ｍｇ／ｋｇの捏ね物である。醸造用酵母を用いて発酵させた対照捏ね物の濃度は、４２０．０７（ｍｇ／ｋｇ）であった。２の配合を用いた長時間（２４時間）の発酵は、１２時間のインキュベーション後に得られた遊離アミノ酸の濃度の倍増をもたらし、このことは、「天然酵母」によって発酵されたパンの栄養価及び消化率を高める可能性を示す。ｎ．２の組合せを用いて得られた捏ね物のアミノ酸プロフィールは、Ａｒｇ（１７８．３８ｍｇ／ｋｇ）、Ｌｅｕ（１３４．０９ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｌｕ（８２．４５ｍｇ／ｋｇ）及びＰｒｏ（８７．３０ｍｇ／ｋｇ）アミノ酸の生成について顕著である（図６）。
【００３８】
（５）グルテンフリーのパンの製造
選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を、図８に報告されるバイオテクノロジープロトコールに従って、グルテンフリーのパンの製造に用いた。２種の提案される代替物は、異なる技術的な解決策に対応するものである。さらなる発酵プロセス（３０℃で２時間）のためのスターターとしての新鮮な「天然酵母」の使用は、従来技術を表すが、高価ではなく、毎日の「天然酵母の補給」を必要とする。「天然酵母」の使用自体の変法として、より長期の保存及び再活性化後の連続使用を可能にするためのその凍結があり得る。「天然酵母」の乾燥及び成分としてのその直接使用は、最終発酵期間（３０℃で２時間）において活性ではないものの、容易な保存を可能にする。酵母添加剤としての醸造用酵母の使用に関しては、３０％の新鮮な「天然酵母」の使用によって、発酵プロセスの間に約１０〜３０倍高いフィターゼ活性が得られることが可能となり、生物学的に利用可能なＣａ２＋及びＺｎ２＋の含量の、それぞれ約２１及び４８％の増大をもたらし、遊離アミノ酸の含量が約１０倍増大する。所望の特性によって変わる「天然酵母」の使用パーセンテージに基づいて、前記のすべての官能的なもの、前記で報告された増大は、変動を起こしやすい。また、再活性化後の凍結「天然酵母」の使用は、新鮮なものの同様の性能を示す。選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を用いて得られたすべてのパンは、醸造用酵母のみを用いて製造された対照パンと比較して、比容積及び硬度の同様の又はわずかに良好な値を特徴とする。製造されたパンを官能分析に付した。評価した官能パラメータは、弾性、色、芳香酸、酸味、甘味、乾燥度及び芳香とした。どのパラメータも、０〜１００の範囲の値で漸増強度評価に従って評価した。各パンの官能プロフィールの定性的評価のために、得られたデータを、主成分（ＰＣＡ）の統計分析によって処理した。図９に報告される２種の主成分は、サンプル全分散の７３％を説明した。水平軸（因子１）は、全官能評価の関数としてのパンの類型の分布を示し、縦軸（因子２）は、各々考慮される官能パラメータの関数としてのパンの分布を表す。２種の主成分から規定される図でのパン分布から明らかなように（図９ａ）、新鮮な「天然酵母」を用いて製造されたパンの類型は、全く同様の官能結果を示したということが推定される。図９ｂからは、芳香、風味及び色の官能上特有の、高く評価される特性は、「天然酵母」を用いて製造されたパンが存在する図の部分において分布しているということが明確に明らかであり、このことから、芳香及び風味の点での「天然酵母」の役割及び寄与が確認される。最終的に、工業規模で製造され、改変雰囲気（４０％Ｎ２及び６０％ＣＯ２）において包装され、６カ月間の保存に付された、２の配合を用いて製造されたパン。全保存期間の間、保存性化合物（例えば、プロピオン酸Ｃａ）の添加のない、微生物汚染現象（白カビの生えた、「粘り気のある」パン）は観察されなかった。
【受託番号】
【００３９】
ＤＳＭ１８４２６
ＤＳＭ１８４２７
ＤＳＭ１８４２８
ＤＳＭ１８４２９
ＤＳＭ１８４３０
ＤＳＭ１８４３１
ＤＳＭ１８４３２
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１
＜２２３＞増幅プライマーＬｐｉｇＦ
配列番号２
＜２２３＞増幅プライマーＬｉＰＲ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物に関する。詳細には、本発明は、セリアック病患者によって用いられるグルテンフリーのパンの製造のための「酵母添加剤」としての、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の使用に関する。選択された乳酸菌及び提案された製造プロトコールを用いることによって、グルテンフリーの、醸造用酵母又は化学的酵母添加を用いて得られたパンと比較して、感覚受容性の栄養的特性及び貯蔵能力特性の改善が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
グルテン不耐性又はセリアック病は流行し続けている。欧州及び米国の集団に関する最近の調査によれば、１／１００個体という発生率が報告されている（Ｒｅｖｅｒｓ、２００５年、セリアック病の疫学：セリアック病の有病率、発生率及び進行はどのようなものであるのか？（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ：ｗｈａｔ ａｒｅ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ、ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ、ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ？）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２８：４７〜５１頁）。現在の知識によれば、この食物不耐性に対する唯一の有効な治療的療法は、生涯すべての間、厳しく維持される、グルテンを完全に欠く（グルテンフリーの）食事である（Ｈａｍｅｒ、２００５年、セリアック病：背景及び生化学的側面（Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖａｎｃ ２３：４０１〜４０８頁）。厳しい食事療法計画（ゼロトレランス）を受けたセリアック病患者は、多くの場合、正常な形態のビラス（ｖｉｌｌａｓ）及び腸の陰窩を回復する（Ｈａｍｅｒ、２００５年、セリアック病：背景及び生化学的側面（Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖａｎｃ ２３：４０１〜４０８頁）。
【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）及び食糧農業機関（ＦＡＯ）によって採用される標準コーデックスに報告されるように、グルテンフリーの食品は以下に従って規定されている：（ｉ）もともと含有しないコムギ成分（トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属のすべての種）、スペルト、カムート、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はそれらの交雑品種から調製されており、グルテン濃度が２０ｐｐｍより低い、（ｉｉ）コムギ、スペルト、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はそれらの交雑品種から抽出された成分を用いて調製されており、グルテンフリーになっており、グルテン濃度が２００ｐｐｍより高くない、及び（ｉｉｉ）項目（ｉ）及び（ｉｉ）の成分の混合物から調製されており、グルテン濃度が２００ｐｐｍよりも高くない。多種多様なグルテンフリーの製品が市販されている：パン、ピザ、ビスケット及びパスタ（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。一般に、グルテンフリーのパンの、官能特性及びレオロジー特性の点での品質は、コムギ粉又はライムギから調製されたパンよりも低い（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。グルテン、したがって、難置換性の構造特性がないこと、及び非従来成分に適合させた製造プロトコールの適用が、主に低い品質を決定する（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。最も最近の文献報告には、レオロジー特性及び貯蔵能力特性を改善するために実施された種々の研究が示されている。特に、異なって生じるデンプンを用いること（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００２年、グルテンフリーのパンにおける新規コメデンプン（Ｎｏｖｅｌ ｒｉｃｅｓ ｓｔａｒｃｈｅｓ ｉｎ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄ．）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．２４〜２６頁；Ｄｅｍｉａｔｅら、２０００年、ＦＴＩＲ分光法による修飾キャッサバデンプンの製パン挙動とデンプン化学構造の間の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｋｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｓｓａｖａ ｓｔａｒｃｈｅｓ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ ＦＴＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．）