ケラタン硫酸由来オリゴ糖の同定方法
【課題】 ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖を微量試料で正確かつ迅速に同定する方法を提供すること。
【解決手段】 ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行う工程と、を含み、
前記２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析により得られたスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【解決手段】 ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンのスペクトルデータを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行う工程と、を含み、
前記２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析により得られたスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
硫酸化グリコサミノグリカンは、生体内でプロテオグリカンとして存在し、細胞の増殖、移動、分化、組織の形態形成などに重要な役割を担う糖鎖として近年注目されている。ケラタン硫酸は、この硫酸化グリコサミノグリカンの一種であり、ＧａｌとＧｌｃＮＡｃとが結合した２糖単位の繰り返し構造を有している。糖鎖の枝分かれ構造や硫酸基の数によって、種々のケラタン硫酸が知られている。
ケラタン硫酸は、生体内では軟骨や角膜、脳組織等に存在していることが確認されている。ケラタン硫酸の構造解析は、生体におけるケラタン硫酸の機能や様々な疾患との関連性の解明に重要である。
【０００３】
ケラタン硫酸の構造を解析するために、ケラタン硫酸と同様の組成を有するオリゴ糖を同定することが行われている。このオリゴ糖の同定は、従来は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析し、標準物質のピーク位置と照合することにより行われていた。しかし、ＨＰＬＣは、化合物の化学構造よりむしろ性質を反映する手法であり、ピーク位置が標準物質と同じであっても、構造が異なる不純物である可能性もある。
また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置を用いてケラタン硫酸の構造を解析する試みもあるが（非特許文献１参照。）、該手法は配列解析法とは言い難く、しかも比較的多量の試料を必要とする上に長い測定時間を要するという問題がある。
【０００４】
最近の糖鎖の構造解析では、質量分析（ＭＳ）装置を用いた糖の構造決定の研究が活発化している。グリコサミノグリカンでは、コンドロイチン硫酸やヘパリン由来のオリゴ糖のＭＳによる研究が報告されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
また、非特許文献６においては、ケラタン硫酸関連構造を持つ標準オリゴ糖鎖を多段階質量分析（ＭＳｎ分析）し、従来のHPLC分析ではピークが重なり合う可能性のあった種々のオリゴ糖鎖を、その分子量を指標として分別検出すること、更には分子量が同じ糖鎖であっても化学構造の異なるそれぞれを、ＭＳ２、ＭＳ３分析のシグナル・パターンで分別検出できることが報告されている。即ちこれは、標準試料の質量分析によって得られるシグナルのパターン（ＭＳ３まで）を予め標準データとして得ておき、照合型同定により未知試料を同定する方法である。
【０００５】
【非特許文献１】European Journal of Biochemistry, Thomas N. Huckerby et al., Vol. 253, pp. 499-506 (1998)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 73, pp. 6030-3039, No. 24 (2001)
【非特許文献３】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 75, pp. 2445-2455, No. 10 (2003)
【非特許文献４】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 74, pp. 3760-3771, No. 15 (2002)
【非特許文献５】J. American Society Mass Spectrometry, Joseph Zaia et al., Vol. 14, pp. 1270-1281 (2003)
【非特許文献６】Analytical Chemistry, Yuntano Zhang et al., Vol. 77, pp. 902-910, No. 3 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースの交互配列構造を有するケラタン硫酸中には、硫酸化された（硫酸基を持つ）糖残基（Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはガラクトース）と、硫酸化されていない（硫酸基を持たない）糖残基（同）が無秩序に存在し、それらの配列情報を得る方法論は今まで存在しなかった。
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖を微量試料で正確かつ迅速に同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の上記目的は、下記手段により解決された。
１．ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
２．前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする上記１に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
３．ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記ＭＳ４分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の同定方法によれば、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトース、及び硫酸化と非硫酸化の情報それぞれを含む糖鎖全体の配列を、微量試料で正確かつ迅速に同定することができる。本発明の同定方法によりケラタン硫酸全長の構造を推定することも可能となり、例えば、軟骨、角膜、脳等の生体組織から得られるケラタン硫酸の構造解析等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る同定方法の対象となるオリゴ糖は、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖であり、ガラクトース（Gal）とＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）とがβ１−４結合した構造を有する。ケラタン硫酸由来のオリゴ糖としては、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖のみならずケラタン硫酸を分解して得たオリゴ糖の一部の糖を除去又は修飾したものも含まれる。また、本発明の同定対象は、還元糖であることが望ましい。
