ケラチノサイト増殖因子の治療用製剤
本発明は、長期間安定な凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子の製剤およびケラチノサイト増殖因子を含む凍結乾燥組成物を作製する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥したケラチノサイト増殖因子製剤、及びケラチノサイト増殖因子を含む凍結乾燥組成物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は、上皮細胞に特異的な増殖因子であり、ヒト胎児の肺繊維芽細胞の細胞系の条件培地中に先ず特定された［Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８０２−８０６（１９８９）］。ＫＧＦのメッセンジャーＲＮＡ発現は、様々な発生段階にある上皮組織から得られた種々の間質繊維芽細胞の細胞系において検出されている。ＫＧＦへの転写は、健康な成人の腎臓及び胃腸管の器官から抽出されたＲＮＡにおいて明らかにされた［Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７５２−７５５（１９８９）］。ＫＧＦが繊維芽細胞から培養液中に分泌されおよび生体内で表皮ではなく真皮において発現している事実は、ＫＧＦがケラチノサイト増殖の重要な標準パラクラインエフェクターである可能性を示唆している。各研究により、ＫＧＦは、組織培養中の初代または第二世代ヒトケラチノサイトの増殖を促進させる点において、上皮成長因子（ＥＧＦ）と同様の効果を奏することが報告されている ［Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓ． １４４：３２６−３３２ （１９９０）］。ＫＧＦは、上皮、口腔および下部消化管上皮、膵臓、肝臓、肺、尿路上皮、前立腺上皮ならびに他を含む種々の器官の上皮近隣の間葉細胞により産生される ［Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ， 上掲， Ｈｏｕｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１７６４−７７， （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ． １４５：８０−８５， （１９９４）； Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９８３１−４０， （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｕｒｏｌ． １５４：１５６６−７０， （１９９５）； ａｎｄ Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：１２９８−１３０６， （１９９４）］。
【０００３】
国際公開ＷＯ ９０／０８７７１には、ヒト胎児繊維芽細胞の細胞系の条件培地からのＫＧＦの精製、精製されたＫＧＦの部分アミノ酸配列、ＫＧＦ遺伝子のクローニングおよび生物学的に活性な組換えＫＧＦを得るための遺伝子の発現が記載されている。この国際公開はまた、ＫＧＦ又はＫＧＦ様ポリペプチドは、火傷の創傷治療剤としてまたは被移植角膜組織を刺激するために有用であることを開示している。
【０００４】
健康な成体動物を用いた生体外及び生体内の各研究では、ＫＧＦ−１（以下において「ＫＧＦ」）は、毛嚢形態発生、肝細胞増殖ならびに肺、胸部、膵臓、胃、小腸および大腸での上皮細胞増殖に変化を生じさせることが示されている［Ｐａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２：９６９−９７７ （１９９３）； Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １４４：８６２−８６８ （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １４５：８０−８５ （１９９４）； ａｎｄ Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：１２９８−１３０６ （１９９４）］。胎児又は新生児の発生におけるＫＧＦの役目については現在のところ調査中である。しかしながら、ＫＧＦは新生マウスの精嚢発生の重要なメディエーターであることが示された［Ａｌａｒｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４−１０７８ （１９９４）］。加えて、肝細胞内でＫＧＦを過剰発現するマウスでは、多嚢胞性腎を呈し［Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：２１０９−１９， （１９９６）］、さらにサーファクタントプロモーターを用いてＫＧＦを肺において過剰発現させると、肺嚢胞腺腫を有するマウスを生じる結果となり［Ｓｉｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１２４６１−６５ （１９９５）］、腎臓と肺の正常な発生におけるＫＧＦの重要性を示している。
【０００５】
ＫＧＦは、ウサギの耳またはブタの皮膚に外科的に施された傷に、組換えＫＧＦを局所的に適用した場合、再上皮化を増加させ、上皮の厚さを増大させることが示されている［Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：８３１−８４０ （１９９４）； Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：８６５−８７８ （１９９３）］。Ｂｏｓｃｈらは［Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２６８３−２６８７ （１９９６）］、ケラチノサイト増殖因子の投与が、肝臓細胞の増殖を促すことを報告した。
【０００６】
通常、精製されたポリペプチドは、水溶液中の状態では、ほんのわずかしか安定でなく、化学的に物理的な分解を起こし、加工および保存の間に生物学的活性の損失をもたらす。加えて、水溶液中のポリペプチド構成物は、脱アミドおよびペプチド結合の開裂などの加水分解を受ける。これらの作用は、生物学的活性に基づいて決定された投与量の範囲内で人に投与することが意図された、治療活性のあるポリペプチドにとって重大な課題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
精製されたケラチノサイト増殖因子の投与は、依然、ヒト集団を冒す多くの病気を処置するための有望な候補である。しかしながら、多様な保存条件の下で長期に渡り安定な医薬組成物であり続け、したがって患者にとって生体内で有効であるという、ＫＧＦの能力に関しては、未だ取り上げられていない。このように、ＫＧＦの媒介による上皮細胞の増殖の刺激により利益をもたらし、種々の病気を処置する治療剤として有用な、安定した製剤であるケラチノサイト増殖因子を提供する必要が、この技術分野において依然残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高度に安定なケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産物をもたらす、ケラチノサイト増殖因子の凍結乾燥のために有用な、新規な製剤を提供する。この安定なＫＧＦは、ＫＧＦの投与が利益をもたらす病気または状態を患っている個体の処置の治療のための治療剤として有用である。
【０００９】
一形態において、本発明は、ヒスチジン、充填剤、界面活性剤および糖類（例えば安定化糖）を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を提供する。
【００１０】
一実施形態において、このＫＧＦ組成物は、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体を含む。ＫＧＦタンパク質の変異体は、天然型ＫＧＦの断片、キメラ分子またはハイブリド分子を含み、対立遺伝子変異体、アミノ酸が除去され、置換され又は挿入されたものが挙げられる。例えば、本発明は、ＫＧＦが天然型ＫＧＦの最初の２３個のアミノ酸が除去されているΔＮ２３ ＫＧＦ（配列番号３）であることを意図している。変異体は、天然型ＫＧＦ（配列番号２）の第４１からし１５４番目のアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が除去された、またはタンパク質の正電荷を減少させる作用を及ぼすように選ばれた中性残基または負に帯電した残基により置換された電荷−変化ポリペプチドなどの、ここで述べられている分子を含む。ＫＧＦのさらなる例は、これらに限られるものではないが、天然型ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域中の少なくとも１つのアミノ酸を、少なくとも１つのより高いループ形成能を有するアミノ酸により置換されて作製されたタンパク質を含む。さらなる例は、天然型ＫＧＦの第１２３から１３３番目（配列番号２の第１５４から１６４番目のアミノ酸）のアミノ酸領域内において、１つまたは複数のアミノ酸の置換、除去又は付加を有するタンパク質が挙げられる。
【００１１】
一形態において、本発明は、充填剤／浸透圧調整剤の使用を意図する。充填剤は結晶性（例えば、グリシン、マンニトール）又は非結晶性（例えば、Ｌ−ヒスチジン、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースおよびラクトース）のいずれかであり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。さらなる実施形態において、このマンニトールは、約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度で混合される。さらなる実施形態において、この濃度は、約３％ないし４．５％ｗ／ｖである。別の実施例において、このマンニトールは、４％ｗ／ｖの濃度である。
【００１２】
他の形態において、本発明は、安定化糖を含む組成物を提供する。使用が意図される糖は、これらに限られるものではないが、スクロース、トレハロース又はグリシンを包含する。一実施形態において、この糖はスクロースである。関連する実施形態において、このスクロースは約１−３％ｗ／ｖの濃度にある。さらなる実施形態において、このスクロースは２％の濃度である。
【００１３】
本発明の組成物は、ｐＨが約５．０から約８．０の範囲に調製されることを意図する。一実施形態において、このＫＧＦ組成物は約６．０から約８．０の範囲のｐＨを有する。別の実施形態において、この組成物は約６．０から約７．０の範囲のｐＨを有する。さらなる実施形態において、この組成物は約６．５のｐＨを有する。
【００１４】
さらなる形態において、この組成物は、界面活性剤の使用を意図している。使用される界面活性剤は、これらに限られるものではないが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０を意図する。一実施形態において、この界面活性剤は、ポリソルベート２０である。関連する実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．１％ないし約０．００４％ｗ／ｖの範囲内にある。さらなる実施形態において、前記ポリソルベート２０の濃度は、約０．０１％ｗ／ｖである。
【００１５】
一形態において、本発明は、ｐＨ６．５における、１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロース及び０．０１％ポリソルベート２０を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を意図する。
【００１６】
さらに、本発明は、ａ）ヒスチジン、充填剤、安定化糖および界面活性剤の溶液を調製する段階ならびにｂ）ＫＧＦを凍結乾燥する段階を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作製方法を提供する。関連する形態として、本発明は、凍結乾燥の前に、ｂ）溶液のｐＨを約６．０から約８．０に調整する段階、ｃ）ケラチノサイト増殖因子を含む溶液を調製する段階、ｄ）段階（ｃ）の溶液を段階（ｂ）の溶液へとバッファー交換を行う段階、ｅ）適切な量の界面活性剤を添加する段階ならびにｆ）段階（ｅ）からの混合物を凍結乾燥する段階をさらに含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作製方法を意図する。さらに、このＫＧＦは、配列番号２又は配列番号３に呈示されているＫＧＦタンパク質またその変異体であり得ることが意図されている。
【００１７】
一形態において、本発明の方法は、充填剤／浸透圧調整剤の使用を意図し、この充填剤は結晶性（例えば、グリシン、マンニトール）又は非結晶性（例えば、Ｌ−ヒスチジン、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースおよびラクトース）であり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。他の実施形態において、このマンニトールは約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度である。関連する実施形態において、このマンニトールは約３％ないし４．５％ｗ／ｖの濃度である。さらなる実施例において、このマンニトールは、４％ｗ／ｖの濃度である。
【００１８】
他の形態において、本発明の方法は、糖を含む組成物を提供し、この糖は安定化糖である。使用を意図される糖は、これらに限られるものではないが、スクロース、トレハロース又はグリシンを包含する。一実施形態において、この糖はスクロースである。関連する実施形態において、このスクロースは約１％ないし約３％ｗ／ｖの濃度にある。さらなる実施形態において、このスクロースは２％の濃度である。
【００１９】
本発明の方法において、ｐＨは生理学的ｐＨに調整されることを意図する。一実施形態において、このｐＨは約５．０から約８．０の範囲に調製される。別の実施形態において、このｐＨは約６．０から約８．０の範囲に調整される。さらなる実施形態においては、このｐＨは約６．０から約７．０の範囲に調整される。さらなる実施形態において、このｐＨは、６．５のｐＨ値に調整される。
【００２０】
さらなる形態において、本発明の方法は、界面活性剤の使用を意図している。使用される界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０が意図されるが、これらに限られない。一実施形態において、この界面活性剤は、ポリソルベート２０である。関連する実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．１％ないし約０．００４％ｗ／ｖの範囲内にある。さらなる実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．０１％ｗ／ｖである。
【００２１】
一形態において、本発明は、ｐＨ約６．５である、１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロース及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子組成物の作製方法が意図される。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子組成物の有効量を対象に投与することを含む、ＫＧＦにより媒介される上皮細胞増殖の刺激を増大させることによる、疾患を治療する方法を意図する。
【００２３】
治療される疾患は、腸毒性；粘膜炎；火傷もしくは他の非全層型および全層型の損傷；毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖；付属器構造の増殖；表皮水疱症；化学療法による脱毛症；男性型の禿頭症；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；びらん性胃炎、食道炎もしくは食道逆流；炎症性腸疾患；肺硝子膜症；煙吸入による損傷；気腫；肝硬変、肝不全、急性ウイルス肝炎および他の肝臓の毒性傷害；または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）が意図されている。
【００２４】
本発明は、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を含む第１の容器とおよび生理学的に許容される凍結乾燥組成物用の復元溶液を含む第２の容器とを含む、水性医薬組成物を調製するためのキットもまた意図している。ＫＧＦタンパク質は、配列番号２又は配列番号３に呈示されているものまたはその変異体であり得ることが意図されている。生理学的に許容される復元溶液は、いかなる医薬的に許容される担体または希釈剤でもよく、以下に限定されるものではないが、いかなるおよび全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などならびにここに開示されている薬剤を包含する。加えて、このＫＧＦ組成物は、担当医により適切であると考えられる投与法であれば、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、噴霧剤の吸引による投与、経膣投与、直腸投与又は頭蓋内注射を含むいかなる方法でも患者に投与することができる。ここで用いられる「非経口投与」という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射または点滴による方法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜内、球後、肺内の注射および／または適所への外科的移植による投与も意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、安定なタンパク質産物を提供して、精製されたタンパク質の保存寿命を上昇させる、精製されたケラチノサイト増殖因子の凍結乾燥のための製剤に関する。さらに、本発明は、ケラチノサイト増殖因子を含む、凍結乾燥された組成物の作製方法を提供する。
【００２６】
ここで、「ケラチノサイト増殖因子」または「ＫＧＦ」は、ケラチノサイト増殖因子ポリペプチド（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００９）又は配列番号２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０００）に記述されているポリペプチド又はΔＮ２３ ＫＧＦ（配列番号３）などのこれらの類似体又はケラチノサイト増殖因子受容体に結合してこれを活性化させる因子を指す。好ましい実施形態において、ＫＧＦはΔＮ２３ ＫＧＦであり、これは、成熟ＫＧＦからのＮ末端の最初の２３個のアミノ酸が除去された（シグナル配列が付加されていないもの）、組換えにより作製された形のＫＧＦである。例えば、米国特許第５，６７７，２７８号、第６，６７７，３０１号、第６，０７４，８４８号、第５，８４３，８８３号、第５，８６３，７６７号及び第５，７７３，５８６号（全てＣＨＩＲＯＮ Ｃｏｒｐに付与されている。）、米国特許第５，７３１，１７０号及び１９９０年８月９日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９０／０８７７１（完全長ＫＧＦおよび変異体に関する）；及び１９９６年４月２５日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９６／１１９４９；１９９６年４月２５日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９６／１１９５１；及び１９９８年６月１１日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９８／２４８１３（ＫＧＦの安定な類似体に関する）を参照。以上の全ては、その図も含めて、本明細書に組み入れられる。
【００２７】
天然のＫＧＦに対し増大された安定性を有するＫＧＦの類似体は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９６／１１９５１および米国特許第６，６７７，３０１号に記載されており、このようなＫＧＦは本発明により意図される。あるいは、完全にまたはは部分的でも、ＫＧＦ活性を残している、完全長ＫＧＦポリペプチドのいかなる断片またはその類似体も意図される。
【００２８】
本明細書にて用いられる「ケラチノサイト増殖因子」及び「ＫＧＦ」という用語は、特に指示のない限り、天然型ＫＧＦのペプチド配列の全長またはその部分と実質的に同じペプチド配列により特徴づけられる、および、天然型ＫＧＦの生物学的活性（特に非繊維芽細胞上皮細胞の増殖、例えば、Ｈ−チミジンの取り込みにより定義される、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の刺激よりもＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の少なくとも５００倍以上大きな刺激を示す活性およびＢＳ／５８９上皮細胞もしくはＣＣ１２０８上皮細胞の刺激よりもＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の少なくとも５０倍以上の大きな刺激を示す活性）の全てまたはいくらかを維持していることにより特徴づけられる、天然型ＫＧＦおよびＫＧＦ類似体タンパク質（または「変異体」）を含み、交換可能に意味することが意図されていることが了解されるべきである。本発明は、また、ここに例示されている穏やかな条件から非常に緊縮なハイブリド形成条件下にて、配列番号１のコード領域にハイブリド形成可能なＤＮＡ配列によりコードされているペプチドを指す、「天然型ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により特徴づけられる」ペプチドを意図している。
【００２９】
ハイブリド形成という文脈において、緊縮な条件とは、塩、温度、有機溶媒およびハイブリド形成反応において一般に制御される要素の複合的な緊縮条件である。典型的な緊縮なハイブリド形成条件は、６２℃ないし６７℃にて、４ｘＳＳＣにおけるハイブリド形成、続いく６２℃ないし６７℃にて０．１ｘＳＳＣ中での約１時間の洗浄が挙げられる。あるいは、典型的な緊縮なハイブリド形成条件は、４０℃ないし４５℃にて４５ないし５５％ホルムアルデヒド、４ｘＳＳＣにおけるハイブリド形成が挙げられる［Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， 「分子クローニング、実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）， 第３８７頁ないし３８９頁参照］。
【００３０】
ＫＧＦタンパク質は、天然型ＫＧＦの断片、キメラまたはハイブリドＤＮＡ分子を含む、対立遺伝子変異、またはアミノ酸の除去、置換又は挿入を含む。この発明の好ましいＫＧＦ分子はΔＮ２３ ＫＧＦである。他のＫＧＦの例は、これらに限られるものではないが、配列番号２のＣｙｓ１およびＣｙｓ１５に対応する残基が、得られた分子が親分子と比較して改善された安定性を有する、置換されているまたは除去されている（同じ所有の米国特許６，００８，３２８に開示されているごとく）タンパク質を含む。他のＫＧＦの例は、天然型ＫＧＦの第４１ないし１５４番目のアミノ酸（好ましくはＡｒｇ４１，Ｇｌｎ４３，Ｌｙｓ５５，Ｌｙｓ９５，Ｌｙｓ１２８，Ａｓｎ１３７，Ｇｌｎ１３８，Ｌｙｓ１３９，Ａｒｇ１４４，Ｌｙｓ１４７，Ｇｌｎ１５２，Ｌｙｓ１５３またはＴｈｒ１５４の残基）の１つまたはそれ以上が、除去されているまたはタンパク質の正電荷を減少させる作用を及ぼすように選択された中性の残基または負の電荷を帯びた残基により置換されている電荷変化ポリペプチドが挙げられるが、これらに限られるものではない。ＫＧＦのさらなる例として、天然ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域中（米国特許６，００８，３２８に開示されるがごとく）の少なくとも１つのアミノ酸を少なくとも１つのより高いループ形成能を有するアミノ酸により置換して作製されたタンパク質が挙げられるが、これらに限られるものではない。さらなる例として、天然型ＫＧＦの第１２３ないし１３３番目のアミノ酸領域（配列番号２の第１５４ないし１６４番目のアミノ酸）において、１または複数のアミノ酸の置換、除去又は付加を有するタンパク質が挙げられる。