Ｃａｒｂｏｈｙｄ Ｐｏｌｙｍ ４２：１４９〜１５８頁）、ゴム及びその他の親水コロイド（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カラギーナン、キサンタン）（Ｋａｎｇら、１９９７年、Ｋｏｒ Ｊｏｕｒ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２９：７００〜７０４頁；Ｓｃｈｗａｒｚｌａｆｆら、１９９６年、パン中の中力粉の部分代替物としてのグアーガム及びローカストビーンガム：客観的評価及び官能評価（Ｇｕａｒ ａｎｄ ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍｓ ａｓ ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｐｌａｃｅｒｓ ｏｆ ａｌｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｆｌｏｕｒ ｉｎ ｂｒｅａｄ：ａｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．）Ｊ Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌ １９：２１７〜２２９頁）、ダイズタンパク質（Ｒａｎｈｏｒｔａら、１９７５年、ダイズ強化されたグルテンフリーのパンの調製及び強化（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙ−ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄ．）Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ ４０：６２〜６４頁）及び粉乳及び米（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００３年、改変雰囲気において保存されたグルテンフリーのパンの、ローフ及びクラム特徴に対する、また保存期間（中期及び長期）に対する乳製品及び粉末添加の効果（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄａｉｒｙ ａｎｄ ｐｏｗｄｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏａｆ ａｎｄ ｃｒｕｍｂ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、ａｎｄ ｏｎ ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ （ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ） ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｂｒｅａｄｓ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ．）Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１８：４４〜４８頁）が報告されており、これらは、種々の配合において、グルテンフリーの製品の構造及び保存期間の改善に寄与し得る。セリアック病患者は、正常な食事計画を受けている個体と比較して、繊維、ミネラル及びその他の栄養素の低い吸収にさらされている（Ｇｒｅｈｎら、２００１年、グルテンフリーの食事によって１０年間治療されたスウェーデン人の成人セリアック病患者の食生活（Ｄｉｅｔａｒｙ ｈａｂｉｔｓ ｏｆ Ｓｗｅｄｉｓｈ ａｄｕｌｔ ｃｅｌｉａｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｔｏ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ ｆｏｒ １０ ｙｅａｒｓ．） Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｎｕｔｒ ４５：１７８〜１８２頁；Ｍａｒｉａｎｉら、１９９８年、グルテンフリーの食事：セリアック病の青年期の若者に対する栄養上の危険因子（Ｔｈｅ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ：ａ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）Ｊ Ｐｅｄｉａｒｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔ ２７：５１９〜５２３頁）ということが実証されているので、グルテンフリーの製品に種々の起源の繊維（例えば、イヌリン）を豊富にすることも、種々の研究グループによって考慮されている（Ｇｉｂｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、１９９５年、ヒト結腸微生物群の食事療法による調節：プロバイオティクスという概念の導入（Ｄｉｅｔａｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ： ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ．）Ｊ Ｎｕｔ １２５：１４０１〜１４１２頁；Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｒｋｅｒ、２００２年、キノア、擬似穀物及びあまり一般的でない穀物、コムギ特性及び利用の可能性（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ ｌｅｓｓ ｃｏｍｍｏｎ ｃｅｒｅａｌｓ、ｗｈｅａｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）９３〜１２２頁；Ｔｏｓｉら、１９９６年、セリアック病のためのビスケットの製造における全粒アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）粉の利用（Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ａｍａｒａｎｔｈｕｓ（Ａｍａｒａｎｔｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ） ｆｌｏｕｒ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｉｓｃｕｉｔｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃｓ．）Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉａ ３４：４９〜５１頁）。グルテンフリーの製品についての技術は、主に、酵母添加化学物質又は醸造用酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の使用に基づいている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００４年、グルテンフリーの穀物ベースの製品の配合における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ−ｆｒｅｅ ｃｅｒｅａｌ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｋｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １５：１４３〜１５２頁）。現在の知識によれば、特に、グルテンフリーの、パン及び焼き製品の製造のためのスターターに関する特許出願ＷＯ０２０６５８４２（前記スターターはファーメンタム菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に基づいている）が知られている。さらに、一研究が知られており（Ｋａｔｉｎａら、２００５年、より健康な穀物製品のためのサワー種の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈｉｅｒ ｃｅｒｅａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １６：１０４〜１１２頁におけるアーレントの公開されていないデータ）、これには、風味及び芳香を高め、保存期間を延長するための、米、ダイズ、サラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）及びキサンタンをベースとするグルテンフリーのパン製造のための、生物学的及び天然酵母添加剤としての「天然酵母」の使用が記載されている。得られた結果から、「天然酵母」の使用が、グルテンフリーの製品においても技術的に可能であり、特に、貯蔵能力及び風味が、醸造用酵母又は化学的酵母添加を用いて得られた同様の製品と比較して改善されるということが実証された。酵母添加される焼き製品の技術では、「天然酵母」、生物質を起源とする乳酸菌及び酵母のカクテルが用いられることが多い。