ケラタン硫酸の分解は、化学的な方法（酸加水分解等）や酵素的な方法（ケラタン硫酸分解酵素による分解等）によって行うことができるが、酵素的な方法を用いることが好ましく、ケラタナーゼＩＩを用いることがより好ましい。酵素反応は、用いるケラタン硫酸分解酵素の種類に応じて当業者が適宜設定することができるが、例えばケラタナーゼＩＩを用いる場合、ｐＨ５．０〜７．０、温度３０〜４０℃で、０．１〜４８時間反応させることが好ましい。
【００１０】
ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖は、Gal及びGlcNAcにおける６位のヒドロキシル基の一部又は全部が硫酸化されたオリゴ糖、非還元末端のGalにシアル酸等が結合したオリゴ糖等も含まれ、本発明ではこれらのようなオリゴ糖も同定対象とすることができる。シアル酸としては、Ｎ−アセチルイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が例示される。また、シアル酸とGalとの間の結合は、α２−３結合であることが好ましい。
【００１１】
ケラタン硫酸を上記のように酵素反応を用いて分解すると、通常、種々のサイズの偶数糖を含む混合物が得られる。本発明に係る同定方法では、この偶数糖をさらに酵素処理して得られる奇数糖も同定対象とすることができる。このような酵素としては、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
また、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖における硫酸基を除去したオリゴ糖、非還元末端のシアル酸を除去したオリゴ糖、また、化学的もしくは酵素的に硫酸基を増加せしめたオリゴ糖等も同定対象とすることができる。なお、オリゴ糖の脱硫酸化は、例えば塩酸含有メタノールとの反応（ＷＯ９８／０３５２４号パンフレット記載の方法）によって行うことができる。また、シアル酸の除去は、オリゴ糖の希硫酸処理またはノイラミニダーゼ処理によって行うことができる。硫酸基の増加は、例えば硫酸基転移酵素を用いた反応や、ジメチルホルムアミド中、三酸化硫黄・ピリジン複合体による処理によって行うことができる。
【００１２】
ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖又はこのオリゴ糖を処理したものの具体例としては、以下のものを挙げることができる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
【化２】
【００１５】
本発明の同定方法の対象となるオリゴ糖の糖鎖長は、特に限定されないが、２糖〜１２糖であることが好ましく、２糖〜６糖であることがより好ましい。
また、それらオリゴ糖は精製されていることが好ましいが、種々のケラタン硫酸由来オリゴ糖を含む混合物の場合でも本発明の方法により同定可能である。
【００１６】
本発明に係るオリゴ糖の同定方法では、まず、被検オリゴ糖をＥＳＩ（エレクトロスプレー・イオン化）法によりイオン化させる。
ＥＳＩ法によって被検オリゴ糖をイオン化することにより、被検オリゴ糖の分子量に起因する１種類又は２種類以上のイオン（以下、分子量関連イオンと呼ぶ。）が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検オリゴ糖の分子量を確定することができる。分子量関連イオンの検出はＩＴ（イオントラップ）型分析装置、ＱＩＴ−ＴＯＦ（四重極イオントラップ−飛行時間）型分析装置、またはＦＴ−ＩＣＲ（フーリエ変換イオンサイクロトロン）型分析装置等を用いることが好ましい。ＥＳＩ法によるイオン化するＩＴ型分析装置としては、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。
このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、ＭＳの１乗スペクトル（以下、「ＭＳ１スペクトル」等と略称する。）が得られる。
【００１７】
前記のようにして得られたＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンをプレカーサー・イオンとしてフラグメンテーションを行い、フラグメントイオンを生成させて検出することにより、ＭＳ２分析を行う（これにより「ＭＳ２スペクトル」が得られる。）。ここで、本発明ではＥＳＩ法によりイオン化するために、ＭＳ１スペクトルにおいては種々の価数の分子量関連イオンを生じ得るが、ＭＳ２分析では、硫酸基の数に等しい価数のイオンを分析対象とすることが好ましい。
ＭＳ２分析により、シアル化オリゴ糖は脱シアル酸が起きるため、その分子量変化よりオリゴ糖の非還元末端にシアル酸が導入されていたことを同定することができる。また、殆どのオリゴ糖鎖で下記のように脱水イオンと0,2Ａｒイオン（Domon, B.; Costello, C.E. Glycoconjugate Journal 1988, 5, 397-409、ここでは特に還元末端をｒとして示した。具体例を図５に示す。）が観測される。
【００１８】
【化３】
【００１９】
本発明に係る同定方法では、この0,2ＡｒイオンをさらにフラグメンテーションさせることでＭＳ３分析する（ＭＳ３スペクトルが得られる。）。ＭＳ２分析で得た0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルでは、還元末端糖以外の糖に電荷があれば必ず2,4Ａｒイオンを生じる。
【化４】
【００２０】
ここで、0,2Ａｒイオンとは、還元末端糖残基における糖環内酸素と１位炭素間の結合ならびに２位炭素と３位炭素間の結合の二つの結合が切断されて生じた、 非還元末端糖を含むフラグメントイオンを指す。
また、2,4Ａｒイオンとは、還元末端糖残基における２位炭素と３位炭素間の結合ならびに４位炭素と５位炭素間の結合の二つの結合が切断されて生じた、非還元末端糖を含むフラグメントイオンを指す。
これらのイオンは、Cross-ring cleavageイオンと呼ばれるイオンである。
【００２１】
さらに、ＭＳ３分析において観測された2,4ＡｒイオンをフラグメンテーションさせることでＭＳ４分析する（ＭＳ４スペクトルが得られる。）。
