ゲル非含有ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー
本発明は、単鎖鋳型に沿った二本鎖伸長の連続的サイクルを行なうことにより、核酸配列を決定する方法を提供する。該サイクルは、伸長、ライゲーション、および好ましくは、切断の工程を含む。ある特定の実施形態において、該方法では、ホスホロチオレート結合を含有する伸長プローブを利用し、かかる連結を切断するのに適した試薬を用いる。ある特定の実施形態において、該方法では、無塩基残基または損傷塩基を含有する伸長プローブを利用し、ヌクレオシドと無塩基残基間の連結を切断するのに適した試薬および／または損傷塩基を核酸から除去するのに適した試薬を用いる。本発明は、少なくとも２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを用いて配列に関する情報を決定する方法を提供する。ある特定の実施形態において、該方法により、各サイクルで複数の鋳型内のヌクレオチドの各々から２ビット未満の情報が取得される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドチドに沿って伸長させる工程、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｂ） 該ポリヌクレオチドチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｃ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することにより、伸長可能なプローブ末端を生成させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型ポリヌクレオチドを伸長させる前に、該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合し、前記鋳型がビオチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材が実質的に平面状で剛性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 鋳型ポリヌクレオチドチドにハイブリダイズされたプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程；
（ｂ） 伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｃ） 該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートしたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチド残基であるかのであるかのいずれかである、該鋳型ポリヌクレオチドチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ） 該鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定する工程が、前記伸長不可能な部分を除去すること、および前記伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを核酸ポリメラーゼにより、１種類以上の標識された連鎖停止ヌクレオシド三リン酸の存在下で伸長させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライゲーション工程において伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｆ）前記ライゲートされたプローブおよび前記初期オリゴヌクレオチドを前記鋳型から除去する工程；（ｇ）前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた第２のオリゴヌクレオチドを用いて工程（ａ）を反復する工程；ならびに（ｈ）工程（ｂ）〜（ｅ）を反復する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた初期オリゴヌクレオチドを用いて複数回反復される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
各反復で、前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライゲーション工程において、伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、
（ａ） 前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ） プローブ−鋳型二本鎖を形成する工程
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ） 半固相支持体内または該支持体上に固定化されているか、あるいは実質的に平面状で剛性の基材に結合されている微粒子に結合された鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程
（ｃ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは必要に応じて切れやすい連結を含む、工程；
（ｄ） 該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｅ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記伸長させる工程が半固相支持体内で行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビーズに結合した一本鎖鋳型が、前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 該鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程であって、ここで、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有し、該プローブ鋳型二本鎖は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している微粒子に結合されている、工程；
（ｂ） 伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、工程；
（ｃ） 該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートされたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチド残基であるかのいずれかである鋳型ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし該伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ） 鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
工程（ａ）の前に、鋳型とブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ライゲートする工程および前記生成させる工程が、半固相支持体内で行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 微粒子の存在下、エマルジョンの区画内で、該微粒子に結合した鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有する微粒子が生成されるように、鋳型ポリヌクレオチド分子を増幅する工程；
（ｂ） 該微粒子を該エマルジョンから回収する工程；