【００３１】
具体的に意図されるＫＧＦタンパク質は、以下のＫＧＦ分子が挙げられる（配列番号２に示す成熟タンパク質（シグナル配列を差し引いたもの）中の位置に存在する残基により参照され、次に括弧内にアミノ酸位置が続き、さらに置換された残基または除去を示す「−」が続いている。）；ＫＧＦのΔＮ１５、ΔＮ１６、ΔＮ１８、ΔＮ２３、ΔＮ２４、ΔＮ２５、ΔＮ２６又はΔＮ２７、Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５‐ΔＮ２４、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ８／Ｃ（１５）−、Ｃ（１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ；Ｒ（１４４）ＱおよびＨ（１１６）Ｇ。
【００３２】
上皮および内皮細胞の多くの異なる種類に対するＫＧＦの増殖作用は、個体を冒す多くの状態又は疾患の処置における有用な治療薬であることを示唆している。下記は、本発明のＫＧＦを用いて処置することができる疾患および医学的状態についての説明である。
【００３３】
腸毒性は、放射線療法および化学療法の主な限定要因である。ＫＧＦによる事前処理は、小腸粘膜の細胞保護効果を有し得、腸毒性の可能性ある致命的副作用を減少させて、このような治療法の放射線量又は投与量を増加させることを可能にしよう。最近の、化学治療剤５‐フルオロウラシルによる処置前の、組換えヒトＫＧＦの患者への投与の第一相臨床試験は、ＫＧＦによる処置は粘膜炎の発生率を低下させることを示唆している［Ｍｅｒｏｐｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２１：１４５２−８（２００３）］。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、放射線誘発腸毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｗｉｔｈｅｒｓ ａｎｄ Ｅｌｋｉｎｄ， 「放射線に曝露されたマウス腸粘膜細胞のための微小コロニー生存率分析」（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｕｃｏｓａ Ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ．， １７：２６１−２６７ （１９７０）］。ヒトへの治療効能を予測可能な、化学療法誘発腸毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｓｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， 「化学療法、口腔外科により誘起された粘膜炎の動物モデル」（Ａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．）， Ｏｒａｌ Ｍｅｄ． Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．， ６９：４３７−４３１ （１９９０）； 及び、Ｍｏｏｒｅ， 「１２種類の細胞障害性薬剤に対するマウス腸陰窩細胞のクローン原性応答」（Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃｒｙｐｔｓ ｔｏ １２ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｒｕｇｓ）， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １５：１１−１５ （１９８５）］。
【００３４】
ＫＧＦ治療は、胃腸管の全体を通して粘液の産生に顕著な効果を有する。この性質は、摂取された有害物質から腸粘膜を保護するためにまたは炎症性腸疾患のような状態において損傷の拡大を制限するために有用であろう。
【００３５】
毛嚢、汗腺および皮脂腺などの付属器構造の増殖および分化の刺激は、火傷ならびに他の非全層型および全層型の損傷を有する患者の表皮および真皮の再生において決定的に重要である。現状において、表面の欠損は、瘢痕化およびケラチノサイトの表面再建により治癒しており、皮膚の完全な再生は未だ可能ではない。現在のところ、火傷を含む全層型の皮膚損傷では、毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖が起きることはない。ＫＧＦの使用は、このような再増殖を可能とし得る。火傷ならびに他の非全層型および全層型の損傷についてヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、付属器構造の増殖および刺激の標準インビボモデルは周知である［Ｍｕｓｔｏｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｄｅｒｍａｌ ｕｌｃｅｒ ｍｏｄｅｌ”， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８７：６９４−７０３ （１９９１）； Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＢＢ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）， ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １， ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｄｅｒｍａｌ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ”， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．， １４０：１３７５−８８ （１９９２）； 及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｇｒｅｅ ｂｕｒｎ ｈｅａｌｉｎｇ： ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ ａｎｄ ａ ｃｒｅａｍ”， Ｊ． ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓ．， ４８：２４５−２４８ （１９９０）］。
【００３６】
表皮水疱症は、表皮の、その下にある真皮への付着の欠損であり、重度の病的状態を引き起こしうる、頻繁な開口、苦痛を伴う水疱を生じる。ＫＧＦによる処置などによる、これら損傷の促進された再上皮形成は、感染の低いリスク、軽減された苦痛、創傷治癒の少ない負担をもたらすであろう。
【００３７】
化学治療誘発性の脱毛症は、患者が悪性腫瘍の化学治療クールによる処置を受けることで発症する。現状において、一時的な毛髪の損失を生じさせる毛根細胞の死滅を防ぐ有効な治療薬はない。ＫＧＦはそのような手法を提供する。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、化学治療誘発性の脱毛症の標準インビボモデルは周知である［Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， 「シクロスポリンＡはヌードマウスにおける発毛を刺激する」（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｈａｉｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ５６（６）：６８４ （１９８７）； Ｈｏｌｌａｎｄ， 「脱毛症の動物モデル」（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｏｐｅｃｉａ”， Ｃｌｉｎ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ， ６：１５９：１６２ （１９８８）； Ｈｕｓｓｅｉｎ， 「ラットモデルにおける化学療法により誘起された脱毛症からの保護」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｏｐｅｃｉａ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１５６４−１５６６ （１９９０）； 及びＨｕｓｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， 「新生ラット動物モデルにおいて、インターロイキン１は、１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンにより誘導された脱毛症に対する保護を与える」（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ １−Ｂ−Ｄ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｕｌｃｙｔｏｓｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｏｐｅｃｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｒａｔ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５１：３３２９−３３３０ （１９９１）］。
【００３８】
男性型禿頭症は、広まっており、本質的に治療不可能である。男性及び女性の進行性の毛髪の喪失は、深刻な美容上の問題である。ＫＧＦ欠損マウスは、逆立って乱れた外被を呈し、ＫＧＦ受容体ノックアウトは、菲薄皮膚、少ない数の毛嚢及び遅延した創傷の治癒を呈する［Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６：８１９−８２２ （１９９４）］。脱毛症の実験モデルでは、組換えＫＧＦの事前処置により、化学治療剤であるシトシンアラビノシド（ＡＲＡ−ｃ）の投与により誘発される脱毛症の約５０％が予防された［Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．， １４７：１４５−５４ （１９９５）］。これらの異常は、ＫＧＦを使用して、全身に、または薬剤が局所投与可能で、頭蓋を通して吸収されるのであれば局所的に、またはエアガン或いはこれに類似した技術を用いて噴霧注射により頭蓋に投与することで、治療することが可能である。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、男性型禿頭症の標準インビボモデルは周知である［Ｕｎｏ，「禿頭症モデルとしてのベニガオザル：ミノキシジルの効果」（Ｔｈｅ Ｓｔｕｍｐｔａｉｌｅｄ Ｍａｃａｑｕｅ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｂａｌｄｎｅｓｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８：６３−７１ （１９８６）； Ｐｏｒｔｅｒ Ｒ．， 「ヒト脱毛疾患のマウスモデル」（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｌｏｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）， Ｊ． Ａｎａｔ．， ２０２：１２５−３１ （２００３）］。
【００３９】
ＫＧＦの投与が、胃腸管の細胞増殖を促進し得たことを研究により示された［Ｐｌａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １８４：３１６−２２ （１９９８）］。胃潰瘍は、Ｈ２拮抗剤により処置可能であるが、かなりの罹患率及び再発生率を生じており、粘膜内層の瘢痕化により治癒される。例えばＫＧＦを用いた処置のように、胃潰瘍患者の腺粘膜をより迅速に再生する能力は、胃潰瘍治療に重要な治療法上の改善をもたらすであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、胃潰瘍の標準インビボモデルは周知であり、例えば、Ｔａｒｎａｗｓｋｉら［「インドメタシンは、実験的胃潰瘍の治癒の質を損なう：定量的組織学的及び超微細構造的分析」（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ Ｉｍｐａｉｒｓ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｕｌｃｅｒ Ｈｅａｌｉｎｇ： Ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ） 、「上部胃腸管の損傷、保護及び修復のメカニズム」（Ｉｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ）， （ｅｄｓ）（編集の意） Ｇａｒｎｅｒ ａｎｄ Ｏ’ｂｒｉｅｎ， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９１）］、及びＡｓｔｕｄｉｌｌｏら［「ラット及びマウスにおいて実験的に誘起された胃病変に対するオレアノール酸誘導体の胃保護効果」（Ｇａｓｔｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ）， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４：５８３−８ （２００２）］である。
【００４０】
十二指腸潰瘍は、胃潰瘍と同様に治療可能であるが、より完全に、より迅速に十二指腸の粘膜内層を再生する治療剤を開発することは重大な進歩であろう。それに加え、これら潰瘍を再生的に治癒し、再発症を低下させる治療剤は有益である。ＫＧＦがこのような能力を提供する。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、十二指腸潰瘍の標準インビボモデルは周知である［Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， 「パントテン酸欠損食餌により形成された十二指腸潰瘍」（Ｄｕｏｄｅｎａｌ ｕｌｃｅｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ａ ｄｉｅｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ”， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７：３７４−３７６ （１９４９）； Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｐｉｈａｎ， 「十二指腸潰瘍のシステアミン及びプロピオニトリルモデルの発生と意義」（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ｕｌｃｅｒ）， Ｃｈｒｏｎｏｂｉｏｌ． Ｉｎｔ．， ６：３１−４２ （１９８７）； Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける十二指腸潰瘍の分泌促進物質の生産」（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔａｔｏｇｕｅｓ ｏｆ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ｕｌｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ５９：９５−１０２ （１９７０）；及びＫｅｓｈａｖａｒｚｉａｎ．， 「ラットにおける、１−メチル −４−フェニル −１，２，５，６−テトラヒドロピリジン （ＭＰＴＰ）により誘起された胃十二指腸潰瘍：胃酸分泌の必要性及びプロスタグランジンの役割」（Ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｕｌｃｅｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （ＭＰＴＰ）： ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）， Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ７０：２１−４８ （１９９０）］。
【００４１】
びらん性胃炎、食道炎または食道逆流などの胃および食道のびらんは、治療可能であるが、より完全に、より迅速に胃および食道の粘膜内層を再生する治療剤を開発することは重大な進歩であろう。加えて、これらびらんを再生的に治癒し、再発症を低下させる治療剤は有益である。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、びらん性胃炎、食道炎または食道逆流などの胃および食道のびらんの標準インビボモデルは周知である［Ｇｅｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， 「ネコにおける、酸により誘起された食道炎の組織学的発達」（Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔ）， Ｍｅｄ−Ｐａｔｈｏｌ．， ３：６１９−６２４ （１９９０）； Ｃａｒｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， 「テトラサイクリンにより誘起された食道潰瘍。臨床及び実験的研究」（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｕｌｃｅｒｓ． Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ）， Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ， ９３：１８４−１８７ （１９８７）； Ｃａｒｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， 「経口投与された薬剤により引き起こされた食道病変。ネコにおける実験的研究」（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇｓ． Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔ）， Ｅｕｒ−Ｓｕｒｇ−Ｅｔｈａｎｏｌ ｏｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃａｔｓ， Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｃｌｉｎ−Ｅｘｐ−Ｒｅｓ．， １５：１１６−１２１ （１９９１）；及びＫａｔｚ ｅｔ ａｌ， 「ネコにおける酸により誘起された食道炎は、スクラルファートにより予防されるがプロスタグランジンＥによっては予防されない」（Ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ ｉｎ ｃａｔｓ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ．”， Ｄｉｇ−Ｄｉｓ−Ｓｃｉ．， ３３：２１７−２２４ （１９８８）］。
【００４２】
クローン病（主に小腸を冒す。）および潰瘍性大腸炎（主に大腸を冒す。）などの炎症性腸疾患は、病因が不明の慢性疾患であり、粘膜面の破壊、炎症、修復中の瘢痕および癒着形成および罹患個体への重度の病的状態を生じる。現段階での治療は、炎症を制御することが計画されているが、ＫＧＦ処置が、炎症性腸疾患に罹患した動物の胃腸管上皮の増殖を誘発することが示されている［Ｈｏｕｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４：１７６４−７７ （１９９４）］。粘膜面の表面形成を刺激し迅速な治癒をもたらすＫＧＦなどの治療薬は、疾患の進行を制御できる点で有用であり得る。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、炎症性腸疾患の標準インビボモデルは周知である［Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， 「ラット結腸における慢性炎症及び潰瘍形成のハプテン誘起モデル」（Ｈａｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ Ｃｏｌｏｎ”， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９６：７９５−８０３ （１９８９）； Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける実験的大腸炎の炎症メディエーター」（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９７：３２６−３２７ （１９８９）； Ａｌｌｇａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける、大腸炎のトリニトロベンゼンスルホンによる誘起の前後における１６，１６“ジメチル−プロスタグランジンＥ２による治療」（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ １６，１６’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｒａｔｓ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９６：１２９０−１３００ （１９８９）； 「総説：動物モデルにおける実験的大腸炎」（Ｒｅｖｉｅｗ： Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ”， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ， ２７：５２９−５３７ （１９９２）］。
【００４３】
未熟児の肺硝子膜症は、肺内のＩＩ型肺胞細胞による界面活性物質の生産も欠如をもたらし、肺胞が虚脱してしまう。肺硝子膜症には、急性期と慢性期の両方がある。急性期の肺硝子膜症（小児型呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ））は、機械換気と８０％ないし１００％の濃度の酸素補給による処置及び外因性表面活性剤の投与により治療できる。長期間の治療クールを受け続ける患者は、慢性疾患期の肺硝子症（気管支肺形成異常（ＢＰＤ））を発症する可能性がある。表面活性物質は、ＩＲＤＳに伴う死亡率を大きく低下させるが、ＢＰＤに伴う罹患率は高く維持されたままである。従って、新生児の肺の成熟および界面界面活性物質分泌を促進し、ＢＰＤの発生率を低下させる効果的な治療法の開発が必要である。コルチコステロイドは、２８週目およびそれ以上に大きな胎児の成熟および分泌を促すことができるが、現在のところ、それよりも未熟な胎児の治療法はなく、この集団に重大な罹患率と死亡率を引き起こしている。ＢＰＤの履歴は、ＩＲＤＳ治療法における改善が、より小さな未熟出生児の機械換気、及び、それに続くこれらより小さな小児のＢＰＤ罹患率の増加に適合していることを示唆している。ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化を促すＫＧＦ［Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２２：３１５−２５ （１９９８）］のような治療剤は、当疾患の治療に大きな利益となるであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、ＩＲＤＳの標準インビボモデルは周知である［Ｓｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ， 「未熟ウサギにおける界面活性剤可動化に対する出産前の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、出産前のコルチコステロイド及び出産後換気の効果」（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｅｎａｔａｌ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ， ａｎｔｅｎａｔａｌ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ， ａｎｄ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｒａｂｂｉｔｓ）， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃ．， １６６：１５５１−１５５９ （１９９２）； Ｉｋｅｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， 「早期産ヒツジ肺機能に対するコルチコステロイド及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの効果」（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｓｈｅｅｐ ｌｕｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ７０：２２６８−２２７８ （１９９１）］。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、ＢＰＤの標準インビボモデルは周知である［Ｙｕｈ−Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ， 「霊長類における、天然の界面活性剤及び超酸化物による肺損傷。Ｉ．生理学及び生化学」（Ｎａｔｕｒａｌ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｉ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ７６：９９１−１００１ （１９９４）、及び Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ．， 「早期産ヒヒにおける肺硝子膜症の予防のための、子宮における界面活性剤置換」（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｉｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂａｂｏｏｎ）， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｔｓｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．， １６９：８１７−８２４ （１９９３）］。
