ゲル化疎水性注入ポリマー組成物
リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシ基またはカルボン酸基を有する脂肪族分子から合成された生分解性キャリアであって、３７℃未満の温度で液体またはペーストである生分解性キャリア、ならびに、その作製方法および使用方法。本発明のポリマーは、水性媒体に浸けられたとき、その粘度を著しく増大させる。これらのポリマーは、疎水性の生物医学的シーラント、接着（例えば、臓器間の接着など）を防止するための一時的なバリア、細胞支持体、薬物送達用のキャリア、および、埋め込み可能な医療デバイス（例えば、ステントなど）における被覆として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国特許仮出願第６０／７２０８４０号（２００５年９月２７日出願）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般には、医薬的に活性のある薬剤の制御された放出のためのゲル化疎水性ポリマー組成物の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
非経口投与による制御された薬物送達のためのｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムは、典型的には、広範囲の粘度を有する液体またはペーストの形態である。そのようなシステムは通常、溶媒／共溶媒系に溶解または分散された生分解性のキャリアを含有し、一方で、薬物は送達システムの液相に分散されるか、または溶解されるかのいずれかである。皮下または筋肉内に注入されたとき、固体の貯留部が注入部位において形成される。そのようなシステムの投与は、多くの場合には埋め込むことが要求される外科的手法よりもはるかに侵襲性がなく、また、費用がかからない。近年、種々のｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムが再検討され、貯留部形成機構に従って種々のカテゴリーに分類されている（Ｈａｔｅｆｉ他、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、８０（１−３）：９〜２８（２００２））。
【０００４】
近年では、様々な特定の製造物（例えば、Ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）技術を酢酸ロイプロリドを長期間送達するために使用するＥｌｉｇａｒｄ（登録商標）など）が規制当局により承認されたために、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（「ＰＬＧＡ」）コポリマーとともに形成されるｉｎ ｓｉｔｕ析出システムが最も注目を集めている。Ｅｌｉｇａｒｄ（登録商標）は、Ａｔｒｉｘ Ｌａｂ（現在、ＱＬＴ）によって上市されている。Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）は、この特定の配合物において使用される有機溶媒である。他の有機溶媒（例えば、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、トリアセチンおよび安息香酸エチルなど）もまた、初期薬物バーストに対する影響について評価されている。これらの有機溶媒の生体適合性および全身毒性が主要な懸案事項となっている。ＰＬＧＡのｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムがまた、より親油性の溶媒（例えば、安息香酸ベンジル（Ａｌｚａｍｅｒ（登録商標）など）の使用によりＡｌｚａによって開発されており、このシステムは、刺激性がより少ないことが主張されており、また、初期薬物バーストが低下している。
【０００５】
ＳＡＢＥＲ（登録商標）システム（Ｄｕｒｅｃｔ）は、エタノール、ベンジルアルコールまたは他の水混和性溶媒に溶解されたスクロースアセタートイソブチラート（ＳＡＩＢ）からなる。溶液の粘度が低いために、小ゲージのニードルによる投与の容易さは、ＰＬＧＡシステムを上回る明白な利点である。ＳＡＢＥＲ−ブピバカインの長期間作用配合物が現在、手術後の痛み管理について臨床試験中である。ペプチドおよびタンパク質を送達するためのＳＡＢＥＲシステムにおいてあり得る適用もまた、組換えヒト成長ホルモン（「ｒｈ−ＧＨ」）が、液相に溶解された不溶性ｒｈ−ＧＨ粉末およびＰＬＧＡを含有するＳＡＢＥＲ懸濁物からラットにおいて７日間持続して放出されたことによって明らかにされている。感熱性の生分解性トリブロックコポリマーが、非経口による薬物送達のための持続放出システムとしてＭａｃｒｏＭｅｄによって開発されている。そのコポリマーは疎水性のＰＬＧＡブロック（Ａ）および親水性のＰＥＧブロック（Ｂ）から構成され、２つの異なったブロック形態（ＡＢＡおよびＢＡＢ）を有する。ＲｅＧｅｌ（登録商標）は、水に可溶であるＡＢＡ型のトリブロックコポリマーである。ＲｅＧｅｌ（登録商標）の水溶液は、１５℃では自由に流れる液体であり、これは、注入されたとき、体温でゲルに変わる。薬物放出速度が、疎水性／親水性の含有量、ポリマー濃度、トリブロックコポリマーの分子量および／または多分散度を変化させることによって調節される。様々な薬物をＲｅＧｅｌ（登録商標）に溶解、懸濁または乳化させることができる。ＯｎｃｏＧｅｌ（登録商標）は、固形腫瘍の局所的治療のためにＲｅＧｅｌ（登録商標）に配合されたパクリタキセルを含有する製造物である。パクリタキセルが可溶化され、ゲルの疎水性ドメインの内部に閉じ込められ、その放出が、ゲルが分解／侵食を受けるに従い、６週間にわたって持続する。ＲｅＧｅｌにおけるパクリタキセルの血管周囲での持続した送達もまた、イヌにおける血管移植片での新生内膜過形成を効果的に阻害することが示されている。ＲｅＧｅｌ（登録商標）の水性的性質のために、水溶性薬物についての長期間の持続した放出（例えば、１ヶ月を超える放出）は、達成することが困難であり得る。さらに、薬物の大きい初期バーストを避けることができない。
【０００６】
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０７は、ポリ（オキシエチレン）ユニットおよびポリ（オキシプロピレン）ユニットからなるＡＢＡトリブロックコポリマーである。これは、逆熱ゲル化性質を有する水溶液を形成する水溶性の非イオン性界面活性剤である。ポリマーが２０％を超える溶液は低い温度で低い粘度を示すが、体温では柔軟性のない半固体ゲルの網状組織物を迅速に形成する。しかしながら、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）の非経口適用は、生分解性がないこと、および、高いポリマー濃度での細胞毒性の懸念によって制限されている。このポリマーが腹腔内注入された後でのラットにおける血漿コレステロールレベルおよび血漿トリグリセロールレベルの増大もまた問題となり得る。
【０００７】
多数のチオール（−ＳＨ）基をポリマー骨格に沿って含有するポリ（エチレングリコール）型コポリマーの調製もまた報告されている。このコポリマーの水溶液が、架橋剤、すなわち、中性のリン酸塩緩衝液に溶解されたα，ω−ジビニルスルホン−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＤのＭＷ）と混合されたとき、ヒドロゲルが形成された。水溶性薬物をいずれかの溶液に溶解することができ、ヒドロゲルが形成されるときに、薬物が物理的に閉じ込められる。ラットおよびウサギにおける予備的な生体適合性評価では、ｉｎ ｓｉｔｕ架橋ゲルに対する軽度の有害な組織反応が示された。
【０００８】
ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）（ＤｅｌＳｉｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）ポリマーは、アロエ植物から抽出および精製された天然の酸性多糖である。このポリマーは、水溶液では、皮下または筋肉内に注入されたとき、カルシウムの存在下でゲルを形成し、従って、水溶性薬物（すなわち、タンパク質）を水溶液に閉じ込め、持続した放出をもたらす。この結合により、薬物放出に関するさらなる制御が、タンパク質の生物学的機能を妨害することなくもたらされる。
【０００９】
これらのシステムは、水に浸けられたとき、親水性溶媒が周囲の組織に溶け出し、その一方で、ポリマーが析出する、水、ＮＭＰ、ポリエチレングリコールおよび／または他のジオールのいずれかにおけるポリマーキャリアの親水性溶液に基づいている。そのようなシステムの制限には、注入のために要求されるポリマーキャリアおよび溶媒の大きい体積；親水性溶媒が速く溶け出すことによる、ポリマー溶液に取り込まれた薬物のバースト放出；毒性有機溶媒（例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）など）の使用；および、ポリマーの遅い分解時間（例えば、数ヶ月〜数年）が含まれる。
【００１０】
薬物治療の目的は、薬物の治療的効果を最大限にし、その一方で、有害な影響を最小限に抑えることである。局在化した腫瘍に対する薬物の全身送達は、薬物の比較的低い濃度が、腫瘍における異常な毛細管ネットワークから遠くに位置することがある増殖し続ける細胞境界部に提供されるという欠点を有する。抗ガン薬物が負荷されたポリマー型インプラントは、高用量の局在化した薬物を長期間にわたって直接に腫瘍内または腫瘍切除部位において送達する機会をもたらす。従って、注入可能なｉｎ ｓｉｔｕ硬化性の半固体の薬物貯留物が、代わりの送達システムとして開発され続けている。このようなインプラントシステムは、シリンジにより体内に注入することができ、かつ、注入されると、ゲル化して、半固体の貯留物を形成することができる生分解性の製造物から作製される。生分解性のポリ無水物およびポリエステルが、制御された薬物送達のための有用な物質である。
【００１１】
薬物キャリアとして使用されるリシノール酸含有のポリエステルおよびポリ無水物が、米国特許出願公開第２００４／０１６１４６４号および同第２００４／０１６１４６４号（Ｄｏｍｂ）に記載されている。しかしながら、これらのポリマーは、３０個のモノマーユニットの範囲での低い重合度をもたらし、かつ、ペースト状のポリマーを得るために大きいリシノール酸含有量を必要としたリシノール酸モノマーから調製された。また、これらの以前に記載されたポリマーは、水性媒体中に置かれたとき、ゲル化しなかった。
【００１２】
以前に記載された薬物送達システムにもかかわらず、薬物の制御放出のためにｉｎ ｓｉｔｕインプラントを形成するか、または、一時的な手術用インプラントとして役立つ、体内に注入することができる信頼できるポリマー組成物が依然として求められている。
【００１３】
従って、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、水性媒体または組織に入れられたときにゲル化する生分解性のポリエステルおよびポリエステル−無水物、ならびに、その作製方法および使用方法を提供することが本発明の１つの目的である。さらに、乳酸、グリコール酸およびヒドロキシルカプロン酸から作製されるポリヒドロキシアルカン酸エステルの一般に使用される固体のホモポリエステルおよびコポリエステルを、比較的少量のリシノール酸オリゴマーを配合することによって液体またはペーストに変換することが本発明の目的である。
【００１４】
さらに、アルカンジカルボン酸の一般に使用される固体のホモポリ無水物およびコポリ無水物を、リシノール酸オリゴマーをポリマー骨格に取り込むことによって液体またはペーストに変換することが本発明の目的である。
【００１５】
さらに、３７℃未満で液体またはペーストである生分解性のポリエステルおよび／またはポリ無水物からの、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも４週間にわたる医薬的に活性のある薬剤の持続した放出を提供することが本発明の目的である。
【００１６】
さらに、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、約１２週間で完全に分解するゲルを、水性媒体または組織に入れられたときに形成する生分解性のポリエステルおよびポリ無水物を提供することが本発明の目的である。
【００１７】
さらに、内部器官の接着防止のためのシーラントおよび一時的なシールドとして役立ち得るペースト状の生分解性組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１８】
さらに、低コストの純粋なリシノール酸を粗リシノール酸またはひまし油から提供することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【００１９】
リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシ基またはカルボン酸基を有する脂肪族分子から合成された生分解性キャリアであって、３７℃未満の温度で液体またはペーストである生分解性キャリア、ならびに、その作製方法および使用方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載されるポリマーは、水性媒体に浸けられたとき、その粘度を著しく増大させる。本明細書中に記載されるポリマーは、疎水性の生物医学的シーラント、接着を防止するための一時的なバリア、細胞支持体、薬物送達用のキャリア、および、埋め込み可能な医療デバイス（例えば、ステントなど）における被覆として使用することができる。リシノール酸オリゴマーから作製された本明細書中に記載されるポリマーは、リシノール酸モノマーから調製された類似する組成および分子量のポリマーと比較して、粘度が小さく、かつ、注入することがより容易であり、また、リシノール酸モノマーから合成されたポリマーと比較して、より大きい分子量を有し、取り込まれた薬物をより長い期間にわたって保持し、かつ、より遅い速度で軟らかい分解産物に分解する。様々な医薬的に活性のある薬剤を、有機溶媒の使用を伴うことなく、そのような液体またはペーストに取り込むことができる。
【００２０】
組成物を水性媒体（例えば、体液など）に浸けることにより、組成物の粘度が増大し、これにより、半固体の物質の形成がもたらされる。１つの実施形態において、ポリマー物質は、リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基、および、少なくともヒドロキシル基またはカルボン酸基のいずれかを有する脂肪族分子とから構成される、ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）である。
図面の簡単な記述
図１は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度を種々の剪断速度において温度（℃）の関数として示すグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図２は、種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））（２：８）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図３は、種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリリシノール酸（ＰＲＡ）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図４は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：４）をリン酸塩緩衝液にさらした前後における、剪断速度（ｓｅｃ−１）と、剪断応力（ダイン／ｃｍ２）との間における関係を示すグラフである。測定を２３℃で行った。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す。
図５は、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からのパクリタキセルのインビトロでの累積放出を示す。それぞれの点が平均値±ＳＴＤ（ｎ＝３）を表す。放出を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において３７℃で行った。パクリタキセルの濃度をＨＰＬＣによって求めた。
図６は、負荷Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）および無負荷Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。図６ａは、分解途中のサンプルの重量減少によってモニターされる、無負荷のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、ならびに、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。図６ｂは、インビトロでの加水分解による分解の期間中でのサンプルにおけるパクリタキセルの蓄積（ＮＰ ＨＰＬＣによって求められる）を示す。インビトロでの加水分解による分解を一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃でリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）において行った。
図７は、Ｃ３Ｈ正常マウスの皮下に注入されたブランクポリマーおよびパクリタキセル配合物（５％および１０％）のインビボでの分解を示す。それぞれの時点（１日目、７日目、２１日目および７０日目）で、マウス（ｎ＝４）を屠殺し、ポリマーインプラントを、Ｍｗ、重量およびパクリタキセル含有量について調べた。
図８は、Ｃ３ＨマウスにおけるＭＢＴ異所性モデルに対するパクリタキセル配合物のインビボ抗腫瘍効果を示す。治療を腫瘍細胞接種後８日目に開始した。時間ゼロは治療の開始を表す。それぞれの点は平均±ＳＴＤ（ｎ＝１０）を表す。
図９は、Ｃ５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの生存の進展を示す。
図１０は、５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの腫瘍量の進展を示す。
図１１は、実験期間中のすべての治療群におけるラットの平均体重の進展を示す。標準偏差が誤差棒によって示される。
図１２は、種々の治療群についての死亡時の腫瘍体積の進展を示す。
図１３は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）（ｗ／ｗ）およびｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）（ｗ／ｗ）からの、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、インスリン、インターフェロン−α（「ＩＮＦ−ａｌｐｈａ」）およびインターロイキンのパーセントインビトロ放出を時間（ｈｏｕｒｓ）の関数として示す。ペプチドの放出を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において３７℃で行った。放出媒体における薬物含有量をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって求めた。
図１４は、異なる分子量のｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）からのゲンタマイシンのパーセントインビトロ放出を時間（日数）の関数として示す。
図１５は、３つの異なる希釈物について時間（日数）に対する細菌濃度（光学濃度）を示すグラフである。
図１６は、４℃および−１７℃で８週間にわたって貯蔵された後でのゲンタマイシンの放出を時間（日数）の関数として示す。図１６ａは、４℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出を示す。図１６ｂは、−１７℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
Ｉ．組成物
Ａ．ポリマー
リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシ基またはカルボン酸基を有する脂肪族分子とから合成された生分解性キャリアであって、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、かつ、水性媒体に浸けられたとき、その粘度を著しく増大させる生分解性キャリアが本明細書中に記載される。そのようなポリマーは分子量が少なくとも３０００ダルトンであり、好ましくは少なくとも７０００ダルトンであり、より好ましくは少なくとも１００００ダルトンである。そのようなポリマーは様々な重合度を有することができる。１つの実施形態において、そのようなポリマーは重合度が少なくとも４０である。
【００２２】
リシノール酸（ｃｉｓ−１２−ヒドロキシオクタデカ−９−エン酸）は、シス形態の二重結合を９位に、ヒドロキシル基を１２位に有するＣ１８脂肪酸である。粗リシノール酸を商業的に購入することができ、または、ひまし油の加水分解によって調製することができる。ひまし油は、平均して約３個のヒドロキシル基を１分子あたり含有する天然トリグリセリドである。ひまし油は、典型的には圧搾することによってトウゴマの実から抽出され、およそ９０％がリシノレアート（１２−ヒドロキシオレアート）である。
【００２３】
リシノール酸は、１分子または数分子のポリ無水物として反応して、リシノール酸オリゴエステルのプレポリマーを形成することができ、このプレポリマーはさらに重合して、最終的なポリマーを形成する。好適なポリ無水物を脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸の重合によって調製することができる。好適なジカルボン酸には、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸が含まれるが、これらに限定されない。好適な不飽和ジカルボン酸には、フマル酸、イタコン酸およびマレイン酸が含まれる。１０個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、１５個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、２０個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、および、２５個を超える炭素原子を有する長鎖二酸（例えば、ダイマーオレイン酸およびダイマーエルカ酸など）、ならびに、ポリカルボン酸（例えば、トリマーエルカ酸またはトリマーオレイン酸など）、ポリアクリル酸誘導体およびクエン酸もまた使用することができる。ジカルボン酸はまた、反応性の官能基（例えば、アミノ基および／またはヒドロキシル基など）を含有することができる。
【００２４】
リシノール酸はまた、ヒドロキシアルカン酸と共重合して、リシノラートモノマーユニットを含有するポリエステルをもたらすことができる。好適なヒドロキシアルカン酸には、乳酸；グリコール酸；ヒドロキシカプロン酸；３−ヒドロキシアルカン酸、４−ヒドロキシアルカン酸および５−ヒドロキシアルカン酸、ならびに、それらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書中に記載されるポリマーは生分解性であり、生体適合性である。１つの実施形態において、本明細書中に記載されるポリマーは約１２週間で完全に分解する。
【００２６】
Ｂ．活性薬剤
本明細書中に記載されるポリマー組成物は、治療剤、診断剤および／または予防薬剤を送達するために使用することができる。
【００２７】
本明細書中に記載される組成物を形成するために有用である例示的な薬物剤には、興奮剤；鎮痛剤；麻酔剤；抗喘息剤；抗関節炎剤；抗ガン剤；抗コリン作動性薬剤；抗痙攣剤；抗うつ剤；抗糖尿病剤；下痢止め剤；制吐剤；駆虫剤；抗ヒスタミン剤；抗高脂血症剤；抗高血圧剤；抗感染剤；抗炎症剤；抗片頭痛剤；抗新生物剤；抗パーキンソン病薬物；止痒剤；抗精神病剤；解熱剤；鎮痙剤；抗結核剤；抗潰瘍剤；抗ウイルス剤；抗不安剤；食欲抑制剤（食欲減退剤）；注意欠陥障害薬物および注意欠陥多動性障害薬物；心臓血管剤（カルシウムチャネル遮断剤、抗狭心症剤、中枢神経系（「ＣＮＳ」）剤、ベータ−遮断剤および抗不整脈剤を含む）；中枢神経系刺激剤；利尿剤；遺伝的物質；ホルモン遮断薬（ｈｏｒｍｏｎｏｌｙｔｉｃ）；催眠剤；血糖低下剤；免疫抑制剤；筋弛緩剤；麻薬拮抗剤；ニコチン；栄養剤；副交感神経遮断剤；ペプチド薬物；精神興奮剤；鎮静剤；唾液分泌促進薬、ステロイド；禁煙剤；交感神経様作用薬；トランキライザー；血管拡張剤；ベータ−アゴニスト；子宮収縮抑制剤；および、それらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、活性薬剤は抗ガン剤であり、例えば、パクリタキセルまたはメトトレキサートなどである。別の実施形態において、活性薬剤は抗生物質であり、例えば、ゲンタマイシンなどである。さらに別の実施形態において、活性薬剤はペプチドまたはタンパク質である。
【００２８】
これらの薬剤の効果的な量は当業者によって決定することができる。治療効果的な量を決定する際に考慮する要因には、治療される人の年齢、体重および身体状態；使用薬剤のタイプ、使用ポリマーのタイプ；ならびに、所望される放出速度が含まれる。典型的には、活性薬剤の濃度は組成物の約１重量％〜約９０重量％であり、好ましくは組成物の約５重量％〜約６０重量％であり、より好ましくは組成物の約５重量％〜約２０重量％である。
【００２９】
Ｃ．キャリア、添加剤および賦形剤
様々な配合物が、安全および効果的であると見なされ、かつ、望ましくない生物学的副作用または望まれない相互作用を引き起こすことなく個体に投与することができる物質から構成される医薬的に許容され得る「キャリア」を使用して調製される。「キャリア」は、その有効成分を除く、医薬配合物に存在するすべての成分である。用語「キャリア」には、界面活性剤、希釈剤、緩衝剤、塩および保存剤または安定剤が含まれるが、これらに限定されない。安定剤が、例として酸化的反応を含む薬物の分解反応を阻害するために、または遅らせるために使用される。
【００３０】
ＩＩ．作成方法
本明細書中に記載されるポリマーは、当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。ポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを溶融縮合によって調製することができる。１つの実施形態において、脂肪族または芳香族のジカルボン酸が、ポリ無水物のプレポリマーを形成するために無水酢酸と反応させられる。このプレポリマーは、ポリ無水物を形成するために高真空下で加熱される。低分子量のポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを、ポリ無水物をリシノール酸によりエステル化することによって調製することができる。
【００３１】
あるいは、より高分子量のポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを、ポリ無水物を不活性雰囲気下で周囲圧力においてリシノール酸のオリゴマーによりエステル化することによって調製することができる。この反応は、ポリマーの分子量が１０００ダルトンになったときに停止させられる。無水酢酸がポリマーに加えられ、溶液が３０分間加熱される。過剰な無水酢酸が除かれ、これにより、オイル状のプレポリマーが得られる。このプレポリマーは、最終的なポリマーを形成するために、高真空下で熱により重合させられる。最終的なポリマーの分子量は、反応時間、ならびに、リシノール酸の純度に依存する。例えば、純粋なリシノール酸モノマーを用いて調製されたポリマーは８０００の最大分子量を有した。対照的に、粗リシノール酸（８５％のリシノール酸含有量）を用いて調製されたポリマーは３５００ダルトンの最大分子量を有した。
【００３２】
リシノール酸モノマーユニットを含有するポリエステルを、ヒドロキシアルカン酸（例えば、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシカプロン酸、および、これらの混合物）を触媒としてのＨ３ＰＯ４の存在下でひまし油と反応することによって調製することができる。
【００３３】
これらのポリマーには、１つ以上の治療剤、診断剤および／または予防薬剤を、ポリマーおよび薬剤を、熱および／または溶媒を必要とすることなく直接に混合することによって負荷することができる。ポリマーおよび薬物は、滑らかなペーストが形成されるまで混合される。１つ以上の添加剤を、配合物の粘度を低下させるために、および／または、配合物の注入性を改善するために、薬物負荷ポリマーに加えることができる。好適な添加剤の例には、リシノール酸、リン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００が含まれるが、これらに限定されない。添加剤が使用されるならば、典型的には、薬物が最初に添加剤と混合され、その後、薬物−添加剤の混合物がポリマーに配合される。再度ではあるが、添加剤は、熱および／または溶媒を必要とすることなく、直接に薬物およびポリマーと混合することができる。
【００３４】
ＩＩＩ．使用方法
本明細書中に記載されるポリマー組成物は、局所的疾患、例えば、ガン、細菌および真菌の局所的感染、ならびに、痛みなどを治療するための分解性キャリアとして使用することができる。高い薬物濃度を疾患部位において長期間にわたってもたらす部位特異的な化学療法が、感染領域を切除した後での残存する感染細胞（例えば、固形腫瘍など）を治療する効果的な方法である。典型的には、配合物は、（腫瘍切除前、腫瘍切除時または腫瘍切除後に）注入および／または埋め込みによって筋肉内、皮下、腹腔内および／または腫瘍内に投与される。ポリマーは、添加剤を必要とすることなく注入または埋め込むことができるように室温において液体またはペーストである。しかしながら、様々な添加剤を、必要に応じて、組成物の粘度を低下させるために、および／または、組成物の注入性を改善するために加えることができる。
【００３５】
特に注目されるのが、これらのポリマーを、腫瘍内への注入または挿入のために、頭部＆頸部の扁平上皮ガン（ＳＣＣ）、前立腺ガンおよび肉腫をはじめとする固形腫瘍の治療のための部位特異的な化学療法のために適用することである。頭頸部のガンが、合衆国では毎年、約４００００人の新規患者を占め、合衆国におけるすべての新規癌患者の約５％である。他の固形腫瘍とは異なり、頭頸部ガンが再発する最も一般的な発現は限局的である（すなわち、頸部における再発）。本発明のポリマーに基づく期待されるデバイスは、抗ガン剤が負荷された生分解性ポリマーマトリックスから作製されるペースト状または液状のポリマーインプラントである。抗ガン剤（例えば、メトトレキサートまたはパクリタキセルなど）がポリマーマトリックス内に均一に分散される。活性な薬物が、体液と接触して置かれたとき、周りの組織に制御された様式で放出され、この間に、ポリマーキャリアが遅い分解によって排除される。
【００３６】
そのようなインプラントは注入可能な液体またはペーストの形態であり、腫瘍除去の外科的治療を行っているときに腫瘍内に注入されるか、または、腫瘍部位内に挿入される。インプラントにより、高用量の抗ガン薬物が、全身的な薬物分布を最小限に抑えながら、長期間（典型的には、数日間、数週間または数ヶ月間）にわたって腫瘍部位においてもたらされ、従って、これにより、残存する腫瘍細胞の局在化された治療が、手術に対する補完的な薬物治療として提供される。
【００３７】
薬物を特定の病的身体部位に長期間にわたって送達するという同じ概念は、他の固形腫瘍、局所的感染（例えば、骨髄炎を生じさせる感染など）、ガン患者またはＡＩＤＳ患者のための局所的な麻酔剤送達、および、組織成長を抑制する薬物（例えば、再狭窄およびケロイドを治療するためのヘパリンおよびステロイドなど）に対してもまた適用される。
【００３８】
ポリマーはまた、埋め込み可能な医療デバイス（例えば、ステントなど）における被覆物として、手術シーラントとして、または、臓器間の接着を低下させるためのバリアとして使用することができる。
【実施例】
【００３９】
材料および器具
リシノール酸（ＲＡ）（８５％純粋）をＦｌｕｋａ（Ｂｕｃｈ、スイス）から得て、クロマトグラフィーによって測定されたとき、９７％に精製した。セバシン酸（ＳＡ）（９９％）、アジピン酸、フマル酸、無水マレイン酸および無水コハク酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（イスラエル）から得た。すべての溶媒が、ＢｉｏＬａｂ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。
【００４０】
ポリ（エステル−無水物）の分子量を、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率（ＲＩ）検出器、２０μＬのループ（Ｗａｔｅｒｓ Ｍａ）を有するＲｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏａｔａｔｉ、ＣＡ）注入バルブを伴うＷａｔｅｒｓ１５１５アイソクラチックＨＰＬＣポンプからなるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで推定した。サンプルを１ｍＬ／分の流速で直線カラムに通してクロロホルムにより溶出した。分子量をポリスチレン標準物（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に対して求めた。
【００４１】
赤外（ＩＲ）分光法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、２０００ＦＴＩＲ）を、プレポリマー、ポリマーサンプル、および、ジクロロメタン溶液からＮａＣｌプレートに注型された加水分解サンプルに対して行った。
【００４２】
熱分析を、亜鉛標準物（「Ｚｎ」）およびインジウム標準物（「Ｉｎ」）により校正されたＭｅｔｔｌｅｒ ＴＡ４０００−ＤＳＣ示差走査熱量計で１０℃／分の加熱速度で求め（１０ｍｇの平均サンプル重量）、また、Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＭＰ１融点用加熱装置で求めた。
【００４３】
低温走査電子顕微鏡観察（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）を、Ｑｕａｎｔａ２０００ＳＥＭ（３０ｋＶ）を使用して行った。
【００４４】
光学顕微鏡観察を、デジタルカメラＣｏｏｐｌｉｘ９９０（Ｎｉｋｏｎ、日本）を備えた立体顕微鏡Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）でのサンプルの顕微鏡観察によって行った。
【００４５】
ポリマーの粘度を、回転法（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄプログラム可能レオメーター、ＬＶ−ＤＶ−ＩＩＩ）を使用して求めた。円筒状スピンドルＬＶ４を使用した。
【００４６】
実施例１：ポリ（リシノール酸−セバシン酸）コポリマーの調製
純粋なリシノール酸の調製
ひまし油を、常時攪拌で室温で数時間、エタノール中の２Ｎ ＫＯＨの２体積に溶解した。エタノールにおける生じたリシノール酸カリウムの沈殿物を、沈殿物をより良好に分離するためにイソプロピルエーテルと混合し、混合物を分離させた。沈殿物のスラリーを、固体を分離するために遠心分離し、溶媒をデカンテーションした。リシノール酸のカリウム塩を、氷冷した１Ｎ ＨＣｌ溶液に分散し、酢酸エチルにより抽出した。溶媒をエバポレーションした後、わずかに黄色のオイルが得られ、これは、ガスクロマトグラフィーによって測定されたとき、１００％の脂肪酸を含有し、その少なくとも９５％がリシノール酸であった。
【００４７】
ポリマー合成
ＰＳＡ（ポリ（セバシン酸））を溶融縮合によって調製した。セバシン酸を無水酢酸中で２０分間煮沸した。無水酢酸を、乾固するまでエバポレーションして、セバシン酸の灰白色のプレポリマーを得た。ＰＳＡを調製するために、このセバシン酸プレポリマーを、高真空（１．３ｘ１０−１ｍｂａｒ）下で３時間、１４０℃に加熱して、３００００Ｄａを超えるＭｗを有するポリ（セバシン酸）を得た。低分子量（ＡＳ３−１０２、ＡＳ３−１０１、ＡＳ３−９２）のポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））コポリマーを、ＰＳＡをリシノール酸（ＲＡ、２９８ＤａのＭｗ）によりエステル化することによって調製した。より高分子量の（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））コポリマーを、ＰＳＡをＲＡのオリゴマー（約２１００Ｄａ〜３５００ＤａのＭｗ）によりエステル化することによって調製した（ＡＳ３−１１４、ＡＳ３−１０４）。エステル交換反応が、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ＡＳ３−１０１、ＡＳ３−１０２、ＡＳ３−１１４）については３：７（ｗ／ｗ）の比率で行われ、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）（ＡＳ３−９２、ＡＳ３−１０４）については２：８の比率で行われる。反応を、一括して乾燥フラスコで、窒素雰囲気下において１２０℃で３時間〜４時間行った。反応を、１０００ダルトンの分子量が達成されたときに停止させた。その後、無水酢酸を加えた（１／１、ｗ／ｗ）。溶液を１４０℃で３０分間還流し、過剰な無水酢酸および酢酸を、乾固するまでエバポレーションして、粘性の黄色オイルを得た。この油状プレポリマーを、所望される分子量に依存して、４時間〜８時間、０．１９ｍｍＨｇ〜０．３２ｍｍＨｇの真空下において１４０℃で重合した。リシノール酸オリゴマーから調製されたポリマーについては、反応時間が長いほど、ポリマーの得られる分子量が大きくなった。リシノール酸モノマーを用いて調製されたポリマーについては、到達された最大ＭＷがＭｗ＝８０００であった。粗リシノール酸（８５％のリシノール酸含有量）から調製されたポリマーについては、３５００までの分子量が得られた。
【００４８】
結果および考察
下記の表には、ポリマーの分子量が示される。ポリマーは、上記で記載されたように調製された。
【００４９】
実施例２：リシノール酸および様々な脂肪二酸に基づく液状ポリ（エステル−無水物）
合成
ポリ（フマル酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（３：７（ｗ／ｗ）の比率）
２０グラムのフマル酸（ＦＡ）を無水酢酸中で２時間還流した。無水酢酸をエバポレーションし、残渣を１７０℃で４時間重合して、２００００の分子量を有するポリ（フマル酸）（ＰＦＡ）を得た。５０グラムのリシノール酸（ＲＡ）オリゴマー（Ｍｗ＝７００）を加え、１２０℃での４時間のエステル交換反応の後では、ポリマーの分子量が１２００ダルトンに低下した。オリゴマーを無水酢酸によって活性化し、再び重合した。得られたポリマーは、Ｍｗが１５０００であり、Ｍｎが８０００であった。ＤＳＣでのＭＰピークが３４℃に存在した。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。
【００５０】
ポリ（アジピン酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（２：８（ｗ／ｗ）の比率）
２０グラムのアジピン酸（ＡＡ）を無水酢酸中で３０分間還流した。無水酢酸をエバポレーションし、アジピン酸プレポリマーを１７０℃で４時間重合して、２７０００ダルトンの分子量を有するポリマーを作製した。５０グラムのＲＡを加え、１２０℃での４時間のエステル交換反応の後では、ポリマーの分子量が９００に低下した。オリゴマーを無水酢酸によって活性化し、再び重合した。得られたポリマーは、Ｍｎが４０００であり、Ｍｗが６０００であった。ポリマーの融点は１０℃であった。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、１．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２アジピン酸）。同様に、ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗ＝１５０００の液状ポリマーを得た。
【００５１】
ポリ（コハク酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の比率）
３６グラム（０．１２ｍｏｌ）のＲＡおよび無水コハク酸（２４グラム、０．２４ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、２回蒸留水（ＤＤＷ）により４回洗浄して、未反応の無水コハク酸を溶解した。収率は６７％であった。ＮＭＲにより、エステル形成が確認された：４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合した。４時間後、Ｍｎ＝４２００およびＭｗ＝６２００。ポリマーの融点は−２℃であった。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、２．６ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２スクシナート）。ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗ＝２００００の液状ポリマーを得た。
【００５２】
ポリ（マレイン酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の比率）
３６グラム（０．１２ｍｏｌ）のＲＡおよび無水マレイン酸（２４グラム、０．２４ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、ＤＤＷにより４回洗浄して、未反応の無水マレイン酸を溶解した。収率は７２％であった。ＮＭＲにより、エステル形成が確認された：４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合した。４時間後、Ｍｎ＝４７００およびＭｗ＝７０００。ポリマーの融点は−８℃であった。２４時間後、Ｍｎ＝１１０００およびＭｗ＝１４０００（一定）。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、６．８ｐｐｍおよび６．２ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２＝ＣＨ２−ＣＯマレアート）。同様に、ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗが１５０００を超える液状ポリマーを得た。
【００５３】
ポリ（コハク酸−ｃｏ−オリゴリシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の率）
ＲＡのオリゴマーを、塊状のＲＡを１２０℃で７時間エステル化することによって調製した。得られた分子量は、３００、９００、１２００および２１００であった（１個、３個、４個および７個の反復ユニット）。平均分子量はＭｎが約９５０であった。
【００５４】
４０グラム（０．０４ｍｏｌ）のＲＡオリゴマーおよび無水コハク酸（８．４グラム、０．０８ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、ＤＤＷにより４回洗浄して、未反応の無水コハク酸を溶解した。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合して、高分子量のポリマーを得た。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、２．６（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯスクシナート）。同様に、ポリマーを、無水コハク酸を無水マレイン酸により置き換えることによって無水マレイン酸から調製した。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯリシノール酸エステル）、４．９ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯリシノロリルマレアートエステル）、６．８ｐｐｍおよび６．２ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２＝ＣＨ２−ＣＨ２マレアート）。
【００５５】
実施例３：リシノール酸から調製されたポリ（エステル無水物）ポリマーのゲル化挙動およびインビボ評価
ポリマーのゲル化挙動を、熱分析、光学顕微鏡観察、低温走査電子顕微鏡観察および粘度測定を使用して評価した。
【００５６】
光学顕微鏡観察
緩衝液にさらされる前のポリマーと、緩衝液にさらされた後でのポリマーとの間での違いを、デジタルカメラ（Ｃｏｏｐｌｉｘ９９０、Ｎｉｋｏｎ、日本）を画像記録のために備えた立体顕微鏡Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）でのサンプルの顕微鏡観察によって調べた。画像記録を、種々の顕微鏡ズーム倍率を、最も良い画像分解能に調節されたデジタルカメラのズームと一緒に適用する通常の画質モードで行った。照明を、ＫＬ１５００Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ照明システム（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）によって供給される反射光によって行った。
