コイルドコイル構造を有するリポペプチドのヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子
本発明は、コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖と、該ペプチド鎖に共有結合で連結された、長いアルキルまたはアルケニル鎖を含む脂質部分と、ペプチド鎖に任意選択で連結された抗原とにより構成されるリポペプチドビルディングブロック；ならびに凝集によって形成されたリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子に関する。これらのバンドルおよび粒子の、ナノメートル規模の大きさおよび形状、水性の生理学的条件下における安定性、化学組成、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを組込む実現性、ならびに化学合成による生産は、該バンドルおよび粒子をワクチン送達手段として非常に適したものにしている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集してリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子となる、コイルドコイルドメインと任意選択で抗原とを含むリポペプチドビルディングブロックに関する。抗原を担持する合成ウイルス様粒子は、ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
単離された小さなペプチドおよびタンパク質が通常はごく低い免疫抗原性しか持たないことは良く知られている。有名なフロイントの完全アジュバントのような有毒なアジュバントが、動物体内でのサブユニットワクチンに対する免疫応答を刺激するために広く使用されているが、多くアジュバントはその有毒な副作用のためヒトで使用することができない。理想的状態は、外部アジュバントの使用を完全に回避することであろうが、これでは一般に不十分な免疫応答しか得られない。しかしながら、（ヒトの）免疫系は、例えばウイルス表面のような表面の全域に反復的な抗原構造を提示する病原体に対して強健な免疫応答を生じる［非特許文献１］。
【０００３】
リポソームは、薬物、核酸、および生物医薬品を含む医薬品の担体として過去３０年にわたって大きな注目を集めてきており、また抗原、核酸および薬物の送達媒体としてのリポソームの適用はよく知られている。特定の受容体を標的とするために、リポソームの表面にペプチドまたはタンパク質を結合させることでリポソームの特性を変化させることができ、これはプロテオリポソームとして知られる系を作り出す。ペプチドおよびタンパク質は、免疫応答を生じさせる目的でもリポソームに組み込まれてきた［非特許文献２、３］。ペプチドを脂質とコンジュゲートさせると、脂質が二分子膜に固定されてペプチドがリポソーム内にはめ込まれ易くなり、その結果リポソームの表面でペプチドが抗体によって認識されるようになる。一般的な送達媒体としてのリポソームの欠点の１つは、血中からの急速な消失および細網内皮系の細胞による捕捉が原因で、ｉｎ ｖｉｖｏで不安定なことである［非特許文献４］。
【０００４】
ワクチンの設計において、ファージを含む天然もしくは遺伝子組換え型のウイルスおよびキメラ体、または天然もしくは遺伝子組換え型のウイルス構成成分、例えばカプシドタンパク質、表面タンパク質および糖タンパク質、もしくはこれらのフラグメントから構成されるウイルス様粒子を使用することの潜在的な利点は、以前から認識されてきた［非特許文献５〜７］。そのようなウイルス様粒子の生産には、天然のウイルスが自己集合するプロセスが利用される。多くのウイルスの自己集合性の天然のコア構造を利用し、組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの粒子の表面上に１つ以上の抗原を提示することができる。これらのウイルス様粒子はサイズが大きく、構造が複雑であるため、化学合成によって入手することはできない。特許文献１、２は「合成ウイルス様粒子」に言及しているが、同文献で言及される粒子は、組換えＤＮＡ法および細胞を用いる方法を使用して作製された、天然もしくは遺伝子組換え型のウイルス粒子またはその構成成分に基づくものであり、化学合成によって生産された材料ではない。特許文献３には、組換え型シンビスウイルスを用いて例証された、抗原が規則正しい反復的な方法で付着された天然または非天然起源のコア粒子の使用について記載されている。
【０００５】
ナノテクノロジー上の適用のために、自己集合性のペプチドおよびタンパク質を設計するための相当な努力もなされてきた。ナノスケールの形態は、設計された両親媒性ペプチドをベースとして生産されており［非特許文献８］、例えばβストランド、βシートおよびαへリックスの二次構造がある［非特許文献９、１０］。ナノ構造を有する複合材料を調製するためのリポペプチドの使用の別の例は、スタップ（Stupp）および共同研究者の研究に見出される［非特許文献１１］。両親媒性ペプチドは、自己集合してナノファイバーとなることが早くに示されている［非特許文献１２］。
【０００６】
合成抗原を基にした有効なワクチンの設計における主な問題のうちの１つは、免疫原性が不十分なことであった。比較的小さな合成分子は、免疫原性が低い傾向にある。この不十分な免疫原性を克服する１つの方法は、破傷風菌毒素またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のようなタンパク質などの担体に合成抗原を共有結合でコンジュゲートすることである［非特許文献１３］。しかしながらこのコンジュゲートは、強い免疫応答を誘発するためにはなおアジュバント（例えばアラムまたはフロイントアジュバント）と一緒に動物に投与しなければならない。Ｂ細胞およびＴ細胞のエピトープを組み込んだ多重エピトープ構築物を生産するための、いくつかの他の方法が報告されている（［非特許文献１４］に総説がある）。
【０００７】
合成の細菌リポペプチド・アナログは、そのアジュバント効果について、またペプチド抗原の担体としてのいずれに関してもワクチン研究において広く注目されてきた［非特許文献１５］。脂質およびリポペプチドは、別の方法で弱いペプチド免疫原のアジュバントとして作用しうることが知られている［非特許文献１６、１７］。周知のアジュバント効果を備えた脂質がペプチドに連結されて、自身がアジュバントとして作用するワクチン候補が生成される、多くのリポペプチド構築物が報告されている。特によく研究されているのは、トリパルミトイル‐Ｓ‐グリセリルシステイン（Ｎ‐パルミトイル‐Ｓ‐（２，３‐ビス‐（Ｏ‐パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐システイニル‐またはＰａｍ３Ｃｙｓ）、およびジパルミトイル‐Ｓ‐グリセリルシステイン（２，３‐ビス‐（Ｏ‐パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐システイニル‐またはＰａｍ２Ｃｙｓ）である［非特許文献１５］。これらの脂質部分は、グラム陰性菌の内膜および外膜のリポタンパク質成分中に見られる。Ｎ末端に上記または関連するジアシル化もしくはトリアシル化されたＳ‐グリセリルシステイン残基を担持する合成リポペプチドは、Ｔｏｌｌ様受容体の特異的リガンドであることが示されている［非特許文献１８、１９］。さらに、ペプチド抗原をＰａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ２Ｃｙｓとコンジュゲートさせることは、自身がアジュバントとして作用する合成ワクチン候補の設計に適用されてきた［非特許文献２０〜２２］。特許文献４には、ペプチド部分がトリプルヘリックス構造を引き起こすことのできるコラーゲン様の配列をとりうるリポペプチドの、薬物ターゲティングを目的とした使用について記載されている。
【０００８】
コイルドコイル構造の設計について最近いくつかの総説が出されており［非特許文献２３］、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにはコイルドコイル、コラーゲンおよびエラストマーに費やされた巻もある［非特許文献２４］。多くの天然のウイルスおよび微生物が、自身の表面タンパク質（例えばインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、ヒト免疫不全ウイルス‐１（ＨＩＶ‐１）のｇｐ４１、または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦ糖タンパク質）の内部にコイルドコイル構造のペプチド配列を含んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開第９８／０１４５６４号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願公開第００／０３５４７９号パンフレット
【特許文献３】国際特許出願公開第００／３２２２７号パンフレット
【特許文献４】国際特許出願公開第９８／０７７５２号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ツィンカーナーゲル、Ｒ．（Zinkernagel, R.）、Science (1996), 171, 173-178
【非特許文献２】レッサーマン、Ｌ．（Leserman, L.）、J Liposome Res (2004), 14, 175-189
【非特許文献３】フリッシュ、Ｂ．（Frisch, B.）ら、Methods Enzymol. (2003), 373, 51-73
【非特許文献４】トルチリン、Ｖ．Ｐ．（Torchilin, V. P.）、Nat. Rev. Drug Discov. (2005), 4, 145-160
【非特許文献５】フェルネローバ、Ｄ．（Felnerova, D.）ら、Curr Opin Biotechnol (2004), 15, 518-529
【非特許文献６】ガルセア、Ｒ．Ｌ．（Garcea, R. L.）ら、Curr Opin Biotechnol (2004), 15, 513-517
【非特許文献７】ドアン、Ｌ．Ｘ．（Doan, L. X.）ら、Rev Med Virol (2005), 15, 75-88
【非特許文献８】レーヴィク、Ｄ．Ｗ．Ｐ．Ｍ．（Loewik, D. W. P. M.）ら、Chem. Soc. Rev. (2004), 33, 234-245
【非特許文献９】ラジャゴパル、Ｋ．（Rajagopal, K.）ら、Curr. Opin. Struct. Biol. (2004), 14, 480-486
【非特許文献１０】チュー、Ｒ．Ｓ．（Tu, R. S.）ら、Adv. Drug Deliv. Revs. (2004), 56, 1537-1563
【非特許文献１１】ベハンナ、Ｈ．Ａ．（Behanna, H. A.）ら、J. Am. Chem. Soc. (2005), 127, 1193-1200
【非特許文献１２】ハルトゲリンク、Ｊ．Ｄ．（Hartgerink, J. D.）ら、Science (2001), 294, 1684-1688
【非特許文献１３】ヘリングトン、Ｄ．Ａ．（Herrington, D. A.）ら、Nature (1987), 328, 257-259
【非特許文献１４】ジャクソン、Ｄ．Ｃ．（Jackson, D. C.）ら、Vaccine (1999), 18, 355-361
【非特許文献１５】ギールメッティ、Ｍ．（Ghielmetti, M.）ら、Immunobiology (2005), 210, 211-215
【非特許文献１６】ユング、Ｇ．（Jung, G.）ら、Angew. Chem. Int. Ed. (1985), 10, 872
【非特許文献１７】マルティノン、Ｆ．（Martinon, F.）ら、J. Immunol. (1992), 149, 3416
【非特許文献１８】ロイター、Ｆ．（Reutter, F.）ら、J. Pept. Res. (2005), 65, 375-383
【非特許文献１９】ビューウィット‐ベックマン、Ｕ．（Buwitt-Beckmann, U.）ら、Eur. J. Immunol. (2005), 35, 1-8
【非特許文献２０】ベスラー、Ｗ．Ｇ．（Bessler, W. G.）ら、Int. J. Immunopharmac. (1998), 19, 547-550
【非特許文献２１】ロライト、Ｍ．（Loleit, M.）ら、Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1990), 371, 967-975
【非特許文献２２】ミュラー、Ｃ．Ｐ．（Muller, C. P.）ら、Clin. Exp. Immunol. (1989), 78, 499-504
【非特許文献２３】ウールフソン、Ｄ．Ｎ．（Woolfson, D. N.）、Adv. Prot. Chem. (2005), 70, 79-112
【非特許文献２４】パリー、Ｄ．Ａ．Ｄ．（Parry, D. A. D.）ら、Advances in Protein Chemistry (2005), 70
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）と、該ペプチド鎖に共有結合で連結された、２個または３個の長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分（ＬＭ）と、ペプチド鎖に任意選択で連結された抗原（Ａ）とで構成されるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）；２、３、４または５個のリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）を含み、ビルディングブロックの数はリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）のペプチド鎖のコイルドコイルドメインの特性によって決まる、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）；ならびに、多数のリポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）を含み、かつ脂質コアとペプチドの外側表面とを備えた球状または回転楕円体状の構造を有する合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）に関する。
【００１２】
本発明はさらに、リポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）および合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）の生産方法；ワクチンの調製における、抗原を担持するリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）および合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）の使用；ならびにそのようなワクチンを使用するワクチン接種の方法に関する。同様に本発明は、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を含む医薬製剤に関する。
【００１３】
本発明の様々な組成物は、感染症、アレルギー、がん、薬物依存、中毒、を含む疾患、障害または状態の予防または治療のための免疫応答を誘発するのに有用であり、一般に抗原特異的な免疫応答を効率的に誘発するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＶＬＰの構成成分および集合体を示す図。ＰＣはコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖；ＬＭは脂質部分；Ａは抗原；ＬＢＢはリポペプチドビルディングブロック；ＨＬＢはリポペプチドヘリックスバンドル（三量体が示されている）；ＳＶＬＰは合成ウイルス様粒子（抗原を備えたもの）である。
【図２】コイルドコイルペプチド中に存在するヘプタドモチーフを示す図。Ａ：ヘプタド。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ：αアミノ酸残基（全（Ｌ）または全（Ｄ））。ａおよびｄ（矢印で示す）は疎水性のαアミノ酸である。３〜８個のヘプタドモチーフが典型的なコイルドコイルペプチドに相当する。Ｂ：疎水性残基ａおよびｄの相互作用を示している三量体への集合体化。
【図３】リポペプチド４凝集物の代表的な沈降平衡プロファイルを示す図。下側パネル：Ａ２３１は２３１ｎｍにおける吸光度である。データポイントは５０００、７５００および１００００ｒｐｍに関するものである。リポペプチド濃度は、０．０９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４（ＰＢＳ）中で２４μＭとした。上側パネル：ΔＯＤは光学密度の差である。２４μＭおよび４８μＭ、ならびに３通りのロータ速度における１８組のデータセットについてのグローバルフィットに対する残差を示す。
【図４】様々な濃度におけるリポペプチド４凝集物の沈降速度実験を示す図。ｃ（ｓ）は見かけの沈降係数の分布。全ての（１０、３０、５０、７５、１００および１５０μＭについての）分布が９．５〜１０Ｓの間に集中した。
【図５】ＳＶＬＰのコンピュータモデルを示す図。リポタンパク質４から形成されるＳＶＬＰは、２４個のサブユニット（ＨＬＢ）から構成された。各々のＨＬＢ（右に示す）は３コピーのリポペプチド４で形成されて三量体コイルドコイルを生じている。
【図６】リポペプチド４およびペプチド５の凝集物のＣＤスペクトルを示す図。λは波長（ｎｍ）；Θは平均残基楕円率（ｄｅｇ．ｃｍ２／ｄｍｏｌ）である。ｐＨ７．４のＰＢＳ中でリポペプチド４は２０μＭ、ペプチド５は５０μＭである。
【図７】リポペプチド４凝集物のピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）発光スペクトルを示す図。λは波長（ｎｍ）；Ｉ４３７は４３７ｎｍにおける蛍光強度（任意の単位）である。様々な曲線は、バッファー（ＰＢＳ）ならびに濃度が８０、１００、２００、４００、６００、８００および１０００ｎＭのリポペプチド４に相当する。
【図８】リポペプチド４凝集物の臨界ミセル濃度を示す図。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を決定するために蛍光データを分析した。データをリポペプチド４の濃度（ｎＭ）に対するＩ４３７／Ｉ４６６としてプロットする。挿入図は、ＣＭＣが理想的条件下でどのように決定されるかを示している。
【図９】リポペプチド４凝集物に関するＤＬＳ計測値の数量重み付きＮＩＣＯＭＰ分布解析を示す図。ｐＨ７．４、２０℃のトリスバッファー中のリポペプチド４の１．１ｍＭ溶液。形成された粒子の平均径はおよそ１７ｎｍであった。
【図１０】リポペプチド４凝集物の陰性染色電子顕微鏡写真。トリスバッファー（ｐＨ７．４）中でリポペプチド４によって形成されたＳＶＬＰ。左側のスケールバーは２０ｎｍ；右側のスケールバーは５０ｎｍ（拡大）である。１５〜２０ｎｍの粒子の星状の形状および試料の高い均質性を、はっきりと見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、
・抗原（Ａ）、
・抗原（Ａ）に任意選択で連結された3つまたは好ましくは2つの長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分（ＬＭ）、
・脂質部分（ＬＭ）に共有結合で連結されたコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）
からなるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）を含む。
【００１６】
ペプチド鎖（ＰＣ）はコイルドコイルドメインを含む。そのようなコイルドコイルドメインは、会合して規定のヘリックスバンドル、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体のバンドルとなる。ペプチドは１２〜１２０個のアミノ酸残基、好ましくは２１〜８０個のアミノ酸残基を含みうる。コイルドコイルドメインは複数のタンデムリピートモチーフを含み、該モチーフは脂質を含まない単独のペプチドとして、自己集合して平行なコイルドコイルのヘリックスバンドルとなる特性を有する。ペプチド鎖（ＰＣ）は、多量体化して規定のオリゴマー化状態（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体、特に二量体、三量体、四量体または五量体）の平行なコイルドコイルのヘリックスバンドルを形成するはずである。好ましいペプチド配列は、ヒトのワクチン接種に適用される場合は自己免疫異常のリスクを回避するためヒト以外の配列である。
【００１７】
ペプチド鎖はさらに、１つ以上のヘルパーＴ細胞エピトープ、およびリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）の水中溶解性を促進する極性残基の列の少なくともいずれか一方を含むアミノ酸配列モチーフを含む。
【００１８】
脂質部分（ＬＭ）は、２個または３個、好ましくは２個の長鎖ヒドロカルビルを備えた脂質アンカーと、これらヒドロカルビル鎖を合わせてペプチド鎖（ＰＣ）に直接またはリンカーを介して接続する構造とを含む。好ましい脂質部分は、２個または３個、好ましくは２個の長いヒドロカルビル鎖を含むリン脂質である。
【００１９】
「長鎖ヒドロカルビル」とは、炭素原子が少なくとも７個の直鎖アルキルまたはアルケニル基、例えば８〜５０個のＣ原子、好ましくは８〜２５個のＣ原子で構成される直鎖アルキルまたはアルケニルを意味する。アルケニルは、天然の脂肪酸および脂肪族アルコールにおいて通常見られるように、鎖の中に各々がＥまたはＺの幾何学的配置を有する好ましくは１、２または３個の二重結合を有する。「長鎖ヒドロカルビル」の定義にはさらに、分岐鎖アルキルまたはアルケニル、例えば、２‐エチルヘキシルの場合のように鎖の端から数えて２番目または３番目の炭素原子にメチルまたはエチル置換基を有しているアルキルも含まれる。
【００２０】
本発明による特定の好ましい脂質部分は、式Ｚ１〜Ｚ８すなわち
【００２１】
【化１】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルまたは長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ＹはＨまたはＣＯＯＨである）、
【００２２】
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は長鎖ヒドロカルビルであるか、またはＲ１およびＲ２が長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝ＯでＲ３がＨもしくはアセチルである）、
【００２３】
【化３】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ｎは１、２、３または４である）、
【００２４】
【化４】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルであり、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１、２、３または４である）、または
【００２５】
【化５】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルである）
の脂質部分である。
【００２６】
脂質部分は、脂肪酸において見られるように、例えばＺ１〜Ｚ８のように、少なくとも２つの長鎖ヒドロカルビルを含む。１つの好ましい脂質部分は、様々な種類の、例えば式Ｚ１またはＺ２のリン脂質であって、エステル結合またはエーテル結合した長いアルキルまたはアルケニル鎖を有するもの、例えば１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミンのエナンチオマー、または１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミンのようなアキラル性アナログのいずれかである。好ましい脂質部分は、トリ‐もしくはジ‐パルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニル残基（Ｚ３型）、またはＺ４〜Ｚ８型の脂質部分である。最も好ましいのは実施例に記載の脂質部分である。
【００２７】
ペプチド鎖（ＰＣ）は、一方の末端すなわちＮ末端もしくはＣ末端、好ましくはＮ末端において、または該末端の近傍で、脂質部分（ＬＭ）に共有結合で連結される。脂質部分は、直接結合されてもよいし（１）、リンカーを介して結合されてもよく（２または３）、式中のＬはリンカーを意味し、ＸはＯまたはＮＨである。
【００２８】
【化６】
当業者には明白なことであるが、種々様々の適切なリンカーおよびカップリング方策があり、該リンカーおよびカップリング方策には、限定するものではないが、ジカルボン酸誘導体ベースのリンカー、１つもしくは複数のエチレングリコール単位、アミノ酸残基（α‐、β‐、γ‐、δ‐アミノ酸など）、もしくは糖（炭水化物）単位を含むか、または複素環を含むリンカーが挙げられる。検討した特定のリンカーは、リンカーＬ１〜Ｌ１０であり、Ｌ１〜Ｌ１０においてｎは１〜２０、ｍは１〜２０であり、接続官能基Ｃ＝ＯまたはＸ（ＸはＯまたはＮＨ）とともに示されている：
【００２９】
【化７】
最も好ましいのは実施例に記載されるリンカーである。
【００３０】
上記接続において「一方の末端の近傍で」とは、脂質部分が、ペプチドのＮ末端またはＣ末端からそれぞれ数えて１番目、２番目、３番目、４番目または５番目のアミノ酸に結合されることを意味するものとする。脂質部分は、ペプチド構造の骨格に取り付けられてもよいし、末端の近傍の上記アミノ酸のうちの１つの側鎖に取り付けられてもよい。
【００３１】
本発明において定義される「抗原」は、抗体が結合することができる分子である。抗原は、ペプチド、タンパク質、または動物において抗原特異的な体液性免疫応答を誘発するために使用される１つ以上のＢ細胞エピトープを有するエピトープミメティックを含みうる。あるいは、抗原はハプテンまたは炭水化物を含む場合もある。適切なペプチド抗原およびタンパク質抗原は最大１５０個のアミノ酸を含み、糖ペプチドおよび糖タンパク質を含む。ペプチドおよびタンパク質の配列は、例えば１種類以上の感染性病原体に対する、免疫応答を誘発するように選択することができる。そのような抗原は当分野において良く知られている。エピトープミメティックは、天然のペプチドエピトープまたは炭水化物エピトープを模倣する分子であり、１つ以上の非天然アミノ酸（例えばＤ‐アミノ酸、β‐アミノ酸、γ‐アミノ酸、δ‐アミノ酸、またはε‐アミノ酸）およびエピトープ模倣体の分野で周知のその他の置換体を含むペプチド化合物が含まれる。好ましいのは立体配座的に制限されたペプチドミメティックで、タンパク質様の立体配座に固定されたものである。ハプテンは、分子量３０００未満の有機化合物で、それ自体は体液性免疫応答を誘発しないが、担体に付着すると免疫応答を誘発するものである。典型的なハプテンには、薬物、ホルモン、毒素および炭水化物が挙げられる。
【００３２】
好ましいのは実施例に記載の抗原である。
抗原は、ペプチド鎖の他方の末端に、または該末端の近傍に共有結合により付着されるが、ここで「他方の」とは、ペプチドの、脂質部分を担持していない側の末端を意味する。脂質部分がペプチドのＮ末端またはＮ末端近傍に接続される場合、抗原はＣ末端またはＣ末端近傍に結合される。脂質部分がペプチドのＣ末端またはＣ末端近傍に接続される場合、抗原はＮ末端またはＮ末端近傍に結合される。
【００３３】
１つ以上の抗原を、ペプチド鎖（ＰＣ）のコイルドコイルドメインに、例えばコイルドコイルペプチド中のアミノ酸（例えばリジンもしくはシステイン）の側鎖のうち１つ以上を介して、またはペプチド鎖の末端を介して、コンジュゲートさせることができる。抗原は、ペプチド鎖の側鎖のうちの１つまたはペプチド鎖の末端の官能基にコンジュゲートするのに適した官能基を担持している。好ましいのは、抗原特異的な抗体に基づく免疫応答を誘発するための、Ｂ細胞受容体により認識される抗原、またはハプテンである。
【００３４】
「コイルドコイルドメイン」は、自発的な自己会合によって熱力学的に安定なαヘリックスの平行なヘリックスバンドルを形成する適切なアミノ酸配列を注意深く選択することによって設計される。
【００３５】
コイルドコイルドメインは、右巻きの両親媒性αヘリックスを形成する基準的なヘプタド配列のタンデムリピートをベースとしたペプチドを含み、該へリックスはその後集合して左巻きのスーパーコイルを備えたヘリックスバンドルを形成する。さらに、必ずしも左巻きや通常のスーパーコイルではないコイルドコイルを形成する、非基準的な非ヘプタドをベースとした繰り返しから形成されたペプチドも含まれる。
【００３６】
基準的なコイルドコイルは、天然に存在する生物活性を有するペプチドおよびタンパク質に広く存在し、新たに設計もされてきた。所定のオリゴマー化状態、トポロジーおよび安定性（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体）のヘリックスバンドルとなるコイルドコイルペプチドの設計について、一連の法則が解明されてきた。これらの法則により、設計者は所与の標的構造に適合したペプチド配列を構築することができる。最も重要なことは、基準的なコイルドコイルペプチド配列は特徴的な７残基のモチーフを含み、該モチーフは典型的には３〜１０回繰り返されることである。１つのヘプタドモチーフ内の位置は伝統的にａｂｃｄｅｆｇで表され、ほとんどは（ただし例外もあるが）位置ａおよびｄに疎水性残基が存在し、その他の位置には一般に極性の、へリックスに都合のよい残基を有する。ペプチド鎖に沿って縦列した（タンデムの）ヘプタドモチーフは、ａ残基とｄ残基との間に、これら残基がαへリックスの１つの面に位置することができるような平均間隔を有している。２つ以上のヘリックスが密集してコイルドコイルバンドルとなる場合、ヘリックスの疎水性の面が会合して互いに巻き付いて、疎水性表面どうしの間の接触が最大となる（図２）。ヘプタドリピート内の各位置に存在しうる残基の種類は、へリックスバンドルの安定性およびオリゴマー化状態に影響を及ぼすことになる。一般に、主に疎水性の残基（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）または芳香族の疎水性側鎖（Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）がａ部位およびｄ部位に使用される。残りのｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇ部位は、ａ、ｄ部位よりも自由度が高い傾向があるが、極性でヘリックスに都合のよい残基（Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＧｌｎ）が好ましい。ａ部位およびｄ部位の残基の選択は、コイルドコイルのオリゴマー化状態（すなわち二量体か三量体）に影響を及ぼしうる。従って、β‐分岐していない残基（例えばＬｅｕ）が位置ｄに存在する場合は二量体となりやすく；この部位にβ‐分岐した残基（ＶａｌおよびＩｌｅ）があると二量体になりにくい。他方、二量体ではａ部位にはβ‐分岐した残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ）が好ましい。別の法則は、ａ＝ｄ＝ＩｌｅまたはＬｅｕであると三量体となりやすいことであり、これは平行な三量体を特異的に形成するコイルドコイルを設計するのに役立つ。上記およびその他の設計上の法則については、［ウールフソン、Ｄ．Ｎ．（Woolfson, D. N.）、Adv. Prot. Chem. (2005), 70, 79-112］においてより詳細に議論されている。
【００３７】
ヘプタドモチーフは両親媒性αへリックスをコードし、該へリックスはその疎水性の面を介してオリゴマー化する（図２）。コイルドコイルドメインは、少なくとも３つのタンデムなヘプタドリピートモチーフを含んでいる。各鎖の中のヘプタドリピートの数が多くなると、ヘリックスバンドルの安定性に影響を及ぼすであろう。該リピート数は、長いペプチドの化学合成の実現可能性によって主に制限を受けるが、３つを超えるヘプタドリピート（例えば４、５、６、７および８個のヘプタドリピート）を含む配列が好ましい。以下に議論される実施例では三量体のαヘリックス状コイルドコイルが形成されるが（図１も参照）、本発明は同様に二量体、四量体、五量体、六量体および七量体のコイルドコイルドメインにも関係する。
【００３８】
本発明によるコイルドコイルドメインは、より長いリピート単位、例えば天然に存在するコイルドコイル中に存在するような１１残基リピートおよび１５残基リピートを有することもできる。したがって、凝集構造物の形成に必要なヘリックスバンドルは、７個以外の周期性を備えたコイルドコイルモチーフを使用するときにも生じる場合がある。通常とは異なる周期性を備えたコイルドコイルも可能である。天然に存在する多くのコイルドコイルでは、連続したヘプタドリピートパターンに様々な不連続部が含まれる場合がある。２つの一般的な不連続部は、ヘプタドパターン内への１残基の挿入、同様に３または４残基の挿入である。例えば、１残基の挿入はインフルエンザヘマグルチニンの三量体コイルドコイルに見られる。天然に存在する他のコイルドコイルは７残基以外の周期性を示し、例えば、１１残基の規則的周期性（ヘンデカドと呼ばれる）はスタフィロサーマス・マリナス（Staphylothermus marinus）の表層タンパク質であるテトラブラキオン（tetrabrachion）に見られる。
【００３９】
ウイルスコートタンパク質に天然に存在するコイルドコイルペプチド配列の他の例は、ＨＩＶ‐１のｇｐ４１コートタンパク質、およびＲＳＶのＦ糖タンパク質の三量体ヘリックスバンドルを形成するコイルドコイルモチーフである。これらのコイルドコイルドメインは、本発明によるコイルドコイルドメインの定義に含まれる。
【００４０】
好ましいコイルドコイルペプチドは、３〜８個のタンデムに連結したヘプタドモチーフを含む。コイルドコイル内のヘプタドモチーフは、（リポペプチド８のように）同一の配列を有していてもよいし、（リポペプチド６および７のように）各々異なる配列を有していてもよい。すべての場合において、１つのヘプタドモチーフ内の７個のアミノ酸残基の７つの位置は文字：ａｂｃｄｅｆｇで示される。したがって、コイルドコイルペプチドは、位置（ａｂｃｄｅｆｇ）３〜８を有するアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましいのは、３〜８個のタンデムに連結したヘプタドモチーフを含むコイルドコイルペプチド配列であって、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ａおよびｄが本明細書中以下に定義するグループ１および／またはグループ２に属するαアミノ酸を含むものである。さらに、すべての位置ａおよびｄのうち２箇所まではグループ３に属する任意のアミノ酸残基を位置づけることが可能であり、すべての位置ａおよびｄのうち１箇所まではグループ４もしくはグループ５に属する任意のアミノ酸残基またはグリシンを位置づけることが可能である。さらに、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇには、グループ３、４および５に属するαアミノ酸が好ましいが、グループ１および２に属するアミノ酸でもよく、加えて任意の１つのヘプタドモチーフ内の上記位置のうちの１箇所まではグリシンであってもよいが、いずれもプロリンであってはならない。
【００４２】
グループ１は、大きさが小〜中位の疎水性側鎖Ｒ１を備えたαアミノ酸残基からなる。
【００４３】
【化８】
疎水性残基Ｒ１は、生理的なｐＨでは荷電せず、水溶液によってはじかれるアミノ酸側鎖を表す。これらの側鎖は一般に、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミンならびにこれらに対応するプロトン化された塩、チオール、アルコール、尿素またはチオ尿素のような水素結合供与体基を含まない。しかしながら、上記側鎖は、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされるこのグループのアミノ酸には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンが挙げられる。
【００４４】
特定の疎水性残基Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＳＲ３、‐（ＣＨＲ２）ＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａＳＲ３、‐（ＣＨ２）ａＲ４、または‐ＣＨ（ＣＦ３）２であり、式中、Ｒ２は低級アルキル；Ｒ３は低級アルキル；Ｒ４はシクロヘキシル、シクロペンチルまたはシクロブチル；ａは１〜４；ｂは０または１である。