過去１０年で種々の研究が行われ（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、２００５年、サワー種乳酸菌の細菌生化学及び生理学（Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ １６：５７〜６９頁）、天然酵母の乳酸菌によってもたらされる酸性化プロセス及びペプチダーゼ活性は、焼成された酵母添加された製品の風味、レオロジー特性、栄養特性及び貯蔵能力特性を改善するのに適しているということが実証された。最近の研究（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００２年、サワー種乳酸菌によるタンパク質分解：ヒト穀物不耐性に関与しているコムギ粉タンパク質画分及びグリアジンペプチドに対する効果（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａｄｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅａｌ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８：６２３〜６３３頁；Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００４年、コムギ及び非毒性粉から製造され、選択された乳酸桿菌を用いて開始されたサワー種パンは、セリアック病において耐容性を示す（Ａ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｂｒｅａｄ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｆｌｏｕｒｓ ａｎｄ ｓｔａｒｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｉｓ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：１０８８〜１０９６頁；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら、２００５年、ＶＳＬ．＃３プロバイオティック調製物は、セリアック病の原因であるグリアジンポリペプチドを加水分解する能力を有する（ＶＳＬ＃３ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｈｙｄｒｏｌｙｓｅ ｇｌｉａｄｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ １７６２：８０〜９３頁）によって、「天然酵母」の乳酸菌が、そのタンパク質分解活性について選択される場合には、セリアック病変の原因であるグルテン画分を著しく分解できるということが実証された。これに関連して、北欧
において市販の製品に対して実施されたいくつかの研究（Ｓｔｏｒｓｒｕｄら、２００３年、オートムギ製品及び天然にグルテンを含まない製品におけるグルテン混入（Ｇｌｕｔｅｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｏａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔｅｎ）Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１７：２８１〜４８５頁）によって、注目すべきパーセンテージ（約３０％）のグルテンフリーの製品が、微量のグルテン（１００〜３００ｐｐｍ）によって汚染されている可能性があり、これはこの不耐性を受けている個体にとって危険の可能性となり得るということが実証された。
【０００４】
報告された文献及び上記のデータに基づいて、いくつかの問題がグルテンフリー製品の品質に関してより重要であると思われる：（ｉ）従来製品からあまりにも異なっているので官能的品質を改善すること；（ｉｉ）セリアック病患者の吸収欠乏を減じるために栄養価を高めること；（ｉｉｉ）屋外又は変換過程の間に起きる可能性のあるグルテンの混入の危険を減じること；（ｉｖ）貯蔵能力を延長すること。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、上記を考慮して、既知のものの不利点を示さない焼き製品の調製のための材料及び方法を提供する必要があることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の著者は、ここで、選択された乳酸菌の混合物からなる「天然酵母」を発見し、風味及び栄養特性を増強するために適した製造プロトコールを提供し、これは、グルテンフリーのパンの品質に関する優先問題を解決するのに適したよく考えられた技術機器であり得る。本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属し、中央及び南イタリアの代表的なパンの製造のための「天然酵母」からこれまでに単離されている。選択は、タンパク質分解、酸性化、フィターゼ活性に基づいて、より一般的には、最適官能特性を決定する能力に基づいて単離された５５種のパンの間で実施した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５）を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及び（ＤＳＭ１８４２９）種に属する株から放出されたアルブミン及びグロブリンポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。各株は、加水分解プロフィールを代表するものである。Ｓｔ、標準；Ａ／Ｇ、非加水分解タンパク質。
【図３】それぞれ、Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ、Ｆｏｒ−ｐ−ＮＡ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ及びＦｏｒ−Ｇｌｙ合成基質に対する、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株のＮ型アミノペプチダーゼ活性（ａ）、プロリンイミノペプチダーゼ（ｂ）、ジペプチダーゼ（ｃ）、トリペプチダーゼ（ｄ）、プロリダーゼ（ｅ）及びプロリナーゼ（ｆ）を示す図である。酵素活性は、ジ及びトリペプチダーゼ活性について、１μｍｏｌ／分のｐ−ニトロアニリド又は１μｍｏｌ／分のアミノ酸を放出するのに必要な酵素量である活性単位（ｕ）として表されている。
【図４】ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株を用いて３０℃で７時間発酵された捏ね物のΔｐＨ（初期及び最終ｐＨ値の間の差）（ａ）及びμｍａｘ（酸性化の最大速度）（ｂ）を示す図である。
【図５】選択された乳酸菌の配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物のΔｐＨ（初期及び最終ｐＨ値の間の差）（ａ）及びμｍａｘ（酸性化の最大速度）（ｂ）を示す図である。
【図６】選択された乳酸菌の配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物の総遊離アミノ酸の濃度を示す図である。
【図７】選択された乳酸菌のｎ．２配合を用いて、３０℃で１２時間発酵された捏ね物の、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０によって測定された、遊離アミノ酸プロフィールを示す図である。
【図８】選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の使用によるグルテンフリーのパンの製造プロトコールを示す図である。この図では、量的及び質的な意味で４種の混合物への言及が純粋に示されており、二次発酵では、先に明記されるように、その他の成分の添加が考慮される。
【図９】醸造用酵母によって発酵した対照（Ｃ）と比較した、新鮮な「天然酵母」（ｎ．１、２、４及び５配合）を用いて得られたグルテンフリーのパンの官能分析から得られたデータの主成分（ＰＣＡ）の分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の乳酸菌は、２００６年７月１１日にＤＳＭＺ認定コレクションセンター（ＤＳＭＺ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｅ）に寄託されており、以下の対応に従って、細菌毎に以下の寄託番号が割り当てられた：
ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４０＝ＤＳＭ１８４２６
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ） ＬＳ４１＝ＤＳＭ１８４２７
ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）ＬＲ１５＝ＤＳＭ１８４２８
ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）Ｃｉ３５＝ＤＳＭ１８４２９
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＦ１＝ＤＳＭ１８４３０
ラクトバチルス・カルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）１Ｈｄ＝ＤＳＭ１８４３１
ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）２ＸＡ３＝ＤＳＭ１８４３２
【０００９】
しかし、ＤＳＭＺに発送した後に、この機関に、実際には、ラクトバチルス・カルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）１Ｈｄ及びラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）２ＸＡ３の正確な名称は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）１Ｈｄ及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）２ＸＡ３であることが伝えられた。
【００１０】
したがって、本開示内容の継続では、本発明の細菌、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４０、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＬＳ４１、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）ＬＲ１５、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）Ｃｉ３５、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＦ１、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）１Ｈｄ、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）２ＸＡ３は、以下、それぞれ、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）と命名される。
【００１１】
特に、「天然酵母」の形で用いられる以下の混合物は、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）が選択された。図１には、ＬｐｉｇＦ／ＬｉＰＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得られた、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列が示されている。
（ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧ／ＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴ、それぞれ、配列番号１及び配列番号２）。
【００１２】
グルテンフリー成分からなる捏ね物中での８〜２４時間の天然酵母の増殖とその連続使用とを含む「天然酵母」の増殖プロトコールは、天然スターター又は短時間酵母添加（約１〜３時間）とその後のパン焼成用の成分と同様の所望の特性に従って種々のパーセンテージで、標準化され、最適化されている。
【００１３】
本発明の「天然酵母」を用いる発酵方法によって、（ｉ）グルテンフリー成分における混入として生じるグルテンのグルテン解毒（約３００ｐｐｍ）の可能性が可能となり、（ｉｉ）酵母添加剤としての醸造用酵母の使用と比較した、用量及び使用種類に応じて、遊離アミノ酸の濃度を３〜１０倍増大し、したがって、パンの栄養価を改善し、（ｉｉｉ）酵母添加剤として醸造用酵母を用いるよりも約１０倍高いフィターゼ活性を特徴とし、したがって、原子吸光分光分析法を用いてＣａ２＋及びＺｎ２＋に関して実証されるように、パンミネラル塩の生物学的利用率を高め、（ｉｖ）酵母添加剤としての醸造用酵母の使用と比較した官能特性の改善を可能にし、従来のパンに特有の風味及び芳香を付与し、（ｖ）化学的保存物質の使用を避けながら、より良好なパンの保存期間を決定する。さらに、本発明の株混合物は、先行技術において用いられたＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を用いて得られたものよりも、かなり高いペプチダーゼ型活性及び酸性化力を示す。本発明の混合物の酵素活性は、アミノ酸のより多い放出に有利に働き、したがって、その栄養上の利用率を高める；焼成プロセスの間に生じる、より多量の揮発性化合物の前駆体を遊離させ、パンに特有の芳香の原因となり；グルテンフリー製品汚染のような、あり得るグルテンの痕跡の解毒に寄与するという栄養上の利点を有する。
【００１４】
乳酸菌ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）を、上記の混合物と比較して、主に官能の観点で異なっている種々の配合において使用できる。
【００１５】
したがって、本発明の具体的な目的は、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）からなる群から選択される少なくとも２種、好ましくは、少なくとも３種の乳酸菌株を含む、又はからなるグルテンフリーの粉の酵母添加のための乳酸菌株の混合物である。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、種又は株間で等比の、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）又はＬ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）を含む、又はからなる以下の混合物を使用できる。
【００１７】
本発明の微生物混合物は、例えば、トウモロコシ、米、サラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）、タピオカデンプン、ヒマワリ、リネン、テフ、サトウモロコシ、キノア、ジャガイモ、キャッサバ、アマランサス及び雑穀由来の粉のようなグルテンフリーの粉の酵母添加のために用いることができる。
【００１８】
上記で定義される株混合物を用いる、グルテンフリーの焼き製品のスターター又は同様のグルテンフリーの焼き製品を調製するための２つの発酵プロセスにおいて使用されるグルテンフリーの粉組成物が、本発明のさらなる目的を構成し、前記粉組成物は、トウモロコシデンプン１０〜３０％、好ましくは１２％、タピオカデンプン２〜１０％、好ましくは４％、米粉２０〜６０％、好ましくは３２％、サラセンホウィート粉１〜１０％、好ましくは６％を含み、又はからなり、前記パーセンテージは、粉組成物総重量の重量％として表される。グルテンフリーの焼き製品の調製のために使用される混合物には、製品の種類に応じて、種々のパーセンテージ（０．５〜３．０％）で用いられる、グアーガム、キサンタン、グリセリン、イヌリン、ソルビトール、ダイズタンパク質加水分解物、ダイズレシチン、オリーブオイル、ヒマワリ油、糖、塩、乳清及びスキムミルク粉末のようなその他の成分が加えられる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、以下のステップを含む、グルテンフリーの焼き製品のための、イーストスターター（実験の項では、本発明の「天然酵母」とも呼ばれる）の調製方法を指す：
ａ）前記で定義される乳酸菌株混合物を培養増殖させるステップと、
ｂ）５０〜６５％濃度の前記で定義される粉組成物を、約１０８ｕｆｃ／ｇの細胞密度を有するステップａ）において定義される菌株混合物を含有する３５〜５０％の水と混合するステップと、
ｃ）２０〜３０℃で８〜２４時間発酵させるステップ。
【００２０】
さらに、本方法は、ｄ）ステップｃ）において得られたスターターを乾燥又は凍結させるステップをさらに含み得る。
【００２１】
さらに、本発明は、以下のステップを含む、グルテンフリーの焼き製品の調製方法に関する：
ａ）４０〜６０％、好ましくは４４％のパーセンテージの前記で定義される粉組成物と、醸造用酵母１〜３％を含有する水１０〜３０％、好ましくは２６％と、塩０．１〜１．２％と、５〜３０％、好ましくは３０％の量の前記の方法に従って得ることができる新鮮なスターター種菌（パーセンテージが３０％より低い場合は、粉及び水の量を比例的に増大させる）、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージであるステップと、
ｂ）３０℃で約１〜３時間発酵させるステップと、
ｃ）２２０℃で５０分間調理するステップ。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記で定義される方法を用いて得ることができるスターター混合物である。さらに、本発明は、例えば、パンのような、前記で定義される方法を用いて得ることができる焼き製品に関する。
【００２３】
以下、本発明を、その好ましい実施形態に従って、制限ではなく例示として記載し、特に同封の図面を参照する：
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
本発明の株の選択及び分析