【００５７】
ポリマーを水性媒体と接触させたとき、ポリマーサンプルにおける変化が認められた。緩衝液にさらされる前のポリマー（乾燥ポリマー）は透明であり、一方、ゲル化プロセスが生じた後（緩衝液中で８時間）では、ポリマーは不透明となった。ポリマーを切断したとき、２つの異なった領域が見出された：ゲルであった外側領域（１）、および、軟らかいマトリックスとして現れたコア（２）。
【００５８】
低温走査電子顕微鏡観察（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）
湿潤ポリマーサンプルおよび乾燥ポリマーサンプルをスタブに固定し、高真空下で液体窒素により凍結し、その後、Ｐｏｌａｒｏｎｅ Ｅ５１００を使用して金被覆した。ポリマーサンプルをＣｒｙｏ−ＳＥＭ用に調製するために、ポリマーを緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）の中に注入した。２４時間後、サンプルを引き出し、乾燥することなくスタブの上に置いた。サンプルを高真空下で液体窒素により凍結した。凍結サンプルを、Ｐｏｌａｒｏｎｅ Ｅ５１００を使用して金被覆した。
【００５９】
吸収された水を（乾燥または凍結乾燥することによって）そのさらされたポリマーから除くことにより、ポリマーは、ポリマーが水にさらされる前と同じ特徴を有するオイルに変わった。低温顕微鏡観察は、吸収された水をサンプルが依然として含有しながら、サンプルを凍結することを可能にし、従って、ポリマーが水性媒体によって影響を受けたときのポリマーを可視化することが可能であった。緩衝液にさらされる前のポリマー（乾燥ポリマー）は均一な表面を有し、一方、水にさらされたポリマーサンプルは、規定された構造を、水性媒体に近い外側層において示した。ポリマー鎖は、水にさらされたとき、ある種の堅い網状組織を、水に注入されたポリマーサンプルの滴全体で形成した。この網状組織により、ポリマーの滴はその形状を水性媒体中で保った。ポリマー液滴の断面から、ポリマーの内側が、水相にさらされる前のポリマーと類似して、無傷のままであったことが示された。これらの知見により、ポリマーのゲル化が、水性媒体と接触している表面でのみ生じたことが示される。
【００６０】
水の吸収
ポリマーサンプル（Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８））をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃）に入れ、ＫＦ滴定を、緩衝液への０時間、４時間、１２時間、２６時間および４０時間の暴露の後で行った。別個のポリマーサンプルをそれぞれの時点のために調製した。それぞれの時点で、ポリマーを緩衝液から取り出し、吸取り紙でブロットし、重量測定し、１ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ポリマー溶液を滴定ポットに入れた。直接の滴定を、通常のＫＦ試薬を使用してメタノール中で行った。試料の内側コアからのサンプルを同様に調製した。
【００６１】
示差走査熱測定
緩衝液にさらした種々の期間でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の吸熱を測定した。ポリマーを緩衝液にさらす前には、ピークを３５℃に有する１つの転移が存在する。緩衝液中で３時間後、ピークは３８．３℃であり、緩衝液中で１２時間では、転移が４５℃になった。２４時間では、さらなる転移が６１℃で現れた。これは、分解プロセス、すなわち、セバシン酸の形成が始まっていることを示しているかもしれない。同様の結果がＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）について見出された。ポリマーを緩衝液にさらす前には、ピークを約３２℃に有する１つの転移が存在する。緩衝液中で１２時間後および２４時間後、転移温度がそれぞれ、４２℃および５０℃になった。
【００６２】
緩衝液中に保たれたポリマーに対して行われた別の観察はポリマーの膨潤能である。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）は緩衝液中での最初の２４時間の期間中にその体積を１５％増大させたことが見出された。
【００６３】
粘度の測定
円筒状のスピンドルを使用した。ポリマーの粘度を、ポリマーが水性媒体にさらされる前、および、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃でリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）において１２時間インキュベーションされた後で測定した。粘度測定を行うための大きい十分なサンプルを得るために、ポリマーを大きい表面に広げ、緩衝液の中に入れた。水性媒体にさらした後、ポリマーサンプルを回収し、ガラス容器に入れた。感熱性試験を、一定の回転速度を加えることによって、４０℃の温度で開始し、室温（２２℃）まで行った。レオロジー学的挙動の検出を、より粘性のポリマーについては０．２０９ｓｅｃ−１から始め、また、それほど粘性でないポリマーについては３６ｓｅｃ−１までの種々の剪断速度で剪断応力および／または粘度を測定することによって行った。すべての実験を三連で行った。
【００６４】
図１には、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度が３つの異なる剪断速度（８．４ｓｅｃ−１、１２．５ｓｅｃ−１および２１ｓｅｃ−１）で示される。４３℃から開始し、測定することが可能であった最も低い温度（Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の場合には２５℃）まで粘度を測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）は、剪断速度／剪断応力の関係が一定でないために、低温側（３０℃未満）では非ニュートン流体の性質を示し、このポリマーは、剪断速度の増大とともに低下する粘度を示す擬塑性ずり減粘物質として分類することができる。この挙動は、ポリマーの注入性のためには重要である：圧力が加えられるにつれ、ポリマーのペーストはより軟らかくなり、ニードルから押し出される。高温側（３０℃を超える温度）では、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）はニュートン流体として作用し、その粘度は、加えられた剪断速度によって影響されない。最も注目される温度は、室温（およそ２２℃〜２５℃、好ましくは２５℃）（これは、ポリマーが注入される温度であるからである）、および、体温（３７℃）（これは、ポリマーが、身体に注入された後でさらされる温度であるからである）である。８．４ｓｅｃ−１および１２．５ｓｅｃ−１の剪断速度が室温で加えられたとき、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度は８６００ｃＰ〜９０００ｃＰであり、一方、水にさらされた後では、粘度は高すぎて、そのような剪断速度で室温では測定することができなかった。水性媒体に３７℃でさらされた後でのポリマー粘度における増大は剪断速度に依存していた：８．４ｓｅｃ−１の剪断速度については、粘度が、４２００ｃＰから、緩衝液にさらされた後での８９４０ｃＰに増大し、１２．５ｓｅｃ−１の剪断速度では、粘度が４３６０ｃＰから６７７０ｃＰに増大し、２１ｓｅｃ−１では、粘度が４１１５ｃＰから５７６５ｃＰに増大した。水性媒体にさらされた後、ポリマーは擬塑性の挙動を示す。このことは、ポリマー鎖の再配置が、緩衝液にさらされたことによって誘導されるが、スピンドルを回転させる瞬間に破壊されることによって説明されるかもしれない。スピンドルの回転が速くなるほど（剪断速度が大きくなるほど）、破壊される構造が多くなるほど、また、一緒に滑る構造分子が少なくなるほど、粘度が低くなる。
【００６５】
図２には、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度が３つの異なる剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で示される。粘度を、４３℃から開始し、室温まで測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）は、ポリマーの液状性に寄与するリシノール酸のより大きい含有量のために、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）未満の粘度を有する。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）はニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。ポリマーの粘度がより低いために、粘度がより大きい剪断速度で測定された。室温では、加えられたすべての剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）において、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度は約２９００ｃＰであり、一方、さらされた後では、粘度が、１２．５ｓｅｃ−１では８５７０ｃＰであり、２１ｓｅｃ−１では５０００ｃＰであり、３１ｓｅｃ−１では大きすぎて測定することができなかった。水性媒体にさらされた後でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度は、３７℃で測定されたとき、ニュートン流体の挙動を示すが、２２００ｃＰの差でポリマー粘度の増大が依然として認められた（緩衝液にさらされる前での１１５０ｃＰ、および、後での３２００ｃＰ）。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の場合、このポリマーは、粘度が、３７℃ではなく、室温で測定されたときにだけ、擬塑性の挙動を示した。
【００６６】
Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度を２つの異なる剪断速度（２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は、リシノール酸のそのより大きい含有量（８０％）のために、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度未満の粘度を示した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）はニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。ポリマーの粘度がより低いために、粘度がより大きい剪断速度で測定された。室温では、加えられた両方の剪断速度（２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）において、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度は約９００ｃＰであり、一方、さらされた後では、粘度が、２１ｓｅｃ−１では１８００ｃＰであり、３１ｓｅｃ−１では１９００ｃＰであった。水性媒体にさらされた後でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度は、３７℃で測定されたとき、ニュートン流体の挙動を示した。
【００６７】
図３には、ポリ（リシノール酸）（ＰＲＡ）ポリマーの粘度が３つの異なる剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で示される。ＰＲＡは、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）に類似する粘度を有しているが、このポリマーは４℃でさえ液状であり、水性媒体と接触した後では変化せず、よりオイルのように作用する。ＰＲＡはニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。
【００６８】
剪断応力（Ｆ）と、剪断速度（ｄｖ／ｄｒ）との間での関係が数学的には下記のニュートン方程式で表される：
Ｆ＝ηｄｖ／ｄｒ
式中、比例定数ηは粘性率である。
【００６９】
図４には、水性媒体にさらされた前後での下記のポリマーの、剪断速度と、剪断応力との間における関係が示される：Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）およびＰＲＡ。水性媒体においてゲル化したＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）と一致する曲線（図６ａ）の傾斜は、水相にさらされる前よりも２３倍大きい。ＰＲＡに関しては、水性媒体にさらされたとき、ポリマー粘度における変化が認められなかった。
【００７０】
配合物のインビトロ評価
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。異なる体積のＰ（ＳＡ：ＲＡ）ポリマー（０．０５ｍｌ、０．１ｍｌおよび０．１５ｍｌ）を２２Ｇのニードルにより背中に皮下注入した。注入後の８時間および２４時間で、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。動物の皮膚を持ち上げ、ポリマーインプラントを露出させ、写真撮影した。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）は動物研究についての申請を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決している（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【００７１】
Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の３つの異なる体積（０．０５ｍｌ、０．１ｍｌおよび０．１５ｍｌ）が注入されたマウスを、前（１２ａ）および後（図５ｂおよび図５ｃ）において、８時間および２４時間でそれぞれ屠殺した。両方の時点で、オイルがそのような皮下空間に注入されるときに生じるように、注入されたインプラントはその形状を維持していたし、また、注入部位に残留している。これらのインビボ実験では、ポリマーが組織と接触してゲルになったことが判明した。
【００７２】
加えて、ラットにおけるｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）インプラントの全身的および局所的な影響が６週間の期間にわたって観察された。ｐ（ＳＡ：ＲＡ）を溶融縮合によって合成し、重量平均分子量が１１６００であった。メスのＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＨａｒｌａｎ Ｌａｂ．（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）から得た。埋め込み時のラットの体重は２１０±１５．０ｇであった。ラットを動物施設のＳＰＦユニットに収容し、餌および水を自由に摂らせた。ラットを２つの群（ｎ＝４）の一方に無作為に割り当てた：生理的食塩水を同じ注入−埋め込み部位に受け、ポリマーの埋め込みを受けた群と同じ方法で麻酔されたラットからなるコントロール群（Ａ群）、および、ポリマーマトリックスが埋め込まれたラットからなるＢ群。
【００７３】
それぞれのラットをそのそれぞれのケージから取り出し、腹腔内経路により投与された等張５％クロラール水和物溶液（０．６４ｍｌ／１００ｇ）を使用して麻酔した。それぞれのラットは、動物用バリカンを使用して両方の背側および大腿部領域で毛が剃られていた。その後、動物を、７０％アルコールを使用して無菌的に調製した。ポリマーインプラントを、それぞれの動物の両側で皮下に、また、両側の大腿筋の筋肉内に２２Ｇのニードルにより注入した。ラットをそのケージに戻す前に、ラットを手術室で目覚めさせた。
【００７４】
埋め込み前５日および埋め込み当日に、血液サンプルを、ベースラインパラメーターをそれぞれのラットについて求めるために尾静脈から抜き取った。埋め込み後の３日、７日、２１日および４２日で、ラットを麻酔し、血液サンプルを心臓穿刺によって抜き取った。その後、サンプルをそれぞれのラットについて臨床化学および血液学的パラメーターのために分析した（ＡＭＬ、Ｈｅｒｚｌｉｙａ Ｐｉｔｕａｈ、イスラエル）。ポリマーインプラントが与えられたラットを２つの群に分けた。
【００７５】
第１の群は、ブランクポリマーの４回の注入を受けたＳＤラットからなった。２回の注入（それぞれが２００μｌ）が、それぞれが向かい合った背側で皮下であった。２回の他の注入（それぞれが５０μｌ）がそれぞれの脚の大腿筋の筋肉内に行われた。１つの埋め込みが生分解評価のために使用され、別の埋め込みが組織病理学評価のために使用された。ラットの器官を、全身毒性を評価するために無作為に選択した。
【００７６】
第２の群は、１０μｌのポリマーブランクを頭蓋内に受けたＷｉｓｔａｒラットからなった。ポリマーを、その中心がコロナ構造から５．５ｍｍ後方で、矢状縫合構造から３．５ｍｍ側方である、左頭頂領域の上に作製された頭蓋における穴から注入した。注入を２５μｌのシリンジにより行い、ニードル挿入の深さは冠状表面から４ｍｍであった。
【００７７】
埋め込み後の３日、７日、２１日および４２日で、ラットを、上記で記載されたように麻酔し、体重測定し、それぞれのラットの体重を記録した。その後、ラットを心臓穿刺によって屠殺し、検死解剖した。様々な器官および埋め込み部位の全体的な観察を検死解剖時に行った。その後、これらの器官を取り出し、重量測定し、緩衝化ホルムアルデヒド（４％）（Ｂｉｏｌａｂ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、、イスラエル）において固定処理した。集められた組織には、心臓、脳、肝臓、脾臓、肺、胸腺および腎臓が含まれた。加えて、局所的なインプラント部位を取り出し、緩衝化ホルムアルデヒド（４％）において固定処理した。すべての組織を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色し、顕微鏡により調べた。
【００７８】
検死解剖のとき、ポリマーインプラントを取り出し、クロロホルムに溶解し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、有機溶媒をエバポレーションした。単離された残渣を重量測定し、無水物およびエステルの含有量についてＩＲによって、分子量測定のためにＧＰＣによって、また、ＲＡ対ＳＡの比率についてＮＭＲによって調べた。分解されたポリマーマトリックスのアリコートを１ＮのＫＯＨ水溶液で加水分解し、濃ＨＣｌで酸性化し、放出されたオイル残渣を酢酸エチルにより抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、溶媒をエバポレーションして乾固した。ポリマー加水分解の生成物を、ＨＰＬＣを使用してリシノール酸およびセバシン酸の含有量について調べた。
【００７９】
それぞれの組織の生体適合性を、下記のように優れた耐性から不耐性までの５段階によって採点した：
優れた耐性（炎症反応が全くないか、または、最小限である）
良好な耐性（最小限の有害な反応、最小限の炎症）
中程度の耐性（中程度の炎症）
良好でない耐性（有害な反応、炎症反応）
不耐性（重度の壊死および炎症反応）
【００８０】
すべての動物が健康であり、コントロール動物と類似した体重を得た。有害な影響または腫大がインプラント部位に何ら認められず、一方、注入されたポリマーは、その部位を触ったとき、固く感じられた。この研究の動物から分離されたすべての器官は正常であり、違いがコントロール群およびポリマー群の間で何ら見出されなかった。注入／インプラント部位組織の組織病理学では、急性炎症および若干の壊死が、注入部位、および、ポリマーから数ｍｍ以内の組織に限定された有害反応を伴って３日目の時点で示された。７日目には、すべてのインプラント部位が最小限〜中程度の炎症を示したが、３日目の部位と比較して著しい改善を伴っていた。２１日目および４２日目では、優れた許容性が検出された。これらの組織病理学結果は、臨床的に使用されている生分解性のポリエステルおよびポリ無水物の適合性について以前に報告された結果と類似している。
脳適合性に関しては、３日目の時点を含めて、すべての時点でのすべての動物が、優れた生体適合性を示した。類似した結果がパクリタキセル負荷ポリマーから得られた。
【００８１】
インプラント部位から回収されたポリマーの量を、サンプルを乾燥した後での重量測定によって求めた。ポリマー含有量における緩やかな減少が見出され、ほぼ全量が４２日目の時点までになくなった。
【００８２】
結論
本研究の結果から、本実験において記載されたポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）が、水媒体と相互作用したときにゲル化し、従って、ポリマーインプラントのｉｎ ｓｉｔｕ形成における使用、あるいは、組織の接着を防止するための生分解性のシーラントまたはバリアとしての使用を有することが立証される。これらのポリマーは、有機ゲルをｉｎ ｓｉｔｕで形成する溶媒を伴わない純物質である。有機ゲルは水不溶性の両親媒性脂質から構成され、そのようなゲルは水中で膨潤し、様々なタイプのリオトロピック液晶を形成する。形成される液晶相の性質は、脂質の構造的性質、温度、および、系における水の量に依存する。薬物送達について今日までに調べられた両親媒性脂質は主に、室温でワックスである脂肪酸のグリセロールエステル（例えば、グリセロールのモノオレアート、モノパルミトステアラートおよびモノリノレアートなど）である。これらの化合物は、水性媒体に注入されたとき、立方液晶相を形成する。この液晶構造はゲル様であり、非常に粘性であった。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）コポリマーは、水性媒体にさらされたときに粘度および融点の変化を示す水不溶性のコポリマーである。レオロジー学的変化が、三次元網状組織の形成によって引き起こされ、ＳＥＭを使用して得られた画像により、緩衝液にさらされたときに現れた可逆的な特異な物理的構造が示された。この三次元構造は、カルボキシル基と、周囲の水分子との間での水素結合の形成によって説明されるかもしれない。類似する機構が、有機ゲルにおける水素結合によるレシチン架橋について、液体の官能基がどこで溶媒に対する親和性を示すか、また、液体の官能基が溶媒にどのように結合したかについて示唆された（Ｓｈｃｈｉｐｕｎｏｖ ＹＡ、Ｓｈｕｍｉｌｉｎａ ＥＶ、有機ゲルにおける水素結合によるレシチン架橋、Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｃ−Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒ．Ｓｅｎｓ．Ｓｙｓｔ．、１９９５：３（１）：４３〜５０）。
【００８３】
実施例４．マウス膀胱腫瘍（ＭＢＴ）におけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）およびパクリタキセルに基づく注入可能なポリマー配合物の、異所性腫瘍モデルに対する有効性を調べた。
【００８４】
方法および材料
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル無水物）（２：８）を、上記で議論されたように合成した。パクリタキセル（ＧＭＰ規格）（ＢｉｏｘｅｌＰｈａｒｍａ、ＱＣ、カナダ）、無水酢酸（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）およびＬｕｔｒｏｌ Ｆ８６（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を使用した。すべての溶媒が、ＢｉｏＬＡＢ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。ＭＢＴ（マウス膀胱腫瘍）細胞は、Ｈａｄａｓｓａｈ Ｅｉｎ−Ｋａｒｅｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）のＯｆｅｒ Ｇｏｆｒｉｔ博士からの譲渡物であった。細胞培養培地およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）をＢｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ（イスラエル）から得た。
【００８５】
ポリ（エステル−無水物）の分子量を、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率（ＲＩ）検出器、２０αＬのループ（Ｗａｔｅｒｓ Ｍａ）を有するＲｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏａｔａｔｉ、ＣＡ）注入バルブを伴うＷａｔｅｒｓ１５１５アイソクラチックＨＰＬＣポンプからなるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで推定した。サンプルを１ｍＬ／分の流速で直線Ｕｌｔｒａｓｔｙｒｏｇｅｌカラム（Ｗａｔｅｒｓ；５００Åの細孔サイズ）に通してクロロホルムにより溶出した。分子量を、Ｂｒｅｅｚｅコンピュータープログラムを使用して、分子量範囲が５００〜１００００であるポリスチレン標準物（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に対して求めた。緩衝溶液におけるパクリタキセル濃度を、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔＲ２５０−４、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＲ１００、５μｍ）を使用して、ＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムから構成される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ［Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ］）システムによって求めた。１ｍｌ／分の流速での６５％アセトニトリル：３５％水の混合物を溶出液として使用し、ＵＶ検出を２３０ｎｍで行った。
【００８６】
ポリマーマトリックスにおけるパクリタキセル含有量を、周囲温度（２５＋１０℃）で、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ Ｓｉガードカラム（４ｘ４ｍｍ、５μｍの粒子サイズ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）とともに使用されたＰｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ Ｓｉ分析ＨＰＬＣカラム（２５０ｘ４ｍｍ、５μｍの粒子サイズ）から構成される順相ＨＰＬＣシステムによって求めた。移動相は種々の比率（１％〜２．５％、ｖ／ｖ）でのジクロロメタン（ＤＣＭ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）からなった。アイソクラチックモードの溶出を１ｍｌ／分の流速とともに利用した。ＵＶ検出を２つの波長（２４０ｎｍおよび２５４ｎｍ）で行った（Ｖａｉｓｍａｎ他、２００５）。
【００８７】
配合物の調製およびインビトロでの薬物放出
パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）が負荷されたポリマーの配合物を、ポリマーを室温で薬物と直接に混合することによって調製した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。すべての配合物を、加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られた配合物は室温で注射可能な半固体のペーストであった。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１０ｍｇのペースト状配合物サンプルを５０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。ペーストは、緩衝液に添加された直後に軟らかい固体に硬化した。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液におけるパクリタキセル濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。
【００８８】
インビトロでの加水分解による分解
インビトロでの加水分解を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２５ｍｇのブランクポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、または、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有する配合物をリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替えた。それぞれの時点で、ポリマーサンプルを緩衝液から取り出し、湿重量を測定し、凍結乾燥後に乾燥重量を測定した。ポリマーの加水分解を、（１）分子量低下および（２）残存するポリマー配合物におけるパクリタキセル含有量によってモニターした。それぞれの時点で、配合物を、ＮＰ ＨＰＬＣによって、分解されたサンプルにおけるパクリタキセル含有量について調べた。
【００８９】
配合物のインビボでの分解
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。ブランクポリマー、および、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するペースト状配合物を、各群において４匹のＣ３Ｈマウスからなる１２の群に２３Ｇのニードルにより背中に皮下注入した。動物を局所的および全身的な毒性の徴候について、また、体重減少について観察した。１日後、７日後、２１日後および７０日後、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。ポリマーインプラントを取り出し、凍結乾燥の前後で重量測定し、残存する配合物におけるパクリタキセル含有量について調べた。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）はこの研究を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決した（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【００９０】
インビボでの抗腫瘍活性
ＭＢＴ細胞の接種
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。マウスには、０．１ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁された１＊１０６個のＭＢＴ細胞を後脇腹に２７ゲージのニードルにより皮下注入した。腫瘍を、カリパスを使用して１日おきに測定し、その体積を、文献に記載される下記の式を使用して計算した：
長さｘ幅ｘ高さｘ０．５２３
【００９１】
治療プロトコル
ＭＢＴモデルにおいて、治療を、腫瘍が触診可能になり、０．５ｃｍ３に達した接種後８日目に開始した。マウスを３つの治療群の１つに無作為に割り当てた（それぞれ群においてｎ＝１０）。２つのコントロール群（それぞれ群においてｎ＝１０）には、０．１ｍｌのブランクポリマーの腫瘍内注入が与えられたか、または、治療が全く与えられなかった。第１の治療群には、５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌ（２５０ｍｇ／ｋｇと等価）が腫瘍内に与えられ、第２の治療群には、この配合物の０．１５ｍｌ（３７５ｍｇ／ｋｇと等価）が与えられ、第３の治療群には、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌ（７５０ｍｇ／ｋｇと等価）が与えられた。マウスには、実験期間中に１回だけ注入された。動物を、腫瘍が潰瘍化したとき、または、腫瘍が許容され得ない苦痛を引き起こしたときに屠殺した。
【００９２】
結果および考察
インビトロでのパクリタキセル放出
Ｍｗ＝４０００およびＭｎ＝３５００であるポリマーキャリア−ランダムポリ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）を、上記で議論されたような溶融縮合によって精製ＲＡ（９８％純粋）およびＳＡ（９９％純粋）から調製した。ポリマーの構造を下記に示す。
【００９３】
パクリタキセルを、ＧＰＣまたは１Ｈ−ＮＭＲによって確認されるように、ポリマーの分子量に影響を及ぼすことなく、または、ポリマーと化学的相互作用することなく、ポリマーに配合した（５％および１０％、ｗ／ｗ）。図５には、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からの５％パクリタキセルおよび１０％パクリタキセルの放出プロフィルが示される。５％のパクリタキセルを含有する配合物は、２０日間にわたって、取り込まれた薬物の２０±１．４％を放出し、一方、１０％を含有する配合物は８±０．８％を放出した。放出プロフィルを６０日間モニターした。この期間中に、５％のパクリタキセルを含有する配合物は、取り込まれた薬物の４０±０．５％を放出し、一方、１０％を含有する配合物はその含有量の１６±０．３％を放出した。シンク（ｓｉｎｋ）条件を放出研究期間中保ち、放出媒体におけるパクリタキセル濃度は緩衝液におけるその最大溶解度の１０％以下であった（緩衝液における溶解度はおよそ５μｇ／ｍｌである）。パクリタキセルの疎水的性質のために、ポリマーからのその放出速度は、ポリマーに負荷された薬物の量の関数である：パクリタキセルの負荷が大きくなるほど、その放出速度は遅くなる。
【００９４】
インビトロでの加水分解による分解
本発明者らは、分子量およびサンプル重量における低下をモニターすることによってポリマーの加水分解を調べた。結果が図６に示される。パクリタキセルを含まないポリマーが最も速い分解速度を有していた。最初の１週間で、ブランクポリマーはその初期重量の３３±２％を失い、その後は徐々に分解し、４０日後では、その初期重量の９０．７±６．８％を失っていた。パクリタキセルが負荷されたポリマーの分解速度はそれよりも遅かった。５％のパクリタキセルを含有する配合物は最初の１週間の期間中に１８±５％が分解し、４０日後では７８±４％を失い、８０日後では、配合物のわずかに６％だけが残っていた。１０％のパクリタキセルを含有する配合物は最初の１週間の期間中に１３±５％が分解し、４０日後では６５±８％を失い、８０日後では、配合物の１９％が残っていた。ブランクポリマーおよびパクリタキセル含有ポリマーの分子量（Ｍｗ）低下は類似していた。サンプルが緩衝液に浸けられた後、そのＭｗは最初の３日の期間中に３９００Ｄａから１２００Ｄａに低下した。次の２５日の期間中に、ブランクポリマーの分子量は６７０Ｄａに低下し、一方、パクリタキセルを伴う配合物はそのＭｗを１０７０Ｄａで保った。これは主にパクリタキセルの寄与である。パクリタキセルを含有するポリマーのより遅い分解速度は、パクリタキセルがポリマーを保護し、水が浸透し、薬物およびポリマー分解生成物を溶解することを許さないという本発明者らの以前の発見を裏付けている。他方で、配合物のＭｗが、ほとんどブランクポリマーのＭｗのように低下する。このことは、水が依然としてポリマーマトリックスの内側に浸透し、ポリマーの加水分解を引き起こし得ることを意味する。
【００９５】
パクリタキセルを含有する配合物の重量減少はパクリタキセル放出速度よりも速い。５％のパクリタキセルを含有する配合物は、４０日後、その初期重量の７８％を失っており（図６ａ）、一方、取り込まれた薬物の３５％のみを放出していた（図６ｂ）。同じ不釣り合いが１０％の配合物について見出された：２０日後、１０％の配合物はその初期重量の２７％を失っており（図６ａ）、一方、取り込まれた薬物の８％のみが放出された（図６ｂ）。これらの結果は、分解途中の配合物におけるパクリタキセルの蓄積と相関する（図６ｂ）。分解媒体中で７日後、配合物におけるパクリタキセル含有量は１５±３．５％上昇し、１５日後では５２±１３％上昇し、４０日後では、パクリタキセル含有量はその初期値のほぼ２倍であった（９８±１５％上昇した）。以前に言及されたように、より大きいパクリタキセル含有量はより遅いパクリタキセル放出を引き起こすが、ポリマーマトリックスは依然として分解され得る。
【００９６】
配合物のインビボでの分解
注入された配合物のインビボでの分解の程度を重量減少によって評価した（図７）。ブランクポリマーはインビボで１日後ではその初期重量の４０±７％を失い、５％のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は３１±５％を失い、１０％のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は１５±８％を失っていた。ブランクポリマーは注入後７日で完全に分解し、一方、パクリタキセルを伴う配合物はそのときまでにその初期重量の半分を失い（著しい違いが、５％または１０％のパクリタキセルを含有する配合物の間で何ら見られなかった）、７０日後には注入部位から完全になくなった。パクリタキセルを含有する配合物の注入部位における何らかの活発な炎症反応または組織過敏の証拠は何ら認められなかった。
【００９７】
インビボでの腫瘍活性
腫瘍内に送達されたパクリタキセルの効力をマウス膀胱腫瘍（ＭＢＴ）異所性モデルで調べた。治療を腫瘍細胞接種後８日目に開始した。治療されなかったマウス、および、ブランクポリマーが注入されたマウスは、腫瘍サイズが１７ｃｍ３を越えたので、接種後２５日で屠殺された。しかしながら、腫瘍の大きさは、ブランク注入群の方が小さかった（コントロールの非治療群の１７ｃｍ３に対して１１ｃｍ３）（図８）。腫瘍内へのブランクポリマーの注入はその構造を傷つけ、その発達を遅らせたことが理論的に想定される。
【００９８】
生存および腫瘍サイズについての最も良い結果が、５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌにより治療された群（１００％の生存、すべてのマウスが腫瘍細胞接種後３０日で生存していた）、および、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌにより治療された群（７５％の生存）において見られた。６０％および５０％の生存がそれぞれ、５％および１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌにより治療された群においてであった。
【００９９】
マウスにおける腫瘍成長の経過が図８に示される。すべての治療群（５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌ、０．１５ｍｌ、および、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌ）において、腫瘍サイズは、ブランクポリマーにより治療された群における腫瘍サイズより４倍小さく、また、治療を伴わない群の場合よりも５倍小さかった。この違いは統計学的に有意である（ｐ＜０．００１、ｔ−スチューデント検定）。このことは、治療されなかったマウス、および、腫瘍接種後２０日で治療されたマウスを目視検査することによって確認された。
【０１００】
本研究で使用されたポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（２：８）は、天然脂肪酸から組み立てられた疎水性ポリマーであり、これは、疎水性薬物および親水性薬物の両方を放出させるために使用することができる。本研究の目的は、マウスにおける異所性モデルにおいて筋肉内に注入されたパクリタキセル−ポリマー配合物の効果を評価することであった。パクリタキセルを伴うポリマーペースト配合物は室温で粘性の液体であり、これは２３ゲージのニードルによって注入することができ、体液と接触してゲル化する。この配合物は、薬物を注入部位において局所的に放出する半固体のインプラントをｉｎ ｓｉｔｕで形成した。
【０１０１】
すべての配合物について、インビボでの分解および放出はインビトロでの分解および放出よりもはるかに速かった。これは、インビボでは、脂肪分解産物が注入部位から効率的に除かれ、一方、インビトロ条件下では、脂肪分解産物が残留し、分解プロセスおよび薬物放出を阻止するからである。
【０１０２】
実施例５．メラノーマにおけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
腫瘍内に注入された配合物からのパクリタキセルの局所的送達を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるメラノーマ異所性モデルを使用して調べた。腫瘍の進行、生存時間および体重における変化を、局所的なパクリタキセル治療の有効性を明らかにするために７７日の期間にわたって観察した。腫瘍保有動物に、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルを含有する配合物の異なる体積を腫瘍内に注入した。
【０１０３】
制御放出配合物を、２０：８０の比率での生分解性ポリマーのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））を用いて調製した。ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）を、５％、１０％、１５％および２０％（ｗ／ｗ）の負荷でパクリタキセル（Ｂｉｏｘｅｌ Ｐｈａｒｍａ、Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙ、カナダ）と混合した。混合物を粉砕によって室温で調製し、その後、１ｍＬのルーアーロックシリンジに引き入れ、２３Ｇのニードルでキャップし、使用まで−２０℃で貯蔵した。コントロールポリマー（薬物非含有）もまた、１ｍＬのルーアーロックシリンジに入れた。腫瘍内注入のためのパクリタキセル懸濁物を、１００ｍｇのパクリタキセルを２００ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−８６と（１：２の比率で）混合し、７００μｌの生理的食塩水を加えることによって調製した。
【０１０４】
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（２０ｇ〜２１ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ（Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｃ）から得た。Ｂ１６Ｆ１マウス細胞（ロット番号：１５１１５４８ｐ３２）（ＣＲＬ−６２２３）は、Ｍｉｃｈｅｌ Ｐａｇｅ博士からの譲渡物であった。この細胞は最初は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られた。研究プロトコル＃２００４−０７０が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａｖａｌ（Ｐａｖｉｌｌｏｎ Ａｇａｔｈｅ Ｌａｃｅｒｔｅ、ｌｏｃａｌ １０４０、Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙ、（Ｑｕｅｂｅｃ）カナダ、Ｇ１Ｋ ７Ｐ４）にあるＳｅｃｒｅｔａｒｉａｔ ｌｏｃａｌ ｄｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ ａｎｉｍａｕｘによって受理された。要請が、カナダ動物管理協会（ＣＣＡＣ）によって提供される指針に基づいて個々に審査される。
【０１０５】
Ｂ１６Ｆ１細胞の接種
動物がその環境に順応すると、腫瘍を移植する前に、マウスを、１０匹のマウスからなる８つの群に分けた（コントロール群＃８では１１匹）。この場合、マウスの群間の平均体重はできる限り等しくした。マウスには、１００μＬのＤＭＥＭに懸濁された２０００００個のＢ１６Ｆ１腫瘍細胞を肩甲骨のレベルで皮下に注入した。マウスを１日に２回（午前および夕方）に観察した。マウスの体重を毎日測定し、腫瘍を、腫瘍が急速に成長し続けてからは毎日測定した。メラノーマ腫瘍が検出可能になったとき、その測定を開始した。腫瘍体積を標準的な式に基づいて推定した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２ｘｌ）／２、式中、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ）およびｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ）。実験を続け、腫瘍重量が体重の１０％に達したとき、または、倫理プロトコルに記載されるように、苦痛が許容され得なくなったとき、マウスを屠殺した。安楽死の基準を満たすマウスを、ＣＯ２を使用して屠殺した。安楽死の後、肺を取り出し、肺転移の数を目視より求めた。簡単な検死解剖を、転移物の存在を求めるために行った。