【００４５】
グループ２は、芳香族またはヘテロ芳香族の側鎖Ｒ５を備えたアミノ酸残基からなる。
【００４６】
【化９】
芳香族アミノ酸残基とは、芳香族π（パイ）電子系がコンジュゲートしている少なくとも１つの環を含む側鎖Ｒ５を有する疎水性アミノ酸を指す。さらに該残基は、追加として、低級アルキル、アリールまたはハロゲンのような疎水基、第一級および第二級アミンとこれらの対応するプロトン化された塩、第一級および第二級アミド、アルコールのような水素結合供与体基、ならびに、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸にはフェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。ヘテロ芳香族アミノ酸残基とは、Ｏ、ＳおよびＮのようなヘテロ原子が少なくとも１つ組み込まれた芳香族π（パイ）電子系がコンジュゲートしている少なくとも１つの環を含む側鎖Ｒ５を有する疎水性アミノ酸を指す。さらにそのような残基は、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミンとこれらの対応するプロトン化された塩、アルコールのような水素結合供与体基、ならびにエーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされるヘテロ芳香族アミノ酸にはトリプトファンおよびヒスチジンが挙げられる。
【００４７】
特定の芳香族またはヘテロ芳香族の側鎖Ｒ５は、‐（ＣＨ２）ａＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＳ（ＣＨ２）ｄＲ６、または‐（ＣＨ２）ｃＮＲ７（ＣＨ２）ｄＲ６であり、式中、Ｒ７はＨ、低級アルキル、アリールまたはアリール‐低級アルキル；Ｒ６は、任意選択で置換された式‐Ｃ６Ｒ８Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２のフェニルまたは式Ｈ１〜Ｈ１４
【００４８】
【化１０】
のうち１つのアリール基もしくはヘテロアリール基であって、式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＮＲ７Ｒ１４、Ｎ７ＣＯＲ１４、低級アルキル、アリールまたはＯＲ７；Ｒ１３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、低級アルキル、またはアリール；Ｒ１４は、Ｈ、低級アルキル、またはアリール；ａは１〜４；ｃは１または２；ｄは０〜４である。
【００４９】
グループ３は、極性で非荷電の残基Ｒ１５を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５０】
【化１１】
極性で非荷電の残基Ｒ１５は、生理的なｐＨでは荷電しないが水溶液によってはじかれない親水性の側鎖を表す。そのような側鎖は、典型的には、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミン、チオール、ならびにアルコールのような水素結合供与体基を含む。これらの基は、水分子を伴う水素結合ネットワークを形成することができる。さらに上記の基は、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミド、または第三級アミンのような水素結合受容体基も含む場合がある。遺伝的にコードされる極性で非荷電のアミノ酸には、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが挙げられる。
【００５１】
特定の極性で非荷電の残基Ｒ１５は、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＳＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＣＯＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９であり、式中、Ｒ１６は、低級アルキル、アリール、アリール‐低級アルキル、‐（ＣＨ２）ａＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９；Ｒ１７およびＲ１８は、互いに独立にＨ、低級アルキル、アリール、もしくはアリール‐低級アルキルであるか、またはＲ１７およびＲ１８がともに‐（ＣＨ２）ｅ‐、‐（ＣＨ２）２‐Ｏ‐（ＣＨ２）２‐、もしくは‐（ＣＨ２）２‐ＮＲ１７‐（ＣＨ２）２‐をなし；Ｒ１９は、低級アルキル、アリール、またはアリール‐低級アルキル；ａ、ｂおよびｄは上記に定義されるような意味を有し、ｅは２〜６である。
【００５２】
グループ４は、極性のカチオン性残基およびそのアシル化誘導体、例えばアシルアミノから誘導される残基および尿素から誘導される残基Ｒ２０を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５３】
【化１２】
極性のカチオン性側鎖Ｒ２０は、生理的なｐＨでプロトン化される塩基性の側鎖を表す。遺伝的にコードされる極性のカチオン性アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。シトルリンは尿素から誘導されるアミノ酸残基の例である。
【００５４】
特定の極性カチオン性残基およびそのアシル化誘導体Ｒ２０は、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮ＝Ｃ（ＮＲ２１Ｒ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１Ｃ（＝ＮＲ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＲ１９、または‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＮＲ１７Ｒ１８であり、式中、Ｒ２１はＨまたは低級アルキルでＲ２２はＨまたは低級アルキル；Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は上記に定義されるような意味を有し、ａは１〜４である。
【００５５】
グループ５は、極性のアニオン性残基Ｒ２３を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５６】
【化１３】
極性でアニオン性とは、生理的なｐＨで脱プロトン化される酸性の側鎖Ｒ２３を指す。遺伝的にコードされる極性アニオン性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。特定の極性カチオン性残基Ｒ２３は、‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＨであり、式中のａは１〜４である。
【００５７】
低級アルキルは、Ｃ１‐７‐アルキル、好ましくはＣ１‐４‐アルキルであって、具体的にはメチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチルまたはイソブチルである。アリールは５〜１０個の炭素原子を有し、好ましくはフェニルまたはナフチルである。
【００５８】
より好ましいのは、３〜８個のタンデムに連結されたヘプタドモチーフを含むコイルドコイルペプチド配列であって、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）が次の配列すなわち：
１ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
１ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
２ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；または
２ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
（上記配列中、１はグループ１由来の遺伝的にコードされるアミノ酸、２はグループ２由来の遺伝的にコードされるアミノ酸、ｘはグループ１、２、３、４もしくは５由来の遺伝的にコードされるアミノ酸またはグリシンである）のうちのいずれか１つを有するものである。
【００５９】
さらに一層好ましいのは、天然に存在するペプチドおよびタンパク質（ただしヒト起源のものを除く）の中で同定されたコイルドコイルペプチド配列である。これらは、例えばウイルスおよび細菌のタンパク質中で同定されたコイルドコイルであって、以下のものすなわち：
インフルエンザウイルスヘマグルチニン由来（配列番号５）：
ＧＳＴＱＡＡＩＤＱＩＮＧＫＬＮＲＶＩＥＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＣＧ；
ヒト免疫不全ウイルス由来（配列番号６）：
ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＧＤＣＧ；
ウシ免疫不全ウイルス由来（配列番号７）：
ＧＧＥＲＶＶＱＮＶＳＹＩＡＱＴＱＤＱＦＴＨＬＦＲＮＩＮＮＲＬＮＶＬＨＨＲＶＳＹＬＥＹＶＥＥＩＲＱＫＱＶＦＦＧＣＧ；
ネコ免疫不全ウイルス由来（配列番号８）：
ＧＧＡＴＨＱＥＴＩＥＫＶＴＥＡＬＫＩＮＮＬＲＬＶＴＬＥＨＱＶＬＶＩＧＬＫＶＥＡＭＥＫＦＬＹＴＡＦＡＭＱＥＬＧＣＧ；
ウマ伝染性貧血ウイルス由来（配列番号９）：
ＧＧＮＨＴＦＥＶＥＮＳＴＬＮＧＭＤＬＩＥＲＱＩＫＩＬＹＡＭＩＬＱＴＨＡＲＶＱＬＬＫＥＲＱＱＶＥＥＴＦＮＬＩＧＣＧ；
サル免疫不全ウイルス由来（配列番号１０）：
ＧＧＡＱＳＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＴＲＶＴＡＩＥＫＹＬＫＤＱＡＧＣＧ；
ヤギ関節炎脳炎ウイルス由来（配列番号１１）：
ＧＧＳＹＴＫＡＡＶＱＴＬＡＮＡＴＡＡＱＱＤＶＬＥＡＴＹＡＭＶＱＨＶＡＫＧＶＲＩＬＥＡＲＶＡＲＶＥＡＧＣＧ；
ビスナウイルス由来（配列番号１２）：
ＧＧＳＬＡＮＡＴＡＡＱＱＮＶＬＥＡＴＹＡＭＶＱＨＶＡＫＧＩＲＩＬＥＡＲＶＡＲＶＥＡＩＩＤＲＭＭＶＹＱＥＬＤＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐３由来（配列番号１３）：
ＧＧＥＡＫＱＡＲＳＤＩＥＫＬＫＥＡＩＲＤＴＮＫＡＶＱＳＶＱＳＳＩＧＮＬＩＶＡＩＫＳＶＱＤＹＶＮＫＥＩＶＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐１由来（配列番号１４）：
ＧＧＥＡＲＥＡＲＫＤＩＡＬＩＫＤＳＩＩＫＴＨＮＳＶＥＬＩＱＲＧＩＧＥＱＩＩＡＬＫＴＬＱＤＦＶＮＮＥＩＲＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐２由来（配列番号１５）：
ＧＧＫＡＮＡＮＡＡＡＩＮＮＬＡＳＳＩＱＳＴＮＫＡＶＳＤＶＩＴＡＳＲＴＩＡＴＡＶＱＡＩＱＤＨＩＮＧＡＩＶＮＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐４ａ由来（配列番号１６）：
ＧＧＫＡＱＥＮＡＫＬＩＬＴＬＫＫＡＡＴＥＴＮＥＡＶＲＤＬＡＮＳＮＫＩＶＶＫＭＩＳＡＩＱＮＱＩＮＴＩＩＱＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐４ｂ由来（配列番号１７）：
ＧＧＫＡＱＥＮＡＱＬＩＬＴＬＫＫＡＡＫＥＴＮＤＡＶＲＤＬＴＫＳＮＫＩＶＡＲＭＩＳＡＩＱＮＱＩＮＴＩＩＱＧＣＧ；
麻疹ウイルス由来（配列番号１８）：
ＧＧＳＭＬＮＳＱＡＩＤＮＬＲＡＳＬＥＴＴＮＱＡＩＥＡＩＲＱＳＧＱＥＭＩＬＡＶＱＧＶＱＤＹＩＮＮＥＬＩＧＣＧ；
ムンプスウイルス由来（配列番号１９）：
ＧＧＡＱＴＮＡＲＡＩＡＡＭＫＮＳＩＱＡＴＮＲＡＶＦＥＶＫＥＧＴＱＱＬＡＩＡＶＱＡＩＱＤＨＩＮＴＩＭＮＴＱＬＮＮＭＳＣＧ；
ウシ呼吸器合胞体ウイルス由来（配列番号２０）：
ＧＧＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＥＧＣＧ；
エボラウイルス由来（配列番号２１）：
ＧＧＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲＷＧＧＴＣＨＩＬＧＣＧ；
マールブルグウイルス由来（配列番号２２）：
ＧＧＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＴＥＥＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＴＲＷＧＧＴＣＫＶＬＧＣＧ；
ラウス肉腫ウイルス由来（配列番号２３）：
ＧＧＡＮＬＴＴＳＬＬＧＤＬＬＤＤＶＴＳＩＲＨＡＶＬＱＮＲＡＡＩＤＦＬＬＬＡＨＧＨＧＣＧ；
スタフィロサーマス・マリナス由来（配列番号２４）：
ＧＳＩＩＮＥＴＡＤＤＩＶＹＲＬＴＶＩＩＤＤＲＹＥＳＬＫＮＬＩＴＬＲＡＤＲＬＥＭＩＩＮＤＮＶＳＴＩＬＡＳＩＧＣＧ；
ＳＡＲＳコロナウイルス由来（配列番号２５）：
ＧＧＮＶＬＹＥＮＱＫＱＩＡＮＱＦＮＫＡＩＳＱＩＱＥＳＬＴＴＴＳＴＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＣＧ；
肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）のＭＰＮ０１０のＤＵＦ１６ドメイン由来（配列番号２６）：
ＧＧＴＫＴＥＦＫＥＦＱＴＶＶＭＥＳＦＡＶＱＮＱＮＩＤＡＱＧＥＱＩＫＥＬＱＶＥＱＫＡＱＧＫＴＬＱＬＩＬＥＡＬＱＧＩＮＫＲＬＤＮＬＥＳＣＧ；
七量体コイルドコイル（配列番号２７）：
ＧＧＫＶＫＱＬＡＤＡＶＥＥＬＡＳＡＮＹＨＬＡＮＡＶＡＲＬＡＫＡＶＧＥＲＧＣＧ；
三量体コイルドコイル（配列番号２８）：
ＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＫＫＣ；
または四量体コイルドコイル（配列番号２９）：
ＫＬＫＱＩＥＤＫＬＥＥＩＬＳＫＬＹＨＩＥＮＥＬＡＫＩＥＫＫＬＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＫＫＣ
が挙げられる。
【００６０】
最も好ましいのは、実施例に記載のコイルドコイルペプチド配列である。
リポペプチドビルディングブロックの設計において、前記ヘプタドリピートを含まない追加の残基を、コイルドコイルペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端のいずれか一方または両方に任意選択で付加することができる。これらの追加の残基は、例えば、ヘプタドリピート（コイルドコイル）領域と、脂質部分または任意選択で付着される抗原のうち少なくともいずれか一方との間のリンカーとして働くことができる。これらの追加の残基は、ヘルパーＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を含むこともできる。
【００６１】
リポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）の合成には、合成化学のこの領域において良く知られたペプチド合成方法およびカップリング方法を利用することができる。典型的には、ペプチド鎖を組み立てるために固相ペプチド合成を使用する。脂質部分をリンカーにカップリングして脂質‐リンカー中間物を得ることができる。その後、この脂質‐リンカーを、標準的なカップリング方法によって、例えばまだ樹脂に結合しているペプチドの遊離Ｎ末端に付加することができる。最後に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた処理により、完全に組み立てられたリポペプチドを樹脂から切り出し、全ての標準的な側鎖保護基を除去する。
【００６２】
ジパルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニル部分（Ｚ３）は、リンカーなしでペプチド鎖のＮ末端に直接カップリングすることができる。Ｚ４タイプの脂質部分の場合には、Ｆｍｏｃで適切に保護されたアミノ酸、例えばビス‐Ｆｍｏｃ‐２，４‐ジアミノ酪酸を、組立ての最終段階で鎖のＮ末端に付加することができる。（Ｆｍｏｃ）保護基を除去した後、２つの遊離アミノ基を適切な脂肪酸誘導体でアシル化することができる。ＴＦＡを用いて樹脂から切り出した後にリポペプチド生成物が形成される。同様の確立した合成方策を用いて他の脂質部分を含むリポペプチドビルディングブロックを調製することができる。
【００６３】
様々なカップリング手法またはコンジュゲーション手法を使用してペプチド鎖に抗原を付着させることも可能であり、該手法は当業者に良く知られたものとなろう。したがって、ＬＢＢのペプチド鎖のアミノ酸側鎖の遊離アミノ基を、抗原の反応性エステル（例えばカルボン酸から調製されたＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル）にカップリングしてもよく；ペプチド鎖のチオールを抗原のマレイミド基にカップリングしてもよく；ペプチド鎖のアミノ酸残基の側鎖にアジドを組み込み、該アジドを、銅触媒性の付加環化反応を用いてアセチレン基を含む抗原にカップリングしてもよく；また、ペプチド中の他の求核分子（例えばヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、ｖｉｃ‐アミノチオール基）を、抗原中の求電子（例えばアルデヒド、ケトン、活性エステル）にカップリングしてもよい。選択的カップリングを達成するために、ペプチド鎖および抗原の２つの反応基の位置を逆にすることが原則として可能であることは、明白であろう。
【００６４】
上記方法を例証するリポペプチド合成の例は以降に記載されている。
本明細書で定義されるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）は、自己集合してリポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）となり、さらには合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）となることができる。水溶液中での自己集合プロセスには、ＬＢＢのコイルドコイルドメインが急速にオリゴマー化して、規定のオリゴマー化状態のα‐ヘリックスの平行なコイルドコイルバンドル（リポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）と呼ばれる）を形成する工程が含まれる。その結果、各ＨＬＢ内のペプチド鎖に結合した脂質部分も該バンドルの一端で凝集する。さらにその後、複数の同じ抗原がＨＬＢの表面上（すなわちＨＬＢのもう一方の脂肪親和性ではない側）に現れることになる。自己集合プロセスがさらに進行する結果、合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）が形成されることもある（図１を参照）。該プロセスは、各ビルディングブロックに取り付けられた脂質尾部の自己会合によって駆動され、脂質尾部はその後ＳＶＬＰの中央の脂質コアを占める。こうして、個々のヘリックスバンドル中のペプチド鎖は、外向きに、大量の溶媒の方を向くように位置付けられる。従って、リポペプチドビルディングブロックの大きさおよび組成が集合体（ＳＶＬＰ）の最終的な大きさおよび形状を決定し、集合体の直径は典型的にはナノメーター範囲（１０〜３０ｎｍ）である。ＳＶＬＰは、抗原を多価提示するための、また抗原を免疫担当細胞および受容体へ送達するための新規なナノ粒子プラットフォームを表す。
【００６５】
本発明による合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）は、実際のウイルスで見られるようにタンパク質成分と脂質成分とから構成され、ある種の小型ウイルスに類似の物理的大きさを有し、脂質コアと外側のタンパク質／ペプチドをベースとした外側表面とを有するが、完全に合成起源のものであり、すなわち細胞を用いる方法を使用せずにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）から始まる化学合成で生産される。核酸成分を持たず、従って複製することができないので、ＳＶＬＰは本物のウイルスではない。
【００６６】
抗原をリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）に付着させると、その結果生じるＨＬＢ上およびＳＶＬＰ上での抗原の高い表面密度、さらにこれらの分子構造により、これらの合成材料はワクチン送達の領域における適用にとって魅力的なものとなる。ＳＶＬＰの表面に複数の同じ抗原を有することにより、結合活性作用により抗原へのＢ細胞受容体親和性が増強され、免疫担当細胞による該粒子またはその成分の取り込みおよび提示が促進される。したがって、ＨＬＢおよびＳＶＬＰは、動物体内で抗原に対する効率的な免疫応答を引き起こすための、抗原の巨大分子担体または送達媒体として見ることもできる。特に重要なのは、抗原送達媒体としてのＨＬＢおよびＳＶＬＰの使用により、潜在的に有害なアジュバントの使用（同時注射）を伴わずに動物体内で効率的な免疫（抗体）反応を生成させることができることである。
【００６７】
特性を独自に組み合わせることにより、これらＨＬＢおよびＳＶＬＰは、動物における効率的な免疫応答を誘発するのに理想的な、従ってワクチン発見における適用に理想的なものとなる。Ｂ細胞の応答は、標的Ｂ細胞上の特異的Ｂ細胞受容体と抗原との相互作用により、特に、多価抗原の結合によりＢ細胞の表面上で複数のＢ細胞受容体がクラスター化することにより、開始される。集合体化した粒子の表面に複数の同じ抗原を有することは、結合活性作用を介して受容体親和性を増強し、かつ細胞表面上で抗原が結合したＢ細胞受容体のクラスターを形成するのに重要である。コイルドコイルペプチドが規定のオリゴマー化状態のヘリックスバンドルを形成する能力は、共有結合で結合した抗原の多価提示を可能にするために活用される。ハプテン、ペプチド、タンパク質またはその他のある種のエピトープミメティックのような、標的Ｂ細胞上の特異的Ｂ細胞受容体と相互作用するために設計された抗原を、モノマーのＬＢＢにコンジュゲートすることができる。ＨＬＢおよびＳＶＬＰへと自己集合した後、抗原は該オリゴマー集合体の表面上に複数のコピーとして現れる（図１を参照）。
【００６８】
ウイルスおよび微生物のコイルドコイル配列はヘルパーＴ細胞のエピトープを含むこともある。ＬＢＢの成分であるコイルドコイル担体ペプチドはヘルパーＴ細胞エピトープを含む天然の配列に由来するものでもよいので、このエピトープも本発明において活用することができる。別例として、Ｔ細胞エピトープを、設計型または天然のコイルドコイル配列に組み込むことも、附属させることも可能である。
【００６９】
モノマーのＬＢＢは脂質部分を含む。この脂質の別の目的は、Ｂ細胞に対するエピトープの提示を容易にすることであるが、これは、細胞膜と会合した抗原がＢ細胞の活性化およびＢ細胞により駆動されるＴ細胞活性化の促進に特に有効であることが知られているからである。集合したＨＬＢおよびＳＶＬＰの内部に存在する脂質部分の局所濃度が高いことにより、該集合物と細胞膜との相互作用が促進されて、Ｂ細胞への抗原の提示が促進されることになる。ＬＢＢの脂質部分は、良く知られたリポペプチドのＴｏｌｌ様受容体リガンドのような、細菌由来の脂質部分に由来するものでもよい。ＬＢＢに組み込まれる自己集合リポペプチドの特徴は、抗原の多価提示のための機構だけでなく、該リポペプチドがＢ細胞の活性化を増強する成分を含みうることである。確かに、ＨＬＢおよびＳＶＬＰは抗体に基づいた強い免疫応答を誘発することが可能であり、このことにより、免疫化の際の有毒なアジュバントの使用を回避することができるというさらなる利点がもたらされる。
【００７０】
水溶液中でミセルおよび小胞のような熱力学的に安定した凝集物を形成し、長い疎水性領域がミセルコア内でクラスター化して水との接触から遠ざかり隔離される一方、頭部の極性基が溶媒と相互作用することは、界面活性剤、頭部の極性基と無極性の疎水性の脂質尾部とを有する洗剤様分子の一般的な特徴である。しかしながら、本発明のＨＬＢおよびＳＶＬＰは単なるミセルではない。ＨＬＢおよびＳＶＬＰの巨大分子構造は、非共有結合の力の独自の組み合わせ、すなわち、コイルドコイルペプチドドメインが集合してヘリックスバンドルとなるのを駆動する力と、脂質尾部の粒子内部への隔離を駆動する疎水性の力とが合わさることによって維持される。
【００７１】
遊離モノマーが溶液中に存在する最大濃度に相当する、ミセルが形成し始める濃度は、臨界ミセル濃度、またはより一般的には臨界凝集濃度である。臨界ミセル濃度は、ミセルの熱力学的安定性の尺度を提供する。臨界ミセル濃度の値は、両親媒性分子の疎水性部分および親水性部分の構造、ならびに温度や溶媒の組成のような外部要因によって変化する。低い臨界ミセル濃度は低い界面活性剤濃度で安定なミセルを示し、このことは、所望の活性（例えば細胞のターゲティングおよび送達）が、全体的に大幅に希釈した後でもミセル状構造を保持することに依存している生物学的適用において、重要である。本発明によるＳＶＬＰは低ｎＭ領域において熱力学的安定を維持し、このことはワクチン送達の目的に理想的であることを示している。この高い安定性はＳＶＬＰの独特の分子構造から生じる。さらに、ＳＶＬＰは、大きさおよび形状の分布が比較的均質であるように作製することができる。
【００７２】
本発明によるＳＶＬＰは、コア内に水溶液を囲い込む二分子膜構造を有するリポソームとは似ていない。ＳＶＬＰは、水性の外部に対して広面積の脂質膜を露出することはないので、リポソームよりもｉｎ ｖｉｖｏで安定であることができる。
【００７３】
先行技術のウイルス様粒子とは対照的に、本発明のＨＬＢおよびＳＶＬＰは人工的なものであり、これらの構成成分はすべて化学合成によって生産されるので、生物学的方法を使用して作製しなければならない材料の使用が回避される。ウイルス様粒子は「合成の」と称されてきたが、これらの粒子は、組換えＤＮＡ法および細胞を用いる方法を使用して作製された天然型もしくは遺伝子組換え型のウイルス粒子、またはその構成成分であって、化学合成によって生産された材料ではない。さらに、本発明のＳＶＬＰの設計および組成は、他のナノ粒子集合体、例えば金のクラスター、量子ドット、デンドリマー、組換え型タンパク質およびリポソームをベースとする集合体の設計および組成とは全く異なる。
【００７４】
本発明のＬＢＢは、リポペプチド中のコイルドコイルドメインが会合して規定のへリックスバンドル（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体のヘリックスバンドル）となるように設計されている。この会合によりＨＬＢの形成がもたらされる。得られるリポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）（例えば、三量体を図１に示す）は、自己集合してナノメートル規模の大きさの合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）（巨大分子集合体）となることができる。ＬＢＢに抗原（ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、炭水化物またはハプテンの形態）が付着されている場合、複数のコピーがＨＬＢおよびＳＶＬＰの表面上に提示される。
【００７５】
自己（すなわちヒト）タンパク質に基づいたペプチド配列は不適切であるが、これは、ヒト（自己）タンパク質に対する免疫反応により人体に慢性自己免疫性疾患が生じる可能性があるからである（例えばグッドパスチャーの症候群、ヒトがコラーゲンに対する抗体を生じた時に引き起こされる自己免疫性疾患である）。
【００７６】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子を含む医薬製剤に関する。温血動物（特にヒト）への、鼻内、口腔内、直腸内もしくは経口投与のような腸内投与、および静脈内、筋肉内もしくは皮下投与のような非経口投与のための医薬製剤が考えられる。特に好ましいのは非経口投与のための製剤である。該製剤は、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を単独で、または好ましくは薬学的に許容可能な担体とともに含む。有効成分の用量は、意図されるワクチン接種によって、また生物種、該生物の年齢、体重および個体の状態、個々の薬物動態学的データ、ならびに投与方法によって変化する。
【００７７】
医薬製剤は、およそ１％〜およそ１０％の有効成分を含む。非経口投与のための単位用量形態は、例えばアンプルまたはバイアル、例えば、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を約０．０１ｍｇ〜約１．０ｇ含むバイアルである。
【００７８】
優先されるのは、抗原を担持する合成ウイルス様粒子の溶液、さらには懸濁液または分散物、特に等張の水溶液、分散物または懸濁液であって、例えば有効成分を単独で、または担体（例えばマンニトール）と一緒に含む凍結乾燥形態の場合には使用前に調製することができるものを使用することである。医薬製剤は滅菌されてもよいし、添加剤（例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩類、およびバッファーのうち少なくともいずれか）を含んでもよく、かつそれ自体良く知られたやり方で、例えば従来の溶解処理および凍結乾燥処理によって調製される。前記溶液または懸濁液は粘性調節剤を含むこともできる。
【００７９】
非経口投与については、抗原を担持する合成ウイルス様粒子の水溶液、または粘性調節剤と所望の場合には安定化剤とを含む水性注射用懸濁液が、特に適切である。抗原を担持する合成ウイルス様粒子を、任意選択で添加剤とともに凍結乾燥物の形態とすることも可能であり、非経口投与の前に適切な溶媒を追加することによって溶液とすることができる。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子のワクチンとしての使用に関する。これらのワクチンは、感染症、アレルギー、がん、薬物依存、中毒、を含む疾患、障害または病態の予防または治療のための免疫応答を引き起こすために、また一般には効率的に抗原特異的な免疫応答を引き起こすために、有用である。
【００８１】
本発明はさらに、免疫遺伝学的に有効な量の、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子を、投与の必要のある患者に投与することを特徴とするワクチン接種方法に関する。
【実施例】
【００８２】
略語：
ＤＣＭ、 ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）；
ＤＩＥＡ、 ジイソプロピルエチルアミン；
Ｂｏｃ、 ｔ‐ブトキシカルボニル；
ＤＭＦ、 Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド；
ＥＤＴ、 エタンジチオール；
Ｆｍｏｃ、 ９‐フルオレニルメトキシカルボニル；
ＨＡＴＵ、 ２‐（１Ｈ‐９‐アザベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；
ＨＢＴＵ、 ２‐［１Ｈ‐ベンゾトリアゾール‐１‐イル］‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；
ＨＯＢｔ、 Ｎ‐ヒドロキシベンゾトリアゾール；
Ｐｂｆ、 ２，２，４，６，７‐ペンタメチルジヒドロベンゾフラン‐５‐スルホニル；
ＮＭＰ、 Ｎ‐メチルピロリドン；
ＭＢＨＡ、 メチルベンズヒドリルアミン
ＰｙＢＯＰ、 （ベンゾトリアゾール‐１‐イルオキシ）‐トリピロリジノホスホニウム‐ヘキサフルオロホスファート；
ｒ．ｔ．、 室温；
ＴＩＳ、 トリイソプロピルシラン（ｉＰｒ３ＳｉＨ）；
Ｔｒｔ、 トリチル；
ＴＦＡ、 トリフルオロ酢酸；
ｔＲ、 保持時間。
【００８３】
実施例１：リポペプチド４
【００８４】
【化１４】
このリポペプチド中のコイルドコイルペプチド５の配列番号１の一次配列は、大部分はＲＳＶのＦ糖タンパク質に由来する［ローレス‐デルメディコ、Ｍ．Ｋ．（Lawless-Delmedico, M. K.）ら、Biochemistry (2000), 39, 11684-11695］。このコイルドコイルペプチドは５つのヘプタドリピートを含む。Ｎ末端には、ペプチドのＮ末端をリン脂質に連結するためのコハク酸由来のリンカーとともに追加のグリシン残基がスペーサとして付加されており、その結果リポペプチド４が得られる。
【００８５】
このペプチド鎖の合成は、標準的なＦｍｏｃ法を使用して、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で実施した。鎖の組み立てを完了した後、リン脂質‐リンカーユニット（１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ））を樹脂上のペプチドの遊離Ｎ末端にカップリングした。その後、リン脂質を樹脂から切り出し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏを用いた処理によって側鎖保護基を除去した。逆相ＨＰＬＣにより精製した後、生成物を、分析用逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレイＭＳ（ｍ計算値６２３８．４；ｍ／ｚ観測値１５６０．８（（Ｍ＋４Ｈ）４＋））によって特徴解析した。
【００８６】
１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）は、１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミン（バッケム（Bachem）社）をトリエチルアミンのような塩基の存在下で無水コハク酸と反応させることにより容易に調製することができる。
【００８７】
ａ）ペプチド５
ペプチド鎖は、Ｆｍｏｃ法を使用して、ＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機でＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（ノババイオケム（Novabiochem）社）上で合成した。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｐ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｅｕ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、およびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨであった。樹脂（５００ｍｇ；０．４ｍｍｏｌ／ｇ）に、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＨＢＴＵ（３等量）、ＨＯＢｔ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）を使用してＦｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨを負荷した。未反応の遊離アミンを、Ａｃ２Ｏキャッピング溶液（ＮＭＰ中Ａｃ２Ｏ（０．５Ｍ）、ＤＩＥＡ（０．１２５Ｍ）およびＨＯＢｔ（０．０１５Ｍ）；１５ｍｌで３０分を２回）を使用してアセチル化した。カップリングは、５倍過剰量（１ｍｍｏｌ）の各アミノ酸を使用して実施した。
【００８８】
ペプチド鎖の組み立ての完了に続いて、該ペプチド鎖を樹脂から切り出し、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（９ｍｌ）によりｒ．ｔで３時間脱保護した。濾過および減圧下での濃縮の後、ペプチドを冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で沈澱させ、遠心分離処理してデカントした（３回繰り返した）。粗製生成物の分析用ＨＰＬＣによる精製（Ｃ１８カラム：バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：水＋０．１％ＴＦＡの中で５〜１００％アセトニトリル、１ｍｌ／分で２０分間；ｔＲ＝１６分）から、白色粉体としてペプチド５（収率１０％）が得られた。分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム：バイダック２１８ＴＰ５４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：水＋０．１％ＴＦＡの中で１０〜６０％アセトニトリル、１ｍｌ／分で３５分間）：ｔＲ＝２６分。ＥＳＩ‐ＭＳ（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）＋０．１％ＨＣＯＯＨ；陽イオンモード；ｍ／ｚ）：１８２２．８［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１３６７．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１０９４．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、９１１．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算上のＭＷ：５４６５．４ｇ／ｍｏｌ）。