【００４４】
煙吸引は、細気管支上皮と肺胞の壊死により、火傷に次いで、重大な病的状態および一週間以内の死亡を引き起こす重要な原因である。これらの構造の増殖及び分化を刺激し、修復及び再生を誘発するＫＧＦなどの増殖因子は、吸入傷害の治療に有益であろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、煙吸引の標準インビボモデルは周知である［Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ， 「ヒツジにおける煙吸入傷害」（Ｓｍｏｋｅ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｓｈｅｅｐ）， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １３３：６６０−６６３ （１９９８）］。
【００４５】
気腫は、肺胞の進行性喪失により生じる。再増殖を刺激し得または残存する肺胞にとって細胞保護的なＫＧＦ［Ｋａｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０６（１２ Ｓｕｐｐｌ １）： Ｉ１２０−４ （２００２）］のような増殖因子は、治療上有益であろう。現状においては、効果的な治療はない。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、気腫の標準インビボモデルは周知である［Ｓｔｏｌｋ ｅｔ ａｌ， 「ハムスターにおけるリポ多糖の気管内滴下による肺気腫及び気管支粘液細胞過形成の誘起」（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｍｕｃｕｓ ｃｅｌｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｍｓｔｅｒ）， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １６７：３４９−５６ （１９９２）］。
【００４６】
肝硬変は、ウィルス性肝炎及び慢性的アルコール摂取に続く第２期のものであり、重度の病的状態と死亡率の原因である。ＫＧＦの使用などによる、肝機能を増加させるための幹細胞の細胞保護、増殖及び分化［Ｄａｎｉｌｅｎｋｉ， Ｄ．， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ， ２７： ６４−７１ （１９９９）］は、肝硬変の発症を遅らせ又は予防するために有益であろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、肝硬変の標準インビボモデルは周知である［Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， 「ラットにおける肝硬変の生成」（Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ”， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １１：２２９−２３１ （１９９１）］。
【００４７】
劇症肝不全は、命を脅かす状態であり、肝硬変の最終段階にて発症する。現在において、肝臓移植によってのみ処置可能なこの疾患に対し、残存する肝細胞の増殖を促進できるＫＧＦのような薬剤は、直接的な利益となるであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、劇症肝不全の標準インビボモデルは周知である［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， 「アセトアミノフェンにより誘起された肝壊死Ｉ．薬剤代謝の役割」（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｉ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）， Ｊ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １８７：１８５−１９４ （１９７３）； 及びＴｈａｋｏｒｅ ａｎｄ Ｍｅｈｅｎｄａｌｅ， 「ＣＣ１４自己防御における肝細胞再生の役割」（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＣ１４ ａｕｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌ， １９：４７−５８ （１９９１）］。
【００４８】
急性ウィルス性肝炎は、しばしば潜在的であり、自己制御される。しかしながら、少数派の患者においては、重度の肝臓損傷が数週間に渡って生じる。ＫＧＦのような細胞保護剤が、肝細胞の変性予防に有用であろう。
【００４９】
アセトアミノフェン、ハロタン、四塩化炭素および他の毒素により生じる肝臓への毒性傷害は、肝細胞にとって細胞保護的な増殖因子（ＫＧＦ）により改善されようる。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、肝毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， （１９７３）， 上掲，及びＴｈａｋｏｒｅ ａｎｄ Ｍｅｈｅｎｄａｌｅ， （１９９１）， 上掲］。
【００５０】
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）（慢性または急性）は、無力化した骨髄、又は、患者への造血細胞の移植の第一要因である。ＧＶＨＤは、免疫調節及び細胞毒性因子の増加作用により、種々の器官系への損傷を及ぼす。ＧＶＨＤは、胃腸管、肺、肝臓、皮膚ならびに目の粘液腺、口腔内の唾液腺および胃の内壁と腸を滑らかにする腺を含む多くの領域に損傷をもたらす。ＧＶＨＤが誘発された動物を用いた最近の研究は、ｒＨｕＫＧＦで処置されたレシピエントは、腸にＧＶＨＤを発症せず、内毒血症を発生せず、死に至ることがなかったことを示している［Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ ｅｔ ａｌ， 「ケラチノサイト増殖因子は、条件付けにより誘起された組織損傷の修復から独立した機構により、マウス内での同種移植を促進し、対宿主性移植片病を緩和する」（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ）， Ｂｌｏｏｄ， ９６：４３５０−６ （２０００）］。これらのデータは、ＫＧＦが、ＴＮＦ−α、ＮＯ及び他の潜在的な細胞毒性因子が介する上皮細胞の損傷を保護することにより、急性で致命的なＧＶＨＤの発症を防いでいることを示唆している。これら様々なタイプの上皮細胞の増殖を促すＫＧＦのような薬剤は、ヒト移植レシピエントのＧＶＨＤ治療に直接的な利益となるであろう。
【００５１】
製剤と投与
ＫＧＦタンパク質またはペプチドは、前述したヒトの疾患を治療するための医薬製剤として有用である。ＫＧＦは、液体または凍結乾燥された剤形として調製することができる。好ましい実施形態において、ＫＧＦ組成物は凍結乾燥される。凍結乾燥は、当分野において周知の技術により行なうことができ、開発中の組成物用に最適化すべきである［Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， ２１：１９１−２００ （２００４）， 及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， １３：２４３−９ （１９９６）］。
【００５２】
凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、第１乾燥および第２乾燥の３段階から成る［Ａ．Ｐ． Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｓｅｒ Ｂ， Ｂｉｏｌ， ２７８：１６７ （１９７７）］。凍結段階では、溶媒を冷却して、氷形成を開始させ完了させる。さらに、この段階は充填剤の結晶化を引き起こす。真空を用いおよび昇華を促進するために熱を加えて、チャンバー内の圧力を氷の蒸気圧よりも下になるように減圧する第１乾燥段階において、氷は昇華する。最後に、第２乾燥段階において、吸収水または結合水は、減圧されたチャンバー内圧力と上昇した棚温度の下で取り除かれる。この工程により、凍結乾燥ケーキとしてしられ知られている物質が作られる。その後において、このケーキは、注射用の蒸留水または使用前に適当な種々の投与用復元溶液を用いて復元することができる。
【００５３】
この凍結乾燥サイクルは、賦形剤の最終的な物理的状態を決定するだけではなく、復元時間、外観、安定性及び最終的な水分の含量などの他のパラメーターにも影響する。凍結状態にある組成物の構造は、特異的な温度で起こり、凍結乾燥の工程を理解し、最適化するために利用できるいくつかの転移（例えば、ガラス転移や結晶化）を経る。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、溶質の物理的状態についての情報を提供し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定できる。これは、凍結乾燥サイクルを設計するにあたって、考慮に入れねばならない重要なパラメーターである。さらに、乾燥状態において、このガラス転移温度は、最終生産物の保存温度についての情報をもたらす。
【００５４】
本組成物の特定の実施形態において、凍結乾燥又は保存により引き起こされる凝集や化学分解を防止又は低下させるために、安定化剤を凍結乾燥製剤に添加する。復元した際の霞んだもしくは濁った溶液は、タンパク質が沈殿していることを表す。「安定化剤」という語句は、水溶液中または固体の状態において、化学分解（例えば、自己分解、アミド分解、酸化等）に加えて凝集および他の物理的分解を防ぐことのできる賦形剤を意味する。スクロース、トレハロース又はグリシンを含む、医薬組成物に従来から用いられている安定化剤を用いることができるが、これらに限定されるものではない［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄａｒｄ．， ７４： ２２５ （１９９１）］。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）又はポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）などの界面活性安定剤を適当量添加して、凍結中および乾燥中の表面に関連した凝集現象を防止することができる［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８５： １２３５ （１９９６）］。必要に応じ、凍結乾燥された組成物は、凍結乾燥「ケーキ」を形成するのに適した充填剤および浸透圧調整剤を適当量含有する。充填剤は結晶性（例えば、マンニトール、グリシン）又は非結晶性（例えば、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース）であり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。さらなる実施形態において、このマンニトールは、約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度で混合され、さらなる実施形態において、約３％ないし４．５％ｗ／ｖの濃度にあり、力学的かつ医薬的に安定で上質なケーキを産生する。もう１つの実施例では、前記マンニトール濃度は、２％ｗ／ｖである。
【００５５】
医薬的に許容できる緩衝液とｐＨの選択は、本組成物の安定性に影響することが見出された。本組成物中に存在する緩衝系は、生理学的な適合性するように選択され、凍結乾燥前の溶媒だけでなく復元溶液をも望ましいｐＨに維持するものが選択される。好ましくは、この緩衝液は、約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ８．０の範囲でｐＨ緩衝能を有する。上述したパラメーターを組み入れた一連のスクリーニングの研究は、概して最も安定な剤形条件を選択するように行なわれた。
【００５６】
本組成物は、凍結乾燥状態で、２℃ないし８℃において、少なくとも２年間は安定であることが見込まれる。この長期に渡る安定性は、医薬製品の保存期間を増加させるために有益である。
【００５７】
本発明はさらに、ＫＧＦ製剤の調製方法を意図する。一形態において、
（ａ）ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤からなる緩衝液中にＫＧＦ組成物を混合する段階、
（ｂ）ＫＧＦを凍結乾燥する段階、
を含む凍結乾燥されたＫＧＦ製剤の調製方法である。
【００５８】
本方法は、さらに、次の１または複数の段階を含む。凍結乾燥の前に、混合物に安定化剤を添加する段階、凍結乾燥の前に、混合物に充填剤および浸透圧調整剤および界面活性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を添加する段階。この充填剤は、上記で述べたものであれば、いかなる充填剤でもよい。好ましくは、この充填剤はマンニトールである。糖は、上記で述べたものであれば、いかなる安定化糖でもよい。一実施形態において、この安定化剤はスクロースである。この界面活性剤は、上記で述べたものであれば、いかなる界面活性剤でもよい。一実施形態において、この界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００５９】
凍結乾燥された物質の基本的な復元手段は、一定体積の純水又は注射用の蒸留水（ＷＦＩ）を加え戻すこと（典型として、凍結乾燥により取り除かれた量と等しい体積）であるが、非経口投与用の医薬製品においては、しばしば抗菌剤の希釈溶液が用いられる［Ｃｈｅｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １８： １３１１−１３５４ （１９９２）］。
【００６０】
この凍結乾燥されたＫＧＦ組成物は、水溶液として復元され得る。種々の水性担体、例えば注射用の蒸留水、複数投与使用のための保存剤が入った水もしくは適切な量の界面活性剤（例えばポリソルベート２０）が入った水、０．４％食塩水、０．３％グリシン又は水性懸濁液などは、水性懸濁液の生産に適した賦形剤との混合物として活性化合物を含むことができる。このような賦形剤は、懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント、アカシアガム）であり、分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）または脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアラート）または長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばヘプタデカエチル−エネオキシセタノール）または脂肪酸およびヘキシトールから得られた部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）または脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られた部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。この水性懸濁液は、例えばエチル又はｎ‐プロピルパラヒドロキシ安息香酸といった保存剤の１つまたはは複数を含み得る。
【００６１】
本発明の組成物をヒトもしくは試験動物に投与するために、この組成物を、１つまたは複数の医薬的に許容される担体を含む組成物に調合することが好ましい。「医薬的に」または「薬理学的に許容される」という語句は、安定で、凝集や分解産物などのタンパク質分解を阻害するおよび後述の当分野で周知の経路で投与した場合にアレルギーまたは他の有害な反応を生じない分子的実体及び組成物を指す。「医薬的に許容される担体」は、上述した薬剤も含む、全てのおよびいずれかの臨床的に有用な溶媒、分散媒、被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを包含する。
【００６２】
本ケラチノサイト増殖因子組成物は、経口、局所、経皮、非経口、噴霧剤の吸引、経膣、直腸投与または頭蓋内注射により投与してよい。ここで用いられる非経口投与という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射または点滴による方法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜内、球後、肺内の注射及び／又は適所への外科的移植による投与も同様に意図する。通常、組成物は、発熱物質を本質的に含まず、レシピエントに有害と思われる夾雑物も同様に含まない。
【００６３】
キット
追加の形態として、本発明は、化合物や組成物を対象へ投与する使用を容易にするような方法により、１つまたは複数の化合物または組成物が梱包されたものを含むキットを包含する。一実施形態において、このようなキットは、密封された瓶または容器に包装されたここに記載されている化合物または組成物（例えば、ケラチノサイト増殖因子を含む組成物）を、本方法の実施における本化合物または本組成物の使用について述べている、容器に付されたまたは包装に含まれたラベルと共に含む。一実施形態において、このキットは、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物が入った第１の容器とおよびこの凍結乾燥された組成物のための生理学的に許容される復元溶液が入った第２の容器とを包含する。好ましくは、この記化合物または組成物は、単一投与形態にて包装されている。さらに、このキットは、本組成物を具体的な投与経路にそって投与するために適した装置を含む。好ましくは、このキットは、本ケラチノサイト増殖因子組成物の使用を記載したラベルを含む。
【００６４】
本発明のさらなる形態および詳細は、下記実施例から明白である。
【実施例１】
【００６５】
ＫＧＦの液体製剤
製品安定性、保存寿命および生物活性は、あらゆる治療上有効な組成物にとって重要な側面である。推奨される保存温度下で長期に渡って保存しても安定であり、しかし有効な生物活性を維持する組成物の設計及び製剤は、医薬組成物の鍵となる要素である。
【００６６】
先の実験において、ＫＧＦの液体製剤は、重度の凝集およびそれに続いて高められた温度（３７℃）下でのタンパク質の損失を示した。ＫＧＦ組成物に最大の安定性を提供するｐＨを決定するために、ケラチノサイト増殖因子の液体製剤液剤のｐＨを、３．０ないし９．０のｐＨ範囲にて試験した。
【００６７】
以下の実験、例えば実施例１ないし３において使用されたＫＧＦは、ΔＮ２３ ＫＧＦ分子である。溶液のｐＨは、濃ＨＣｌまたは水酸化ナトリウムのいずれかを用いて調整した。異なるｐＨにおけるＫＧＦ製剤（０．５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ緩衝液、０．１ＭＮａＣｌ）のサンプルは、３７℃で温置して０、６および２８時間後に採取した（図１）。回収したタンパク質のパーセントは、ＳＥ−ＨＰＬＣ（図１Ａ）またはＣＥ−ＨＰＬＣ（図１Ｂ）により測定した。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）のために、サンプル（４０μｇ）は、ＨＰ １０９０／１０５０マシンに接続されたＧ２０００ＳＷｘ１カラム（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）に負荷した。前記タンパク質は、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰ）、１ＭＮａＣｌを用いて溶出させた。タンパク質は２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。単一のピークは、このＫＧＦの製剤中に凝集が殆どないことを示す。
【００６８】
陽イオン交換（ＣＥ）−ＨＰＬＣは、室温にて、Ｍｏｎｏ−Ｓカラムを装備したＨＰ １０９０／１０５０マシンにより行なわれた。４０μｇのＫＧＦタンパク質を、前記カラムに負荷し、ｐＨ８の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液および塩勾配（１ＭＮａＣｌ）を用いて溶出させた。溶出したタンパク質は２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【００６９】
逆相−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、Ｖｙｄａｃの孔径３００ＡのＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、ＨＰ１０９０／１０５０マシンにより行なわれた。タンパク質（３０μｇ）は、前記カラムに注入され、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）入りのアセトニトリル（ＣＡＮ）勾配、及び９０％ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水を用いて溶出させた。タンパク質のピークは２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【００７０】
タンパク質の完全な回収が、時間０において、ｐＨ５．０ないし９．０の範囲で観察された。しかしながら、ｐＨ３．０においては、タンパク質の完全な喪失が確認され、ｐＨ４．０では、急速な沈殿によりタンパク質の８０％を喪失した。３７℃にて６時間経過時では、ｐＨ４．０のサンプルからは、可溶性のタンパク質を得ることができなかった。可溶性ＫＧＦをｐＨ５ないし９にて製剤し、３７℃にて２８時間経過時の回収したタンパク質パーセントは、２０％未満であった。しかしながら、ｐＨ７．０では、全タンパク質のうちわずか２０％のみが失われた。３７℃にて２８時間経過時の可溶性タンパク質の喪失は、主に凝集によるものであった。
【００７１】
これらの結果から、液体製剤中におけるＫＧＦタンパク質は、中性のｐＨにて最も安定であることを示しているが、しかし、この最適なｐＨの範囲内であっても、ＫＧＦを液体で保つことは、凝集による重大なタンパク質の喪失がもたらされる。