【０１０６】
治療プロトコル
腫瘍移植後２日で、マウスはその治療を受けた。２つの陰性コントロール群（それぞれの群においてｎ＝１０）には、パクリタキセルを伴わないポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）の０．１ｍｌが腫瘍内に注入され（群＃１）、群＃８は治療を何ら受けなかった。治療群（２〜５）には、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルが負荷されたポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）が腫瘍内に注入された（５％および１０％の負荷については０．２ｍｌ、１５％および２０％の負荷については０．１ｍｌ）。治療群６には、１０％のパクリタキセルが負荷されたパクリタキセル懸濁物が腫瘍内に注入された（０．１ｍｌ）。マウスには、実験期間中、１回だけ注入された。治療群７は、１日目、４日目、７日目および１０日目に腹腔内注入されるパクリタキセル／Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ溶液の従来の全身的治療により治療された。腫瘍が潰瘍化したとき、または、腫瘍が、許容されない苦痛を引き起こしたとき、または、腫瘍サイズが動物体重の１０％に達したとき、動物を屠殺した。
【０１０７】
統計学的分析
すべての統計学的分析を、Ｓ−ＰＬＵＳを使用して行った。生存時間（日数）をそれぞれのマウスについて記録した。治療群によるノンパラメトリック生存曲線を、右側打ち切り事例（研究終了時を越えて生存する動物について）を考慮に入れて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して得た。パクリタキセルゲルの治療を受けている動物についての生存時間における統計学的有意差が存在するかどうかを検定するために、生存曲線を、ログランク検定を使用して比較した。生存の関連した尺度は２つの治療の間でのハザード比である。ハザードにより、小さい時間単位の期間中における死亡率、または、その次の続く時間間隔の期間中における瀕死状態の発生率の尺度が提供される。プラセボに対する治療の間でのハザード比を推定するために、セミパラメトリックＣｏｘ比例ハザード回帰モデルをデータに対して近似した。ハザード比に対するパクリタキセル用量濃度の影響を定量化するために、また、５つのゲル治療におけるパクリタキセルの増大する濃度レベルを考慮に入れるために、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを５つのゲル治療について近似した。具体的には、本発明者らは、ハザード比に対する、連続変数としての用量の影響をモデル化したいと思っている。そのうえ、用量と、ハザード比との間での関係における何らかの曲線関係を説明するために、用量についての二乗項もまた、モデルに含められた。より精密には、近似されたモデルは、
Ｌｏｇ（ハザード比）＝ａ＊用量＋ｂ＊用量２
であった。
二次項がモデルにおいて統計学的に有意であると考えられるとしても、最小のハザード比をもたらす０％〜２０％の間での最適な用量濃度を、最小値が存在するならば、曲線の最小値を見つけることによって決定することができる。
α＝５％の全般的な有意水準がすべての統計学的検定について仮定された。
それぞれの統計学的検定のために、全体的な治療影響が見出されたときには常に、多重比較法を使用して、治療のどの対が統計学的に異なっているかを認定した。多重検定を説明するために、多重比較補正を、全般的なα−レベルを５％で維持するためにＴｕｋｅｙ法を使用して適用した。治療群による検出可能な腫瘍体積までの時間についてのノンパラメトリック生存曲線を、右側打ち切り事例（０の一貫した腫瘍体積を有する動物）を考慮に入れて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して得た。
【０１０８】
結果および考察
前述されたように、治療日におけるそれぞれの群の平均体重が２０グラムから変動した。群間の平均体重の分布は、治療後の最初の１０日の期間中は非常に狭かった。実験の最初の１０日の後、体重の増大はそれぞれの群について比較的類似しており、また、残存する腫瘍の重量の増大について「平衡化」した著しい腫瘍重量を有するマウスを安楽死させた以降は、治療のタイプとの相関を何ら示さなかった。
【０１０９】
０．８９９３のｐ値は、受けた治療が０．０５のα−レベルで相対的な体重について統計学的に有意でないことを示す。このことから、相対的な体重は受けた治療によって影響されないという示された記述統計学からなされた観察結果を裏付けるための形式的証拠がもたらされる。
【０１１０】
時間の影響は単独で、０．０００１未満のｐ値により、体重に対する統計学的に有意な影響を有していた。このことは、本発明者らが体重における経時的な増大を認めるグラフと一致している。
【０１１１】
しかしながら、より重要なことは、体重における経時的な変化が、受けた治療に依存するかどうかを評価することである。すなわち、相互作用（治療＊日数）が有意であるかどうか。ＡＮＣＯＶＡ表から、本発明者らは、そのような相互作用が、０．４１５１のｐ値により、統計学的に有意でないことが見出されなかったことを認めている。このことは、相対的な体重に対する時間の影響が治療群によって異ならないことを暗示している。
【０１１２】
動物の生存率
それぞれの群についての生存率が図９に示される。生存は、何らかの形態の治療を受けかなかったコントロール群であった群＃８において、また同様に、パクリタキセルを伴わないポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）だけを受けた群＃１において最低であった。両方の群については、動物の死亡が１３日目に始まり、マウスはすべてが２０日目に死亡し、メジアン生存時間（ＭＳＴ）が１６日であった。パクリタキセルをその治療において受けているすべてのマウスは、コントロールよりも大きいＭＳＴを示した。このことは治療の非急性毒性を例示している。
【０１１３】
ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）により治療された群は、ＭＳＴが、０％、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルの濃度についてそれぞれ、１６、２２、３５、１８および２０．５であった。最後に、パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８の懸濁物により治療されたマウス、および、ＩＰ投与用の（生理的食塩水における）市販のパクリタキセルにより治療されたマウスは、ＭＳＴがそれぞれ、１８日および１９日であった。興味深いことに、群＃６（パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８の懸濁物）は「二峰性」の生存曲線を示した。実際、この群の６匹の最初のマウスが直ぐに死亡し、一方で、残る４匹は著しく増大した生存を有した。表４には、すべての群についての治療および対応するＭＳＴがまとめられる。
【０１１４】
注入パクリタキセルの量と、生存との間における相関を明瞭に明らかにすることができなかった。しかしながら、生存に対する、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）において負荷および送達されたパクリタキセルの効力は顕著である。実際、非治療の群では、マウスは一匹も生存せず（最大生存時間が２３日であった）、一方、治療された群では、７７日後、非常に健康なマウスが５つの群に存在する（群＃３＝３匹のマウス；群＃４＝１匹のマウス；群＃５＝１匹のマウス）。
【０１１５】
ログランク検定を、生存時間に対する治療の全体的な効果が存在したかどうかを求めるためにすべての治療群にわたって行った。統計学的検定では、３２のχ二乗値および０．００００４のｐ値により、生存時間に対する治療の非常に有意な効果が明らかにされた。
【０１１６】
治療のどの対が統計学的に異なっていたかを明らかにするために、ログランク検定を治療のすべての対組合せに対して行った。Ｔｕｋｅｙ（Ｈｏｎｅｓｔｌｙ有意差）調節を、５％の全般的なα−レベルが維持されることを保証するように多重比較のために適用した。この方法のもとでは、それぞれの比較のための補正されたα−レベルは０．００２、すなわち、０．２％であった。
【０１１７】
表３には、ログランク検定のｐ値が報告される。星印が付けられた太字での値（この場合、ｐ値は０．００２未満である）は、統計学的に異なる生存分布を有することが見出された治療対を示す。４つのポリマー負荷パクリタキセル治療のうち、５％および１０％の濃度のみが、プラセボと統計学的に異なる生存曲線を有すると考えられた。そのうえ、１０％および２０％の用量濃度は０％の濃度（プラセボコントロール群と最も類似する治療群）とは著しく異なる。５％から２０％までの活性なパクリタキセルゲルの治療では、生存における違いは何ら検出されなかった。まとめると、統計学的有意差が、活性な治療（１０％、２０％のゲル治療）と、非活性な治療（０％のゲル治療およびプラセボ）との間においてだけ見出された。
【０１１８】
腫瘍成長
治療後におけるそれぞれの群についての腫瘍成長速度が図１０に示される。最大の腫瘍サイズが、パクリタキセルをその治療様式において受けなかったコントロール群について報告される。群＃８（治療なし）では、腫瘍サイズが２０日目に３．６ｇであり、群＃１（パクリタキセルを伴わないＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０））では、腫瘍サイズが２．５ｇであった。パクリタキセルが負荷されたポリマーにより治療されたすべての群では、腫瘍サイズがブランクポリマー群または非治療群における腫瘍サイズよりもはるかに小さく、１．３ｇ〜０．３ｇの範囲であった（図１１）。
このデータから、本発明者らは下記のことを認めることができる：
・活性な治療は、プラセボ治療または０％のパクリタキセル治療よりも長い不顕性期間（すなわち、腫瘍サイズが増大し始める前の時間）を示した；
・５％、１０％、１５％および２０％でのパクリタキセル−ポリマー治療は、腫瘍体積において、それ以外の治療よりも遅い増大速度を有するようである；
・腫瘍成長が検出できないマウスが、５％、１０％、１５％および２０％でのパクリタキセルポリマー治療、ならびに、パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８治療について認められる。
腫瘍体積が検出可能になる前における時間（日数）に関する記述統計学では、下記のことが示される：
・腫瘍体積が引き続き検出できないマウスの大部分が１０％のパクリタキセルゲル治療群において生じていた；
・最大のメジアン時間（すなわち、２６．５日）が１０％用量でもまた生じていた；
・変動係数（ＣＶ）は、プラセボ群および１０％用量群の方が活性な治療の場合よりも低い；
・このことは、動物が、活性な治療の群においては異なる反応を示す傾向があり、これに対して、コントロール群における挙動がより一貫しているという事実によって説明することができる。
【０１１９】
生存曲線と一致して、１０％のパクリタキセルゲル治療は、最大の生存時間を提供することにおいて、それ以外の治療よりも優れているようである。再度ではあるが、プラセボコントロールおよび０％のパクリタキセルゲル治療は、長期にわたるゼロの腫瘍体積の可能性における急速な低下を暗示する最も急勾配の生存曲線に対応する。
治療を比較するために、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを、ハザードに対する治療の影響を検定するために近似した。推定されたハザード比が、プラセボコントロールに関して下記の結果において示される。結果から、本発明者らは、それぞれの治療と、プラセボとの間におけるハザード比が統計学的に有意であること（０．０５未満のｐ値）を見出す。他の結果と一致しているように、ハザードにおける最大の低下を示す治療は１０％のパクリタキセルゲル治療であり、ハザードがプラセボのハザードの０．０３３８倍である。そのうえ、５％および１５％のパクリタキセルゲル治療は、検出可能な腫瘍体積を生じさせるというハザードにおいて類似する低下をもたらし、ハザード比がプラセボのハザード比の０．０９３３倍および０．０９０７倍である。
【０１２０】
治療後における体重の減少がどの群においても示されなかった。このことは、治療の毒性が低いことを示す重要なものであり、また、２０％パクリタキセル配合物の少なくとも１００マイクロリットル（群５、２０ｍｇのパクリタキセル）が注入できることを示す。動物は、治療後１０日における体重の絶え間ない増大によって示されるように、治療時に健康であった。体重は治療後のすべての群で絶えず増大し続けた。しかしながら、パクリタキセルを含有するゲルにより治療されたマウスの皮膚の皮膚潰瘍化により、著しい局所的毒性が明瞭に明らかにされた。その毒性は、血管によって灌注されなくなっている周りの組織に対してポリマーが及ぼす圧力に関連するかもしれず、従って、薬物を局所的に毒性レベルで増大させている。
【０１２１】
パクリタキセルを含有するゲルにより遭遇した潰瘍化の問題にもかかわらず、この医薬配合物が、マウスの生存に対する著しい有益な効果を有していたことは明らかである。例えば、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）における１０％パクリタキセルによって治療された群＃３のマウスの３０％が７７日後も依然として生存しており、一方、コントロール群では、一匹も、２３日を超えて生存しなかった。興味深いことに、全身毒性は何ら認められなかった。生存と薬物濃度との相関は、予想されたほど良好ではないが、ゲル配合物によって治療されたマウスで認められた局所的毒性は説明されなければならないかもしれない。治療された群において生存と投薬量との間に相関がないことの別の理由が、研究で使用される選択された腫瘍モデルが、配合物による遅い薬物放出と比較した場合、比較的速く成長する腫瘍であるという事実に関連づけられ得る。より遅く成長する腫瘍モデルが、臨床的治療をより良く表すものであるかもしれない。
【０１２２】
ポリマーの外観
興味深いことに、腫瘍の近くにあるポリマーは、注入されたポリマーに比べて、非常に類似した外観を有したことが最初の死体解剖のときに認められた。しかしながら、数日後には、ポリマーは硬化するようであり、塊が収縮し続けた。加えて、パクリタキセルが負荷されたポリマーを取り囲む組織は形質転換し続け、破壊された。
【０１２３】
実施例６．前立腺腺ガンにおけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
本研究の目的は、ラットにおける同所性前立腺腫瘍に対する、パクリタキセルを伴う注入可能なポリマーペースト配合物の効力を評価することであった。パクリタキセルが負荷されたポリマーを、腫瘍細胞接種後３日で、ラットの腫瘍保有前立腺に室温で注入した。Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ラット前立腺腺ガンは、腫瘍の進行を研究するために使用される、そのヒト対応物の対応する実験的腫瘍モデルである。本発明者らの研究において、本発明者らは、最も攻撃的な局所的転移能を有するＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。
【０１２４】
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル無水物）（２：８）を、以前に記載されたように合成した。パクリタキセル（ＧＭＰ規格）（ＢｉｏｘｅｌＰｈａｒｍａ、ＱＣ、カナダ）、無水酢酸（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）およびＣｈｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ ５０％（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を使用した。すべての溶媒が、ＢｉｏＬＡＢ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。
【０１２５】
注入当日、腫瘍細胞（Ｄｕｎｎｉｎｇ腫瘍、ＭａｔＬｙＬｕ亜系統）をトリプシン／ＥＤＴＡにより組織培養フラスコから取り出した。細胞のトリプシン処理（１分）の後、４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を加えた。腫瘍細胞を遠心分離し、ＰＢＳにおいて２回洗浄し、計数し、補充物を含まないＲＰＭＩ１６４０培地に３つの最終濃度（１ｍｌあたり１ｘ１０５個、３ｘ１０５個および５ｘ１０５個の生腫瘍細胞）で再懸濁した。
【０１２６】
開始時の体重が２２０ｇ〜２４０ｇであるオスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラット（ｎ＝１２）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、ラットには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。同所性モデルを作製するために、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎラットを３つの群に分け、麻酔した（ケタミン／キシラジン、ＩＰ）。下部腹部の毛を剃り、横方向の切開を恥骨の上で行った。腹筋を分割し、腸を持ち上げ、前立腺の腹葉を膀胱より下側で露出させた。５０μＬに懸濁された異なる数のＭａｔＬｙＬｕ細胞を、下記のように、１ｍｌのインスリンシリンジおよび２６Ｇのニードルを使用して腹葉の中に注入した：
・群１：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された８ｘ１０３個の細胞；
・群２：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された１．５ｘ１０４個の細胞；
・群３：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された２．５ｘ１０４個の細胞；
【０１２７】
腹筋を３／０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）の縫合糸により閉じ、皮膚を３／０の絹糸により閉じた。（予備研究から得られたように）３日後、ラットを屠殺した。それらの前立腺、肝臓および肺の組織病理学評価を、腫瘍発達の存在および程度を求めるために行った。
【０１２８】
配合物調製
パクリタキセル（１０％ｗ／ｗ）が負荷されたポリマーの配合物を、ポリマーを室温で薬物と直接に混合することによって調製した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。すべての配合物を、加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られたポリマー配合物は室温で注射可能なペーストであった。
【０１２９】
パクリタキセルの懸濁物を、パクリタキセルをＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８と１：２の比率で混合することによって調製し、その後、混合物を生理的食塩水に分散して、７．５％（ｗ／ｖ）のパクリタキセル濃度を得た。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８は、パクリタキセルのような、水溶性が低い薬剤を懸濁するために使用される懸濁化剤である。それぞれのラットに２５０μｌの懸濁物を腫瘍内に注入した。
【０１３０】
パクリタキセルの非経口溶液を調製するために、薬物をエタノール（５０％）／Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（５０％）に溶解して、６ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を得た。その後、この溶液を生理的食塩水により希釈して、１．２ｍｇ／ｍｌのパクリタキセルの溶液を得た。それぞれのラットに４ｍｌの希釈された溶液をＩＰ注入した。
【０１３１】
腫瘍の接種および治療
開始時の体重が２２０ｇ〜２４０ｇであるオスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラット（ｎ＝２６）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、ラットには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。同所性モデルを作製するために、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎラットを５つの群に分け、麻酔し（ケタミン／キシラジン、ＩＰ）、上記で示されたように手術した。腫瘍細胞（５０μｌに懸濁された８ｘ１０３個のＭａｔＬｙＬｕ細胞）を、下記のように、インスリンシリンジおよび２６Ｇのニードルを使用して腹葉の中に注入した。腹筋を３／０のビクリル縫合糸により閉じ、皮膚を３／０の絹糸により閉じた。動物の体重を２日毎にモニターした。治療を腫瘍細胞注入後３日目に開始した。薬物が負荷されたポリマー、および、パクリタキセル懸濁物を、前立腺の腹葉における成長中の腫瘍の中に注入した。非経口パクリタキセルにより治療される群におけるラットには３日毎にＩＰ注入した。実験の予定表が表５に記載され、治療群が表６に記載される。
【０１３２】
動物を、全身毒性の徴候について、また、体重減少について観察した。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）はこの研究を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決した（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【０１３３】
目視による腫瘍計算
動物から集められた後、腫瘍を切除し、腫瘍体積の目視による計算を、下記に示される式を使用して行った：
Ｖ＝（長さｘ高さｘ幅）ｘπ／６。
【０１３４】
組織学的分析
すべての動物に由来する腫瘍を切除し、測定し、４％ホルムアルデヒド溶液において固定処理した。組織スライド片をパラフィン中に処理し、３μｍの切片を組織学的評価のためにヘマトキシリン＆エオシンにより染色した。検査パラメーターは、壊死の総面積、被膜形成、炎症細胞の浸潤、および、腫瘍内血管の含有量であった。
【０１３５】
統計学的分析
生存分布およびメジアン生存をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって計算し、ログランク検定を使用して比較した。０．０１未満のｐ値をすべての検定について有意であると見なした。
【０１３６】
結果および考察
手術手法および腫瘍細胞注入は十分に許容され、すべてのラットが両方の手術（腫瘍細胞接種、および、３日後に与えられた治療）の後で覚醒した。すべてのラットにおいて、同所性腫瘍が、組織学的検査によって確認されたように、腫瘍細胞の注入によって首尾良く移植された。Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ラット前立腺腺ガンは、成長速度、分化、ホルモン応答性および転移能において異なる数多くの亜系統によって誘導され得ることには留意しなければならない。本発明者らの研究において、本発明者らは、最も攻撃的な局所的転移能を有するＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。
【０１３７】
動物モデルの校正
ラットの３つの群に、増大する濃度の腫瘍細胞をその前立腺に注入した。ＭａｔＬｙＬｕ亜系統の攻撃性のために、安定な、しかし、依然として治療可能な腫瘍を生じさせる細胞の最適な最少量を選択した。以前に報告されたように（１８）、腫瘍をすべての前立腺内注入動物において形成させたＭａｔＬｙＬｕ細胞の最少量は５ｘ１０３個の細胞であった。これらの結果に従って、本発明者らは、腫瘍が、注入された前立腺において実際に成長することが確信されるように、類似する濃度の細胞を使用した。他方で、ラットに、２ｘ１０５個が前立腺内に注入されたとき（データは示されず）、得られた腫瘍は非常に大きく、治療できず、すべてのラットが細胞接種後２週間以内に死亡した。
【０１３８】
腫瘍細胞接種後３日でラットを屠殺した。前立腺、肺および肝臓を単離し、組織病理学的評価に送った。腫瘍細胞接種後３日で、前立腺における明白な腫瘍が認められた；しかしながら、転移は肉眼観察によってすべての群で見出されなかった。注入後３日でのラットの前立腺における前立腺ガンの組織病理学では、前立腺ガンの多数の病巣が示された。転移が、組織病理学的評価のとき、肝臓および肺において見出されなかった。腫瘍細胞の注入量のすべて（８ｘ１０３個、１．５ｘ１０４個および２．５ｘ１０４個）で、腫瘍が３日後には首尾良く生じたので、８ｘ１０３個の腫瘍細胞を注入し、動物を３日後に治療することを決めた。
【０１３９】
生存および体重減少
ガン細胞の前立腺内滴注では、腫瘍が非常に速く形成し、すべてのラットにおいて致命的であった。ラットの生存が表７に示される。
【０１４０】
ラットの最も短い生存が、パクリタキセルの非経口配合物により治療された群においてであった：治療された動物の５０％が、２回目の用量の後、すなわち、腫瘍細胞接種後９日で死亡した。これらのラットもまた、実験期間中、体重が減少していた（図１１）。このことは、それらの死亡および病的状態が薬物配合物の全身毒性によって引き起こされたことを暗示している。最大の生存が、１０％（ｗ／ｗ）のパクリタキセルが負荷されたポリマーの２００μｌにより腫瘍内で治療された群においてであった。１匹のラットが腫瘍細胞接種後３週間で死亡しただけであり、一方、それ以外のすべてのラットが、研究終了まで、すなわち、腫瘍細胞接種後３５日まで生存していた。非治療の群では、１匹のラットが腫瘍細胞接種後３週間で死亡し、それ以外のすべてのラットが３日後（腫瘍細胞接種後２５日目）に死亡した。パクリタキセル／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ懸濁物の腫瘍内注入は、腫瘍内注入後、パクリタキセルが注入部位で凝集したので、全身毒性を引き起こさなかった。他方で、この配合物はラットの寿命を延ばさなかった。すなわち、すべてのラットが腫瘍細胞接種後２５日で死亡した。
【０１４１】
検死解剖時において、大きい腫瘍（直径が３ｃｍを超える）を有する動物は、大きい血管への腫瘍の侵入、または、非常に血管新生化した原発腫瘍の破裂のいずれかによる顕著な内出血を示した。他方で、ポリマー／パクリタキセル治療群におけるラットは他の治療群よりも１０日遅く死亡し、その間、比較的小さい腫瘍を有していた。本発明者らは、転移または内出血のいずれもが検死解剖時に見られなかったので、それらの死亡が尿管閉塞によって引き起こされたと考えている。体重減少曲線から、すべてのラットが最初の５日間でその体重を失ったことが明白である（図１２）。この体重減少は、おそらくは、ラットが受けた手術および外傷が原因であった。５日目から開始したとき、パクリタキセルのＩＰにより非経口治療を除くすべての治療群に由来するラットは、その体重を増大させることが始まり、これらの群の間には統計学的な違いがなかった。全身的治療は、統計学的に有意な体重減少（２３１ｇｍから２０３ｇｍへの減少）、および、５０％の「早すぎる」死亡例を引き起こしただけであった。
【０１４２】
リンパ節、肺および肝臓への転移
検死解剖時に、リンパ節転移が腫瘍保有動物において触診可能であり、また、視認された（表８）。
【０１４３】
そのようなラットは肉眼で見えるほど大きい骨盤および後腹膜のリンパ節転移を有し、節のサイズが０．６ｃｍにまでなっていた。表８に示されるように、治療されなかった動物、および、パクリタキセル懸濁物が腫瘍に注入された動物はすべてが、転移を肺および肝臓に示した。パクリタキセルの非経口配合物により治療され、腫瘍細胞接種後９日で死亡したラットは（おそらくは、非常に早く死亡したために）転移を発生させなかったが、他の２匹のラットは転移を肺および肝臓に発生させた。転移が、ポリマー／パクリタキセル配合物の２００μｌにより腫瘍内で治療されたラットでは１つも見出されなかった。
【０１４４】
腫瘍体積
図１２には、異なる治療群における腫瘍を有する前立腺の体積が示される。非治療の群では、１匹のラットが腫瘍細胞接種後２１日で死亡し、１１．８３ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが２５日目で死亡し、１４．８±１．０８ｃｍ３の前立腺体積を有していた。非経口パクリタキセルにより治療された群では、死亡は二峰性であった。すなわち、ラットの半数が９日後に死亡し、１４．１８ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが２５日後に死亡し、１３．６５±０．２６ｃｍ３の前立腺体積を有していた。より良好な結果が、腫瘍内に注入されたパクリタキセル懸濁物により治療された群においてであった。すなわち、すべてのラットが２５日後に死亡し、６．６±０．７ｃｍ３の前立腺体積を有していた。最も良い結果がポリマー／パクリタキセル治療について得られ、この場合、１匹のラットが２１日後に死亡し、０．８４５ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが最も長い期間を生存し、３５日後に死亡し、０．８６２±０．１６ｃｍ３の前立腺体積を有していた。一方、２００μｌのポリマーが注入された健康な前立腺の体積は約０．４ｃｍ３である。
ポリマー／パクリタキセル群から３５日目で採取された前立腺、および、すべての他の群からは２５日目で採取された前立腺の比較では、それらの群の間における目視による違いが明瞭に示された。
【０１４５】
組織病理学的評価
すべての上記パラメーターが評価されたが、群の間で違いを明らかにした唯一のパラメーターが腫瘍内壊死であった。すべての他の評価されたパラメーターは群の間で違いを何ら示さなかった。従って、このデータは示されていない。非治療の群では、総腫瘍内壊死の割合が低かった（１０％〜２０％）。パクリタキセル懸濁物により治療された群では、総腫瘍内壊死の割合は類似しており（１０％〜１５％）、１つのだけの腫瘍がより大きい壊死を示しただけであった（約５０％）。パクリタキセル懸濁物の非経口配合物により治療された群では、腫瘍内壊死が全く見出されず、一方、総腫瘍内壊死の最も大きい割合が、１０％のパクリタキセルが負荷されたポリマーにより治療された群において見出された（２５％〜７０％）。加えて、ポリマー／パクリタキセル群に由来する３匹のラットを腫瘍細胞接種後１０日で屠殺し、それらの前立腺を組織病理学的評価に送った。間質壊死および腺内壊死の多数の領域、ならびに、急性の炎症が認められた。しかしながら、前立腺ガンの明らかな存在はなかった。
【０１４６】
転移が、すべての非治療ラット（群＃１、４匹中４匹）、パクリタキセル懸濁物により腫瘍内で治療されたすべてのラット（群２、４匹中４匹）、非経口配合物により治療されたすべてのラットにおいて肝臓および肺に見出され、また、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物により治療されたラットでは、転移が１つも見出されなかった。
【０１４７】
本発明者らの知見（すなわち、群の間での腫瘍内壊死の量における著しい違い）は、エストラムスチンおよびエトポシドにさらされた同じモデルにより文献に報告されることと一致していることは強調されなければならない。
【０１４８】
本発明者らは、抗新生物薬物（例えば、パクリタキセルなど）の部位特異的な送達のための生体適合性および生分解性の注入可能なポリマーゲルの効果的な使用を以前に記載している。本研究で使用されるポリマーゲル配合物は、小ゲージのニードル（２３Ｇ）により注入することができる室温で粘性のペーストであり、生体内では１時間で固まる。このゲルは、薬物を注入部位において局所的に放出する制御放出インプラントを形成する。インビボ研究では、パクリタキセルが３週間〜４週間にわたって放出され、インプラントがこの期間の間に完全に分解されることが示された。
【０１４９】
ＤｕｎｎｉｎｇラットＭａｔＬｙＬｕ前立腺ガンはホルモン不応性の転移性ヒト前立腺ガンと多くの点で類似する。異所性部位で誘導された腫瘍は実験操作のために容易に利用することができるが、そのような腫瘍はその解剖学的起源と一致していない。その本来の環境にないガン細胞は、その起源器官における場合と極めて異なる挙動を有することが知られている。
【０１５０】
本研究において、本発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇモデルにおけるパクリタキセル含有ポリマーの腫瘍内注入の効力を評価した。同所性モデルにより、ガンを、そのガンが実際の生涯で生じるようなそれ自身の環境において治療することができる。この動物モデルは、再発した前立腺ガンを有する患者のための可能性のある治療方法を反映するかもしれない。パクリタキセル／ポリマー配合物の治療効果は、インビトロおよびインビボで記録されたＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導から生じた。本発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇ前立腺ガンモデルの中で最も攻撃的で、非常に転移性の亜系統であるＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。このモデルを校正した後、本発明者らは、治療することができる均一に成長し続ける同所性腫瘍を生じさせるための腫瘍細胞の最適な量を見出した。本発明者らの結果では、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物の１回の腫瘍内投与により、コントロール群または全身的治療との比較において著しい様式でＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラットのＭａｔＬｙＬｕ細胞Ｄｕｎｎｉｎｇ前立腺ガンの腫瘍成長を低下させることができたことが示される。パクリタキセル懸濁物による腫瘍内治療もまた、腫瘍体積を幾分か低下させたが、ポリマー／パクリタキセル配合物ほど良好ではなく、動物の寿命を延ばさなかった。懸濁物の腫瘍内注入の後、水が除かれ、パクリタキセルの粉末のみが注入部位に残る。この粉末は（ラットの検死解剖時に見られたように）ケークを形成する。多くのパクリタキセルがこのケークから溶解するので、このケークは、ある程度の壊死を周囲において引き起こすために十分であるが、腫瘍進行および転移を防止するためには全く十分ではない。他方で、１０％（ｗ／ｗ）のパクリタキセルを伴うポリマー配合物の同じ体積が腫瘍の中に注入されたとき、ポリマーは注入部位に数週間にわたって留まる。配合物が分解し、パクリタキセルを、極めて大きいインプラント表面から放出する。前立腺全体が配合物により満たされる一方で、腫瘍の進行および転移形成が停止させられる。従って、最も良い治療は、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物の腫瘍内注入である。この治療はラットの寿命を１０日延長し、また、腫瘍体積が他の治療よりも１８倍小さく、腫瘍組織における壊死割合が著しく大きくなり、転移が全く見出されなかった。
【０１５１】
補助的な全身的治療を伴わない進行したヒト前立腺ガンにおいて、前立腺を除くための手術は、生存を延ばすためにほとんど役に立っていない。効果的な補助的治療が現在ないことにより、手術を新しい実験的治療様式により強化しなければならない必要性が強調される。抗ガン薬物を局所的に放出する注入可能な生分解性ペーストの使用により、この問題が解決されるかもしれない。
【０１５２】
実施例７：薬物放出に対する添加剤の影響
本研究の目的は、配合物からのパクリタキセルの放出に影響を及ぼすことなく、リシノール酸、リン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００をポリマー−薬物配合物に取り込むことによって、ポリ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）−パクリタキセル配合物の粘度をさらに低下させ、また、その注入性を改善することであった。配合物を、下記の３つの工程で行われた、室温におけるすべての成分の直接の混合によって調製した：ａ）パクリタキセル（５％および１０％ｗ／ｗ）を添加剤（ＰＥＧまたはリン脂質）と粉砕により混合した；ｂ）リシノール酸（２０％ｗ／ｗ）を混合物に加えた；ｃ）混合物をｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）ポリマーペーストに粉砕により配合した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。パクリタキセルを伴わない配合物を、工程２から出発して同じスキームによって調製した。下記の配合物を調製した：ａ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）；ｂ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％リン脂質（ＰＬ）；ｃ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％ポリ（エチレングリコール）４００（ＰＥＧ４００）；ｄ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％ポリ（エチレングリコール）２０００（ＰＥＧ２０００）；および、コントロールとして、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、薬物を伴わない、添加剤を含まないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）。すべての配合物を調製し、さらに加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られた配合物は、注入することができる室温で半固体のペーストであった。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１０ｍｇのペースト状配合物サンプルを５０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。ペーストは、緩衝液に添加された直後に軟らかい固体に硬化する。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液における薬物濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。
【０１５３】
インビトロでの加水分解による分解
インビトロでの加水分解を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２５ｍｇのブランクポリマー、または、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有する添加剤含有ペースト状配合物をリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって評価した。媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替えた。それぞれの時点で、ポリマーサンプルを緩衝液から取り出し、湿重量を測定し、凍結乾燥後に乾燥重量を測定した。ポリマーの加水分解をサンプルの重量減少によってモニターした。
【０１５４】
結果
ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に添加される選択された添加剤は、リシノール酸、卵のリン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００であった。これらの添加剤と均一に混合されたポリマー、および、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）が負荷された添加剤含有配合物は、加熱することなく２２Ｇのニードルにより容易に注入することができた。
【０１５５】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を、２０％ｗ／ｗのリシノール酸を添加する前後におけるＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の分子量を求めるために使用した。２０％ｗ／ｗのリシノール酸がポリマーに加えられた後、ポリマーの分子量は変化しないままであり、リシノール酸のピークが、その分子量（３００ｇ／モル）に対応する８分後に見られる。ＩＲ分光法では、添加剤および／またはパクリタキセルが加えられたとき、無水物のバンドに対応するピーク（１８１７ｃｍ−１）における変化が示されなかった。
【０１５６】
２０％のリシノール酸をポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に加えることにより、配合物はより軟らかくなり、５％および１０％のパクリタキセルを含有する配合物を、さらに加熱することなく室温で２２Ｇのニードルにより注入することが可能となった。パクリタキセルをポリマーに分散させて、均一な配合物を得た。
【０１５７】
実施例８：ペプチドおよびタンパク質の放出
数多くのペプチド治療剤およびタンパク質治療剤が承認されているか、または、臨床試験の進んだ段階にある。広範な研究がペプチドおよびタンパク質のための制御放出システムのためのポリマーについて行われている。本研究のほとんどがＰＬＧＡに集中している。残念なことに、ＰＬＧＡの塊状分解は酸性のコアをもたらし、そのような酸性コアはｐＨ感受性薬物（例えば、ペプチドおよびタンパク質など）に損傷をもたらすことがある。表面侵食性ポリマー（例えば、ポリ無水物など）は、粒子からの可溶性フラグメントの増大した拡散速度によって酸性増大の影響を低下させる。本明細書中に記載される液状ポリマーおよびペースト状ポリマーはペプチドおよびタンパク質の送達のために使用された。ペースト状態の薬物送達システムを使用することの利点は、何らかの有機溶媒、熱または剪断力を用いることなく、薬物粉末をポリマーのペーストに室温で単に混合することによる薬物取り込みにおける容易さである。
【０１５８】
下記のペプチドおよびタンパク質を本研究では使用した：ロイプロリド（１２７０Ｄａ）、オクトレオチド（１０１９Ｄａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６８０００Ｄａ）、インスリン（５８６０Ｄａ）、インターロイキン（５３０００Ｄａ）およびインターフェロンα−２ａ（ＩＦＮ−ａｌｐｈａ）（１９０００Ｄａ）を使用した。これらのペプチドを商業的供給元から得た：ロイプロリドおよびオクトレオチド（Ｎｏｖｅｔｉｄｅ Ｌｔｄ．）、インスリン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎｃ．）、ウシ血清アルブミン（Ｉｎｔｅｒｇｒｅｎ ｃｏｍｐａｎｙ）、インターフェロンα−２ａ（ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標）、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、スイス）、インターロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を本研究では使用した。
【０１５９】
緩衝溶液におけるＬＨＲＨおよびオクトレオチドの濃度を、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔ（登録商標）２５０−４、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）１００、５μｍ）を使用して、ＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムから構成されるＨＰＬＣシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）によって求めた。ＬＨＲＨをアセトニトリル：ＴＥＡＰ緩衝液（ｐＨ３、０．０１Ｍ）（３：７、ｖ／ｖ）によって溶出し、λ＝２７８ｎｍにおいて検出した。オクトレオチドをアセトニトリル：ＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．０２Ｍ）によって溶出し、λ＝２１８ｎｍにおいて検出した。緩衝溶液におけるＢＳＡ、インスリン、ＩＮＦ−ａｌｐｈａおよびインターフェロンの濃度をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって求めた。
【０１６０】