「天然酵母」からこれまでに単離された、Ｃｏｌｌｅｚｉｏｎｅ ｄｉ Ｃｏｌｔｕｒｅ ｄｅｌ Ｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ ｄｉ Ｐｒｏｔｅｚｉｏｎｅ ｄｅｌｌｅ Ｐｉａｎｔｅ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ Ａｐｐｌｉｃａｔａ ｄｅｌｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ ｄｅｇｌｉ Ｓｔｕｄｉ ｄｉ Ｂａｒｉに属する５５種の乳酸菌の株を、通常成分に加えて、５％マルトース及び１０％のイースト水を含有する改変ＭＲＳ（ｍＭＲＳ）−最終ｐＨ５．６において３０℃で２４時間増殖させた。表１には、「天然酵母」から単離され、本発明において使用されている乳酸菌種の一覧。
表１
【表１】
【００２５】
本発明の好ましい乳酸菌Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）は、図１に示されるように配列決定によって特徴付けられている。
【００２６】
（１）タンパク質分解活性
タンパク質分解活性に基づいた選択を、２４時間培養し、遠心分離（１０，０００ｇ×１０分、４℃）によって回収し、リン酸バッファー５０ｍＭ、ｐＨ７．０で２回洗浄し、同バッファーで、１０８ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度に対応する、２．５光学密度（Ａ６２０ｎｍ）に再懸濁した細胞を用いて実施した。プロテイナーゼ活性は、小麦粉から抽出されたアルブミン及びグロブリンに対して試験した（Ｗｅｉｓｓら、１９９３年、パン屋喘息に関与する種々の栽培品種に由来するコムギ粒アレルゲンの電気泳動による特徴付け（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｇｒａｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂａｋｅｒ’ｓ ａｓｔｈｍａ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４：８０５〜８１６頁）。０．９ｍｌのアルブミン−グロブリン画分（約４ｍｇ／１ｍｌのタンパク質）と、０．１ｍｌの細胞懸濁液を含有する反応混合物を、撹拌下（１５０ｒｐｍ）、３０℃で４８時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ一次元電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉシステムに従って実施した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、バクテリオファージＴ４の頭部の組み立ての間の構造タンパク質の切断（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４）、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０〜６８５頁）。Ｎ型アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）及びプロリンイミノペプチダーゼ（ＰｅｐＩ）活性を、合成基質、それぞれ、Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ及びＦｏｒ−ｐ−ＮＡを用いて調べた。反応混合物は、合成基質が溶解している（最終濃度２ｍＭ）、０．９ｍｌのＫ−リン酸バッファー５０ｍＭ、ｐＨ７．０と、１００μλの細胞懸濁液とを含んでいた。１μｍｏｌ／分のｐ−ニトロアニリドを放出するのに必要な酵素量に対応する、活性単位（Ｕ）として表される酵素活性（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、１９９６年、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＣＢ１のタンパク質分解系：プロテイナーゼ、ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの精製及び特徴付け（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＣＢ１：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ａｎｄ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｚｓｅ．）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３２２０〜３２２６頁）。プロリダーゼ（ＰｅｐＱ）及びプロリナーゼ（ＰｅｐＲ）は、Ｄｉ Ｃａｇｎｏ及び共同研究者（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００４年、コムギ及び非毒性粉及び選択された乳酸菌を含むスターターから製造されたサワー種パンは、セリアック病患者において耐容性を示す（Ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｂｒｅａｄ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｎｏｎｔｏｘｉｃ ｆｌｏｕｒｓ ａｎｄ ｓｔａｒｔｅｒ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｉｓ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：１０８８〜１０９６頁）によって記載されるように、それぞれＶａｌ−Ｐｒｏ及びＦｏｒ−Ｇｌｙに対して調べた。ジペプチダーゼ（ＰｅｐＶ）及びトリペプチダーゼ（ＰｅｐＴ）は、それぞれ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ及びＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕを用い、Ｃｄ−ニニドリン（Ｃｄ−ｎｉｎｉｄｒｉｎｅ）法（Ｇｏｂｂｅｔｔｉら、１９９９年、二次応答曲面法によるチーズ関連乳酸菌のタンパク質分解及び脂肪分解活性に対する温度、ｐＨ、ＮａＣｌ及びａｗの作用についての研究（Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ＮａＣｌ，ａｎｄ ａｗ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｅｅｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２５：７９５〜８０９頁）に従って調べた。活性単位（Ｕ）は、１μｍｏｌのアミノ酸／分を放出するのに必要な酵素量として定義した。
【００２７】
（２）酸性化力
酸性化力に基づく選択は、１５、１５、６５及び５重量％のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉のような６２．５１ｇの粉混合物と、最終細胞密度１０８ｕｆｃ／ｇの捏ね物の単一の乳酸菌の細胞懸濁液を含有する３７．５ｍｌの水とを用いる１００ｇの捏ね物（捏ね物収量１６０）で実施した。捏ね物の酸性化動態は、オンラインでｐＨを測定して検出した（ｐＨメーター５０７、Ｃｒｉｓｏｎ、Ｉｔａｌｙ）。データは、Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇと共同研究者によって改変されたＧｏｍｐｅｒｔｚ方程式を用いてモデル化した（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０年、細菌増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ．）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１８７５〜１８８１頁）。
【００２８】
（３）グルテン解毒
グルテン解毒試験は、１５、１５、６５及び５％のネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉のような６２．５１ｇの粉混合物と、最終細胞密度１０８ｕｆｃ／ｇの捏ね物の、より高いタンパク質分解活性のために選択された乳酸菌（ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、（ＤＳＭ１８４２７）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、（ＤＳＭ１８４２８）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１））の細胞懸濁液を含有する３７．５ｍｌの水とを用いる１００ｇの捏ね物（捏ね物収量１６０）で実施した。捏ね物に５００又は１０００ｐｐｍというグルテン量を加えた。それぞれ、５００及び１０００ｐｐｍのグルテンと、０．１５ｇのＮａＮ３（ｐ／ｐ）を含有する２種の対照捏ね物を、細菌種菌を用いずに製造し、ｐＨ３．６に化学的に酸性化した。捏ね物は、３０℃で５、２４及び４８時間インキュベートした。発酵の最後に、グルテン定量のためにＥＬＩＳＡ試験を用いた（Ｔｒａｎｓｉａ Ｐｌａｔｅ、Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）。
【００２９】
（４）発酵させた捏ね物の特徴付け
選択された乳酸菌を、ネイティブコーン、ホワイトコーン、米粉及びサラセンホウィート（ｓａｒａｃｅｎ ｗｈｅａｔ）粉からなる粉混合物をベースとする捏ね物の製造に用いられる５種の異なる配合に用いた（表２）。
表２
【表２】
【００３０】