【実施例２】
【００７２】
凍結乾燥のためのＫＧＦ組成物の製剤
より安定なＫＧＦ組成物を開発するため、ＫＧＦを凍結乾燥産物として製剤することに決定した。凍結乾燥されたＫＧＦ組成物を製剤する前回の試みは、復元溶液の取り扱いを伴い、復元溶液の組成に依存して、より少ないタンパク質凝集を作る組成物を生じた［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， １２：１４４７−５２ （１９９５）］。しかしながら、この前回の研究において、復元時に見られる凝集は、いずれも元に戻すことが非常に困難であるか、または不可能であった。
【００７３】
この実施例は、復元溶液によらずに復元に伴う凝集を防ぎ、あつらえの復元溶液の必要性を排除する、溶液中のこのタンパク質の凍結保存について説明する。
【００７４】
安定な凍結保存製剤の組成物を決定するため、ｐＨ、充填剤、糖濃度および界面活性剤濃度などのパラメーターを変更した種々の条件下でＫＧＦ、例えばΔＮ２３ ＫＧＦ、の凍結乾燥を行った。その後、ＫＧＦの長期保存安定性が推奨保存温度下にて測定された。
【００７５】
凍結乾燥サイクル
凍結乾燥のために、サンプルは、約４℃のチャンバー温度に事前冷却したＶｉｒＴｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ ＥＬパイロット型（ＶｉｒＴｉｓ， Ｇａｒｄｉｎｅｒ， ニューヨーク州）凍結乾燥機に負荷された。サンプルは急速に凍結され（約１℃／分にて−５０℃まで）、最低２時間はその温度を維持した。サンプルを凍結保存機に載せると、棚温度は約２７℃／時間の率で−５０℃まで下げられた。サンプルは、−５０℃にて２時間維持され、完全な凍結を確実なものにした。マンニトールを結晶化させる任意の工程では、前記棚温度は１０℃／時間の率で−５０℃まで上げられて２−３時間平衡化され、次いで９℃／時間の率で−５５℃まで下げられた。追加して最低２時間維持した後に、約１００ｍＴｏｒｒの真空を適用した。第１乾燥のために棚温度は−３５℃まで上げられたが、しかし、−４５℃ないし−１０℃の範囲内であればよい。第１乾燥は４０時間継続されたが、２４−４８時間の範囲内であればよい。次いで、第２乾燥のため、棚温度は５℃／時間の率で＋２０℃ないし＋２５℃まで上げられ、真空は約５０ｍＴｏｒｒまで弱められた。第２乾燥は３６時間行なわれたが、２４から７２時間のどこかで行なうことができる。第２乾燥の終結で、サンプルは真空下（２５ｍＴｏｒｒ以下）にて封入され、バイアルは凍結乾燥機から取り外された。バイアルは止め蓋で閉じられ、安定性試験のために様々な温度下に置かれた。
【００７６】
凍結乾燥されたＫＧＦの安定性へのｐＨの影響
一連のｐＨ値におけるＫＧＦの安定性が先ず評価された。ＫＧＦ（５ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースおよび０．０１％ポリソルベート２０を含み、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５又はｐＨ７．０のいずれかにある溶液中で製剤した。凍結乾燥前のサンプルのＳＥ−ＨＰＬＣは、９９％のメインピーク百分率を示し、これは９９％の単一の活性成分に相当する。
【００７７】
さらに促進した安定性の調査を行なうため、サンプルのいくつかは保存用の保温器に移された。その他のサンプルは、対照とするために−７０℃の冷凍庫に移された。大部分のバイアルは４℃にて保存された。解析の時点で、サンプルは１．２ｍＬの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で復元された。
【００７８】
４５℃にて６ヶ月保存後の凍結乾燥されたＫＧＦサンプルのＳＥ−ＨＰＬＣは、全てのｐＨでのサンプルのメインピーク百分率が約９７．５％であることを示し、６．０ないし７．０のｐＨ範囲内では、凍結乾燥されたＫＧＦは、高温下で６ヶ月間の保存の後でも安定であることが示された。また、これらの調査は、５．０ないし８．０のｐＨ範囲は、製剤が４℃に保たれた場合に安定なタンパク質を提供することを示した。
【００７９】
ＫＧＦの安定性へのスクロース濃度の影響
凍結乾燥されたＫＧＦに最大の安定性を提供するスクロール量を評価するために、組換えヒトＫＧＦ（１ｍｇ／ｍｌ）を、スクロースを含まない、又は２％スクロース（ｗ／ｖ）を含む溶液中で、ｐＨ７．０の１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトールを含む組成物に製剤した。このサンプルは、上記のように凍結乾燥され、４５℃にて３ヶ月間インキュベートされた。
【００８０】
スクロース入り又はスクロース無しでのＫＧＦ製剤のメインピーク百分率のＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、２％のスクロースの添加が凍結乾燥ＫＧＦ製剤に有意な安定性を提供することを示す。２％スクロースと共に凍結乾燥されたＫＧＦは、凍結乾燥直後に約９９．５％のメインピークを示し、凍結乾燥後１ヵ月後および３ヵ月後の両方で９８．５％を示した。スクロースなしの製剤は、凍結乾燥後１ヵ月後および３ヵ月後に、それぞれ、約９６％のメインピークと約９３．５％のメインピークを示した。
【００８１】
これらの結果は、スクロースなしの製剤では、４５℃にて３ヶ月間保存した後にパーセント活性単一ピークが７％減少したが、スクロース有りの製剤では、単一ピークはほんの僅かしか減少しなかったことを示す。従って、凍結乾燥製剤に添加すると、スクロースは強力な安定化剤としてＫＧＦに作用する。
【００８２】
適切なマンニトールの百分率により溶液が常時等張性を維持する、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５のスクロース濃度が１％ないし３％のスクロースを含むＫＧＦの凍結乾燥産物を用いてさらなる解析を行った。１％ないし３％のスクロースを有し、３７℃で１年間保管された凍結乾燥産物は、テストされた全ての製剤において９９％を超えるメインピーク百分率を維持しており、２％スクロース入りの製剤に匹敵するタンパク質安定性を示した。
【００８３】
ＫＧＦの安定性へのポリソルベート２０の濃度の影響
復元における粒子形成を排除する能力に基づき、ＫＧＦの凍結乾燥製剤中のポリソルベート２０濃度が選択された。組換えヒトＫＧＦは、１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースを含むｐＨ７．０の組成物に製剤され、凍結乾燥された。次いで、ＫＧＦは、異なる濃度のポリソルベート２０を含む溶液中で復元された。凍結乾燥ケーキは、上記のように製剤された５ｍｇ／ｍｌのＫＧＦをその構成とした。表１は、復元した際の、前記凍結乾燥製剤の観測記録を記す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
さらなる研究により、凍結乾燥前にポリソルベート２０をケーキに含ませた製剤が、復元溶液にポリソルベート２０を添加した場合と比較して、４５℃にて４ヶ月後に同等に安定であることが示された。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析［Ｂｉｏｒａｄ Ｂｉｏｓｉｌ ＳＥＣ １２５（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）、２０ｍＭＮａＰ、ｐＨ７．０、１ＭＮａＣｌ、４０μｇ注入負荷］は、０、１および４ヶ月で試験を行った全てのポリソルベート濃度において、単一のＫＧＦの喪失は無視できる程度であったことを示した（表１と同様）。復元の際に目視できる粒子を安定して排除する能力に基づき、０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度を、製剤に含ませることにした。
【００８６】
ＫＧＦの安定性へのマンニトール濃度の影響
マンニトールおよび他の充填剤が製剤に含まれ、それにより良質なケーキの外観と品質を得ることができる。加えて、これらは、生理液を含む医薬組成物の等張性を維持する助けをする。例えば、生理液は、２９０−３２０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。最終的なＫＧＦ製剤のマンニトール濃度は、生理液と等浸透圧になるように調整した。
【００８７】
凍結乾燥剤形に安定性を提供するマンニトール濃度の百分率を評価するため、３ｍｇ／ｍｌのＫＧＦを、ｐＨ７の、１０ｍＭヒスチジン、２％スクローおよび０．０１％ポリソルベート２０を含み、３％マンニトールまたは４％マンニトールのいずれかを含む製剤に凍結乾燥した。このＫＧＦ製剤は、凍結乾燥され、４℃にて１年間保管された。浸透圧は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製（Ｎｏｒｗｏｏｄ， マサチューセッツ州）のＯｓｍｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３Ｄ３を用いて測定された。４％マンニトール溶液における実測浸透圧は３１２ｍＯｓｍであり、一方３％マンニトール製剤は、２５０ｍＯｓｍの溶液を生じた。
【００８８】
図２は、等張性の４％マンニトール／２％スクロース製剤を、僅かに低張性の３％マンニトール／２％スクロース製剤と比較した逆相（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを重ね合わせた図であり、４℃保存の時刻ゼロ（図２Ａ）または１年経過時（図２Ｂ）に採られた図を示す。これらの結果は、等浸透性の製剤はは、２℃ないし８℃の推奨保存温度下で１年経過後でも安定であることを示す。加えて、これらの浸透性の製剤は、ケーキの外観が良好で、その含水率は２％未満であった。本研究に基づき、４％のマンニトールが凍結乾燥剤形への使用に推奨された。
【００８９】
ｒＨｕＫＧＦの安定性へのタンパク質濃度の影響
凍結乾燥されたサンプル中のタンパク質濃度はまた、復元された産物の安定性に加え、タンパク質の凍結乾燥の質の安定性にも影響する。
【００９０】
安定性に対するＫＧＦ濃度の影響を、０．５、１、２、３および５ｍｇ／ｍｌにて探査した。サンプルは、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースおよび０．００５％ポリソルベート２０中で製剤され、凍結乾燥された。この凍結乾燥されたサンプルは、復元まで４５℃にて２４週間保管された。タンパク質分解は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＣＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察した。この実験においては、ＨＰシステムとＧ２０００ＳＷｘ１カラムを用いて、上記同様にＳＥ−ＨＰＬＣを行なった。
【００９１】
図３は、４５℃で２４週間保管後のＫＧＦのＳＥ−ＨＰＬＣ解析から得られた、タンパク質濃度の関数としてのメインピーク百分率を表す。点線は、実測データに対する動向ラインを表す。ＳＥ−ＨＰＬＣデータによれば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度までは、安定性はＫＧＦ濃度の上昇に伴って上昇した。ＲＰ−ＨＰＬＣやＣＥ−ＨＰＬＣによって測定されたメインピーク百分率のタンパク質濃度依存性についても、ＳＥ−ＨＰＬＣに見られたのと同様であった。さらなる研究により、１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度も、安定な凍結乾燥製剤を生み出すことが示された。
【００９２】
ｐＨ６．５の、１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート２０、２％スクロースおよび３％マンニトールを含む最適化されたＫＧＦ凍結乾燥製剤は、２℃ないし８℃にて４年間にわたり保存された。このＫＧＦ製剤は、復元すると、下記に試験されたように、ＫＧＦ活性を維持していることが示され、特定の組成物が、治療効果のある医薬組成物に必要な型の安定性と活性を保持したことを示している。
【実施例３】
【００９３】
復元したＫＧＦ製剤のバイオアッセイ
医薬的に有効な製品の製剤の１つの要素は、対象タンパク質の高い生物学的活性の必要要件である。
【００９４】
ＫＧＦ（例えばΔＮ２３ ＫＧＦ）製剤の生物活性を、３２Ｄ ＫＥＣＡクローン１６細胞（これは、Ｈｓｕら（１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８、２５２３−２５３４）に記載されているように、３２Ｄクローン３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３４６）と同様、ＫＧＦ存在下で増殖し、したがって増殖アッセイシステムとして有用な、ＩＬ−３依存性マウスリンパ芽球である。）を用いて、試験した。
【００９５】
３２Ｄクローン１６細胞は、生育培地［ＲＰＭＩ、ウシ胎児血清（１０％）（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ユタ州）、グルタミン（１％）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， カリフォルニア州）、ジェネティシン（２％）（Ｇｉｂｃｏ）及びマウスＩＬ−３（１２ｎｇ／ｍＬ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃａｎａｒｉｌｌｏ， カリフォルニア州）］中に、３７℃、５．５％ＣＯ２にて維持された。サンプルＫＧＦ製剤と参照標準（ΔＮ２３ＫＧＦの−７０℃にて保存、凍結乾燥）は、アッセイ培地［ＲＰＭＩ、ＦＢＳ（６％）、グルタミン（１％）、ヘパリン（０．６μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）］で、約２５ｎｇ／ｍＬに復元された。次いで、一連の希釈液が作成され、約２５ｎｇ／ｍＬから１．６ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が得られた。
【００９６】
ＫＧＦ製剤の生物学的活性を試験するために、３２Ｄクローン１６細胞は、２．０ｘ１０５細胞／ｍＬにて１５０μＬ分が平板接種された。所望の濃度の、参照標準、対照およびＫＧＦ試験サンプルは、５０μＬの体積でサンプルウェルに加えられた。細胞のプレート及びサンプルは３７℃、５．５％ＣＯ２にて、約２４時間温置された。第２日目に、４０μＬのＡｌｏｍａｒ Ｂｌｕｅ（ＡｃｃｕＭｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃｈｉｃａｇｏ， イリノイ州）が全ウェルに添加され、撹拌された。これらプレートは、３７℃、５．５％ＣＯ２にて、もう一度２４時間温置された。２４時間後、蛍光が、５３０−５６０ｎｍの励起波長、および５９０ｎｍの放射波長を用いて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩ又はＣｙｔｏｆｌｕｏｒシリーズ４０００、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， マサチューセッツ州）にて測定された。
【００９７】
２℃から８℃で７日間保存されて復元された３つのロットの凍結乾燥されたＫＧＦ製剤は、参照標準ＫＧＦタンパク質（−７０℃にて凍結乾燥、保存された）と似た生物学的活性を示し、０日目で≧１００％の生物学活性を、７日目でそれぞれ９２％、１００％および１０７％の活性を示した。２５℃で保管されたＫＧＦ製剤は、時間０で≧１００％の生物学活性を示し、４時間後に、天然ＫＧＦと比較して、９０％、９５％および１００％にそれぞれわずかに低下した。この活性レベルは、復元されたＫＧＦ製剤を２５℃にて２４時間保管したあとでも維持されており、ＫＧＦ製剤の安定性を示している。
【００９８】
これらの結果は、ここに記述する復元されたＫＧＦ製剤が、参照標準のＫＧＦタンパク質と同程度の効力を有することを示し、この製剤はＫＧＦ（例えばΔＮ２３ ＫＧＦ）の安定性又は効力に何らの有害な影響を及ぼさず、従って、上皮細胞などの増殖を促進して個体を処置する治療法に有効であることを示している。
【００９９】
加えて、ＫＧＦの生物学的活性は、復元された製剤の、Ｂａｌｂ／Ｃ−ＭＫ細胞の増殖を促進する能力により評価することができる。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞の保存株は、１０％ウシ胎児血清、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌａＰＧＦが補充された、低カルシウムのダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中にて、生育させ、維持される。この細胞は、３７℃にて１０％ＣＯ２雰囲気下、湿度９９％で温置される。生物学的活性のアッセイのために、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら［Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４２：３２５−３３３ （１９９０）］に記載されているとおり、細胞は１２ウェルプレートのウェル毎に、１ｍＬの培地中５ｘ１０３細胞の濃度で接種される。事前に決定した量のＫＧＦ製剤を細胞培養ウェルに添加する。ＦＧＦを陽性対照として用いる。
【０１００】
培養から５日後、細胞をトリプシン処理し、セルカウンターを用いて最終細胞濃度を測定する。細胞は、培養培地を０．９％ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ（ＳＴＶ）を含む溶液と交換し、３７℃にて５−１０分間温置して、プレートから離される。次いで、保存培養培地がこの細胞に加えられる。
【０１０１】
ＫＧＦで処理されたサンプルにおけるＢａｌｂ／Ｃ−ＭＫ細胞の密度の、非処理細胞と比べての増加は、ＫＧＦ組成物が、製剤工程中にその生物活性を失わないことを示し、ＫＧＦ製剤が、より高いＫＧＦ活性を必要とする処置対象への有効な治療剤を提供することを示している。
【０１０２】
上記の例示的実施例にて説明される本発明についての多数の改変や変形が生じることは、当業者の予期するところである。従って、本発明には、付随する特許請求の範囲に現れる制限のみが載せられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、異なるｐＨにおける液体ＫＧＦ製剤中の可溶タンパク質のサイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ（図１Ａ）及び陽イオン交換（ＣＥ）−ＨＰＬＣ（図１Ｂ）分析を表す。
【図２】図２は、１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート２０および４％マンニトール／２％スクロースまたは３％マンニトール／２％スクロースのいずれか一方中にて凍結乾燥されたＫＧＦ製剤を比較する、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣクロマトグラムを表す。図２Ａは凍結乾燥後から時間ゼロをを表し、図２Ｂは４℃で１年間保管後の産物を示す。挿入図は、メインピーク周辺の領域を示す。
【図３】図３は、４５℃で２４週間保存した後の、凍結乾燥されたＫＧＦ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ分析からの、タンパク質濃度の関数としてのメインピーク百分率を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥したケラチノサイト増殖因子製剤、及びケラチノサイト増殖因子を含む凍結乾燥組成物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は、上皮細胞に特異的な増殖因子であり、ヒト胎児の肺繊維芽細胞の細胞系の条件培地中に先ず特定された［Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８０２−８０６（１９８９）］。ＫＧＦのメッセンジャーＲＮＡ発現は、様々な発生段階にある上皮組織から得られた種々の間質繊維芽細胞の細胞系において検出されている。ＫＧＦへの転写は、健康な成人の腎臓及び胃腸管の器官から抽出されたＲＮＡにおいて明らかにされた［Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７５２−７５５（１９８９）］。ＫＧＦが繊維芽細胞から培養液中に分泌されおよび生体内で表皮ではなく真皮において発現している事実は、ＫＧＦがケラチノサイト増殖の重要な標準パラクラインエフェクターである可能性を示唆している。各研究により、ＫＧＦは、組織培養中の初代または第二世代ヒトケラチノサイトの増殖を促進させる点において、上皮成長因子（ＥＧＦ）と同様の効果を奏することが報告されている ［Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓ． １４４：３２６−３３２ （１９９０）］。ＫＧＦは、上皮、口腔および下部消化管上皮、膵臓、肝臓、肺、尿路上皮、前立腺上皮ならびに他を含む種々の器官の上皮近隣の間葉細胞により産生される ［Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ， 上掲， Ｈｏｕｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１７６４−７７， （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ． １４５：８０−８５， （１９９４）； Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９８３１−４０， （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｕｒｏｌ． １５４：１５６６−７０， （１９９５）； ａｎｄ Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：１２９８−１３０６， （１９９４）］。
【０００３】
国際公開ＷＯ ９０／０８７７１には、ヒト胎児繊維芽細胞の細胞系の条件培地からのＫＧＦの精製、精製されたＫＧＦの部分アミノ酸配列、ＫＧＦ遺伝子のクローニングおよび生物学的に活性な組換えＫＧＦを得るための遺伝子の発現が記載されている。この国際公開はまた、ＫＧＦ又はＫＧＦ様ポリペプチドは、火傷の創傷治療剤としてまたは被移植角膜組織を刺激するために有用であることを開示している。
【０００４】
健康な成体動物を用いた生体外及び生体内の各研究では、ＫＧＦ−１（以下において「ＫＧＦ」）は、毛嚢形態発生、肝細胞増殖ならびに肺、胸部、膵臓、胃、小腸および大腸での上皮細胞増殖に変化を生じさせることが示されている［Ｐａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２：９６９−９７７ （１９９３）； Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １４４：８６２−８６８ （１９９４）； Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １４５：８０−８５ （１９９４）； ａｎｄ Ｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：１２９８−１３０６ （１９９４）］。胎児又は新生児の発生におけるＫＧＦの役目については現在のところ調査中である。しかしながら、ＫＧＦは新生マウスの精嚢発生の重要なメディエーターであることが示された［Ａｌａｒｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４−１０７８ （１９９４）］。加えて、肝細胞内でＫＧＦを過剰発現するマウスでは、多嚢胞性腎を呈し［Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：２１０９−１９， （１９９６）］、さらにサーファクタントプロモーターを用いてＫＧＦを肺において過剰発現させると、肺嚢胞腺腫を有するマウスを生じる結果となり［Ｓｉｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１２４６１−６５ （１９９５）］、腎臓と肺の正常な発生におけるＫＧＦの重要性を示している。
【０００５】