（ｃ） 該微粒子を、半固相支持体内または該支持体上に包埋させるか、該微粒子を基材に結合させる工程；
（ｄ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは切れやすい連結を含む、工程；
（ｅ） 該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｆ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｄ）および（ｅ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
（ｉ）異なる配列を含む複数の鋳型ポリヌクレオチド分子がエマルジョンの個々の区画内で増幅され；（ｉｉ）各々が自身に結合され鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有し、該クローン性の集団が異なる配列を有する複数の微粒子が、エマルジョンから回収され、前記支持体内または該支持体上に包埋され、そして（ｉｉｉ） 工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が、複数の配列が並行して決定されるように、包埋または結合された微粒子に結合されたクローン性の集団において並行して行なわれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションのメンバーであり、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ） 該オリゴヌクレオチドプローブと会合した標識を検出する工程；ならびに
（ｃ） プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに
（ｄ） 該ヌクレオチドの配列に対する１つ以上の可能性を排除するためにプローブファミリーの該序列リスト名を使用する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
工程（ｄ）が、前記配列を決定するためにプローブファミリーの前記序列リスト名をデコード化することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた初期オリゴヌクレオチドプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供することを含み、伸長させる工程が、該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせて、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成させることを含み、さらに、伸長させる工程においてオリゴヌクレオチドプローブが該伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、任意の残留する伸長可能な末端をキャッピングする工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
各プローブファミリー内の前記オリゴヌクレオチドプローブが伸長不可能な部分を一方の末端に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
各検出工程後に、（ｆ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、前記最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長可能な末端を、該最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブ上に生成させることをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがホスホロチオレート結合を含み、前記伸長可能なプローブ末端が、該ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断させることにより生成される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記伸長させる工程が半固相支持体内または該支持体上で行なわれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記コレクションが２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記コレクションが３つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記コレクションが４つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
前記コレクションが、４つより多くの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ヌクレオシドが独立しては選択されない拘束部分を含み、配列が異なる拘束部分を有するオリゴヌクレオチドプローブが、コード化に従ってプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドが既知の正体を有し、デコード化する工程が：
（ｉ） 正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内の該ヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ） どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ） 配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
（ａ） ヌクレオチドが既知の正体を有するように、前記鋳型内のヌクレオチドの該正体を決定する工程をさらに含み、ここで前記デコード化する工程は：
（ｉ） 正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内のヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ） どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ） 配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
前記決定する工程が、鋳型プローブ二本鎖を標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼの存在下、該二本鎖に隣接する位置の該鋳型に相補的である場合は、標識されたヌクレオチドの組込みを可能にする条件下で接触させることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記デコード化する工程が、少なくとも１つの候補配列をプローブファミリーの前記序列リスト名から生成させること；および前記鋳型内のヌクレオチドの配列として候補配列を選択することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
前記生成させる工程が、少なくとも４つの候補配列を生成させることを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記生成させる工程が、
（ｉ） 正体をヌクレオチドの配列内の第１のヌクレオチドと仮定すること；
（ｉｉ） 可能な正体を該第１のヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて隣接するヌクレオチドと決定することにより、正体を第１のヌクレオチドに隣接するヌクレオチド割り当てること；