【００８９】
ｂ）リポペプチド４
ペプチド５に関して上述のようにして、樹脂上での直鎖ペプチドの組み立てを実施した。ペプチド鎖の組み立て完了に続いて、１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）を樹脂上のＮ末端にカップリングした。該ペプチジル樹脂（８０μｍｏｌ）に、予め準備したＤＭＦ（５ｍｌ）中のＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１９０ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）、ＨＡＴＵ（９２ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）、ＨＯＡｔ（３３ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）およびＤＩＥＡ（１１０μｌ、６４０μｍｏｌ、８等量）の溶液を添加した。反応混合物をｒ．ｔ．で一晩渦流撹拌した。カップリングの進行をカイザーテストで観察した。カップリングの完了に続いて、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×５ｍｌ）、ＤＣＭ（３×５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（３×５ｍｌ）で洗浄した。その後、リポペプチドを樹脂から切り離し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（２７ｍｌ）でｒ．ｔ．で３時間脱保護した。濾過および減圧下での濃縮の後、ペプチドを冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で沈澱させ、遠心分離処理してデカントした（３回繰り返した）。セミ分取用ＨＰＬＣによる粗製生成物の精製（Ｃ４カラム：バイダック２１４ＴＰ１０１０；１０μｍ、３００Å、１０×２５０ｍｍ；５ｍｌ／分で１５分間に、水＋０．１％ＴＦＡ中で３０〜１００％アセトニトリルのグラジエント；ｔＲ＝１４．４分）により、白色粉体としてリポペプチド４を得た。分析用ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム：バイダック２１４ＴＰ１０４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：１ｍｌ／分で３０分間に、水＋０．１％ＴＦＡ中で１０〜１００％アセトニトリル）：ｔＲ＝２３．３分。ＥＳＩ‐ＭＳ（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）＋０．１％ＨＣＯＯＨ；陽イオンモード；ｍ／ｚ）：２０８１．４［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１５６０．８［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１２４８．９［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１０４０．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算上のＭＷ：６２３８．４ｇ／ｍｏｌ）。ε２７６＝１５１１Ｍ−１ｃｍ−１。
【００９０】
ｃ）リポペプチド４に関する生物物理学的研究
本発明の重要な特徴は、合成によって入手可能なリポペプチドが、自然に集合して規定の構造かつウイルス様ナノ粒子の大きさの巨大分子集合体となることができるということである。リポペプチド４は、振盪させながら緩衝水溶液中に溶解させることが可能であり、次いでＳＶＬＰの溶解特性を調べることができる。そのようなリポペプチドがＳＶＬＰを形成しうることを実証するために、リポペプチド４から生じる粒子について、様々な生物物理学的技法で特徴解析を実施しており、その原理を例証すべく本明細書で述べる。
【００９１】
リポペプチド４を用いた沈降平衡超遠心分離実験から、該粒子が４００ｋＤ範囲に見かけの質量を有することが示された（図３）。分析のために、３通りのロータ速度５，０００、７，５００および１０，０００ｒｐｍについて、また３通りの濃度２４、４８および２４０μＭについて三連のデータセットを集めた。低い方の２つのリポペプチド濃度におけるデータは、４５１，８２０±９，６７０ｇ．ｍｏｌ−１の見かけのモル質量を有する単一の理想的な分子種の存在を仮定したモデルによくフィットした。最も高い濃度（２４０μＭ）のデータを含めると見かけの質量は４３１，１７０±１４，１６０ｇ．ｍｏｌ−１となったが、特に超遠心分離用セルの底部近くでフィッティングの質が下がった。しかしながら、実験データからのフィッティングのずれは、凝集した材料の出現に典型的な形式を持たず、高濃度では理想的でないことが示されたのかもしれない。
【００９２】
沈降速度実験も実施し、見かけの沈降係数の分布、ｇ（ｓ＊）［スタフォード、Ｗ．Ｆ．（Stafford, W. F.）、Anal. Biochem. (1992), 203, 295-301］、Ｉｓ‐ｇ＊（ｓ）およびｃ（ｓ）［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］の面から分析した。異なる手法にもかかわらず、すべての方法から、〜１０Ｓを中心とした比較的広い分布が得られた。平衡データと速度データを一致させ、かつサイズ分布をより詳細に調査する試みにおいて、Ｓｅｄｆｉｔソフトウェアで実行されるようなラム（Lamm）の方程式のモデル化［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］を使用した；典型的なｃ（ｓ）プロファイルを図４に示す。恐らくはアーチファクトにより、低濃度では低いＳ値側に軽微なテーリングがあるように見えるが、分布はすべて９．５〜１０Ｓに集中している。離散した相互作用しない分子種を含む他のモデルを試験しても有意な統計学的改善は見られなかった。個々のｓ値の検討からは、明白な濃度依存は示されず、データのグローバルフィットとその後のモンテカルロ・シュミレーションから、値ｓ２０．ｗ＝９．８３７±４．４・１０−３Ｓが得られた。
【００９３】
リン脂質の化学的性質、および主な会合状態に含まれるモノマーの見かけの数（〜７２）から、検討した濃度範囲内ではリポペプチドはミセル様の構造を形成することが示唆され、また、各々が三量体のコイルドコイルリポペプチドで構成されたおよそ２４個のサブユニットが相互作用して、コイルドコイル状態のペプチド鎖で装飾されたコンパクトな脂質コアを形成するモデルが考えられる。生じる粒子のサイズは超遠心分離のデータで支持される。ペプチドが空間に最適に分布することも考えられる。そのような球状粒子を視覚化するために作製したコンピュータモデルを図５に示す。該モデルは、中心に集塊した疎水性の尾部と、溶液中へ花穂のように外側へ伸びる三量体のへリックス状のコイルドコイルとを示している。完全な球体以外の幾何学的形状も可能であるかもしれないが、該モデルは標準的条件下の希薄溶液中における該材料の挙動をよく反映しているようである。
【００９４】
円偏光二色性（ＣＤ）によりペプチドの立体配座を調べるために、リポペプチド４と同じペプチド配列を有するがリン脂質およびリンカーを欠くペプチド５を分析した。そのような系で予想された通り、該ペプチドは、温度および濃度の両方に依存するＣＤスペクトルを示した。該ペプチドは、ペプチド濃度３５μＭにおいて、１℃では高度にαへリックス状であり、熱変性の遷移は〜４０℃の中央点を示した。ペプチド５と類似の配列を備えたペプチドが、薄い水溶液中でモノマーと平衡状態にある三量体コイルドコイルを形成することが以前に示されている［ローレス‐デルメディコ、Ｍ．Ｋ．（Lawless-Delmedico, M. K.）ら、Biochemistry (2000), 39, 11684-11695］。ペプチド５は、Ｎ末端に２つの追加のグリシン残基を有し、遊離Ｎ末端を有する点でこのペプチドとは異なる。しかしながら、室温での遠紫外線ＣＤスペクトル（図６）は両ペプチドについて類似していた。いずれの軽微な差異も、恐らくは、追加のグリシン残基による非周期的構造の単純な追加、または該グリシン残基が引き起こした可能性のある何らかの構造上の摂動のうち少なくともいずれかによるものと思われた。スペクトルはランダムコイル／αヘリックス平衡に特徴的なものであり、ＣＯＮＴＩＮプログラムを使用するスペクトル分析［プロベンチャー、Ｓ．Ｗ．（Provencher, S. W.）、Comp. Phys. Comm. (1982), 27, 229-242］から、αヘリックス、βシートおよび非周期的な構造についてそれぞれ３３％、２５％および４２％の値が得られた。
【００９５】
ペプチド５にリン脂質部分を付加してリポペプチド４を形成することにより、ＣＤスペクトルに著しい変化が引き起こされ（図６）、ＣＯＮＴＩＮのフィットで判断されるようにヘリックス含量は〜１００％まで上昇する。スペクトルへのリン脂質部分の直接的寄与は小さいと考えられ、注目しなかった。ヘリックス含量の増加は、ペプチド単独の場合に見られる一方の平衡状態がより構造化された状態へ移行すること、高度に構造化された別の状態へ再編成がなされること、またはこれら２つの組み合わせを示している。上記に報告した流体力学上の結果から見て、後者は、極めて大きな凝集物と共存し、恐らくは新しい平衡系を形成する比較的小さな分子種の存在を説明しうるため、後者が事実であると思われる。
【００９６】
蛍光プローブのピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）を使用して臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を調べた。該プローブの蛍光特性は溶媒の極性に敏感であり、したがってプローブは疎水性のミセル媒体中では水性媒体と比較して異なる蛍光挙動を示す。該色素は、ミセルの疎水性内部に優先的に溶解し、その蛍光強度は水性環境と比較してより高く、また発光極大はより長い波長へと移行する。リポペプチド４存在下での該色素の発光スペクトルは、４６６ｎｍで主ピークおよび４３７ｎｍで微小ピークを示し、ミセル不在下では逆の挙動が見られた（図７）。
【００９７】
ＣＭＣを、蛍光変化の濃度依存性の計測により調べ［ヴィルヘルム、Ｍ．（Wilhelm, M.）ら、Macromol. (1991), 24, 1033-1040；アスタフィーバ、Ｉ．（Astafieva, I.）ら、Macromol. (1993), 26, 7339-7352］、＜２０ｎＭであることを見出した。しかしながら、該方法の感度および信頼性は、高いＣＭＣ値を有するミセル系に関しては非常に良好であるが、２０ｎＭ未満のＣＭＣ値の正確な測定には不十分のようである。したがって、この系におけるＰＹＣＨＯ蛍光スペクトルの特徴は低濃度における小さなピークシフトを示しただけであった（図７）。
【００９８】
リポペプチドの１２通りの希釈物における発光スペクトルを、１μＭ〜３ｎＭの範囲で計測し、データを発光強度の比Ｉ４３７／Ｉ４６６として濃度に対してプロットした。結果（図８）から、ＣＭＣ未満のペプチド濃度において予想されるプラトー領域が達成されなかったことは明白である。より高濃度（４００ｎＭ〜１μＭ）では、モノマー濃度を増加させることで新しいオリゴマーの形成が簡単にもたらされるプラトーの始まりが見られる。従って、ＰＹＣＨＯ蛍光スペクトルの変化は、オリゴマーが形成されることと、ＣＭＣが非常に低い（＜２０ｎＭ）こととを示している。
【００９９】
このリポペプチドに由来するＳＶＬＰの平均直径を、動的光散乱（ＤＬＳ）計測値から、球状微粒子用の数理モデルに基づいた数量重み付き分布解析を使用して計算した。データは約１７ｎｍの平均径と一致している（図９）。ＤＬＳによる粒径を４０℃でも計測したが、この場合粒径分布はわずかに狭くなり、生理的な温度ではおそらくより均質な粒径分布であることが示された（データは示されていない）。
【０１００】
電子顕微鏡法を用いてリポペプチドＳＶＬＰを視覚化した。透過型電子顕微鏡写真を記録するために、ｐＨ７．４のトリス緩衝液中３μＭのリポペプチド４溶液の陰性染色を使用した。粒子は、円形および星形のように見える（図１０）。これが、基本的に全体が球形のもの反映しているのか、あるいは円盤状のものを反映しているのか電子顕微鏡写真からは判定できないが、いずれの構造であってもミセル様の系を示すものであろう。粒子は、顕微鏡写真を評価するために使用した方法に依存して、平均直径が１７ｎｍであり主集団のあたりでおよそ±５ｎｍの粒径分布を有していた。試料の大きさおよび形状のいずれにおいても高い均質性が顕著であった。直径が２５ｎｍ〜４０ｎｍの少数のより大きな集合物も、顕微鏡写真で見ることができた。これは、粒子が多層をなして支持体に吸着した可能性があることから、使用した技法のアーチファクトであったかもしれない。しかしながら、電子顕微鏡法により、規則的な形状および寸法の、安定したナノスケールの星状粒子の形成が明白に示されている。
【０１０１】
星状の形状の粒子は、図５に描かれるような、リン脂質が粒子の中心を向き（疎水性コアを形成）、親水性ペプチド鎖が外側を向いているリポペプチドモノマーの配置構成を示唆している。
【０１０２】
ｄ）リポペプチド４に関する生物物理学的検討の実験の部
リン酸定量
アッセイの出典は［エームズ、Ｂ．Ｎ．（Ames, B. N.）、Methods Enzymol. (1966), 8, 115-118］であり、リン脂質部分の中に存在するリン酸総量を概算することにより、以降の実験で使用されるリポペプチド溶液の濃度を測定するために該アッセイを用いた。使用した材料は：２５０℃まで加熱することができる加熱ブロック（例えばテコン（Tecon）プログラマブル制御装置６３０）；元素分析用の耐熱性ホウケイ酸ガラスチューブ（６０×７ｍｍΦ）；および４５℃のウォーターバスである。
【０１０３】
１ｍＭリン酸溶液を、ＫＨ２ＰＯ４から正確に調製した（標準溶液、１μｌ＝１ｎｍｏｌリン酸）。この標準溶液のアリコート（試料について推測されるリン酸含量に応じて、通常は１０〜８０μｌ）を、検量線を構築するために一連の清潔なチューブに加えた。試料および検量用標準溶液を加熱ブロック（１００℃〜１２０℃）で乾燥させ、乾燥したら７０μｌのＨ２ＳＯ４／ＨＣｌＯ４（１：１）を各チューブに添加し、該チューブを２３０〜２５０℃で１５〜３０分間加熱した。
【０１０４】
０．８３５％アスコルビン酸／０．２％モリブデン酸アンモニウムの溶液を以下のようにして調製した；２回蒸留したＨ２Ｏでアスコルビン酸溶液（１０％ｗ／ｖ）およびモリブデン酸アンモニウム溶液（２．５％ｗ／ｖ）を調製した。利用の直前に、１．６７ｍｌのアスコルビン酸溶液および１．６０ｍｌのモリブデン酸アンモニウム溶液を合わせて混合し、体積を２０ｍｌに調節した（１２件の試料に十分な量）。
【０１０５】
２３０〜２５０℃で１５〜３０分間の後、試料をｒ．ｔ．に冷却し、１．６ｍｌのアッセイ溶液を振盪しながら添加し、次いで試料を４５℃で３０分間インキュベートした。試料やリン酸標準溶液の入っていないチューブを全く同じように処理してブランクを用意した。インキュベーション直後に、各試料の８２０ｎｍにおける吸光度を１ｃｍのセル中で計測した。試料の濃度を標準曲線から推定した。
【０１０６】
超遠心分析法
標準的な沈降平衡実験および沈降速度実験を、ＡＮ６０Ｔｉロータを装備したベックマン（Beckman）ＸＬ‐Ａ分析用超遠心機を使用して実施した。ダブルセクターかつ６チャネル測定のチャコールエポンのセンターピースを使用し、適切な場合にはフルオロカーボンＦＣ４３を使用してフォールスボトムを設けた。特定の実験に合わせて様々なロータ速度を設定し、すべての計測を２０℃で実施した。数種類のリポペプチド濃度で実験を実施し、９０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または９０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）のいずれかのバッファーを終始使用した。沈降平衡の実施において、０．００１ｃｍ間隔で径方向のデータを収集し、各データセットについて少なくとも１０回のスキャンを平均した。そのような３つのデータセットを各速度および濃度について得た。適切な時間間隔で収集されたデータの重ね合わせによって平衡を確認した。沈降速度データは２〜４分のスキャン間隔で径方向に０．００５ｃｍ間隔で得た。加法原理を用いて、みかけの偏比容を、脂質部分（ｖ２０＝０．９３４ｃｍ３ｇ−１）およびペプチド部分（ｖ２０＝０．７２６ｃｍ３ｇ−１）について別々に、これらのグループ寄与から計算した［コーン、Ｅ．Ｊ．（Cohn, E. J.）ら、「Proteins, amino acids and peptides as ions and dipolar ions」、（１９４３）、ニューヨーク所在のハーフナー出版（Hafner publishers）、のｐ．３７０−３８１；ヘイランド、Ｈ．（Hoeiland, H.）、「Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology」、（１９８６）、ベルリン所在のスプリンガー‐フェアラーク（Springer-Verlag）、のｐ．１７−４４；
トラウベ、Ｉ．（Traube, I.）、Ann. Chem. Liebigs (1891), 265, 27；ラウエ、Ｔ．Ｍ．（Laue, T. M.）、「Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science」、（１９９２）、ケンブリッジ所在の英国学士院化学出版（Royal Society of Chemistry publishers）］。リポペプチド４の偏比容（ｖ２０＝０．７８１ｃｍ３ｇ−１）は、２つの構成成分の値の質量加重平均として近似した。バッファー密度は標準テーブルからコンピュータで計算した［ラウエ、Ｔ．Ｍ．（Laue, T. M.）、「Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science」、（１９９２）、ケンブリッジ所在の英国学士院化学出版］。ソフトウェアパッケージＳｅｄｆｉｔおよびＳｅｄｐｈａｔ［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］を速度データの分析に使用し、Ｕｌｔｒａｓｃａｎプログラムを沈降平衡データの分析に使用した［デメラー、Ｂ．（Demeler, B.）、ＵｌｔｒａＳｃａｎ５．０（２００１）］。
【０１０７】
円偏光二色性分光法
遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、日本分光株式会社のＪ−７１５分光旋光計および光路長０．１ｃｍの石英セルを使用してｒ．ｔ．で計測した。ペプチド５の溶液（５０μＭ）およびリポペプチド４の溶液（３５．７μＭ）をトリス緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で調製し、濃度をそれぞれに見合ったリン酸分析またはアミノ酸分析によって測定した。１０〜１００ｎｍ／分のスキャン速度、１〜２秒の応答時間および１ｎｍのスペクトルバンド幅を使用し、最低限の分解能０．５ｎｍでスペクトルを収集した。ブランクを差し引いた後、スペクトル値を平均残基楕円率［ｄｅｇ．ｃｍ２／ｄｍｏｌ］として報告し、平均残基分子量を計算する際には脂質部分を無視した。
【０１０８】
リポペプチド４の低濃度試料（２〜４０μＭ）のＣＤスペクトルを、光路長１ｃｍの石英セルを用いて日本分光株式会社のＪ−８１０分光旋光計にて２０℃で計測した。リポペプチド溶液をＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で調製し、濃度をリン酸分析によって測定した。１０ｎｍ／分のスキャン速度、４秒の応答時間および２ｎｍのスペクトルバンド幅を使用して、最低限の分解能０．５ｎｍでスペクトルを収集した。上記に記載のようにしてデータを処理した。
【０１０９】
蛍光：臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
蛍光プローブのピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定に使用した［トウッロ、Ｎ．Ｊ．（Turro, N. J.）、Macromolecules (1984), 17, 2123-2126；アナンタパドマナバン、Ｋ．Ｐ．（Ananthapadmanabhan, K. P.）ら、Langmuir (1985), 1, 352-355］。パーキン・エルマー（Perkin Elmer）ＬＳ５５ルミネセンス分光計で蛍光スペクトルを得た。ピレン‐３‐カルボキシアルデヒドの発光スペクトルを、２０℃にて４００〜５５０ｎｍで計測した。該発光スペクトルは、３００ｎｍ／分のスキャン速度、４ｎｍの励起スリット幅、および９ｎｍの発光スリット幅として、試料を３８０ｎｍで励起することにより得られ、各スキャンを４回繰り返して平均化した。リポペプチド４の溶液は、予めＰＹＣＨＯで飽和させたＨＢＳ ｐＨ７．４（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、９０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して調製した（溶液濃度＜１０−６Ｍ）。１μＭ〜５ｎＭの１２種類のペプチド濃度で蛍光スペクトルを計測し、試料の濃度はリン酸アッセイを使用して測定した。低ｎＭ（５０ｎＭ−３ｎＭ）領域のリポペプチド濃度は、ＨＢＳバッファー中の飽和ＰＹＣＨＯ溶液の１／１０希釈液を使用して調製した。データをＯｒｉｇｉｎ（ｖ７．０）ソフトウェアで解析し、発光スペクトルの相対強度比Ｉ４３７／Ｉ４６６を試料濃度に対してプロットしてＣＭＣ値を推定した。
【０１１０】
動的光散乱（ＤＬＳ）
光散乱法を、ＮＩＣＯＭＰサブミクロン粒径測定器（モデル３７０）で実施した。リポペプチド４試料をトリスバッファー（１０ｍＭ、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で調製し、試料濃度はリン酸アッセイを使用して測定した。リポペプチド４の１．１ｍＭ溶液を０．４５μＭミリポアフィルターで濾過し、１．０５ｍＭの試料を得た。この溶液について、２０℃、３０℃および３７℃で光散乱法を実施した。２０℃ではｔ＝０、２０および９０分、３０℃および３７℃ではｔ＝０および９０分で測定を実施した。データ処理は、理想的な球状微粒子の存在を仮定するＮＩＣＯＭＰ多成分フィッティングモデルを用いて実施した。
【０１１１】
電子顕微鏡法
カーボン被膜付き４００メッシュ銅製グリッドを酸素プラズマ処理で親水化したものを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による予備構造解析に使用した。リポペプチド４溶液（トリス緩衝液（ｐＨ７．４）中４μＭ）の小滴を親水性のＣ‐支持体に載せ、２０秒後、ごく薄い層がグリッド上に残るようにほとんどの溶液を取り除いた。その後、少量の水を表面に接触させることによりグリッドを洗浄した。過剰な水を拭き取り、少量の２％酢酸ウラニル水溶液を表面に接触させることにより直ちにグリッドを染色した。染色液を除去した後、グリッドを乾燥させた。顕微鏡写真は、１ｋ×１ｋのスロースキャンＣＣＤカメラ（プロスキャン（ProScan）、ドイツ連邦共和国ミュンヘン所在）を使用して、ツァイス（Zeiss）ＥＭ９１２電子顕微鏡（ツァイスＡＧ（Zeiss AG）、ドイツ連邦共和国オーバーコッヘン所在）で記録した。
【０１１２】
実施例２：リポペプチド６
【０１１３】
【化１５】
リポペプチド６は、追加のＣｙｓが配列番号１のＣ末端に付加されている点を除いてリポペプチド４と同一である。このＣｙｓの側鎖はリポペプチドを抗原にコンジュゲートさせるために使用することができる。
【０１１４】
５３ｍｅｒのペプチドを、ペプチド５について上述したように、Ｆｍｏｃ法を使用して、さらにＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨも用いてＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で合成した。合成が完了したらすぐに、樹脂の試料をＴＦＡで処理した。その後、生成物を、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ（Ｒ）Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣにより、１８分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリル、次いで４分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１００％アセトニトリルまでのグラジエントを使用して分析した。保持時間＝１９．６分。ＥＳＩ‐ＭＳ：（ｍ／ｚ）：１３９３．２［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１１１５．０［Ｍ＋５Ｈ］５＋；９２９．１［Ｍ＋６Ｈ］６＋；７９６．８［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｍ実測値＝５５６９．６±０．０１％；Ｍ計算値＝５５６９．６）。正しい直鎖ペプチドが樹脂上に存在していたので、リン脂質１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）を、ＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２（２：１）に溶解したＰｙＢＯＰ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）を使用してｒ．ｔで１６時間、残りの樹脂に結合しているペプチドのＮ末端にカップリングした。カップリングの完了はカイザーテスト陰性により確認した。得られた樹脂結合コンジュゲートを最後に樹脂から切り離し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＥＤＴ（９２．５：２．５：２．５：２．５）を使用して３時間脱保護した。ＴＦＡ相を減圧下で濃縮し、次に粗製の脱保護リポペプチドを冷ｉＰｒ２Ｏの添加によって沈澱させた。遠心分離した後、ペレットをｉＰｒ２Ｏで２度洗浄し、高真空下で乾燥させた。生成物をＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＤＭＦ（４：４：２）に溶解し、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ；１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して精製した。生成物を含むフラクションを凍結乾燥してコンジュゲート６を得た。コンジュゲート６を、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％。ｔＲ＝１７．２分。ＥＳＩ‐ＭＳ（陽イオンモード）（ｍ／ｚ）：１５８７．７［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１２６９．６［Ｍ＋５Ｈ］５＋；１０５８．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋；９０７．０［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｍ実測値＝６３４２．９±０．０１％；Ｍ計算値＝６３４２．６）。
【０１１５】
実施例３：リポペプチド７
【０１１６】
【化１６】
この分子のペプチド部分（配列番号２）は、設計したコイルドコイルヘプタドリピート配列を、ＨＩＶ‐１のＪＲ‐ＦＬ株のｇｐ４１タンパク質から得られた天然のコイルドコイル配列に融合させたものを含んでいる。したがってこのコイルドコイル配列は、一部は天然のものであり一部は設計されたものである。さらに、ジペプチド‐ＳＧ‐をＮ末端に付加して脂質の前の短いスペーサとして作用させ、またＣ末端にはジペプチド‐ＣＧ‐を取り付けてＣｙｓ残基中のチオール基を抗原とのコンジュゲートに使用できるようになっている。
【０１１７】
該ペプチドを、活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡと、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙを搭載した２‐クロロトリチルクロリド樹脂（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ、５００ｍｇ）とを使用して組み立てた。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｒｇ（Ｐｂｆ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｐ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｅｕ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｍｅｔ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨであった。６倍過剰量のＦｍｏｃアミノ酸および８等量のＤＩＥＡを使用した。各カップリングサイクルの後、残っている遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡでキャッピングした。組み立ておよび末端Ｆｍｏｃ基の除去の後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）およびｎ−ヘキサン（４×６ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。脂質部分をカップリングするために、樹脂（９５７ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２中で３０分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（２：１）（３．５ｍｌ）中の、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐ＯＨ（Ｆｍｏｃ‐Ｐａｍ２Ｃｙｓ‐ＯＨ、１７４ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（１０１ｍｇ）およびＨＯＢｔ（２６ｍｇ）の溶液を添加し、続いてＤＩＥＡ（１．６等量）を添加した。この混合物を、振盪機上でｒ．ｔ．にて１８時間穏やかに撹拌した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＤＭＦ（５×６ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いた処理（２ｍｌで２分間×６回）で除去した。脱保護は３０１ｎｍでのＵＶ吸収によって観察した。樹脂を、ＤＭＦ（５×１０ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）、およびｎヘキサン（４×６ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（２×６ｍｌ）で洗浄した。ペプチジル樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中の０．６％ＴＦＡで処理し（４．５ｍｌで２分間×４回）、続いてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下で蒸発させた。続いて、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（６９：１０：１０：５：３．５：１）（９．８５ｍｌ）を用いてｒ．ｔ．で２時間穏やかに撹拌する処理によって側鎖保護基を除去した。脱保護されたペプチドを、予め−２０°に冷却したｉＰｒ２Ｏの中で沈澱させ、ｉＰｒ２Ｏ（１５ｍｌ）で３回洗浄した。沈殿物を一晩空気乾燥させ、分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いたＲＰ‐ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して、コイルドコイルリポペプチドを精製した。収量：４５ｍｇ。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１１．９２分。ＬＣ‐ＭＳ：Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ：ｔＲ＝５．４７分；ｍ／ｚ＝１３４２．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１１８．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９５９．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋、８９３．４［Ｍ＋８Ｈ］８＋、７４６．６［Ｍ＋９Ｈ］９＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３０８Ｈ５３２Ｎ７６Ｏ８２Ｓ３について計算したｍ／ｚ：６７０４．９；観測されたｍ／ｚ：６７０４．７［Ｍ］＋。
【０１１８】
実施例４：リポペプチド８
【０１１９】
【化１７】
リポペプチド８は、設計したコイルドコイル（配列番号３）がＮ末端で短いリンカーを介してリン脂質に結合したものを含んでいる。
【０１２０】
ペプチド（配列番号３）は、Ｆｍｏｃ法を使用し、活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡと２‐クロロトリチルクロリド樹脂（０．４２ｍｍｏｌ／ｇ、５９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌスケール）とを使用して組み立てた。使用したアミノ酸はＦｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨであった。４倍過剰量のＦｍｏｃ保護アミノ酸および６等量のＤＩＥＡを使用した。各カップリングサイクルの後、残存している遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡでキャッピングした。ペプチド鎖の組み立ておよび末端Ｆｍｏｃ基の除去の後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）およびｎヘキサン（４×６ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。脂質部分をカップリングするために、樹脂（２５０ｍｇ）をＤＣＭ中で３０分間膨潤させた。ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１１３ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（６６ｍｇ）およびＨＯＢｔ（１７ｍｇ）の溶液を添加し、続いてＤＩＥＡ（３１μｌ、３００μｍｏｌ、６．０等量）を添加した。この混合物を、振盪機でｒ．ｔ．にて１６時間穏やかに撹拌した。樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）およびＤＣＭ（２×６ｍｌ）で洗浄した。ペプチジル樹脂をＤＣＭ中の０．６％ＴＦＡで処理し（４．５ｍｌで２分間を４回）、続いてＤＣＭで洗浄した。濾液を合わせ、減圧下で蒸発させた。その後、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）を用いてｒ．ｔ．で２時間穏やかに撹拌することにより側鎖保護基を除去した。脱保護されたペプチドを、予め−２０°に冷却したｉＰｒ２Ｏで沈澱させ、ｉＰｒ２Ｏで３回洗浄した。分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して、リポペプチド８を精製した。収量：１５ｍｇ。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝１２．５４分。ＥＳＩ‐ＭＳ：Ｃ２６７Ｈ４７４Ｎ５７Ｏ７９ＰＳについて計算したｍ／ｚ：５８１０．０；観測されたｍ／ｚ：１４５３．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１１６２．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋。