ＫＧＦは、ウサギの耳またはブタの皮膚に外科的に施された傷に、組換えＫＧＦを局所的に適用した場合、再上皮化を増加させ、上皮の厚さを増大させることが示されている［Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：８３１−８４０ （１９９４）； Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：８６５−８７８ （１９９３）］。Ｂｏｓｃｈらは［Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２６８３−２６８７ （１９９６）］、ケラチノサイト増殖因子の投与が、肝臓細胞の増殖を促すことを報告した。
【０００６】
通常、精製されたポリペプチドは、水溶液中の状態では、ほんのわずかしか安定でなく、化学的に物理的な分解を起こし、加工および保存の間に生物学的活性の損失をもたらす。加えて、水溶液中のポリペプチド構成物は、脱アミドおよびペプチド結合の開裂などの加水分解を受ける。これらの作用は、生物学的活性に基づいて決定された投与量の範囲内で人に投与することが意図された、治療活性のあるポリペプチドにとって重大な課題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
精製されたケラチノサイト増殖因子の投与は、依然、ヒト集団を冒す多くの病気を処置するための有望な候補である。しかしながら、多様な保存条件の下で長期に渡り安定な医薬組成物であり続け、したがって患者にとって生体内で有効であるという、ＫＧＦの能力に関しては、未だ取り上げられていない。このように、ＫＧＦの媒介による上皮細胞の増殖の刺激により利益をもたらし、種々の病気を処置する治療剤として有用な、安定した製剤であるケラチノサイト増殖因子を提供する必要が、この技術分野において依然残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高度に安定なケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産物をもたらす、ケラチノサイト増殖因子の凍結乾燥のために有用な、新規な製剤を提供する。この安定なＫＧＦは、ＫＧＦの投与が利益をもたらす病気または状態を患っている個体の処置の治療のための治療剤として有用である。
【０００９】
一形態において、本発明は、ヒスチジン、充填剤、界面活性剤および糖類（例えば安定化糖）を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を提供する。
【００１０】
一実施形態において、このＫＧＦ組成物は、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体を含む。ＫＧＦタンパク質の変異体は、天然型ＫＧＦの断片、キメラ分子またはハイブリド分子を含み、対立遺伝子変異体、アミノ酸が除去され、置換され又は挿入されたものが挙げられる。例えば、本発明は、ＫＧＦが天然型ＫＧＦの最初の２３個のアミノ酸が除去されているΔＮ２３ ＫＧＦ（配列番号３）であることを意図している。変異体は、天然型ＫＧＦ（配列番号２）の第４１からし１５４番目のアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が除去された、またはタンパク質の正電荷を減少させる作用を及ぼすように選ばれた中性残基または負に帯電した残基により置換された電荷−変化ポリペプチドなどの、ここで述べられている分子を含む。ＫＧＦのさらなる例は、これらに限られるものではないが、天然型ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域中の少なくとも１つのアミノ酸を、少なくとも１つのより高いループ形成能を有するアミノ酸により置換されて作製されたタンパク質を含む。さらなる例は、天然型ＫＧＦの第１２３から１３３番目（配列番号２の第１５４から１６４番目のアミノ酸）のアミノ酸領域内において、１つまたは複数のアミノ酸の置換、除去又は付加を有するタンパク質が挙げられる。
【００１１】
一形態において、本発明は、充填剤／浸透圧調整剤の使用を意図する。充填剤は結晶性（例えば、グリシン、マンニトール）又は非結晶性（例えば、Ｌ−ヒスチジン、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースおよびラクトース）のいずれかであり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。さらなる実施形態において、このマンニトールは、約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度で混合される。さらなる実施形態において、この濃度は、約３％ないし４．５％ｗ／ｖである。別の実施例において、このマンニトールは、４％ｗ／ｖの濃度である。
【００１２】
他の形態において、本発明は、安定化糖を含む組成物を提供する。使用が意図される糖は、これらに限られるものではないが、スクロース、トレハロース又はグリシンを包含する。一実施形態において、この糖はスクロースである。関連する実施形態において、このスクロースは約１−３％ｗ／ｖの濃度にある。さらなる実施形態において、このスクロースは２％の濃度である。
【００１３】
本発明の組成物は、ｐＨが約５．０から約８．０の範囲に調製されることを意図する。一実施形態において、このＫＧＦ組成物は約６．０から約８．０の範囲のｐＨを有する。別の実施形態において、この組成物は約６．０から約７．０の範囲のｐＨを有する。さらなる実施形態において、この組成物は約６．５のｐＨを有する。
【００１４】
さらなる形態において、この組成物は、界面活性剤の使用を意図している。使用される界面活性剤は、これらに限られるものではないが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０を意図する。一実施形態において、この界面活性剤は、ポリソルベート２０である。関連する実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．１％ないし約０．００４％ｗ／ｖの範囲内にある。さらなる実施形態において、前記ポリソルベート２０の濃度は、約０．０１％ｗ／ｖである。
【００１５】
一形態において、本発明は、ｐＨ６．５における、１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロース及び０．０１％ポリソルベート２０を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を意図する。
【００１６】
さらに、本発明は、ａ）ヒスチジン、充填剤、安定化糖および界面活性剤の溶液を調製する段階ならびにｂ）ＫＧＦを凍結乾燥する段階を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作製方法を提供する。関連する形態として、本発明は、凍結乾燥の前に、ｂ）溶液のｐＨを約６．０から約８．０に調整する段階、ｃ）ケラチノサイト増殖因子を含む溶液を調製する段階、ｄ）段階（ｃ）の溶液を段階（ｂ）の溶液へとバッファー交換を行う段階、ｅ）適切な量の界面活性剤を添加する段階ならびにｆ）段階（ｅ）からの混合物を凍結乾燥する段階をさらに含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作製方法を意図する。さらに、このＫＧＦは、配列番号２又は配列番号３に呈示されているＫＧＦタンパク質またその変異体であり得ることが意図されている。
【００１７】
一形態において、本発明の方法は、充填剤／浸透圧調整剤の使用を意図し、この充填剤は結晶性（例えば、グリシン、マンニトール）又は非結晶性（例えば、Ｌ−ヒスチジン、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースおよびラクトース）であり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。他の実施形態において、このマンニトールは約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度である。関連する実施形態において、このマンニトールは約３％ないし４．５％ｗ／ｖの濃度である。さらなる実施例において、このマンニトールは、４％ｗ／ｖの濃度である。
【００１８】
他の形態において、本発明の方法は、糖を含む組成物を提供し、この糖は安定化糖である。使用を意図される糖は、これらに限られるものではないが、スクロース、トレハロース又はグリシンを包含する。一実施形態において、この糖はスクロースである。関連する実施形態において、このスクロースは約１％ないし約３％ｗ／ｖの濃度にある。さらなる実施形態において、このスクロースは２％の濃度である。
【００１９】
本発明の方法において、ｐＨは生理学的ｐＨに調整されることを意図する。一実施形態において、このｐＨは約５．０から約８．０の範囲に調製される。別の実施形態において、このｐＨは約６．０から約８．０の範囲に調整される。さらなる実施形態においては、このｐＨは約６．０から約７．０の範囲に調整される。さらなる実施形態において、このｐＨは、６．５のｐＨ値に調整される。
【００２０】
さらなる形態において、本発明の方法は、界面活性剤の使用を意図している。使用される界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０が意図されるが、これらに限られない。一実施形態において、この界面活性剤は、ポリソルベート２０である。関連する実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．１％ないし約０．００４％ｗ／ｖの範囲内にある。さらなる実施形態において、このポリソルベート２０の濃度は、約０．０１％ｗ／ｖである。
【００２１】
一形態において、本発明は、ｐＨ約６．５である、１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロース及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子組成物の作製方法が意図される。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子組成物の有効量を対象に投与することを含む、ＫＧＦにより媒介される上皮細胞増殖の刺激を増大させることによる、疾患を治療する方法を意図する。
【００２３】
治療される疾患は、腸毒性；粘膜炎；火傷もしくは他の非全層型および全層型の損傷；毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖；付属器構造の増殖；表皮水疱症；化学療法による脱毛症；男性型の禿頭症；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；びらん性胃炎、食道炎もしくは食道逆流；炎症性腸疾患；肺硝子膜症；煙吸入による損傷；気腫；肝硬変、肝不全、急性ウイルス肝炎および他の肝臓の毒性傷害；または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）が意図されている。
【００２４】
本発明は、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を含む第１の容器とおよび生理学的に許容される凍結乾燥組成物用の復元溶液を含む第２の容器とを含む、水性医薬組成物を調製するためのキットもまた意図している。ＫＧＦタンパク質は、配列番号２又は配列番号３に呈示されているものまたはその変異体であり得ることが意図されている。生理学的に許容される復元溶液は、いかなる医薬的に許容される担体または希釈剤でもよく、以下に限定されるものではないが、いかなるおよび全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などならびにここに開示されている薬剤を包含する。加えて、このＫＧＦ組成物は、担当医により適切であると考えられる投与法であれば、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、噴霧剤の吸引による投与、経膣投与、直腸投与又は頭蓋内注射を含むいかなる方法でも患者に投与することができる。ここで用いられる「非経口投与」という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射または点滴による方法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜内、球後、肺内の注射および／または適所への外科的移植による投与も意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、安定なタンパク質産物を提供して、精製されたタンパク質の保存寿命を上昇させる、精製されたケラチノサイト増殖因子の凍結乾燥のための製剤に関する。さらに、本発明は、ケラチノサイト増殖因子を含む、凍結乾燥された組成物の作製方法を提供する。
【００２６】
ここで、「ケラチノサイト増殖因子」または「ＫＧＦ」は、ケラチノサイト増殖因子ポリペプチド（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００９）又は配列番号２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０００）に記述されているポリペプチド又はΔＮ２３ ＫＧＦ（配列番号３）などのこれらの類似体又はケラチノサイト増殖因子受容体に結合してこれを活性化させる因子を指す。好ましい実施形態において、ＫＧＦはΔＮ２３ ＫＧＦであり、これは、成熟ＫＧＦからのＮ末端の最初の２３個のアミノ酸が除去された（シグナル配列が付加されていないもの）、組換えにより作製された形のＫＧＦである。例えば、米国特許第５，６７７，２７８号、第６，６７７，３０１号、第６，０７４，８４８号、第５，８４３，８８３号、第５，８６３，７６７号及び第５，７７３，５８６号（全てＣＨＩＲＯＮ Ｃｏｒｐに付与されている。）、米国特許第５，７３１，１７０号及び１９９０年８月９日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９０／０８７７１（完全長ＫＧＦおよび変異体に関する）；及び１９９６年４月２５日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９６／１１９４９；１９９６年４月２５日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９６／１１９５１；及び１９９８年６月１１日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９８／２４８１３（ＫＧＦの安定な類似体に関する）を参照。以上の全ては、その図も含めて、本明細書に組み入れられる。
【００２７】
天然のＫＧＦに対し増大された安定性を有するＫＧＦの類似体は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９６／１１９５１および米国特許第６，６７７，３０１号に記載されており、このようなＫＧＦは本発明により意図される。あるいは、完全にまたはは部分的でも、ＫＧＦ活性を残している、完全長ＫＧＦポリペプチドのいかなる断片またはその類似体も意図される。
【００２８】
本明細書にて用いられる「ケラチノサイト増殖因子」及び「ＫＧＦ」という用語は、特に指示のない限り、天然型ＫＧＦのペプチド配列の全長またはその部分と実質的に同じペプチド配列により特徴づけられる、および、天然型ＫＧＦの生物学的活性（特に非繊維芽細胞上皮細胞の増殖、例えば、Ｈ−チミジンの取り込みにより定義される、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の刺激よりもＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の少なくとも５００倍以上大きな刺激を示す活性およびＢＳ／５８９上皮細胞もしくはＣＣ１２０８上皮細胞の刺激よりもＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の少なくとも５０倍以上の大きな刺激を示す活性）の全てまたはいくらかを維持していることにより特徴づけられる、天然型ＫＧＦおよびＫＧＦ類似体タンパク質（または「変異体」）を含み、交換可能に意味することが意図されていることが了解されるべきである。本発明は、また、ここに例示されている穏やかな条件から非常に緊縮なハイブリド形成条件下にて、配列番号１のコード領域にハイブリド形成可能なＤＮＡ配列によりコードされているペプチドを指す、「天然型ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により特徴づけられる」ペプチドを意図している。
【００２９】
ハイブリド形成という文脈において、緊縮な条件とは、塩、温度、有機溶媒およびハイブリド形成反応において一般に制御される要素の複合的な緊縮条件である。典型的な緊縮なハイブリド形成条件は、６２℃ないし６７℃にて、４ｘＳＳＣにおけるハイブリド形成、続いく６２℃ないし６７℃にて０．１ｘＳＳＣ中での約１時間の洗浄が挙げられる。あるいは、典型的な緊縮なハイブリド形成条件は、４０℃ないし４５℃にて４５ないし５５％ホルムアルデヒド、４ｘＳＳＣにおけるハイブリド形成が挙げられる［Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， 「分子クローニング、実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）， 第３８７頁ないし３８９頁参照］。
【００３０】
ＫＧＦタンパク質は、天然型ＫＧＦの断片、キメラまたはハイブリドＤＮＡ分子を含む、対立遺伝子変異、またはアミノ酸の除去、置換又は挿入を含む。この発明の好ましいＫＧＦ分子はΔＮ２３ ＫＧＦである。他のＫＧＦの例は、これらに限られるものではないが、配列番号２のＣｙｓ１およびＣｙｓ１５に対応する残基が、得られた分子が親分子と比較して改善された安定性を有する、置換されているまたは除去されている（同じ所有の米国特許６，００８，３２８に開示されているごとく）タンパク質を含む。他のＫＧＦの例は、天然型ＫＧＦの第４１ないし１５４番目のアミノ酸（好ましくはＡｒｇ４１，Ｇｌｎ４３，Ｌｙｓ５５，Ｌｙｓ９５，Ｌｙｓ１２８，Ａｓｎ１３７，Ｇｌｎ１３８，Ｌｙｓ１３９，Ａｒｇ１４４，Ｌｙｓ１４７，Ｇｌｎ１５２，Ｌｙｓ１５３またはＴｈｒ１５４の残基）の１つまたはそれ以上が、除去されているまたはタンパク質の正電荷を減少させる作用を及ぼすように選択された中性の残基または負の電荷を帯びた残基により置換されている電荷変化ポリペプチドが挙げられるが、これらに限られるものではない。ＫＧＦのさらなる例として、天然ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域中（米国特許６，００８，３２８に開示されるがごとく）の少なくとも１つのアミノ酸を少なくとも１つのより高いループ形成能を有するアミノ酸により置換して作製されたタンパク質が挙げられるが、これらに限られるものではない。さらなる例として、天然型ＫＧＦの第１２３ないし１３３番目のアミノ酸領域（配列番号２の第１５４ないし１６４番目のアミノ酸）において、１または複数のアミノ酸の置換、除去又は付加を有するタンパク質が挙げられる。
【００３１】
具体的に意図されるＫＧＦタンパク質は、以下のＫＧＦ分子が挙げられる（配列番号２に示す成熟タンパク質（シグナル配列を差し引いたもの）中の位置に存在する残基により参照され、次に括弧内にアミノ酸位置が続き、さらに置換された残基または除去を示す「−」が続いている。）；ＫＧＦのΔＮ１５、ΔＮ１６、ΔＮ１８、ΔＮ２３、ΔＮ２４、ΔＮ２５、ΔＮ２６又はΔＮ２７、Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５‐ΔＮ２４、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ８／Ｃ（１５）−、Ｃ（１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ；Ｒ（１４４）ＱおよびＨ（１１６）Ｇ。
【００３２】
上皮および内皮細胞の多くの異なる種類に対するＫＧＦの増殖作用は、個体を冒す多くの状態又は疾患の処置における有用な治療薬であることを示唆している。下記は、本発明のＫＧＦを用いて処置することができる疾患および医学的状態についての説明である。
【００３３】
腸毒性は、放射線療法および化学療法の主な限定要因である。ＫＧＦによる事前処理は、小腸粘膜の細胞保護効果を有し得、腸毒性の可能性ある致命的副作用を減少させて、このような治療法の放射線量又は投与量を増加させることを可能にしよう。最近の、化学治療剤５‐フルオロウラシルによる処置前の、組換えヒトＫＧＦの患者への投与の第一相臨床試験は、ＫＧＦによる処置は粘膜炎の発生率を低下させることを示唆している［Ｍｅｒｏｐｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２１：１４５２−８（２００３）］。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、放射線誘発腸毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｗｉｔｈｅｒｓ ａｎｄ Ｅｌｋｉｎｄ， 「放射線に曝露されたマウス腸粘膜細胞のための微小コロニー生存率分析」（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｕｃｏｓａ Ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ．， １７：２６１−２６７ （１９７０）］。ヒトへの治療効能を予測可能な、化学療法誘発腸毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｓｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， 「化学療法、口腔外科により誘起された粘膜炎の動物モデル」（Ａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．）， Ｏｒａｌ Ｍｅｄ． Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．， ６９：４３７−４３１ （１９９０）； 及び、Ｍｏｏｒｅ， 「１２種類の細胞障害性薬剤に対するマウス腸陰窩細胞のクローン原性応答」（Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃｒｙｐｔｓ ｔｏ １２ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｒｕｇｓ）， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １５：１１−１５ （１９８５）］。
【００３４】
ＫＧＦ治療は、胃腸管の全体を通して粘液の産生に顕著な効果を有する。この性質は、摂取された有害物質から腸粘膜を保護するためにまたは炎症性腸疾患のような状態において損傷の拡大を制限するために有用であろう。
【００３５】
毛嚢、汗腺および皮脂腺などの付属器構造の増殖および分化の刺激は、火傷ならびに他の非全層型および全層型の損傷を有する患者の表皮および真皮の再生において決定的に重要である。現状において、表面の欠損は、瘢痕化およびケラチノサイトの表面再建により治癒しており、皮膚の完全な再生は未だ可能ではない。現在のところ、火傷を含む全層型の皮膚損傷では、毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖が起きることはない。ＫＧＦの使用は、このような再増殖を可能とし得る。火傷ならびに他の非全層型および全層型の損傷についてヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、付属器構造の増殖および刺激の標準インビボモデルは周知である［Ｍｕｓｔｏｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｄｅｒｍａｌ ｕｌｃｅｒ ｍｏｄｅｌ”， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８７：６９４−７０３ （１９９１）； Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＢＢ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）， ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １， ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｄｅｒｍａｌ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ”， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．， １４０：１３７５−８８ （１９９２）； 及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｇｒｅｅ ｂｕｒｎ ｈｅａｌｉｎｇ： ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ ａｎｄ ａ ｃｒｅａｍ”， Ｊ． ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓ．， ４８：２４５−２４８ （１９９０）］。