ペプチドおよびタンパク質を室温において乳鉢で別々に微粉末に粉砕した。この薬物粉末を、均一なペーストが達成されるまで、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）またはｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）と混合した。ポリマーからのペプチド放出を調べるために、１０％（ｗ／ｗ）のロイプロリドおよびオクトレオチドが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の２０ｍｇのサンプル、ならびに、同じ重量のブランクポリマーのサンプルを調製した。サンプルを回旋振とう（１００ＲＰＭ）とともに１５ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ）において３７℃でインキュベーションした。２ｍｌのサンプルを採取し、ＨＰＬＣによって分析した。緩衝溶液を、ペプチドの飽和および溶液の濁りを避けるために４８時間毎に取り替えた。生理学的条件下でのポリマーの分解を重量減少およびＧＰＣ分析によって４０日間にわたって追跡した。
【０１６１】
ポリマーからのタンパク質放出：１０％（ｗ／ｗ）のＢＳＡが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の５０ｍｇのサンプル、および、５％（ｗ／ｗ）のインスリンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の５０ｍｇのサンプルを調製し、２０ｍｌの緩衝液においてインキュベーションし、また、５％（ｗ／ｗ）のインターフェロンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２０ｍｇのサンプル、および、５％（ｗ／ｗ）のＩＦＮ−ａｌｐｈａが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２０ｍｇのサンプルを調製し、１０ｍｌの緩衝液においてインキュベーションした。０．２ｍｌのサンプルをそれぞれ４８時間で媒体から採取し、Ｌｏｗｒｙアッセイ法に従ってＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬とインキュベーションし、ＵＶ分光光度計により分析した。緩衝溶液を、タンパク質の飽和および溶液の濁りを避けるために４８時間毎に取り替えた。結果が図１３に示される。
【０１６２】
本研究のために選ばれたポリマーは、平均分子量がそれぞれ１２０００および１８０００である、２：８（ｗ／ｗ）および３：７（ｗ／ｗ）の比率を有するｐ（ＳＡ：ＲＡ）であった。これらのポリマーは１７３２ｃｍ−１および１８１７ｃｍ−１における２つのＩＲ無水物ピークを示した。１７３２ｃｍ−１におけるピークはまた、エステル結合に参照されるかもしれない。遊離酸のピークが１７００ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）および３５００ｃｍ−１（Ｏ−Ｈ）において存在しなかった。ＮＭＲ分光法により、すべてのＲＡがＰＳＡ鎖内に挿入されていることが、３．６１３ｐｐｍにおけるＣＨ−ＯＨピークの消失および４．８５３ｐｐｍにおけるＣＨ−Ｏ−ＣＯピークの出現によって確認された。
【０１６３】
１０％のＬＨＲＨおよびオクトレチドが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の加水分解による分解を、重量減少および分子量における変化によって調べた。分子量減少における著しい違いがブランクポリマーおよびペプチドペプチドの間にはなかった。ＬＨＲＨおよびオクトレチドが、ＨＰＬＣによってモニターされたとき、４０日を超える期間にわたってゲル化ポリマーから絶えず放出された。
【０１６４】
実施例９：ブピバカイン局所麻酔剤を送達するための液状ポリマー
手術後の痛みは、手術後の患者および治癒プロセスにとって大きな問題であると見なされる。現在の方法では、短期間作用する局所麻酔剤の溶液を多数回注射することが含まれるが、時間がかかり、また、高価な設備および綿密なモニターリングが要求される。浸襲性がより低い方法は一般にそれほど有効でない。手術後の痛みのための効率的な治療がこのようにないことにより、新しい治療原理がさし迫って必要であることがこの領域では強調される。代わりの方法が高用量の局所麻酔剤の局所投与であり、これは、局所麻酔剤の効果を、制御放出の注入可能なインプラントにより、数日の期間にわたって、または、数週間の期間にわたってさえ延ばすことができる。そのような部位特異的な薬物送達システムは薬物の効果的な用量をもたらすことができ、また、全身的な配合物の繰り返される使用に関連する全身毒性を避けることができる。
【０１６５】
インプラントの調製およびインビトロでの薬物放出
ブピバカイン遊離塩基（５％、７％、１０％、ｗ／ｗ）を、薬物粉末を４０℃でポリマーに混合し、１ｍｌのシリンジをこの配合物で満たすことによって液状ポリマーに配合した。この配合物は室温では半固体物であり、体温では液体である。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１００ｍｇの半固体配合物を５０ｍｌの溶解媒体（リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））に注入することによって行った。インビボでのシンク条件をシミュレーションするために、大量の溶解媒体を使用し、ブピバカインがその最大溶解度の１０％を決して越えないようにした。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液における薬物濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。同様に、ブピバカイン塩酸塩を、類似した手順を使用してポリマーに配合した。遊離塩基のブピバカインはポリマーにおいて透明な溶液を形成し、一方、ＨＣｌ塩は微細な分散物であった。
【０１６６】
動物
体重が４０ｇであるメスのＩＣＲマウスを使用した。マウスを１つのケージに対して１０匹収容し、餌および水を自由に摂取させた。動物室を循環的に照明し（１２時間の照明、１２時間の消灯）、温度は２２℃であった。動物を、座骨神経の特定および配合物の注入の期間中、ハロタン（１．５％〜２％）により麻酔した。神経を神経刺激装置（Ｓｔｉｍｕｐｌｅｘ（登録商標）２２Ｇの直径、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ ＡＧ、ドイツ）により特定した。それぞれの動物は、ブピバカイン（１０％ｗ／ｗ）含有ポリマーの１回の注入（０．１ｍｌ）を一方の側面に受け、対応するブランクポリマーまたは生理的食塩水溶液を反対側に受けた。
【０１６７】
ポリマー配合物の毒性および排除
主要な器官における炎症、感染および壊死、ならびに、ポリマー−薬物およびコントロールにより治療された座骨神経についての死後の組織学評価を行った。ブピバカインの効力についての実験が完了した後、動物をクロラール水和物（４％）（０．２ｍｌ）により麻酔し、血液を心臓から抜き取り、そして、動物を肺穿刺によって屠殺した後、主要な器官（心臓、肺、肝臓、脾臓、脳および左右の座骨神経）を切除し、固定処理のために１０％ホルマリン溶液に入れた。その後、組織をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色した。組織学的評価を、Ｈｅｂｒｅｗ大学Ｈａｄａｓｓａｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける動物施設において病理学者の助けをかりて光学顕微鏡観察によって行った。マウス血液におけるブピバカイン濃度を知られている手法に従って求めた。簡単に記載すると、０．５ｍｌのマウス血漿を１．５ｍｌのヘプタン−酢酸エチル（９：１、ｖ／ｖ）により抽出し、２分間振とうした。１２００ｇでの１０分間の遠心分離の後、有機相をコニカルチューブに移した。２回目の抽出工程を、１００μｌの０．０５Ｍ硫酸を加え、２分間振とうした後で行った。１２００ｇでの５分間の遠心分離の後、有機相を捨て、５０μｌの水性酸塩基に１００μｌのＤＤＷを加えた。１００μｌのアリコートをクロマトグラフィーに注入した。クロマトグラフィーシステムは、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔＲ２５０−４、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＲ１００、５μｍ）を備えたＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムからなった。移動相はアセトニトリルおよび０．０１Ｍリン酸二水素ナトリウムのｐＨ２．１での混合物であった。流速は１ｍｌ／分であり、ＵＶ検出が２０５ｎｍにおいてであった（注入体積：１００μｌ、処理時間：１２分）。
【０１６８】
インビボでの効力研究
運動ブロック
マウスを４点の尺度に従って運動ブロックに関して評価した：１−正常、２−尾によって持ち上げられたとき、足の損なわれていない背屈、しかし、足の指を広げることができない、３−曲がった足の指および足の裏、しかし、広げることができない、４−背屈の喪失、足の指の屈曲、および、歩行障害。
【０１６９】
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓホットプレート感覚試験
このモデルは、独立した運動試験および感覚試験を可能にする。マウスを、プレートの上で立たせるように置いた。装置に慣れさせた後、赤外ビーム（標準熱温度、５０℃〜５２℃）を、試験された後足に向ける。後足をホットプレートから引っ込めるまでの遅れ時間を、足を交代させ、少なくとも１５秒の回復をプレート測定の間で許すことによって記録する。脚についての引っ込め筋肉は腿の内転筋（座骨神経ではなく、大腿神経）であるので、マウスは、完全な（レベル４）の座骨神経ブロックにもかかわらず、足を引っ込めることができる。加えて、針で刺すことを足に加え、反応（あり＝１、または、なし＝０）が記録される。
【０１７０】
統計学的分析
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ（事象までの時間）スコアを、分散の混合モデル分析を使用して分析した。注目される大きな疑問は、薬物がＨａｒｇｒｅａｖｅｓスコアに影響を及ぼしたかどうかであった。２つの実験を行い、異なる動物を様々な時間で使用した。薬物、実験および時間は固定効果であると見なされ、動物（実験および時間において入れ子にされる）がランダム効果であると見なされた。ＳＡＳ Ｐｒｏｃ Ｍｉｘｅｄ（バージョン８／０２）を使用して、分析を行った。
【０１７１】
結果
インビトロでの薬物放出
ブピバカインを、ＧＰＣによって確認されるように、ポリマーの分子量に影響を及ぼすことなくポリマーに配合した。ブピバカイン遊離塩基（ＢＦＢ）は１５％（ｗ／ｗ）のＢＦＢまでＰ（ＳＡ：ＲＡ）に容易に可溶である。塩酸塩の塩は、少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の負荷まで、その粘度に影響を及ぼすことなくポリマーに十分に分散した。５％および７％のブピバカインを含有するＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）配合物およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）配合物は、一次のプロフィルで薬物を絶えず放出し、取り込まれた薬物の約６０％が緩衝液において７日の期間中に放出され、１０％を含有する配合物はその含有量のおよそ７０％をこの期間中に放出した。すべての実験について、より大きいＭＷのポリマー（Ｍｗ＝１８０００）は、低いＭＷのポリマー（Ｍｗ＝５０００）と比較して、薬物をより遅い速度（それぞれの時点で放出された量の１０％〜２０％少ない）で放出する。
【０１７２】
毒性および組織病理学的評価
座骨神経、その周りの組織（脂肪および筋肉）および主要な器官の組織学的評価を、注入後の３日および１週間で屠殺されたマウスに対して行った。注入後３日では、３匹中１匹のマウスにおいてのみ、マクロファージの浸潤が、座骨神経を取り囲む脂肪に見出された。それ以外の２匹のマウスでは、左右の神経、周りの筋肉および脂肪は正常であることが見出された。他の調べられた器官のすべて（肺、肝臓、心臓、脳および脾臓）がすべての調べられたマウスにおいて正常であることが見出された。注入後１週間で行われた組織学的検査では、５匹中２匹のマウスにおいてのみ、希な好中球および神経周囲リンパ球が、座骨神経を取り囲む組織に見出され、調べられた器官のすべて（肺、肝臓、心臓、脳および脾臓）がすべての調べられたマウスにおいて正常であることが見出された。
【０１７３】
ポリマーに負荷された薬物の１０ｍｇを注入した後におけるブピバカインの血漿中濃度を調べた。２４時間後、血漿中レベルは７５±１５ｎｇ／ｍｌに達し、その後、６日後では１８±５ｎｇ／ｍｌに低下し、７日目以降〜２１日目まで、血漿中レベルはほとんど検出不能であった（７±２ｎｇ／ｍｌ）。これらの血漿中濃度は、痙攣のような何らかの観測された全身毒性を引き起こさず、また、ポリマーに負荷されたブピバカインの１０ｍｇが与えられたマウスはすべてがこの研究を生き延びた。
【０１７４】
効力
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓホットプレート感覚試験を、ブピバカイン配合物の注入後、４日の期間中に行った。麻酔効果が注入後の３日の期間中維持されたことが見出された。運動ブロックが注入後２４時間〜３６時間で消失した。
【０１７５】
結論：これらの結果に基づいて、ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）はブピバカインの放出を遅らせ、感覚消失を、何らかの負の病理学的影響を伴うことなく延ばす。
【０１７６】
実施例１０：骨粗鬆症を治療するためのゲンタマイシンの制御放出のためのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル−無水物）生分解性キャリア
骨髄炎は、通常の場合には細菌によって、しかし、ときには真菌によって引き起こされる骨感染症である。骨が冒され得る３つの可能な様式がある。骨の感染が、傷害を受けているか、または、血液循環が悪い隣接する軟組織からの感染の拡大によって引き起こされ得る。身体の他の部分からの感染が血液を介して骨に持ち込まれ得る（血液学的広まり）。直接の骨感染が穿通創または開放骨折の結果であり得る。骨感染の治療は主に、手術による創面切除、すべての異物の除去、および、抗生物質治療を伴う。通常、静脈内投与による抗生物質が３週間にわたって処方され、その後、３週間の経口投与による抗生物質が続く。しかしながら、骨における効果的な治療的薬物レベルを達成するために要求される抗生物質の大きい非経口用量、ならびに、長期にわたる治療経過は、抗生物質の全身毒性をもたらし得る。感染部位への抗生物質の局所的送達は、従来の静脈内治療を上回る大きな利点をもたらす。局所的な薬物送達システムでは、低い全身的薬物レベルを維持しながら、感染部位における大きな薬物濃度を達成することができる。抗生物質の局所的送達のために開発された薬物送達システムは非生分解性キャリアおよび生分解性キャリアに分けることができる。ゲンタマイシンを含有するポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ビーズが、欧州では骨髄炎の治療における使用のために承認されている。この製造物は、有効であることが証明されているが、非生分解性であり、かつ、抗生物質の放出が完了したときにビーズのその後の取り出しを必要とするという大きな欠点を有する。近年、様々な生分解性の送達システムが開発され、骨感染症の治療における抗生物質の局所的送達について評価されている。硫酸ゲンタマイシンは強力な抗生物質薬剤であり、現在、長期の留置カテーテル、抗生物質を含有するポリメタクリル酸メチルビーズまたはリン酸カルシウム（骨セメント）の局所インプラントとともに、主に静脈内注入による骨髄炎の治療のために使用されている。
【０１７７】
インビトロでのゲンタマイシン放出
異なる分子量を有するＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ比）ポリマーを、実施例１に記載されるように調製した。硫酸ゲンタマイシンを、均一な混合物が得られるまで、加熱または溶媒の使用を何ら伴うことなく、室温でポリ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に混合した。薬物負荷量は１０％および２０％であった。薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２００ｍｇの配合物を５０ｍｌのリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に入れることによって行った。生物学的流体の流れをシミュレーションするために、緩衝溶液を４８時間毎に取り替え、取り替えた溶液をゲンタマイシン分析のために保存した。
【０１７８】
インビトロ放出アッセイのために、２５μｌの配合物を２４ウエルマイクロタイター平底プレート（Ｎｕｎｃ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）から入手可能）におけるそれぞれのウエルの底に置いた。１ｍｌのリン酸塩緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を加え、プレートを加湿チャンバーにおいて３７℃でインキュベーションした。それぞれの時点で、溶解媒体を集め、配合物を１ｍｌのＰＢＳにより洗浄し、新鮮な１ｍｌのＰＢＳをウエルに加えた。媒体を遠心分離し、上清を細菌研究およびゲンタマイシン濃度分析のために保存した。
【０１７９】
集められたサンプルを１００倍希釈し、フルオレスカミン（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を反応させ、３９２ｎｍの励起波長および４８０ｎｍの放射波長で分光蛍光計（Ｊａｓｃｏ、日本）によって分析して、ゲンタマイシンの濃度を求めた。
【０１８０】
本研究のために調製された配合物は２０ｍｇ〜４０ｍｇのゲンタマイシンを含有した。ゲンタマイシン負荷ポリマーを、薬物粉末をポリマーペーストに単に混合することによって調製した。薬物の塩と、ポリマーとの間での化学的相互作用は何ら認められなかった。ペースト状配合物からのリン酸塩緩衝液へのゲンタマイシンの放出速度が図１４に示される。２０％のゲンタマイシンを有する配合物は、１０％のゲンタマイシンを有する配合物の放出プロフィルよりも遅い放出プロフィルを有することを認めることができる。放出プロフィルにおけるこの違いは、ゲンタマイシンと、ポリマーの脂肪分解産物との間での塩形成のためであることが最も考えられる。両方の場合において、ポリマーの分子量を増大させると、ゲンタマイシンの放出速度が低下する。Ｍｎが１００００Ｄａを超えるゲンタマイシン負荷ポリマーは粘性であり、注入することが困難であった。従って、２０％のゲンタマイシンが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（Ｍｎ＝４５００）をさらなる研究のために選んだ。
【０１８１】
別のインビトロ放出研究において、ゲンタマイシンを２４ウエルトレイ（ウエルあたり１ｍｌの溶液）の中に放出させた。本研究で使用された配合物はおよそ５ｍｇの活性なゲンタマイシンを含有した。放出プロフィルは、より大量の水において放出するときに得られる放出プロフィルと類似していた。例えば、８日後では、負荷されたゲンタマイシンの９％（約０．４５ｍｇ）が放出された。全体的な結果は、長期間（例えば、６０日を超える期間）にわたるゲンタマイシンの絶え間ない放出を示しており、これは、慢性的な感染を治療するために、または、再発する感染を防止するために好都合なことである。緩衝剤溶液における放出されたゲンタマイシンの抗菌活性が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＴＳＢにおいて一晩インキュベーションし、細菌の生存性を求めることによって確認された。
【０１８２】
インビトロでの抗菌活性
ゲンタマイシンを含有するポリマーのインビトロ放出研究からの上清溶液をＳ．ａｕｒｅｕｓの培養液に加えた。集められた上清をＰＢＳで１００倍、１０００倍および１００００倍希釈し、１０６個のＳ．ａｕｒｅｕｓをＴＳＢに含有する９６ウエルマイクロタイター平底プレートにおけるウエルに加えた。プレートを、温度制御されたマイクロプレート分光光度計（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、米国）の内部で２４時間インキュベーションした。光学濃度（ＯＤ）の測定を６５０ｎｍで２時間毎に行って、ウエルにおける細菌濃度を求めた。相関が、フルオレスカミン法によって求められたゲンタマイシン濃度と、インビトロでの細菌作用との間で見出された。
【０１８３】
本研究で使用されたＳ．ａｕｒｅｕｓｕについてのゲンタマイシンの最小阻害濃度は２μｇ／ｍｌ〜４μｇ／ｍｌである。ＶＥＲＳＡｍａｘ分光光度計よる分析の結果が図１５にまとめられる。６日後および８日後で、ゲンタマイシンの濃度は、溶液が１００倍希釈（４．５ｘ１０−３ｍｇ／ｍｌ）および１０００倍希釈（４．５ｘ１０−４ｍｇ／ｍｌ）されたときにそれぞれ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを根絶するために十分であった（図１５におけるＡおよびＢ）。１００００倍希釈の場合（図１５におけるＣ）、濃度は阻害的ではなかった。ブランクＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ）（Ｍｎ＝４５００）を伴うコントロールウエルは細菌の成長に影響を及ぼさなかった。このウエルでは効果が何ら見出されなかった：Ｏ．Ｄ．がおよそ０．７であった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓをＴＳＢのみに含有するウエルでは、およそ０．６のＯ．Ｄ．が見出された。ゲンタマイシン放出の結果（図１４）および希釈された溶液による顕著な細菌阻害（図１５）を考慮すると、おそらくは、著しい抗菌活性がより早い段階での放出媒体において認められる。
【０１８４】
インビボ効力および注入部位での薬物濃度
１０％および２０％の硫酸ゲンタマイシンが負荷された注入可能なｐ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル−無水物）の３：７（ｗ／ｗ）ポリマーおよび２：８（ｗ／ｗ）ポリマーを使用した。効力研究を、１６匹のオスＷｉｓｔａｒラットの両方の脛骨近位端において黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を感染させたラットに対して行った。脚を剃毛し、除毛し、アルコール消毒した。無菌状態を手術期間中に提供するために、動物を無菌ドレープの上に置き、身体を無菌シートで覆った。脚を無菌の切開ホイルで別々に覆った。近位側の脛骨骨幹端における皮膚および筋膜を長さ５ｍｍにわたって切開した。穴を、皮質骨および海綿骨を貫いて開けた（３ｍｍのチタンバー）。１ｍｌあたり１．０ｘ１０６コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を含有するＳ．ａｕｒｅｕｓの懸濁物を調製した。１０μｌの懸濁物を５０μｌのシリンジによりそれぞれの創傷部位に注入した。動物を、骨髄炎を発症させるために４週間維持した。この期間の後、患部肢のＸ線写真を撮影し、ラットは治療を受けた。配合物を試験群からのラットの感染骨に注入した。
【０１８５】
試験群はｐ（ＳＡ：ＲＡ）の注入を受けた。１０％のゲンタマイシンが負荷されたポリマーの１００μｌを２３Ｇのニードルにより感染骨に注入した。コントロール群は何ら治療を受けなかった。
【０１８６】
動物を屠殺した後、肢を手首および肘で関節離開した。それぞれの試料のＸ線写真を撮影した。２ｍｍの組織サンプルを、１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に埋め込み部位から採取した。組織を１ｍｌの規定生理的食塩水（ｐＨ７．４）においてホモジネートし、遠心分離した。上清を取り出し、Ａｂｂｏｔｔ ＤｉａｇｎｓｔｉｃｓからＴＤｘの商標で入手可能である蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）によって分析して、ゲンタマイシンの濃度を求めた。
【０１８７】
すべての動物において、細菌計数における著しい減少が、コントロール群と比較して見出された。ゲンタマイシンが、４週間後、分析された組織において見出され、微量が８週間後に観測された。
【０１８８】
ポリマー−ゲンタマイシンインプラントの毒性
オスのＷｉｓｔａｒラット（１０週齢）（Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）を特定病原体除去条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（国立衛生研究所承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）は動物研究についての申請を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決している（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【０１８９】
２００μｌのゲンタマイシン負荷された半固体配合物（０％、１０％および２０％、ｗ／ｗ）を、３匹のＷｉｓｔａｒラットからなる２つの群の腹部の前方に１９Ｇのニードルにより皮下注入した。一方の群には、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）ブランクの２００μｌを含有する配合物が左側に埋め込まれ、２０％のゲンタマイシンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２００μｌが右側に埋め込まれた。第２の群には、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）ブランクの２００μｌを含有する配合物が左側に埋め込まれ、１０％のゲンタマイシンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２００μｌが右側に埋め込まれた。動物を局所的毒性の徴候および体重減少について観察した。注入後６週間で、ラットを屠殺し、インプラントを化学的分析のために取り出し、周りの組織を４％中性緩衝化ホルムアルデヒドにおいて固定処理し、組織病理学的検査に供した。
【０１９０】
組織病理学的評価では、１０％または２０％のゲンタマイシン配合物がポリマーｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に加えられた２つの群から採取されたサンプルにおいて、被膜組織反応の程度が、ブランクポリマーだけが存在したときに形成される被膜組織反応の程度に匹敵したことが示された。このことは、混合治療様式を適用したとき、有害な反応がないことを示唆する。形成された被膜は成熟コラーゲンの沈着物から主に構成され、これには、線維芽細胞、血管、および、まばらな組織球または他の単核細胞の存在が付随していた。何らかの活発な炎症反応または組織刺激の証拠は何ら、被膜内に、または、局所的被膜を越えて広がって存在していなかった。すべての場合において、被膜の厚さは類似していた。薄い包み込む被膜から典型的にはなる局所的な組織反応は、瘢痕化する亜慢性の炎症反応として解釈された。肉芽腫性異物、リンパ球様細胞の凝集、および／または、免疫学的刺激の証拠は何ら認められなかった。このことは、インプラントが十分に許容されたことを示している。
【０１９１】
骨とのポリマー（ポリ（ＲＡ−ＳＡ）（７０：３０））および２０％ゲンタマイシン負荷配合物の生体適合性を、ラットの脛骨に穴を開け、０．２ｍｌのポリマーまたは配合物を骨の中に注入することによって求めた。５匹のラットからなる群を本研究では使用した。骨を組織病理学的に分析し、ポリマーまたは配合物に起因すると考えられる毒性の証拠は何ら見出されなかった。ポリマーに対する応答で認められた炎症は、正常な機構による物体の積極的な除去と一致していた。ポリマーおよび配合物は埋め込み後の８週間後には骨から完全に除かれた。
【０１９２】
γ線照射に対する安定性
２０％の硫酸ゲンタマイシン（ＧＳ）を伴うＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ）を本研究では使用した。重合が完了した後、ＧＳをペースト状ポリマーに室温で加え、均一な混合物が達成されるまで機械的に混合した。１ｍｌの混合物を１ｍｌのロック式プラスチックシリンジに入れた。１ｍｌのブランクポリマーを含有するシリンジもまた調製した。すべてのポリマーに２．５Ｍｒａｄの吸収線量を６０Ｃｏ線源（４５００００Ｃｉ；８時間）によって照射した。照射をＳｏｒ−Ｖａｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．（Ｋｉｒｙａｔ Ｓｏｒｅｑ、Ｙａｖｎｅ、イスラエル）において行った。
【０１９３】
照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの分子量をＧＰＣによって測定した。照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの融点をＤＳＣによって測定した。照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの化学構造をＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって求めた。ゲンタマイシン含有量を、照射前のサンプルおよび照射後のサンプルをジクロロメタンに溶解し、薬物を２回蒸留水（ＤＤＷ）により３回抽出することによって求めた。抽出液を一緒にし、分光蛍光計を使用して分析した。
【０１９４】
照射後、配合物を、３７℃、２０℃、４℃および−１７℃で貯蔵した。非照射サンプルをコントロールとして使用した。種々の時点で、サンプルを照射配合物およびコントロール配合物から取り出し、上記の方法によって分析した。結果が表９に示される。
【０１９５】
いくつかの時点で、簡単な薬物放出研究を、貯蔵条件による薬物放出における起こり得る変化を検出するために行った。４℃および−１７℃で貯蔵された配合物の放出プロフィルが図１６に示される。ゲンタマイシンの放出はこれら２つの配合物では類似していた。サンプルをジクロロメタンに溶解し、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）により３回抽出した。図１６ａには、４℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出が示される。図１６ｂには、−１７℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出が示される。照射サンプルおよび非照射サンプルの放出プロフィルは類似していた。このことは、照射はポリマーからの薬物の放出に影響を及ぼさなかったことを示している。２週間にわたる室温での貯蔵は、ゲンタマイシンの放出プロフィルに影響を及ぼさないようであった。照射配合物および非照射配合物についてのＩＲスペクトルおよびＮＭＲスペクトルには違いが何ら認められなかった。貯蔵期間中の分解を、無水物ピークの消失および１７００ｃｍ−１における酸ピークの出現をモニターすることによりＩＲ分光法によって追跡することができる。分解が、−１７℃で貯蔵された配合物については何ら示されなかった。４℃で貯蔵された配合物は、６週間後、酸のピークをもたらし、このピークは時間とともに増大した。
【０１９６】
実施例１１：リシノール酸オリゴマーを含有する液状ポリエステル
リシノール酸の直接の縮合によって調製された、Ｍｗが２２００および３６００であるリシノール酸オリゴマーを本研究では使用した。ヒドロキシ末端のＲＡオリゴマーを、ＲＡオリゴマーを、エチレングリコールまたはプロピレングリコールのエステルを形成するエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと反応することによって得た。このヒドロキシ末端のＲＡオリゴマーを、ＤＬ−ラクチド、カプロラクトンおよびグリコール酸ならびにそれらの混合物の開環重合のための開始剤として使用した。Ｂセグメントがリシノール酸オリゴマーであるＡＢＡトリブロックコポリマーを、ＨＯ末端のＡオリゴマーを、オクタン酸第一スズを触媒として使用してＤＬ−ラクチドと開環重合することによって得た。ＲＡオリゴマーおよびラクチドの間でのモル比により、分子量およびセグメント長さが決定された。２０％のＲＡオリゴマーを含有するＤＬ−ラクチドのトリブロックコポリマーは室温で液状であったし、水中でゲルを形成する。同様に、ペースト状ポリマーを、ＤＬ−ラクチドと、１つのヒドロキシル基を有するＲＡオリゴマーとのジブロックコポリマーから得た。
【０１９７】
ＲＡオリゴマーおよびヒドロキシル酸のランダムコポリマーを、乳酸、グリコール酸およびヒドロキシ酪酸とのリシノール酸オリゴマーの重縮合によって得た。この重合は、酸性触媒を用いてトルエン中で行われる。トルエンをエバポレーションした後、重合が、１０％未満の乳酸含有量でのペースト状ポリマーを得るために、１ｍｍＨｇの真空下で１３０℃で続けられる。粘性のコポリマーが、ヒドロキシル酸およびそのラクトンをポリエステルに共重合することから得られた。これらのポリマーは、身体に注入されたとき、粘度が増大し、取り込まれた薬物を、主に薬物の水溶性に依存して数週間および数ヶ月にわたって放出する。
【０１９８】
実施例１２．乳酸およびグリコール酸とのリシノール酸のポリエステルの合成および特徴づけ
Ｌ−乳酸（５０％水溶液）を使用前に一晩凍結乾燥した。ひまし油およびＬ−乳酸を、１：１０、１：５、２：５、３：５のｗ／ｗ比（ｗ／ｗ、ひまし油対ラクチド）で、触媒としての０．５％（ｗ／ｗ）のＨ３ＰＯ４と混合し、乾燥Ｎ２を流しながら１．５時間、１７０℃に加熱して、系を乾燥させた。１．５時間後、反応物を１５ｍＢａｒの真空につなぎ、反応を２４時間続けた。サンプルを３時間、５時間および７時間の重合のときに採取した。
【０１９９】
ポリマーの外観ならびに重量平均分子量および数平均分子量が表４に記載される。リシノール酸および乳酸のポリエステルもまた調製した。これらのポリマーの性質が表５に記載される。リシノール酸／ひまし油との乳酸の共重合により、所望される性質（例えば、柔軟性、疎水性および柔らかさなど）を有するポリマーが得られた。ポリマー鎖におけるリシノール酸の存在は、軟らかいポリマー、または、液状でさえあるポリマーを生じさせるためのポリマーの立体障害をもたらした。これらのペースト状ポリマーは、ポリマーを水溶液に沈めたとき、より硬い物質にゲル化した。これらのポリマーペーストを組織内に注入することにより、ポリマー配合物の注入部位での局在化がもたらされた。
【０２００】
３０：７０の比率（ｗ／ｗ）（３０％のひまし油またはリシノール酸）を含有するポリマーをＤＬ−乳酸およびグリコール酸ならびにそれらの混合物から合成した。すべてのポリマーが４０００の範囲でのＭｎの類似した分子量を示し、ペースト状の物質であった。ＤＬ−乳酸ポリマーはそれ以外のポリマーよりも液体様であった。すべてのポリマーが、水性媒体に室温で１時間入れたとき、その粘度を変化させ、ゲル化する。
【０２０１】
実施例１３．リシノール酸および乳酸のポリエステルからのタキソールおよびメトトレキサートのインビトロでの放出
１０％（ｗ／ｗ）のタキソールおよび１０％（ｗ／ｗ）のメトトレキサートを含有する配合物を、薬物を、Ｍｎ＝３０００およびＭｗ＝７０００を有するポリ（乳酸：ひまし油）の６０：４０（ｗ／ｗ）比のコポリマーおよび７０：３０（ｗ／ｗ）比のコポリマーと混合することによって調製した。薬物を、乳鉢および乳棒を使用してポリマーと室温で混合した。溶媒または熱は何ら使用しなかった。ペースト状配合物における薬物粒子の粒子サイズは、ＳＥＭ分析によって決定されたとき、１００ミクロン未満であった。
【０２０２】
１ｍＬのシリンジに薬物−ポリマー配合物を充填し、それぞれ１０ｍｇのサンプルを、ｐＨが７．４である５０ｍｌのリン酸塩緩衝液に３７℃で注入した。緩衝溶液はまた、０．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有した。ＳＤＳは、放出されたパクリタキセルの溶解性を増大させるために添加された。緩衝液を、最初の１週間は毎日取り替え、その後は３日毎に取り替えた。パクリタキセルおよびメトトレキサートの放出をＨＰＬＣによってモニターした。タキソールおよびメトトレキサートがポリマー配合物から一定の速度で放出され、ポリマーが、崩壊することなく、一様な半固体の液滴として残留した。負荷されたメトトレキサートの２５％が約２０日間にわたって一定の速度で放出され、一方、負荷されたパクリタキセルの５％および１０％が約３０日後および６０日後にわたってそれぞれ放出された。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度を種々の剪断速度において温度（℃）の関数として示すグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図２】種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））（２：８）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図３】種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリリシノール酸（ＰＲＡ）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図４】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：４）をリン酸塩緩衝液にさらした前後における、剪断速度（ｓｅｃ−１）と、剪断応力（ダイン／ｃｍ２）との間における関係を示すグラフである。
【図５】５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からのパクリタキセルのインビトロでの累積放出を示す。
【図６ａ】分解途中のサンプルの重量減少によってモニターされる、無負荷のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、ならびに、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。
【図６ｂ】インビトロでの加水分解による分解の期間中でのサンプルにおけるパクリタキセルの蓄積（ＮＰ ＨＰＬＣによって求められる）を示す。
【図７】Ｃ３Ｈ正常マウスの皮下に注入されたブランクポリマーおよびパクリタキセル配合物（５％および１０％）のインビボでの分解を示す。
【図８】Ｃ３ＨマウスにおけるＭＢＴ異所性モデルに対するパクリタキセル配合物のインビボ抗腫瘍効果を示す。
【図９】Ｃ５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの生存の進展を示す。
【図１０】５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの腫瘍量の進展を示す。
【図１１】実験期間中のすべての治療群におけるラットの平均体重の進展を示す。標準偏差が誤差棒によって示される。
【図１２】種々の治療群についての死亡時の腫瘍体積の進展を示す。
【図１３】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）（ｗ／ｗ）およびｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）（ｗ／ｗ）からの、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、インスリン、インターフェロン−α（「ＩＮＦ−ａｌｐｈａ」）およびインターロイキンのパーセントインビトロ放出を時間（ｈｏｕｒｓ）の関数として示す。
【図１４】異なる分子量のｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）からのゲンタマイシンのパーセントインビトロ放出を時間（日数）の関数として示す。
【図１５】３つの異なる希釈物について時間（日数）に対する細菌濃度（光学濃度）を示すグラフである。
【図１６】４℃および−１７℃で８週間にわたって貯蔵された後でのゲンタマイシンの放出を時間（日数）の関数として示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国特許仮出願第６０／７２０８４０号（２００５年９月２７日出願）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般には、医薬的に活性のある薬剤の制御された放出のためのゲル化疎水性ポリマー組成物の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
非経口投与による制御された薬物送達のためのｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムは、典型的には、広範囲の粘度を有する液体またはペーストの形態である。そのようなシステムは通常、溶媒／共溶媒系に溶解または分散された生分解性のキャリアを含有し、一方で、薬物は送達システムの液相に分散されるか、または溶解されるかのいずれかである。皮下または筋肉内に注入されたとき、固体の貯留部が注入部位において形成される。そのようなシステムの投与は、多くの場合には埋め込むことが要求される外科的手法よりもはるかに侵襲性がなく、また、費用がかからない。近年、種々のｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムが再検討され、貯留部形成機構に従って種々のカテゴリーに分類されている（Ｈａｔｅｆｉ他、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、８０（１−３）：９〜２８（２００２））。
【０００４】
近年では、様々な特定の製造物（例えば、Ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）技術を酢酸ロイプロリドを長期間送達するために使用するＥｌｉｇａｒｄ（登録商標）など）が規制当局により承認されたために、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（「ＰＬＧＡ」）コポリマーとともに形成されるｉｎ ｓｉｔｕ析出システムが最も注目を集めている。Ｅｌｉｇａｒｄ（登録商標）は、Ａｔｒｉｘ Ｌａｂ（現在、ＱＬＴ）によって上市されている。Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）は、この特定の配合物において使用される有機溶媒である。他の有機溶媒（例えば、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、トリアセチンおよび安息香酸エチルなど）もまた、初期薬物バーストに対する影響について評価されている。これらの有機溶媒の生体適合性および全身毒性が主要な懸案事項となっている。ＰＬＧＡのｉｎ ｓｉｔｕ貯留部形成システムがまた、より親油性の溶媒（例えば、安息香酸ベンジル（Ａｌｚａｍｅｒ（登録商標）など）の使用によりＡｌｚａによって開発されており、このシステムは、刺激性がより少ないことが主張されており、また、初期薬物バーストが低下している。
【０００５】
ＳＡＢＥＲ（登録商標）システム（Ｄｕｒｅｃｔ）は、エタノール、ベンジルアルコールまたは他の水混和性溶媒に溶解されたスクロースアセタートイソブチラート（ＳＡＩＢ）からなる。溶液の粘度が低いために、小ゲージのニードルによる投与の容易さは、ＰＬＧＡシステムを上回る明白な利点である。ＳＡＢＥＲ−ブピバカインの長期間作用配合物が現在、手術後の痛み管理について臨床試験中である。ペプチドおよびタンパク質を送達するためのＳＡＢＥＲシステムにおいてあり得る適用もまた、組換えヒト成長ホルモン（「ｒｈ−ＧＨ」）が、液相に溶解された不溶性ｒｈ−ＧＨ粉末およびＰＬＧＡを含有するＳＡＢＥＲ懸濁物からラットにおいて７日間持続して放出されたことによって明らかにされている。感熱性の生分解性トリブロックコポリマーが、非経口による薬物送達のための持続放出システムとしてＭａｃｒｏＭｅｄによって開発されている。そのコポリマーは疎水性のＰＬＧＡブロック（Ａ）および親水性のＰＥＧブロック（Ｂ）から構成され、２つの異なったブロック形態（ＡＢＡおよびＢＡＢ）を有する。ＲｅＧｅｌ（登録商標）は、水に可溶であるＡＢＡ型のトリブロックコポリマーである。ＲｅＧｅｌ（登録商標）の水溶液は、１５℃では自由に流れる液体であり、これは、注入されたとき、体温でゲルに変わる。薬物放出速度が、疎水性／親水性の含有量、ポリマー濃度、トリブロックコポリマーの分子量および／または多分散度を変化させることによって調節される。様々な薬物をＲｅＧｅｌ（登録商標）に溶解、懸濁または乳化させることができる。ＯｎｃｏＧｅｌ（登録商標）は、固形腫瘍の局所的治療のためにＲｅＧｅｌ（登録商標）に配合されたパクリタキセルを含有する製造物である。パクリタキセルが可溶化され、ゲルの疎水性ドメインの内部に閉じ込められ、その放出が、ゲルが分解／侵食を受けるに従い、６週間にわたって持続する。ＲｅＧｅｌにおけるパクリタキセルの血管周囲での持続した送達もまた、イヌにおける血管移植片での新生内膜過形成を効果的に阻害することが示されている。ＲｅＧｅｌ（登録商標）の水性的性質のために、水溶性薬物についての長期間の持続した放出（例えば、１ヶ月を超える放出）は、達成することが困難であり得る。さらに、薬物の大きい初期バーストを避けることができない。