（ｉｉｉ） その正体が最も新しく割り当てられたヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて可能な正体を後続のヌクレオチドと決定することにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てること；
（ｉｖ） 候補配列が生成されるまで工程（ｉｉｉ）を反復すること；ならびに
（ｖ） 工程（ｉ）〜（ｉｖ）を反復することであって、ここで、各反復において、所望数の候補配列が生成されるまで、異なる正体を該第１のヌクレオチドと仮定すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記選択工程が、少なくとも１つの候補配列を１つ以上の既知配列と比較すること、および該既知配列の１つ以上と所定の程度の同一性を示すか、またはほとんどほぼ同一である候補配列を選択することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記鋳型が、目的の生物体由来のものであり、前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、該生物体から得られた配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、各々が、測定対象のポリヌクレオチドの配列の可能な択一的な配列を含む複数の比較配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択工程が、
（ｉ） 第２のプローブファミリーの序列リスト名を、前記鋳型から、識別可能に標識されたコードされたプローブのファミリーの第２のコレクションを用いて得ることであって、ここで、該プローブファミリーの該第２のコレクション内のプローブファミリーは、プローブファミリーの前記第１のコレクション内のプローブファミリーと異なるようにコードされていること；
（ｉｉ） 少なくとも１つの比較配列を、該第２のプローブファミリーの序列リスト名から生成させること；
（ｉｉｉ） 候補配列の少なくとも１つの一部分を比較配列の少なくとも１つの一部分と比較すること；ならびに
（ｉｖ） 所定のレベルの同一性を示すか、または該鋳型内のヌクレオチドの配列として工程（ｃ）で比較される部分において、該比較配列とほとんどほぼ同一である候補配列を選択すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記比較される部分が単一のジヌクレオチドである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２のプローブファミリーの序列リスト名が、単一の要素のみを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
各プローブファミリー内のオリゴヌクレオチドプローブが、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、ＸＹはプローブの拘束部分であり、ここで、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立しては選択されないヌクレオシドを表し、ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｋは１〜１００（両端を含む）であり、ただし、検出可能な部分は、Ｙ上に、または（Ｎ）ｋの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）
を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
前記切れやすい連結がホスホロチオレート連結である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記検出可能な部分が、切断可能なリンカーに結合されているか、光退色性であるか、またはその両方である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記切断可能なリンカーがジスルフィド結合を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
４つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーが使用され、プローブの拘束部分の異なる配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８４】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） 二本鎖部分を含むプローブ−鋳型複合体を伸長可能な末端と、および目的の配列決定対象の単鎖部分を少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーと、ハイブリダイゼーションが該鋳型の該二本鎖部分に直接隣接する部分に相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドプローブ間で起こるように接触させる工程であって、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ） ハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせ、それにより、伸長された二本鎖を含むプローブ−鋳型複合体を生成させる工程；
（ｃ） 該ライゲートされたプローブと会合した標識を検出する工程；
（ｄ） 伸長可能なプローブ末端が既に存在しない場合は、該伸長可能なプローブ末端を該伸長された二本鎖上に生成させる工程；ならびに
（ｅ） プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで（ａ）〜（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項８６】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
オリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） 伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルを行なう工程であって、ここで、該検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの該鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含み、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；ならびに
（ｂ） 工程（ａ）で得られた情報を少なくとも１ビットのさらなる情報と組み合わせて該配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１ビットのさらなる情報が、前記鋳型内のヌクレオチドの正体、候補配列を少なくとも１つの既知配列と比較することにより得られる情報；およびオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第２のコレクションを用いて該方法を反復することにより得られる情報からなる群より選択される項目を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
複数の鋳型ポリヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ） 複数の微粒子と半固相支持体とを接触させる工程であって、該微粒子の少なくとも一部は、それに結合した鋳型を有し、該半固相支持体は、該半固相支持体に結合しているか、または該半固相支持体内に包埋したプライマーを有し、該鋳型が該プライマーにハイブリダイズする、工程；ならびに
（ｂ） 該プライマーを伸長して、該微粒子に結合した該鋳型に相補的な鋳型を形成する工程