【００３６】
表皮水疱症は、表皮の、その下にある真皮への付着の欠損であり、重度の病的状態を引き起こしうる、頻繁な開口、苦痛を伴う水疱を生じる。ＫＧＦによる処置などによる、これら損傷の促進された再上皮形成は、感染の低いリスク、軽減された苦痛、創傷治癒の少ない負担をもたらすであろう。
【００３７】
化学治療誘発性の脱毛症は、患者が悪性腫瘍の化学治療クールによる処置を受けることで発症する。現状において、一時的な毛髪の損失を生じさせる毛根細胞の死滅を防ぐ有効な治療薬はない。ＫＧＦはそのような手法を提供する。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能である、化学治療誘発性の脱毛症の標準インビボモデルは周知である［Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， 「シクロスポリンＡはヌードマウスにおける発毛を刺激する」（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｈａｉｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ５６（６）：６８４ （１９８７）； Ｈｏｌｌａｎｄ， 「脱毛症の動物モデル」（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｏｐｅｃｉａ”， Ｃｌｉｎ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ， ６：１５９：１６２ （１９８８）； Ｈｕｓｓｅｉｎ， 「ラットモデルにおける化学療法により誘起された脱毛症からの保護」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｏｐｅｃｉａ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１５６４−１５６６ （１９９０）； 及びＨｕｓｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， 「新生ラット動物モデルにおいて、インターロイキン１は、１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンにより誘導された脱毛症に対する保護を与える」（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ １−Ｂ−Ｄ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｕｌｃｙｔｏｓｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｏｐｅｃｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｒａｔ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５１：３３２９−３３３０ （１９９１）］。
【００３８】
男性型禿頭症は、広まっており、本質的に治療不可能である。男性及び女性の進行性の毛髪の喪失は、深刻な美容上の問題である。ＫＧＦ欠損マウスは、逆立って乱れた外被を呈し、ＫＧＦ受容体ノックアウトは、菲薄皮膚、少ない数の毛嚢及び遅延した創傷の治癒を呈する［Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６：８１９−８２２ （１９９４）］。脱毛症の実験モデルでは、組換えＫＧＦの事前処置により、化学治療剤であるシトシンアラビノシド（ＡＲＡ−ｃ）の投与により誘発される脱毛症の約５０％が予防された［Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．， １４７：１４５−５４ （１９９５）］。これらの異常は、ＫＧＦを使用して、全身に、または薬剤が局所投与可能で、頭蓋を通して吸収されるのであれば局所的に、またはエアガン或いはこれに類似した技術を用いて噴霧注射により頭蓋に投与することで、治療することが可能である。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、男性型禿頭症の標準インビボモデルは周知である［Ｕｎｏ，「禿頭症モデルとしてのベニガオザル：ミノキシジルの効果」（Ｔｈｅ Ｓｔｕｍｐｔａｉｌｅｄ Ｍａｃａｑｕｅ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｂａｌｄｎｅｓｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８：６３−７１ （１９８６）； Ｐｏｒｔｅｒ Ｒ．， 「ヒト脱毛疾患のマウスモデル」（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｌｏｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）， Ｊ． Ａｎａｔ．， ２０２：１２５−３１ （２００３）］。
【００３９】
ＫＧＦの投与が、胃腸管の細胞増殖を促進し得たことを研究により示された［Ｐｌａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １８４：３１６−２２ （１９９８）］。胃潰瘍は、Ｈ２拮抗剤により処置可能であるが、かなりの罹患率及び再発生率を生じており、粘膜内層の瘢痕化により治癒される。例えばＫＧＦを用いた処置のように、胃潰瘍患者の腺粘膜をより迅速に再生する能力は、胃潰瘍治療に重要な治療法上の改善をもたらすであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、胃潰瘍の標準インビボモデルは周知であり、例えば、Ｔａｒｎａｗｓｋｉら［「インドメタシンは、実験的胃潰瘍の治癒の質を損なう：定量的組織学的及び超微細構造的分析」（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ Ｉｍｐａｉｒｓ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｕｌｃｅｒ Ｈｅａｌｉｎｇ： Ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ） 、「上部胃腸管の損傷、保護及び修復のメカニズム」（Ｉｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ）， （ｅｄｓ）（編集の意） Ｇａｒｎｅｒ ａｎｄ Ｏ’ｂｒｉｅｎ， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９１）］、及びＡｓｔｕｄｉｌｌｏら［「ラット及びマウスにおいて実験的に誘起された胃病変に対するオレアノール酸誘導体の胃保護効果」（Ｇａｓｔｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ）， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４：５８３−８ （２００２）］である。
【００４０】
十二指腸潰瘍は、胃潰瘍と同様に治療可能であるが、より完全に、より迅速に十二指腸の粘膜内層を再生する治療剤を開発することは重大な進歩であろう。それに加え、これら潰瘍を再生的に治癒し、再発症を低下させる治療剤は有益である。ＫＧＦがこのような能力を提供する。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、十二指腸潰瘍の標準インビボモデルは周知である［Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， 「パントテン酸欠損食餌により形成された十二指腸潰瘍」（Ｄｕｏｄｅｎａｌ ｕｌｃｅｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ａ ｄｉｅｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ”， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７：３７４−３７６ （１９４９）； Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｐｉｈａｎ， 「十二指腸潰瘍のシステアミン及びプロピオニトリルモデルの発生と意義」（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ｕｌｃｅｒ）， Ｃｈｒｏｎｏｂｉｏｌ． Ｉｎｔ．， ６：３１−４２ （１９８７）； Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける十二指腸潰瘍の分泌促進物質の生産」（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔａｔｏｇｕｅｓ ｏｆ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ｕｌｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ５９：９５−１０２ （１９７０）；及びＫｅｓｈａｖａｒｚｉａｎ．， 「ラットにおける、１−メチル −４−フェニル −１，２，５，６−テトラヒドロピリジン （ＭＰＴＰ）により誘起された胃十二指腸潰瘍：胃酸分泌の必要性及びプロスタグランジンの役割」（Ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｕｌｃｅｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （ＭＰＴＰ）： ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）， Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ７０：２１−４８ （１９９０）］。
【００４１】
びらん性胃炎、食道炎または食道逆流などの胃および食道のびらんは、治療可能であるが、より完全に、より迅速に胃および食道の粘膜内層を再生する治療剤を開発することは重大な進歩であろう。加えて、これらびらんを再生的に治癒し、再発症を低下させる治療剤は有益である。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、びらん性胃炎、食道炎または食道逆流などの胃および食道のびらんの標準インビボモデルは周知である［Ｇｅｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， 「ネコにおける、酸により誘起された食道炎の組織学的発達」（Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔ）， Ｍｅｄ−Ｐａｔｈｏｌ．， ３：６１９−６２４ （１９９０）； Ｃａｒｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， 「テトラサイクリンにより誘起された食道潰瘍。臨床及び実験的研究」（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｕｌｃｅｒｓ． Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ）， Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ， ９３：１８４−１８７ （１９８７）； Ｃａｒｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， 「経口投与された薬剤により引き起こされた食道病変。ネコにおける実験的研究」（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇｓ． Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔ）， Ｅｕｒ−Ｓｕｒｇ−Ｅｔｈａｎｏｌ ｏｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃａｔｓ， Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｃｌｉｎ−Ｅｘｐ−Ｒｅｓ．， １５：１１６−１２１ （１９９１）；及びＫａｔｚ ｅｔ ａｌ， 「ネコにおける酸により誘起された食道炎は、スクラルファートにより予防されるがプロスタグランジンＥによっては予防されない」（Ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ ｉｎ ｃａｔｓ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ．”， Ｄｉｇ−Ｄｉｓ−Ｓｃｉ．， ３３：２１７−２２４ （１９８８）］。
【００４２】
クローン病（主に小腸を冒す。）および潰瘍性大腸炎（主に大腸を冒す。）などの炎症性腸疾患は、病因が不明の慢性疾患であり、粘膜面の破壊、炎症、修復中の瘢痕および癒着形成および罹患個体への重度の病的状態を生じる。現段階での治療は、炎症を制御することが計画されているが、ＫＧＦ処置が、炎症性腸疾患に罹患した動物の胃腸管上皮の増殖を誘発することが示されている［Ｈｏｕｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４：１７６４−７７ （１９９４）］。粘膜面の表面形成を刺激し迅速な治癒をもたらすＫＧＦなどの治療薬は、疾患の進行を制御できる点で有用であり得る。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、炎症性腸疾患の標準インビボモデルは周知である［Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， 「ラット結腸における慢性炎症及び潰瘍形成のハプテン誘起モデル」（Ｈａｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ Ｃｏｌｏｎ”， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９６：７９５−８０３ （１９８９）； Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける実験的大腸炎の炎症メディエーター」（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９７：３２６−３２７ （１９８９）； Ａｌｌｇａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「ラットにおける、大腸炎のトリニトロベンゼンスルホンによる誘起の前後における１６，１６“ジメチル−プロスタグランジンＥ２による治療」（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ １６，１６’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｒａｔｓ）， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９６：１２９０−１３００ （１９８９）； 「総説：動物モデルにおける実験的大腸炎」（Ｒｅｖｉｅｗ： Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ”， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ， ２７：５２９−５３７ （１９９２）］。
【００４３】
未熟児の肺硝子膜症は、肺内のＩＩ型肺胞細胞による界面活性物質の生産も欠如をもたらし、肺胞が虚脱してしまう。肺硝子膜症には、急性期と慢性期の両方がある。急性期の肺硝子膜症（小児型呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ））は、機械換気と８０％ないし１００％の濃度の酸素補給による処置及び外因性表面活性剤の投与により治療できる。長期間の治療クールを受け続ける患者は、慢性疾患期の肺硝子症（気管支肺形成異常（ＢＰＤ））を発症する可能性がある。表面活性物質は、ＩＲＤＳに伴う死亡率を大きく低下させるが、ＢＰＤに伴う罹患率は高く維持されたままである。従って、新生児の肺の成熟および界面界面活性物質分泌を促進し、ＢＰＤの発生率を低下させる効果的な治療法の開発が必要である。コルチコステロイドは、２８週目およびそれ以上に大きな胎児の成熟および分泌を促すことができるが、現在のところ、それよりも未熟な胎児の治療法はなく、この集団に重大な罹患率と死亡率を引き起こしている。ＢＰＤの履歴は、ＩＲＤＳ治療法における改善が、より小さな未熟出生児の機械換気、及び、それに続くこれらより小さな小児のＢＰＤ罹患率の増加に適合していることを示唆している。ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化を促すＫＧＦ［Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２２：３１５−２５ （１９９８）］のような治療剤は、当疾患の治療に大きな利益となるであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、ＩＲＤＳの標準インビボモデルは周知である［Ｓｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ， 「未熟ウサギにおける界面活性剤可動化に対する出産前の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、出産前のコルチコステロイド及び出産後換気の効果」（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｅｎａｔａｌ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ， ａｎｔｅｎａｔａｌ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ， ａｎｄ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｒａｂｂｉｔｓ）， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃ．， １６６：１５５１−１５５９ （１９９２）； Ｉｋｅｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， 「早期産ヒツジ肺機能に対するコルチコステロイド及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの効果」（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｓｈｅｅｐ ｌｕｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ７０：２２６８−２２７８ （１９９１）］。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、ＢＰＤの標準インビボモデルは周知である［Ｙｕｈ−Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ， 「霊長類における、天然の界面活性剤及び超酸化物による肺損傷。Ｉ．生理学及び生化学」（Ｎａｔｕｒａｌ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｉ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ７６：９９１−１００１ （１９９４）、及び Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ．， 「早期産ヒヒにおける肺硝子膜症の予防のための、子宮における界面活性剤置換」（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｉｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂａｂｏｏｎ）， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｔｓｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．， １６９：８１７−８２４ （１９９３）］。
【００４４】
煙吸引は、細気管支上皮と肺胞の壊死により、火傷に次いで、重大な病的状態および一週間以内の死亡を引き起こす重要な原因である。これらの構造の増殖及び分化を刺激し、修復及び再生を誘発するＫＧＦなどの増殖因子は、吸入傷害の治療に有益であろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、煙吸引の標準インビボモデルは周知である［Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ， 「ヒツジにおける煙吸入傷害」（Ｓｍｏｋｅ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｓｈｅｅｐ）， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １３３：６６０−６６３ （１９９８）］。
【００４５】
気腫は、肺胞の進行性喪失により生じる。再増殖を刺激し得または残存する肺胞にとって細胞保護的なＫＧＦ［Ｋａｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０６（１２ Ｓｕｐｐｌ １）： Ｉ１２０−４ （２００２）］のような増殖因子は、治療上有益であろう。現状においては、効果的な治療はない。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、気腫の標準インビボモデルは周知である［Ｓｔｏｌｋ ｅｔ ａｌ， 「ハムスターにおけるリポ多糖の気管内滴下による肺気腫及び気管支粘液細胞過形成の誘起」（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｍｕｃｕｓ ｃｅｌｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｍｓｔｅｒ）， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １６７：３４９−５６ （１９９２）］。
【００４６】
肝硬変は、ウィルス性肝炎及び慢性的アルコール摂取に続く第２期のものであり、重度の病的状態と死亡率の原因である。ＫＧＦの使用などによる、肝機能を増加させるための幹細胞の細胞保護、増殖及び分化［Ｄａｎｉｌｅｎｋｉ， Ｄ．， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ， ２７： ６４−７１ （１９９９）］は、肝硬変の発症を遅らせ又は予防するために有益であろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、肝硬変の標準インビボモデルは周知である［Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， 「ラットにおける肝硬変の生成」（Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ”， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １１：２２９−２３１ （１９９１）］。