【０００６】
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０７は、ポリ（オキシエチレン）ユニットおよびポリ（オキシプロピレン）ユニットからなるＡＢＡトリブロックコポリマーである。これは、逆熱ゲル化性質を有する水溶液を形成する水溶性の非イオン性界面活性剤である。ポリマーが２０％を超える溶液は低い温度で低い粘度を示すが、体温では柔軟性のない半固体ゲルの網状組織物を迅速に形成する。しかしながら、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）の非経口適用は、生分解性がないこと、および、高いポリマー濃度での細胞毒性の懸念によって制限されている。このポリマーが腹腔内注入された後でのラットにおける血漿コレステロールレベルおよび血漿トリグリセロールレベルの増大もまた問題となり得る。
【０００７】
多数のチオール（−ＳＨ）基をポリマー骨格に沿って含有するポリ（エチレングリコール）型コポリマーの調製もまた報告されている。このコポリマーの水溶液が、架橋剤、すなわち、中性のリン酸塩緩衝液に溶解されたα，ω−ジビニルスルホン−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＤのＭＷ）と混合されたとき、ヒドロゲルが形成された。水溶性薬物をいずれかの溶液に溶解することができ、ヒドロゲルが形成されるときに、薬物が物理的に閉じ込められる。ラットおよびウサギにおける予備的な生体適合性評価では、ｉｎ ｓｉｔｕ架橋ゲルに対する軽度の有害な組織反応が示された。
【０００８】
ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）（ＤｅｌＳｉｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）ポリマーは、アロエ植物から抽出および精製された天然の酸性多糖である。このポリマーは、水溶液では、皮下または筋肉内に注入されたとき、カルシウムの存在下でゲルを形成し、従って、水溶性薬物（すなわち、タンパク質）を水溶液に閉じ込め、持続した放出をもたらす。この結合により、薬物放出に関するさらなる制御が、タンパク質の生物学的機能を妨害することなくもたらされる。
【０００９】
これらのシステムは、水に浸けられたとき、親水性溶媒が周囲の組織に溶け出し、その一方で、ポリマーが析出する、水、ＮＭＰ、ポリエチレングリコールおよび／または他のジオールのいずれかにおけるポリマーキャリアの親水性溶液に基づいている。そのようなシステムの制限には、注入のために要求されるポリマーキャリアおよび溶媒の大きい体積；親水性溶媒が速く溶け出すことによる、ポリマー溶液に取り込まれた薬物のバースト放出；毒性有機溶媒（例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）など）の使用；および、ポリマーの遅い分解時間（例えば、数ヶ月〜数年）が含まれる。
【００１０】
薬物治療の目的は、薬物の治療的効果を最大限にし、その一方で、有害な影響を最小限に抑えることである。局在化した腫瘍に対する薬物の全身送達は、薬物の比較的低い濃度が、腫瘍における異常な毛細管ネットワークから遠くに位置することがある増殖し続ける細胞境界部に提供されるという欠点を有する。抗ガン薬物が負荷されたポリマー型インプラントは、高用量の局在化した薬物を長期間にわたって直接に腫瘍内または腫瘍切除部位において送達する機会をもたらす。従って、注入可能なｉｎ ｓｉｔｕ硬化性の半固体の薬物貯留物が、代わりの送達システムとして開発され続けている。このようなインプラントシステムは、シリンジにより体内に注入することができ、かつ、注入されると、ゲル化して、半固体の貯留物を形成することができる生分解性の製造物から作製される。生分解性のポリ無水物およびポリエステルが、制御された薬物送達のための有用な物質である。
【００１１】
薬物キャリアとして使用されるリシノール酸含有のポリエステルおよびポリ無水物が、米国特許出願公開第２００４／０１６１４６４号および同第２００４／０１６１４６４号（Ｄｏｍｂ）に記載されている。しかしながら、これらのポリマーは、３０個のモノマーユニットの範囲での低い重合度をもたらし、かつ、ペースト状のポリマーを得るために大きいリシノール酸含有量を必要としたリシノール酸モノマーから調製された。また、これらの以前に記載されたポリマーは、水性媒体中に置かれたとき、ゲル化しなかった。
【００１２】
以前に記載された薬物送達システムにもかかわらず、薬物の制御放出のためにｉｎ ｓｉｔｕインプラントを形成するか、または、一時的な手術用インプラントとして役立つ、体内に注入することができる信頼できるポリマー組成物が依然として求められている。
【００１３】
従って、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、水性媒体または組織に入れられたときにゲル化する生分解性のポリエステルおよびポリエステル−無水物、ならびに、その作製方法および使用方法を提供することが本発明の１つの目的である。さらに、乳酸、グリコール酸およびヒドロキシルカプロン酸から作製されるポリヒドロキシアルカン酸エステルの一般に使用される固体のホモポリエステルおよびコポリエステルを、比較的少量のリシノール酸オリゴマーを配合することによって液体またはペーストに変換することが本発明の目的である。
【００１４】
さらに、アルカンジカルボン酸の一般に使用される固体のホモポリ無水物およびコポリ無水物を、リシノール酸オリゴマーをポリマー骨格に取り込むことによって液体またはペーストに変換することが本発明の目的である。
【００１５】
さらに、３７℃未満で液体またはペーストである生分解性のポリエステルおよび／またはポリ無水物からの、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも４週間にわたる医薬的に活性のある薬剤の持続した放出を提供することが本発明の目的である。
【００１６】
さらに、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、約１２週間で完全に分解するゲルを、水性媒体または組織に入れられたときに形成する生分解性のポリエステルおよびポリ無水物を提供することが本発明の目的である。
【００１７】
さらに、内部器官の接着防止のためのシーラントおよび一時的なシールドとして役立ち得るペースト状の生分解性組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１８】
さらに、低コストの純粋なリシノール酸を粗リシノール酸またはひまし油から提供することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【００１９】
リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシ基またはカルボン酸基を有する脂肪族分子から合成された生分解性キャリアであって、３７℃未満の温度で液体またはペーストである生分解性キャリア、ならびに、その作製方法および使用方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載されるポリマーは、水性媒体に浸けられたとき、その粘度を著しく増大させる。本明細書中に記載されるポリマーは、疎水性の生物医学的シーラント、接着を防止するための一時的なバリア、細胞支持体、薬物送達用のキャリア、および、埋め込み可能な医療デバイス（例えば、ステントなど）における被覆として使用することができる。リシノール酸オリゴマーから作製された本明細書中に記載されるポリマーは、リシノール酸モノマーから調製された類似する組成および分子量のポリマーと比較して、粘度が小さく、かつ、注入することがより容易であり、また、リシノール酸モノマーから合成されたポリマーと比較して、より大きい分子量を有し、取り込まれた薬物をより長い期間にわたって保持し、かつ、より遅い速度で軟らかい分解産物に分解する。様々な医薬的に活性のある薬剤を、有機溶媒の使用を伴うことなく、そのような液体またはペーストに取り込むことができる。
【００２０】
組成物を水性媒体（例えば、体液など）に浸けることにより、組成物の粘度が増大し、これにより、半固体の物質の形成がもたらされる。１つの実施形態において、ポリマー物質は、リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基、および、少なくともヒドロキシル基またはカルボン酸基のいずれかを有する脂肪族分子とから構成される、ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）である。
図面の簡単な記述
図１は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度を種々の剪断速度において温度（℃）の関数として示すグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図２は、種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））（２：８）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図３は、種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリリシノール酸（ＰＲＡ）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃、２４時間）。
図４は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：４）をリン酸塩緩衝液にさらした前後における、剪断速度（ｓｅｃ−１）と、剪断応力（ダイン／ｃｍ２）との間における関係を示すグラフである。測定を２３℃で行った。実線は、リン酸塩緩衝液にさらされる前のポリマーを示し、点線は、リン酸塩緩衝液にさらされた後のポリマーを示す。
図５は、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からのパクリタキセルのインビトロでの累積放出を示す。それぞれの点が平均値±ＳＴＤ（ｎ＝３）を表す。放出を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において３７℃で行った。パクリタキセルの濃度をＨＰＬＣによって求めた。
図６は、負荷Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）および無負荷Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。図６ａは、分解途中のサンプルの重量減少によってモニターされる、無負荷のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、ならびに、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。図６ｂは、インビトロでの加水分解による分解の期間中でのサンプルにおけるパクリタキセルの蓄積（ＮＰ ＨＰＬＣによって求められる）を示す。インビトロでの加水分解による分解を一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃でリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）において行った。
図７は、Ｃ３Ｈ正常マウスの皮下に注入されたブランクポリマーおよびパクリタキセル配合物（５％および１０％）のインビボでの分解を示す。それぞれの時点（１日目、７日目、２１日目および７０日目）で、マウス（ｎ＝４）を屠殺し、ポリマーインプラントを、Ｍｗ、重量およびパクリタキセル含有量について調べた。
図８は、Ｃ３ＨマウスにおけるＭＢＴ異所性モデルに対するパクリタキセル配合物のインビボ抗腫瘍効果を示す。治療を腫瘍細胞接種後８日目に開始した。時間ゼロは治療の開始を表す。それぞれの点は平均±ＳＴＤ（ｎ＝１０）を表す。
図９は、Ｃ５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの生存の進展を示す。
図１０は、５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの腫瘍量の進展を示す。
図１１は、実験期間中のすべての治療群におけるラットの平均体重の進展を示す。標準偏差が誤差棒によって示される。
図１２は、種々の治療群についての死亡時の腫瘍体積の進展を示す。
図１３は、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）（ｗ／ｗ）およびｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）（ｗ／ｗ）からの、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、インスリン、インターフェロン−α（「ＩＮＦ−ａｌｐｈａ」）およびインターロイキンのパーセントインビトロ放出を時間（ｈｏｕｒｓ）の関数として示す。ペプチドの放出を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において３７℃で行った。放出媒体における薬物含有量をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって求めた。
図１４は、異なる分子量のｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）からのゲンタマイシンのパーセントインビトロ放出を時間（日数）の関数として示す。
図１５は、３つの異なる希釈物について時間（日数）に対する細菌濃度（光学濃度）を示すグラフである。
図１６は、４℃および−１７℃で８週間にわたって貯蔵された後でのゲンタマイシンの放出を時間（日数）の関数として示す。図１６ａは、４℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出を示す。図１６ｂは、−１７℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
Ｉ．組成物
Ａ．ポリマー
リシノール酸オリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシ基またはカルボン酸基を有する脂肪族分子とから合成された生分解性キャリアであって、３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、かつ、水性媒体に浸けられたとき、その粘度を著しく増大させる生分解性キャリアが本明細書中に記載される。そのようなポリマーは分子量が少なくとも３０００ダルトンであり、好ましくは少なくとも７０００ダルトンであり、より好ましくは少なくとも１００００ダルトンである。そのようなポリマーは様々な重合度を有することができる。１つの実施形態において、そのようなポリマーは重合度が少なくとも４０である。
【００２２】
リシノール酸（ｃｉｓ−１２−ヒドロキシオクタデカ−９−エン酸）は、シス形態の二重結合を９位に、ヒドロキシル基を１２位に有するＣ１８脂肪酸である。粗リシノール酸を商業的に購入することができ、または、ひまし油の加水分解によって調製することができる。ひまし油は、平均して約３個のヒドロキシル基を１分子あたり含有する天然トリグリセリドである。ひまし油は、典型的には圧搾することによってトウゴマの実から抽出され、およそ９０％がリシノレアート（１２−ヒドロキシオレアート）である。
【００２３】
リシノール酸は、１分子または数分子のポリ無水物として反応して、リシノール酸オリゴエステルのプレポリマーを形成することができ、このプレポリマーはさらに重合して、最終的なポリマーを形成する。好適なポリ無水物を脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸の重合によって調製することができる。好適なジカルボン酸には、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸が含まれるが、これらに限定されない。好適な不飽和ジカルボン酸には、フマル酸、イタコン酸およびマレイン酸が含まれる。１０個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、１５個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、２０個を超える炭素原子を有する長鎖二酸、および、２５個を超える炭素原子を有する長鎖二酸（例えば、ダイマーオレイン酸およびダイマーエルカ酸など）、ならびに、ポリカルボン酸（例えば、トリマーエルカ酸またはトリマーオレイン酸など）、ポリアクリル酸誘導体およびクエン酸もまた使用することができる。ジカルボン酸はまた、反応性の官能基（例えば、アミノ基および／またはヒドロキシル基など）を含有することができる。
【００２４】
リシノール酸はまた、ヒドロキシアルカン酸と共重合して、リシノラートモノマーユニットを含有するポリエステルをもたらすことができる。好適なヒドロキシアルカン酸には、乳酸；グリコール酸；ヒドロキシカプロン酸；３−ヒドロキシアルカン酸、４−ヒドロキシアルカン酸および５−ヒドロキシアルカン酸、ならびに、それらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書中に記載されるポリマーは生分解性であり、生体適合性である。１つの実施形態において、本明細書中に記載されるポリマーは約１２週間で完全に分解する。
【００２６】
Ｂ．活性薬剤
本明細書中に記載されるポリマー組成物は、治療剤、診断剤および／または予防薬剤を送達するために使用することができる。
【００２７】
本明細書中に記載される組成物を形成するために有用である例示的な薬物剤には、興奮剤；鎮痛剤；麻酔剤；抗喘息剤；抗関節炎剤；抗ガン剤；抗コリン作動性薬剤；抗痙攣剤；抗うつ剤；抗糖尿病剤；下痢止め剤；制吐剤；駆虫剤；抗ヒスタミン剤；抗高脂血症剤；抗高血圧剤；抗感染剤；抗炎症剤；抗片頭痛剤；抗新生物剤；抗パーキンソン病薬物；止痒剤；抗精神病剤；解熱剤；鎮痙剤；抗結核剤；抗潰瘍剤；抗ウイルス剤；抗不安剤；食欲抑制剤（食欲減退剤）；注意欠陥障害薬物および注意欠陥多動性障害薬物；心臓血管剤（カルシウムチャネル遮断剤、抗狭心症剤、中枢神経系（「ＣＮＳ」）剤、ベータ−遮断剤および抗不整脈剤を含む）；中枢神経系刺激剤；利尿剤；遺伝的物質；ホルモン遮断薬（ｈｏｒｍｏｎｏｌｙｔｉｃ）；催眠剤；血糖低下剤；免疫抑制剤；筋弛緩剤；麻薬拮抗剤；ニコチン；栄養剤；副交感神経遮断剤；ペプチド薬物；精神興奮剤；鎮静剤；唾液分泌促進薬、ステロイド；禁煙剤；交感神経様作用薬；トランキライザー；血管拡張剤；ベータ−アゴニスト；子宮収縮抑制剤；および、それらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、活性薬剤は抗ガン剤であり、例えば、パクリタキセルまたはメトトレキサートなどである。別の実施形態において、活性薬剤は抗生物質であり、例えば、ゲンタマイシンなどである。さらに別の実施形態において、活性薬剤はペプチドまたはタンパク質である。
【００２８】
これらの薬剤の効果的な量は当業者によって決定することができる。治療効果的な量を決定する際に考慮する要因には、治療される人の年齢、体重および身体状態；使用薬剤のタイプ、使用ポリマーのタイプ；ならびに、所望される放出速度が含まれる。典型的には、活性薬剤の濃度は組成物の約１重量％〜約９０重量％であり、好ましくは組成物の約５重量％〜約６０重量％であり、より好ましくは組成物の約５重量％〜約２０重量％である。
【００２９】
Ｃ．キャリア、添加剤および賦形剤
様々な配合物が、安全および効果的であると見なされ、かつ、望ましくない生物学的副作用または望まれない相互作用を引き起こすことなく個体に投与することができる物質から構成される医薬的に許容され得る「キャリア」を使用して調製される。「キャリア」は、その有効成分を除く、医薬配合物に存在するすべての成分である。用語「キャリア」には、界面活性剤、希釈剤、緩衝剤、塩および保存剤または安定剤が含まれるが、これらに限定されない。安定剤が、例として酸化的反応を含む薬物の分解反応を阻害するために、または遅らせるために使用される。
【００３０】
ＩＩ．作成方法
本明細書中に記載されるポリマーは、当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。ポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを溶融縮合によって調製することができる。１つの実施形態において、脂肪族または芳香族のジカルボン酸が、ポリ無水物のプレポリマーを形成するために無水酢酸と反応させられる。このプレポリマーは、ポリ無水物を形成するために高真空下で加熱される。低分子量のポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを、ポリ無水物をリシノール酸によりエステル化することによって調製することができる。
【００３１】
あるいは、より高分子量のポリ（リシノール酸−無水物）コポリマーを、ポリ無水物を不活性雰囲気下で周囲圧力においてリシノール酸のオリゴマーによりエステル化することによって調製することができる。この反応は、ポリマーの分子量が１０００ダルトンになったときに停止させられる。無水酢酸がポリマーに加えられ、溶液が３０分間加熱される。過剰な無水酢酸が除かれ、これにより、オイル状のプレポリマーが得られる。このプレポリマーは、最終的なポリマーを形成するために、高真空下で熱により重合させられる。最終的なポリマーの分子量は、反応時間、ならびに、リシノール酸の純度に依存する。例えば、純粋なリシノール酸モノマーを用いて調製されたポリマーは８０００の最大分子量を有した。対照的に、粗リシノール酸（８５％のリシノール酸含有量）を用いて調製されたポリマーは３５００ダルトンの最大分子量を有した。
【００３２】
リシノール酸モノマーユニットを含有するポリエステルを、ヒドロキシアルカン酸（例えば、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシカプロン酸、および、これらの混合物）を触媒としてのＨ３ＰＯ４の存在下でひまし油と反応することによって調製することができる。
【００３３】
これらのポリマーには、１つ以上の治療剤、診断剤および／または予防薬剤を、ポリマーおよび薬剤を、熱および／または溶媒を必要とすることなく直接に混合することによって負荷することができる。ポリマーおよび薬物は、滑らかなペーストが形成されるまで混合される。１つ以上の添加剤を、配合物の粘度を低下させるために、および／または、配合物の注入性を改善するために、薬物負荷ポリマーに加えることができる。好適な添加剤の例には、リシノール酸、リン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００が含まれるが、これらに限定されない。添加剤が使用されるならば、典型的には、薬物が最初に添加剤と混合され、その後、薬物−添加剤の混合物がポリマーに配合される。再度ではあるが、添加剤は、熱および／または溶媒を必要とすることなく、直接に薬物およびポリマーと混合することができる。
【００３４】
ＩＩＩ．使用方法
本明細書中に記載されるポリマー組成物は、局所的疾患、例えば、ガン、細菌および真菌の局所的感染、ならびに、痛みなどを治療するための分解性キャリアとして使用することができる。高い薬物濃度を疾患部位において長期間にわたってもたらす部位特異的な化学療法が、感染領域を切除した後での残存する感染細胞（例えば、固形腫瘍など）を治療する効果的な方法である。典型的には、配合物は、（腫瘍切除前、腫瘍切除時または腫瘍切除後に）注入および／または埋め込みによって筋肉内、皮下、腹腔内および／または腫瘍内に投与される。ポリマーは、添加剤を必要とすることなく注入または埋め込むことができるように室温において液体またはペーストである。しかしながら、様々な添加剤を、必要に応じて、組成物の粘度を低下させるために、および／または、組成物の注入性を改善するために加えることができる。
【００３５】
特に注目されるのが、これらのポリマーを、腫瘍内への注入または挿入のために、頭部＆頸部の扁平上皮ガン（ＳＣＣ）、前立腺ガンおよび肉腫をはじめとする固形腫瘍の治療のための部位特異的な化学療法のために適用することである。頭頸部のガンが、合衆国では毎年、約４００００人の新規患者を占め、合衆国におけるすべての新規癌患者の約５％である。他の固形腫瘍とは異なり、頭頸部ガンが再発する最も一般的な発現は限局的である（すなわち、頸部における再発）。本発明のポリマーに基づく期待されるデバイスは、抗ガン剤が負荷された生分解性ポリマーマトリックスから作製されるペースト状または液状のポリマーインプラントである。抗ガン剤（例えば、メトトレキサートまたはパクリタキセルなど）がポリマーマトリックス内に均一に分散される。活性な薬物が、体液と接触して置かれたとき、周りの組織に制御された様式で放出され、この間に、ポリマーキャリアが遅い分解によって排除される。
【００３６】
そのようなインプラントは注入可能な液体またはペーストの形態であり、腫瘍除去の外科的治療を行っているときに腫瘍内に注入されるか、または、腫瘍部位内に挿入される。インプラントにより、高用量の抗ガン薬物が、全身的な薬物分布を最小限に抑えながら、長期間（典型的には、数日間、数週間または数ヶ月間）にわたって腫瘍部位においてもたらされ、従って、これにより、残存する腫瘍細胞の局在化された治療が、手術に対する補完的な薬物治療として提供される。
【００３７】
薬物を特定の病的身体部位に長期間にわたって送達するという同じ概念は、他の固形腫瘍、局所的感染（例えば、骨髄炎を生じさせる感染など）、ガン患者またはＡＩＤＳ患者のための局所的な麻酔剤送達、および、組織成長を抑制する薬物（例えば、再狭窄およびケロイドを治療するためのヘパリンおよびステロイドなど）に対してもまた適用される。
【００３８】
ポリマーはまた、埋め込み可能な医療デバイス（例えば、ステントなど）における被覆物として、手術シーラントとして、または、臓器間の接着を低下させるためのバリアとして使用することができる。
【実施例】
【００３９】
材料および器具
リシノール酸（ＲＡ）（８５％純粋）をＦｌｕｋａ（Ｂｕｃｈ、スイス）から得て、クロマトグラフィーによって測定されたとき、９７％に精製した。セバシン酸（ＳＡ）（９９％）、アジピン酸、フマル酸、無水マレイン酸および無水コハク酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（イスラエル）から得た。すべての溶媒が、ＢｉｏＬａｂ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。
【００４０】
ポリ（エステル−無水物）の分子量を、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率（ＲＩ）検出器、２０μＬのループ（Ｗａｔｅｒｓ Ｍａ）を有するＲｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏａｔａｔｉ、ＣＡ）注入バルブを伴うＷａｔｅｒｓ１５１５アイソクラチックＨＰＬＣポンプからなるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで推定した。サンプルを１ｍＬ／分の流速で直線カラムに通してクロロホルムにより溶出した。分子量をポリスチレン標準物（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に対して求めた。
【００４１】
赤外（ＩＲ）分光法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、２０００ＦＴＩＲ）を、プレポリマー、ポリマーサンプル、および、ジクロロメタン溶液からＮａＣｌプレートに注型された加水分解サンプルに対して行った。
【００４２】
熱分析を、亜鉛標準物（「Ｚｎ」）およびインジウム標準物（「Ｉｎ」）により校正されたＭｅｔｔｌｅｒ ＴＡ４０００−ＤＳＣ示差走査熱量計で１０℃／分の加熱速度で求め（１０ｍｇの平均サンプル重量）、また、Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＭＰ１融点用加熱装置で求めた。
【００４３】
低温走査電子顕微鏡観察（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）を、Ｑｕａｎｔａ２０００ＳＥＭ（３０ｋＶ）を使用して行った。
【００４４】
光学顕微鏡観察を、デジタルカメラＣｏｏｐｌｉｘ９９０（Ｎｉｋｏｎ、日本）を備えた立体顕微鏡Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）でのサンプルの顕微鏡観察によって行った。
【００４５】
ポリマーの粘度を、回転法（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄプログラム可能レオメーター、ＬＶ−ＤＶ−ＩＩＩ）を使用して求めた。円筒状スピンドルＬＶ４を使用した。
【００４６】
実施例１：ポリ（リシノール酸−セバシン酸）コポリマーの調製
純粋なリシノール酸の調製
ひまし油を、常時攪拌で室温で数時間、エタノール中の２Ｎ ＫＯＨの２体積に溶解した。エタノールにおける生じたリシノール酸カリウムの沈殿物を、沈殿物をより良好に分離するためにイソプロピルエーテルと混合し、混合物を分離させた。沈殿物のスラリーを、固体を分離するために遠心分離し、溶媒をデカンテーションした。リシノール酸のカリウム塩を、氷冷した１Ｎ ＨＣｌ溶液に分散し、酢酸エチルにより抽出した。溶媒をエバポレーションした後、わずかに黄色のオイルが得られ、これは、ガスクロマトグラフィーによって測定されたとき、１００％の脂肪酸を含有し、その少なくとも９５％がリシノール酸であった。
【００４７】
ポリマー合成
ＰＳＡ（ポリ（セバシン酸））を溶融縮合によって調製した。セバシン酸を無水酢酸中で２０分間煮沸した。無水酢酸を、乾固するまでエバポレーションして、セバシン酸の灰白色のプレポリマーを得た。ＰＳＡを調製するために、このセバシン酸プレポリマーを、高真空（１．３ｘ１０−１ｍｂａｒ）下で３時間、１４０℃に加熱して、３００００Ｄａを超えるＭｗを有するポリ（セバシン酸）を得た。低分子量（ＡＳ３−１０２、ＡＳ３−１０１、ＡＳ３−９２）のポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））コポリマーを、ＰＳＡをリシノール酸（ＲＡ、２９８ＤａのＭｗ）によりエステル化することによって調製した。より高分子量の（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））コポリマーを、ＰＳＡをＲＡのオリゴマー（約２１００Ｄａ〜３５００ＤａのＭｗ）によりエステル化することによって調製した（ＡＳ３−１１４、ＡＳ３−１０４）。エステル交換反応が、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ＡＳ３−１０１、ＡＳ３−１０２、ＡＳ３−１１４）については３：７（ｗ／ｗ）の比率で行われ、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）（ＡＳ３−９２、ＡＳ３−１０４）については２：８の比率で行われる。反応を、一括して乾燥フラスコで、窒素雰囲気下において１２０℃で３時間〜４時間行った。反応を、１０００ダルトンの分子量が達成されたときに停止させた。その後、無水酢酸を加えた（１／１、ｗ／ｗ）。溶液を１４０℃で３０分間還流し、過剰な無水酢酸および酢酸を、乾固するまでエバポレーションして、粘性の黄色オイルを得た。この油状プレポリマーを、所望される分子量に依存して、４時間〜８時間、０．１９ｍｍＨｇ〜０．３２ｍｍＨｇの真空下において１４０℃で重合した。リシノール酸オリゴマーから調製されたポリマーについては、反応時間が長いほど、ポリマーの得られる分子量が大きくなった。リシノール酸モノマーを用いて調製されたポリマーについては、到達された最大ＭＷがＭｗ＝８０００であった。粗リシノール酸（８５％のリシノール酸含有量）から調製されたポリマーについては、３５００までの分子量が得られた。
【００４８】
結果および考察
下記の表には、ポリマーの分子量が示される。ポリマーは、上記で記載されたように調製された。
【００４９】
実施例２：リシノール酸および様々な脂肪二酸に基づく液状ポリ（エステル−無水物）
合成
ポリ（フマル酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（３：７（ｗ／ｗ）の比率）
２０グラムのフマル酸（ＦＡ）を無水酢酸中で２時間還流した。無水酢酸をエバポレーションし、残渣を１７０℃で４時間重合して、２００００の分子量を有するポリ（フマル酸）（ＰＦＡ）を得た。５０グラムのリシノール酸（ＲＡ）オリゴマー（Ｍｗ＝７００）を加え、１２０℃での４時間のエステル交換反応の後では、ポリマーの分子量が１２００ダルトンに低下した。オリゴマーを無水酢酸によって活性化し、再び重合した。得られたポリマーは、Ｍｗが１５０００であり、Ｍｎが８０００であった。ＤＳＣでのＭＰピークが３４℃に存在した。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。
【００５０】
ポリ（アジピン酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（２：８（ｗ／ｗ）の比率）
２０グラムのアジピン酸（ＡＡ）を無水酢酸中で３０分間還流した。無水酢酸をエバポレーションし、アジピン酸プレポリマーを１７０℃で４時間重合して、２７０００ダルトンの分子量を有するポリマーを作製した。５０グラムのＲＡを加え、１２０℃での４時間のエステル交換反応の後では、ポリマーの分子量が９００に低下した。オリゴマーを無水酢酸によって活性化し、再び重合した。得られたポリマーは、Ｍｎが４０００であり、Ｍｗが６０００であった。ポリマーの融点は１０℃であった。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、１．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２アジピン酸）。同様に、ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗ＝１５０００の液状ポリマーを得た。
【００５１】
ポリ（コハク酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の比率）
３６グラム（０．１２ｍｏｌ）のＲＡおよび無水コハク酸（２４グラム、０．２４ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、２回蒸留水（ＤＤＷ）により４回洗浄して、未反応の無水コハク酸を溶解した。収率は６７％であった。ＮＭＲにより、エステル形成が確認された：４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合した。４時間後、Ｍｎ＝４２００およびＭｗ＝６２００。ポリマーの融点は−２℃であった。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、２．６ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２スクシナート）。ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗ＝２００００の液状ポリマーを得た。
【００５２】
ポリ（マレイン酸−ｃｏ−リシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の比率）
３６グラム（０．１２ｍｏｌ）のＲＡおよび無水マレイン酸（２４グラム、０．２４ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、ＤＤＷにより４回洗浄して、未反応の無水マレイン酸を溶解した。収率は７２％であった。ＮＭＲにより、エステル形成が確認された：４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合した。４時間後、Ｍｎ＝４７００およびＭｗ＝７０００。ポリマーの融点は−８℃であった。２４時間後、Ｍｎ＝１１０００およびＭｗ＝１４０００（一定）。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、６．８ｐｐｍおよび６．２ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２＝ＣＨ２−ＣＯマレアート）。同様に、ポリマーを、Ｍｗ＝２２００のリシノール酸オリゴマーから調製して、Ｍｗが１５０００を超える液状ポリマーを得た。
【００５３】
ポリ（コハク酸−ｃｏ−オリゴリシノール酸−エステル−無水物）（１：１（ｍ／ｍ）の率）
ＲＡのオリゴマーを、塊状のＲＡを１２０℃で７時間エステル化することによって調製した。得られた分子量は、３００、９００、１２００および２１００であった（１個、３個、４個および７個の反復ユニット）。平均分子量はＭｎが約９５０であった。
【００５４】
４０グラム（０．０４ｍｏｌ）のＲＡオリゴマーおよび無水コハク酸（８．４グラム、０．０８ｍｏｌ）をトルエン中で一晩還流した。溶媒をエバポレーションし、生成物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、ＤＤＷにより４回洗浄して、未反応の無水コハク酸を溶解した。生成物を無水酢酸（１：１０、ｗ／ｖ）中で３０分間還流し、乾固するまでエバポレーションした。プレポリマーを無水物との縮合によって重合して、高分子量のポリマーを得た。ＩＲ：１７３２ｃｍ−１および１８１９ｃｍ−１。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯ）、２．６（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯスクシナート）。同様に、ポリマーを、無水コハク酸を無水マレイン酸により置き換えることによって無水マレイン酸から調製した。ＮＭＲ：５．３ｐｐｍおよび５．４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ）、４．８ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯリシノール酸エステル）、４．９ｐｐｍ（ＣＨ−Ｏ−ＣＯリシノロリルマレアートエステル）、６．８ｐｐｍおよび６．２ｐｐｍ（ＣＯ−ＣＨ２＝ＣＨ２−ＣＨ２マレアート）。
【００５５】
実施例３：リシノール酸から調製されたポリ（エステル無水物）ポリマーのゲル化挙動およびインビボ評価
ポリマーのゲル化挙動を、熱分析、光学顕微鏡観察、低温走査電子顕微鏡観察および粘度測定を使用して評価した。
【００５６】
光学顕微鏡観察
緩衝液にさらされる前のポリマーと、緩衝液にさらされた後でのポリマーとの間での違いを、デジタルカメラ（Ｃｏｏｐｌｉｘ９９０、Ｎｉｋｏｎ、日本）を画像記録のために備えた立体顕微鏡Ｓｔｅｍｉ ＳＶ１１（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）でのサンプルの顕微鏡観察によって調べた。画像記録を、種々の顕微鏡ズーム倍率を、最も良い画像分解能に調節されたデジタルカメラのズームと一緒に適用する通常の画質モードで行った。照明を、ＫＬ１５００Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ照明システム（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）によって供給される反射光によって行った。
【００５７】
ポリマーを水性媒体と接触させたとき、ポリマーサンプルにおける変化が認められた。緩衝液にさらされる前のポリマー（乾燥ポリマー）は透明であり、一方、ゲル化プロセスが生じた後（緩衝液中で８時間）では、ポリマーは不透明となった。ポリマーを切断したとき、２つの異なった領域が見出された：ゲルであった外側領域（１）、および、軟らかいマトリックスとして現れたコア（２）。
【００５８】
低温走査電子顕微鏡観察（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）
湿潤ポリマーサンプルおよび乾燥ポリマーサンプルをスタブに固定し、高真空下で液体窒素により凍結し、その後、Ｐｏｌａｒｏｎｅ Ｅ５１００を使用して金被覆した。ポリマーサンプルをＣｒｙｏ−ＳＥＭ用に調製するために、ポリマーを緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）の中に注入した。２４時間後、サンプルを引き出し、乾燥することなくスタブの上に置いた。サンプルを高真空下で液体窒素により凍結した。凍結サンプルを、Ｐｏｌａｒｏｎｅ Ｅ５１００を使用して金被覆した。
【００５９】
吸収された水を（乾燥または凍結乾燥することによって）そのさらされたポリマーから除くことにより、ポリマーは、ポリマーが水にさらされる前と同じ特徴を有するオイルに変わった。低温顕微鏡観察は、吸収された水をサンプルが依然として含有しながら、サンプルを凍結することを可能にし、従って、ポリマーが水性媒体によって影響を受けたときのポリマーを可視化することが可能であった。緩衝液にさらされる前のポリマー（乾燥ポリマー）は均一な表面を有し、一方、水にさらされたポリマーサンプルは、規定された構造を、水性媒体に近い外側層において示した。ポリマー鎖は、水にさらされたとき、ある種の堅い網状組織を、水に注入されたポリマーサンプルの滴全体で形成した。この網状組織により、ポリマーの滴はその形状を水性媒体中で保った。ポリマー液滴の断面から、ポリマーの内側が、水相にさらされる前のポリマーと類似して、無傷のままであったことが示された。これらの知見により、ポリマーのゲル化が、水性媒体と接触している表面でのみ生じたことが示される。
【００６０】
水の吸収
ポリマーサンプル（Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８））をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、３７℃）に入れ、ＫＦ滴定を、緩衝液への０時間、４時間、１２時間、２６時間および４０時間の暴露の後で行った。別個のポリマーサンプルをそれぞれの時点のために調製した。それぞれの時点で、ポリマーを緩衝液から取り出し、吸取り紙でブロットし、重量測定し、１ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ポリマー溶液を滴定ポットに入れた。直接の滴定を、通常のＫＦ試薬を使用してメタノール中で行った。試料の内側コアからのサンプルを同様に調製した。
【００６１】
示差走査熱測定
緩衝液にさらした種々の期間でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の吸熱を測定した。ポリマーを緩衝液にさらす前には、ピークを３５℃に有する１つの転移が存在する。緩衝液中で３時間後、ピークは３８．３℃であり、緩衝液中で１２時間では、転移が４５℃になった。２４時間では、さらなる転移が６１℃で現れた。これは、分解プロセス、すなわち、セバシン酸の形成が始まっていることを示しているかもしれない。同様の結果がＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）について見出された。ポリマーを緩衝液にさらす前には、ピークを約３２℃に有する１つの転移が存在する。緩衝液中で１２時間後および２４時間後、転移温度がそれぞれ、４２℃および５０℃になった。
【００６２】
緩衝液中に保たれたポリマーに対して行われた別の観察はポリマーの膨潤能である。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）は緩衝液中での最初の２４時間の期間中にその体積を１５％増大させたことが見出された。
【００６３】
粘度の測定
円筒状のスピンドルを使用した。ポリマーの粘度を、ポリマーが水性媒体にさらされる前、および、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃でリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）において１２時間インキュベーションされた後で測定した。粘度測定を行うための大きい十分なサンプルを得るために、ポリマーを大きい表面に広げ、緩衝液の中に入れた。水性媒体にさらした後、ポリマーサンプルを回収し、ガラス容器に入れた。感熱性試験を、一定の回転速度を加えることによって、４０℃の温度で開始し、室温（２２℃）まで行った。レオロジー学的挙動の検出を、より粘性のポリマーについては０．２０９ｓｅｃ−１から始め、また、それほど粘性でないポリマーについては３６ｓｅｃ−１までの種々の剪断速度で剪断応力および／または粘度を測定することによって行った。すべての実験を三連で行った。
【００６４】