本発明の同定方法では、このＭＳ３及びＭＳ４分析操作において、必ず0,2Ａｒイオン及び2,4Ａｒイオンをそれぞれ各プレカーサー・イオンとしてフラグメンテーションさせることが重要である。
【００２２】
ＭＳ２スペクトル中のどのシグナルが0,2Ａｒイオンであるか、またＭＳ３スペクトル中のどのイオンが2,4Ａｒイオンであるかは、以下の計算方法で確定することができる。
即ち、ＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンに沿って観測される同位体イオンのｍ／ｚ値から、そのイオンの価数（ｚ）が決定される。本発明の測定条件に従う限りは、化合物構造中の硫酸基の数と、価数ｚが同値となる。すなわち、天然炭素中には１２Ｃのほかに１３Ｃが１％程度含まれるため、糖のように炭素を持つ化合物の場合は、質量が大きいシグナルが同時に弱めに観測される。仮に、分子量１００の化合物の場合には１０１にもシグナルが現れることになる。これが硫酸基を２個持って二価になった場合、ｍ／ｚ値が二分の一になるので、５０．０と５０．５にシグナルが観測され、これを読むことによって硫酸基の数を決めることができる。
このｚ値を分子量関連イオンのＭＳ１スペクトルにおけるｍ／ｚ値に乗じることで測定するケラタン硫酸オリゴ糖の分子量ｍが決定される。逆に言えば、測定化合物の分子量を硫酸基の数で除した値のｍ／ｚ位置に、分子量関連イオンが観測される。ＭＳ２スペクトルにおいて観測される0,2Ａｒイオンは、分子量ｍ値として必ず101だけ小さくなるため、実際のＭＳ２スペクトル中に化合物分子量から101を減じ、それを硫酸基数で除した値のｍ／ｚ位置に観測されるのが0,2Ａｒイオンである。
また、ＭＳ３スペクトルにおいて生じる2,4Ａｒイオンは、分子量ｍ値として60（還元末端糖が硫酸化されていない場合）もしくは139（還元末端糖が硫酸化されている場合）だけ必ず小さくなるため、実際のＭＳ３スペクトル中に化合物分子量から60もしくは139を減じ、それを硫酸基数で除した値のｍ／ｚ位置に観測されるのが2,4Ａｒイオンである。
【００２３】
このようにして得た2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルは、ＭＳ２、ＭＳ３スペクトルとは異なり、種々の位置のグリコシド結合が切断されたイオンのシグナルを与えることが判明した。すなわち、2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルでは、アルデヒドのような活性基を持たないためグリコシド結合の切断が随所で起こり、グリコシドの切断様式によって、Ｂイオン、Ｃイオン、Ｙイオン、Ｚイオンと称されるグリコシド結合切断イオン（Domon, B.; Costello, C.E. Glycoconjugate Journal 1988, 5, 397-409、具体例を図５に示す。）が生じる。糖鎖の配列を解読するには、各糖残基間のグリコシド結合単位が切断されて得られるこのような情報が最も有用であり、配列解析が可能となる。
【００２４】
即ち、以下の手順により糖鎖の配列解析を行うことができる。
まず、ＭＳ４スペクトルにおけるそれぞれのイオンのｚ値（イオンの価数）を読み、その値をｍ／ｚ値（質量電化比）に乗じることで、各々のイオンのm値（質量）を決定することができる。
次に、ＭＳ４スペクトル上には複数のフラグメントイオンが観測されることが通常であるから、複数のフラグメントイオンのm値を算出し、任意の二つのイオンのｍ値の差（質量差）が203（N−アセチルグルコサミンの分子量221からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値）であればＮ−アセチルグルコサミン、162（ガラクトースの分子量180からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値）であればガラクトースが、双方の構造の違い（配列上の差）となっていることを示す。
さらに、ある糖残基が硫酸化されている場合には、m値に79（水酸基と硫酸基の差）の差を生じるため、任意の糖残基の６位の水酸基が硫酸化されているか否かも同時に解読することができる。（ケラタン硫酸の場合、硫酸基の位置はＮ−アセチルグルコサミンとガラクトースのどちらの場合でも、６位水酸基上であることが既に知られている。）
【００２５】
最終的には、全てのフラグメントイオンのｍ値の差（質量差）の情報から元の配列を再構成し、その分子量がＭＳ１スペクトルから得られる分子量と矛盾しないことを確認しておくことが望ましい。
【００２６】
なお、上記に説明した方法では、ＭＳ３分析では0,2Ａｒイオンのみについて行ったが、これに合わせてＭＳ２分析で得た脱水イオンについてもＭＳ３分析を行ってもよい。この脱水イオンのＭＳ３スペクトルのｍ／ｚ値：183.9（Y1-OSO3H）のイオンが生じる場合、還元末端６位が硫酸化されていることがわかる。
さらに、オリゴ糖の官能基分布を解析する場合は、ＭＳ５以降の分析が必要と考えられる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
［実施例１］
（オリゴ糖の入手及び調製）
（１）Ｌ１は生化学工業株式会社より、ＳＬ１はフナコシ株式会社より購入した。
【００２８】
（２）Ｌ２、Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ４Ｌ４、ＳＬ２Ｌ４、Ｌ２Ｌ２Ｌ２の調製
ウシ角膜由来のケラタン硫酸Ｉ（生化学工業株式会社製）又はサメ軟骨由来のケラタン硫酸ＩＩ（生化学工業株式会社製）の１ｍｇ/２００μl水溶液に、０．１Ｍの酢酸緩衝液で稀釈したケラタナーゼＩＩ（生化学工業株式会社より入手）を１ｍＵ/μｌ加え、ｐＨ５．０、３７℃で２時間反応させた。
この反応溶液を分画分子量１００００の遠心フィルター（ミリポア社製）にかけて高分子量成分を取り除き、得られた溶出液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で２分毎に分画した（５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ：６．０、０．１ｍｌ／ｍｉｎ）。ＧＰＣカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ 10/300ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。
【００２９】
（３）Ｌ２Ｌ４の調製
ＷＯ９６／１６９７３号パンフレットに記載の方法によって調製した。
【００３０】
（４）Ｇ４Ｌ２、Ｇ４Ｌ４の調製
上記（２）で得られたＬ２Ｌ２及びＬ２Ｌ４をそれぞれ特開２０００−２５６３８５号公報に記載の如くβ−ガラクトシダーゼで処理することによって調製した。
【００３１】
（５）Ｌ３、Ｇ１Ｌ１、Ｌ１Ｌ１の調製
Ｌ３は特開２００１−０８９４９３号公報に記載の方法、Ｇ１Ｌ１及びＬ１Ｌ１はＷＯ９８／０３５２４号パンフレットに記載の方法によって、それぞれ調製した。