【０１２１】
実施例５：４‐マレイミドブチリル‐ヒドラジノグリシニル基を担持する抗原Ｖ３ＳＳ、１２
【０１２２】
【化１８】
Ｖ３ＳＳと呼ばれるジスルフィド架橋ペプチドは、主としてＨＩＶ‐１のｇｐ１２０糖タンパク質のいわゆるＶ３ループから得られる。この配列（配列番号４）はｇｐ１２０のいわゆる主要中和決定基を表し、潜在的なＨＩＶ‐１ワクチン候補として広く研究されてきた［ホアン、Ｃ．Ｃ．（Huang, C.-C.）ら、Science (2005), 310, 1025-1028；パントフレット、Ｒ．（Pantophlet, R.）ら、Annu. Rev. Immunol. (2006), 24, 739-769］。したがって、ジスルフィド架橋ペプチドＶ３ＳＳはｇｐ１２０のＶ３ループのエピトープミメティックである。
【０１２３】
Ｖ３ＳＳ（配列番号４）のＮ末端にはヒドラジノグリシン（Ｚ）残基が付加されているので、求核性のヒドラジノ基を使用して該ペプチドをＬＢＢにカップリングすることができる。ペプチド鎖を、標準的な固相法およびＦｍｏｃ法を使用して２‐クロロトリチルクロリド樹脂上で組み立てた。トリＢｏｃで保護したヒドラジノグリシン残基をＮ末端に付加した。樹脂から切り離して十分に脱保護した後、空気酸化によってジスルフィド結合を導入した。最後に、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）リンカーをＮ末端のヒドラジノ基と部位特異的に反応させて生成物１２を得た。
【０１２４】
直鎖ペプチドＺ‐ＮＣＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＣＧ（Ｚが配列番号４に付加される；Ｚは‐ＮＨＮＨＣＨ２ＣＯ‐を意味する）を、標準的なＦｍｏｃ法および２‐クロロトリチルクロリド樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨを負荷した後、以下の側鎖保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｒｇ（Ｐｂｆ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨを合成に使用した。Ｎ末端残基として、Ｂｏｃで保護したヒドラジノグリシンを、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のトリＢｏｃ‐ヒドラジノ酢酸（３等量）、ＰｙＢＯＰ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）の溶液で樹脂を３時間処理することによりカップリングした。その後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×）、次いでＣＨ２Ｃｌ２（５×）で洗浄した。ペプチドを樹脂から切り出し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／エタンジチオール（９２．５：２．５：２．５：２．５）（１５ｍｌ）で樹脂を２．５時間処理することにより脱保護した。濾過により樹脂を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した後、冷ｉＰｒ２Ｏの添加によって粗製の脱保護直鎖ペプチドを沈澱させた。遠心分離した後、ペレットをｉＰｒ２Ｏで２回洗浄し、高真空下で乾燥させて白色固形物を得た。生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して精製し、還元されたジチオール形態の純粋な直鎖ペプチドを得た。このペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（分析用Ｃ１８カラムＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）によって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．２分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２２１１．２［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２２１０．２±０．０１％；Ｍ計算値＝２２１０．４）。
【０１２５】
酸化（ジスルフィド架橋の形成）については、Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）中の直鎖ペプチド（２０ｍｇ）の溶液を、空気中ｒ．ｔ．で４８時間撹拌した。対応するジスルフィド架橋ペプチドを、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１２〜４０％アセトニトリルのグラジエントを使用して直接精製し、１５ｍｇの酸化ペプチドを得た。酸化（ジスルフィド架橋）ペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（分析用Ｃ１８カラムＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）によって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．２分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２２０９．０［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２２０８．０±０．０１％；Ｍ計算値＝２２０８．４）。
【０１２６】
Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）中のジスルフィド架橋ペプチド（３０ｍｇ）をＨ２Ｏ（３ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＨ（０．２Ｎ）を使用してｐＨをｐＨ６に調節した。ここに、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）（３等量、１１ｍｇ）のＴＨＦ溶液（４５０μｌ）を添加し、反応混合物をｒ．ｔ．で２時間撹拌した。その後、溶液をＨ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍｌ）で希釈し、生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜５０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して精製し、２１ｍｇのペプチド１２を得た。ペプチド１２を、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．７分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２３７４．３［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２３７３．３±０．０１％；Ｍ計算値＝２３７３．４）。
【０１２７】
実施例６：４‐マレイミドブチリル基を担持する抗原ＬＹ‐ＣＨ、ＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ
【０１２８】
【化１９】
実施例５のように、ＨＭＢリンカーを、有機小分子ハプテンであるルシファーイエロー‐ＣＨ（ＬＹ‐ＣＨ）と呼ばれる黄色色素とカップリングして、コンジュゲートＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢを得た。
【０１２９】
ルシファーイエロー‐ＣＨ（ＬＹ‐ＣＨ）（スイス国ブーフ所在のフルカ（Fluka）社製、１２．５ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（１ｍｌ、４：１）に溶解し、溶液のｐＨを０．２ＮのＮａＯＨで６．５に調節した。この溶液に、ＴＨＦ（４００μｌ）中のＮ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）（１５ｍｇ、２等量）の溶液を添加し、反応混合物をｒ．ｔ．で６時間撹拌した。Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍｌ）で希釈した後、生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ；２１ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、１２０Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して直接精製し、９．６ｍｇのＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢを黄色固形物として得た。ＥＳＩ‐ＭＳ（ｍ／ｚ）：６０８．０［Ｍ−Ｈ］−、６３０．９［Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−（陰イオンモード）。
【０１３０】
実施例７：コンジュゲートＬＢＢ６‐１２
ペプチド１２（実施例５、５．９ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（４：１）（７５０μｌ）に溶解し、溶液のｐＨをＮａＯＨ（０．２Ｎ）で６．５に調節した。これに、リポペプチド６（実施例２、６．６ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（１：１）に溶解した溶液（８００μｌ）を添加し、反応混合物を不活性雰囲気下にてｒ．ｔ．で２時間撹拌した。Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍＬ）で希釈した後、生成物を、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ；１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して直接精製し、４ｍｇのＬＢＢ６‐１２を得た。このコンジュゲートを、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５ＱＳ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％。ｔＲ＝１５．４分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：８７１７．４［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝８７１６．４±０．０１％；Ｍ計算値＝８７１６．３）。
【０１３１】
実施例８：コンジュゲートＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨ
リポペプチド６（実施例２、１．１ｍｇ、１７７ｎｍｏｌ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＥ（１：４：１）（６００μｌ）中の溶液を撹拌している中に、ＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ（実施例６、４４０μｇ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）溶液（４００μｌ）を少量ずつ添加した。０．０１ＮのＮａＯＨでｐＨをｐＨ６．３に注意深く調節し、混合物をｒ．ｔ．で２時間激しく撹拌した。リポペプチド６およびルシファーイエローコンジュゲートは様々なＨ２Ｏ／ＭｅＣＮグラジエントについてＣ４およびＣ８のＲＰ‐ＨＰＬＣカラム上で同一の保持時間を有するので、反応後にＥＳＩ‐ＭＳを使用してリポペプチド６の消失をモニターした。反応が完了したらすぐに、該懸濁物を０．１％ＴＦＡ（５００μｌ）の添加により希釈し、付加生成物を、Ｃ４カラムを用いるセミ分取逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０ｍ、３００Å孔径、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、１６．５分間に５０〜１００％Ｂ）によって過剰なＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢから分離した。ＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨコンジュゲートは、ｔＲ＝１３．３８分の鋭いピークとして溶出された。収量：１．０ｍｇ（８２％）。生成物を、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０ｍ、３００Å）を用いる逆相ＨＰＬＣ、およびＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、イオン源、検出器）によって分析した。分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、１３分間に５０〜１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１３．０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｃ８カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋ＨＣＯＯＨ、１０分間に３０〜１００％Ｂ）：保持時間＝７．７３分。ｍ／ｚ：１３９２．４［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１６０．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９９４．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｃ３０７Ｈ５１４Ｎ７４Ｏ９９ＰＳ３Ｌｉについて計算したｍ／ｚ：１３９２．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１６０．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９９４．７［Ｍ＋７Ｈ］７＋）。
【０１３２】
実施例９：コンジュゲートＬＢＢ７‐１２
リポペプチド７（実施例３、３．５ｍｇ）のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＥ（４：１：１）（１．２ｍｌ）中の溶液を撹拌している中に、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）（４００μｌ）中の１２（実施例５、３．７ｍｇ）の溶液を添加した。０．１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ＝６．０に注意深く調節した。該混合物をｒ．ｔ．で２時間撹拌した。反応の完了（Ｃ８カラムを使用してＬＣ‐ＭＳによって検出）の後に、コンジュゲートＬＢＢ７‐１２を、Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いるセミ分取用ＲＰ‐ＨＰＬＣによって、１７分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して直接精製した。収量：４．１ｍｇ（８７％）。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ））：純度＞９７％、保持時間＝１０．７２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝５．５３分、ｍ／ｚ＝１０１０．４［Ｍ＋９Ｈ］９＋、９０９．８［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋、８２７．２［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋、７５８．３［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋、７００．０［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０９Ｈ６８５Ｎ１０９Ｏ１１２Ｓ５について計算したｍ／ｚ：９０８２．０；観測されたｍ／ｚ：９０８２．８［Ｍ］＋、４５４２．１［Ｍ］２＋。
【０１３３】
実施例１０：コンジュゲートＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨ
ＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨの合成および精製は、リポペプチド７（３．０ｍｇ）およびＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ（実施例６、１．１ｍｇ）を使用して、実施例９にＬＢＢ７‐１２について述べたようにして実施した。収量：２．８ｍｇ（８６％）。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝１１．９１分。ＬＣ‐ＭＳ：Ｃ８カラム、５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で６６〜１００％ＭｅＣＮ：ｔＲ＝２．７分、ｍ／ｚ＝１４６４．９［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１２２０．７［Ｍ＋６Ｈ］６＋、１０４６．５［Ｍ＋７Ｈ］７＋、９１５．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３２９Ｈ５４９Ｎ８２Ｏ９４Ｓ５Ｌｉについて計算したｍ／ｚ：７３２４．８；観測されたｍ／ｚ：７３３６．６［Ｍ−Ｌｉ＋Ｎａ］＋、７３２０．４［Ｍ］＋、３６６０．０［Ｍ］２＋。
【０１３４】
実施例１１：免疫化
ＨＬＢおよびＳＶＬＰの１つの重要な用途は、免疫応答を高めるための免疫系へのワクチン成分の送達にある。抗原を搭載したＨＬＢまたはＳＶＬＰで動物を免疫化すると、効率的な抗原特異的免疫応答が誘発されるはずである。これが可能であることを実証するために、ＬＢＢ６‐１２、ＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨ、ＬＢＢ７‐１２およびＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨを用いてウサギを免疫化した。さらに、最初の３つのコンジュゲートは、フロイントの完全／不完全アジュバントを使用する場合および不使用の場合について試験した。ＤＬＳの検討から、各コンジュゲートが水溶液中で自然に自己集合することによりＨＬＢまたはＳＶＬＰを形成することが示された。
【０１３５】
４００μｌのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）の中で、またはフロイントのアジュバント（初回免疫にはフロイントの完全アジュバント（ＦＡ）、追加免疫にはフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ））とともに、ｒ．ｔ．で少なくとも１時間再構成および平衡化した１種類のコンジュゲート１５０μｇを用いて、ウサギ（１群２羽）を免疫化した。免疫化は第０日、第２８日および第５６日に実施した。第１４日、第３８日および第６６日に血清を採取した。血清を酸素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって分析し、免疫化に使用したコンジュゲートに結合する抗体を検出した。結果を表１に示す。
【０１３６】
表１．コンジュゲートの免疫原性
各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。免疫前血清試料は、対応する免疫原との有意な反応性を示さなかった。例えば、ｌｏｇ１０（終点）力価５．００は力価１００，０００に相当する。
【０１３７】
【表１】
表１からわかるように、すべてのコンジュゲートが第２の追加免疫後に高い抗体レベルを引き起こした。ほとんどの初回の抗血清（力価は１：１００〜１：１５，０００に及ぶ）において既に反応が検出可能であり、抗体価の最も急激な上昇は２回目の免疫化の後に観察され、２回目の免疫化から３回目の免疫化については軽微な上昇が見られた。アジュバントを使用せずに到達した抗体価は、フロイントアジュバントを使用して達成された抗体価と同じか、またはそれより高いことも明らかとなった。これは、アジュバントを使用せずに良好な免疫応答を達成させることができることを示している。
【０１３８】
各々のハプテン特異的免疫応答の特異性についてもＥＬＩＳＡによって分析した（表２）。ここでは、各コンジュゲートによって誘導された抗体が異なるＬＢＢに付着された同じ抗原と交差反応する能力を測定した。結果から、免疫応答のかなりの部分が各ＬＢＢに付着された抗原に対して指向性を有することが示された。
【０１３９】
表２．ハプテン特異的免疫応答の特異性
各免疫原に対して生成された抗体を、各抗原との交差反応に関してＥＬＩＳＡで試験した。各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。
【０１４０】
【表２】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc） ｌｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（ＴＭ） Ｐｏｌｙｓｏｒｂ（Ｒ） Ｆ９６）を、ＰＢＳに溶解した各抗原の５μｇ／ｍｌ溶液で一晩コーティング処理した。その後、ウェルを０．０５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、５％脱脂粉乳を含むＰＢＳでｒ．ｔ．にて１時間ブロッキング処理した。ブロッキング処理の後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、０．０５％トゥイーン２０と０．５％脱脂粉乳とを含むＰＢＳ（ＭＰＢＳＴ）で系列希釈したウサギ血清とともにｒ．ｔ．にて２．５時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、プレートを、アルカリホスファターゼ結合型マウス抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ（Sigma））（ＭＰＢＳＴ中で１：２００００に希釈）とともに、ｒ．ｔ．で１時間インキュベートし、再びＰＢＳＴで３回洗浄し、基質バッファー（５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．６）中のパラニトロフェニルリン酸（シグマ）１ｍｇ／ｍｌ溶液とともに暗所でｒ．ｔ．にてインキュベートした。適切な時間を経た後、バイオラッド（Bio-Rad）社のモデル３５５０マイクロプレートリーダを使用して４０５ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１４１】
実施例１２：リポペプチド９
【０１４２】
【化２０】
この実施例は、実施例４のリポペプチド８のＩＥＫＫＩＥＡヘプタドリピートモチーフをベースとして、さらにユニバーサルなヘルパーＴ細胞エピトープ［シニガーリャ、Ｆ．（Sinigaglia, F.）ら、Nature (1988), 336, 778-780に記載］が正確に融合しており、かつＣ末端に、溶解度および安定性を改善し、抗原の結合を可能にするための追加の残基を含む。
【０１４３】
直鎖ペプチドＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＫＫＣａ−ＮＨ２（配列番号２８、「ａ‐ＮＨ２」で表されたＤ‐アラニンアミドがＣ末端に付加されている）を、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。活性化のためのＨＢＴＵ、ＨＯＢｔおよびＤＩＥＡを使用して樹脂に最初にＦｍｏｃ‐Ｄ‐アラニンを載せた後、以下の保護アミノ酸を正確な順序で使用してペプチドを組み立てた：Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｍｅｔ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨ。各カップリングサイクルの後で、残存している遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡを使用してアセチル化した。鎖の組み立てが完了して末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。脂質部分のカップリングについては、樹脂（３２５ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中で４５分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＰＥ‐Ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１２０ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（７８ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、１５０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。該混合物を２０時間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。切り出しおよび側鎖保護基の除去については、樹脂を、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）で２．５時間振盪しながら処理した。樹脂を濾過し、ペプチドをｉＰｒ２Ｏ（予め−２０°に冷却）で沈澱させてｉＰｒ２Ｏ（３×２５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を一晩空気乾燥させ、分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してリポペプチドを精製した。収量：３７ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝２２．１０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝５．３２分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝９９０．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋；８６６．６［Ｍ＋８Ｈ］８＋；７７０．２［Ｍ＋９Ｈ］９＋；６９３．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３１５Ｈ５５７Ｎ７４Ｏ９０ＰＳ２について計算したｍ／ｚ：６９１６．３；観測されたｍ／ｚ：６９１６．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４４】
実施例１３：リポペプチド１０
【０１４５】
【化２１】
この実施例は実施例１２と同じペプチド配列を使用するが、リン脂質に基づいた脂質頭部基の代わりにＰａｍ２‐システインに基づいた脂質頭部基（Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル））を含む。
【０１４６】
リポペプチド９について上述したように、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズのＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で直鎖ペプチドを合成した。ペプチド鎖のＮ末端への脂質部分のカップリングについては、樹脂（２８０ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中で３０分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐ＯＨ（１３４ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（７８ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、１５０μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。該混合物を室温で２０時間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×６ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を除去するために、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（４．５ｍｌで２分を５回）で処理した。Ｆｍｏｃ保護基を完全に除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。切り出しおよび側鎖保護基の除去については、樹脂を、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）で２．５時間振盪しながら処理した。リポペプチド９について上述したようにして、リポペプチドを沈澱させて精製した。収量：４５ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝２２．７１分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．８７分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝８５１．１［Ｍ＋８Ｈ］８＋；７５６．９［Ｍ＋９Ｈ］９＋；６８１．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；６１８．１［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３１２Ｈ５５２Ｎ７４Ｏ８５Ｓ３について計算したｍ／ｚ：６７９６．４；観測されたｍ／ｚ：６７９８．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４７】
実施例１４：ガンマ‐マレイミドブチリル基を担持する抗原、ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１４８】
【化２２】
ペプチド配列は、主としてマラリア原虫の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質のＮＰＮＡリピート領域から得られるが、該タンパク質はマラリアワクチン候補としての可能性について広く研究されてきたものである［ヘリングトン、Ｄ．Ａ．（Herrington, D. A.）ら、Nature (1987), 328, 257-259］。Ｃ末端には、安定性を改善するために追加のＤ‐アラニンアミド（「ａ‐ＮＨ２」と表示されている）が付加されている。ガンマ‐マレイミドブチリル（ＧＭＢ）基は、リポペプチド９またはリポペプチド１０のシステイン残基とコンジュゲート可能なように付加されている。
【０１４９】
直鎖ペプチドＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡａ‐ＮＨ２（配列番号３０、追加のＤ‐アラニンアミドがＣ末端に付加されている）を、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（搭載量０．６９ｍｍｏｌ／ｇ、３６２ｍｇ）、ならびに活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡを使用して、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｄ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｍｔｔ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨであった。鎖の組み立てが完了して末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＤＣＭ（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。ペプチドを切り出し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（１０ｍｌ）で４時間処理することにより側鎖保護基を除去した。ペプチドをｉＰｒ２Ｏ（予め−２０°に冷却）で沈澱させてｉＰｒ２Ｏ（３×２５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を減圧下で乾燥させ、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜３０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してペプチドを精製した。収量：１６２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２１分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ）：純度＞９５％、ｔＲ＝８．７７分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝３．６１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝６９１．６［Ｍ＋３Ｈ］３＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ８３Ｈ１２７Ｎ３１Ｏ３２について計算したｍ／ｚ：２０７１．１；観測されたｍ／ｚ：２０６９．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５０】
ペプチドにＧＭＢリンカーをカップリングするために、ＴＨＦ（０．５ｍｌ）中の４‐マレイミドブチリル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ‐スクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート、１４．０ｍｇ、４９．２μｍｏｌ、６等量）の溶液を、５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５（０．５ｍｌ）中のペプチド（１７．０ｍｇ、８．２μｍｏｌ）の撹拌中の溶液に少量ずつ添加した。該混合物を４°で２０時間撹拌し、凍結乾燥し、分取用Ｃ１８カラム（ウォーターズ（Waters））を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜４０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して生成物ＧＭＢ‐Ｌ２１を精製した。収量：１０．４ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ：純度＞９５％、ｔＲ＝１３．０２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝３．１５分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝７４６．５［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
【０１５１】
実施例１５：３‐マレイミド‐プロピオニルおよびポリエチレングリコールスペーサ基を担持する抗原、ＰＥＯ８‐Ｌ２１
【０１５２】
【化２３】
ＣＳタンパク質のＮＰＮＡリピート領域に基づいた実施例１４と同じ抗原を、３‐マレイミド‐プロピオニル基およびポリエチレングリコール［Ｏ‐（２‐アミノエチル）‐Ｏ’‐（２‐カルボキシエチル）‐ヘプタエチレングリコール］をベースとしたスペーサ基に付着させる。マレイミド基により、リポペプチドビルディングブロック中のシステイン残基との結合が可能となる。
【０１５３】