図１には、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度が３つの異なる剪断速度（８．４ｓｅｃ−１、１２．５ｓｅｃ−１および２１ｓｅｃ−１）で示される。４３℃から開始し、測定することが可能であった最も低い温度（Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の場合には２５℃）まで粘度を測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）は、剪断速度／剪断応力の関係が一定でないために、低温側（３０℃未満）では非ニュートン流体の性質を示し、このポリマーは、剪断速度の増大とともに低下する粘度を示す擬塑性ずり減粘物質として分類することができる。この挙動は、ポリマーの注入性のためには重要である：圧力が加えられるにつれ、ポリマーのペーストはより軟らかくなり、ニードルから押し出される。高温側（３０℃を超える温度）では、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）はニュートン流体として作用し、その粘度は、加えられた剪断速度によって影響されない。最も注目される温度は、室温（およそ２２℃〜２５℃、好ましくは２５℃）（これは、ポリマーが注入される温度であるからである）、および、体温（３７℃）（これは、ポリマーが、身体に注入された後でさらされる温度であるからである）である。８．４ｓｅｃ−１および１２．５ｓｅｃ−１の剪断速度が室温で加えられたとき、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度は８６００ｃＰ〜９０００ｃＰであり、一方、水にさらされた後では、粘度は高すぎて、そのような剪断速度で室温では測定することができなかった。水性媒体に３７℃でさらされた後でのポリマー粘度における増大は剪断速度に依存していた：８．４ｓｅｃ−１の剪断速度については、粘度が、４２００ｃＰから、緩衝液にさらされた後での８９４０ｃＰに増大し、１２．５ｓｅｃ−１の剪断速度では、粘度が４３６０ｃＰから６７７０ｃＰに増大し、２１ｓｅｃ−１では、粘度が４１１５ｃＰから５７６５ｃＰに増大した。水性媒体にさらされた後、ポリマーは擬塑性の挙動を示す。このことは、ポリマー鎖の再配置が、緩衝液にさらされたことによって誘導されるが、スピンドルを回転させる瞬間に破壊されることによって説明されるかもしれない。スピンドルの回転が速くなるほど（剪断速度が大きくなるほど）、破壊される構造が多くなるほど、また、一緒に滑る構造分子が少なくなるほど、粘度が低くなる。
【００６５】
図２には、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度が３つの異なる剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で示される。粘度を、４３℃から開始し、室温まで測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）は、ポリマーの液状性に寄与するリシノール酸のより大きい含有量のために、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）未満の粘度を有する。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）はニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。ポリマーの粘度がより低いために、粘度がより大きい剪断速度で測定された。室温では、加えられたすべての剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）において、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度は約２９００ｃＰであり、一方、さらされた後では、粘度が、１２．５ｓｅｃ−１では８５７０ｃＰであり、２１ｓｅｃ−１では５０００ｃＰであり、３１ｓｅｃ−１では大きすぎて測定することができなかった。水性媒体にさらされた後でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度は、３７℃で測定されたとき、ニュートン流体の挙動を示すが、２２００ｃＰの差でポリマー粘度の増大が依然として認められた（緩衝液にさらされる前での１１５０ｃＰ、および、後での３２００ｃＰ）。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の場合、このポリマーは、粘度が、３７℃ではなく、室温で測定されたときにだけ、擬塑性の挙動を示した。
【００６６】
Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度を２つの異なる剪断速度（２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で測定した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は、リシノール酸のそのより大きい含有量（８０％）のために、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）の粘度未満の粘度を示した。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）はニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。ポリマーの粘度がより低いために、粘度がより大きい剪断速度で測定された。室温では、加えられた両方の剪断速度（２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）において、水性媒体にさらされる前のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度は約９００ｃＰであり、一方、さらされた後では、粘度が、２１ｓｅｃ−１では１８００ｃＰであり、３１ｓｅｃ−１では１９００ｃＰであった。水性媒体にさらされた後でのＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の粘度は、３７℃で測定されたとき、ニュートン流体の挙動を示した。
【００６７】
図３には、ポリ（リシノール酸）（ＰＲＡ）ポリマーの粘度が３つの異なる剪断速度（１２．５ｓｅｃ−１、２１ｓｅｃ−１および３１ｓｅｃ−１）で示される。ＰＲＡは、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）に類似する粘度を有しているが、このポリマーは４℃でさえ液状であり、水性媒体と接触した後では変化せず、よりオイルのように作用する。ＰＲＡはニュートン流体として作用し、その粘度は、この温度範囲では加えられた剪断速度によって影響されない。
【００６８】
剪断応力（Ｆ）と、剪断速度（ｄｖ／ｄｒ）との間での関係が数学的には下記のニュートン方程式で表される：
Ｆ＝ηｄｖ／ｄｒ
式中、比例定数ηは粘性率である。
【００６９】
図４には、水性媒体にさらされた前後での下記のポリマーの、剪断速度と、剪断応力との間における関係が示される：Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）およびＰＲＡ。水性媒体においてゲル化したＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２５：７５）と一致する曲線（図６ａ）の傾斜は、水相にさらされる前よりも２３倍大きい。ＰＲＡに関しては、水性媒体にさらされたとき、ポリマー粘度における変化が認められなかった。
【００７０】
配合物のインビトロ評価
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。異なる体積のＰ（ＳＡ：ＲＡ）ポリマー（０．０５ｍｌ、０．１ｍｌおよび０．１５ｍｌ）を２２Ｇのニードルにより背中に皮下注入した。注入後の８時間および２４時間で、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。動物の皮膚を持ち上げ、ポリマーインプラントを露出させ、写真撮影した。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）は動物研究についての申請を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決している（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【００７１】
Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の３つの異なる体積（０．０５ｍｌ、０．１ｍｌおよび０．１５ｍｌ）が注入されたマウスを、前（１２ａ）および後（図５ｂおよび図５ｃ）において、８時間および２４時間でそれぞれ屠殺した。両方の時点で、オイルがそのような皮下空間に注入されるときに生じるように、注入されたインプラントはその形状を維持していたし、また、注入部位に残留している。これらのインビボ実験では、ポリマーが組織と接触してゲルになったことが判明した。
【００７２】
加えて、ラットにおけるｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）インプラントの全身的および局所的な影響が６週間の期間にわたって観察された。ｐ（ＳＡ：ＲＡ）を溶融縮合によって合成し、重量平均分子量が１１６００であった。メスのＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＨａｒｌａｎ Ｌａｂ．（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）から得た。埋め込み時のラットの体重は２１０±１５．０ｇであった。ラットを動物施設のＳＰＦユニットに収容し、餌および水を自由に摂らせた。ラットを２つの群（ｎ＝４）の一方に無作為に割り当てた：生理的食塩水を同じ注入−埋め込み部位に受け、ポリマーの埋め込みを受けた群と同じ方法で麻酔されたラットからなるコントロール群（Ａ群）、および、ポリマーマトリックスが埋め込まれたラットからなるＢ群。
【００７３】
それぞれのラットをそのそれぞれのケージから取り出し、腹腔内経路により投与された等張５％クロラール水和物溶液（０．６４ｍｌ／１００ｇ）を使用して麻酔した。それぞれのラットは、動物用バリカンを使用して両方の背側および大腿部領域で毛が剃られていた。その後、動物を、７０％アルコールを使用して無菌的に調製した。ポリマーインプラントを、それぞれの動物の両側で皮下に、また、両側の大腿筋の筋肉内に２２Ｇのニードルにより注入した。ラットをそのケージに戻す前に、ラットを手術室で目覚めさせた。
【００７４】
埋め込み前５日および埋め込み当日に、血液サンプルを、ベースラインパラメーターをそれぞれのラットについて求めるために尾静脈から抜き取った。埋め込み後の３日、７日、２１日および４２日で、ラットを麻酔し、血液サンプルを心臓穿刺によって抜き取った。その後、サンプルをそれぞれのラットについて臨床化学および血液学的パラメーターのために分析した（ＡＭＬ、Ｈｅｒｚｌｉｙａ Ｐｉｔｕａｈ、イスラエル）。ポリマーインプラントが与えられたラットを２つの群に分けた。
【００７５】
第１の群は、ブランクポリマーの４回の注入を受けたＳＤラットからなった。２回の注入（それぞれが２００μｌ）が、それぞれが向かい合った背側で皮下であった。２回の他の注入（それぞれが５０μｌ）がそれぞれの脚の大腿筋の筋肉内に行われた。１つの埋め込みが生分解評価のために使用され、別の埋め込みが組織病理学評価のために使用された。ラットの器官を、全身毒性を評価するために無作為に選択した。
【００７６】
第２の群は、１０μｌのポリマーブランクを頭蓋内に受けたＷｉｓｔａｒラットからなった。ポリマーを、その中心がコロナ構造から５．５ｍｍ後方で、矢状縫合構造から３．５ｍｍ側方である、左頭頂領域の上に作製された頭蓋における穴から注入した。注入を２５μｌのシリンジにより行い、ニードル挿入の深さは冠状表面から４ｍｍであった。
【００７７】
埋め込み後の３日、７日、２１日および４２日で、ラットを、上記で記載されたように麻酔し、体重測定し、それぞれのラットの体重を記録した。その後、ラットを心臓穿刺によって屠殺し、検死解剖した。様々な器官および埋め込み部位の全体的な観察を検死解剖時に行った。その後、これらの器官を取り出し、重量測定し、緩衝化ホルムアルデヒド（４％）（Ｂｉｏｌａｂ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、、イスラエル）において固定処理した。集められた組織には、心臓、脳、肝臓、脾臓、肺、胸腺および腎臓が含まれた。加えて、局所的なインプラント部位を取り出し、緩衝化ホルムアルデヒド（４％）において固定処理した。すべての組織を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色し、顕微鏡により調べた。
【００７８】
検死解剖のとき、ポリマーインプラントを取り出し、クロロホルムに溶解し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、有機溶媒をエバポレーションした。単離された残渣を重量測定し、無水物およびエステルの含有量についてＩＲによって、分子量測定のためにＧＰＣによって、また、ＲＡ対ＳＡの比率についてＮＭＲによって調べた。分解されたポリマーマトリックスのアリコートを１ＮのＫＯＨ水溶液で加水分解し、濃ＨＣｌで酸性化し、放出されたオイル残渣を酢酸エチルにより抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、溶媒をエバポレーションして乾固した。ポリマー加水分解の生成物を、ＨＰＬＣを使用してリシノール酸およびセバシン酸の含有量について調べた。
【００７９】
それぞれの組織の生体適合性を、下記のように優れた耐性から不耐性までの５段階によって採点した：
優れた耐性（炎症反応が全くないか、または、最小限である）
良好な耐性（最小限の有害な反応、最小限の炎症）
中程度の耐性（中程度の炎症）
良好でない耐性（有害な反応、炎症反応）
不耐性（重度の壊死および炎症反応）
【００８０】
すべての動物が健康であり、コントロール動物と類似した体重を得た。有害な影響または腫大がインプラント部位に何ら認められず、一方、注入されたポリマーは、その部位を触ったとき、固く感じられた。この研究の動物から分離されたすべての器官は正常であり、違いがコントロール群およびポリマー群の間で何ら見出されなかった。注入／インプラント部位組織の組織病理学では、急性炎症および若干の壊死が、注入部位、および、ポリマーから数ｍｍ以内の組織に限定された有害反応を伴って３日目の時点で示された。７日目には、すべてのインプラント部位が最小限〜中程度の炎症を示したが、３日目の部位と比較して著しい改善を伴っていた。２１日目および４２日目では、優れた許容性が検出された。これらの組織病理学結果は、臨床的に使用されている生分解性のポリエステルおよびポリ無水物の適合性について以前に報告された結果と類似している。
脳適合性に関しては、３日目の時点を含めて、すべての時点でのすべての動物が、優れた生体適合性を示した。類似した結果がパクリタキセル負荷ポリマーから得られた。
【００８１】
インプラント部位から回収されたポリマーの量を、サンプルを乾燥した後での重量測定によって求めた。ポリマー含有量における緩やかな減少が見出され、ほぼ全量が４２日目の時点までになくなった。
【００８２】
結論
本研究の結果から、本実験において記載されたポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）が、水媒体と相互作用したときにゲル化し、従って、ポリマーインプラントのｉｎ ｓｉｔｕ形成における使用、あるいは、組織の接着を防止するための生分解性のシーラントまたはバリアとしての使用を有することが立証される。これらのポリマーは、有機ゲルをｉｎ ｓｉｔｕで形成する溶媒を伴わない純物質である。有機ゲルは水不溶性の両親媒性脂質から構成され、そのようなゲルは水中で膨潤し、様々なタイプのリオトロピック液晶を形成する。形成される液晶相の性質は、脂質の構造的性質、温度、および、系における水の量に依存する。薬物送達について今日までに調べられた両親媒性脂質は主に、室温でワックスである脂肪酸のグリセロールエステル（例えば、グリセロールのモノオレアート、モノパルミトステアラートおよびモノリノレアートなど）である。これらの化合物は、水性媒体に注入されたとき、立方液晶相を形成する。この液晶構造はゲル様であり、非常に粘性であった。Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）コポリマーは、水性媒体にさらされたときに粘度および融点の変化を示す水不溶性のコポリマーである。レオロジー学的変化が、三次元網状組織の形成によって引き起こされ、ＳＥＭを使用して得られた画像により、緩衝液にさらされたときに現れた可逆的な特異な物理的構造が示された。この三次元構造は、カルボキシル基と、周囲の水分子との間での水素結合の形成によって説明されるかもしれない。類似する機構が、有機ゲルにおける水素結合によるレシチン架橋について、液体の官能基がどこで溶媒に対する親和性を示すか、また、液体の官能基が溶媒にどのように結合したかについて示唆された（Ｓｈｃｈｉｐｕｎｏｖ ＹＡ、Ｓｈｕｍｉｌｉｎａ ＥＶ、有機ゲルにおける水素結合によるレシチン架橋、Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｃ−Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒ．Ｓｅｎｓ．Ｓｙｓｔ．、１９９５：３（１）：４３〜５０）。
【００８３】
実施例４．マウス膀胱腫瘍（ＭＢＴ）におけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）およびパクリタキセルに基づく注入可能なポリマー配合物の、異所性腫瘍モデルに対する有効性を調べた。
【００８４】
方法および材料
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル無水物）（２：８）を、上記で議論されたように合成した。パクリタキセル（ＧＭＰ規格）（ＢｉｏｘｅｌＰｈａｒｍａ、ＱＣ、カナダ）、無水酢酸（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）およびＬｕｔｒｏｌ Ｆ８６（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を使用した。すべての溶媒が、ＢｉｏＬＡＢ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。ＭＢＴ（マウス膀胱腫瘍）細胞は、Ｈａｄａｓｓａｈ Ｅｉｎ−Ｋａｒｅｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）のＯｆｅｒ Ｇｏｆｒｉｔ博士からの譲渡物であった。細胞培養培地およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）をＢｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ（イスラエル）から得た。
【００８５】
ポリ（エステル−無水物）の分子量を、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率（ＲＩ）検出器、２０αＬのループ（Ｗａｔｅｒｓ Ｍａ）を有するＲｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏａｔａｔｉ、ＣＡ）注入バルブを伴うＷａｔｅｒｓ１５１５アイソクラチックＨＰＬＣポンプからなるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムで推定した。サンプルを１ｍＬ／分の流速で直線Ｕｌｔｒａｓｔｙｒｏｇｅｌカラム（Ｗａｔｅｒｓ；５００Åの細孔サイズ）に通してクロロホルムにより溶出した。分子量を、Ｂｒｅｅｚｅコンピュータープログラムを使用して、分子量範囲が５００〜１００００であるポリスチレン標準物（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に対して求めた。緩衝溶液におけるパクリタキセル濃度を、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔＲ２５０−４、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＲ１００、５μｍ）を使用して、ＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムから構成される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ［Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ］）システムによって求めた。１ｍｌ／分の流速での６５％アセトニトリル：３５％水の混合物を溶出液として使用し、ＵＶ検出を２３０ｎｍで行った。
【００８６】
ポリマーマトリックスにおけるパクリタキセル含有量を、周囲温度（２５＋１０℃）で、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ Ｓｉガードカラム（４ｘ４ｍｍ、５μｍの粒子サイズ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）とともに使用されたＰｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ Ｓｉ分析ＨＰＬＣカラム（２５０ｘ４ｍｍ、５μｍの粒子サイズ）から構成される順相ＨＰＬＣシステムによって求めた。移動相は種々の比率（１％〜２．５％、ｖ／ｖ）でのジクロロメタン（ＤＣＭ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）からなった。アイソクラチックモードの溶出を１ｍｌ／分の流速とともに利用した。ＵＶ検出を２つの波長（２４０ｎｍおよび２５４ｎｍ）で行った（Ｖａｉｓｍａｎ他、２００５）。
【００８７】
配合物の調製およびインビトロでの薬物放出
パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）が負荷されたポリマーの配合物を、ポリマーを室温で薬物と直接に混合することによって調製した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。すべての配合物を、加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られた配合物は室温で注射可能な半固体のペーストであった。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１０ｍｇのペースト状配合物サンプルを５０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。ペーストは、緩衝液に添加された直後に軟らかい固体に硬化した。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液におけるパクリタキセル濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。
【００８８】
インビトロでの加水分解による分解
インビトロでの加水分解を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２５ｍｇのブランクポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、または、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有する配合物をリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替えた。それぞれの時点で、ポリマーサンプルを緩衝液から取り出し、湿重量を測定し、凍結乾燥後に乾燥重量を測定した。ポリマーの加水分解を、（１）分子量低下および（２）残存するポリマー配合物におけるパクリタキセル含有量によってモニターした。それぞれの時点で、配合物を、ＮＰ ＨＰＬＣによって、分解されたサンプルにおけるパクリタキセル含有量について調べた。
【００８９】
配合物のインビボでの分解
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。ブランクポリマー、および、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するペースト状配合物を、各群において４匹のＣ３Ｈマウスからなる１２の群に２３Ｇのニードルにより背中に皮下注入した。動物を局所的および全身的な毒性の徴候について、また、体重減少について観察した。１日後、７日後、２１日後および７０日後、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。ポリマーインプラントを取り出し、凍結乾燥の前後で重量測定し、残存する配合物におけるパクリタキセル含有量について調べた。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）はこの研究を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決した（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【００９０】
インビボでの抗腫瘍活性
ＭＢＴ細胞の接種
同系交配された８週齢〜１０週齢のメスのＣ３Ｈマウス（約２０ｇの体重）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。マウスには、０．１ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁された１＊１０６個のＭＢＴ細胞を後脇腹に２７ゲージのニードルにより皮下注入した。腫瘍を、カリパスを使用して１日おきに測定し、その体積を、文献に記載される下記の式を使用して計算した：
長さｘ幅ｘ高さｘ０．５２３
【００９１】
治療プロトコル
ＭＢＴモデルにおいて、治療を、腫瘍が触診可能になり、０．５ｃｍ３に達した接種後８日目に開始した。マウスを３つの治療群の１つに無作為に割り当てた（それぞれ群においてｎ＝１０）。２つのコントロール群（それぞれ群においてｎ＝１０）には、０．１ｍｌのブランクポリマーの腫瘍内注入が与えられたか、または、治療が全く与えられなかった。第１の治療群には、５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌ（２５０ｍｇ／ｋｇと等価）が腫瘍内に与えられ、第２の治療群には、この配合物の０．１５ｍｌ（３７５ｍｇ／ｋｇと等価）が与えられ、第３の治療群には、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌ（７５０ｍｇ／ｋｇと等価）が与えられた。マウスには、実験期間中に１回だけ注入された。動物を、腫瘍が潰瘍化したとき、または、腫瘍が許容され得ない苦痛を引き起こしたときに屠殺した。
【００９２】
結果および考察
インビトロでのパクリタキセル放出
Ｍｗ＝４０００およびＭｎ＝３５００であるポリマーキャリア−ランダムポリ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）を、上記で議論されたような溶融縮合によって精製ＲＡ（９８％純粋）およびＳＡ（９９％純粋）から調製した。ポリマーの構造を下記に示す。
【００９３】
パクリタキセルを、ＧＰＣまたは１Ｈ−ＮＭＲによって確認されるように、ポリマーの分子量に影響を及ぼすことなく、または、ポリマーと化学的相互作用することなく、ポリマーに配合した（５％および１０％、ｗ／ｗ）。図５には、Ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からの５％パクリタキセルおよび１０％パクリタキセルの放出プロフィルが示される。５％のパクリタキセルを含有する配合物は、２０日間にわたって、取り込まれた薬物の２０±１．４％を放出し、一方、１０％を含有する配合物は８±０．８％を放出した。放出プロフィルを６０日間モニターした。この期間中に、５％のパクリタキセルを含有する配合物は、取り込まれた薬物の４０±０．５％を放出し、一方、１０％を含有する配合物はその含有量の１６±０．３％を放出した。シンク（ｓｉｎｋ）条件を放出研究期間中保ち、放出媒体におけるパクリタキセル濃度は緩衝液におけるその最大溶解度の１０％以下であった（緩衝液における溶解度はおよそ５μｇ／ｍｌである）。パクリタキセルの疎水的性質のために、ポリマーからのその放出速度は、ポリマーに負荷された薬物の量の関数である：パクリタキセルの負荷が大きくなるほど、その放出速度は遅くなる。
【００９４】
インビトロでの加水分解による分解
本発明者らは、分子量およびサンプル重量における低下をモニターすることによってポリマーの加水分解を調べた。結果が図６に示される。パクリタキセルを含まないポリマーが最も速い分解速度を有していた。最初の１週間で、ブランクポリマーはその初期重量の３３±２％を失い、その後は徐々に分解し、４０日後では、その初期重量の９０．７±６．８％を失っていた。パクリタキセルが負荷されたポリマーの分解速度はそれよりも遅かった。５％のパクリタキセルを含有する配合物は最初の１週間の期間中に１８±５％が分解し、４０日後では７８±４％を失い、８０日後では、配合物のわずかに６％だけが残っていた。１０％のパクリタキセルを含有する配合物は最初の１週間の期間中に１３±５％が分解し、４０日後では６５±８％を失い、８０日後では、配合物の１９％が残っていた。ブランクポリマーおよびパクリタキセル含有ポリマーの分子量（Ｍｗ）低下は類似していた。サンプルが緩衝液に浸けられた後、そのＭｗは最初の３日の期間中に３９００Ｄａから１２００Ｄａに低下した。次の２５日の期間中に、ブランクポリマーの分子量は６７０Ｄａに低下し、一方、パクリタキセルを伴う配合物はそのＭｗを１０７０Ｄａで保った。これは主にパクリタキセルの寄与である。パクリタキセルを含有するポリマーのより遅い分解速度は、パクリタキセルがポリマーを保護し、水が浸透し、薬物およびポリマー分解生成物を溶解することを許さないという本発明者らの以前の発見を裏付けている。他方で、配合物のＭｗが、ほとんどブランクポリマーのＭｗのように低下する。このことは、水が依然としてポリマーマトリックスの内側に浸透し、ポリマーの加水分解を引き起こし得ることを意味する。
【００９５】
パクリタキセルを含有する配合物の重量減少はパクリタキセル放出速度よりも速い。５％のパクリタキセルを含有する配合物は、４０日後、その初期重量の７８％を失っており（図６ａ）、一方、取り込まれた薬物の３５％のみを放出していた（図６ｂ）。同じ不釣り合いが１０％の配合物について見出された：２０日後、１０％の配合物はその初期重量の２７％を失っており（図６ａ）、一方、取り込まれた薬物の８％のみが放出された（図６ｂ）。これらの結果は、分解途中の配合物におけるパクリタキセルの蓄積と相関する（図６ｂ）。分解媒体中で７日後、配合物におけるパクリタキセル含有量は１５±３．５％上昇し、１５日後では５２±１３％上昇し、４０日後では、パクリタキセル含有量はその初期値のほぼ２倍であった（９８±１５％上昇した）。以前に言及されたように、より大きいパクリタキセル含有量はより遅いパクリタキセル放出を引き起こすが、ポリマーマトリックスは依然として分解され得る。
【００９６】
配合物のインビボでの分解
注入された配合物のインビボでの分解の程度を重量減少によって評価した（図７）。ブランクポリマーはインビボで１日後ではその初期重量の４０±７％を失い、５％のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は３１±５％を失い、１０％のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）は１５±８％を失っていた。ブランクポリマーは注入後７日で完全に分解し、一方、パクリタキセルを伴う配合物はそのときまでにその初期重量の半分を失い（著しい違いが、５％または１０％のパクリタキセルを含有する配合物の間で何ら見られなかった）、７０日後には注入部位から完全になくなった。パクリタキセルを含有する配合物の注入部位における何らかの活発な炎症反応または組織過敏の証拠は何ら認められなかった。
【００９７】
インビボでの腫瘍活性
腫瘍内に送達されたパクリタキセルの効力をマウス膀胱腫瘍（ＭＢＴ）異所性モデルで調べた。治療を腫瘍細胞接種後８日目に開始した。治療されなかったマウス、および、ブランクポリマーが注入されたマウスは、腫瘍サイズが１７ｃｍ３を越えたので、接種後２５日で屠殺された。しかしながら、腫瘍の大きさは、ブランク注入群の方が小さかった（コントロールの非治療群の１７ｃｍ３に対して１１ｃｍ３）（図８）。腫瘍内へのブランクポリマーの注入はその構造を傷つけ、その発達を遅らせたことが理論的に想定される。
【００９８】
生存および腫瘍サイズについての最も良い結果が、５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌにより治療された群（１００％の生存、すべてのマウスが腫瘍細胞接種後３０日で生存していた）、および、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌにより治療された群（７５％の生存）において見られた。６０％および５０％の生存がそれぞれ、５％および１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌにより治療された群においてであった。
【００９９】
マウスにおける腫瘍成長の経過が図８に示される。すべての治療群（５％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１ｍｌ、０．１５ｍｌ、および、１０％のパクリタキセルを含有する配合物の０．１５ｍｌ）において、腫瘍サイズは、ブランクポリマーにより治療された群における腫瘍サイズより４倍小さく、また、治療を伴わない群の場合よりも５倍小さかった。この違いは統計学的に有意である（ｐ＜０．００１、ｔ−スチューデント検定）。このことは、治療されなかったマウス、および、腫瘍接種後２０日で治療されたマウスを目視検査することによって確認された。
【０１００】
本研究で使用されたポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（２：８）は、天然脂肪酸から組み立てられた疎水性ポリマーであり、これは、疎水性薬物および親水性薬物の両方を放出させるために使用することができる。本研究の目的は、マウスにおける異所性モデルにおいて筋肉内に注入されたパクリタキセル−ポリマー配合物の効果を評価することであった。パクリタキセルを伴うポリマーペースト配合物は室温で粘性の液体であり、これは２３ゲージのニードルによって注入することができ、体液と接触してゲル化する。この配合物は、薬物を注入部位において局所的に放出する半固体のインプラントをｉｎ ｓｉｔｕで形成した。
【０１０１】
すべての配合物について、インビボでの分解および放出はインビトロでの分解および放出よりもはるかに速かった。これは、インビボでは、脂肪分解産物が注入部位から効率的に除かれ、一方、インビトロ条件下では、脂肪分解産物が残留し、分解プロセスおよび薬物放出を阻止するからである。
【０１０２】
実施例５．メラノーマにおけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
腫瘍内に注入された配合物からのパクリタキセルの局所的送達を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるメラノーマ異所性モデルを使用して調べた。腫瘍の進行、生存時間および体重における変化を、局所的なパクリタキセル治療の有効性を明らかにするために７７日の期間にわたって観察した。腫瘍保有動物に、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルを含有する配合物の異なる体積を腫瘍内に注入した。
【０１０３】
制御放出配合物を、２０：８０の比率での生分解性ポリマーのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））を用いて調製した。ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）を、５％、１０％、１５％および２０％（ｗ／ｗ）の負荷でパクリタキセル（Ｂｉｏｘｅｌ Ｐｈａｒｍａ、Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙ、カナダ）と混合した。混合物を粉砕によって室温で調製し、その後、１ｍＬのルーアーロックシリンジに引き入れ、２３Ｇのニードルでキャップし、使用まで−２０℃で貯蔵した。コントロールポリマー（薬物非含有）もまた、１ｍＬのルーアーロックシリンジに入れた。腫瘍内注入のためのパクリタキセル懸濁物を、１００ｍｇのパクリタキセルを２００ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−８６と（１：２の比率で）混合し、７００μｌの生理的食塩水を加えることによって調製した。
【０１０４】
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（２０ｇ〜２１ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ（Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｃ）から得た。Ｂ１６Ｆ１マウス細胞（ロット番号：１５１１５４８ｐ３２）（ＣＲＬ−６２２３）は、Ｍｉｃｈｅｌ Ｐａｇｅ博士からの譲渡物であった。この細胞は最初は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られた。研究プロトコル＃２００４−０７０が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａｖａｌ（Ｐａｖｉｌｌｏｎ Ａｇａｔｈｅ Ｌａｃｅｒｔｅ、ｌｏｃａｌ １０４０、Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙ、（Ｑｕｅｂｅｃ）カナダ、Ｇ１Ｋ ７Ｐ４）にあるＳｅｃｒｅｔａｒｉａｔ ｌｏｃａｌ ｄｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ ａｎｉｍａｕｘによって受理された。要請が、カナダ動物管理協会（ＣＣＡＣ）によって提供される指針に基づいて個々に審査される。
【０１０５】
Ｂ１６Ｆ１細胞の接種
動物がその環境に順応すると、腫瘍を移植する前に、マウスを、１０匹のマウスからなる８つの群に分けた（コントロール群＃８では１１匹）。この場合、マウスの群間の平均体重はできる限り等しくした。マウスには、１００μＬのＤＭＥＭに懸濁された２０００００個のＢ１６Ｆ１腫瘍細胞を肩甲骨のレベルで皮下に注入した。マウスを１日に２回（午前および夕方）に観察した。マウスの体重を毎日測定し、腫瘍を、腫瘍が急速に成長し続けてからは毎日測定した。メラノーマ腫瘍が検出可能になったとき、その測定を開始した。腫瘍体積を標準的な式に基づいて推定した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２ｘｌ）／２、式中、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ）およびｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ）。実験を続け、腫瘍重量が体重の１０％に達したとき、または、倫理プロトコルに記載されるように、苦痛が許容され得なくなったとき、マウスを屠殺した。安楽死の基準を満たすマウスを、ＣＯ２を使用して屠殺した。安楽死の後、肺を取り出し、肺転移の数を目視より求めた。簡単な検死解剖を、転移物の存在を求めるために行った。
【０１０６】
治療プロトコル
腫瘍移植後２日で、マウスはその治療を受けた。２つの陰性コントロール群（それぞれの群においてｎ＝１０）には、パクリタキセルを伴わないポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）の０．１ｍｌが腫瘍内に注入され（群＃１）、群＃８は治療を何ら受けなかった。治療群（２〜５）には、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルが負荷されたポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）が腫瘍内に注入された（５％および１０％の負荷については０．２ｍｌ、１５％および２０％の負荷については０．１ｍｌ）。治療群６には、１０％のパクリタキセルが負荷されたパクリタキセル懸濁物が腫瘍内に注入された（０．１ｍｌ）。マウスには、実験期間中、１回だけ注入された。治療群７は、１日目、４日目、７日目および１０日目に腹腔内注入されるパクリタキセル／Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ溶液の従来の全身的治療により治療された。腫瘍が潰瘍化したとき、または、腫瘍が、許容されない苦痛を引き起こしたとき、または、腫瘍サイズが動物体重の１０％に達したとき、動物を屠殺した。
【０１０７】
統計学的分析
すべての統計学的分析を、Ｓ−ＰＬＵＳを使用して行った。生存時間（日数）をそれぞれのマウスについて記録した。治療群によるノンパラメトリック生存曲線を、右側打ち切り事例（研究終了時を越えて生存する動物について）を考慮に入れて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して得た。パクリタキセルゲルの治療を受けている動物についての生存時間における統計学的有意差が存在するかどうかを検定するために、生存曲線を、ログランク検定を使用して比較した。生存の関連した尺度は２つの治療の間でのハザード比である。ハザードにより、小さい時間単位の期間中における死亡率、または、その次の続く時間間隔の期間中における瀕死状態の発生率の尺度が提供される。プラセボに対する治療の間でのハザード比を推定するために、セミパラメトリックＣｏｘ比例ハザード回帰モデルをデータに対して近似した。ハザード比に対するパクリタキセル用量濃度の影響を定量化するために、また、５つのゲル治療におけるパクリタキセルの増大する濃度レベルを考慮に入れるために、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを５つのゲル治療について近似した。具体的には、本発明者らは、ハザード比に対する、連続変数としての用量の影響をモデル化したいと思っている。そのうえ、用量と、ハザード比との間での関係における何らかの曲線関係を説明するために、用量についての二乗項もまた、モデルに含められた。より精密には、近似されたモデルは、
Ｌｏｇ（ハザード比）＝ａ＊用量＋ｂ＊用量２
であった。
二次項がモデルにおいて統計学的に有意であると考えられるとしても、最小のハザード比をもたらす０％〜２０％の間での最適な用量濃度を、最小値が存在するならば、曲線の最小値を見つけることによって決定することができる。
α＝５％の全般的な有意水準がすべての統計学的検定について仮定された。
それぞれの統計学的検定のために、全体的な治療影響が見出されたときには常に、多重比較法を使用して、治療のどの対が統計学的に異なっているかを認定した。多重検定を説明するために、多重比較補正を、全般的なα−レベルを５％で維持するためにＴｕｋｅｙ法を使用して適用した。治療群による検出可能な腫瘍体積までの時間についてのノンパラメトリック生存曲線を、右側打ち切り事例（０の一貫した腫瘍体積を有する動物）を考慮に入れて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して得た。
【０１０８】
結果および考察
前述されたように、治療日におけるそれぞれの群の平均体重が２０グラムから変動した。群間の平均体重の分布は、治療後の最初の１０日の期間中は非常に狭かった。実験の最初の１０日の後、体重の増大はそれぞれの群について比較的類似しており、また、残存する腫瘍の重量の増大について「平衡化」した著しい腫瘍重量を有するマウスを安楽死させた以降は、治療のタイプとの相関を何ら示さなかった。
【０１０９】
０．８９９３のｐ値は、受けた治療が０．０５のα−レベルで相対的な体重について統計学的に有意でないことを示す。このことから、相対的な体重は受けた治療によって影響されないという示された記述統計学からなされた観察結果を裏付けるための形式的証拠がもたらされる。
【０１１０】
時間の影響は単独で、０．０００１未満のｐ値により、体重に対する統計学的に有意な影響を有していた。このことは、本発明者らが体重における経時的な増大を認めるグラフと一致している。
【０１１１】
しかしながら、より重要なことは、体重における経時的な変化が、受けた治療に依存するかどうかを評価することである。すなわち、相互作用（治療＊日数）が有意であるかどうか。ＡＮＣＯＶＡ表から、本発明者らは、そのような相互作用が、０．４１５１のｐ値により、統計学的に有意でないことが見出されなかったことを認めている。このことは、相対的な体重に対する時間の影響が治療群によって異ならないことを暗示している。
【０１１２】
動物の生存率