【００３２】
（オリゴ糖のＭＳスペクトルの測定）
上記で得られたオリゴ糖のＭＳｎ分析を行った。まず、上記オリゴ糖を、酢酸の終濃度が１ｍＭかつメタノール含量が５０％の溶媒に、１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように溶解し、マイクロシリンジを用いて３６０μＬ／時間の速度で装置に注入した。その際のキャピラリー電圧は−３．８ｋＶであり、窒素ドライガスの速度を4.0 L/min、キャピラリー温度は３００°Ｃに設定した。
ＭＳｎ分析は、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）を用い、ネガティヴ・イオン・モードで測定した。
ＭＳ２分析は、ＭＳ１分析において観測された分子量関連イオン（［Ｍ−ｎＨ］ｎ−フラグメントイオン）を、１．００Ｖのフラグメント・エネルギーでフラグメンテーションすることによって生じたフラグメントイオンを観測することによって得た。なお、ＭＳ１スペクトル上においてイオン化に伴って脱硫酸化もしくは脱シアル化が認められたＬ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ４及びＳＬ２Ｌ４については、前記の酢酸濃度を前記の１／１０に設定して測定した。
ＭＳ２分析において観測された種々のイオンのうち、0,2ＡｒイオンをＭＳ３分析した。さらに、ＭＳ３分析において観測された種々のイオンのうち2,4ＡｒイオンをＭＳ４分析した。
【００３３】
以上のＭＳｎ分析によって得られたＭＳスペクトルのデータを図１〜４に示す。図１は、ＭＳ１スペクトルのデータ、図２は、ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２スペクトルのデータ、図３は、ＭＳ２分析で得られた0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルのデータ、図４は、ＭＳ３分析で得られた2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルのデータを示している。
図４に示すＭＳ４スペクトルにおいて、Ｌ３、Ｌ４、Ｇ４Ｌ２、Ｇ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ２Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２Ｌ２では、オリゴ糖鎖の配列に対応した開裂様式が観測されることがわかった（図６）。これにより、2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルデータから、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖を同定できることがわかる。
【００３４】
［実施例２］
次に、上記実施例で用いたオリゴ糖のうち任意に１種類のオリゴ糖を選び、配列が未知のオリゴ糖を同定した例を示す。なお、本実施例において得られたＭＳｎスペクトルのデータを図７に示す。
まず、この被検オリゴ糖を上記実施例１と同様にしてＭＳ１スペクトルを得た。ＭＳ１スペクトルにおけるｍ／ｚ値は453.0であった。なお、同位体イオンがｍ／ｚ値は453.5に確認されたことから、この被検オリゴ糖は硫酸基を２個持ち、分子量は453.0×２（価数）＋２（イオン化による脱プロトン数）＝908であることが判明した。また、この分子量から、被検オリゴ糖の構造は二硫酸化四糖であると推定された。
次に、このｍ／ｚ値：453.0の分子量関連イオンについてＭＳ２分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が138.8、402.5、443.9、623.9、665.9等のイオンが観測された。453.0（プリカーサーイオン）×２（価数）−101を２（価）で除した値が402.5であることから、ｍ／ｚ値が402.5のイオンが0,2Ａｒイオンであると決定された。
次に、この0,2ＡｒイオンについてＭＳ３分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が138.8、393.4、665.9等のイオンが観測された。402.5（プリカーサーイオン）×２（価数）−139＝666であることから、ｍ／ｚ値が665.9のイオンが2,4Ａｒイオンであると決定された。
さらに、この2,4ＡｒイオンについてＭＳ４分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が443.9、503.8等のイオンが観測された。ここで推定構造を絞ると、前者は非還元末端側二糖中に硫酸基１個を有する配列（Ｂ２イオン）を示し、後者は還元末端側三糖のうち還元末端ともう１個の硫酸基を持つ配列（Ｙ３イオン）に合致する。両条件に合う配列は、四糖のうち還元末端側から一番目と三番目の糖に硫酸基を持つ構造であることがわかり、未知のオリゴ糖はＬ２Ｌ２であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１において得られたＭＳ１スペクトルデータを示す図である。
【図２】実施例１において得られたＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２スペクトルデータを示す図である。
【図３】実施例１において得られたＭＳ２分析で得られた0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルデータを示す図である。
【図４】実施例１において得られたＭＳ３分析で得られた2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルデータを示す図である。
【図５】ＭＳ１〜ＭＳ４分析において観測されるフラグメントイオンを示す図である。
【図６】ＭＳ４スペクトルデータから判明した各オリゴ糖の開裂様式を示す図である。
【図７】実施例２における被検オリゴ糖のＭＳ１〜ＭＳ４スペクトルデータを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
硫酸化グリコサミノグリカンは、生体内でプロテオグリカンとして存在し、細胞の増殖、移動、分化、組織の形態形成などに重要な役割を担う糖鎖として近年注目されている。ケラタン硫酸は、この硫酸化グリコサミノグリカンの一種であり、ＧａｌとＧｌｃＮＡｃとが結合した２糖単位の繰り返し構造を有している。糖鎖の枝分かれ構造や硫酸基の数によって、種々のケラタン硫酸が知られている。
ケラタン硫酸は、生体内では軟骨や角膜、脳組織等に存在していることが確認されている。ケラタン硫酸の構造解析は、生体におけるケラタン硫酸の機能や様々な疾患との関連性の解明に重要である。
【０００３】