【００４７】
劇症肝不全は、命を脅かす状態であり、肝硬変の最終段階にて発症する。現在において、肝臓移植によってのみ処置可能なこの疾患に対し、残存する肝細胞の増殖を促進できるＫＧＦのような薬剤は、直接的な利益となるであろう。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、劇症肝不全の標準インビボモデルは周知である［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， 「アセトアミノフェンにより誘起された肝壊死Ｉ．薬剤代謝の役割」（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｉ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）， Ｊ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １８７：１８５−１９４ （１９７３）； 及びＴｈａｋｏｒｅ ａｎｄ Ｍｅｈｅｎｄａｌｅ， 「ＣＣ１４自己防御における肝細胞再生の役割」（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＣ１４ ａｕｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌ， １９：４７−５８ （１９９１）］。
【００４８】
急性ウィルス性肝炎は、しばしば潜在的であり、自己制御される。しかしながら、少数派の患者においては、重度の肝臓損傷が数週間に渡って生じる。ＫＧＦのような細胞保護剤が、肝細胞の変性予防に有用であろう。
【００４９】
アセトアミノフェン、ハロタン、四塩化炭素および他の毒素により生じる肝臓への毒性傷害は、肝細胞にとって細胞保護的な増殖因子（ＫＧＦ）により改善されようる。ヒトへの治療効能を有する化合物による予測試験が可能な、肝毒性の標準インビボモデルは周知である［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， （１９７３）， 上掲，及びＴｈａｋｏｒｅ ａｎｄ Ｍｅｈｅｎｄａｌｅ， （１９９１）， 上掲］。
【００５０】
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）（慢性または急性）は、無力化した骨髄、又は、患者への造血細胞の移植の第一要因である。ＧＶＨＤは、免疫調節及び細胞毒性因子の増加作用により、種々の器官系への損傷を及ぼす。ＧＶＨＤは、胃腸管、肺、肝臓、皮膚ならびに目の粘液腺、口腔内の唾液腺および胃の内壁と腸を滑らかにする腺を含む多くの領域に損傷をもたらす。ＧＶＨＤが誘発された動物を用いた最近の研究は、ｒＨｕＫＧＦで処置されたレシピエントは、腸にＧＶＨＤを発症せず、内毒血症を発生せず、死に至ることがなかったことを示している［Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ ｅｔ ａｌ， 「ケラチノサイト増殖因子は、条件付けにより誘起された組織損傷の修復から独立した機構により、マウス内での同種移植を促進し、対宿主性移植片病を緩和する」（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ）， Ｂｌｏｏｄ， ９６：４３５０−６ （２０００）］。これらのデータは、ＫＧＦが、ＴＮＦ−α、ＮＯ及び他の潜在的な細胞毒性因子が介する上皮細胞の損傷を保護することにより、急性で致命的なＧＶＨＤの発症を防いでいることを示唆している。これら様々なタイプの上皮細胞の増殖を促すＫＧＦのような薬剤は、ヒト移植レシピエントのＧＶＨＤ治療に直接的な利益となるであろう。
【００５１】
製剤と投与
ＫＧＦタンパク質またはペプチドは、前述したヒトの疾患を治療するための医薬製剤として有用である。ＫＧＦは、液体または凍結乾燥された剤形として調製することができる。好ましい実施形態において、ＫＧＦ組成物は凍結乾燥される。凍結乾燥は、当分野において周知の技術により行なうことができ、開発中の組成物用に最適化すべきである［Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， ２１：１９１−２００ （２００４）， 及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， １３：２４３−９ （１９９６）］。
【００５２】
凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、第１乾燥および第２乾燥の３段階から成る［Ａ．Ｐ． Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｓｅｒ Ｂ， Ｂｉｏｌ， ２７８：１６７ （１９７７）］。凍結段階では、溶媒を冷却して、氷形成を開始させ完了させる。さらに、この段階は充填剤の結晶化を引き起こす。真空を用いおよび昇華を促進するために熱を加えて、チャンバー内の圧力を氷の蒸気圧よりも下になるように減圧する第１乾燥段階において、氷は昇華する。最後に、第２乾燥段階において、吸収水または結合水は、減圧されたチャンバー内圧力と上昇した棚温度の下で取り除かれる。この工程により、凍結乾燥ケーキとしてしられ知られている物質が作られる。その後において、このケーキは、注射用の蒸留水または使用前に適当な種々の投与用復元溶液を用いて復元することができる。
【００５３】
この凍結乾燥サイクルは、賦形剤の最終的な物理的状態を決定するだけではなく、復元時間、外観、安定性及び最終的な水分の含量などの他のパラメーターにも影響する。凍結状態にある組成物の構造は、特異的な温度で起こり、凍結乾燥の工程を理解し、最適化するために利用できるいくつかの転移（例えば、ガラス転移や結晶化）を経る。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、溶質の物理的状態についての情報を提供し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定できる。これは、凍結乾燥サイクルを設計するにあたって、考慮に入れねばならない重要なパラメーターである。さらに、乾燥状態において、このガラス転移温度は、最終生産物の保存温度についての情報をもたらす。
【００５４】
本組成物の特定の実施形態において、凍結乾燥又は保存により引き起こされる凝集や化学分解を防止又は低下させるために、安定化剤を凍結乾燥製剤に添加する。復元した際の霞んだもしくは濁った溶液は、タンパク質が沈殿していることを表す。「安定化剤」という語句は、水溶液中または固体の状態において、化学分解（例えば、自己分解、アミド分解、酸化等）に加えて凝集および他の物理的分解を防ぐことのできる賦形剤を意味する。スクロース、トレハロース又はグリシンを含む、医薬組成物に従来から用いられている安定化剤を用いることができるが、これらに限定されるものではない［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄａｒｄ．， ７４： ２２５ （１９９１）］。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）又はポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）などの界面活性安定剤を適当量添加して、凍結中および乾燥中の表面に関連した凝集現象を防止することができる［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８５： １２３５ （１９９６）］。必要に応じ、凍結乾燥された組成物は、凍結乾燥「ケーキ」を形成するのに適した充填剤および浸透圧調整剤を適当量含有する。充填剤は結晶性（例えば、マンニトール、グリシン）又は非結晶性（例えば、スクロース、ポリマー（例えばデキストラン）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース）であり得る。一実施形態において、この充填剤はマンニトールである。さらなる実施形態において、このマンニトールは、約２％ないし５％ｗ／ｖの濃度で混合され、さらなる実施形態において、約３％ないし４．５％ｗ／ｖの濃度にあり、力学的かつ医薬的に安定で上質なケーキを産生する。もう１つの実施例では、前記マンニトール濃度は、２％ｗ／ｖである。
【００５５】
医薬的に許容できる緩衝液とｐＨの選択は、本組成物の安定性に影響することが見出された。本組成物中に存在する緩衝系は、生理学的な適合性するように選択され、凍結乾燥前の溶媒だけでなく復元溶液をも望ましいｐＨに維持するものが選択される。好ましくは、この緩衝液は、約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ８．０の範囲でｐＨ緩衝能を有する。上述したパラメーターを組み入れた一連のスクリーニングの研究は、概して最も安定な剤形条件を選択するように行なわれた。
【００５６】
本組成物は、凍結乾燥状態で、２℃ないし８℃において、少なくとも２年間は安定であることが見込まれる。この長期に渡る安定性は、医薬製品の保存期間を増加させるために有益である。
【００５７】
本発明はさらに、ＫＧＦ製剤の調製方法を意図する。一形態において、
（ａ）ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤からなる緩衝液中にＫＧＦ組成物を混合する段階、
（ｂ）ＫＧＦを凍結乾燥する段階、
を含む凍結乾燥されたＫＧＦ製剤の調製方法である。
【００５８】
本方法は、さらに、次の１または複数の段階を含む。凍結乾燥の前に、混合物に安定化剤を添加する段階、凍結乾燥の前に、混合物に充填剤および浸透圧調整剤および界面活性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を添加する段階。この充填剤は、上記で述べたものであれば、いかなる充填剤でもよい。好ましくは、この充填剤はマンニトールである。糖は、上記で述べたものであれば、いかなる安定化糖でもよい。一実施形態において、この安定化剤はスクロースである。この界面活性剤は、上記で述べたものであれば、いかなる界面活性剤でもよい。一実施形態において、この界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００５９】
凍結乾燥された物質の基本的な復元手段は、一定体積の純水又は注射用の蒸留水（ＷＦＩ）を加え戻すこと（典型として、凍結乾燥により取り除かれた量と等しい体積）であるが、非経口投与用の医薬製品においては、しばしば抗菌剤の希釈溶液が用いられる［Ｃｈｅｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １８： １３１１−１３５４ （１９９２）］。
【００６０】
この凍結乾燥されたＫＧＦ組成物は、水溶液として復元され得る。種々の水性担体、例えば注射用の蒸留水、複数投与使用のための保存剤が入った水もしくは適切な量の界面活性剤（例えばポリソルベート２０）が入った水、０．４％食塩水、０．３％グリシン又は水性懸濁液などは、水性懸濁液の生産に適した賦形剤との混合物として活性化合物を含むことができる。このような賦形剤は、懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント、アカシアガム）であり、分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）または脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアラート）または長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばヘプタデカエチル−エネオキシセタノール）または脂肪酸およびヘキシトールから得られた部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）または脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られた部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。この水性懸濁液は、例えばエチル又はｎ‐プロピルパラヒドロキシ安息香酸といった保存剤の１つまたはは複数を含み得る。
【００６１】
本発明の組成物をヒトもしくは試験動物に投与するために、この組成物を、１つまたは複数の医薬的に許容される担体を含む組成物に調合することが好ましい。「医薬的に」または「薬理学的に許容される」という語句は、安定で、凝集や分解産物などのタンパク質分解を阻害するおよび後述の当分野で周知の経路で投与した場合にアレルギーまたは他の有害な反応を生じない分子的実体及び組成物を指す。「医薬的に許容される担体」は、上述した薬剤も含む、全てのおよびいずれかの臨床的に有用な溶媒、分散媒、被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを包含する。
【００６２】
本ケラチノサイト増殖因子組成物は、経口、局所、経皮、非経口、噴霧剤の吸引、経膣、直腸投与または頭蓋内注射により投与してよい。ここで用いられる非経口投与という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射または点滴による方法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜内、球後、肺内の注射及び／又は適所への外科的移植による投与も同様に意図する。通常、組成物は、発熱物質を本質的に含まず、レシピエントに有害と思われる夾雑物も同様に含まない。
【００６３】
キット
追加の形態として、本発明は、化合物や組成物を対象へ投与する使用を容易にするような方法により、１つまたは複数の化合物または組成物が梱包されたものを含むキットを包含する。一実施形態において、このようなキットは、密封された瓶または容器に包装されたここに記載されている化合物または組成物（例えば、ケラチノサイト増殖因子を含む組成物）を、本方法の実施における本化合物または本組成物の使用について述べている、容器に付されたまたは包装に含まれたラベルと共に含む。一実施形態において、このキットは、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物が入った第１の容器とおよびこの凍結乾燥された組成物のための生理学的に許容される復元溶液が入った第２の容器とを包含する。好ましくは、この記化合物または組成物は、単一投与形態にて包装されている。さらに、このキットは、本組成物を具体的な投与経路にそって投与するために適した装置を含む。好ましくは、このキットは、本ケラチノサイト増殖因子組成物の使用を記載したラベルを含む。
【００６４】
本発明のさらなる形態および詳細は、下記実施例から明白である。
【実施例１】
【００６５】
ＫＧＦの液体製剤
製品安定性、保存寿命および生物活性は、あらゆる治療上有効な組成物にとって重要な側面である。推奨される保存温度下で長期に渡って保存しても安定であり、しかし有効な生物活性を維持する組成物の設計及び製剤は、医薬組成物の鍵となる要素である。
【００６６】
先の実験において、ＫＧＦの液体製剤は、重度の凝集およびそれに続いて高められた温度（３７℃）下でのタンパク質の損失を示した。ＫＧＦ組成物に最大の安定性を提供するｐＨを決定するために、ケラチノサイト増殖因子の液体製剤液剤のｐＨを、３．０ないし９．０のｐＨ範囲にて試験した。
【００６７】
以下の実験、例えば実施例１ないし３において使用されたＫＧＦは、ΔＮ２３ ＫＧＦ分子である。溶液のｐＨは、濃ＨＣｌまたは水酸化ナトリウムのいずれかを用いて調整した。異なるｐＨにおけるＫＧＦ製剤（０．５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ緩衝液、０．１ＭＮａＣｌ）のサンプルは、３７℃で温置して０、６および２８時間後に採取した（図１）。回収したタンパク質のパーセントは、ＳＥ−ＨＰＬＣ（図１Ａ）またはＣＥ−ＨＰＬＣ（図１Ｂ）により測定した。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）のために、サンプル（４０μｇ）は、ＨＰ １０９０／１０５０マシンに接続されたＧ２０００ＳＷｘ１カラム（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）に負荷した。前記タンパク質は、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰ）、１ＭＮａＣｌを用いて溶出させた。タンパク質は２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。単一のピークは、このＫＧＦの製剤中に凝集が殆どないことを示す。
【００６８】
陽イオン交換（ＣＥ）−ＨＰＬＣは、室温にて、Ｍｏｎｏ−Ｓカラムを装備したＨＰ １０９０／１０５０マシンにより行なわれた。４０μｇのＫＧＦタンパク質を、前記カラムに負荷し、ｐＨ８の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液および塩勾配（１ＭＮａＣｌ）を用いて溶出させた。溶出したタンパク質は２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【００６９】
逆相−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、Ｖｙｄａｃの孔径３００ＡのＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、ＨＰ１０９０／１０５０マシンにより行なわれた。タンパク質（３０μｇ）は、前記カラムに注入され、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）入りのアセトニトリル（ＣＡＮ）勾配、及び９０％ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水を用いて溶出させた。タンパク質のピークは２１５ｎｍにおける吸光度によりモニターした。
【００７０】
タンパク質の完全な回収が、時間０において、ｐＨ５．０ないし９．０の範囲で観察された。しかしながら、ｐＨ３．０においては、タンパク質の完全な喪失が確認され、ｐＨ４．０では、急速な沈殿によりタンパク質の８０％を喪失した。３７℃にて６時間経過時では、ｐＨ４．０のサンプルからは、可溶性のタンパク質を得ることができなかった。可溶性ＫＧＦをｐＨ５ないし９にて製剤し、３７℃にて２８時間経過時の回収したタンパク質パーセントは、２０％未満であった。しかしながら、ｐＨ７．０では、全タンパク質のうちわずか２０％のみが失われた。３７℃にて２８時間経過時の可溶性タンパク質の喪失は、主に凝集によるものであった。
【００７１】
これらの結果から、液体製剤中におけるＫＧＦタンパク質は、中性のｐＨにて最も安定であることを示しているが、しかし、この最適なｐＨの範囲内であっても、ＫＧＦを液体で保つことは、凝集による重大なタンパク質の喪失がもたらされる。
【実施例２】
【００７２】
凍結乾燥のためのＫＧＦ組成物の製剤
より安定なＫＧＦ組成物を開発するため、ＫＧＦを凍結乾燥産物として製剤することに決定した。凍結乾燥されたＫＧＦ組成物を製剤する前回の試みは、復元溶液の取り扱いを伴い、復元溶液の組成に依存して、より少ないタンパク質凝集を作る組成物を生じた［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， １２：１４４７−５２ （１９９５）］。しかしながら、この前回の研究において、復元時に見られる凝集は、いずれも元に戻すことが非常に困難であるか、または不可能であった。
【００７３】
この実施例は、復元溶液によらずに復元に伴う凝集を防ぎ、あつらえの復元溶液の必要性を排除する、溶液中のこのタンパク質の凍結保存について説明する。
【００７４】
安定な凍結保存製剤の組成物を決定するため、ｐＨ、充填剤、糖濃度および界面活性剤濃度などのパラメーターを変更した種々の条件下でＫＧＦ、例えばΔＮ２３ ＫＧＦ、の凍結乾燥を行った。その後、ＫＧＦの長期保存安定性が推奨保存温度下にて測定された。
【００７５】
凍結乾燥サイクル
凍結乾燥のために、サンプルは、約４℃のチャンバー温度に事前冷却したＶｉｒＴｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ ＥＬパイロット型（ＶｉｒＴｉｓ， Ｇａｒｄｉｎｅｒ， ニューヨーク州）凍結乾燥機に負荷された。サンプルは急速に凍結され（約１℃／分にて−５０℃まで）、最低２時間はその温度を維持した。サンプルを凍結保存機に載せると、棚温度は約２７℃／時間の率で−５０℃まで下げられた。サンプルは、−５０℃にて２時間維持され、完全な凍結を確実なものにした。マンニトールを結晶化させる任意の工程では、前記棚温度は１０℃／時間の率で−５０℃まで上げられて２−３時間平衡化され、次いで９℃／時間の率で−５５℃まで下げられた。追加して最低２時間維持した後に、約１００ｍＴｏｒｒの真空を適用した。第１乾燥のために棚温度は−３５℃まで上げられたが、しかし、−４５℃ないし−１０℃の範囲内であればよい。第１乾燥は４０時間継続されたが、２４−４８時間の範囲内であればよい。次いで、第２乾燥のため、棚温度は５℃／時間の率で＋２０℃ないし＋２５℃まで上げられ、真空は約５０ｍＴｏｒｒまで弱められた。第２乾燥は３６時間行なわれたが、２４から７２時間のどこかで行なうことができる。第２乾燥の終結で、サンプルは真空下（２５ｍＴｏｒｒ以下）にて封入され、バイアルは凍結乾燥機から取り外された。バイアルは止め蓋で閉じられ、安定性試験のために様々な温度下に置かれた。
【００７６】
凍結乾燥されたＫＧＦの安定性へのｐＨの影響
一連のｐＨ値におけるＫＧＦの安定性が先ず評価された。ＫＧＦ（５ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースおよび０．０１％ポリソルベート２０を含み、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５又はｐＨ７．０のいずれかにある溶液中で製剤した。凍結乾燥前のサンプルのＳＥ−ＨＰＬＣは、９９％のメインピーク百分率を示し、これは９９％の単一の活性成分に相当する。
【００７７】
さらに促進した安定性の調査を行なうため、サンプルのいくつかは保存用の保温器に移された。その他のサンプルは、対照とするために−７０℃の冷凍庫に移された。大部分のバイアルは４℃にて保存された。解析の時点で、サンプルは１．２ｍＬの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で復元された。
【００７８】
４５℃にて６ヶ月保存後の凍結乾燥されたＫＧＦサンプルのＳＥ−ＨＰＬＣは、全てのｐＨでのサンプルのメインピーク百分率が約９７．５％であることを示し、６．０ないし７．０のｐＨ範囲内では、凍結乾燥されたＫＧＦは、高温下で６ヶ月間の保存の後でも安定であることが示された。また、これらの調査は、５．０ないし８．０のｐＨ範囲は、製剤が４℃に保たれた場合に安定なタンパク質を提供することを示した。
【００７９】
ＫＧＦの安定性へのスクロース濃度の影響
凍結乾燥されたＫＧＦに最大の安定性を提供するスクロール量を評価するために、組換えヒトＫＧＦ（１ｍｇ／ｍｌ）を、スクロースを含まない、又は２％スクロース（ｗ／ｖ）を含む溶液中で、ｐＨ７．０の１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトールを含む組成物に製剤した。このサンプルは、上記のように凍結乾燥され、４５℃にて３ヶ月間インキュベートされた。
【００８０】
スクロース入り又はスクロース無しでのＫＧＦ製剤のメインピーク百分率のＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、２％のスクロースの添加が凍結乾燥ＫＧＦ製剤に有意な安定性を提供することを示す。２％スクロースと共に凍結乾燥されたＫＧＦは、凍結乾燥直後に約９９．５％のメインピークを示し、凍結乾燥後１ヵ月後および３ヵ月後の両方で９８．５％を示した。スクロースなしの製剤は、凍結乾燥後１ヵ月後および３ヵ月後に、それぞれ、約９６％のメインピークと約９３．５％のメインピークを示した。
【００８１】
これらの結果は、スクロースなしの製剤では、４５℃にて３ヶ月間保存した後にパーセント活性単一ピークが７％減少したが、スクロース有りの製剤では、単一ピークはほんの僅かしか減少しなかったことを示す。従って、凍結乾燥製剤に添加すると、スクロースは強力な安定化剤としてＫＧＦに作用する。
【００８２】