それぞれの群についての生存率が図９に示される。生存は、何らかの形態の治療を受けかなかったコントロール群であった群＃８において、また同様に、パクリタキセルを伴わないポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）だけを受けた群＃１において最低であった。両方の群については、動物の死亡が１３日目に始まり、マウスはすべてが２０日目に死亡し、メジアン生存時間（ＭＳＴ）が１６日であった。パクリタキセルをその治療において受けているすべてのマウスは、コントロールよりも大きいＭＳＴを示した。このことは治療の非急性毒性を例示している。
【０１１３】
ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）により治療された群は、ＭＳＴが、０％、５％、１０％、１５％および２０％のパクリタキセルの濃度についてそれぞれ、１６、２２、３５、１８および２０．５であった。最後に、パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８の懸濁物により治療されたマウス、および、ＩＰ投与用の（生理的食塩水における）市販のパクリタキセルにより治療されたマウスは、ＭＳＴがそれぞれ、１８日および１９日であった。興味深いことに、群＃６（パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８の懸濁物）は「二峰性」の生存曲線を示した。実際、この群の６匹の最初のマウスが直ぐに死亡し、一方で、残る４匹は著しく増大した生存を有した。表４には、すべての群についての治療および対応するＭＳＴがまとめられる。
【０１１４】
注入パクリタキセルの量と、生存との間における相関を明瞭に明らかにすることができなかった。しかしながら、生存に対する、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）において負荷および送達されたパクリタキセルの効力は顕著である。実際、非治療の群では、マウスは一匹も生存せず（最大生存時間が２３日であった）、一方、治療された群では、７７日後、非常に健康なマウスが５つの群に存在する（群＃３＝３匹のマウス；群＃４＝１匹のマウス；群＃５＝１匹のマウス）。
【０１１５】
ログランク検定を、生存時間に対する治療の全体的な効果が存在したかどうかを求めるためにすべての治療群にわたって行った。統計学的検定では、３２のχ二乗値および０．００００４のｐ値により、生存時間に対する治療の非常に有意な効果が明らかにされた。
【０１１６】
治療のどの対が統計学的に異なっていたかを明らかにするために、ログランク検定を治療のすべての対組合せに対して行った。Ｔｕｋｅｙ（Ｈｏｎｅｓｔｌｙ有意差）調節を、５％の全般的なα−レベルが維持されることを保証するように多重比較のために適用した。この方法のもとでは、それぞれの比較のための補正されたα−レベルは０．００２、すなわち、０．２％であった。
【０１１７】
表３には、ログランク検定のｐ値が報告される。星印が付けられた太字での値（この場合、ｐ値は０．００２未満である）は、統計学的に異なる生存分布を有することが見出された治療対を示す。４つのポリマー負荷パクリタキセル治療のうち、５％および１０％の濃度のみが、プラセボと統計学的に異なる生存曲線を有すると考えられた。そのうえ、１０％および２０％の用量濃度は０％の濃度（プラセボコントロール群と最も類似する治療群）とは著しく異なる。５％から２０％までの活性なパクリタキセルゲルの治療では、生存における違いは何ら検出されなかった。まとめると、統計学的有意差が、活性な治療（１０％、２０％のゲル治療）と、非活性な治療（０％のゲル治療およびプラセボ）との間においてだけ見出された。
【０１１８】
腫瘍成長
治療後におけるそれぞれの群についての腫瘍成長速度が図１０に示される。最大の腫瘍サイズが、パクリタキセルをその治療様式において受けなかったコントロール群について報告される。群＃８（治療なし）では、腫瘍サイズが２０日目に３．６ｇであり、群＃１（パクリタキセルを伴わないＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０））では、腫瘍サイズが２．５ｇであった。パクリタキセルが負荷されたポリマーにより治療されたすべての群では、腫瘍サイズがブランクポリマー群または非治療群における腫瘍サイズよりもはるかに小さく、１．３ｇ〜０．３ｇの範囲であった（図１１）。
このデータから、本発明者らは下記のことを認めることができる：
・活性な治療は、プラセボ治療または０％のパクリタキセル治療よりも長い不顕性期間（すなわち、腫瘍サイズが増大し始める前の時間）を示した；
・５％、１０％、１５％および２０％でのパクリタキセル−ポリマー治療は、腫瘍体積において、それ以外の治療よりも遅い増大速度を有するようである；
・腫瘍成長が検出できないマウスが、５％、１０％、１５％および２０％でのパクリタキセルポリマー治療、ならびに、パクリタキセル／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８治療について認められる。
腫瘍体積が検出可能になる前における時間（日数）に関する記述統計学では、下記のことが示される：
・腫瘍体積が引き続き検出できないマウスの大部分が１０％のパクリタキセルゲル治療群において生じていた；
・最大のメジアン時間（すなわち、２６．５日）が１０％用量でもまた生じていた；
・変動係数（ＣＶ）は、プラセボ群および１０％用量群の方が活性な治療の場合よりも低い；
・このことは、動物が、活性な治療の群においては異なる反応を示す傾向があり、これに対して、コントロール群における挙動がより一貫しているという事実によって説明することができる。
【０１１９】
生存曲線と一致して、１０％のパクリタキセルゲル治療は、最大の生存時間を提供することにおいて、それ以外の治療よりも優れているようである。再度ではあるが、プラセボコントロールおよび０％のパクリタキセルゲル治療は、長期にわたるゼロの腫瘍体積の可能性における急速な低下を暗示する最も急勾配の生存曲線に対応する。
治療を比較するために、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを、ハザードに対する治療の影響を検定するために近似した。推定されたハザード比が、プラセボコントロールに関して下記の結果において示される。結果から、本発明者らは、それぞれの治療と、プラセボとの間におけるハザード比が統計学的に有意であること（０．０５未満のｐ値）を見出す。他の結果と一致しているように、ハザードにおける最大の低下を示す治療は１０％のパクリタキセルゲル治療であり、ハザードがプラセボのハザードの０．０３３８倍である。そのうえ、５％および１５％のパクリタキセルゲル治療は、検出可能な腫瘍体積を生じさせるというハザードにおいて類似する低下をもたらし、ハザード比がプラセボのハザード比の０．０９３３倍および０．０９０７倍である。
【０１２０】
治療後における体重の減少がどの群においても示されなかった。このことは、治療の毒性が低いことを示す重要なものであり、また、２０％パクリタキセル配合物の少なくとも１００マイクロリットル（群５、２０ｍｇのパクリタキセル）が注入できることを示す。動物は、治療後１０日における体重の絶え間ない増大によって示されるように、治療時に健康であった。体重は治療後のすべての群で絶えず増大し続けた。しかしながら、パクリタキセルを含有するゲルにより治療されたマウスの皮膚の皮膚潰瘍化により、著しい局所的毒性が明瞭に明らかにされた。その毒性は、血管によって灌注されなくなっている周りの組織に対してポリマーが及ぼす圧力に関連するかもしれず、従って、薬物を局所的に毒性レベルで増大させている。
【０１２１】
パクリタキセルを含有するゲルにより遭遇した潰瘍化の問題にもかかわらず、この医薬配合物が、マウスの生存に対する著しい有益な効果を有していたことは明らかである。例えば、ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）における１０％パクリタキセルによって治療された群＃３のマウスの３０％が７７日後も依然として生存しており、一方、コントロール群では、一匹も、２３日を超えて生存しなかった。興味深いことに、全身毒性は何ら認められなかった。生存と薬物濃度との相関は、予想されたほど良好ではないが、ゲル配合物によって治療されたマウスで認められた局所的毒性は説明されなければならないかもしれない。治療された群において生存と投薬量との間に相関がないことの別の理由が、研究で使用される選択された腫瘍モデルが、配合物による遅い薬物放出と比較した場合、比較的速く成長する腫瘍であるという事実に関連づけられ得る。より遅く成長する腫瘍モデルが、臨床的治療をより良く表すものであるかもしれない。
【０１２２】
ポリマーの外観
興味深いことに、腫瘍の近くにあるポリマーは、注入されたポリマーに比べて、非常に類似した外観を有したことが最初の死体解剖のときに認められた。しかしながら、数日後には、ポリマーは硬化するようであり、塊が収縮し続けた。加えて、パクリタキセルが負荷されたポリマーを取り囲む組織は形質転換し続け、破壊された。
【０１２３】
実施例６．前立腺腺ガンにおけるポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）ポリマーからのパクリタキセルのインビトロおよびインビボでの放出
本研究の目的は、ラットにおける同所性前立腺腫瘍に対する、パクリタキセルを伴う注入可能なポリマーペースト配合物の効力を評価することであった。パクリタキセルが負荷されたポリマーを、腫瘍細胞接種後３日で、ラットの腫瘍保有前立腺に室温で注入した。Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ラット前立腺腺ガンは、腫瘍の進行を研究するために使用される、そのヒト対応物の対応する実験的腫瘍モデルである。本発明者らの研究において、本発明者らは、最も攻撃的な局所的転移能を有するＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。
【０１２４】
ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル無水物）（２：８）を、以前に記載されたように合成した。パクリタキセル（ＧＭＰ規格）（ＢｉｏｘｅｌＰｈａｒｍａ、ＱＣ、カナダ）、無水酢酸（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）およびＣｈｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ ５０％（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を使用した。すべての溶媒が、ＢｉｏＬＡＢ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）またはＦｒｕｔａｒｏｍ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）から得られた分析規格であり、これらをさらに精製することなく使用した。
【０１２５】
注入当日、腫瘍細胞（Ｄｕｎｎｉｎｇ腫瘍、ＭａｔＬｙＬｕ亜系統）をトリプシン／ＥＤＴＡにより組織培養フラスコから取り出した。細胞のトリプシン処理（１分）の後、４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を加えた。腫瘍細胞を遠心分離し、ＰＢＳにおいて２回洗浄し、計数し、補充物を含まないＲＰＭＩ１６４０培地に３つの最終濃度（１ｍｌあたり１ｘ１０５個、３ｘ１０５個および５ｘ１０５個の生腫瘍細胞）で再懸濁した。
【０１２６】
開始時の体重が２２０ｇ〜２４０ｇであるオスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラット（ｎ＝１２）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、ラットには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。同所性モデルを作製するために、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎラットを３つの群に分け、麻酔した（ケタミン／キシラジン、ＩＰ）。下部腹部の毛を剃り、横方向の切開を恥骨の上で行った。腹筋を分割し、腸を持ち上げ、前立腺の腹葉を膀胱より下側で露出させた。５０μＬに懸濁された異なる数のＭａｔＬｙＬｕ細胞を、下記のように、１ｍｌのインスリンシリンジおよび２６Ｇのニードルを使用して腹葉の中に注入した：
・群１：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された８ｘ１０３個の細胞；
・群２：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された１．５ｘ１０４個の細胞；
・群３：５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された２．５ｘ１０４個の細胞；
【０１２７】
腹筋を３／０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）の縫合糸により閉じ、皮膚を３／０の絹糸により閉じた。（予備研究から得られたように）３日後、ラットを屠殺した。それらの前立腺、肝臓および肺の組織病理学評価を、腫瘍発達の存在および程度を求めるために行った。
【０１２８】
配合物調製
パクリタキセル（１０％ｗ／ｗ）が負荷されたポリマーの配合物を、ポリマーを室温で薬物と直接に混合することによって調製した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。すべての配合物を、加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られたポリマー配合物は室温で注射可能なペーストであった。
【０１２９】
パクリタキセルの懸濁物を、パクリタキセルをＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８と１：２の比率で混合することによって調製し、その後、混合物を生理的食塩水に分散して、７．５％（ｗ／ｖ）のパクリタキセル濃度を得た。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８は、パクリタキセルのような、水溶性が低い薬剤を懸濁するために使用される懸濁化剤である。それぞれのラットに２５０μｌの懸濁物を腫瘍内に注入した。
【０１３０】
パクリタキセルの非経口溶液を調製するために、薬物をエタノール（５０％）／Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（５０％）に溶解して、６ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を得た。その後、この溶液を生理的食塩水により希釈して、１．２ｍｇ／ｍｌのパクリタキセルの溶液を得た。それぞれのラットに４ｍｌの希釈された溶液をＩＰ注入した。
【０１３１】
腫瘍の接種および治療
開始時の体重が２２０ｇ〜２４０ｇであるオスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラット（ｎ＝２６）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育し、ラットには、放射線照射された無菌餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。同所性モデルを作製するために、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎラットを５つの群に分け、麻酔し（ケタミン／キシラジン、ＩＰ）、上記で示されたように手術した。腫瘍細胞（５０μｌに懸濁された８ｘ１０３個のＭａｔＬｙＬｕ細胞）を、下記のように、インスリンシリンジおよび２６Ｇのニードルを使用して腹葉の中に注入した。腹筋を３／０のビクリル縫合糸により閉じ、皮膚を３／０の絹糸により閉じた。動物の体重を２日毎にモニターした。治療を腫瘍細胞注入後３日目に開始した。薬物が負荷されたポリマー、および、パクリタキセル懸濁物を、前立腺の腹葉における成長中の腫瘍の中に注入した。非経口パクリタキセルにより治療される群におけるラットには３日毎にＩＰ注入した。実験の予定表が表５に記載され、治療群が表６に記載される。
【０１３２】
動物を、全身毒性の徴候について、また、体重減少について観察した。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（ＮＩＨ承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）はこの研究を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決した（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【０１３３】
目視による腫瘍計算
動物から集められた後、腫瘍を切除し、腫瘍体積の目視による計算を、下記に示される式を使用して行った：
Ｖ＝（長さｘ高さｘ幅）ｘπ／６。
【０１３４】
組織学的分析
すべての動物に由来する腫瘍を切除し、測定し、４％ホルムアルデヒド溶液において固定処理した。組織スライド片をパラフィン中に処理し、３μｍの切片を組織学的評価のためにヘマトキシリン＆エオシンにより染色した。検査パラメーターは、壊死の総面積、被膜形成、炎症細胞の浸潤、および、腫瘍内血管の含有量であった。
【０１３５】
統計学的分析
生存分布およびメジアン生存をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって計算し、ログランク検定を使用して比較した。０．０１未満のｐ値をすべての検定について有意であると見なした。
【０１３６】
結果および考察
手術手法および腫瘍細胞注入は十分に許容され、すべてのラットが両方の手術（腫瘍細胞接種、および、３日後に与えられた治療）の後で覚醒した。すべてのラットにおいて、同所性腫瘍が、組織学的検査によって確認されたように、腫瘍細胞の注入によって首尾良く移植された。Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ラット前立腺腺ガンは、成長速度、分化、ホルモン応答性および転移能において異なる数多くの亜系統によって誘導され得ることには留意しなければならない。本発明者らの研究において、本発明者らは、最も攻撃的な局所的転移能を有するＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。
【０１３７】
動物モデルの校正
ラットの３つの群に、増大する濃度の腫瘍細胞をその前立腺に注入した。ＭａｔＬｙＬｕ亜系統の攻撃性のために、安定な、しかし、依然として治療可能な腫瘍を生じさせる細胞の最適な最少量を選択した。以前に報告されたように（１８）、腫瘍をすべての前立腺内注入動物において形成させたＭａｔＬｙＬｕ細胞の最少量は５ｘ１０３個の細胞であった。これらの結果に従って、本発明者らは、腫瘍が、注入された前立腺において実際に成長することが確信されるように、類似する濃度の細胞を使用した。他方で、ラットに、２ｘ１０５個が前立腺内に注入されたとき（データは示されず）、得られた腫瘍は非常に大きく、治療できず、すべてのラットが細胞接種後２週間以内に死亡した。
【０１３８】
腫瘍細胞接種後３日でラットを屠殺した。前立腺、肺および肝臓を単離し、組織病理学的評価に送った。腫瘍細胞接種後３日で、前立腺における明白な腫瘍が認められた；しかしながら、転移は肉眼観察によってすべての群で見出されなかった。注入後３日でのラットの前立腺における前立腺ガンの組織病理学では、前立腺ガンの多数の病巣が示された。転移が、組織病理学的評価のとき、肝臓および肺において見出されなかった。腫瘍細胞の注入量のすべて（８ｘ１０３個、１．５ｘ１０４個および２．５ｘ１０４個）で、腫瘍が３日後には首尾良く生じたので、８ｘ１０３個の腫瘍細胞を注入し、動物を３日後に治療することを決めた。
【０１３９】
生存および体重減少
ガン細胞の前立腺内滴注では、腫瘍が非常に速く形成し、すべてのラットにおいて致命的であった。ラットの生存が表７に示される。
【０１４０】
ラットの最も短い生存が、パクリタキセルの非経口配合物により治療された群においてであった：治療された動物の５０％が、２回目の用量の後、すなわち、腫瘍細胞接種後９日で死亡した。これらのラットもまた、実験期間中、体重が減少していた（図１１）。このことは、それらの死亡および病的状態が薬物配合物の全身毒性によって引き起こされたことを暗示している。最大の生存が、１０％（ｗ／ｗ）のパクリタキセルが負荷されたポリマーの２００μｌにより腫瘍内で治療された群においてであった。１匹のラットが腫瘍細胞接種後３週間で死亡しただけであり、一方、それ以外のすべてのラットが、研究終了まで、すなわち、腫瘍細胞接種後３５日まで生存していた。非治療の群では、１匹のラットが腫瘍細胞接種後３週間で死亡し、それ以外のすべてのラットが３日後（腫瘍細胞接種後２５日目）に死亡した。パクリタキセル／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ懸濁物の腫瘍内注入は、腫瘍内注入後、パクリタキセルが注入部位で凝集したので、全身毒性を引き起こさなかった。他方で、この配合物はラットの寿命を延ばさなかった。すなわち、すべてのラットが腫瘍細胞接種後２５日で死亡した。
【０１４１】
検死解剖時において、大きい腫瘍（直径が３ｃｍを超える）を有する動物は、大きい血管への腫瘍の侵入、または、非常に血管新生化した原発腫瘍の破裂のいずれかによる顕著な内出血を示した。他方で、ポリマー／パクリタキセル治療群におけるラットは他の治療群よりも１０日遅く死亡し、その間、比較的小さい腫瘍を有していた。本発明者らは、転移または内出血のいずれもが検死解剖時に見られなかったので、それらの死亡が尿管閉塞によって引き起こされたと考えている。体重減少曲線から、すべてのラットが最初の５日間でその体重を失ったことが明白である（図１２）。この体重減少は、おそらくは、ラットが受けた手術および外傷が原因であった。５日目から開始したとき、パクリタキセルのＩＰにより非経口治療を除くすべての治療群に由来するラットは、その体重を増大させることが始まり、これらの群の間には統計学的な違いがなかった。全身的治療は、統計学的に有意な体重減少（２３１ｇｍから２０３ｇｍへの減少）、および、５０％の「早すぎる」死亡例を引き起こしただけであった。
【０１４２】
リンパ節、肺および肝臓への転移
検死解剖時に、リンパ節転移が腫瘍保有動物において触診可能であり、また、視認された（表８）。
【０１４３】
そのようなラットは肉眼で見えるほど大きい骨盤および後腹膜のリンパ節転移を有し、節のサイズが０．６ｃｍにまでなっていた。表８に示されるように、治療されなかった動物、および、パクリタキセル懸濁物が腫瘍に注入された動物はすべてが、転移を肺および肝臓に示した。パクリタキセルの非経口配合物により治療され、腫瘍細胞接種後９日で死亡したラットは（おそらくは、非常に早く死亡したために）転移を発生させなかったが、他の２匹のラットは転移を肺および肝臓に発生させた。転移が、ポリマー／パクリタキセル配合物の２００μｌにより腫瘍内で治療されたラットでは１つも見出されなかった。
【０１４４】
腫瘍体積
図１２には、異なる治療群における腫瘍を有する前立腺の体積が示される。非治療の群では、１匹のラットが腫瘍細胞接種後２１日で死亡し、１１．８３ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが２５日目で死亡し、１４．８±１．０８ｃｍ３の前立腺体積を有していた。非経口パクリタキセルにより治療された群では、死亡は二峰性であった。すなわち、ラットの半数が９日後に死亡し、１４．１８ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが２５日後に死亡し、１３．６５±０．２６ｃｍ３の前立腺体積を有していた。より良好な結果が、腫瘍内に注入されたパクリタキセル懸濁物により治療された群においてであった。すなわち、すべてのラットが２５日後に死亡し、６．６±０．７ｃｍ３の前立腺体積を有していた。最も良い結果がポリマー／パクリタキセル治療について得られ、この場合、１匹のラットが２１日後に死亡し、０．８４５ｃｍ３の前立腺体積を有し、他のラットが最も長い期間を生存し、３５日後に死亡し、０．８６２±０．１６ｃｍ３の前立腺体積を有していた。一方、２００μｌのポリマーが注入された健康な前立腺の体積は約０．４ｃｍ３である。
ポリマー／パクリタキセル群から３５日目で採取された前立腺、および、すべての他の群からは２５日目で採取された前立腺の比較では、それらの群の間における目視による違いが明瞭に示された。
【０１４５】
組織病理学的評価
すべての上記パラメーターが評価されたが、群の間で違いを明らかにした唯一のパラメーターが腫瘍内壊死であった。すべての他の評価されたパラメーターは群の間で違いを何ら示さなかった。従って、このデータは示されていない。非治療の群では、総腫瘍内壊死の割合が低かった（１０％〜２０％）。パクリタキセル懸濁物により治療された群では、総腫瘍内壊死の割合は類似しており（１０％〜１５％）、１つのだけの腫瘍がより大きい壊死を示しただけであった（約５０％）。パクリタキセル懸濁物の非経口配合物により治療された群では、腫瘍内壊死が全く見出されず、一方、総腫瘍内壊死の最も大きい割合が、１０％のパクリタキセルが負荷されたポリマーにより治療された群において見出された（２５％〜７０％）。加えて、ポリマー／パクリタキセル群に由来する３匹のラットを腫瘍細胞接種後１０日で屠殺し、それらの前立腺を組織病理学的評価に送った。間質壊死および腺内壊死の多数の領域、ならびに、急性の炎症が認められた。しかしながら、前立腺ガンの明らかな存在はなかった。
【０１４６】
転移が、すべての非治療ラット（群＃１、４匹中４匹）、パクリタキセル懸濁物により腫瘍内で治療されたすべてのラット（群２、４匹中４匹）、非経口配合物により治療されたすべてのラットにおいて肝臓および肺に見出され、また、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物により治療されたラットでは、転移が１つも見出されなかった。
【０１４７】
本発明者らの知見（すなわち、群の間での腫瘍内壊死の量における著しい違い）は、エストラムスチンおよびエトポシドにさらされた同じモデルにより文献に報告されることと一致していることは強調されなければならない。
【０１４８】
本発明者らは、抗新生物薬物（例えば、パクリタキセルなど）の部位特異的な送達のための生体適合性および生分解性の注入可能なポリマーゲルの効果的な使用を以前に記載している。本研究で使用されるポリマーゲル配合物は、小ゲージのニードル（２３Ｇ）により注入することができる室温で粘性のペーストであり、生体内では１時間で固まる。このゲルは、薬物を注入部位において局所的に放出する制御放出インプラントを形成する。インビボ研究では、パクリタキセルが３週間〜４週間にわたって放出され、インプラントがこの期間の間に完全に分解されることが示された。
【０１４９】
ＤｕｎｎｉｎｇラットＭａｔＬｙＬｕ前立腺ガンはホルモン不応性の転移性ヒト前立腺ガンと多くの点で類似する。異所性部位で誘導された腫瘍は実験操作のために容易に利用することができるが、そのような腫瘍はその解剖学的起源と一致していない。その本来の環境にないガン細胞は、その起源器官における場合と極めて異なる挙動を有することが知られている。
【０１５０】
本研究において、本発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇモデルにおけるパクリタキセル含有ポリマーの腫瘍内注入の効力を評価した。同所性モデルにより、ガンを、そのガンが実際の生涯で生じるようなそれ自身の環境において治療することができる。この動物モデルは、再発した前立腺ガンを有する患者のための可能性のある治療方法を反映するかもしれない。パクリタキセル／ポリマー配合物の治療効果は、インビトロおよびインビボで記録されたＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導から生じた。本発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇ前立腺ガンモデルの中で最も攻撃的で、非常に転移性の亜系統であるＭａｔＬｙＬｕ亜系統を使用した。このモデルを校正した後、本発明者らは、治療することができる均一に成長し続ける同所性腫瘍を生じさせるための腫瘍細胞の最適な量を見出した。本発明者らの結果では、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物の１回の腫瘍内投与により、コントロール群または全身的治療との比較において著しい様式でＣｏｐｅｎｈａｇｅｎラットのＭａｔＬｙＬｕ細胞Ｄｕｎｎｉｎｇ前立腺ガンの腫瘍成長を低下させることができたことが示される。パクリタキセル懸濁物による腫瘍内治療もまた、腫瘍体積を幾分か低下させたが、ポリマー／パクリタキセル配合物ほど良好ではなく、動物の寿命を延ばさなかった。懸濁物の腫瘍内注入の後、水が除かれ、パクリタキセルの粉末のみが注入部位に残る。この粉末は（ラットの検死解剖時に見られたように）ケークを形成する。多くのパクリタキセルがこのケークから溶解するので、このケークは、ある程度の壊死を周囲において引き起こすために十分であるが、腫瘍進行および転移を防止するためには全く十分ではない。他方で、１０％（ｗ／ｗ）のパクリタキセルを伴うポリマー配合物の同じ体積が腫瘍の中に注入されたとき、ポリマーは注入部位に数週間にわたって留まる。配合物が分解し、パクリタキセルを、極めて大きいインプラント表面から放出する。前立腺全体が配合物により満たされる一方で、腫瘍の進行および転移形成が停止させられる。従って、最も良い治療は、２００μｌのポリマー／パクリタキセル配合物の腫瘍内注入である。この治療はラットの寿命を１０日延長し、また、腫瘍体積が他の治療よりも１８倍小さく、腫瘍組織における壊死割合が著しく大きくなり、転移が全く見出されなかった。
【０１５１】
補助的な全身的治療を伴わない進行したヒト前立腺ガンにおいて、前立腺を除くための手術は、生存を延ばすためにほとんど役に立っていない。効果的な補助的治療が現在ないことにより、手術を新しい実験的治療様式により強化しなければならない必要性が強調される。抗ガン薬物を局所的に放出する注入可能な生分解性ペーストの使用により、この問題が解決されるかもしれない。
【０１５２】
実施例７：薬物放出に対する添加剤の影響
本研究の目的は、配合物からのパクリタキセルの放出に影響を及ぼすことなく、リシノール酸、リン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００をポリマー−薬物配合物に取り込むことによって、ポリ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）−パクリタキセル配合物の粘度をさらに低下させ、また、その注入性を改善することであった。配合物を、下記の３つの工程で行われた、室温におけるすべての成分の直接の混合によって調製した：ａ）パクリタキセル（５％および１０％ｗ／ｗ）を添加剤（ＰＥＧまたはリン脂質）と粉砕により混合した；ｂ）リシノール酸（２０％ｗ／ｗ）を混合物に加えた；ｃ）混合物をｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）ポリマーペーストに粉砕により配合した。組成物を、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。パクリタキセルを伴わない配合物を、工程２から出発して同じスキームによって調製した。下記の配合物を調製した：ａ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）；ｂ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％リン脂質（ＰＬ）；ｃ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％ポリ（エチレングリコール）４００（ＰＥＧ４００）；ｄ）パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、パクリタキセルを伴わないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）＋２０％リシノール（ＲＡ）＋５％ポリ（エチレングリコール）２０００（ＰＥＧ２０００）；および、コントロールとして、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有するか、または、薬物を伴わない、添加剤を含まないｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）。すべての配合物を調製し、さらに加熱することなく室温でシリンジに充填した。得られた配合物は、注入することができる室温で半固体のペーストであった。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１０ｍｇのペースト状配合物サンプルを５０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって行った。ペーストは、緩衝液に添加された直後に軟らかい固体に硬化する。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液における薬物濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。
【０１５３】
インビトロでの加水分解による分解
インビトロでの加水分解を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２５ｍｇのブランクポリマー、または、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）を含有する添加剤含有ペースト状配合物をリン酸塩緩衝溶液（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に注入することによって評価した。媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替えた。それぞれの時点で、ポリマーサンプルを緩衝液から取り出し、湿重量を測定し、凍結乾燥後に乾燥重量を測定した。ポリマーの加水分解をサンプルの重量減少によってモニターした。
【０１５４】
結果
ポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に添加される選択された添加剤は、リシノール酸、卵のリン脂質、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ２０００であった。これらの添加剤と均一に混合されたポリマー、および、パクリタキセル（５％および１０％、ｗ／ｗ）が負荷された添加剤含有配合物は、加熱することなく２２Ｇのニードルにより容易に注入することができた。
【０１５５】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を、２０％ｗ／ｗのリシノール酸を添加する前後におけるＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の分子量を求めるために使用した。２０％ｗ／ｗのリシノール酸がポリマーに加えられた後、ポリマーの分子量は変化しないままであり、リシノール酸のピークが、その分子量（３００ｇ／モル）に対応する８分後に見られる。ＩＲ分光法では、添加剤および／またはパクリタキセルが加えられたとき、無水物のバンドに対応するピーク（１８１７ｃｍ−１）における変化が示されなかった。
【０１５６】
２０％のリシノール酸をポリマーＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に加えることにより、配合物はより軟らかくなり、５％および１０％のパクリタキセルを含有する配合物を、さらに加熱することなく室温で２２Ｇのニードルにより注入することが可能となった。パクリタキセルをポリマーに分散させて、均一な配合物を得た。
【０１５７】
実施例８：ペプチドおよびタンパク質の放出
数多くのペプチド治療剤およびタンパク質治療剤が承認されているか、または、臨床試験の進んだ段階にある。広範な研究がペプチドおよびタンパク質のための制御放出システムのためのポリマーについて行われている。本研究のほとんどがＰＬＧＡに集中している。残念なことに、ＰＬＧＡの塊状分解は酸性のコアをもたらし、そのような酸性コアはｐＨ感受性薬物（例えば、ペプチドおよびタンパク質など）に損傷をもたらすことがある。表面侵食性ポリマー（例えば、ポリ無水物など）は、粒子からの可溶性フラグメントの増大した拡散速度によって酸性増大の影響を低下させる。本明細書中に記載される液状ポリマーおよびペースト状ポリマーはペプチドおよびタンパク質の送達のために使用された。ペースト状態の薬物送達システムを使用することの利点は、何らかの有機溶媒、熱または剪断力を用いることなく、薬物粉末をポリマーのペーストに室温で単に混合することによる薬物取り込みにおける容易さである。
【０１５８】
下記のペプチドおよびタンパク質を本研究では使用した：ロイプロリド（１２７０Ｄａ）、オクトレオチド（１０１９Ｄａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６８０００Ｄａ）、インスリン（５８６０Ｄａ）、インターロイキン（５３０００Ｄａ）およびインターフェロンα−２ａ（ＩＦＮ−ａｌｐｈａ）（１９０００Ｄａ）を使用した。これらのペプチドを商業的供給元から得た：ロイプロリドおよびオクトレオチド（Ｎｏｖｅｔｉｄｅ Ｌｔｄ．）、インスリン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎｃ．）、ウシ血清アルブミン（Ｉｎｔｅｒｇｒｅｎ ｃｏｍｐａｎｙ）、インターフェロンα−２ａ（ＲｏｆｅｒｏｎＡ（登録商標）、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、スイス）、インターロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を本研究では使用した。
【０１５９】
緩衝溶液におけるＬＨＲＨおよびオクトレオチドの濃度を、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔ（登録商標）２５０−４、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）１００、５μｍ）を使用して、ＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムから構成されるＨＰＬＣシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）によって求めた。ＬＨＲＨをアセトニトリル：ＴＥＡＰ緩衝液（ｐＨ３、０．０１Ｍ）（３：７、ｖ／ｖ）によって溶出し、λ＝２７８ｎｍにおいて検出した。オクトレオチドをアセトニトリル：ＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．０２Ｍ）によって溶出し、λ＝２１８ｎｍにおいて検出した。緩衝溶液におけるＢＳＡ、インスリン、ＩＮＦ−ａｌｐｈａおよびインターフェロンの濃度をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって求めた。
【０１６０】
ペプチドおよびタンパク質を室温において乳鉢で別々に微粉末に粉砕した。この薬物粉末を、均一なペーストが達成されるまで、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）またはｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）と混合した。ポリマーからのペプチド放出を調べるために、１０％（ｗ／ｗ）のロイプロリドおよびオクトレオチドが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の２０ｍｇのサンプル、ならびに、同じ重量のブランクポリマーのサンプルを調製した。サンプルを回旋振とう（１００ＲＰＭ）とともに１５ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ）において３７℃でインキュベーションした。２ｍｌのサンプルを採取し、ＨＰＬＣによって分析した。緩衝溶液を、ペプチドの飽和および溶液の濁りを避けるために４８時間毎に取り替えた。生理学的条件下でのポリマーの分解を重量減少およびＧＰＣ分析によって４０日間にわたって追跡した。
【０１６１】
ポリマーからのタンパク質放出：１０％（ｗ／ｗ）のＢＳＡが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の５０ｍｇのサンプル、および、５％（ｗ／ｗ）のインスリンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の５０ｍｇのサンプルを調製し、２０ｍｌの緩衝液においてインキュベーションし、また、５％（ｗ／ｗ）のインターフェロンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２０ｍｇのサンプル、および、５％（ｗ／ｗ）のＩＦＮ−ａｌｐｈａが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２０ｍｇのサンプルを調製し、１０ｍｌの緩衝液においてインキュベーションした。０．２ｍｌのサンプルをそれぞれ４８時間で媒体から採取し、Ｌｏｗｒｙアッセイ法に従ってＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬とインキュベーションし、ＵＶ分光光度計により分析した。緩衝溶液を、タンパク質の飽和および溶液の濁りを避けるために４８時間毎に取り替えた。結果が図１３に示される。
【０１６２】
本研究のために選ばれたポリマーは、平均分子量がそれぞれ１２０００および１８０００である、２：８（ｗ／ｗ）および３：７（ｗ／ｗ）の比率を有するｐ（ＳＡ：ＲＡ）であった。これらのポリマーは１７３２ｃｍ−１および１８１７ｃｍ−１における２つのＩＲ無水物ピークを示した。１７３２ｃｍ−１におけるピークはまた、エステル結合に参照されるかもしれない。遊離酸のピークが１７００ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）および３５００ｃｍ−１（Ｏ−Ｈ）において存在しなかった。ＮＭＲ分光法により、すべてのＲＡがＰＳＡ鎖内に挿入されていることが、３．６１３ｐｐｍにおけるＣＨ−ＯＨピークの消失および４．８５３ｐｐｍにおけるＣＨ−Ｏ−ＣＯピークの出現によって確認された。
【０１６３】
１０％のＬＨＲＨおよびオクトレチドが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）の加水分解による分解を、重量減少および分子量における変化によって調べた。分子量減少における著しい違いがブランクポリマーおよびペプチドペプチドの間にはなかった。ＬＨＲＨおよびオクトレチドが、ＨＰＬＣによってモニターされたとき、４０日を超える期間にわたってゲル化ポリマーから絶えず放出された。
【０１６４】
実施例９：ブピバカイン局所麻酔剤を送達するための液状ポリマー
手術後の痛みは、手術後の患者および治癒プロセスにとって大きな問題であると見なされる。現在の方法では、短期間作用する局所麻酔剤の溶液を多数回注射することが含まれるが、時間がかかり、また、高価な設備および綿密なモニターリングが要求される。浸襲性がより低い方法は一般にそれほど有効でない。手術後の痛みのための効率的な治療がこのようにないことにより、新しい治療原理がさし迫って必要であることがこの領域では強調される。代わりの方法が高用量の局所麻酔剤の局所投与であり、これは、局所麻酔剤の効果を、制御放出の注入可能なインプラントにより、数日の期間にわたって、または、数週間の期間にわたってさえ延ばすことができる。そのような部位特異的な薬物送達システムは薬物の効果的な用量をもたらすことができ、また、全身的な配合物の繰り返される使用に関連する全身毒性を避けることができる。
【０１６５】
インプラントの調製およびインビトロでの薬物放出
ブピバカイン遊離塩基（５％、７％、１０％、ｗ／ｗ）を、薬物粉末を４０℃でポリマーに混合し、１ｍｌのシリンジをこの配合物で満たすことによって液状ポリマーに配合した。この配合物は室温では半固体物であり、体温では液体である。インビトロ薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、１００ｍｇの半固体配合物を５０ｍｌの溶解媒体（リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））に注入することによって行った。インビボでのシンク条件をシミュレーションするために、大量の溶解媒体を使用し、ブピバカインがその最大溶解度の１０％を決して越えないようにした。放出媒体を新鮮な緩衝溶液により定期的に取り替え、溶液における薬物濃度をＨＰＬＣによって求めた。すべての実験を三連で行った。同様に、ブピバカイン塩酸塩を、類似した手順を使用してポリマーに配合した。遊離塩基のブピバカインはポリマーにおいて透明な溶液を形成し、一方、ＨＣｌ塩は微細な分散物であった。
【０１６６】