ケラタン硫酸の構造を解析するために、ケラタン硫酸と同様の組成を有するオリゴ糖を同定することが行われている。このオリゴ糖の同定は、従来は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析し、標準物質のピーク位置と照合することにより行われていた。しかし、ＨＰＬＣは、化合物の化学構造よりむしろ性質を反映する手法であり、ピーク位置が標準物質と同じであっても、構造が異なる不純物である可能性もある。
また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置を用いてケラタン硫酸の構造を解析する試みもあるが（非特許文献１参照。）、該手法は配列解析法とは言い難く、しかも比較的多量の試料を必要とする上に長い測定時間を要するという問題がある。
【０００４】
最近の糖鎖の構造解析では、質量分析（ＭＳ）装置を用いた糖の構造決定の研究が活発化している。グリコサミノグリカンでは、コンドロイチン硫酸やヘパリン由来のオリゴ糖のＭＳによる研究が報告されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
また、非特許文献６においては、ケラタン硫酸関連構造を持つ標準オリゴ糖鎖を多段階質量分析（ＭＳｎ分析）し、従来のHPLC分析ではピークが重なり合う可能性のあった種々のオリゴ糖鎖を、その分子量を指標として分別検出すること、更には分子量が同じ糖鎖であっても化学構造の異なるそれぞれを、ＭＳ２、ＭＳ３分析のシグナル・パターンで分別検出できることが報告されている。即ちこれは、標準試料の質量分析によって得られるシグナルのパターン（ＭＳ３まで）を予め標準データとして得ておき、照合型同定により未知試料を同定する方法である。
【０００５】
【非特許文献１】European Journal of Biochemistry, Thomas N. Huckerby et al., Vol. 253, pp. 499-506 (1998)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 73, pp. 6030-3039, No. 24 (2001)
【非特許文献３】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 75, pp. 2445-2455, No. 10 (2003)
【非特許文献４】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 74, pp. 3760-3771, No. 15 (2002)
【非特許文献５】J. American Society Mass Spectrometry, Joseph Zaia et al., Vol. 14, pp. 1270-1281 (2003)
【非特許文献６】Analytical Chemistry, Yuntano Zhang et al., Vol. 77, pp. 902-910, No. 3 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースの交互配列構造を有するケラタン硫酸中には、硫酸化された（硫酸基を持つ）糖残基（Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはガラクトース）と、硫酸化されていない（硫酸基を持たない）糖残基（同）が無秩序に存在し、それらの配列情報を得る方法論は今まで存在しなかった。
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、ケラタン硫酸から得られるオリゴ糖を微量試料で正確かつ迅速に同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の上記目的は、下記手段により解決された。
１．ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
２．前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする上記１に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
３．ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記ＭＳ４分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の同定方法によれば、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトース、及び硫酸化と非硫酸化の情報それぞれを含む糖鎖全体の配列を、微量試料で正確かつ迅速に同定することができる。本発明の同定方法によりケラタン硫酸全長の構造を推定することも可能となり、例えば、軟骨、角膜、脳等の生体組織から得られるケラタン硫酸の構造解析等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る同定方法の対象となるオリゴ糖は、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖であり、ガラクトース（Gal）とＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）とがβ１−４結合した構造を有する。ケラタン硫酸由来のオリゴ糖としては、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖のみならずケラタン硫酸を分解して得たオリゴ糖の一部の糖を除去又は修飾したものも含まれる。また、本発明の同定対象は、還元糖であることが望ましい。
ケラタン硫酸の分解は、化学的な方法（酸加水分解等）や酵素的な方法（ケラタン硫酸分解酵素による分解等）によって行うことができるが、酵素的な方法を用いることが好ましく、ケラタナーゼＩＩを用いることがより好ましい。酵素反応は、用いるケラタン硫酸分解酵素の種類に応じて当業者が適宜設定することができるが、例えばケラタナーゼＩＩを用いる場合、ｐＨ５．０〜７．０、温度３０〜４０℃で、０．１〜４８時間反応させることが好ましい。
【００１０】
ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖は、Gal及びGlcNAcにおける６位のヒドロキシル基の一部又は全部が硫酸化されたオリゴ糖、非還元末端のGalにシアル酸等が結合したオリゴ糖等も含まれ、本発明ではこれらのようなオリゴ糖も同定対象とすることができる。シアル酸としては、Ｎ−アセチルイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が例示される。また、シアル酸とGalとの間の結合は、α２−３結合であることが好ましい。
【００１１】
ケラタン硫酸を上記のように酵素反応を用いて分解すると、通常、種々のサイズの偶数糖を含む混合物が得られる。本発明に係る同定方法では、この偶数糖をさらに酵素処理して得られる奇数糖も同定対象とすることができる。このような酵素としては、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