上述のようにして実施例１４と同じ直鎖ペプチドを合成した。マレイミドリンカーをカップリングするために、ペプチド（１０．０ｍｇ、４．８μｍｏｌ）を５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５（０．５ｍｌ）に溶解した溶液を、ＴＨＦ（０．５ｍｌ）に溶解したＯ‐［Ｎ‐（３‐マレイミドプロピオニル）‐２‐アミノエチル］‐Ｏ’‐［３‐（Ｎ‐スクシンイミジルオキシ）‐Ｓ‐オキソプロピル］‐ヘプタエチレングリコール（５．０ｍｇ、７．２μｍｏｌ、１．５等量）に添加した。収量：７．２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２１分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ）：純度＞９８％、ｔＲ＝１４．２７分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．３１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝８８２．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
【０１５４】
実施例１６：コンジュゲートＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１５５】
【化２４】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）９にカップリングすることができるかを例示する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＧＭＢ‐Ｌ２１を使用し、これをリポペプチド９のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１５６】
ペプチドＧＭＢ‐Ｌ２１をリポペプチド９にカップリングするために、リポペプチド９（６．９ｍｇ、１．０μｍｏｌ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）（０．５ｍｌ）中の溶液を、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）中のＧＭＢ‐Ｌ２１の撹拌中の溶液（１ｍｌ、２．７ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１．２等量）に少量ずつ添加した。０．１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ６．５に注意深く調節し、混合物を３時間撹拌した。カップリング反応が完了した後、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ（２ｍｌ）で混合物を希釈し、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１７分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してコンジュゲートを精製した。収量：７．１ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１９．９０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ））：ｔＲ＝４．８３分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１３１０．２［Ｍ＋７Ｈ］７＋；１１４５．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１０１９．０［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９１７．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；８３３．８［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋；７６４．２［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０６Ｈ６９１Ｎ１０６Ｏ１２５ＰＳ２について計算されたｍ／ｚ：９１５２．６；観測されたｍ／ｚ：９１５２．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５７】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２０ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１５８】
実施例１７：コンジュゲートＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１
【０１５９】
【化２５】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）９にカップリングすることができるかをさらに例示する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＰＥＯ８‐Ｌ２１を使用し、リポペプチド９のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１６０】
カップリングおよび精製は、リポペプチド９（６．０ｍｇ、０．９μｍｏｌ）およびＰＥＯ８‐Ｌ２１（４．５ｍｇ、１．７μｍｏｌ、２等量）を使用して、ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１について上述したようにして実施した。収量：７．２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９５％、ｔＲ＝１９．８２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．９３分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１３６６．０［Ｍ＋７Ｈ］７＋；１１９６．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１０６４．０［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９５７．８［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４２４Ｈ７２７Ｎ１０８Ｏ１３３ＰＳ２について計算されたｍ／ｚ：９５６１．１；観測されたｍ／ｚ：９５６１．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６１】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２４ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１６２】
実施例１８：コンジュゲートＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１６３】
【化２６】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）１０にカップリングすることができるかを例証する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＧＭＢ‐Ｌ２１を使用し、リポペプチド１０のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１６４】
カップリングおよび精製は、リポペプチド１０（６．８ｍｇ、１．０μｍｏｌ）およびＧＭＢ‐Ｌ２１（２．７ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１．２等量）を使用して、ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１について上述したようにして実施した。収量：７．４ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１９．６４分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．８１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１１３０．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１００５．７［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９０５．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；８２２．７［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋；７５４．４［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０３Ｈ６８６Ｎ１０６Ｏ１２０Ｓ３について計算されたｍ／ｚ：９０３２．６；観測されたｍ／ｚ：９０３２．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６５】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２０ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１６６】
実施例１９：ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１、ＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１およびＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１を用いた免疫化
この実施例は、上述のコンジュゲートが、動物に注射すると高度に免疫原性であり、強力な体液性免疫応答を誘発することを示す。実施例１１に記載されているようにして免疫化を実施した。
【０１６７】
したがって先述のように、ニュージーランドホワイト種のウサギ（１群２羽）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（４００μｌ）中で調剤した１５０μｇのリポペプチド（ＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１またはＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１のいずれか）を用いて皮下注射により免疫化した。免疫化は第０日、第２８日および第５６日に実施した。採血は第０日、第１４日、第３８日および第６６日に実施した。血清をＩｇＧ反応についてＥＬＩＳＡによって分析した。表３は、達成された終点力価をまとめたものである。これらの免疫化ではアジュバントは使用しなかった。
【０１６８】
さらに、免疫化した動物由来の血清は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト上のＣＳタンパク質に結合する高力価（＞１０，０００）の抗体を含むことが免疫蛍光測定法によって示され、従ってこれらの構築物に対する免疫応答の大部分がＮＰＮＡリピートモチーフを含むペプチド抗原を対象としていることが示された。
【０１６９】
表３．コンジュゲートの免疫原性
各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。免疫前血清試料は、対応する免疫原との有意な反応性を示さなかった。例えば、ｌｏｇ１０（終点）力価５．００は力価１００，０００に相当する。
【０１７０】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集してリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子となる、コイルドコイルドメインと任意選択で抗原とを含むリポペプチドビルディングブロックに関する。抗原を担持する合成ウイルス様粒子は、ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
単離された小さなペプチドおよびタンパク質が通常はごく低い免疫抗原性しか持たないことは良く知られている。有名なフロイントの完全アジュバントのような有毒なアジュバントが、動物体内でのサブユニットワクチンに対する免疫応答を刺激するために広く使用されているが、多くアジュバントはその有毒な副作用のためヒトで使用することができない。理想的状態は、外部アジュバントの使用を完全に回避することであろうが、これでは一般に不十分な免疫応答しか得られない。しかしながら、（ヒトの）免疫系は、例えばウイルス表面のような表面の全域に反復的な抗原構造を提示する病原体に対して強健な免疫応答を生じる［非特許文献１］。
【０００３】
リポソームは、薬物、核酸、および生物医薬品を含む医薬品の担体として過去３０年にわたって大きな注目を集めてきており、また抗原、核酸および薬物の送達媒体としてのリポソームの適用はよく知られている。特定の受容体を標的とするために、リポソームの表面にペプチドまたはタンパク質を結合させることでリポソームの特性を変化させることができ、これはプロテオリポソームとして知られる系を作り出す。ペプチドおよびタンパク質は、免疫応答を生じさせる目的でもリポソームに組み込まれてきた［非特許文献２、３］。ペプチドを脂質とコンジュゲートさせると、脂質が二分子膜に固定されてペプチドがリポソーム内にはめ込まれ易くなり、その結果リポソームの表面でペプチドが抗体によって認識されるようになる。一般的な送達媒体としてのリポソームの欠点の１つは、血中からの急速な消失および細網内皮系の細胞による捕捉が原因で、ｉｎ ｖｉｖｏで不安定なことである［非特許文献４］。
【０００４】
ワクチンの設計において、ファージを含む天然もしくは遺伝子組換え型のウイルスおよびキメラ体、または天然もしくは遺伝子組換え型のウイルス構成成分、例えばカプシドタンパク質、表面タンパク質および糖タンパク質、もしくはこれらのフラグメントから構成されるウイルス様粒子を使用することの潜在的な利点は、以前から認識されてきた［非特許文献５〜７］。そのようなウイルス様粒子の生産には、天然のウイルスが自己集合するプロセスが利用される。多くのウイルスの自己集合性の天然のコア構造を利用し、組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの粒子の表面上に１つ以上の抗原を提示することができる。これらのウイルス様粒子はサイズが大きく、構造が複雑であるため、化学合成によって入手することはできない。特許文献１、２は「合成ウイルス様粒子」に言及しているが、同文献で言及される粒子は、組換えＤＮＡ法および細胞を用いる方法を使用して作製された、天然もしくは遺伝子組換え型のウイルス粒子またはその構成成分に基づくものであり、化学合成によって生産された材料ではない。特許文献３には、組換え型シンビスウイルスを用いて例証された、抗原が規則正しい反復的な方法で付着された天然または非天然起源のコア粒子の使用について記載されている。
【０００５】
ナノテクノロジー上の適用のために、自己集合性のペプチドおよびタンパク質を設計するための相当な努力もなされてきた。ナノスケールの形態は、設計された両親媒性ペプチドをベースとして生産されており［非特許文献８］、例えばβストランド、βシートおよびαへリックスの二次構造がある［非特許文献９、１０］。ナノ構造を有する複合材料を調製するためのリポペプチドの使用の別の例は、スタップ（Stupp）および共同研究者の研究に見出される［非特許文献１１］。両親媒性ペプチドは、自己集合してナノファイバーとなることが早くに示されている［非特許文献１２］。
【０００６】
合成抗原を基にした有効なワクチンの設計における主な問題のうちの１つは、免疫原性が不十分なことであった。比較的小さな合成分子は、免疫原性が低い傾向にある。この不十分な免疫原性を克服する１つの方法は、破傷風菌毒素またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のようなタンパク質などの担体に合成抗原を共有結合でコンジュゲートすることである［非特許文献１３］。しかしながらこのコンジュゲートは、強い免疫応答を誘発するためにはなおアジュバント（例えばアラムまたはフロイントアジュバント）と一緒に動物に投与しなければならない。Ｂ細胞およびＴ細胞のエピトープを組み込んだ多重エピトープ構築物を生産するための、いくつかの他の方法が報告されている（［非特許文献１４］に総説がある）。
【０００７】
合成の細菌リポペプチド・アナログは、そのアジュバント効果について、またペプチド抗原の担体としてのいずれに関してもワクチン研究において広く注目されてきた［非特許文献１５］。脂質およびリポペプチドは、別の方法で弱いペプチド免疫原のアジュバントとして作用しうることが知られている［非特許文献１６、１７］。周知のアジュバント効果を備えた脂質がペプチドに連結されて、自身がアジュバントとして作用するワクチン候補が生成される、多くのリポペプチド構築物が報告されている。特によく研究されているのは、トリパルミトイル‐Ｓ‐グリセリルシステイン（Ｎ‐パルミトイル‐Ｓ‐（２，３‐ビス‐（Ｏ‐パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐システイニル‐またはＰａｍ３Ｃｙｓ）、およびジパルミトイル‐Ｓ‐グリセリルシステイン（２，３‐ビス‐（Ｏ‐パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐システイニル‐またはＰａｍ２Ｃｙｓ）である［非特許文献１５］。これらの脂質部分は、グラム陰性菌の内膜および外膜のリポタンパク質成分中に見られる。Ｎ末端に上記または関連するジアシル化もしくはトリアシル化されたＳ‐グリセリルシステイン残基を担持する合成リポペプチドは、Ｔｏｌｌ様受容体の特異的リガンドであることが示されている［非特許文献１８、１９］。さらに、ペプチド抗原をＰａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ２Ｃｙｓとコンジュゲートさせることは、自身がアジュバントとして作用する合成ワクチン候補の設計に適用されてきた［非特許文献２０〜２２］。特許文献４には、ペプチド部分がトリプルヘリックス構造を引き起こすことのできるコラーゲン様の配列をとりうるリポペプチドの、薬物ターゲティングを目的とした使用について記載されている。
【０００８】
コイルドコイル構造の設計について最近いくつかの総説が出されており［非特許文献２３］、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにはコイルドコイル、コラーゲンおよびエラストマーに費やされた巻もある［非特許文献２４］。多くの天然のウイルスおよび微生物が、自身の表面タンパク質（例えばインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、ヒト免疫不全ウイルス‐１（ＨＩＶ‐１）のｇｐ４１、または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦ糖タンパク質）の内部にコイルドコイル構造のペプチド配列を含んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開第９８／０１４５６４号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願公開第００／０３５４７９号パンフレット
【特許文献３】国際特許出願公開第００／３２２２７号パンフレット
【特許文献４】国際特許出願公開第９８／０７７５２号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ツィンカーナーゲル、Ｒ．（Zinkernagel, R.）、Science (1996), 171, 173-178
【非特許文献２】レッサーマン、Ｌ．（Leserman, L.）、J Liposome Res (2004), 14, 175-189
【非特許文献３】フリッシュ、Ｂ．（Frisch, B.）ら、Methods Enzymol. (2003), 373, 51-73
【非特許文献４】トルチリン、Ｖ．Ｐ．（Torchilin, V. P.）、Nat. Rev. Drug Discov. (2005), 4, 145-160
【非特許文献５】フェルネローバ、Ｄ．（Felnerova, D.）ら、Curr Opin Biotechnol (2004), 15, 518-529
【非特許文献６】ガルセア、Ｒ．Ｌ．（Garcea, R. L.）ら、Curr Opin Biotechnol (2004), 15, 513-517
【非特許文献７】ドアン、Ｌ．Ｘ．（Doan, L. X.）ら、Rev Med Virol (2005), 15, 75-88
【非特許文献８】レーヴィク、Ｄ．Ｗ．Ｐ．Ｍ．（Loewik, D. W. P. M.）ら、Chem. Soc. Rev. (2004), 33, 234-245
【非特許文献９】ラジャゴパル、Ｋ．（Rajagopal, K.）ら、Curr. Opin. Struct. Biol. (2004), 14, 480-486
【非特許文献１０】チュー、Ｒ．Ｓ．（Tu, R. S.）ら、Adv. Drug Deliv. Revs. (2004), 56, 1537-1563
【非特許文献１１】ベハンナ、Ｈ．Ａ．（Behanna, H. A.）ら、J. Am. Chem. Soc. (2005), 127, 1193-1200
【非特許文献１２】ハルトゲリンク、Ｊ．Ｄ．（Hartgerink, J. D.）ら、Science (2001), 294, 1684-1688
【非特許文献１３】ヘリングトン、Ｄ．Ａ．（Herrington, D. A.）ら、Nature (1987), 328, 257-259
【非特許文献１４】ジャクソン、Ｄ．Ｃ．（Jackson, D. C.）ら、Vaccine (1999), 18, 355-361
【非特許文献１５】ギールメッティ、Ｍ．（Ghielmetti, M.）ら、Immunobiology (2005), 210, 211-215
【非特許文献１６】ユング、Ｇ．（Jung, G.）ら、Angew. Chem. Int. Ed. (1985), 10, 872
【非特許文献１７】マルティノン、Ｆ．（Martinon, F.）ら、J. Immunol. (1992), 149, 3416
【非特許文献１８】ロイター、Ｆ．（Reutter, F.）ら、J. Pept. Res. (2005), 65, 375-383
【非特許文献１９】ビューウィット‐ベックマン、Ｕ．（Buwitt-Beckmann, U.）ら、Eur. J. Immunol. (2005), 35, 1-8
【非特許文献２０】ベスラー、Ｗ．Ｇ．（Bessler, W. G.）ら、Int. J. Immunopharmac. (1998), 19, 547-550
【非特許文献２１】ロライト、Ｍ．（Loleit, M.）ら、Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1990), 371, 967-975
【非特許文献２２】ミュラー、Ｃ．Ｐ．（Muller, C. P.）ら、Clin. Exp. Immunol. (1989), 78, 499-504
【非特許文献２３】ウールフソン、Ｄ．Ｎ．（Woolfson, D. N.）、Adv. Prot. Chem. (2005), 70, 79-112
【非特許文献２４】パリー、Ｄ．Ａ．Ｄ．（Parry, D. A. D.）ら、Advances in Protein Chemistry (2005), 70
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）と、該ペプチド鎖に共有結合で連結された、２個または３個の長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分（ＬＭ）と、ペプチド鎖に任意選択で連結された抗原（Ａ）とで構成されるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）；２、３、４または５個のリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）を含み、ビルディングブロックの数はリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）のペプチド鎖のコイルドコイルドメインの特性によって決まる、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）；ならびに、多数のリポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）を含み、かつ脂質コアとペプチドの外側表面とを備えた球状または回転楕円体状の構造を有する合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）に関する。
【００１２】
本発明はさらに、リポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）および合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）の生産方法；ワクチンの調製における、抗原を担持するリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）、リポペプチドヘリックスバンドル（ＨＬＢ）および合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）の使用；ならびにそのようなワクチンを使用するワクチン接種の方法に関する。同様に本発明は、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を含む医薬製剤に関する。
【００１３】
本発明の様々な組成物は、感染症、アレルギー、がん、薬物依存、中毒、を含む疾患、障害または状態の予防または治療のための免疫応答を誘発するのに有用であり、一般に抗原特異的な免疫応答を効率的に誘発するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＶＬＰの構成成分および集合体を示す図。ＰＣはコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖；ＬＭは脂質部分；Ａは抗原；ＬＢＢはリポペプチドビルディングブロック；ＨＬＢはリポペプチドヘリックスバンドル（三量体が示されている）；ＳＶＬＰは合成ウイルス様粒子（抗原を備えたもの）である。
【図２】コイルドコイルペプチド中に存在するヘプタドモチーフを示す図。Ａ：ヘプタド。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ：αアミノ酸残基（全（Ｌ）または全（Ｄ））。ａおよびｄ（矢印で示す）は疎水性のαアミノ酸である。３〜８個のヘプタドモチーフが典型的なコイルドコイルペプチドに相当する。Ｂ：疎水性残基ａおよびｄの相互作用を示している三量体への集合体化。
【図３】リポペプチド４凝集物の代表的な沈降平衡プロファイルを示す図。下側パネル：Ａ２３１は２３１ｎｍにおける吸光度である。データポイントは５０００、７５００および１００００ｒｐｍに関するものである。リポペプチド濃度は、０．０９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４（ＰＢＳ）中で２４μＭとした。上側パネル：ΔＯＤは光学密度の差である。２４μＭおよび４８μＭ、ならびに３通りのロータ速度における１８組のデータセットについてのグローバルフィットに対する残差を示す。
【図４】様々な濃度におけるリポペプチド４凝集物の沈降速度実験を示す図。ｃ（ｓ）は見かけの沈降係数の分布。全ての（１０、３０、５０、７５、１００および１５０μＭについての）分布が９．５〜１０Ｓの間に集中した。
【図５】ＳＶＬＰのコンピュータモデルを示す図。リポタンパク質４から形成されるＳＶＬＰは、２４個のサブユニット（ＨＬＢ）から構成された。各々のＨＬＢ（右に示す）は３コピーのリポペプチド４で形成されて三量体コイルドコイルを生じている。
【図６】リポペプチド４およびペプチド５の凝集物のＣＤスペクトルを示す図。λは波長（ｎｍ）；Θは平均残基楕円率（ｄｅｇ．ｃｍ２／ｄｍｏｌ）である。ｐＨ７．４のＰＢＳ中でリポペプチド４は２０μＭ、ペプチド５は５０μＭである。
【図７】リポペプチド４凝集物のピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）発光スペクトルを示す図。λは波長（ｎｍ）；Ｉ４３７は４３７ｎｍにおける蛍光強度（任意の単位）である。様々な曲線は、バッファー（ＰＢＳ）ならびに濃度が８０、１００、２００、４００、６００、８００および１０００ｎＭのリポペプチド４に相当する。
【図８】リポペプチド４凝集物の臨界ミセル濃度を示す図。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を決定するために蛍光データを分析した。データをリポペプチド４の濃度（ｎＭ）に対するＩ４３７／Ｉ４６６としてプロットする。挿入図は、ＣＭＣが理想的条件下でどのように決定されるかを示している。
【図９】リポペプチド４凝集物に関するＤＬＳ計測値の数量重み付きＮＩＣＯＭＰ分布解析を示す図。ｐＨ７．４、２０℃のトリスバッファー中のリポペプチド４の１．１ｍＭ溶液。形成された粒子の平均径はおよそ１７ｎｍであった。
【図１０】リポペプチド４凝集物の陰性染色電子顕微鏡写真。トリスバッファー（ｐＨ７．４）中でリポペプチド４によって形成されたＳＶＬＰ。左側のスケールバーは２０ｎｍ；右側のスケールバーは５０ｎｍ（拡大）である。１５〜２０ｎｍの粒子の星状の形状および試料の高い均質性を、はっきりと見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、
・抗原（Ａ）、
・抗原（Ａ）に任意選択で連結された3つまたは好ましくは2つの長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分（ＬＭ）、
・脂質部分（ＬＭ）に共有結合で連結されたコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）
からなるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）を含む。
【００１６】
ペプチド鎖（ＰＣ）はコイルドコイルドメインを含む。そのようなコイルドコイルドメインは、会合して規定のヘリックスバンドル、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体のバンドルとなる。ペプチドは１２〜１２０個のアミノ酸残基、好ましくは２１〜８０個のアミノ酸残基を含みうる。コイルドコイルドメインは複数のタンデムリピートモチーフを含み、該モチーフは脂質を含まない単独のペプチドとして、自己集合して平行なコイルドコイルのヘリックスバンドルとなる特性を有する。ペプチド鎖（ＰＣ）は、多量体化して規定のオリゴマー化状態（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体、特に二量体、三量体、四量体または五量体）の平行なコイルドコイルのヘリックスバンドルを形成するはずである。好ましいペプチド配列は、ヒトのワクチン接種に適用される場合は自己免疫異常のリスクを回避するためヒト以外の配列である。
【００１７】
ペプチド鎖はさらに、１つ以上のヘルパーＴ細胞エピトープ、およびリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）の水中溶解性を促進する極性残基の列の少なくともいずれか一方を含むアミノ酸配列モチーフを含む。
【００１８】
脂質部分（ＬＭ）は、２個または３個、好ましくは２個の長鎖ヒドロカルビルを備えた脂質アンカーと、これらヒドロカルビル鎖を合わせてペプチド鎖（ＰＣ）に直接またはリンカーを介して接続する構造とを含む。好ましい脂質部分は、２個または３個、好ましくは２個の長いヒドロカルビル鎖を含むリン脂質である。
【００１９】
「長鎖ヒドロカルビル」とは、炭素原子が少なくとも７個の直鎖アルキルまたはアルケニル基、例えば８〜５０個のＣ原子、好ましくは８〜２５個のＣ原子で構成される直鎖アルキルまたはアルケニルを意味する。アルケニルは、天然の脂肪酸および脂肪族アルコールにおいて通常見られるように、鎖の中に各々がＥまたはＺの幾何学的配置を有する好ましくは１、２または３個の二重結合を有する。「長鎖ヒドロカルビル」の定義にはさらに、分岐鎖アルキルまたはアルケニル、例えば、２‐エチルヘキシルの場合のように鎖の端から数えて２番目または３番目の炭素原子にメチルまたはエチル置換基を有しているアルキルも含まれる。
【００２０】
本発明による特定の好ましい脂質部分は、式Ｚ１〜Ｚ８すなわち
【００２１】
【化１】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルまたは長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ＹはＨまたはＣＯＯＨである）、
【００２２】
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は長鎖ヒドロカルビルであるか、またはＲ１およびＲ２が長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝ＯでＲ３がＨもしくはアセチルである）、
【００２３】
【化３】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ｎは１、２、３または４である）、
【００２４】
【化４】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルであり、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１、２、３または４である）、または
【００２５】
【化５】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルである）
の脂質部分である。
【００２６】
脂質部分は、脂肪酸において見られるように、例えばＺ１〜Ｚ８のように、少なくとも２つの長鎖ヒドロカルビルを含む。１つの好ましい脂質部分は、様々な種類の、例えば式Ｚ１またはＺ２のリン脂質であって、エステル結合またはエーテル結合した長いアルキルまたはアルケニル鎖を有するもの、例えば１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミンのエナンチオマー、または１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミンのようなアキラル性アナログのいずれかである。好ましい脂質部分は、トリ‐もしくはジ‐パルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニル残基（Ｚ３型）、またはＺ４〜Ｚ８型の脂質部分である。最も好ましいのは実施例に記載の脂質部分である。
【００２７】
ペプチド鎖（ＰＣ）は、一方の末端すなわちＮ末端もしくはＣ末端、好ましくはＮ末端において、または該末端の近傍で、脂質部分（ＬＭ）に共有結合で連結される。脂質部分は、直接結合されてもよいし（１）、リンカーを介して結合されてもよく（２または３）、式中のＬはリンカーを意味し、ＸはＯまたはＮＨである。
【００２８】
【化６】
当業者には明白なことであるが、種々様々の適切なリンカーおよびカップリング方策があり、該リンカーおよびカップリング方策には、限定するものではないが、ジカルボン酸誘導体ベースのリンカー、１つもしくは複数のエチレングリコール単位、アミノ酸残基（α‐、β‐、γ‐、δ‐アミノ酸など）、もしくは糖（炭水化物）単位を含むか、または複素環を含むリンカーが挙げられる。検討した特定のリンカーは、リンカーＬ１〜Ｌ１０であり、Ｌ１〜Ｌ１０においてｎは１〜２０、ｍは１〜２０であり、接続官能基Ｃ＝ＯまたはＸ（ＸはＯまたはＮＨ）とともに示されている：
【００２９】
【化７】
最も好ましいのは実施例に記載されるリンカーである。
【００３０】
上記接続において「一方の末端の近傍で」とは、脂質部分が、ペプチドのＮ末端またはＣ末端からそれぞれ数えて１番目、２番目、３番目、４番目または５番目のアミノ酸に結合されることを意味するものとする。脂質部分は、ペプチド構造の骨格に取り付けられてもよいし、末端の近傍の上記アミノ酸のうちの１つの側鎖に取り付けられてもよい。
【００３１】