先に示されたように製造された捏ね物を、３０℃で２４時間インキュベートした。醸造用酵母（１．５％）を用いて、３０℃で２時間発酵させた細菌種菌を用いない捏ね物を対照として用いた。種々の配合を用いて発酵させた捏ね物及び対応する対照の特徴付けは、以下を含んでいた：（ｉ）酸性化動態（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０年、細菌増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１８７５〜１８８１頁）；（ｉｉ）酵素キット（ＤＨＦＦ ＣＨＡＭＢ Ｉｔａｌｙ Ｓｒｉ、Ｉｔａｌｙ）による、発酵の間に生成した有機酸（Ｄ−及びＬ−乳酸及び酢酸）の測定；（ｉｉｉ）ｍＭＲＳアガーでのプレート計数による細胞密度（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、（ｉｖ）Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａｒｏｗ（Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａｒｏｗ、１９２５年、リンの比色定量（Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：６６：３７５頁）並びにＳｈｉｍｉｚｕ（Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９２年、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｎａｔｔｏ）ｎ−７７由来のフィターゼの精製及び特徴付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｎａｔｔｏ）ｎ−７７．）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１２６６〜１２６９頁）によって記載された方法を用いる、放出された無機オルトホスフェートの検出によるフィターゼ活性；及び（ｖ）陽イオン交換カラム（Ｎａ Ｏｘｉｄｉｓｅｄ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ、２０ｃｍ×４．６ｍｍ）を用いる、「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０」（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）による総アミノ酸含量の測定。
【００３１】
（５）グルテンフリーのパンの製造
選択した「天然酵母」の種々の配合を、種々の技術的な解決策を考慮する、グルテンフリーのパンの製造に用いた。２４時間発酵させた後、（ｉ）前記で報告された成分からなる５〜３０％ベース捏ね物で播種することによる新鮮な天然スターター又は予備乾燥の場合には、同様の（ｉｉ）成分（１５％）として用いた。この捏ね物に醸造用酵母（１％）及びＮａＣｌ（０．３％）を加え、３０℃で２時間インキュベートし、その後、実験室オーブンで焼成した（２２０℃で５０分）。対照パン対照は、醸造用酵母（２％）を用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物を用いて製造した。以下の測定は、製造されたパンで実施した：（ｉ）水抽出と、原子吸光分光分析法によるその後の測定による生物学的に利用可能な無機養素含量の分析；（ｉｉ）６人の訓練を受けていない試験者によって（Ｈａｇｌｕｎｄら、１９９８年、生態学的に栽培された、及び伝統的な方法で栽培されたコムギから得た全粒パンの官能評価（Ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅｍｅａｌ ｂｒｅａｄ ｆｒｏｍ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ ｇｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ．）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．２７：１９９〜２０７頁）、各特性について、０〜１００の値範囲の漸増する強度の連続的尺度を用いて実施されたパネル試験による官能分析；（ｉｉｉ）ＡＡＣＣ１０−１０及びＡＡＣＣ７４−０９公定法に従う比容積及び硬度の分析（Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｘ版、ＡＡＣＣ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ−Ｕ．Ｓ．Ａ．編）；及び（ｉｖ）工業規模でのパン製造、改変雰囲気（４０％Ｎ２及び６０％ＣＯ２）における包装及び保存性化合物の不在下での６カ月間の継続保存による保存期間試験。
【００３２】
結果
（１）プロテイナーゼ活性
不均一加水分解プロフィールが証明される、基質としてアルブミン及びグロブリンを用いて測定されるプロテイナーゼ活性。図２では、より顕著なプロテイナーゼ活性を代表するＬ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及び（ＤＳＭ１８４２９）のプロフィールが報告されている。グルテンフリーの食品の製造に用いられる内因性粉酵素のものに対して補完的であり得るこのような酵素活性は、タンパク質分解過程の初期段階を構成する。ペプチダーゼ活性は、比較的特異的な合成基質でアッセイした。図３では、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株に関する結果が報告されている。トリペプチダーゼ型活性を除く、すべての考慮される酵素活性について、株（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）が、その他の株よりも著しく高い活性を有することを観察することができる。同じ基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。スクリーニングのためにＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを利用できること及び多数のアッセイされる酵素活性が、通常は得られない選択された株を得るための前提をなす。プロテイナーゼ及びペプチダーゼ活性に基づいて、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＰ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）が選択された。特に、選択された種及び株のペプチダーゼ型活性の、初期スクリーニングに用いた２種のラクトバチル・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株との比較は、すべての試験した基質についてより高いペプチダーゼ活性（平均で４０〜８０％）を常に指し示した。それに基づいて選択が実施された酵素活性は、（ｉ）アミノ酸のより多い放出に有利に働き、したがって、栄養上の利用率を高め；（ｉｉ）焼成プロセスの間に生じたより多量の揮発性化合物前駆体を放出し、典型的なパンの芳香の原因となり；（ｉｉｉ）グルテンフリー製品の混入のような、あり得るグルテンの痕跡の解毒に寄与する多様な価値を有し得る。
【００３３】
（２）酸性化力
乳酸菌単離物の酸性化力は、単一の微生物を用いて３０℃で７時間発酵させた酸性捏ね物で直接調べた。図４には、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）種に属する株に関する結果が報告されている。（ＤＳＭ１８４２６）株、特に、（ＤＳＭ１８４２７）はまた、ΔｐＨ及びμｍａｘを用いて表される、良好な酸性化力も特徴とするということを観察することができる。同一の基準に従って、その他の種に属する株の選択を実施した。２．３より高いΔｐＨ値を特徴とする酸性化力に基づいて、特に、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）が選択された。すべての選択された種又は株が、スクリーニングにおいて考慮された２種のＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株について求められたものより高い酸性化力及び速度を示した。
【００３４】
（３）グルテン解毒
最初に、タンパク質分解活性に基づいて選択されたプール乳酸菌 （Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及び（ＤＳＭ１８４２８）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）及びＰ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２））を、混入をシミュレートするためにグルテンフリーの捏ね物に意図的に加えた５００又は１０００ｐｐｍのグルテンの解毒に用いた。捏ね物を４８時間インキュベートした後、両グルテン濃度の存在において約４０％の減少が観察された。より短いインキュベーション時間、すなわち、２４時間も、同様の解毒パーセンテージを示したが、５時間のインキュベーションはグルテン濃度の実質的な減少を可能にしなかった。組み合わせた、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）は、より多数の単離物からなるプールと同様のグルテンの加水分解活性を示した。同じ組合せの乳酸菌が、グルテンフリー出発材料の妥当な混入値である約３００ｐｐｍの初期グルテン濃度を、２０ｐｐｍという閾値で低下させるのに適していた。グルテンに対する同様の活性によって、発酵プロセスの間のグルテン生物学的混入除去を含むグルテンフリー成分のより高い安全使用が可能となり得る。