また、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖における硫酸基を除去したオリゴ糖、非還元末端のシアル酸を除去したオリゴ糖、また、化学的もしくは酵素的に硫酸基を増加せしめたオリゴ糖等も同定対象とすることができる。なお、オリゴ糖の脱硫酸化は、例えば塩酸含有メタノールとの反応（ＷＯ９８／０３５２４号パンフレット記載の方法）によって行うことができる。また、シアル酸の除去は、オリゴ糖の希硫酸処理またはノイラミニダーゼ処理によって行うことができる。硫酸基の増加は、例えば硫酸基転移酵素を用いた反応や、ジメチルホルムアミド中、三酸化硫黄・ピリジン複合体による処理によって行うことができる。
【００１２】
ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖又はこのオリゴ糖を処理したものの具体例としては、以下のものを挙げることができる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
【化２】
【００１５】
本発明の同定方法の対象となるオリゴ糖の糖鎖長は、特に限定されないが、２糖〜１２糖であることが好ましく、２糖〜６糖であることがより好ましい。
また、それらオリゴ糖は精製されていることが好ましいが、種々のケラタン硫酸由来オリゴ糖を含む混合物の場合でも本発明の方法により同定可能である。
【００１６】
本発明に係るオリゴ糖の同定方法では、まず、被検オリゴ糖をＥＳＩ（エレクトロスプレー・イオン化）法によりイオン化させる。
ＥＳＩ法によって被検オリゴ糖をイオン化することにより、被検オリゴ糖の分子量に起因する１種類又は２種類以上のイオン（以下、分子量関連イオンと呼ぶ。）が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検オリゴ糖の分子量を確定することができる。分子量関連イオンの検出はＩＴ（イオントラップ）型分析装置、ＱＩＴ−ＴＯＦ（四重極イオントラップ−飛行時間）型分析装置、またはＦＴ−ＩＣＲ（フーリエ変換イオンサイクロトロン）型分析装置等を用いることが好ましい。ＥＳＩ法によるイオン化するＩＴ型分析装置としては、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。
このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、ＭＳの１乗スペクトル（以下、「ＭＳ１スペクトル」等と略称する。）が得られる。
【００１７】
前記のようにして得られたＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンをプレカーサー・イオンとしてフラグメンテーションを行い、フラグメントイオンを生成させて検出することにより、ＭＳ２分析を行う（これにより「ＭＳ２スペクトル」が得られる。）。ここで、本発明ではＥＳＩ法によりイオン化するために、ＭＳ１スペクトルにおいては種々の価数の分子量関連イオンを生じ得るが、ＭＳ２分析では、硫酸基の数に等しい価数のイオンを分析対象とすることが好ましい。
ＭＳ２分析により、シアル化オリゴ糖は脱シアル酸が起きるため、その分子量変化よりオリゴ糖の非還元末端にシアル酸が導入されていたことを同定することができる。また、殆どのオリゴ糖鎖で下記のように脱水イオンと0,2Ａｒイオン（Domon, B.; Costello, C.E. Glycoconjugate Journal 1988, 5, 397-409、ここでは特に還元末端をｒとして示した。具体例を図５に示す。）が観測される。
【００１８】
【化３】
【００１９】
本発明に係る同定方法では、この0,2ＡｒイオンをさらにフラグメンテーションさせることでＭＳ３分析する（ＭＳ３スペクトルが得られる。）。ＭＳ２分析で得た0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルでは、還元末端糖以外の糖に電荷があれば必ず2,4Ａｒイオンを生じる。
【化４】
【００２０】
ここで、0,2Ａｒイオンとは、還元末端糖残基における糖環内酸素と１位炭素間の結合ならびに２位炭素と３位炭素間の結合の二つの結合が切断されて生じた、 非還元末端糖を含むフラグメントイオンを指す。
また、2,4Ａｒイオンとは、還元末端糖残基における２位炭素と３位炭素間の結合ならびに４位炭素と５位炭素間の結合の二つの結合が切断されて生じた、非還元末端糖を含むフラグメントイオンを指す。
これらのイオンは、Cross-ring cleavageイオンと呼ばれるイオンである。
【００２１】
さらに、ＭＳ３分析において観測された2,4ＡｒイオンをフラグメンテーションさせることでＭＳ４分析する（ＭＳ４スペクトルが得られる。）。
本発明の同定方法では、このＭＳ３及びＭＳ４分析操作において、必ず0,2Ａｒイオン及び2,4Ａｒイオンをそれぞれ各プレカーサー・イオンとしてフラグメンテーションさせることが重要である。
【００２２】
ＭＳ２スペクトル中のどのシグナルが0,2Ａｒイオンであるか、またＭＳ３スペクトル中のどのイオンが2,4Ａｒイオンであるかは、以下の計算方法で確定することができる。
即ち、ＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンに沿って観測される同位体イオンのｍ／ｚ値から、そのイオンの価数（ｚ）が決定される。本発明の測定条件に従う限りは、化合物構造中の硫酸基の数と、価数ｚが同値となる。すなわち、天然炭素中には１２Ｃのほかに１３Ｃが１％程度含まれるため、糖のように炭素を持つ化合物の場合は、質量が大きいシグナルが同時に弱めに観測される。仮に、分子量１００の化合物の場合には１０１にもシグナルが現れることになる。これが硫酸基を２個持って二価になった場合、ｍ／ｚ値が二分の一になるので、５０．０と５０．５にシグナルが観測され、これを読むことによって硫酸基の数を決めることができる。
このｚ値を分子量関連イオンのＭＳ１スペクトルにおけるｍ／ｚ値に乗じることで測定するケラタン硫酸オリゴ糖の分子量ｍが決定される。逆に言えば、測定化合物の分子量を硫酸基の数で除した値のｍ／ｚ位置に、分子量関連イオンが観測される。ＭＳ２スペクトルにおいて観測される0,2Ａｒイオンは、分子量ｍ値として必ず101だけ小さくなるため、実際のＭＳ２スペクトル中に化合物分子量から101を減じ、それを硫酸基数で除した値のｍ／ｚ位置に観測されるのが0,2Ａｒイオンである。
また、ＭＳ３スペクトルにおいて生じる2,4Ａｒイオンは、分子量ｍ値として60（還元末端糖が硫酸化されていない場合）もしくは139（還元末端糖が硫酸化されている場合）だけ必ず小さくなるため、実際のＭＳ３スペクトル中に化合物分子量から60もしくは139を減じ、それを硫酸基数で除した値のｍ／ｚ位置に観測されるのが2,4Ａｒイオンである。