本発明において定義される「抗原」は、抗体が結合することができる分子である。抗原は、ペプチド、タンパク質、または動物において抗原特異的な体液性免疫応答を誘発するために使用される１つ以上のＢ細胞エピトープを有するエピトープミメティックを含みうる。あるいは、抗原はハプテンまたは炭水化物を含む場合もある。適切なペプチド抗原およびタンパク質抗原は最大１５０個のアミノ酸を含み、糖ペプチドおよび糖タンパク質を含む。ペプチドおよびタンパク質の配列は、例えば１種類以上の感染性病原体に対する、免疫応答を誘発するように選択することができる。そのような抗原は当分野において良く知られている。エピトープミメティックは、天然のペプチドエピトープまたは炭水化物エピトープを模倣する分子であり、１つ以上の非天然アミノ酸（例えばＤ‐アミノ酸、β‐アミノ酸、γ‐アミノ酸、δ‐アミノ酸、またはε‐アミノ酸）およびエピトープ模倣体の分野で周知のその他の置換体を含むペプチド化合物が含まれる。好ましいのは立体配座的に制限されたペプチドミメティックで、タンパク質様の立体配座に固定されたものである。ハプテンは、分子量３０００未満の有機化合物で、それ自体は体液性免疫応答を誘発しないが、担体に付着すると免疫応答を誘発するものである。典型的なハプテンには、薬物、ホルモン、毒素および炭水化物が挙げられる。
【００３２】
好ましいのは実施例に記載の抗原である。
抗原は、ペプチド鎖の他方の末端に、または該末端の近傍に共有結合により付着されるが、ここで「他方の」とは、ペプチドの、脂質部分を担持していない側の末端を意味する。脂質部分がペプチドのＮ末端またはＮ末端近傍に接続される場合、抗原はＣ末端またはＣ末端近傍に結合される。脂質部分がペプチドのＣ末端またはＣ末端近傍に接続される場合、抗原はＮ末端またはＮ末端近傍に結合される。
【００３３】
１つ以上の抗原を、ペプチド鎖（ＰＣ）のコイルドコイルドメインに、例えばコイルドコイルペプチド中のアミノ酸（例えばリジンもしくはシステイン）の側鎖のうち１つ以上を介して、またはペプチド鎖の末端を介して、コンジュゲートさせることができる。抗原は、ペプチド鎖の側鎖のうちの１つまたはペプチド鎖の末端の官能基にコンジュゲートするのに適した官能基を担持している。好ましいのは、抗原特異的な抗体に基づく免疫応答を誘発するための、Ｂ細胞受容体により認識される抗原、またはハプテンである。
【００３４】
「コイルドコイルドメイン」は、自発的な自己会合によって熱力学的に安定なαヘリックスの平行なヘリックスバンドルを形成する適切なアミノ酸配列を注意深く選択することによって設計される。
【００３５】
コイルドコイルドメインは、右巻きの両親媒性αヘリックスを形成する基準的なヘプタド配列のタンデムリピートをベースとしたペプチドを含み、該へリックスはその後集合して左巻きのスーパーコイルを備えたヘリックスバンドルを形成する。さらに、必ずしも左巻きや通常のスーパーコイルではないコイルドコイルを形成する、非基準的な非ヘプタドをベースとした繰り返しから形成されたペプチドも含まれる。
【００３６】
基準的なコイルドコイルは、天然に存在する生物活性を有するペプチドおよびタンパク質に広く存在し、新たに設計もされてきた。所定のオリゴマー化状態、トポロジーおよび安定性（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体）のヘリックスバンドルとなるコイルドコイルペプチドの設計について、一連の法則が解明されてきた。これらの法則により、設計者は所与の標的構造に適合したペプチド配列を構築することができる。最も重要なことは、基準的なコイルドコイルペプチド配列は特徴的な７残基のモチーフを含み、該モチーフは典型的には３〜１０回繰り返されることである。１つのヘプタドモチーフ内の位置は伝統的にａｂｃｄｅｆｇで表され、ほとんどは（ただし例外もあるが）位置ａおよびｄに疎水性残基が存在し、その他の位置には一般に極性の、へリックスに都合のよい残基を有する。ペプチド鎖に沿って縦列した（タンデムの）ヘプタドモチーフは、ａ残基とｄ残基との間に、これら残基がαへリックスの１つの面に位置することができるような平均間隔を有している。２つ以上のヘリックスが密集してコイルドコイルバンドルとなる場合、ヘリックスの疎水性の面が会合して互いに巻き付いて、疎水性表面どうしの間の接触が最大となる（図２）。ヘプタドリピート内の各位置に存在しうる残基の種類は、へリックスバンドルの安定性およびオリゴマー化状態に影響を及ぼすことになる。一般に、主に疎水性の残基（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）または芳香族の疎水性側鎖（Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）がａ部位およびｄ部位に使用される。残りのｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇ部位は、ａ、ｄ部位よりも自由度が高い傾向があるが、極性でヘリックスに都合のよい残基（Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＧｌｎ）が好ましい。ａ部位およびｄ部位の残基の選択は、コイルドコイルのオリゴマー化状態（すなわち二量体か三量体）に影響を及ぼしうる。従って、β‐分岐していない残基（例えばＬｅｕ）が位置ｄに存在する場合は二量体となりやすく；この部位にβ‐分岐した残基（ＶａｌおよびＩｌｅ）があると二量体になりにくい。他方、二量体ではａ部位にはβ‐分岐した残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ）が好ましい。別の法則は、ａ＝ｄ＝ＩｌｅまたはＬｅｕであると三量体となりやすいことであり、これは平行な三量体を特異的に形成するコイルドコイルを設計するのに役立つ。上記およびその他の設計上の法則については、［ウールフソン、Ｄ．Ｎ．（Woolfson, D. N.）、Adv. Prot. Chem. (2005), 70, 79-112］においてより詳細に議論されている。
【００３７】
ヘプタドモチーフは両親媒性αへリックスをコードし、該へリックスはその疎水性の面を介してオリゴマー化する（図２）。コイルドコイルドメインは、少なくとも３つのタンデムなヘプタドリピートモチーフを含んでいる。各鎖の中のヘプタドリピートの数が多くなると、ヘリックスバンドルの安定性に影響を及ぼすであろう。該リピート数は、長いペプチドの化学合成の実現可能性によって主に制限を受けるが、３つを超えるヘプタドリピート（例えば４、５、６、７および８個のヘプタドリピート）を含む配列が好ましい。以下に議論される実施例では三量体のαヘリックス状コイルドコイルが形成されるが（図１も参照）、本発明は同様に二量体、四量体、五量体、六量体および七量体のコイルドコイルドメインにも関係する。
【００３８】
本発明によるコイルドコイルドメインは、より長いリピート単位、例えば天然に存在するコイルドコイル中に存在するような１１残基リピートおよび１５残基リピートを有することもできる。したがって、凝集構造物の形成に必要なヘリックスバンドルは、７個以外の周期性を備えたコイルドコイルモチーフを使用するときにも生じる場合がある。通常とは異なる周期性を備えたコイルドコイルも可能である。天然に存在する多くのコイルドコイルでは、連続したヘプタドリピートパターンに様々な不連続部が含まれる場合がある。２つの一般的な不連続部は、ヘプタドパターン内への１残基の挿入、同様に３または４残基の挿入である。例えば、１残基の挿入はインフルエンザヘマグルチニンの三量体コイルドコイルに見られる。天然に存在する他のコイルドコイルは７残基以外の周期性を示し、例えば、１１残基の規則的周期性（ヘンデカドと呼ばれる）はスタフィロサーマス・マリナス（Staphylothermus marinus）の表層タンパク質であるテトラブラキオン（tetrabrachion）に見られる。
【００３９】
ウイルスコートタンパク質に天然に存在するコイルドコイルペプチド配列の他の例は、ＨＩＶ‐１のｇｐ４１コートタンパク質、およびＲＳＶのＦ糖タンパク質の三量体ヘリックスバンドルを形成するコイルドコイルモチーフである。これらのコイルドコイルドメインは、本発明によるコイルドコイルドメインの定義に含まれる。
【００４０】
好ましいコイルドコイルペプチドは、３〜８個のタンデムに連結したヘプタドモチーフを含む。コイルドコイル内のヘプタドモチーフは、（リポペプチド８のように）同一の配列を有していてもよいし、（リポペプチド６および７のように）各々異なる配列を有していてもよい。すべての場合において、１つのヘプタドモチーフ内の７個のアミノ酸残基の７つの位置は文字：ａｂｃｄｅｆｇで示される。したがって、コイルドコイルペプチドは、位置（ａｂｃｄｅｆｇ）３〜８を有するアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましいのは、３〜８個のタンデムに連結したヘプタドモチーフを含むコイルドコイルペプチド配列であって、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ａおよびｄが本明細書中以下に定義するグループ１および／またはグループ２に属するαアミノ酸を含むものである。さらに、すべての位置ａおよびｄのうち２箇所まではグループ３に属する任意のアミノ酸残基を位置づけることが可能であり、すべての位置ａおよびｄのうち１箇所まではグループ４もしくはグループ５に属する任意のアミノ酸残基またはグリシンを位置づけることが可能である。さらに、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇには、グループ３、４および５に属するαアミノ酸が好ましいが、グループ１および２に属するアミノ酸でもよく、加えて任意の１つのヘプタドモチーフ内の上記位置のうちの１箇所まではグリシンであってもよいが、いずれもプロリンであってはならない。
【００４２】
グループ１は、大きさが小〜中位の疎水性側鎖Ｒ１を備えたαアミノ酸残基からなる。
【００４３】
【化８】
疎水性残基Ｒ１は、生理的なｐＨでは荷電せず、水溶液によってはじかれるアミノ酸側鎖を表す。これらの側鎖は一般に、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミンならびにこれらに対応するプロトン化された塩、チオール、アルコール、尿素またはチオ尿素のような水素結合供与体基を含まない。しかしながら、上記側鎖は、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされるこのグループのアミノ酸には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンが挙げられる。
【００４４】
特定の疎水性残基Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＳＲ３、‐（ＣＨＲ２）ＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａＳＲ３、‐（ＣＨ２）ａＲ４、または‐ＣＨ（ＣＦ３）２であり、式中、Ｒ２は低級アルキル；Ｒ３は低級アルキル；Ｒ４はシクロヘキシル、シクロペンチルまたはシクロブチル；ａは１〜４；ｂは０または１である。
【００４５】
グループ２は、芳香族またはヘテロ芳香族の側鎖Ｒ５を備えたアミノ酸残基からなる。
【００４６】
【化９】
芳香族アミノ酸残基とは、芳香族π（パイ）電子系がコンジュゲートしている少なくとも１つの環を含む側鎖Ｒ５を有する疎水性アミノ酸を指す。さらに該残基は、追加として、低級アルキル、アリールまたはハロゲンのような疎水基、第一級および第二級アミンとこれらの対応するプロトン化された塩、第一級および第二級アミド、アルコールのような水素結合供与体基、ならびに、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸にはフェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。ヘテロ芳香族アミノ酸残基とは、Ｏ、ＳおよびＮのようなヘテロ原子が少なくとも１つ組み込まれた芳香族π（パイ）電子系がコンジュゲートしている少なくとも１つの環を含む側鎖Ｒ５を有する疎水性アミノ酸を指す。さらにそのような残基は、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミンとこれらの対応するプロトン化された塩、アルコールのような水素結合供与体基、ならびにエーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミドまたは第三級アミンのような水素結合受容体基を含むことができる。遺伝的にコードされるヘテロ芳香族アミノ酸にはトリプトファンおよびヒスチジンが挙げられる。
【００４７】
特定の芳香族またはヘテロ芳香族の側鎖Ｒ５は、‐（ＣＨ２）ａＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＳ（ＣＨ２）ｄＲ６、または‐（ＣＨ２）ｃＮＲ７（ＣＨ２）ｄＲ６であり、式中、Ｒ７はＨ、低級アルキル、アリールまたはアリール‐低級アルキル；Ｒ６は、任意選択で置換された式‐Ｃ６Ｒ８Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２のフェニルまたは式Ｈ１〜Ｈ１４
【００４８】
【化１０】
のうち１つのアリール基もしくはヘテロアリール基であって、式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＮＲ７Ｒ１４、Ｎ７ＣＯＲ１４、低級アルキル、アリールまたはＯＲ７；Ｒ１３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、低級アルキル、またはアリール；Ｒ１４は、Ｈ、低級アルキル、またはアリール；ａは１〜４；ｃは１または２；ｄは０〜４である。
【００４９】
グループ３は、極性で非荷電の残基Ｒ１５を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５０】
【化１１】
極性で非荷電の残基Ｒ１５は、生理的なｐＨでは荷電しないが水溶液によってはじかれない親水性の側鎖を表す。そのような側鎖は、典型的には、第一級および第二級アミド、第一級および第二級アミン、チオール、ならびにアルコールのような水素結合供与体基を含む。これらの基は、水分子を伴う水素結合ネットワークを形成することができる。さらに上記の基は、エーテル、チオエーテル、エステル、第三級アミド、または第三級アミンのような水素結合受容体基も含む場合がある。遺伝的にコードされる極性で非荷電のアミノ酸には、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが挙げられる。
【００５１】
特定の極性で非荷電の残基Ｒ１５は、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＳＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＣＯＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９であり、式中、Ｒ１６は、低級アルキル、アリール、アリール‐低級アルキル、‐（ＣＨ２）ａＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９；Ｒ１７およびＲ１８は、互いに独立にＨ、低級アルキル、アリール、もしくはアリール‐低級アルキルであるか、またはＲ１７およびＲ１８がともに‐（ＣＨ２）ｅ‐、‐（ＣＨ２）２‐Ｏ‐（ＣＨ２）２‐、もしくは‐（ＣＨ２）２‐ＮＲ１７‐（ＣＨ２）２‐をなし；Ｒ１９は、低級アルキル、アリール、またはアリール‐低級アルキル；ａ、ｂおよびｄは上記に定義されるような意味を有し、ｅは２〜６である。
【００５２】
グループ４は、極性のカチオン性残基およびそのアシル化誘導体、例えばアシルアミノから誘導される残基および尿素から誘導される残基Ｒ２０を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５３】
【化１２】
極性のカチオン性側鎖Ｒ２０は、生理的なｐＨでプロトン化される塩基性の側鎖を表す。遺伝的にコードされる極性のカチオン性アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。シトルリンは尿素から誘導されるアミノ酸残基の例である。
【００５４】
特定の極性カチオン性残基およびそのアシル化誘導体Ｒ２０は、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮ＝Ｃ（ＮＲ２１Ｒ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１Ｃ（＝ＮＲ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＲ１９、または‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＮＲ１７Ｒ１８であり、式中、Ｒ２１はＨまたは低級アルキルでＲ２２はＨまたは低級アルキル；Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は上記に定義されるような意味を有し、ａは１〜４である。
【００５５】
グループ５は、極性のアニオン性残基Ｒ２３を備えた側鎖を含むアミノ酸からなる。
【００５６】
【化１３】
極性でアニオン性とは、生理的なｐＨで脱プロトン化される酸性の側鎖Ｒ２３を指す。遺伝的にコードされる極性アニオン性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。特定の極性カチオン性残基Ｒ２３は、‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＨであり、式中のａは１〜４である。
【００５７】
低級アルキルは、Ｃ１‐７‐アルキル、好ましくはＣ１‐４‐アルキルであって、具体的にはメチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチルまたはイソブチルである。アリールは５〜１０個の炭素原子を有し、好ましくはフェニルまたはナフチルである。
【００５８】
より好ましいのは、３〜８個のタンデムに連結されたヘプタドモチーフを含むコイルドコイルペプチド配列であって、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）が次の配列すなわち：
１ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
１ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
２ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；または
２ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを表す）；
（上記配列中、１はグループ１由来の遺伝的にコードされるアミノ酸、２はグループ２由来の遺伝的にコードされるアミノ酸、ｘはグループ１、２、３、４もしくは５由来の遺伝的にコードされるアミノ酸またはグリシンである）のうちのいずれか１つを有するものである。
【００５９】
さらに一層好ましいのは、天然に存在するペプチドおよびタンパク質（ただしヒト起源のものを除く）の中で同定されたコイルドコイルペプチド配列である。これらは、例えばウイルスおよび細菌のタンパク質中で同定されたコイルドコイルであって、以下のものすなわち：
インフルエンザウイルスヘマグルチニン由来（配列番号５）：
ＧＳＴＱＡＡＩＤＱＩＮＧＫＬＮＲＶＩＥＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＣＧ；
ヒト免疫不全ウイルス由来（配列番号６）：
ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＧＤＣＧ；
ウシ免疫不全ウイルス由来（配列番号７）：
ＧＧＥＲＶＶＱＮＶＳＹＩＡＱＴＱＤＱＦＴＨＬＦＲＮＩＮＮＲＬＮＶＬＨＨＲＶＳＹＬＥＹＶＥＥＩＲＱＫＱＶＦＦＧＣＧ；
ネコ免疫不全ウイルス由来（配列番号８）：
ＧＧＡＴＨＱＥＴＩＥＫＶＴＥＡＬＫＩＮＮＬＲＬＶＴＬＥＨＱＶＬＶＩＧＬＫＶＥＡＭＥＫＦＬＹＴＡＦＡＭＱＥＬＧＣＧ；
ウマ伝染性貧血ウイルス由来（配列番号９）：
ＧＧＮＨＴＦＥＶＥＮＳＴＬＮＧＭＤＬＩＥＲＱＩＫＩＬＹＡＭＩＬＱＴＨＡＲＶＱＬＬＫＥＲＱＱＶＥＥＴＦＮＬＩＧＣＧ；
サル免疫不全ウイルス由来（配列番号１０）：
ＧＧＡＱＳＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＴＲＶＴＡＩＥＫＹＬＫＤＱＡＧＣＧ；
ヤギ関節炎脳炎ウイルス由来（配列番号１１）：
ＧＧＳＹＴＫＡＡＶＱＴＬＡＮＡＴＡＡＱＱＤＶＬＥＡＴＹＡＭＶＱＨＶＡＫＧＶＲＩＬＥＡＲＶＡＲＶＥＡＧＣＧ；
ビスナウイルス由来（配列番号１２）：
ＧＧＳＬＡＮＡＴＡＡＱＱＮＶＬＥＡＴＹＡＭＶＱＨＶＡＫＧＩＲＩＬＥＡＲＶＡＲＶＥＡＩＩＤＲＭＭＶＹＱＥＬＤＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐３由来（配列番号１３）：
ＧＧＥＡＫＱＡＲＳＤＩＥＫＬＫＥＡＩＲＤＴＮＫＡＶＱＳＶＱＳＳＩＧＮＬＩＶＡＩＫＳＶＱＤＹＶＮＫＥＩＶＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐１由来（配列番号１４）：
ＧＧＥＡＲＥＡＲＫＤＩＡＬＩＫＤＳＩＩＫＴＨＮＳＶＥＬＩＱＲＧＩＧＥＱＩＩＡＬＫＴＬＱＤＦＶＮＮＥＩＲＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐２由来（配列番号１５）：
ＧＧＫＡＮＡＮＡＡＡＩＮＮＬＡＳＳＩＱＳＴＮＫＡＶＳＤＶＩＴＡＳＲＴＩＡＴＡＶＱＡＩＱＤＨＩＮＧＡＩＶＮＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐４ａ由来（配列番号１６）：
ＧＧＫＡＱＥＮＡＫＬＩＬＴＬＫＫＡＡＴＥＴＮＥＡＶＲＤＬＡＮＳＮＫＩＶＶＫＭＩＳＡＩＱＮＱＩＮＴＩＩＱＧＣＧ；
ヒトパラインフルエンザ‐４ｂ由来（配列番号１７）：
ＧＧＫＡＱＥＮＡＱＬＩＬＴＬＫＫＡＡＫＥＴＮＤＡＶＲＤＬＴＫＳＮＫＩＶＡＲＭＩＳＡＩＱＮＱＩＮＴＩＩＱＧＣＧ；
麻疹ウイルス由来（配列番号１８）：
ＧＧＳＭＬＮＳＱＡＩＤＮＬＲＡＳＬＥＴＴＮＱＡＩＥＡＩＲＱＳＧＱＥＭＩＬＡＶＱＧＶＱＤＹＩＮＮＥＬＩＧＣＧ；
ムンプスウイルス由来（配列番号１９）：
ＧＧＡＱＴＮＡＲＡＩＡＡＭＫＮＳＩＱＡＴＮＲＡＶＦＥＶＫＥＧＴＱＱＬＡＩＡＶＱＡＩＱＤＨＩＮＴＩＭＮＴＱＬＮＮＭＳＣＧ；
ウシ呼吸器合胞体ウイルス由来（配列番号２０）：
ＧＧＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＥＧＣＧ；
エボラウイルス由来（配列番号２１）：
ＧＧＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲＷＧＧＴＣＨＩＬＧＣＧ；
マールブルグウイルス由来（配列番号２２）：
ＧＧＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＴＥＥＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＴＲＷＧＧＴＣＫＶＬＧＣＧ；
ラウス肉腫ウイルス由来（配列番号２３）：
ＧＧＡＮＬＴＴＳＬＬＧＤＬＬＤＤＶＴＳＩＲＨＡＶＬＱＮＲＡＡＩＤＦＬＬＬＡＨＧＨＧＣＧ；
スタフィロサーマス・マリナス由来（配列番号２４）：
ＧＳＩＩＮＥＴＡＤＤＩＶＹＲＬＴＶＩＩＤＤＲＹＥＳＬＫＮＬＩＴＬＲＡＤＲＬＥＭＩＩＮＤＮＶＳＴＩＬＡＳＩＧＣＧ；
ＳＡＲＳコロナウイルス由来（配列番号２５）：
ＧＧＮＶＬＹＥＮＱＫＱＩＡＮＱＦＮＫＡＩＳＱＩＱＥＳＬＴＴＴＳＴＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＣＧ；
肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）のＭＰＮ０１０のＤＵＦ１６ドメイン由来（配列番号２６）：
ＧＧＴＫＴＥＦＫＥＦＱＴＶＶＭＥＳＦＡＶＱＮＱＮＩＤＡＱＧＥＱＩＫＥＬＱＶＥＱＫＡＱＧＫＴＬＱＬＩＬＥＡＬＱＧＩＮＫＲＬＤＮＬＥＳＣＧ；
七量体コイルドコイル（配列番号２７）：
ＧＧＫＶＫＱＬＡＤＡＶＥＥＬＡＳＡＮＹＨＬＡＮＡＶＡＲＬＡＫＡＶＧＥＲＧＣＧ；
三量体コイルドコイル（配列番号２８）：
ＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＫＫＣ；
または四量体コイルドコイル（配列番号２９）：
ＫＬＫＱＩＥＤＫＬＥＥＩＬＳＫＬＹＨＩＥＮＥＬＡＫＩＥＫＫＬＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＫＫＣ
が挙げられる。
【００６０】
最も好ましいのは、実施例に記載のコイルドコイルペプチド配列である。
リポペプチドビルディングブロックの設計において、前記ヘプタドリピートを含まない追加の残基を、コイルドコイルペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端のいずれか一方または両方に任意選択で付加することができる。これらの追加の残基は、例えば、ヘプタドリピート（コイルドコイル）領域と、脂質部分または任意選択で付着される抗原のうち少なくともいずれか一方との間のリンカーとして働くことができる。これらの追加の残基は、ヘルパーＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を含むこともできる。
【００６１】
リポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）の合成には、合成化学のこの領域において良く知られたペプチド合成方法およびカップリング方法を利用することができる。典型的には、ペプチド鎖を組み立てるために固相ペプチド合成を使用する。脂質部分をリンカーにカップリングして脂質‐リンカー中間物を得ることができる。その後、この脂質‐リンカーを、標準的なカップリング方法によって、例えばまだ樹脂に結合しているペプチドの遊離Ｎ末端に付加することができる。最後に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた処理により、完全に組み立てられたリポペプチドを樹脂から切り出し、全ての標準的な側鎖保護基を除去する。
【００６２】
ジパルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニル部分（Ｚ３）は、リンカーなしでペプチド鎖のＮ末端に直接カップリングすることができる。Ｚ４タイプの脂質部分の場合には、Ｆｍｏｃで適切に保護されたアミノ酸、例えばビス‐Ｆｍｏｃ‐２，４‐ジアミノ酪酸を、組立ての最終段階で鎖のＮ末端に付加することができる。（Ｆｍｏｃ）保護基を除去した後、２つの遊離アミノ基を適切な脂肪酸誘導体でアシル化することができる。ＴＦＡを用いて樹脂から切り出した後にリポペプチド生成物が形成される。同様の確立した合成方策を用いて他の脂質部分を含むリポペプチドビルディングブロックを調製することができる。
【００６３】
様々なカップリング手法またはコンジュゲーション手法を使用してペプチド鎖に抗原を付着させることも可能であり、該手法は当業者に良く知られたものとなろう。したがって、ＬＢＢのペプチド鎖のアミノ酸側鎖の遊離アミノ基を、抗原の反応性エステル（例えばカルボン酸から調製されたＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル）にカップリングしてもよく；ペプチド鎖のチオールを抗原のマレイミド基にカップリングしてもよく；ペプチド鎖のアミノ酸残基の側鎖にアジドを組み込み、該アジドを、銅触媒性の付加環化反応を用いてアセチレン基を含む抗原にカップリングしてもよく；また、ペプチド中の他の求核分子（例えばヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、ｖｉｃ‐アミノチオール基）を、抗原中の求電子（例えばアルデヒド、ケトン、活性エステル）にカップリングしてもよい。選択的カップリングを達成するために、ペプチド鎖および抗原の２つの反応基の位置を逆にすることが原則として可能であることは、明白であろう。
【００６４】
上記方法を例証するリポペプチド合成の例は以降に記載されている。
本明細書で定義されるリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）は、自己集合してリポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）となり、さらには合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）となることができる。水溶液中での自己集合プロセスには、ＬＢＢのコイルドコイルドメインが急速にオリゴマー化して、規定のオリゴマー化状態のα‐ヘリックスの平行なコイルドコイルバンドル（リポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）と呼ばれる）を形成する工程が含まれる。その結果、各ＨＬＢ内のペプチド鎖に結合した脂質部分も該バンドルの一端で凝集する。さらにその後、複数の同じ抗原がＨＬＢの表面上（すなわちＨＬＢのもう一方の脂肪親和性ではない側）に現れることになる。自己集合プロセスがさらに進行する結果、合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）が形成されることもある（図１を参照）。該プロセスは、各ビルディングブロックに取り付けられた脂質尾部の自己会合によって駆動され、脂質尾部はその後ＳＶＬＰの中央の脂質コアを占める。こうして、個々のヘリックスバンドル中のペプチド鎖は、外向きに、大量の溶媒の方を向くように位置付けられる。従って、リポペプチドビルディングブロックの大きさおよび組成が集合体（ＳＶＬＰ）の最終的な大きさおよび形状を決定し、集合体の直径は典型的にはナノメーター範囲（１０〜３０ｎｍ）である。ＳＶＬＰは、抗原を多価提示するための、また抗原を免疫担当細胞および受容体へ送達するための新規なナノ粒子プラットフォームを表す。
【００６５】
本発明による合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）は、実際のウイルスで見られるようにタンパク質成分と脂質成分とから構成され、ある種の小型ウイルスに類似の物理的大きさを有し、脂質コアと外側のタンパク質／ペプチドをベースとした外側表面とを有するが、完全に合成起源のものであり、すなわち細胞を用いる方法を使用せずにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）から始まる化学合成で生産される。核酸成分を持たず、従って複製することができないので、ＳＶＬＰは本物のウイルスではない。
【００６６】
抗原をリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）に付着させると、その結果生じるＨＬＢ上およびＳＶＬＰ上での抗原の高い表面密度、さらにこれらの分子構造により、これらの合成材料はワクチン送達の領域における適用にとって魅力的なものとなる。ＳＶＬＰの表面に複数の同じ抗原を有することにより、結合活性作用により抗原へのＢ細胞受容体親和性が増強され、免疫担当細胞による該粒子またはその成分の取り込みおよび提示が促進される。したがって、ＨＬＢおよびＳＶＬＰは、動物体内で抗原に対する効率的な免疫応答を引き起こすための、抗原の巨大分子担体または送達媒体として見ることもできる。特に重要なのは、抗原送達媒体としてのＨＬＢおよびＳＶＬＰの使用により、潜在的に有害なアジュバントの使用（同時注射）を伴わずに動物体内で効率的な免疫（抗体）反応を生成させることができることである。
【００６７】
特性を独自に組み合わせることにより、これらＨＬＢおよびＳＶＬＰは、動物における効率的な免疫応答を誘発するのに理想的な、従ってワクチン発見における適用に理想的なものとなる。Ｂ細胞の応答は、標的Ｂ細胞上の特異的Ｂ細胞受容体と抗原との相互作用により、特に、多価抗原の結合によりＢ細胞の表面上で複数のＢ細胞受容体がクラスター化することにより、開始される。集合体化した粒子の表面に複数の同じ抗原を有することは、結合活性作用を介して受容体親和性を増強し、かつ細胞表面上で抗原が結合したＢ細胞受容体のクラスターを形成するのに重要である。コイルドコイルペプチドが規定のオリゴマー化状態のヘリックスバンドルを形成する能力は、共有結合で結合した抗原の多価提示を可能にするために活用される。ハプテン、ペプチド、タンパク質またはその他のある種のエピトープミメティックのような、標的Ｂ細胞上の特異的Ｂ細胞受容体と相互作用するために設計された抗原を、モノマーのＬＢＢにコンジュゲートすることができる。ＨＬＢおよびＳＶＬＰへと自己集合した後、抗原は該オリゴマー集合体の表面上に複数のコピーとして現れる（図１を参照）。
【００６８】
ウイルスおよび微生物のコイルドコイル配列はヘルパーＴ細胞のエピトープを含むこともある。ＬＢＢの成分であるコイルドコイル担体ペプチドはヘルパーＴ細胞エピトープを含む天然の配列に由来するものでもよいので、このエピトープも本発明において活用することができる。別例として、Ｔ細胞エピトープを、設計型または天然のコイルドコイル配列に組み込むことも、附属させることも可能である。
【００６９】
モノマーのＬＢＢは脂質部分を含む。この脂質の別の目的は、Ｂ細胞に対するエピトープの提示を容易にすることであるが、これは、細胞膜と会合した抗原がＢ細胞の活性化およびＢ細胞により駆動されるＴ細胞活性化の促進に特に有効であることが知られているからである。集合したＨＬＢおよびＳＶＬＰの内部に存在する脂質部分の局所濃度が高いことにより、該集合物と細胞膜との相互作用が促進されて、Ｂ細胞への抗原の提示が促進されることになる。ＬＢＢの脂質部分は、良く知られたリポペプチドのＴｏｌｌ様受容体リガンドのような、細菌由来の脂質部分に由来するものでもよい。ＬＢＢに組み込まれる自己集合リポペプチドの特徴は、抗原の多価提示のための機構だけでなく、該リポペプチドがＢ細胞の活性化を増強する成分を含みうることである。確かに、ＨＬＢおよびＳＶＬＰは抗体に基づいた強い免疫応答を誘発することが可能であり、このことにより、免疫化の際の有毒なアジュバントの使用を回避することができるというさらなる利点がもたらされる。
【００７０】
水溶液中でミセルおよび小胞のような熱力学的に安定した凝集物を形成し、長い疎水性領域がミセルコア内でクラスター化して水との接触から遠ざかり隔離される一方、頭部の極性基が溶媒と相互作用することは、界面活性剤、頭部の極性基と無極性の疎水性の脂質尾部とを有する洗剤様分子の一般的な特徴である。しかしながら、本発明のＨＬＢおよびＳＶＬＰは単なるミセルではない。ＨＬＢおよびＳＶＬＰの巨大分子構造は、非共有結合の力の独自の組み合わせ、すなわち、コイルドコイルペプチドドメインが集合してヘリックスバンドルとなるのを駆動する力と、脂質尾部の粒子内部への隔離を駆動する疎水性の力とが合わさることによって維持される。
【００７１】
遊離モノマーが溶液中に存在する最大濃度に相当する、ミセルが形成し始める濃度は、臨界ミセル濃度、またはより一般的には臨界凝集濃度である。臨界ミセル濃度は、ミセルの熱力学的安定性の尺度を提供する。臨界ミセル濃度の値は、両親媒性分子の疎水性部分および親水性部分の構造、ならびに温度や溶媒の組成のような外部要因によって変化する。低い臨界ミセル濃度は低い界面活性剤濃度で安定なミセルを示し、このことは、所望の活性（例えば細胞のターゲティングおよび送達）が、全体的に大幅に希釈した後でもミセル状構造を保持することに依存している生物学的適用において、重要である。本発明によるＳＶＬＰは低ｎＭ領域において熱力学的安定を維持し、このことはワクチン送達の目的に理想的であることを示している。この高い安定性はＳＶＬＰの独特の分子構造から生じる。さらに、ＳＶＬＰは、大きさおよび形状の分布が比較的均質であるように作製することができる。
【００７２】
本発明によるＳＶＬＰは、コア内に水溶液を囲い込む二分子膜構造を有するリポソームとは似ていない。ＳＶＬＰは、水性の外部に対して広面積の脂質膜を露出することはないので、リポソームよりもｉｎ ｖｉｖｏで安定であることができる。
【００７３】
先行技術のウイルス様粒子とは対照的に、本発明のＨＬＢおよびＳＶＬＰは人工的なものであり、これらの構成成分はすべて化学合成によって生産されるので、生物学的方法を使用して作製しなければならない材料の使用が回避される。ウイルス様粒子は「合成の」と称されてきたが、これらの粒子は、組換えＤＮＡ法および細胞を用いる方法を使用して作製された天然型もしくは遺伝子組換え型のウイルス粒子、またはその構成成分であって、化学合成によって生産された材料ではない。さらに、本発明のＳＶＬＰの設計および組成は、他のナノ粒子集合体、例えば金のクラスター、量子ドット、デンドリマー、組換え型タンパク質およびリポソームをベースとする集合体の設計および組成とは全く異なる。
【００７４】
本発明のＬＢＢは、リポペプチド中のコイルドコイルドメインが会合して規定のへリックスバンドル（例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体のヘリックスバンドル）となるように設計されている。この会合によりＨＬＢの形成がもたらされる。得られるリポペプチドへリックスバンドル（ＨＬＢ）（例えば、三量体を図１に示す）は、自己集合してナノメートル規模の大きさの合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）（巨大分子集合体）となることができる。ＬＢＢに抗原（ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、炭水化物またはハプテンの形態）が付着されている場合、複数のコピーがＨＬＢおよびＳＶＬＰの表面上に提示される。