適切なマンニトールの百分率により溶液が常時等張性を維持する、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５のスクロース濃度が１％ないし３％のスクロースを含むＫＧＦの凍結乾燥産物を用いてさらなる解析を行った。１％ないし３％のスクロースを有し、３７℃で１年間保管された凍結乾燥産物は、テストされた全ての製剤において９９％を超えるメインピーク百分率を維持しており、２％スクロース入りの製剤に匹敵するタンパク質安定性を示した。
【００８３】
ＫＧＦの安定性へのポリソルベート２０の濃度の影響
復元における粒子形成を排除する能力に基づき、ＫＧＦの凍結乾燥製剤中のポリソルベート２０濃度が選択された。組換えヒトＫＧＦは、１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースを含むｐＨ７．０の組成物に製剤され、凍結乾燥された。次いで、ＫＧＦは、異なる濃度のポリソルベート２０を含む溶液中で復元された。凍結乾燥ケーキは、上記のように製剤された５ｍｇ／ｍｌのＫＧＦをその構成とした。表１は、復元した際の、前記凍結乾燥製剤の観測記録を記す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
さらなる研究により、凍結乾燥前にポリソルベート２０をケーキに含ませた製剤が、復元溶液にポリソルベート２０を添加した場合と比較して、４５℃にて４ヶ月後に同等に安定であることが示された。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析［Ｂｉｏｒａｄ Ｂｉｏｓｉｌ ＳＥＣ １２５（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）、２０ｍＭＮａＰ、ｐＨ７．０、１ＭＮａＣｌ、４０μｇ注入負荷］は、０、１および４ヶ月で試験を行った全てのポリソルベート濃度において、単一のＫＧＦの喪失は無視できる程度であったことを示した（表１と同様）。復元の際に目視できる粒子を安定して排除する能力に基づき、０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度を、製剤に含ませることにした。
【００８６】
ＫＧＦの安定性へのマンニトール濃度の影響
マンニトールおよび他の充填剤が製剤に含まれ、それにより良質なケーキの外観と品質を得ることができる。加えて、これらは、生理液を含む医薬組成物の等張性を維持する助けをする。例えば、生理液は、２９０−３２０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。最終的なＫＧＦ製剤のマンニトール濃度は、生理液と等浸透圧になるように調整した。
【００８７】
凍結乾燥剤形に安定性を提供するマンニトール濃度の百分率を評価するため、３ｍｇ／ｍｌのＫＧＦを、ｐＨ７の、１０ｍＭヒスチジン、２％スクローおよび０．０１％ポリソルベート２０を含み、３％マンニトールまたは４％マンニトールのいずれかを含む製剤に凍結乾燥した。このＫＧＦ製剤は、凍結乾燥され、４℃にて１年間保管された。浸透圧は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製（Ｎｏｒｗｏｏｄ， マサチューセッツ州）のＯｓｍｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３Ｄ３を用いて測定された。４％マンニトール溶液における実測浸透圧は３１２ｍＯｓｍであり、一方３％マンニトール製剤は、２５０ｍＯｓｍの溶液を生じた。
【００８８】
図２は、等張性の４％マンニトール／２％スクロース製剤を、僅かに低張性の３％マンニトール／２％スクロース製剤と比較した逆相（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを重ね合わせた図であり、４℃保存の時刻ゼロ（図２Ａ）または１年経過時（図２Ｂ）に採られた図を示す。これらの結果は、等浸透性の製剤はは、２℃ないし８℃の推奨保存温度下で１年経過後でも安定であることを示す。加えて、これらの浸透性の製剤は、ケーキの外観が良好で、その含水率は２％未満であった。本研究に基づき、４％のマンニトールが凍結乾燥剤形への使用に推奨された。
【００８９】
ｒＨｕＫＧＦの安定性へのタンパク質濃度の影響
凍結乾燥されたサンプル中のタンパク質濃度はまた、復元された産物の安定性に加え、タンパク質の凍結乾燥の質の安定性にも影響する。
【００９０】
安定性に対するＫＧＦ濃度の影響を、０．５、１、２、３および５ｍｇ／ｍｌにて探査した。サンプルは、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン、３％マンニトール、２％スクロースおよび０．００５％ポリソルベート２０中で製剤され、凍結乾燥された。この凍結乾燥されたサンプルは、復元まで４５℃にて２４週間保管された。タンパク質分解は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＣＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察した。この実験においては、ＨＰシステムとＧ２０００ＳＷｘ１カラムを用いて、上記同様にＳＥ−ＨＰＬＣを行なった。
【００９１】
図３は、４５℃で２４週間保管後のＫＧＦのＳＥ−ＨＰＬＣ解析から得られた、タンパク質濃度の関数としてのメインピーク百分率を表す。点線は、実測データに対する動向ラインを表す。ＳＥ−ＨＰＬＣデータによれば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度までは、安定性はＫＧＦ濃度の上昇に伴って上昇した。ＲＰ−ＨＰＬＣやＣＥ−ＨＰＬＣによって測定されたメインピーク百分率のタンパク質濃度依存性についても、ＳＥ−ＨＰＬＣに見られたのと同様であった。さらなる研究により、１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度も、安定な凍結乾燥製剤を生み出すことが示された。
【００９２】
ｐＨ６．５の、１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート２０、２％スクロースおよび３％マンニトールを含む最適化されたＫＧＦ凍結乾燥製剤は、２℃ないし８℃にて４年間にわたり保存された。このＫＧＦ製剤は、復元すると、下記に試験されたように、ＫＧＦ活性を維持していることが示され、特定の組成物が、治療効果のある医薬組成物に必要な型の安定性と活性を保持したことを示している。
【実施例３】
【００９３】
復元したＫＧＦ製剤のバイオアッセイ
医薬的に有効な製品の製剤の１つの要素は、対象タンパク質の高い生物学的活性の必要要件である。
【００９４】
ＫＧＦ（例えばΔＮ２３ ＫＧＦ）製剤の生物活性を、３２Ｄ ＫＥＣＡクローン１６細胞（これは、Ｈｓｕら（１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８、２５２３−２５３４）に記載されているように、３２Ｄクローン３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３４６）と同様、ＫＧＦ存在下で増殖し、したがって増殖アッセイシステムとして有用な、ＩＬ−３依存性マウスリンパ芽球である。）を用いて、試験した。
【００９５】
３２Ｄクローン１６細胞は、生育培地［ＲＰＭＩ、ウシ胎児血清（１０％）（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ユタ州）、グルタミン（１％）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， カリフォルニア州）、ジェネティシン（２％）（Ｇｉｂｃｏ）及びマウスＩＬ−３（１２ｎｇ／ｍＬ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃａｎａｒｉｌｌｏ， カリフォルニア州）］中に、３７℃、５．５％ＣＯ２にて維持された。サンプルＫＧＦ製剤と参照標準（ΔＮ２３ＫＧＦの−７０℃にて保存、凍結乾燥）は、アッセイ培地［ＲＰＭＩ、ＦＢＳ（６％）、グルタミン（１％）、ヘパリン（０．６μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）］で、約２５ｎｇ／ｍＬに復元された。次いで、一連の希釈液が作成され、約２５ｎｇ／ｍＬから１．６ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が得られた。
【００９６】
ＫＧＦ製剤の生物学的活性を試験するために、３２Ｄクローン１６細胞は、２．０ｘ１０５細胞／ｍＬにて１５０μＬ分が平板接種された。所望の濃度の、参照標準、対照およびＫＧＦ試験サンプルは、５０μＬの体積でサンプルウェルに加えられた。細胞のプレート及びサンプルは３７℃、５．５％ＣＯ２にて、約２４時間温置された。第２日目に、４０μＬのＡｌｏｍａｒ Ｂｌｕｅ（ＡｃｃｕＭｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃｈｉｃａｇｏ， イリノイ州）が全ウェルに添加され、撹拌された。これらプレートは、３７℃、５．５％ＣＯ２にて、もう一度２４時間温置された。２４時間後、蛍光が、５３０−５６０ｎｍの励起波長、および５９０ｎｍの放射波長を用いて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ （Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩ又はＣｙｔｏｆｌｕｏｒシリーズ４０００、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， マサチューセッツ州）にて測定された。
【００９７】
２℃から８℃で７日間保存されて復元された３つのロットの凍結乾燥されたＫＧＦ製剤は、参照標準ＫＧＦタンパク質（−７０℃にて凍結乾燥、保存された）と似た生物学的活性を示し、０日目で≧１００％の生物学活性を、７日目でそれぞれ９２％、１００％および１０７％の活性を示した。２５℃で保管されたＫＧＦ製剤は、時間０で≧１００％の生物学活性を示し、４時間後に、天然ＫＧＦと比較して、９０％、９５％および１００％にそれぞれわずかに低下した。この活性レベルは、復元されたＫＧＦ製剤を２５℃にて２４時間保管したあとでも維持されており、ＫＧＦ製剤の安定性を示している。
【００９８】
これらの結果は、ここに記述する復元されたＫＧＦ製剤が、参照標準のＫＧＦタンパク質と同程度の効力を有することを示し、この製剤はＫＧＦ（例えばΔＮ２３ ＫＧＦ）の安定性又は効力に何らの有害な影響を及ぼさず、従って、上皮細胞などの増殖を促進して個体を処置する治療法に有効であることを示している。
【００９９】
加えて、ＫＧＦの生物学的活性は、復元された製剤の、Ｂａｌｂ／Ｃ−ＭＫ細胞の増殖を促進する能力により評価することができる。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞の保存株は、１０％ウシ胎児血清、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌａＰＧＦが補充された、低カルシウムのダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中にて、生育させ、維持される。この細胞は、３７℃にて１０％ＣＯ２雰囲気下、湿度９９％で温置される。生物学的活性のアッセイのために、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら［Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４２：３２５−３３３ （１９９０）］に記載されているとおり、細胞は１２ウェルプレートのウェル毎に、１ｍＬの培地中５ｘ１０３細胞の濃度で接種される。事前に決定した量のＫＧＦ製剤を細胞培養ウェルに添加する。ＦＧＦを陽性対照として用いる。
【０１００】
培養から５日後、細胞をトリプシン処理し、セルカウンターを用いて最終細胞濃度を測定する。細胞は、培養培地を０．９％ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ（ＳＴＶ）を含む溶液と交換し、３７℃にて５−１０分間温置して、プレートから離される。次いで、保存培養培地がこの細胞に加えられる。
【０１０１】
ＫＧＦで処理されたサンプルにおけるＢａｌｂ／Ｃ−ＭＫ細胞の密度の、非処理細胞と比べての増加は、ＫＧＦ組成物が、製剤工程中にその生物活性を失わないことを示し、ＫＧＦ製剤が、より高いＫＧＦ活性を必要とする処置対象への有効な治療剤を提供することを示している。
【０１０２】
上記の例示的実施例にて説明される本発明についての多数の改変や変形が生じることは、当業者の予期するところである。従って、本発明には、付随する特許請求の範囲に現れる制限のみが載せられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、異なるｐＨにおける液体ＫＧＦ製剤中の可溶タンパク質のサイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ（図１Ａ）及び陽イオン交換（ＣＥ）−ＨＰＬＣ（図１Ｂ）分析を表す。
【図２】図２は、１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート２０および４％マンニトール／２％スクロースまたは３％マンニトール／２％スクロースのいずれか一方中にて凍結乾燥されたＫＧＦ製剤を比較する、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣクロマトグラムを表す。図２Ａは凍結乾燥後から時間ゼロをを表し、図２Ｂは４℃で１年間保管後の産物を示す。挿入図は、メインピーク周辺の領域を示す。
【図３】図３は、４５℃で２４週間保存した後の、凍結乾燥されたＫＧＦ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ分析からの、タンパク質濃度の関数としてのメインピーク百分率を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）組成物。
【請求項２】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記充填剤が、マンニトールである、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記マンニトールが、約２％ないし約５％ｗ／ｖの濃度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記マンニトールが、４％ｗ／ｖの濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記糖が、スクロースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記スクロースが、約１％ないし約３％ｗ／ｖの濃度である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記スクロースが、２％ｗ／ｖである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐＨが、約６．０から約８．０の範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｐＨが、約６．０から約７．０の範囲内である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｐＨが、６．５である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．１％から約０．００４％ｗ／ｖの範囲内である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリソルベート２０の濃度が、０．０１％ｗ／ｖである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＫＧＦの濃度が、３ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬの間にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＫＧＦの濃度が、５ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロースおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含み、ｐＨ６．５である、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物。
【請求項２０】
ａ）ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤の溶液を調製する段階、および
ｂ）前記ＫＧＦを凍結乾燥する段階
を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作出方法。
【請求項２１】
凍結乾燥の前に、
ｂ）前記溶液のｐＨを約６．０から約８．０の間に調整する段階、
ｃ）ケラチノサイト増殖因子を含む溶液を調製する段階、
ｄ）段階（ｃ）の溶液を段階（ｂ）の溶液へとバッファー交換を行う段階、
ｅ）適切な量の界面活性剤を添加する段階、および
ｆ）段階（ｅ）からの混合物を凍結乾燥する段階
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載の凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の有効量を対象に投与することを含む、ＫＧＦにより媒介される上皮細胞増殖の刺激を増大させることによる、疾患を治療する方法。
【請求項２７】
前記疾患が、腸毒性；粘膜炎；火傷もしくは他の非全層型および全層型の損傷；毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖；付属器構造の増殖；表皮水疱症；化学療法による脱毛症；男性型の禿頭症；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；びらん性胃炎、食道炎もしくは食道逆流；炎症性腸疾患；肺硝子膜症；煙吸入による損傷；気腫；肝硬変、肝不全、急性ウイルス肝炎および他の肝臓の毒性傷害；または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を含む第１の容器とおよび生理学的に許容される凍結乾燥組成物用の溶媒を含む第２の容器とを含む、水性医薬組成物を調製するためのキット。
【請求項２９】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項１】
緩衝剤ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤を含む、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）組成物。
【請求項２】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記充填剤が、マンニトールである、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記マンニトールが、約２％ないし約５％ｗ／ｖの濃度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記マンニトールが、４％ｗ／ｖの濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記糖が、スクロースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記スクロースが、約１％ないし約３％ｗ／ｖの濃度である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記スクロースが、２％ｗ／ｖである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐＨが、約６．０から約８．０の範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｐＨが、約６．０から約７．０の範囲内である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｐＨが、６．５である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．１％から約０．００４％ｗ／ｖの範囲内である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリソルベート２０の濃度が、０．０１％ｗ／ｖである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＫＧＦの濃度が、３ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬの間にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＫＧＦの濃度が、５ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％スクロースおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含み、ｐＨ６．５である、凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物。
【請求項２０】
ａ）ヒスチジン、充填剤、糖および界面活性剤の溶液を調製する段階、および
ｂ）前記ＫＧＦを凍結乾燥する段階
を含む、凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の作出方法。
【請求項２１】
凍結乾燥の前に、
ｂ）前記溶液のｐＨを約６．０から約８．０の間に調整する段階、
ｃ）ケラチノサイト増殖因子を含む溶液を調製する段階、
ｄ）段階（ｃ）の溶液を段階（ｂ）の溶液へとバッファー交換を行う段階、
ｅ）適切な量の界面活性剤を添加する段階、および
ｆ）段階（ｅ）からの混合物を凍結乾燥する段階
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載の凍結乾燥ケラチノサイト増殖因子の有効量を対象に投与することを含む、ＫＧＦにより媒介される上皮細胞増殖の刺激を増大させることによる、疾患を治療する方法。
【請求項２７】
前記疾患が、腸毒性；粘膜炎；火傷もしくは他の非全層型および全層型の損傷；毛嚢、汗腺および皮脂腺の再増殖；付属器構造の増殖；表皮水疱症；化学療法による脱毛症；男性型の禿頭症；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；びらん性胃炎、食道炎もしくは食道逆流；炎症性腸疾患；肺硝子膜症；煙吸入による損傷；気腫；肝硬変、肝不全、急性ウイルス肝炎および他の肝臓の毒性傷害；または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
凍結乾燥されたケラチノサイト増殖因子組成物を含む第１の容器とおよび生理学的に許容される凍結乾燥組成物用の溶媒を含む第２の容器とを含む、水性医薬組成物を調製するためのキット。
【請求項２９】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２、配列番号３およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記ケラチノサイト増殖因子が、配列番号３に示すΔＮ２３ ＫＧＦを含む、請求項２８に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５２４２２９（Ｐ２００８−５２４２２９Ａ）
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４６８４４（Ｐ２００７−５４６８４４）
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５８６１
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５８６１
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
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