【００３５】
（４）発酵させた捏ね物の特徴付け
表２には、選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の配合が報告されている。各配合を、捏ね物の３０℃で１２時間の発酵に用いた。醸造用酵母のみを用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物を、対照として用いた。すべての製造された捏ね物は、１２時間発酵させた後に、常に、２．４より高いΔｐＨ値（捏ね物の最終ｐＨ約３．４）に達し（図４）、このことは、すべての配合について、顕著な酸性化を引き起こす能力を示す。特に、ｎ．５の組合せ（Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）及び（ＤＳＭ１８４２７）、及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９））を用いて得られた捏ね物は、約２．６に匹敵する最大のΔｐＨ値を示したのに対し、ｎ．３の組合せ（Ｐ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８））は、約２．４５に匹敵する最低のΔｐＨ値を示した。最大酸性化速度（μｍａｘ）の点では、ｎ．３、４（Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９））並びに５の組合せを用いて得られた捏ね物は、約１．３時間−１に匹敵する最高のΔｐＨ値を示した。必ずしも最大の酸性化力が常に良好なパン構造及び／又は芳香とともにあるわけではないが、特に、グルテンフリーの粉を用いる場合には、酸性化力は、酵母添加された製品の感覚受容性特性を改善するために考慮されるパラメータの１つに相当する。対照捏ね物を除く、すべての捏ね物において、有機酸の存在が検出され、特に、変動は以下のとおりであった：２１〜８２ｍＭのＬ−乳酸、５１〜７５ｍＭのＤ−乳酸及び１０〜３０ｍＭの酢酸（表３は、選択された乳酸菌の配合を用いて３０℃で１２時間発酵させた捏ね物の、Ｌ−及びＤ−乳酸、酢酸の濃度及び発酵指数を示す）。
表３
【表３】
ａ 醸造用酵母を用いて３０℃で２時間発酵させた捏ね物
ｂ ｎｄ、測定せず
ｃ 発酵指数、乳酸と酢酸間のモル比
【００３６】
３種の酸の検出される濃度及び乳酸と酢酸の比は、組合せ中に存在する乳酸菌の代謝プロフィールを反映する。有機酸比は、ｎ．３の組合せを用いて得られた捏ね物を除いて、酸性捏ね物中に通常見られるものに相当している（４：１に匹敵）。有機酸の濃度は、乳酸菌に起因し得る最終製品への芳香の点での寄与に関する有用な情報を提供し得る。一般に、発酵指数を規定する乳酸と酢酸のモル比の値は、より良好な寄与を提供するには極めて低い値の傾向でなければならない。ｎ．３の組合せを除く、すべての製造された捏ね物は、最適発酵指数を示した。１２時間の発酵後に製造された捏ね物の細胞密度は、９．１〜９．４７ｌｏｇ１０ ｕｆｃ／ｇの捏ね物である。天然酵母の使用が、パンにおけるミネラルの生物学的利用率のような栄養上の観点から与え得る寄与を推定するために、報告される５種の組合せを用いて得られた捏ね物をフィターゼ活性について特徴付けた。表４には、選択された乳酸菌の配合を用いて３０℃で１２時間発酵させた捏ね物のフィターゼ活性の値が報告されており、７００ｎｍでの吸光度として表されている。
表４
【表４】
ａ対照１：１％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
ｂ対照２：０．５％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
ｃ対照３：０．２５％の醸造用酵母を用いて３０℃で２時間酵母添加された細菌種菌を含まない捏ね物
【００３７】
１の配合を除いて、その他のすべて（特に、２及び４の組合せ）が、対照捏ね物においてよりも約３０倍高いフィターゼ活性の値を示した。図５には、遊離アミノ酸の総濃度が報告されており、「天然酵母」の５種の配合について、７２６．５４〜２４１５．９７ｍｇ／ｋｇの捏ね物である。醸造用酵母を用いて発酵させた対照捏ね物の濃度は、４２０．０７（ｍｇ／ｋｇ）であった。２の配合を用いた長時間（２４時間）の発酵は、１２時間のインキュベーション後に得られた遊離アミノ酸の濃度の倍増をもたらし、このことは、「天然酵母」によって発酵されたパンの栄養価及び消化率を高める可能性を示す。ｎ．２の組合せを用いて得られた捏ね物のアミノ酸プロフィールは、Ａｒｇ（１７８．３８ｍｇ／ｋｇ）、Ｌｅｕ（１３４．０９ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｌｕ（８２．４５ｍｇ／ｋｇ）及びＰｒｏ（８７．３０ｍｇ／ｋｇ）アミノ酸の生成について顕著である（図６）。
【００３８】
（５）グルテンフリーのパンの製造
選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を、図８に報告されるバイオテクノロジープロトコールに従って、グルテンフリーのパンの製造に用いた。２種の提案される代替物は、異なる技術的な解決策に対応するものである。さらなる発酵プロセス（３０℃で２時間）のためのスターターとしての新鮮な「天然酵母」の使用は、従来技術を表すが、高価ではなく、毎日の「天然酵母の補給」を必要とする。「天然酵母」の使用自体の変法として、より長期の保存及び再活性化後の連続使用を可能にするためのその凍結があり得る。「天然酵母」の乾燥及び成分としてのその直接使用は、最終発酵期間（３０℃で２時間）において活性ではないものの、容易な保存を可能にする。酵母添加剤としての醸造用酵母の使用に関しては、３０％の新鮮な「天然酵母」の使用によって、発酵プロセスの間に約１０〜３０倍高いフィターゼ活性が得られることが可能となり、生物学的に利用可能なＣａ２＋及びＺｎ２＋の含量の、それぞれ約２１及び４８％の増大をもたらし、遊離アミノ酸の含量が約１０倍増大する。所望の特性によって変わる「天然酵母」の使用パーセンテージに基づいて、前記のすべての官能的なもの、前記で報告された増大は、変動を起こしやすい。また、再活性化後の凍結「天然酵母」の使用は、新鮮なものの同様の性能を示す。選択された乳酸菌に基づく「天然酵母」の種々の配合を用いて得られたすべてのパンは、醸造用酵母のみを用いて製造された対照パンと比較して、比容積及び硬度の同様の又はわずかに良好な値を特徴とする。製造されたパンを官能分析に付した。評価した官能パラメータは、弾性、色、芳香酸、酸味、甘味、乾燥度及び芳香とした。どのパラメータも、０〜１００の範囲の値で漸増強度評価に従って評価した。各パンの官能プロフィールの定性的評価のために、得られたデータを、主成分（ＰＣＡ）の統計分析によって処理した。図９に報告される２種の主成分は、サンプル全分散の７３％を説明した。水平軸（因子１）は、全官能評価の関数としてのパンの類型の分布を示し、縦軸（因子２）は、各々考慮される官能パラメータの関数としてのパンの分布を表す。２種の主成分から規定される図でのパン分布から明らかなように（図９ａ）、新鮮な「天然酵母」を用いて製造されたパンの類型は、全く同様の官能結果を示したということが推定される。図９ｂからは、芳香、風味及び色の官能上特有の、高く評価される特性は、「天然酵母」を用いて製造されたパンが存在する図の部分において分布しているということが明確に明らかであり、このことから、芳香及び風味の点での「天然酵母」の役割及び寄与が確認される。最終的に、工業規模で製造され、改変雰囲気（４０％Ｎ２及び６０％ＣＯ２）において包装され、６カ月間の保存に付された、２の配合を用いて製造されたパン。全保存期間の間、保存性化合物（例えば、プロピオン酸Ｃａ）の添加のない、微生物汚染現象（白カビの生えた、「粘り気のある」パン）は観察されなかった。
【受託番号】
【００３９】
ＤＳＭ１８４２６
ＤＳＭ１８４２７
ＤＳＭ１８４２８
ＤＳＭ１８４２９
ＤＳＭ１８４３０
ＤＳＭ１８４３１
ＤＳＭ１８４３２
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１
＜２２３＞増幅プライマーＬｐｉｇＦ
配列番号２
＜２２３＞増幅プライマーＬｉＰＲ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルテンフリーの粉の酵母添加のための乳酸菌株の混合物であって、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）からなる群から選択される少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の乳酸菌株を含む、又はからなる、上記混合物。
【請求項２】
ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びＬ．ｓ プランタラム（Ｌ．ｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項５】
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項６】
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項７】