【００７５】
自己（すなわちヒト）タンパク質に基づいたペプチド配列は不適切であるが、これは、ヒト（自己）タンパク質に対する免疫反応により人体に慢性自己免疫性疾患が生じる可能性があるからである（例えばグッドパスチャーの症候群、ヒトがコラーゲンに対する抗体を生じた時に引き起こされる自己免疫性疾患である）。
【００７６】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子を含む医薬製剤に関する。温血動物（特にヒト）への、鼻内、口腔内、直腸内もしくは経口投与のような腸内投与、および静脈内、筋肉内もしくは皮下投与のような非経口投与のための医薬製剤が考えられる。特に好ましいのは非経口投与のための製剤である。該製剤は、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を単独で、または好ましくは薬学的に許容可能な担体とともに含む。有効成分の用量は、意図されるワクチン接種によって、また生物種、該生物の年齢、体重および個体の状態、個々の薬物動態学的データ、ならびに投与方法によって変化する。
【００７７】
医薬製剤は、およそ１％〜およそ１０％の有効成分を含む。非経口投与のための単位用量形態は、例えばアンプルまたはバイアル、例えば、抗原を担持する合成ウイルス様粒子を約０．０１ｍｇ〜約１．０ｇ含むバイアルである。
【００７８】
優先されるのは、抗原を担持する合成ウイルス様粒子の溶液、さらには懸濁液または分散物、特に等張の水溶液、分散物または懸濁液であって、例えば有効成分を単独で、または担体（例えばマンニトール）と一緒に含む凍結乾燥形態の場合には使用前に調製することができるものを使用することである。医薬製剤は滅菌されてもよいし、添加剤（例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩類、およびバッファーのうち少なくともいずれか）を含んでもよく、かつそれ自体良く知られたやり方で、例えば従来の溶解処理および凍結乾燥処理によって調製される。前記溶液または懸濁液は粘性調節剤を含むこともできる。
【００７９】
非経口投与については、抗原を担持する合成ウイルス様粒子の水溶液、または粘性調節剤と所望の場合には安定化剤とを含む水性注射用懸濁液が、特に適切である。抗原を担持する合成ウイルス様粒子を、任意選択で添加剤とともに凍結乾燥物の形態とすることも可能であり、非経口投与の前に適切な溶媒を追加することによって溶液とすることができる。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子のワクチンとしての使用に関する。これらのワクチンは、感染症、アレルギー、がん、薬物依存、中毒、を含む疾患、障害または病態の予防または治療のための免疫応答を引き起こすために、また一般には効率的に抗原特異的な免疫応答を引き起こすために、有用である。
【００８１】
本発明はさらに、免疫遺伝学的に有効な量の、本明細書に記載されるような抗原を担持する合成ウイルス様粒子を、投与の必要のある患者に投与することを特徴とするワクチン接種方法に関する。
【実施例】
【００８２】
略語：
ＤＣＭ、 ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）；
ＤＩＥＡ、 ジイソプロピルエチルアミン；
Ｂｏｃ、 ｔ‐ブトキシカルボニル；
ＤＭＦ、 Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド；
ＥＤＴ、 エタンジチオール；
Ｆｍｏｃ、 ９‐フルオレニルメトキシカルボニル；
ＨＡＴＵ、 ２‐（１Ｈ‐９‐アザベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；
ＨＢＴＵ、 ２‐［１Ｈ‐ベンゾトリアゾール‐１‐イル］‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；
ＨＯＢｔ、 Ｎ‐ヒドロキシベンゾトリアゾール；
Ｐｂｆ、 ２，２，４，６，７‐ペンタメチルジヒドロベンゾフラン‐５‐スルホニル；
ＮＭＰ、 Ｎ‐メチルピロリドン；
ＭＢＨＡ、 メチルベンズヒドリルアミン
ＰｙＢＯＰ、 （ベンゾトリアゾール‐１‐イルオキシ）‐トリピロリジノホスホニウム‐ヘキサフルオロホスファート；
ｒ．ｔ．、 室温；
ＴＩＳ、 トリイソプロピルシラン（ｉＰｒ３ＳｉＨ）；
Ｔｒｔ、 トリチル；
ＴＦＡ、 トリフルオロ酢酸；
ｔＲ、 保持時間。
【００８３】
実施例１：リポペプチド４
【００８４】
【化１４】
このリポペプチド中のコイルドコイルペプチド５の配列番号１の一次配列は、大部分はＲＳＶのＦ糖タンパク質に由来する［ローレス‐デルメディコ、Ｍ．Ｋ．（Lawless-Delmedico, M. K.）ら、Biochemistry (2000), 39, 11684-11695］。このコイルドコイルペプチドは５つのヘプタドリピートを含む。Ｎ末端には、ペプチドのＮ末端をリン脂質に連結するためのコハク酸由来のリンカーとともに追加のグリシン残基がスペーサとして付加されており、その結果リポペプチド４が得られる。
【００８５】
このペプチド鎖の合成は、標準的なＦｍｏｃ法を使用して、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で実施した。鎖の組み立てを完了した後、リン脂質‐リンカーユニット（１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ））を樹脂上のペプチドの遊離Ｎ末端にカップリングした。その後、リン脂質を樹脂から切り出し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏを用いた処理によって側鎖保護基を除去した。逆相ＨＰＬＣにより精製した後、生成物を、分析用逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレイＭＳ（ｍ計算値６２３８．４；ｍ／ｚ観測値１５６０．８（（Ｍ＋４Ｈ）４＋））によって特徴解析した。
【００８６】
１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）は、１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミン（バッケム（Bachem）社）をトリエチルアミンのような塩基の存在下で無水コハク酸と反応させることにより容易に調製することができる。
【００８７】
ａ）ペプチド５
ペプチド鎖は、Ｆｍｏｃ法を使用して、ＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機でＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（ノババイオケム（Novabiochem）社）上で合成した。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｐ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｅｕ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、およびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨであった。樹脂（５００ｍｇ；０．４ｍｍｏｌ／ｇ）に、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＨＢＴＵ（３等量）、ＨＯＢｔ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）を使用してＦｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨを負荷した。未反応の遊離アミンを、Ａｃ２Ｏキャッピング溶液（ＮＭＰ中Ａｃ２Ｏ（０．５Ｍ）、ＤＩＥＡ（０．１２５Ｍ）およびＨＯＢｔ（０．０１５Ｍ）；１５ｍｌで３０分を２回）を使用してアセチル化した。カップリングは、５倍過剰量（１ｍｍｏｌ）の各アミノ酸を使用して実施した。
【００８８】
ペプチド鎖の組み立ての完了に続いて、該ペプチド鎖を樹脂から切り出し、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（９ｍｌ）によりｒ．ｔで３時間脱保護した。濾過および減圧下での濃縮の後、ペプチドを冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で沈澱させ、遠心分離処理してデカントした（３回繰り返した）。粗製生成物の分析用ＨＰＬＣによる精製（Ｃ１８カラム：バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：水＋０．１％ＴＦＡの中で５〜１００％アセトニトリル、１ｍｌ／分で２０分間；ｔＲ＝１６分）から、白色粉体としてペプチド５（収率１０％）が得られた。分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム：バイダック２１８ＴＰ５４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：水＋０．１％ＴＦＡの中で１０〜６０％アセトニトリル、１ｍｌ／分で３５分間）：ｔＲ＝２６分。ＥＳＩ‐ＭＳ（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）＋０．１％ＨＣＯＯＨ；陽イオンモード；ｍ／ｚ）：１８２２．８［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１３６７．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１０９４．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、９１１．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算上のＭＷ：５４６５．４ｇ／ｍｏｌ）。
【００８９】
ｂ）リポペプチド４
ペプチド５に関して上述のようにして、樹脂上での直鎖ペプチドの組み立てを実施した。ペプチド鎖の組み立て完了に続いて、１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）を樹脂上のＮ末端にカップリングした。該ペプチジル樹脂（８０μｍｏｌ）に、予め準備したＤＭＦ（５ｍｌ）中のＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１９０ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）、ＨＡＴＵ（９２ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）、ＨＯＡｔ（３３ｍｇ、２４０μｍｏｌ、３等量）およびＤＩＥＡ（１１０μｌ、６４０μｍｏｌ、８等量）の溶液を添加した。反応混合物をｒ．ｔ．で一晩渦流撹拌した。カップリングの進行をカイザーテストで観察した。カップリングの完了に続いて、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×５ｍｌ）、ＤＣＭ（３×５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（３×５ｍｌ）で洗浄した。その後、リポペプチドを樹脂から切り離し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（２７ｍｌ）でｒ．ｔ．で３時間脱保護した。濾過および減圧下での濃縮の後、ペプチドを冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で沈澱させ、遠心分離処理してデカントした（３回繰り返した）。セミ分取用ＨＰＬＣによる粗製生成物の精製（Ｃ４カラム：バイダック２１４ＴＰ１０１０；１０μｍ、３００Å、１０×２５０ｍｍ；５ｍｌ／分で１５分間に、水＋０．１％ＴＦＡ中で３０〜１００％アセトニトリルのグラジエント；ｔＲ＝１４．４分）により、白色粉体としてリポペプチド４を得た。分析用ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム：バイダック２１４ＴＰ１０４；１０μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍ；グラジエント：１ｍｌ／分で３０分間に、水＋０．１％ＴＦＡ中で１０〜１００％アセトニトリル）：ｔＲ＝２３．３分。ＥＳＩ‐ＭＳ（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）＋０．１％ＨＣＯＯＨ；陽イオンモード；ｍ／ｚ）：２０８１．４［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１５６０．８［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１２４８．９［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１０４０．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算上のＭＷ：６２３８．４ｇ／ｍｏｌ）。ε２７６＝１５１１Ｍ−１ｃｍ−１。
【００９０】
ｃ）リポペプチド４に関する生物物理学的研究
本発明の重要な特徴は、合成によって入手可能なリポペプチドが、自然に集合して規定の構造かつウイルス様ナノ粒子の大きさの巨大分子集合体となることができるということである。リポペプチド４は、振盪させながら緩衝水溶液中に溶解させることが可能であり、次いでＳＶＬＰの溶解特性を調べることができる。そのようなリポペプチドがＳＶＬＰを形成しうることを実証するために、リポペプチド４から生じる粒子について、様々な生物物理学的技法で特徴解析を実施しており、その原理を例証すべく本明細書で述べる。
【００９１】
リポペプチド４を用いた沈降平衡超遠心分離実験から、該粒子が４００ｋＤ範囲に見かけの質量を有することが示された（図３）。分析のために、３通りのロータ速度５，０００、７，５００および１０，０００ｒｐｍについて、また３通りの濃度２４、４８および２４０μＭについて三連のデータセットを集めた。低い方の２つのリポペプチド濃度におけるデータは、４５１，８２０±９，６７０ｇ．ｍｏｌ−１の見かけのモル質量を有する単一の理想的な分子種の存在を仮定したモデルによくフィットした。最も高い濃度（２４０μＭ）のデータを含めると見かけの質量は４３１，１７０±１４，１６０ｇ．ｍｏｌ−１となったが、特に超遠心分離用セルの底部近くでフィッティングの質が下がった。しかしながら、実験データからのフィッティングのずれは、凝集した材料の出現に典型的な形式を持たず、高濃度では理想的でないことが示されたのかもしれない。
【００９２】
沈降速度実験も実施し、見かけの沈降係数の分布、ｇ（ｓ＊）［スタフォード、Ｗ．Ｆ．（Stafford, W. F.）、Anal. Biochem. (1992), 203, 295-301］、Ｉｓ‐ｇ＊（ｓ）およびｃ（ｓ）［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］の面から分析した。異なる手法にもかかわらず、すべての方法から、〜１０Ｓを中心とした比較的広い分布が得られた。平衡データと速度データを一致させ、かつサイズ分布をより詳細に調査する試みにおいて、Ｓｅｄｆｉｔソフトウェアで実行されるようなラム（Lamm）の方程式のモデル化［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］を使用した；典型的なｃ（ｓ）プロファイルを図４に示す。恐らくはアーチファクトにより、低濃度では低いＳ値側に軽微なテーリングがあるように見えるが、分布はすべて９．５〜１０Ｓに集中している。離散した相互作用しない分子種を含む他のモデルを試験しても有意な統計学的改善は見られなかった。個々のｓ値の検討からは、明白な濃度依存は示されず、データのグローバルフィットとその後のモンテカルロ・シュミレーションから、値ｓ２０．ｗ＝９．８３７±４．４・１０−３Ｓが得られた。
【００９３】
リン脂質の化学的性質、および主な会合状態に含まれるモノマーの見かけの数（〜７２）から、検討した濃度範囲内ではリポペプチドはミセル様の構造を形成することが示唆され、また、各々が三量体のコイルドコイルリポペプチドで構成されたおよそ２４個のサブユニットが相互作用して、コイルドコイル状態のペプチド鎖で装飾されたコンパクトな脂質コアを形成するモデルが考えられる。生じる粒子のサイズは超遠心分離のデータで支持される。ペプチドが空間に最適に分布することも考えられる。そのような球状粒子を視覚化するために作製したコンピュータモデルを図５に示す。該モデルは、中心に集塊した疎水性の尾部と、溶液中へ花穂のように外側へ伸びる三量体のへリックス状のコイルドコイルとを示している。完全な球体以外の幾何学的形状も可能であるかもしれないが、該モデルは標準的条件下の希薄溶液中における該材料の挙動をよく反映しているようである。
【００９４】
円偏光二色性（ＣＤ）によりペプチドの立体配座を調べるために、リポペプチド４と同じペプチド配列を有するがリン脂質およびリンカーを欠くペプチド５を分析した。そのような系で予想された通り、該ペプチドは、温度および濃度の両方に依存するＣＤスペクトルを示した。該ペプチドは、ペプチド濃度３５μＭにおいて、１℃では高度にαへリックス状であり、熱変性の遷移は〜４０℃の中央点を示した。ペプチド５と類似の配列を備えたペプチドが、薄い水溶液中でモノマーと平衡状態にある三量体コイルドコイルを形成することが以前に示されている［ローレス‐デルメディコ、Ｍ．Ｋ．（Lawless-Delmedico, M. K.）ら、Biochemistry (2000), 39, 11684-11695］。ペプチド５は、Ｎ末端に２つの追加のグリシン残基を有し、遊離Ｎ末端を有する点でこのペプチドとは異なる。しかしながら、室温での遠紫外線ＣＤスペクトル（図６）は両ペプチドについて類似していた。いずれの軽微な差異も、恐らくは、追加のグリシン残基による非周期的構造の単純な追加、または該グリシン残基が引き起こした可能性のある何らかの構造上の摂動のうち少なくともいずれかによるものと思われた。スペクトルはランダムコイル／αヘリックス平衡に特徴的なものであり、ＣＯＮＴＩＮプログラムを使用するスペクトル分析［プロベンチャー、Ｓ．Ｗ．（Provencher, S. W.）、Comp. Phys. Comm. (1982), 27, 229-242］から、αヘリックス、βシートおよび非周期的な構造についてそれぞれ３３％、２５％および４２％の値が得られた。
【００９５】
ペプチド５にリン脂質部分を付加してリポペプチド４を形成することにより、ＣＤスペクトルに著しい変化が引き起こされ（図６）、ＣＯＮＴＩＮのフィットで判断されるようにヘリックス含量は〜１００％まで上昇する。スペクトルへのリン脂質部分の直接的寄与は小さいと考えられ、注目しなかった。ヘリックス含量の増加は、ペプチド単独の場合に見られる一方の平衡状態がより構造化された状態へ移行すること、高度に構造化された別の状態へ再編成がなされること、またはこれら２つの組み合わせを示している。上記に報告した流体力学上の結果から見て、後者は、極めて大きな凝集物と共存し、恐らくは新しい平衡系を形成する比較的小さな分子種の存在を説明しうるため、後者が事実であると思われる。
【００９６】
蛍光プローブのピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）を使用して臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を調べた。該プローブの蛍光特性は溶媒の極性に敏感であり、したがってプローブは疎水性のミセル媒体中では水性媒体と比較して異なる蛍光挙動を示す。該色素は、ミセルの疎水性内部に優先的に溶解し、その蛍光強度は水性環境と比較してより高く、また発光極大はより長い波長へと移行する。リポペプチド４存在下での該色素の発光スペクトルは、４６６ｎｍで主ピークおよび４３７ｎｍで微小ピークを示し、ミセル不在下では逆の挙動が見られた（図７）。
【００９７】
ＣＭＣを、蛍光変化の濃度依存性の計測により調べ［ヴィルヘルム、Ｍ．（Wilhelm, M.）ら、Macromol. (1991), 24, 1033-1040；アスタフィーバ、Ｉ．（Astafieva, I.）ら、Macromol. (1993), 26, 7339-7352］、＜２０ｎＭであることを見出した。しかしながら、該方法の感度および信頼性は、高いＣＭＣ値を有するミセル系に関しては非常に良好であるが、２０ｎＭ未満のＣＭＣ値の正確な測定には不十分のようである。したがって、この系におけるＰＹＣＨＯ蛍光スペクトルの特徴は低濃度における小さなピークシフトを示しただけであった（図７）。
【００９８】
リポペプチドの１２通りの希釈物における発光スペクトルを、１μＭ〜３ｎＭの範囲で計測し、データを発光強度の比Ｉ４３７／Ｉ４６６として濃度に対してプロットした。結果（図８）から、ＣＭＣ未満のペプチド濃度において予想されるプラトー領域が達成されなかったことは明白である。より高濃度（４００ｎＭ〜１μＭ）では、モノマー濃度を増加させることで新しいオリゴマーの形成が簡単にもたらされるプラトーの始まりが見られる。従って、ＰＹＣＨＯ蛍光スペクトルの変化は、オリゴマーが形成されることと、ＣＭＣが非常に低い（＜２０ｎＭ）こととを示している。
【００９９】
このリポペプチドに由来するＳＶＬＰの平均直径を、動的光散乱（ＤＬＳ）計測値から、球状微粒子用の数理モデルに基づいた数量重み付き分布解析を使用して計算した。データは約１７ｎｍの平均径と一致している（図９）。ＤＬＳによる粒径を４０℃でも計測したが、この場合粒径分布はわずかに狭くなり、生理的な温度ではおそらくより均質な粒径分布であることが示された（データは示されていない）。
【０１００】
電子顕微鏡法を用いてリポペプチドＳＶＬＰを視覚化した。透過型電子顕微鏡写真を記録するために、ｐＨ７．４のトリス緩衝液中３μＭのリポペプチド４溶液の陰性染色を使用した。粒子は、円形および星形のように見える（図１０）。これが、基本的に全体が球形のもの反映しているのか、あるいは円盤状のものを反映しているのか電子顕微鏡写真からは判定できないが、いずれの構造であってもミセル様の系を示すものであろう。粒子は、顕微鏡写真を評価するために使用した方法に依存して、平均直径が１７ｎｍであり主集団のあたりでおよそ±５ｎｍの粒径分布を有していた。試料の大きさおよび形状のいずれにおいても高い均質性が顕著であった。直径が２５ｎｍ〜４０ｎｍの少数のより大きな集合物も、顕微鏡写真で見ることができた。これは、粒子が多層をなして支持体に吸着した可能性があることから、使用した技法のアーチファクトであったかもしれない。しかしながら、電子顕微鏡法により、規則的な形状および寸法の、安定したナノスケールの星状粒子の形成が明白に示されている。
【０１０１】
星状の形状の粒子は、図５に描かれるような、リン脂質が粒子の中心を向き（疎水性コアを形成）、親水性ペプチド鎖が外側を向いているリポペプチドモノマーの配置構成を示唆している。
【０１０２】
ｄ）リポペプチド４に関する生物物理学的検討の実験の部
リン酸定量
アッセイの出典は［エームズ、Ｂ．Ｎ．（Ames, B. N.）、Methods Enzymol. (1966), 8, 115-118］であり、リン脂質部分の中に存在するリン酸総量を概算することにより、以降の実験で使用されるリポペプチド溶液の濃度を測定するために該アッセイを用いた。使用した材料は：２５０℃まで加熱することができる加熱ブロック（例えばテコン（Tecon）プログラマブル制御装置６３０）；元素分析用の耐熱性ホウケイ酸ガラスチューブ（６０×７ｍｍΦ）；および４５℃のウォーターバスである。
【０１０３】
１ｍＭリン酸溶液を、ＫＨ２ＰＯ４から正確に調製した（標準溶液、１μｌ＝１ｎｍｏｌリン酸）。この標準溶液のアリコート（試料について推測されるリン酸含量に応じて、通常は１０〜８０μｌ）を、検量線を構築するために一連の清潔なチューブに加えた。試料および検量用標準溶液を加熱ブロック（１００℃〜１２０℃）で乾燥させ、乾燥したら７０μｌのＨ２ＳＯ４／ＨＣｌＯ４（１：１）を各チューブに添加し、該チューブを２３０〜２５０℃で１５〜３０分間加熱した。
【０１０４】
０．８３５％アスコルビン酸／０．２％モリブデン酸アンモニウムの溶液を以下のようにして調製した；２回蒸留したＨ２Ｏでアスコルビン酸溶液（１０％ｗ／ｖ）およびモリブデン酸アンモニウム溶液（２．５％ｗ／ｖ）を調製した。利用の直前に、１．６７ｍｌのアスコルビン酸溶液および１．６０ｍｌのモリブデン酸アンモニウム溶液を合わせて混合し、体積を２０ｍｌに調節した（１２件の試料に十分な量）。
【０１０５】
２３０〜２５０℃で１５〜３０分間の後、試料をｒ．ｔ．に冷却し、１．６ｍｌのアッセイ溶液を振盪しながら添加し、次いで試料を４５℃で３０分間インキュベートした。試料やリン酸標準溶液の入っていないチューブを全く同じように処理してブランクを用意した。インキュベーション直後に、各試料の８２０ｎｍにおける吸光度を１ｃｍのセル中で計測した。試料の濃度を標準曲線から推定した。
【０１０６】
超遠心分析法
標準的な沈降平衡実験および沈降速度実験を、ＡＮ６０Ｔｉロータを装備したベックマン（Beckman）ＸＬ‐Ａ分析用超遠心機を使用して実施した。ダブルセクターかつ６チャネル測定のチャコールエポンのセンターピースを使用し、適切な場合にはフルオロカーボンＦＣ４３を使用してフォールスボトムを設けた。特定の実験に合わせて様々なロータ速度を設定し、すべての計測を２０℃で実施した。数種類のリポペプチド濃度で実験を実施し、９０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または９０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）のいずれかのバッファーを終始使用した。沈降平衡の実施において、０．００１ｃｍ間隔で径方向のデータを収集し、各データセットについて少なくとも１０回のスキャンを平均した。そのような３つのデータセットを各速度および濃度について得た。適切な時間間隔で収集されたデータの重ね合わせによって平衡を確認した。沈降速度データは２〜４分のスキャン間隔で径方向に０．００５ｃｍ間隔で得た。加法原理を用いて、みかけの偏比容を、脂質部分（ｖ２０＝０．９３４ｃｍ３ｇ−１）およびペプチド部分（ｖ２０＝０．７２６ｃｍ３ｇ−１）について別々に、これらのグループ寄与から計算した［コーン、Ｅ．Ｊ．（Cohn, E. J.）ら、「Proteins, amino acids and peptides as ions and dipolar ions」、（１９４３）、ニューヨーク所在のハーフナー出版（Hafner publishers）、のｐ．３７０−３８１；ヘイランド、Ｈ．（Hoeiland, H.）、「Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology」、（１９８６）、ベルリン所在のスプリンガー‐フェアラーク（Springer-Verlag）、のｐ．１７−４４；
トラウベ、Ｉ．（Traube, I.）、Ann. Chem. Liebigs (1891), 265, 27；ラウエ、Ｔ．Ｍ．（Laue, T. M.）、「Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science」、（１９９２）、ケンブリッジ所在の英国学士院化学出版（Royal Society of Chemistry publishers）］。リポペプチド４の偏比容（ｖ２０＝０．７８１ｃｍ３ｇ−１）は、２つの構成成分の値の質量加重平均として近似した。バッファー密度は標準テーブルからコンピュータで計算した［ラウエ、Ｔ．Ｍ．（Laue, T. M.）、「Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science」、（１９９２）、ケンブリッジ所在の英国学士院化学出版］。ソフトウェアパッケージＳｅｄｆｉｔおよびＳｅｄｐｈａｔ［シャック、Ｐ．（Schuck, P.）、Biophys. J. (2000), 78, 1606-1619］を速度データの分析に使用し、Ｕｌｔｒａｓｃａｎプログラムを沈降平衡データの分析に使用した［デメラー、Ｂ．（Demeler, B.）、ＵｌｔｒａＳｃａｎ５．０（２００１）］。
【０１０７】
円偏光二色性分光法
遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、日本分光株式会社のＪ−７１５分光旋光計および光路長０．１ｃｍの石英セルを使用してｒ．ｔ．で計測した。ペプチド５の溶液（５０μＭ）およびリポペプチド４の溶液（３５．７μＭ）をトリス緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で調製し、濃度をそれぞれに見合ったリン酸分析またはアミノ酸分析によって測定した。１０〜１００ｎｍ／分のスキャン速度、１〜２秒の応答時間および１ｎｍのスペクトルバンド幅を使用し、最低限の分解能０．５ｎｍでスペクトルを収集した。ブランクを差し引いた後、スペクトル値を平均残基楕円率［ｄｅｇ．ｃｍ２／ｄｍｏｌ］として報告し、平均残基分子量を計算する際には脂質部分を無視した。
【０１０８】
リポペプチド４の低濃度試料（２〜４０μＭ）のＣＤスペクトルを、光路長１ｃｍの石英セルを用いて日本分光株式会社のＪ−８１０分光旋光計にて２０℃で計測した。リポペプチド溶液をＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で調製し、濃度をリン酸分析によって測定した。１０ｎｍ／分のスキャン速度、４秒の応答時間および２ｎｍのスペクトルバンド幅を使用して、最低限の分解能０．５ｎｍでスペクトルを収集した。上記に記載のようにしてデータを処理した。
【０１０９】
蛍光：臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
蛍光プローブのピレン‐３‐カルボキシアルデヒド（ＰＹＣＨＯ）を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定に使用した［トウッロ、Ｎ．Ｊ．（Turro, N. J.）、Macromolecules (1984), 17, 2123-2126；アナンタパドマナバン、Ｋ．Ｐ．（Ananthapadmanabhan, K. P.）ら、Langmuir (1985), 1, 352-355］。パーキン・エルマー（Perkin Elmer）ＬＳ５５ルミネセンス分光計で蛍光スペクトルを得た。ピレン‐３‐カルボキシアルデヒドの発光スペクトルを、２０℃にて４００〜５５０ｎｍで計測した。該発光スペクトルは、３００ｎｍ／分のスキャン速度、４ｎｍの励起スリット幅、および９ｎｍの発光スリット幅として、試料を３８０ｎｍで励起することにより得られ、各スキャンを４回繰り返して平均化した。リポペプチド４の溶液は、予めＰＹＣＨＯで飽和させたＨＢＳ ｐＨ７．４（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、９０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して調製した（溶液濃度＜１０−６Ｍ）。１μＭ〜５ｎＭの１２種類のペプチド濃度で蛍光スペクトルを計測し、試料の濃度はリン酸アッセイを使用して測定した。低ｎＭ（５０ｎＭ−３ｎＭ）領域のリポペプチド濃度は、ＨＢＳバッファー中の飽和ＰＹＣＨＯ溶液の１／１０希釈液を使用して調製した。データをＯｒｉｇｉｎ（ｖ７．０）ソフトウェアで解析し、発光スペクトルの相対強度比Ｉ４３７／Ｉ４６６を試料濃度に対してプロットしてＣＭＣ値を推定した。
【０１１０】
動的光散乱（ＤＬＳ）
光散乱法を、ＮＩＣＯＭＰサブミクロン粒径測定器（モデル３７０）で実施した。リポペプチド４試料をトリスバッファー（１０ｍＭ、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で調製し、試料濃度はリン酸アッセイを使用して測定した。リポペプチド４の１．１ｍＭ溶液を０．４５μＭミリポアフィルターで濾過し、１．０５ｍＭの試料を得た。この溶液について、２０℃、３０℃および３７℃で光散乱法を実施した。２０℃ではｔ＝０、２０および９０分、３０℃および３７℃ではｔ＝０および９０分で測定を実施した。データ処理は、理想的な球状微粒子の存在を仮定するＮＩＣＯＭＰ多成分フィッティングモデルを用いて実施した。
【０１１１】
電子顕微鏡法
カーボン被膜付き４００メッシュ銅製グリッドを酸素プラズマ処理で親水化したものを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による予備構造解析に使用した。リポペプチド４溶液（トリス緩衝液（ｐＨ７．４）中４μＭ）の小滴を親水性のＣ‐支持体に載せ、２０秒後、ごく薄い層がグリッド上に残るようにほとんどの溶液を取り除いた。その後、少量の水を表面に接触させることによりグリッドを洗浄した。過剰な水を拭き取り、少量の２％酢酸ウラニル水溶液を表面に接触させることにより直ちにグリッドを染色した。染色液を除去した後、グリッドを乾燥させた。顕微鏡写真は、１ｋ×１ｋのスロースキャンＣＣＤカメラ（プロスキャン（ProScan）、ドイツ連邦共和国ミュンヘン所在）を使用して、ツァイス（Zeiss）ＥＭ９１２電子顕微鏡（ツァイスＡＧ（Zeiss AG）、ドイツ連邦共和国オーバーコッヘン所在）で記録した。
【０１１２】
実施例２：リポペプチド６
【０１１３】
【化１５】
リポペプチド６は、追加のＣｙｓが配列番号１のＣ末端に付加されている点を除いてリポペプチド４と同一である。このＣｙｓの側鎖はリポペプチドを抗原にコンジュゲートさせるために使用することができる。
【０１１４】
５３ｍｅｒのペプチドを、ペプチド５について上述したように、Ｆｍｏｃ法を使用して、さらにＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨも用いてＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で合成した。合成が完了したらすぐに、樹脂の試料をＴＦＡで処理した。その後、生成物を、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ（Ｒ）Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣにより、１８分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリル、次いで４分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１００％アセトニトリルまでのグラジエントを使用して分析した。保持時間＝１９．６分。ＥＳＩ‐ＭＳ：（ｍ／ｚ）：１３９３．２［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１１１５．０［Ｍ＋５Ｈ］５＋；９２９．１［Ｍ＋６Ｈ］６＋；７９６．８［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｍ実測値＝５５６９．６±０．０１％；Ｍ計算値＝５５６９．６）。正しい直鎖ペプチドが樹脂上に存在していたので、リン脂質１，３‐ジパルミトイル‐グリセロ‐２‐ホスホエタノールアミド‐スクシナート（ＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ）を、ＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２（２：１）に溶解したＰｙＢＯＰ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）を使用してｒ．ｔで１６時間、残りの樹脂に結合しているペプチドのＮ末端にカップリングした。カップリングの完了はカイザーテスト陰性により確認した。得られた樹脂結合コンジュゲートを最後に樹脂から切り離し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＥＤＴ（９２．５：２．５：２．５：２．５）を使用して３時間脱保護した。ＴＦＡ相を減圧下で濃縮し、次に粗製の脱保護リポペプチドを冷ｉＰｒ２Ｏの添加によって沈澱させた。遠心分離した後、ペレットをｉＰｒ２Ｏで２度洗浄し、高真空下で乾燥させた。生成物をＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＤＭＦ（４：４：２）に溶解し、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ；１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して精製した。生成物を含むフラクションを凍結乾燥してコンジュゲート６を得た。コンジュゲート６を、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％。ｔＲ＝１７．２分。ＥＳＩ‐ＭＳ（陽イオンモード）（ｍ／ｚ）：１５８７．７［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１２６９．６［Ｍ＋５Ｈ］５＋；１０５８．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋；９０７．０［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｍ実測値＝６３４２．９±０．０１％；Ｍ計算値＝６３４２．６）。