【００２３】
このようにして得た2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルは、ＭＳ２、ＭＳ３スペクトルとは異なり、種々の位置のグリコシド結合が切断されたイオンのシグナルを与えることが判明した。すなわち、2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルでは、アルデヒドのような活性基を持たないためグリコシド結合の切断が随所で起こり、グリコシドの切断様式によって、Ｂイオン、Ｃイオン、Ｙイオン、Ｚイオンと称されるグリコシド結合切断イオン（Domon, B.; Costello, C.E. Glycoconjugate Journal 1988, 5, 397-409、具体例を図５に示す。）が生じる。糖鎖の配列を解読するには、各糖残基間のグリコシド結合単位が切断されて得られるこのような情報が最も有用であり、配列解析が可能となる。
【００２４】
即ち、以下の手順により糖鎖の配列解析を行うことができる。
まず、ＭＳ４スペクトルにおけるそれぞれのイオンのｚ値（イオンの価数）を読み、その値をｍ／ｚ値（質量電化比）に乗じることで、各々のイオンのm値（質量）を決定することができる。
次に、ＭＳ４スペクトル上には複数のフラグメントイオンが観測されることが通常であるから、複数のフラグメントイオンのm値を算出し、任意の二つのイオンのｍ値の差（質量差）が203（N−アセチルグルコサミンの分子量221からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値）であればＮ−アセチルグルコサミン、162（ガラクトースの分子量180からグリコシド結合に伴う脱水分18を除した値）であればガラクトースが、双方の構造の違い（配列上の差）となっていることを示す。
さらに、ある糖残基が硫酸化されている場合には、m値に79（水酸基と硫酸基の差）の差を生じるため、任意の糖残基の６位の水酸基が硫酸化されているか否かも同時に解読することができる。（ケラタン硫酸の場合、硫酸基の位置はＮ−アセチルグルコサミンとガラクトースのどちらの場合でも、６位水酸基上であることが既に知られている。）
【００２５】
最終的には、全てのフラグメントイオンのｍ値の差（質量差）の情報から元の配列を再構成し、その分子量がＭＳ１スペクトルから得られる分子量と矛盾しないことを確認しておくことが望ましい。
【００２６】
なお、上記に説明した方法では、ＭＳ３分析では0,2Ａｒイオンのみについて行ったが、これに合わせてＭＳ２分析で得た脱水イオンについてもＭＳ３分析を行ってもよい。この脱水イオンのＭＳ３スペクトルのｍ／ｚ値：183.9（Y1-OSO3H）のイオンが生じる場合、還元末端６位が硫酸化されていることがわかる。
さらに、オリゴ糖の官能基分布を解析する場合は、ＭＳ５以降の分析が必要と考えられる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
［実施例１］
（オリゴ糖の入手及び調製）
（１）Ｌ１は生化学工業株式会社より、ＳＬ１はフナコシ株式会社より購入した。
【００２８】
（２）Ｌ２、Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ４Ｌ４、ＳＬ２Ｌ４、Ｌ２Ｌ２Ｌ２の調製
ウシ角膜由来のケラタン硫酸Ｉ（生化学工業株式会社製）又はサメ軟骨由来のケラタン硫酸ＩＩ（生化学工業株式会社製）の１ｍｇ/２００μl水溶液に、０．１Ｍの酢酸緩衝液で稀釈したケラタナーゼＩＩ（生化学工業株式会社より入手）を１ｍＵ/μｌ加え、ｐＨ５．０、３７℃で２時間反応させた。
この反応溶液を分画分子量１００００の遠心フィルター（ミリポア社製）にかけて高分子量成分を取り除き、得られた溶出液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で２分毎に分画した（５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ：６．０、０．１ｍｌ／ｍｉｎ）。ＧＰＣカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ 10/300ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。
【００２９】
（３）Ｌ２Ｌ４の調製
ＷＯ９６／１６９７３号パンフレットに記載の方法によって調製した。
【００３０】
（４）Ｇ４Ｌ２、Ｇ４Ｌ４の調製
上記（２）で得られたＬ２Ｌ２及びＬ２Ｌ４をそれぞれ特開２０００−２５６３８５号公報に記載の如くβ−ガラクトシダーゼで処理することによって調製した。
【００３１】
（５）Ｌ３、Ｇ１Ｌ１、Ｌ１Ｌ１の調製
Ｌ３は特開２００１−０８９４９３号公報に記載の方法、Ｇ１Ｌ１及びＬ１Ｌ１はＷＯ９８／０３５２４号パンフレットに記載の方法によって、それぞれ調製した。
【００３２】
（オリゴ糖のＭＳスペクトルの測定）
上記で得られたオリゴ糖のＭＳｎ分析を行った。まず、上記オリゴ糖を、酢酸の終濃度が１ｍＭかつメタノール含量が５０％の溶媒に、１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように溶解し、マイクロシリンジを用いて３６０μＬ／時間の速度で装置に注入した。その際のキャピラリー電圧は−３．８ｋＶであり、窒素ドライガスの速度を4.0 L/min、キャピラリー温度は３００°Ｃに設定した。
ＭＳｎ分析は、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）を用い、ネガティヴ・イオン・モードで測定した。
ＭＳ２分析は、ＭＳ１分析において観測された分子量関連イオン（［Ｍ−ｎＨ］ｎ−フラグメントイオン）を、１．００Ｖのフラグメント・エネルギーでフラグメンテーションすることによって生じたフラグメントイオンを観測することによって得た。なお、ＭＳ１スペクトル上においてイオン化に伴って脱硫酸化もしくは脱シアル化が認められたＬ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ４及びＳＬ２Ｌ４については、前記の酢酸濃度を前記の１／１０に設定して測定した。
ＭＳ２分析において観測された種々のイオンのうち、0,2ＡｒイオンをＭＳ３分析した。さらに、ＭＳ３分析において観測された種々のイオンのうち2,4ＡｒイオンをＭＳ４分析した。
【００３３】
以上のＭＳｎ分析によって得られたＭＳスペクトルのデータを図１〜４に示す。図１は、ＭＳ１スペクトルのデータ、図２は、ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２スペクトルのデータ、図３は、ＭＳ２分析で得られた0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルのデータ、図４は、ＭＳ３分析で得られた2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルのデータを示している。