を含む、方法。
【請求項９１】
前記プライマーを伸長させることによって生成した前記鋳型を増幅する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
増幅する工程が、ＲＣＡを実行することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記半固相支持体から前記微粒子を放出させる工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記鋳型を増幅する工程の後で、必要に応じて、前記プライマーを伸長させることによって生成した該鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
微粒子の集団を調製するための成分のコレクションであって、
（ａ） 個々の微粒子が、該微粒子に結合されたプライマーの少なくとも第１および第２の集団を有し、該第１の集団のプライマーが、該第２の集団のプライマーと異なる配列を有する、微粒子の集団；
（ｂ） 各核酸断片が目的の第１および第２の核酸セグメントを含み、該第１および第２のプライマーが、該目的の第１および第２の核酸セグメントの外部に位置する普遍配列に対応する、核酸断片のライブラリー；ならびに
（ｃ） 該核酸断片の共通領域に結合するブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、コレクション。
【請求項９６】
前記目的の第１および第２の核酸セグメントが５’および３’タグの１対のタグである、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９７】
前記核酸断片が、核酸セグメントの各々がＰＣＲを用いて増幅され得るように、増幅プライマーのための１つ以上のプライマー結合部位を含む内部アダプターを含む、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９８】
前記内部アダプター内のプライマー結合部位に相補的なプライマーをさらに含む、請求項９７に記載の成分のコレクション。
【請求項９９】
実質的に同一な鋳型分子の集団を含む鋳型であって、該鋳型分子は、少なくとも１つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、該共通領域にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、鋳型。
【請求項１００】
前記鋳型分子が、対合したタグライブラリーのメンバーである、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０１】
前記鋳型分子が、ＲＣＡを使用して増幅される、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０２】
前記鋳型分子は、少なくとも２つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、少なくとも２つの共通領域の各々にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０３】
請求項９９に記載の集団が結合した、支持体または基材。
【請求項１０４】
微粒子である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０５】
半固相支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０６】
実質的に平面状で剛性の支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０７】
前記鋳型が、目的の種々のセグメントを含む、請求項９９に記載の鋳型のコレクション。
【請求項１０８】
請求項１０４に記載の微粒子の集団を含むアレイであって、該微粒子は、それに結合した目的の種々のセグメントを含む鋳型を有する、アレイ。
【請求項１０９】
前記微粒子は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している、請求項１０８に記載のアレイ。
【請求項１１０】
基材に結合した微粒子であり、該微粒子は、それに結合した鋳型を有する、微粒子。
【請求項１１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１３】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋いでいる、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１４】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋ぎ、該鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって該基材および該微粒子に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１５】
請求項１１０に記載の微粒子の集団であって、目的の種々のセグメントと共通配列とを含む鋳型が、異なる微粒子に結合している、微粒子の集団。
【請求項１１６】
アレイを調製するための方法であって、
鋳型が結合した微粒子の集団を提供する工程であって、該鋳型がビオチンを含む、工程；ならびに
ビオチンがビオチン結合タンパク質に結合する条件下で、該微粒子と該ビオチン結合タンパク質を含む基材とを接触させ、それによって微粒子のアレイを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項１１７】
前記鋳型にブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１】
鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドチドに沿って伸長させる工程、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｂ） 該ポリヌクレオチドチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｃ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することにより、伸長可能なプローブ末端を生成させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型ポリヌクレオチドを伸長させる前に、該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合し、前記鋳型がビオチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材が実質的に平面状で剛性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 鋳型ポリヌクレオチドチドにハイブリダイズされたプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程；
（ｂ） 伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは微粒子に結合し、該微粒子は基材に結合し、該微粒子は半固体支持体に固定化されていない、工程；