動物
体重が４０ｇであるメスのＩＣＲマウスを使用した。マウスを１つのケージに対して１０匹収容し、餌および水を自由に摂取させた。動物室を循環的に照明し（１２時間の照明、１２時間の消灯）、温度は２２℃であった。動物を、座骨神経の特定および配合物の注入の期間中、ハロタン（１．５％〜２％）により麻酔した。神経を神経刺激装置（Ｓｔｉｍｕｐｌｅｘ（登録商標）２２Ｇの直径、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ ＡＧ、ドイツ）により特定した。それぞれの動物は、ブピバカイン（１０％ｗ／ｗ）含有ポリマーの１回の注入（０．１ｍｌ）を一方の側面に受け、対応するブランクポリマーまたは生理的食塩水溶液を反対側に受けた。
【０１６７】
ポリマー配合物の毒性および排除
主要な器官における炎症、感染および壊死、ならびに、ポリマー−薬物およびコントロールにより治療された座骨神経についての死後の組織学評価を行った。ブピバカインの効力についての実験が完了した後、動物をクロラール水和物（４％）（０．２ｍｌ）により麻酔し、血液を心臓から抜き取り、そして、動物を肺穿刺によって屠殺した後、主要な器官（心臓、肺、肝臓、脾臓、脳および左右の座骨神経）を切除し、固定処理のために１０％ホルマリン溶液に入れた。その後、組織をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色した。組織学的評価を、Ｈｅｂｒｅｗ大学Ｈａｄａｓｓａｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける動物施設において病理学者の助けをかりて光学顕微鏡観察によって行った。マウス血液におけるブピバカイン濃度を知られている手法に従って求めた。簡単に記載すると、０．５ｍｌのマウス血漿を１．５ｍｌのヘプタン−酢酸エチル（９：１、ｖ／ｖ）により抽出し、２分間振とうした。１２００ｇでの１０分間の遠心分離の後、有機相をコニカルチューブに移した。２回目の抽出工程を、１００μｌの０．０５Ｍ硫酸を加え、２分間振とうした後で行った。１２００ｇでの５分間の遠心分離の後、有機相を捨て、５０μｌの水性酸塩基に１００μｌのＤＤＷを加えた。１００μｌのアリコートをクロマトグラフィーに注入した。クロマトグラフィーシステムは、Ｃ１８逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔＲ２５０−４、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＲ１００、５μｍ）を備えたＨＰ１１００ポンプ、ＨＰ１０５０ＵＶ検出器およびＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ分析プログラムからなった。移動相はアセトニトリルおよび０．０１Ｍリン酸二水素ナトリウムのｐＨ２．１での混合物であった。流速は１ｍｌ／分であり、ＵＶ検出が２０５ｎｍにおいてであった（注入体積：１００μｌ、処理時間：１２分）。
【０１６８】
インビボでの効力研究
運動ブロック
マウスを４点の尺度に従って運動ブロックに関して評価した：１−正常、２−尾によって持ち上げられたとき、足の損なわれていない背屈、しかし、足の指を広げることができない、３−曲がった足の指および足の裏、しかし、広げることができない、４−背屈の喪失、足の指の屈曲、および、歩行障害。
【０１６９】
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓホットプレート感覚試験
このモデルは、独立した運動試験および感覚試験を可能にする。マウスを、プレートの上で立たせるように置いた。装置に慣れさせた後、赤外ビーム（標準熱温度、５０℃〜５２℃）を、試験された後足に向ける。後足をホットプレートから引っ込めるまでの遅れ時間を、足を交代させ、少なくとも１５秒の回復をプレート測定の間で許すことによって記録する。脚についての引っ込め筋肉は腿の内転筋（座骨神経ではなく、大腿神経）であるので、マウスは、完全な（レベル４）の座骨神経ブロックにもかかわらず、足を引っ込めることができる。加えて、針で刺すことを足に加え、反応（あり＝１、または、なし＝０）が記録される。
【０１７０】
統計学的分析
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ（事象までの時間）スコアを、分散の混合モデル分析を使用して分析した。注目される大きな疑問は、薬物がＨａｒｇｒｅａｖｅｓスコアに影響を及ぼしたかどうかであった。２つの実験を行い、異なる動物を様々な時間で使用した。薬物、実験および時間は固定効果であると見なされ、動物（実験および時間において入れ子にされる）がランダム効果であると見なされた。ＳＡＳ Ｐｒｏｃ Ｍｉｘｅｄ（バージョン８／０２）を使用して、分析を行った。
【０１７１】
結果
インビトロでの薬物放出
ブピバカインを、ＧＰＣによって確認されるように、ポリマーの分子量に影響を及ぼすことなくポリマーに配合した。ブピバカイン遊離塩基（ＢＦＢ）は１５％（ｗ／ｗ）のＢＦＢまでＰ（ＳＡ：ＲＡ）に容易に可溶である。塩酸塩の塩は、少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の負荷まで、その粘度に影響を及ぼすことなくポリマーに十分に分散した。５％および７％のブピバカインを含有するＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）配合物およびＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）配合物は、一次のプロフィルで薬物を絶えず放出し、取り込まれた薬物の約６０％が緩衝液において７日の期間中に放出され、１０％を含有する配合物はその含有量のおよそ７０％をこの期間中に放出した。すべての実験について、より大きいＭＷのポリマー（Ｍｗ＝１８０００）は、低いＭＷのポリマー（Ｍｗ＝５０００）と比較して、薬物をより遅い速度（それぞれの時点で放出された量の１０％〜２０％少ない）で放出する。
【０１７２】
毒性および組織病理学的評価
座骨神経、その周りの組織（脂肪および筋肉）および主要な器官の組織学的評価を、注入後の３日および１週間で屠殺されたマウスに対して行った。注入後３日では、３匹中１匹のマウスにおいてのみ、マクロファージの浸潤が、座骨神経を取り囲む脂肪に見出された。それ以外の２匹のマウスでは、左右の神経、周りの筋肉および脂肪は正常であることが見出された。他の調べられた器官のすべて（肺、肝臓、心臓、脳および脾臓）がすべての調べられたマウスにおいて正常であることが見出された。注入後１週間で行われた組織学的検査では、５匹中２匹のマウスにおいてのみ、希な好中球および神経周囲リンパ球が、座骨神経を取り囲む組織に見出され、調べられた器官のすべて（肺、肝臓、心臓、脳および脾臓）がすべての調べられたマウスにおいて正常であることが見出された。
【０１７３】
ポリマーに負荷された薬物の１０ｍｇを注入した後におけるブピバカインの血漿中濃度を調べた。２４時間後、血漿中レベルは７５±１５ｎｇ／ｍｌに達し、その後、６日後では１８±５ｎｇ／ｍｌに低下し、７日目以降〜２１日目まで、血漿中レベルはほとんど検出不能であった（７±２ｎｇ／ｍｌ）。これらの血漿中濃度は、痙攣のような何らかの観測された全身毒性を引き起こさず、また、ポリマーに負荷されたブピバカインの１０ｍｇが与えられたマウスはすべてがこの研究を生き延びた。
【０１７４】
効力
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓホットプレート感覚試験を、ブピバカイン配合物の注入後、４日の期間中に行った。麻酔効果が注入後の３日の期間中維持されたことが見出された。運動ブロックが注入後２４時間〜３６時間で消失した。
【０１７５】
結論：これらの結果に基づいて、ポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）はブピバカインの放出を遅らせ、感覚消失を、何らかの負の病理学的影響を伴うことなく延ばす。
【０１７６】
実施例１０：骨粗鬆症を治療するためのゲンタマイシンの制御放出のためのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル−無水物）生分解性キャリア
骨髄炎は、通常の場合には細菌によって、しかし、ときには真菌によって引き起こされる骨感染症である。骨が冒され得る３つの可能な様式がある。骨の感染が、傷害を受けているか、または、血液循環が悪い隣接する軟組織からの感染の拡大によって引き起こされ得る。身体の他の部分からの感染が血液を介して骨に持ち込まれ得る（血液学的広まり）。直接の骨感染が穿通創または開放骨折の結果であり得る。骨感染の治療は主に、手術による創面切除、すべての異物の除去、および、抗生物質治療を伴う。通常、静脈内投与による抗生物質が３週間にわたって処方され、その後、３週間の経口投与による抗生物質が続く。しかしながら、骨における効果的な治療的薬物レベルを達成するために要求される抗生物質の大きい非経口用量、ならびに、長期にわたる治療経過は、抗生物質の全身毒性をもたらし得る。感染部位への抗生物質の局所的送達は、従来の静脈内治療を上回る大きな利点をもたらす。局所的な薬物送達システムでは、低い全身的薬物レベルを維持しながら、感染部位における大きな薬物濃度を達成することができる。抗生物質の局所的送達のために開発された薬物送達システムは非生分解性キャリアおよび生分解性キャリアに分けることができる。ゲンタマイシンを含有するポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ビーズが、欧州では骨髄炎の治療における使用のために承認されている。この製造物は、有効であることが証明されているが、非生分解性であり、かつ、抗生物質の放出が完了したときにビーズのその後の取り出しを必要とするという大きな欠点を有する。近年、様々な生分解性の送達システムが開発され、骨感染症の治療における抗生物質の局所的送達について評価されている。硫酸ゲンタマイシンは強力な抗生物質薬剤であり、現在、長期の留置カテーテル、抗生物質を含有するポリメタクリル酸メチルビーズまたはリン酸カルシウム（骨セメント）の局所インプラントとともに、主に静脈内注入による骨髄炎の治療のために使用されている。
【０１７７】
インビトロでのゲンタマイシン放出
異なる分子量を有するＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ比）ポリマーを、実施例１に記載されるように調製した。硫酸ゲンタマイシンを、均一な混合物が得られるまで、加熱または溶媒の使用を何ら伴うことなく、室温でポリ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に混合した。薬物負荷量は１０％および２０％であった。薬物放出研究を、一定の振とう（１００ＲＰＭ）とともに３７℃で、２００ｍｇの配合物を５０ｍｌのリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に入れることによって行った。生物学的流体の流れをシミュレーションするために、緩衝溶液を４８時間毎に取り替え、取り替えた溶液をゲンタマイシン分析のために保存した。
【０１７８】
インビトロ放出アッセイのために、２５μｌの配合物を２４ウエルマイクロタイター平底プレート（Ｎｕｎｃ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）から入手可能）におけるそれぞれのウエルの底に置いた。１ｍｌのリン酸塩緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を加え、プレートを加湿チャンバーにおいて３７℃でインキュベーションした。それぞれの時点で、溶解媒体を集め、配合物を１ｍｌのＰＢＳにより洗浄し、新鮮な１ｍｌのＰＢＳをウエルに加えた。媒体を遠心分離し、上清を細菌研究およびゲンタマイシン濃度分析のために保存した。
【０１７９】
集められたサンプルを１００倍希釈し、フルオレスカミン（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を反応させ、３９２ｎｍの励起波長および４８０ｎｍの放射波長で分光蛍光計（Ｊａｓｃｏ、日本）によって分析して、ゲンタマイシンの濃度を求めた。
【０１８０】
本研究のために調製された配合物は２０ｍｇ〜４０ｍｇのゲンタマイシンを含有した。ゲンタマイシン負荷ポリマーを、薬物粉末をポリマーペーストに単に混合することによって調製した。薬物の塩と、ポリマーとの間での化学的相互作用は何ら認められなかった。ペースト状配合物からのリン酸塩緩衝液へのゲンタマイシンの放出速度が図１４に示される。２０％のゲンタマイシンを有する配合物は、１０％のゲンタマイシンを有する配合物の放出プロフィルよりも遅い放出プロフィルを有することを認めることができる。放出プロフィルにおけるこの違いは、ゲンタマイシンと、ポリマーの脂肪分解産物との間での塩形成のためであることが最も考えられる。両方の場合において、ポリマーの分子量を増大させると、ゲンタマイシンの放出速度が低下する。Ｍｎが１００００Ｄａを超えるゲンタマイシン負荷ポリマーは粘性であり、注入することが困難であった。従って、２０％のゲンタマイシンが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（Ｍｎ＝４５００）をさらなる研究のために選んだ。
【０１８１】
別のインビトロ放出研究において、ゲンタマイシンを２４ウエルトレイ（ウエルあたり１ｍｌの溶液）の中に放出させた。本研究で使用された配合物はおよそ５ｍｇの活性なゲンタマイシンを含有した。放出プロフィルは、より大量の水において放出するときに得られる放出プロフィルと類似していた。例えば、８日後では、負荷されたゲンタマイシンの９％（約０．４５ｍｇ）が放出された。全体的な結果は、長期間（例えば、６０日を超える期間）にわたるゲンタマイシンの絶え間ない放出を示しており、これは、慢性的な感染を治療するために、または、再発する感染を防止するために好都合なことである。緩衝剤溶液における放出されたゲンタマイシンの抗菌活性が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＴＳＢにおいて一晩インキュベーションし、細菌の生存性を求めることによって確認された。
【０１８２】
インビトロでの抗菌活性
ゲンタマイシンを含有するポリマーのインビトロ放出研究からの上清溶液をＳ．ａｕｒｅｕｓの培養液に加えた。集められた上清をＰＢＳで１００倍、１０００倍および１００００倍希釈し、１０６個のＳ．ａｕｒｅｕｓをＴＳＢに含有する９６ウエルマイクロタイター平底プレートにおけるウエルに加えた。プレートを、温度制御されたマイクロプレート分光光度計（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、米国）の内部で２４時間インキュベーションした。光学濃度（ＯＤ）の測定を６５０ｎｍで２時間毎に行って、ウエルにおける細菌濃度を求めた。相関が、フルオレスカミン法によって求められたゲンタマイシン濃度と、インビトロでの細菌作用との間で見出された。
【０１８３】
本研究で使用されたＳ．ａｕｒｅｕｓｕについてのゲンタマイシンの最小阻害濃度は２μｇ／ｍｌ〜４μｇ／ｍｌである。ＶＥＲＳＡｍａｘ分光光度計よる分析の結果が図１５にまとめられる。６日後および８日後で、ゲンタマイシンの濃度は、溶液が１００倍希釈（４．５ｘ１０−３ｍｇ／ｍｌ）および１０００倍希釈（４．５ｘ１０−４ｍｇ／ｍｌ）されたときにそれぞれ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを根絶するために十分であった（図１５におけるＡおよびＢ）。１００００倍希釈の場合（図１５におけるＣ）、濃度は阻害的ではなかった。ブランクＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ）（Ｍｎ＝４５００）を伴うコントロールウエルは細菌の成長に影響を及ぼさなかった。このウエルでは効果が何ら見出されなかった：Ｏ．Ｄ．がおよそ０．７であった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓをＴＳＢのみに含有するウエルでは、およそ０．６のＯ．Ｄ．が見出された。ゲンタマイシン放出の結果（図１４）および希釈された溶液による顕著な細菌阻害（図１５）を考慮すると、おそらくは、著しい抗菌活性がより早い段階での放出媒体において認められる。
【０１８４】
インビボ効力および注入部位での薬物濃度
１０％および２０％の硫酸ゲンタマイシンが負荷された注入可能なｐ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸エステル−無水物）の３：７（ｗ／ｗ）ポリマーおよび２：８（ｗ／ｗ）ポリマーを使用した。効力研究を、１６匹のオスＷｉｓｔａｒラットの両方の脛骨近位端において黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を感染させたラットに対して行った。脚を剃毛し、除毛し、アルコール消毒した。無菌状態を手術期間中に提供するために、動物を無菌ドレープの上に置き、身体を無菌シートで覆った。脚を無菌の切開ホイルで別々に覆った。近位側の脛骨骨幹端における皮膚および筋膜を長さ５ｍｍにわたって切開した。穴を、皮質骨および海綿骨を貫いて開けた（３ｍｍのチタンバー）。１ｍｌあたり１．０ｘ１０６コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を含有するＳ．ａｕｒｅｕｓの懸濁物を調製した。１０μｌの懸濁物を５０μｌのシリンジによりそれぞれの創傷部位に注入した。動物を、骨髄炎を発症させるために４週間維持した。この期間の後、患部肢のＸ線写真を撮影し、ラットは治療を受けた。配合物を試験群からのラットの感染骨に注入した。
【０１８５】
試験群はｐ（ＳＡ：ＲＡ）の注入を受けた。１０％のゲンタマイシンが負荷されたポリマーの１００μｌを２３Ｇのニードルにより感染骨に注入した。コントロール群は何ら治療を受けなかった。
【０１８６】
動物を屠殺した後、肢を手首および肘で関節離開した。それぞれの試料のＸ線写真を撮影した。２ｍｍの組織サンプルを、１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に埋め込み部位から採取した。組織を１ｍｌの規定生理的食塩水（ｐＨ７．４）においてホモジネートし、遠心分離した。上清を取り出し、Ａｂｂｏｔｔ ＤｉａｇｎｓｔｉｃｓからＴＤｘの商標で入手可能である蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）によって分析して、ゲンタマイシンの濃度を求めた。
【０１８７】
すべての動物において、細菌計数における著しい減少が、コントロール群と比較して見出された。ゲンタマイシンが、４週間後、分析された組織において見出され、微量が８週間後に観測された。
【０１８８】
ポリマー−ゲンタマイシンインプラントの毒性
オスのＷｉｓｔａｒラット（１０週齢）（Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）を特定病原体除去条件下で飼育し、マウスには、放射線照射された餌および酸性化水を、実験期間中を通して自由に摂取させた。Ｈｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）倫理委員会（国立衛生研究所承認番号：ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）は動物研究についての申請を検討し、研究が、研究室動物の管理および使用に関する基準に適合し得ることを評決している（倫理委員会−研究番号：ＭＤ−８０．０４−３）。
【０１８９】
２００μｌのゲンタマイシン負荷された半固体配合物（０％、１０％および２０％、ｗ／ｗ）を、３匹のＷｉｓｔａｒラットからなる２つの群の腹部の前方に１９Ｇのニードルにより皮下注入した。一方の群には、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）ブランクの２００μｌを含有する配合物が左側に埋め込まれ、２０％のゲンタマイシンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２００μｌが右側に埋め込まれた。第２の群には、ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）ブランクの２００μｌを含有する配合物が左側に埋め込まれ、１０％のゲンタマイシンが負荷されたｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の２００μｌが右側に埋め込まれた。動物を局所的毒性の徴候および体重減少について観察した。注入後６週間で、ラットを屠殺し、インプラントを化学的分析のために取り出し、周りの組織を４％中性緩衝化ホルムアルデヒドにおいて固定処理し、組織病理学的検査に供した。
【０１９０】
組織病理学的評価では、１０％または２０％のゲンタマイシン配合物がポリマーｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）に加えられた２つの群から採取されたサンプルにおいて、被膜組織反応の程度が、ブランクポリマーだけが存在したときに形成される被膜組織反応の程度に匹敵したことが示された。このことは、混合治療様式を適用したとき、有害な反応がないことを示唆する。形成された被膜は成熟コラーゲンの沈着物から主に構成され、これには、線維芽細胞、血管、および、まばらな組織球または他の単核細胞の存在が付随していた。何らかの活発な炎症反応または組織刺激の証拠は何ら、被膜内に、または、局所的被膜を越えて広がって存在していなかった。すべての場合において、被膜の厚さは類似していた。薄い包み込む被膜から典型的にはなる局所的な組織反応は、瘢痕化する亜慢性の炎症反応として解釈された。肉芽腫性異物、リンパ球様細胞の凝集、および／または、免疫学的刺激の証拠は何ら認められなかった。このことは、インプラントが十分に許容されたことを示している。
【０１９１】
骨とのポリマー（ポリ（ＲＡ−ＳＡ）（７０：３０））および２０％ゲンタマイシン負荷配合物の生体適合性を、ラットの脛骨に穴を開け、０．２ｍｌのポリマーまたは配合物を骨の中に注入することによって求めた。５匹のラットからなる群を本研究では使用した。骨を組織病理学的に分析し、ポリマーまたは配合物に起因すると考えられる毒性の証拠は何ら見出されなかった。ポリマーに対する応答で認められた炎症は、正常な機構による物体の積極的な除去と一致していた。ポリマーおよび配合物は埋め込み後の８週間後には骨から完全に除かれた。
【０１９２】
γ線照射に対する安定性
２０％の硫酸ゲンタマイシン（ＧＳ）を伴うＰ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）（ｗ／ｗ）を本研究では使用した。重合が完了した後、ＧＳをペースト状ポリマーに室温で加え、均一な混合物が達成されるまで機械的に混合した。１ｍｌの混合物を１ｍｌのロック式プラスチックシリンジに入れた。１ｍｌのブランクポリマーを含有するシリンジもまた調製した。すべてのポリマーに２．５Ｍｒａｄの吸収線量を６０Ｃｏ線源（４５００００Ｃｉ；８時間）によって照射した。照射をＳｏｒ−Ｖａｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．（Ｋｉｒｙａｔ Ｓｏｒｅｑ、Ｙａｖｎｅ、イスラエル）において行った。
【０１９３】
照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの分子量をＧＰＣによって測定した。照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの融点をＤＳＣによって測定した。照射の前後における負荷ポリマーおよびブランクポリマーの化学構造をＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって求めた。ゲンタマイシン含有量を、照射前のサンプルおよび照射後のサンプルをジクロロメタンに溶解し、薬物を２回蒸留水（ＤＤＷ）により３回抽出することによって求めた。抽出液を一緒にし、分光蛍光計を使用して分析した。
【０１９４】
照射後、配合物を、３７℃、２０℃、４℃および−１７℃で貯蔵した。非照射サンプルをコントロールとして使用した。種々の時点で、サンプルを照射配合物およびコントロール配合物から取り出し、上記の方法によって分析した。結果が表９に示される。
【０１９５】
いくつかの時点で、簡単な薬物放出研究を、貯蔵条件による薬物放出における起こり得る変化を検出するために行った。４℃および−１７℃で貯蔵された配合物の放出プロフィルが図１６に示される。ゲンタマイシンの放出はこれら２つの配合物では類似していた。サンプルをジクロロメタンに溶解し、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）により３回抽出した。図１６ａには、４℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出が示される。図１６ｂには、−１７℃で８週間にわたって貯蔵された配合物からのゲンタマイシンの放出が示される。照射サンプルおよび非照射サンプルの放出プロフィルは類似していた。このことは、照射はポリマーからの薬物の放出に影響を及ぼさなかったことを示している。２週間にわたる室温での貯蔵は、ゲンタマイシンの放出プロフィルに影響を及ぼさないようであった。照射配合物および非照射配合物についてのＩＲスペクトルおよびＮＭＲスペクトルには違いが何ら認められなかった。貯蔵期間中の分解を、無水物ピークの消失および１７００ｃｍ−１における酸ピークの出現をモニターすることによりＩＲ分光法によって追跡することができる。分解が、−１７℃で貯蔵された配合物については何ら示されなかった。４℃で貯蔵された配合物は、６週間後、酸のピークをもたらし、このピークは時間とともに増大した。
【０１９６】
実施例１１：リシノール酸オリゴマーを含有する液状ポリエステル
リシノール酸の直接の縮合によって調製された、Ｍｗが２２００および３６００であるリシノール酸オリゴマーを本研究では使用した。ヒドロキシ末端のＲＡオリゴマーを、ＲＡオリゴマーを、エチレングリコールまたはプロピレングリコールのエステルを形成するエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと反応することによって得た。このヒドロキシ末端のＲＡオリゴマーを、ＤＬ−ラクチド、カプロラクトンおよびグリコール酸ならびにそれらの混合物の開環重合のための開始剤として使用した。Ｂセグメントがリシノール酸オリゴマーであるＡＢＡトリブロックコポリマーを、ＨＯ末端のＡオリゴマーを、オクタン酸第一スズを触媒として使用してＤＬ−ラクチドと開環重合することによって得た。ＲＡオリゴマーおよびラクチドの間でのモル比により、分子量およびセグメント長さが決定された。２０％のＲＡオリゴマーを含有するＤＬ−ラクチドのトリブロックコポリマーは室温で液状であったし、水中でゲルを形成する。同様に、ペースト状ポリマーを、ＤＬ−ラクチドと、１つのヒドロキシル基を有するＲＡオリゴマーとのジブロックコポリマーから得た。
【０１９７】
ＲＡオリゴマーおよびヒドロキシル酸のランダムコポリマーを、乳酸、グリコール酸およびヒドロキシ酪酸とのリシノール酸オリゴマーの重縮合によって得た。この重合は、酸性触媒を用いてトルエン中で行われる。トルエンをエバポレーションした後、重合が、１０％未満の乳酸含有量でのペースト状ポリマーを得るために、１ｍｍＨｇの真空下で１３０℃で続けられる。粘性のコポリマーが、ヒドロキシル酸およびそのラクトンをポリエステルに共重合することから得られた。これらのポリマーは、身体に注入されたとき、粘度が増大し、取り込まれた薬物を、主に薬物の水溶性に依存して数週間および数ヶ月にわたって放出する。
【０１９８】
実施例１２．乳酸およびグリコール酸とのリシノール酸のポリエステルの合成および特徴づけ
Ｌ−乳酸（５０％水溶液）を使用前に一晩凍結乾燥した。ひまし油およびＬ−乳酸を、１：１０、１：５、２：５、３：５のｗ／ｗ比（ｗ／ｗ、ひまし油対ラクチド）で、触媒としての０．５％（ｗ／ｗ）のＨ３ＰＯ４と混合し、乾燥Ｎ２を流しながら１．５時間、１７０℃に加熱して、系を乾燥させた。１．５時間後、反応物を１５ｍＢａｒの真空につなぎ、反応を２４時間続けた。サンプルを３時間、５時間および７時間の重合のときに採取した。
【０１９９】
ポリマーの外観ならびに重量平均分子量および数平均分子量が表４に記載される。リシノール酸および乳酸のポリエステルもまた調製した。これらのポリマーの性質が表５に記載される。リシノール酸／ひまし油との乳酸の共重合により、所望される性質（例えば、柔軟性、疎水性および柔らかさなど）を有するポリマーが得られた。ポリマー鎖におけるリシノール酸の存在は、軟らかいポリマー、または、液状でさえあるポリマーを生じさせるためのポリマーの立体障害をもたらした。これらのペースト状ポリマーは、ポリマーを水溶液に沈めたとき、より硬い物質にゲル化した。これらのポリマーペーストを組織内に注入することにより、ポリマー配合物の注入部位での局在化がもたらされた。
【０２００】
３０：７０の比率（ｗ／ｗ）（３０％のひまし油またはリシノール酸）を含有するポリマーをＤＬ−乳酸およびグリコール酸ならびにそれらの混合物から合成した。すべてのポリマーが４０００の範囲でのＭｎの類似した分子量を示し、ペースト状の物質であった。ＤＬ−乳酸ポリマーはそれ以外のポリマーよりも液体様であった。すべてのポリマーが、水性媒体に室温で１時間入れたとき、その粘度を変化させ、ゲル化する。
【０２０１】
実施例１３．リシノール酸および乳酸のポリエステルからのタキソールおよびメトトレキサートのインビトロでの放出
１０％（ｗ／ｗ）のタキソールおよび１０％（ｗ／ｗ）のメトトレキサートを含有する配合物を、薬物を、Ｍｎ＝３０００およびＭｗ＝７０００を有するポリ（乳酸：ひまし油）の６０：４０（ｗ／ｗ）比のコポリマーおよび７０：３０（ｗ／ｗ）比のコポリマーと混合することによって調製した。薬物を、乳鉢および乳棒を使用してポリマーと室温で混合した。溶媒または熱は何ら使用しなかった。ペースト状配合物における薬物粒子の粒子サイズは、ＳＥＭ分析によって決定されたとき、１００ミクロン未満であった。
【０２０２】
１ｍＬのシリンジに薬物−ポリマー配合物を充填し、それぞれ１０ｍｇのサンプルを、ｐＨが７．４である５０ｍｌのリン酸塩緩衝液に３７℃で注入した。緩衝溶液はまた、０．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有した。ＳＤＳは、放出されたパクリタキセルの溶解性を増大させるために添加された。緩衝液を、最初の１週間は毎日取り替え、その後は３日毎に取り替えた。パクリタキセルおよびメトトレキサートの放出をＨＰＬＣによってモニターした。タキソールおよびメトトレキサートがポリマー配合物から一定の速度で放出され、ポリマーが、崩壊することなく、一様な半固体の液滴として残留した。負荷されたメトトレキサートの２５％が約２０日間にわたって一定の速度で放出され、一方、負荷されたパクリタキセルの５％および１０％が約３０日後および６０日後にわたってそれぞれ放出された。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）の粘度を種々の剪断速度において温度（℃）の関数として示すグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図２】種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリ（セバシン酸−ｃｏ−リシノール酸）（ｐ（ＳＡ：ＲＡ））（２：８）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図３】種々の剪断速度における温度（℃）の関数としてのポリリシノール酸（ＰＲＡ）の粘度のグラフである（加えられた剪断速度が角括弧で示される）。
【図４】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：４）をリン酸塩緩衝液にさらした前後における、剪断速度（ｓｅｃ−１）と、剪断応力（ダイン／ｃｍ２）との間における関係を示すグラフである。
【図５】５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）からのパクリタキセルのインビトロでの累積放出を示す。
【図６ａ】分解途中のサンプルの重量減少によってモニターされる、無負荷のＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）、ならびに、５％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗのパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）のインビトロでの加水分解による分解を示す。
【図６ｂ】インビトロでの加水分解による分解の期間中でのサンプルにおけるパクリタキセルの蓄積（ＮＰ ＨＰＬＣによって求められる）を示す。
【図７】Ｃ３Ｈ正常マウスの皮下に注入されたブランクポリマーおよびパクリタキセル配合物（５％および１０％）のインビボでの分解を示す。
【図８】Ｃ３ＨマウスにおけるＭＢＴ異所性モデルに対するパクリタキセル配合物のインビボ抗腫瘍効果を示す。
【図９】Ｃ５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの生存の進展を示す。
【図１０】５７Ｂｌ／６ラットにＢ１６Ｆ１が接種された後、異なる濃度のパクリタキセルが負荷されたＰ（ＳＡ：ＲＡ）（２：８）により治療されたときの腫瘍量の進展を示す。
【図１１】実験期間中のすべての治療群におけるラットの平均体重の進展を示す。標準偏差が誤差棒によって示される。
【図１２】種々の治療群についての死亡時の腫瘍体積の進展を示す。
【図１３】ｐ（ＳＡ：ＲＡ）（２０：８０）（ｗ／ｗ）およびｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３０：７０）（ｗ／ｗ）からの、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、インスリン、インターフェロン−α（「ＩＮＦ−ａｌｐｈａ」）およびインターロイキンのパーセントインビトロ放出を時間（ｈｏｕｒｓ）の関数として示す。
【図１４】異なる分子量のｐ（ＳＡ：ＲＡ）（３：７）からのゲンタマイシンのパーセントインビトロ放出を時間（日数）の関数として示す。
【図１５】３つの異なる希釈物について時間（日数）に対する細菌濃度（光学濃度）を示すグラフである。
【図１６】４℃および−１７℃で８週間にわたって貯蔵された後でのゲンタマイシンの放出を時間（日数）の関数として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、水溶液においてゲル化する、疎水性ポリマー組成物。
【請求項２】
組成物はリシノール酸エステルオリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシル基または１つのさらなるカルボン酸基を有する脂肪族分子とから構成される、ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）を含み、組成物は３７℃未満の温度で液体またはペーストである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの活性薬剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
治療剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ポリ（エステル−無水物）は、少なくとも４個の炭素原子を有するアルカン二酸モノマーユニットを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
アルカン二酸モノマーユニットは、構造ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨの直鎖のジカルボン酸（式中、ｘは２〜１６の整数である）、フマル酸、またはマレイン酸からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）は、２〜６個の炭素原子を有する１つ以上のヒドロキシアルカン酸モノマーユニットを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットは、乳酸、グリコール酸、４−ヒドロキシ酪酸、および５−ヒドロキシ吉草酸からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
エステル結合によって連結される少なくとも平均で１．５個のリシノール酸ユニットを有するリシノール酸エステルオリゴマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
治療剤、診断剤、および予防薬剤は、小さな薬物分子、ペプチド、タンパク質、オリゴおよびポリヌクレオチド、除草剤、および殺虫剤からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
治療剤、診断剤、および予防薬剤は、鎮痛剤、局所麻酔剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗生物質、成長ホルモン、抗ガン剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリマー組成物は手術シーラントとして適用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリマー組成物は臓器間の接着を低下させるためのバリアとして適用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１５】
ポリマー組成物は被覆として使用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリマーは１００００以上の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリマーは４０以上の重合度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ポリマーは約１２週間で生分解する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中に薬剤を取り込むことを含む、生物活性剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤の送達のための配合物を作製する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、治療剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤の送達のための方法。
【請求項２１】
組成物は注入または埋め込みによって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療剤は抗ガン剤であり、組成物は固形腫瘍を治療するために投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
治療剤は抗生物質であり、組成物は骨感染を治療するために投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
３７℃未満の温度で液体またはペーストであり、水溶液においてゲル化する、疎水性ポリマー組成物。
【請求項２】
組成物はリシノール酸エステルオリゴマーと、少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのヒドロキシル基または１つのさらなるカルボン酸基を有する脂肪族分子とから構成される、ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）を含み、組成物は３７℃未満の温度で液体またはペーストである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの活性薬剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
治療剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ポリ（エステル−無水物）は、少なくとも４個の炭素原子を有するアルカン二酸モノマーユニットを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
アルカン二酸モノマーユニットは、構造ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨの直鎖のジカルボン酸（式中、ｘは２〜１６の整数である）、フマル酸、またはマレイン酸からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ポリエステルまたはポリ（エステル−無水物）は、２〜６個の炭素原子を有する１つ以上のヒドロキシアルカン酸モノマーユニットを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットは、乳酸、グリコール酸、４−ヒドロキシ酪酸、および５−ヒドロキシ吉草酸からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
エステル結合によって連結される少なくとも平均で１．５個のリシノール酸ユニットを有するリシノール酸エステルオリゴマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
治療剤、診断剤、および予防薬剤は、小さな薬物分子、ペプチド、タンパク質、オリゴおよびポリヌクレオチド、除草剤、および殺虫剤からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
治療剤、診断剤、および予防薬剤は、鎮痛剤、局所麻酔剤、抗感染剤、抗炎症剤、抗生物質、成長ホルモン、抗ガン剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリマー組成物は手術シーラントとして適用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリマー組成物は臓器間の接着を低下させるためのバリアとして適用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１５】
ポリマー組成物は被覆として使用される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリマーは１００００以上の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリマーは４０以上の重合度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ポリマーは約１２週間で生分解する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中に薬剤を取り込むことを含む、生物活性剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤の送達のための配合物を作製する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、治療剤、診断剤、および予防薬剤からなる群から選択される薬剤の送達のための方法。
【請求項２１】
組成物は注入または埋め込みによって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療剤は抗ガン剤であり、組成物は固形腫瘍を治療するために投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
治療剤は抗生物質であり、組成物は骨感染を治療するために投与される、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００９−５１００４８（Ｐ２００９−５１００４８Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２９０２（Ｐ２００８−５３２９０２）
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３５４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１０６９４
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０８０９３７３５）エフラット バイオポリマーズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３５４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１０６９４
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０８０９３７３５）エフラット バイオポリマーズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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