図４に示すＭＳ４スペクトルにおいて、Ｌ３、Ｌ４、Ｇ４Ｌ２、Ｇ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２、Ｌ２Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、Ｌ２Ｌ２Ｌ２では、オリゴ糖鎖の配列に対応した開裂様式が観測されることがわかった（図６）。これにより、2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルデータから、ケラタン硫酸由来のオリゴ糖を同定できることがわかる。
【００３４】
［実施例２］
次に、上記実施例で用いたオリゴ糖のうち任意に１種類のオリゴ糖を選び、配列が未知のオリゴ糖を同定した例を示す。なお、本実施例において得られたＭＳｎスペクトルのデータを図７に示す。
まず、この被検オリゴ糖を上記実施例１と同様にしてＭＳ１スペクトルを得た。ＭＳ１スペクトルにおけるｍ／ｚ値は453.0であった。なお、同位体イオンがｍ／ｚ値は453.5に確認されたことから、この被検オリゴ糖は硫酸基を２個持ち、分子量は453.0×２（価数）＋２（イオン化による脱プロトン数）＝908であることが判明した。また、この分子量から、被検オリゴ糖の構造は二硫酸化四糖であると推定された。
次に、このｍ／ｚ値：453.0の分子量関連イオンについてＭＳ２分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が138.8、402.5、443.9、623.9、665.9等のイオンが観測された。453.0（プリカーサーイオン）×２（価数）−101を２（価）で除した値が402.5であることから、ｍ／ｚ値が402.5のイオンが0,2Ａｒイオンであると決定された。
次に、この0,2ＡｒイオンについてＭＳ３分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が138.8、393.4、665.9等のイオンが観測された。402.5（プリカーサーイオン）×２（価数）−139＝666であることから、ｍ／ｚ値が665.9のイオンが2,4Ａｒイオンであると決定された。
さらに、この2,4ＡｒイオンについてＭＳ４分析を行ったところ、ｍ／ｚ値が443.9、503.8等のイオンが観測された。ここで推定構造を絞ると、前者は非還元末端側二糖中に硫酸基１個を有する配列（Ｂ２イオン）を示し、後者は還元末端側三糖のうち還元末端ともう１個の硫酸基を持つ配列（Ｙ３イオン）に合致する。両条件に合う配列は、四糖のうち還元末端側から一番目と三番目の糖に硫酸基を持つ構造であることがわかり、未知のオリゴ糖はＬ２Ｌ２であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１において得られたＭＳ１スペクトルデータを示す図である。
【図２】実施例１において得られたＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２スペクトルデータを示す図である。
【図３】実施例１において得られたＭＳ２分析で得られた0,2ＡｒイオンのＭＳ３スペクトルデータを示す図である。
【図４】実施例１において得られたＭＳ３分析で得られた2,4ＡｒイオンのＭＳ４スペクトルデータを示す図である。
【図５】ＭＳ１〜ＭＳ４分析において観測されるフラグメントイオンを示す図である。
【図６】ＭＳ４スペクトルデータから判明した各オリゴ糖の開裂様式を示す図である。
【図７】実施例２における被検オリゴ糖のＭＳ１〜ＭＳ４スペクトルデータを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【請求項２】
前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする請求項１に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【請求項３】
ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記ＭＳ４分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【請求項１】
ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、グリコシド結合切断イオンを得る工程とを含み、
前記グリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【請求項２】
前記グリコシド結合切断イオンを得る工程において、前記分子量関連イオンのフラグメンテーションを行うことによりCross-ring cleavageイオンを得て、さらに、前記Cross-ring cleavageイオンのフラグメンテーションを行うことによりグリコシド結合切断イオンを得ることを特徴とする請求項１に記載のケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【請求項３】
ケラタン硫酸由来の被検オリゴ糖をエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法でイオン化して多段階質量分析（ＭＳｎ分析）することにより糖鎖配列の解析を行うケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法であって、
前記被検オリゴ糖のＭＳ１分析を行い、分子量関連イオンを得る工程と、前記ＭＳ１分析で得られた分子量関連イオンのＭＳ２分析を行い、０，２Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ２分析で得られた０，２ＡｒイオンのＭＳ３分析を行い、２，４Ａｒイオンを得る工程と、前記ＭＳ３分析で得られた２，４ＡｒイオンのＭＳ４分析を行い、グリコシド結合切断イオンを得る工程と、を含み、
前記ＭＳ４分析により得られたグリコシド結合切断イオンのスペクトルデータから前記糖鎖配列の解析を行うことを特徴とするケラタン硫酸由来のオリゴ糖の同定方法。
【図１】
【図５】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図５】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２９２６８３（Ｐ２００６−２９２６８３Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１７３６７（Ｐ２００５−１１７３６７）
【出願日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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