（ｃ） 該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートしたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチドチド内のヌクレオチド残基であるかのであるかのいずれかである、該鋳型ポリヌクレオチドチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ） 該鋳型ポリヌクレオチドチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定する工程が、前記伸長不可能な部分を除去すること、および前記伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを核酸ポリメラーゼにより、１種類以上の標識された連鎖停止ヌクレオシド三リン酸の存在下で伸長させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライゲーション工程において伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｆ）前記ライゲートされたプローブおよび前記初期オリゴヌクレオチドを前記鋳型から除去する工程；（ｇ）前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた第２のオリゴヌクレオチドを用いて工程（ａ）を反復する工程；ならびに（ｈ）工程（ｂ）〜（ｅ）を反復する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記鋳型ポリヌクレオチドチドと異なる配列に結合させた初期オリゴヌクレオチドを用いて複数回反復される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記伸長プローブが伸長不可能な部分を一方の末端に有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
各反復で、前記同定する工程が、最も新しくライゲートされた伸長プローブに結合された標識を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライゲーション工程において、伸長プローブが前記伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブをキャッピングする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記生成させる工程が、前記ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長させることができない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブ−鋳型二本鎖を提供する前に、
（ａ） 前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ） プローブ−鋳型二本鎖を形成する工程
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列の同定方法であって、以下：
（ａ） 半固相支持体内または該支持体上に固定化されているか、あるいは実質的に平面状で剛性の基材に結合されている微粒子に結合された鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）該鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程
（ｃ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは必要に応じて切れやすい連結を含む、工程；
（ｄ） 該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｅ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記伸長させる工程が半固相支持体内で行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
一本鎖鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビーズに結合した一本鎖鋳型が、前記微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 該鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供する工程であって、ここで、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有し、該プローブ鋳型二本鎖は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している微粒子に結合されている、工程；
（ｂ） 伸長オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートし、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、ここで、該伸長プローブはホスホロチオレート結合を含む、工程；
（ｃ） 該伸長された二本鎖において、（１）ライゲートされたばかりの該伸長プローブに相補的であるか、もしくは（２）該伸長されたオリゴヌクレオチドプローブのすぐ下流にある該鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチド残基であるかのいずれかである鋳型ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）もし該伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、最後の伸長プローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を生成させる工程；ならびに
（ｅ） 鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
工程（ａ）の前に、鋳型とブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ライゲートする工程および前記生成させる工程が、半固相支持体内で行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
鋳型ポリヌクレオチドのヌクレオチドの配列の決定方法であって、以下：
（ａ） 微粒子の存在下、エマルジョンの区画内で、該微粒子に結合した鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有する微粒子が生成されるように、鋳型ポリヌクレオチド分子を増幅する工程；
（ｂ） 該微粒子を該エマルジョンから回収する工程；
（ｃ） 該微粒子を、半固相支持体内または該支持体上に包埋させるか、該微粒子を基材に結合させる工程；
（ｄ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは切れやすい連結を含む、工程；
（ｅ） 該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；ならびに
（ｆ） 該ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ｄ）および（ｅ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