発酵の開始時に約１０８ｃｆｕ／ｇの細胞密度で株が等比にある、請求項１から６までのいずれか一項に記載の混合物。
【請求項８】
グルテンフリーの粉が、トウモロコシ、米、サラセンホウィート、タピオカデンプン、ヒマワリ、リネン、テフ、サトウモロコシ、キノア、ジャガイモ、キャッサバ、アマランサス、雑穀粉からなる群から選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の株混合物を用いる、グルテンフリーの焼き製品のスターター又は同様のグルテンフリーの焼き製品を調製するためのグルテンフリーの粉の混合物であって、前記粉組成物が、トウモロコシデンプン１０〜３０％、好ましくは１２％、タピオカデンプン２〜１０％、好ましくは４％、米粉２０〜６０％、好ましくは３２％、サラセンホウィート粉１〜１０％、好ましくは６％を含み、又はからなり、前記パーセンテージが、全粉組成物重量の重量％として表される、上記グルテンフリーの粉の混合物。
【請求項１０】
グルテンフリーの焼き製品のためのスターターの調製方法であって、
ａ）請求項１から８までの各項に記載の乳酸菌株混合物を培養増殖させるステップと、
ｂ）５０〜６４％濃度の請求項９に記載の粉組成物を、種及び株間で等比で約１０８ｕｆｃ／ｇの細胞密度を有するステップａ）の菌株培養物を含有する３５〜５０％水と混合するステップであって、前記パーセンテージが総捏ね物重量の重量パーセンテージである該ステップと、
ｃ）２０〜３０℃で８〜２４時間発酵させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項１１】
ｄ）ステップｃ）において得られたスターターを乾燥又は凍結させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
グルテンフリーの焼き製品の調製方法であって、
ａ）４０〜６０％、好ましくは４４％のパーセンテージの請求項９に記載の粉組成物と、醸造用酵母１〜３％、好ましくは２％を含有する水１０〜３０％、好ましくは２６％と、塩０．１〜１．２％と、５〜３０％、好ましくは３０％の量の請求項１０から１１までの各項に記載の方法を用いて得ることができる新鮮なスターター種菌、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージである該ステップと、
ｂ）３０℃で約１〜３時間発酵させるステップと、
ｃ）２２０℃で５０分間調理するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の方法を用いて得ることができるスターター組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法を用いて得ることができる焼き製品。
【請求項１】
グルテンフリーの粉の酵母添加のための乳酸菌株の混合物であって、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）からなる群から選択される少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の乳酸菌株を含む、又はからなる、上記混合物。
【請求項２】
ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＤＳＭ１８４３２）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２８）及びＬ．ｓ プランタラム（Ｌ．ｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項５】
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＤＳＭ１８４３１）、Ｌ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）及びＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＤＳＭ１８４３０）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項６】
Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２６）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ１８４２７）及びＬ．ロシエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）（ＤＳＭ１８４２９）を含む、又はからなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項７】
発酵の開始時に約１０８ｃｆｕ／ｇの細胞密度で株が等比にある、請求項１から６までのいずれか一項に記載の混合物。
【請求項８】
グルテンフリーの粉が、トウモロコシ、米、サラセンホウィート、タピオカデンプン、ヒマワリ、リネン、テフ、サトウモロコシ、キノア、ジャガイモ、キャッサバ、アマランサス、雑穀粉からなる群から選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の株混合物を用いる、グルテンフリーの焼き製品のスターター又は同様のグルテンフリーの焼き製品を調製するためのグルテンフリーの粉の混合物であって、前記粉組成物が、トウモロコシデンプン１０〜３０％、好ましくは１２％、タピオカデンプン２〜１０％、好ましくは４％、米粉２０〜６０％、好ましくは３２％、サラセンホウィート粉１〜１０％、好ましくは６％を含み、又はからなり、前記パーセンテージが、全粉組成物重量の重量％として表される、上記グルテンフリーの粉の混合物。
【請求項１０】
グルテンフリーの焼き製品のためのスターターの調製方法であって、
ａ）請求項１から８までの各項に記載の乳酸菌株混合物を培養増殖させるステップと、
ｂ）５０〜６４％濃度の請求項９に記載の粉組成物を、種及び株間で等比で約１０８ｕｆｃ／ｇの細胞密度を有するステップａ）の菌株培養物を含有する３５〜５０％水と混合するステップであって、前記パーセンテージが総捏ね物重量の重量パーセンテージである該ステップと、
ｃ）２０〜３０℃で８〜２４時間発酵させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項１１】
ｄ）ステップｃ）において得られたスターターを乾燥又は凍結させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
グルテンフリーの焼き製品の調製方法であって、
ａ）４０〜６０％、好ましくは４４％のパーセンテージの請求項９に記載の粉組成物と、醸造用酵母１〜３％、好ましくは２％を含有する水１０〜３０％、好ましくは２６％と、塩０．１〜１．２％と、５〜３０％、好ましくは３０％の量の請求項１０から１１までの各項に記載の方法を用いて得ることができる新鮮なスターター種菌、又は乾燥された、酵母添加活性を有さない同様の成分、又は酵母添加活性を有する凍結された成分とを捏ねるステップであって、前記パーセンテージが、捏ね物の総重量に関して重量パーセンテージである該ステップと、
ｂ）３０℃で約１〜３時間発酵させるステップと、
ｃ）２２０℃で５０分間調理するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の方法を用いて得ることができるスターター組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法を用いて得ることができる焼き製品。
【図１】
【図２】
【図３（ａ）】
【図３（ｂ）】
【図３（ｃ）】
【図３（ｄ）】
【図３（ｅ）】
【図３（ｆ）】
【図４（ａ）】
【図４（ｂ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３（ａ）】
【図３（ｂ）】
【図３（ｃ）】
【図３（ｄ）】
【図３（ｅ）】
【図３（ｆ）】
【図４（ａ）】
【図４（ｂ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５４３５７６（Ｐ２００９−５４３５７６Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２０１３３（Ｐ２００９−５２０１３３）
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００７／０００４７９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１０２５２
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（３０９０２０２４２）ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００７／０００４７９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１０２５２
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（３０９０２０２４２）ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ (2)
【Ｆターム（参考）】
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