（ｉ）異なる配列を含む複数の鋳型ポリヌクレオチド分子がエマルジョンの個々の区画内で増幅され；（ｉｉ）各々が自身に結合され鋳型ポリヌクレオチドのクローン性の集団を有し、該クローン性の集団が異なる配列を有する複数の微粒子が、エマルジョンから回収され、前記支持体内または該支持体上に包埋され、そして（ｉｉｉ） 工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が、複数の配列が並行して決定されるように、包埋または結合された微粒子に結合されたクローン性の集団において並行して行なわれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記微粒子に結合した一本鎖鋳型が、該微粒子を前記基材に繋いでいる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） オリゴヌクレオチドプローブを該鋳型ポリヌクレオチドにライゲートさせ、伸長された二本鎖を形成することにより、初期オリゴヌクレオチドを該鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長させる工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブは、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションのメンバーであり、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ） 該オリゴヌクレオチドプローブと会合した標識を検出する工程；ならびに
（ｃ） プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに
（ｄ） 該ヌクレオチドの配列に対する１つ以上の可能性を排除するためにプローブファミリーの該序列リスト名を使用する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
工程（ｄ）が、前記配列を決定するためにプローブファミリーの前記序列リスト名をデコード化することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた初期オリゴヌクレオチドプローブであって、伸長可能な末端を有するプローブを含むプローブ−鋳型二本鎖を提供することを含み、伸長させる工程が、該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせて、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成させることを含み、さらに、伸長させる工程においてオリゴヌクレオチドプローブが該伸長可能な末端にライゲートされなかった場合はいつでも、任意の残留する伸長可能な末端をキャッピングする工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
各プローブファミリー内の前記オリゴヌクレオチドプローブが伸長不可能な部分を一方の末端に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
各検出工程後に、（ｆ）もし伸長可能な末端が既に存在しない場合は、生成される末端が、前記最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブがライゲートされた末端と異なるように、伸長可能な末端を、該最も新しくライゲートされたオリゴヌクレオチドプローブ上に生成させることをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがホスホロチオレート結合を含み、前記伸長可能なプローブ末端が、該ホスホロチオレート結合を、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｄからなる群より選択される原子を含む切断剤で切断させることにより生成される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記切断剤がＡｇＮＯ３である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記伸長させる工程が半固相支持体内または該支持体上で行なわれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記鋳型が、実質的に平面状で剛性の基材に結合された微粒子に結合されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記コレクションが２つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記コレクションが３つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記コレクションが４つの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
前記コレクションが、４つより多くの識別可能に標識されたプローブファミリーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ヌクレオシドが独立しては選択されない拘束部分を含み、配列が異なる拘束部分を有するオリゴヌクレオチドプローブが、コード化に従ってプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドが既知の正体を有し、デコード化する工程が：
（ｉ） 正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内の該ヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ） どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ） 配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
（ａ） ヌクレオチドが既知の正体を有するように、前記鋳型内のヌクレオチドの該正体を決定する工程をさらに含み、ここで前記デコード化する工程は：
（ｉ） 正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と一致するか、およびその近位ヌクレオチドが、既知の正体のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列を調べることにより、既知の正体のヌクレオチドに隣接する該鋳型内のヌクレオチドに割り当てる工程；
（ｉｉ） どの正体が、その近位ヌクレオチドが後続のヌクレオチドに対向してライゲートされたプローブの拘束部分の可能な配列と一致するかを調べることにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てる工程；ならびに
（ｉｉｉ） 配列が決定されるまで工程（ｉｉ）を反復する工程
を含む
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
前記決定する工程が、鋳型プローブ二本鎖を標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼの存在下、該二本鎖に隣接する位置の該鋳型に相補的である場合は、標識されたヌクレオチドの組込みを可能にする条件下で接触させることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記デコード化する工程が、少なくとも１つの候補配列をプローブファミリーの前記序列リスト名から生成させること；および前記鋳型内のヌクレオチドの配列として候補配列を選択することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
前記生成させる工程が、少なくとも４つの候補配列を生成させることを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記生成させる工程が、
（ｉ） 正体をヌクレオチドの配列内の第１のヌクレオチドと仮定すること；
（ｉｉ） 可能な正体を該第１のヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて隣接するヌクレオチドと決定することにより、正体を第１のヌクレオチドに隣接するヌクレオチド割り当てること；
（ｉｉｉ） その正体が最も新しく割り当てられたヌクレオチドに対応するプローブファミリー名に基づいて可能な正体を後続のヌクレオチドと決定することにより、正体を後続のヌクレオチドに割り当てること；
（ｉｖ） 候補配列が生成されるまで工程（ｉｉｉ）を反復すること；ならびに
（ｖ） 工程（ｉ）〜（ｉｖ）を反復することであって、ここで、各反復において、所望数の候補配列が生成されるまで、異なる正体を該第１のヌクレオチドと仮定すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記選択工程が、少なくとも１つの候補配列を１つ以上の既知配列と比較すること、および該既知配列の１つ以上と所定の程度の同一性を示すか、またはほとんどほぼ同一である候補配列を選択することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記鋳型が、目的の生物体由来のものであり、前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、該生物体から得られた配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記比較工程が、少なくとも１つの候補配列を、各々が、測定対象のポリヌクレオチドの配列の可能な択一的な配列を含む複数の比較配列を含むデータベース内の配列と比較することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択工程が、
（ｉ） 第２のプローブファミリーの序列リスト名を、前記鋳型から、識別可能に標識されたコードされたプローブのファミリーの第２のコレクションを用いて得ることであって、ここで、該プローブファミリーの該第２のコレクション内のプローブファミリーは、プローブファミリーの前記第１のコレクション内のプローブファミリーと異なるようにコードされていること；
（ｉｉ） 少なくとも１つの比較配列を、該第２のプローブファミリーの序列リスト名から生成させること；
（ｉｉｉ） 候補配列の少なくとも１つの一部分を比較配列の少なくとも１つの一部分と比較すること；ならびに
（ｉｖ） 所定のレベルの同一性を示すか、または該鋳型内のヌクレオチドの配列として工程（ｃ）で比較される部分において、該比較配列とほとんどほぼ同一である候補配列を選択すること
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記比較される部分が単一のジヌクレオチドである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２のプローブファミリーの序列リスト名が、単一の要素のみを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
各プローブファミリー内のオリゴヌクレオチドプローブが、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’（式中、Ｎは任意のヌクレオシド表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能でない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、ＸＹはプローブの拘束部分であり、ここで、ＸおよびＹは、同一または異なるが独立しては選択されないヌクレオシドを表し、ＸおよびＹは少なくとも２重に縮重しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切れやすい連結であり、ｋは１〜１００（両端を含む）であり、ただし、検出可能な部分は、Ｙ上に、または（Ｎ）ｋの任意のヌクレオシド上に、ＮＢの代わりまたはこれに加えて存在し得るものとする）
を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
前記切れやすい連結がホスホロチオレート連結である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記検出可能な部分が、切断可能なリンカーに結合されているか、光退色性であるか、またはその両方である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記切断可能なリンカーがジスルフィド結合を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
４つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーが使用され、プローブの拘束部分の異なる配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、表１に示す２４個のコード化の１つに従って第１、第２、第３および第４のプローブファミリーに割り当てられる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８４】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） 二本鎖部分を含むプローブ−鋳型複合体を伸長可能な末端と、および目的の配列決定対象の単鎖部分を少なくとも２つの識別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーと、ハイブリダイゼーションが該鋳型の該二本鎖部分に直接隣接する部分に相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドプローブ間で起こるように接触させる工程であって、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；
（ｂ） ハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドプローブを該伸長可能な末端にライゲートさせ、それにより、伸長された二本鎖を含むプローブ−鋳型複合体を生成させる工程；
（ｃ） 該ライゲートされたプローブと会合した標識を検出する工程；
（ｄ） 伸長可能なプローブ末端が既に存在しない場合は、該伸長可能なプローブ末端を該伸長された二本鎖上に生成させる工程；ならびに
（ｅ） プローブファミリーの序列リスト名が得られるまで（ａ）〜（ｄ）を反復する工程
を含む、方法。
【請求項８６】
前記検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの前記鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出工程が、２ビット未満の情報を同時に、前記鋳型内の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から取得することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
オリゴヌクレオチドプローブファミリーの第１のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列に関する情報を決定する方法であって、
（ａ） 伸長、ライゲーション、検出および切断の連続的サイクルを行なう工程であって、ここで、該検出工程が、平均２ビットの情報を同時に、任意の個々のヌクレオチドの２ビットの情報を取得することなく、少なくとも２つの該鋳型内のヌクレオチドの各々から取得することを含み、該鋳型は、それにハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、工程；ならびに
（ｂ） 工程（ａ）で得られた情報を少なくとも１ビットのさらなる情報と組み合わせて該配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１ビットのさらなる情報が、前記鋳型内のヌクレオチドの正体、候補配列を少なくとも１つの既知配列と比較することにより得られる情報；およびオリゴヌクレオチドプローブファミリーの第２のコレクションを用いて該方法を反復することにより得られる情報からなる群より選択される項目を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
複数の鋳型ポリヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ） 複数の微粒子と半固相支持体とを接触させる工程であって、該微粒子の少なくとも一部は、それに結合した鋳型を有し、該半固相支持体は、該半固相支持体に結合しているか、または該半固相支持体内に包埋したプライマーを有し、該鋳型が該プライマーにハイブリダイズする、工程；ならびに
（ｂ） 該プライマーを伸長して、該微粒子に結合した該鋳型に相補的な鋳型を形成する工程
を含む、方法。
【請求項９１】
前記プライマーを伸長させることによって生成した前記鋳型を増幅する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
増幅する工程が、ＲＣＡを実行することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記半固相支持体から前記微粒子を放出させる工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記鋳型を増幅する工程の後で、必要に応じて、前記プライマーを伸長させることによって生成した該鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
微粒子の集団を調製するための成分のコレクションであって、
（ａ） 個々の微粒子が、該微粒子に結合されたプライマーの少なくとも第１および第２の集団を有し、該第１の集団のプライマーが、該第２の集団のプライマーと異なる配列を有する、微粒子の集団；
（ｂ） 各核酸断片が目的の第１および第２の核酸セグメントを含み、該第１および第２のプライマーが、該目的の第１および第２の核酸セグメントの外部に位置する普遍配列に対応する、核酸断片のライブラリー；ならびに
（ｃ） 該核酸断片の共通領域に結合するブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、コレクション。
【請求項９６】
前記目的の第１および第２の核酸セグメントが５’および３’タグの１対のタグである、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９７】
前記核酸断片が、核酸セグメントの各々がＰＣＲを用いて増幅され得るように、増幅プライマーのための１つ以上のプライマー結合部位を含む内部アダプターを含む、請求項９５に記載の成分のコレクション。
【請求項９８】
前記内部アダプター内のプライマー結合部位に相補的なプライマーをさらに含む、請求項９７に記載の成分のコレクション。
【請求項９９】
実質的に同一な鋳型分子の集団を含む鋳型であって、該鋳型分子は、少なくとも１つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、該共通領域にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、鋳型。
【請求項１００】
前記鋳型分子が、対合したタグライブラリーのメンバーである、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０１】
前記鋳型分子が、ＲＣＡを使用して増幅される、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０２】
前記鋳型分子は、少なくとも２つの共通領域および少なくとも１つの目的のセグメントを含み、該鋳型分子の少なくとも一部は、少なくとも２つの共通領域の各々にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを有する、請求項９９に記載の鋳型。
【請求項１０３】
請求項９９に記載の集団が結合した、支持体または基材。
【請求項１０４】
微粒子である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０５】
半固相支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０６】
実質的に平面状で剛性の支持体である、請求項１０１に記載の支持体または基材。
【請求項１０７】
前記鋳型が、目的の種々のセグメントを含む、請求項９９に記載の鋳型のコレクション。
【請求項１０８】
請求項１０４に記載の微粒子の集団を含むアレイであって、該微粒子は、それに結合した目的の種々のセグメントを含む鋳型を有する、アレイ。
【請求項１０９】
前記微粒子は、半固相支持体内または該支持体上に包埋されているか、あるいは基材に結合している、請求項１０８に記載のアレイ。
【請求項１１０】
基材に結合した微粒子であり、該微粒子は、それに結合した鋳型を有する、微粒子。
【請求項１１１】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１２】
前記微粒子が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって前記基材に結合し、該ビオチン結合タンパク質が、該基材に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１３】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋いでいる、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１４】
前記微粒子が、前記基材に結合した一本鎖鋳型に結合しており、それによって前記鋳型が該微粒子を該基材に繋ぎ、該鋳型が、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結によって該基材および該微粒子に結合している、請求項１１０に記載の微粒子。
【請求項１１５】
請求項１１０に記載の微粒子の集団であって、目的の種々のセグメントと共通配列とを含む鋳型が、異なる微粒子に結合している、微粒子の集団。
【請求項１１６】
アレイを調製するための方法であって、
鋳型が結合した微粒子の集団を提供する工程であって、該鋳型がビオチンを含む、工程；ならびに
ビオチンがビオチン結合タンパク質に結合する条件下で、該微粒子と該ビオチン結合タンパク質を含む基材とを接触させ、それによって微粒子のアレイを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項１１７】
前記鋳型にブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記鋳型を配列決定する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２４Ｆ】
【図２４Ｇ】
【図２４Ｈ】
【図２４Ｉ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２４Ｆ】
【図２４Ｇ】
【図２４Ｈ】
【図２４Ｉ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【公表番号】特表２００９−５３８１２３（Ｐ２００９−５３８１２３Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６７６６（Ｐ２００９−５０６７６６）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１４８９
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１４８９
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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