【０１１５】
実施例３：リポペプチド７
【０１１６】
【化１６】
この分子のペプチド部分（配列番号２）は、設計したコイルドコイルヘプタドリピート配列を、ＨＩＶ‐１のＪＲ‐ＦＬ株のｇｐ４１タンパク質から得られた天然のコイルドコイル配列に融合させたものを含んでいる。したがってこのコイルドコイル配列は、一部は天然のものであり一部は設計されたものである。さらに、ジペプチド‐ＳＧ‐をＮ末端に付加して脂質の前の短いスペーサとして作用させ、またＣ末端にはジペプチド‐ＣＧ‐を取り付けてＣｙｓ残基中のチオール基を抗原とのコンジュゲートに使用できるようになっている。
【０１１７】
該ペプチドを、活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡと、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙを搭載した２‐クロロトリチルクロリド樹脂（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ、５００ｍｇ）とを使用して組み立てた。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｒｇ（Ｐｂｆ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｐ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｅｕ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｍｅｔ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨであった。６倍過剰量のＦｍｏｃアミノ酸および８等量のＤＩＥＡを使用した。各カップリングサイクルの後、残っている遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡでキャッピングした。組み立ておよび末端Ｆｍｏｃ基の除去の後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）およびｎ−ヘキサン（４×６ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。脂質部分をカップリングするために、樹脂（９５７ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２中で３０分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（２：１）（３．５ｍｌ）中の、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐ＯＨ（Ｆｍｏｃ‐Ｐａｍ２Ｃｙｓ‐ＯＨ、１７４ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（１０１ｍｇ）およびＨＯＢｔ（２６ｍｇ）の溶液を添加し、続いてＤＩＥＡ（１．６等量）を添加した。この混合物を、振盪機上でｒ．ｔ．にて１８時間穏やかに撹拌した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＤＭＦ（５×６ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いた処理（２ｍｌで２分間×６回）で除去した。脱保護は３０１ｎｍでのＵＶ吸収によって観察した。樹脂を、ＤＭＦ（５×１０ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）、およびｎヘキサン（４×６ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（２×６ｍｌ）で洗浄した。ペプチジル樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中の０．６％ＴＦＡで処理し（４．５ｍｌで２分間×４回）、続いてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下で蒸発させた。続いて、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（６９：１０：１０：５：３．５：１）（９．８５ｍｌ）を用いてｒ．ｔ．で２時間穏やかに撹拌する処理によって側鎖保護基を除去した。脱保護されたペプチドを、予め−２０°に冷却したｉＰｒ２Ｏの中で沈澱させ、ｉＰｒ２Ｏ（１５ｍｌ）で３回洗浄した。沈殿物を一晩空気乾燥させ、分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いたＲＰ‐ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して、コイルドコイルリポペプチドを精製した。収量：４５ｍｇ。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１１．９２分。ＬＣ‐ＭＳ：Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ：ｔＲ＝５．４７分；ｍ／ｚ＝１３４２．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１１８．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９５９．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋、８９３．４［Ｍ＋８Ｈ］８＋、７４６．６［Ｍ＋９Ｈ］９＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３０８Ｈ５３２Ｎ７６Ｏ８２Ｓ３について計算したｍ／ｚ：６７０４．９；観測されたｍ／ｚ：６７０４．７［Ｍ］＋。
【０１１８】
実施例４：リポペプチド８
【０１１９】
【化１７】
リポペプチド８は、設計したコイルドコイル（配列番号３）がＮ末端で短いリンカーを介してリン脂質に結合したものを含んでいる。
【０１２０】
ペプチド（配列番号３）は、Ｆｍｏｃ法を使用し、活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡと２‐クロロトリチルクロリド樹脂（０．４２ｍｍｏｌ／ｇ、５９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌスケール）とを使用して組み立てた。使用したアミノ酸はＦｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨであった。４倍過剰量のＦｍｏｃ保護アミノ酸および６等量のＤＩＥＡを使用した。各カップリングサイクルの後、残存している遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡでキャッピングした。ペプチド鎖の組み立ておよび末端Ｆｍｏｃ基の除去の後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ｉ‐ＰｒＯＨ（５×６ｍｌ）およびｎヘキサン（４×６ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。脂質部分をカップリングするために、樹脂（２５０ｍｇ）をＤＣＭ中で３０分間膨潤させた。ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＰＥ‐ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１１３ｍｇ）、ＰｙＢＯＰ（６６ｍｇ）およびＨＯＢｔ（１７ｍｇ）の溶液を添加し、続いてＤＩＥＡ（３１μｌ、３００μｍｏｌ、６．０等量）を添加した。この混合物を、振盪機でｒ．ｔ．にて１６時間穏やかに撹拌した。樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）およびＤＣＭ（２×６ｍｌ）で洗浄した。ペプチジル樹脂をＤＣＭ中の０．６％ＴＦＡで処理し（４．５ｍｌで２分間を４回）、続いてＤＣＭで洗浄した。濾液を合わせ、減圧下で蒸発させた。その後、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）を用いてｒ．ｔ．で２時間穏やかに撹拌することにより側鎖保護基を除去した。脱保護されたペプチドを、予め−２０°に冷却したｉＰｒ２Ｏで沈澱させ、ｉＰｒ２Ｏで３回洗浄した。分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して、リポペプチド８を精製した。収量：１５ｍｇ。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝１２．５４分。ＥＳＩ‐ＭＳ：Ｃ２６７Ｈ４７４Ｎ５７Ｏ７９ＰＳについて計算したｍ／ｚ：５８１０．０；観測されたｍ／ｚ：１４５３．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１１６２．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋。
【０１２１】
実施例５：４‐マレイミドブチリル‐ヒドラジノグリシニル基を担持する抗原Ｖ３ＳＳ、１２
【０１２２】
【化１８】
Ｖ３ＳＳと呼ばれるジスルフィド架橋ペプチドは、主としてＨＩＶ‐１のｇｐ１２０糖タンパク質のいわゆるＶ３ループから得られる。この配列（配列番号４）はｇｐ１２０のいわゆる主要中和決定基を表し、潜在的なＨＩＶ‐１ワクチン候補として広く研究されてきた［ホアン、Ｃ．Ｃ．（Huang, C.-C.）ら、Science (2005), 310, 1025-1028；パントフレット、Ｒ．（Pantophlet, R.）ら、Annu. Rev. Immunol. (2006), 24, 739-769］。したがって、ジスルフィド架橋ペプチドＶ３ＳＳはｇｐ１２０のＶ３ループのエピトープミメティックである。
【０１２３】
Ｖ３ＳＳ（配列番号４）のＮ末端にはヒドラジノグリシン（Ｚ）残基が付加されているので、求核性のヒドラジノ基を使用して該ペプチドをＬＢＢにカップリングすることができる。ペプチド鎖を、標準的な固相法およびＦｍｏｃ法を使用して２‐クロロトリチルクロリド樹脂上で組み立てた。トリＢｏｃで保護したヒドラジノグリシン残基をＮ末端に付加した。樹脂から切り離して十分に脱保護した後、空気酸化によってジスルフィド結合を導入した。最後に、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）リンカーをＮ末端のヒドラジノ基と部位特異的に反応させて生成物１２を得た。
【０１２４】
直鎖ペプチドＺ‐ＮＣＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＣＧ（Ｚが配列番号４に付加される；Ｚは‐ＮＨＮＨＣＨ２ＣＯ‐を意味する）を、標準的なＦｍｏｃ法および２‐クロロトリチルクロリド樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨを負荷した後、以下の側鎖保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｒｇ（Ｐｂｆ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｔｙｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨを合成に使用した。Ｎ末端残基として、Ｂｏｃで保護したヒドラジノグリシンを、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のトリＢｏｃ‐ヒドラジノ酢酸（３等量）、ＰｙＢＯＰ（３等量）およびＤＩＥＡ（８等量）の溶液で樹脂を３時間処理することによりカップリングした。その後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×）、次いでＣＨ２Ｃｌ２（５×）で洗浄した。ペプチドを樹脂から切り出し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／エタンジチオール（９２．５：２．５：２．５：２．５）（１５ｍｌ）で樹脂を２．５時間処理することにより脱保護した。濾過により樹脂を取り除き、濾液を減圧下で濃縮した後、冷ｉＰｒ２Ｏの添加によって粗製の脱保護直鎖ペプチドを沈澱させた。遠心分離した後、ペレットをｉＰｒ２Ｏで２回洗浄し、高真空下で乾燥させて白色固形物を得た。生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して精製し、還元されたジチオール形態の純粋な直鎖ペプチドを得た。このペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（分析用Ｃ１８カラムＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）によって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．２分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２２１１．２［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２２１０．２±０．０１％；Ｍ計算値＝２２１０．４）。
【０１２５】
酸化（ジスルフィド架橋の形成）については、Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）中の直鎖ペプチド（２０ｍｇ）の溶液を、空気中ｒ．ｔ．で４８時間撹拌した。対応するジスルフィド架橋ペプチドを、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１２〜４０％アセトニトリルのグラジエントを使用して直接精製し、１５ｍｇの酸化ペプチドを得た。酸化（ジスルフィド架橋）ペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（分析用Ｃ１８カラムＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）によって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．２分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２２０９．０［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２２０８．０±０．０１％；Ｍ計算値＝２２０８．４）。
【０１２６】
Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）中のジスルフィド架橋ペプチド（３０ｍｇ）をＨ２Ｏ（３ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＨ（０．２Ｎ）を使用してｐＨをｐＨ６に調節した。ここに、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）（３等量、１１ｍｇ）のＴＨＦ溶液（４５０μｌ）を添加し、反応混合物をｒ．ｔ．で２時間撹拌した。その後、溶液をＨ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍｌ）で希釈し、生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ‐Ｃ１８；２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１６分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜５０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して精製し、２１ｍｇのペプチド１２を得た。ペプチド１２を、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ‐Ｃ１８；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、８０Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％；ｔＲ＝１４．７分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：２３７４．３［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝２３７３．３±０．０１％；Ｍ計算値＝２３７３．４）。
【０１２７】
実施例６：４‐マレイミドブチリル基を担持する抗原ＬＹ‐ＣＨ、ＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ
【０１２８】
【化１９】
実施例５のように、ＨＭＢリンカーを、有機小分子ハプテンであるルシファーイエロー‐ＣＨ（ＬＹ‐ＣＨ）と呼ばれる黄色色素とカップリングして、コンジュゲートＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢを得た。
【０１２９】
ルシファーイエロー‐ＣＨ（ＬＹ‐ＣＨ）（スイス国ブーフ所在のフルカ（Fluka）社製、１２．５ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（１ｍｌ、４：１）に溶解し、溶液のｐＨを０．２ＮのＮａＯＨで６．５に調節した。この溶液に、ＴＨＦ（４００μｌ）中のＮ‐ヒドロキシスクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート（ＨＭＢ）（１５ｍｇ、２等量）の溶液を添加し、反応混合物をｒ．ｔ．で６時間撹拌した。Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍｌ）で希釈した後、生成物を、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ；２１ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、１２０Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜５０％アセトニトリルのグラジエントを使用して直接精製し、９．６ｍｇのＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢを黄色固形物として得た。ＥＳＩ‐ＭＳ（ｍ／ｚ）：６０８．０［Ｍ−Ｈ］−、６３０．９［Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−（陰イオンモード）。
【０１３０】
実施例７：コンジュゲートＬＢＢ６‐１２
ペプチド１２（実施例５、５．９ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（４：１）（７５０μｌ）に溶解し、溶液のｐＨをＮａＯＨ（０．２Ｎ）で６．５に調節した。これに、リポペプチド６（実施例２、６．６ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（１：１）に溶解した溶液（８００μｌ）を添加し、反応混合物を不活性雰囲気下にてｒ．ｔ．で２時間撹拌した。Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ０．１％（２ｍＬ）で希釈した後、生成物を、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ；１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、１５分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して直接精製し、４ｍｇのＬＢＢ６‐１２を得た。このコンジュゲートを、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ ＵＰ５ＷＣ４‐２５ＱＳ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ、３００Å）を用いた逆相ＨＰＬＣによって、２０分間に水（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％アセトニトリルのグラジエントを使用して分析した：純度＞９８％。ｔＲ＝１５．４分。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：８７１７．４［Ｍ＋１Ｈ］１＋（Ｍ実測値＝８７１６．４±０．０１％；Ｍ計算値＝８７１６．３）。
【０１３１】
実施例８：コンジュゲートＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨ
リポペプチド６（実施例２、１．１ｍｇ、１７７ｎｍｏｌ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＥ（１：４：１）（６００μｌ）中の溶液を撹拌している中に、ＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ（実施例６、４４０μｇ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）溶液（４００μｌ）を少量ずつ添加した。０．０１ＮのＮａＯＨでｐＨをｐＨ６．３に注意深く調節し、混合物をｒ．ｔ．で２時間激しく撹拌した。リポペプチド６およびルシファーイエローコンジュゲートは様々なＨ２Ｏ／ＭｅＣＮグラジエントについてＣ４およびＣ８のＲＰ‐ＨＰＬＣカラム上で同一の保持時間を有するので、反応後にＥＳＩ‐ＭＳを使用してリポペプチド６の消失をモニターした。反応が完了したらすぐに、該懸濁物を０．１％ＴＦＡ（５００μｌ）の添加により希釈し、付加生成物を、Ｃ４カラムを用いるセミ分取逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４‐２５Ｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ、１０ｍ、３００Å孔径、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、１６．５分間に５０〜１００％Ｂ）によって過剰なＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢから分離した。ＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨコンジュゲートは、ｔＲ＝１３．３８分の鋭いピークとして溶出された。収量：１．０ｍｇ（８２％）。生成物を、分析用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ；４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０ｍ、３００Å）を用いる逆相ＨＰＬＣ、およびＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、イオン源、検出器）によって分析した。分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、１３分間に５０〜１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１３．０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｃ８カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋ＨＣＯＯＨ、１０分間に３０〜１００％Ｂ）：保持時間＝７．７３分。ｍ／ｚ：１３９２．４［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１６０．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９９４．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋（Ｃ３０７Ｈ５１４Ｎ７４Ｏ９９ＰＳ３Ｌｉについて計算したｍ／ｚ：１３９２．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１１６０．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋、９９４．７［Ｍ＋７Ｈ］７＋）。
【０１３２】
実施例９：コンジュゲートＬＢＢ７‐１２
リポペプチド７（実施例３、３．５ｍｇ）のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＥ（４：１：１）（１．２ｍｌ）中の溶液を撹拌している中に、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）（４００μｌ）中の１２（実施例５、３．７ｍｇ）の溶液を添加した。０．１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ＝６．０に注意深く調節した。該混合物をｒ．ｔ．で２時間撹拌した。反応の完了（Ｃ８カラムを使用してＬＣ‐ＭＳによって検出）の後に、コンジュゲートＬＢＢ７‐１２を、Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いるセミ分取用ＲＰ‐ＨＰＬＣによって、１７分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して直接精製した。収量：４．１ｍｇ（８７％）。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ））：純度＞９７％、保持時間＝１０．７２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝５．５３分、ｍ／ｚ＝１０１０．４［Ｍ＋９Ｈ］９＋、９０９．８［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋、８２７．２［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋、７５８．３［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋、７００．０［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０９Ｈ６８５Ｎ１０９Ｏ１１２Ｓ５について計算したｍ／ｚ：９０８２．０；観測されたｍ／ｚ：９０８２．８［Ｍ］＋、４５４２．１［Ｍ］２＋。
【０１３３】
実施例１０：コンジュゲートＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨ
ＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨの合成および精製は、リポペプチド７（３．０ｍｇ）およびＬＹ‐ＣＨ‐ＨＭＢ（実施例６、１．１ｍｇ）を使用して、実施例９にＬＢＢ７‐１２について述べたようにして実施した。収量：２．８ｍｇ（８６％）。ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（１２．５分間にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝１１．９１分。ＬＣ‐ＭＳ：Ｃ８カラム、５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で６６〜１００％ＭｅＣＮ：ｔＲ＝２．７分、ｍ／ｚ＝１４６４．９［Ｍ＋５Ｈ］５＋、１２２０．７［Ｍ＋６Ｈ］６＋、１０４６．５［Ｍ＋７Ｈ］７＋、９１５．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３２９Ｈ５４９Ｎ８２Ｏ９４Ｓ５Ｌｉについて計算したｍ／ｚ：７３２４．８；観測されたｍ／ｚ：７３３６．６［Ｍ−Ｌｉ＋Ｎａ］＋、７３２０．４［Ｍ］＋、３６６０．０［Ｍ］２＋。
【０１３４】
実施例１１：免疫化
ＨＬＢおよびＳＶＬＰの１つの重要な用途は、免疫応答を高めるための免疫系へのワクチン成分の送達にある。抗原を搭載したＨＬＢまたはＳＶＬＰで動物を免疫化すると、効率的な抗原特異的免疫応答が誘発されるはずである。これが可能であることを実証するために、ＬＢＢ６‐１２、ＬＢＢ６‐ＬＹ‐ＣＨ、ＬＢＢ７‐１２およびＬＢＢ７‐ＬＹ‐ＣＨを用いてウサギを免疫化した。さらに、最初の３つのコンジュゲートは、フロイントの完全／不完全アジュバントを使用する場合および不使用の場合について試験した。ＤＬＳの検討から、各コンジュゲートが水溶液中で自然に自己集合することによりＨＬＢまたはＳＶＬＰを形成することが示された。
【０１３５】
４００μｌのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）の中で、またはフロイントのアジュバント（初回免疫にはフロイントの完全アジュバント（ＦＡ）、追加免疫にはフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ））とともに、ｒ．ｔ．で少なくとも１時間再構成および平衡化した１種類のコンジュゲート１５０μｇを用いて、ウサギ（１群２羽）を免疫化した。免疫化は第０日、第２８日および第５６日に実施した。第１４日、第３８日および第６６日に血清を採取した。血清を酸素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって分析し、免疫化に使用したコンジュゲートに結合する抗体を検出した。結果を表１に示す。
【０１３６】
表１．コンジュゲートの免疫原性
各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。免疫前血清試料は、対応する免疫原との有意な反応性を示さなかった。例えば、ｌｏｇ１０（終点）力価５．００は力価１００，０００に相当する。
【０１３７】
【表１】
表１からわかるように、すべてのコンジュゲートが第２の追加免疫後に高い抗体レベルを引き起こした。ほとんどの初回の抗血清（力価は１：１００〜１：１５，０００に及ぶ）において既に反応が検出可能であり、抗体価の最も急激な上昇は２回目の免疫化の後に観察され、２回目の免疫化から３回目の免疫化については軽微な上昇が見られた。アジュバントを使用せずに到達した抗体価は、フロイントアジュバントを使用して達成された抗体価と同じか、またはそれより高いことも明らかとなった。これは、アジュバントを使用せずに良好な免疫応答を達成させることができることを示している。
【０１３８】
各々のハプテン特異的免疫応答の特異性についてもＥＬＩＳＡによって分析した（表２）。ここでは、各コンジュゲートによって誘導された抗体が異なるＬＢＢに付着された同じ抗原と交差反応する能力を測定した。結果から、免疫応答のかなりの部分が各ＬＢＢに付着された抗原に対して指向性を有することが示された。
【０１３９】
表２．ハプテン特異的免疫応答の特異性
各免疫原に対して生成された抗体を、各抗原との交差反応に関してＥＬＩＳＡで試験した。各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。
【０１４０】
【表２】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc） ｌｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（ＴＭ） Ｐｏｌｙｓｏｒｂ（Ｒ） Ｆ９６）を、ＰＢＳに溶解した各抗原の５μｇ／ｍｌ溶液で一晩コーティング処理した。その後、ウェルを０．０５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、５％脱脂粉乳を含むＰＢＳでｒ．ｔ．にて１時間ブロッキング処理した。ブロッキング処理の後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、０．０５％トゥイーン２０と０．５％脱脂粉乳とを含むＰＢＳ（ＭＰＢＳＴ）で系列希釈したウサギ血清とともにｒ．ｔ．にて２．５時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、プレートを、アルカリホスファターゼ結合型マウス抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ（Sigma））（ＭＰＢＳＴ中で１：２００００に希釈）とともに、ｒ．ｔ．で１時間インキュベートし、再びＰＢＳＴで３回洗浄し、基質バッファー（５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．６）中のパラニトロフェニルリン酸（シグマ）１ｍｇ／ｍｌ溶液とともに暗所でｒ．ｔ．にてインキュベートした。適切な時間を経た後、バイオラッド（Bio-Rad）社のモデル３５５０マイクロプレートリーダを使用して４０５ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１４１】
実施例１２：リポペプチド９
【０１４２】
【化２０】
この実施例は、実施例４のリポペプチド８のＩＥＫＫＩＥＡヘプタドリピートモチーフをベースとして、さらにユニバーサルなヘルパーＴ細胞エピトープ［シニガーリャ、Ｆ．（Sinigaglia, F.）ら、Nature (1988), 336, 778-780に記載］が正確に融合しており、かつＣ末端に、溶解度および安定性を改善し、抗原の結合を可能にするための追加の残基を含む。
【０１４３】
直鎖ペプチドＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＫＫＣａ−ＮＨ２（配列番号２８、「ａ‐ＮＨ２」で表されたＤ‐アラニンアミドがＣ末端に付加されている）を、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。活性化のためのＨＢＴＵ、ＨＯＢｔおよびＤＩＥＡを使用して樹脂に最初にＦｍｏｃ‐Ｄ‐アラニンを載せた後、以下の保護アミノ酸を正確な順序で使用してペプチドを組み立てた：Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｍｅｔ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｖａｌ‐ＯＨ。各カップリングサイクルの後で、残存している遊離アミノ基をＡｃ２Ｏ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡを使用してアセチル化した。鎖の組み立てが完了して末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。脂質部分のカップリングについては、樹脂（３２５ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中で４５分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＰＥ‐Ｓｕｃｃ‐ＯＨ（１２０ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（７８ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、１５０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。該混合物を２０時間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。切り出しおよび側鎖保護基の除去については、樹脂を、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）で２．５時間振盪しながら処理した。樹脂を濾過し、ペプチドをｉＰｒ２Ｏ（予め−２０°に冷却）で沈澱させてｉＰｒ２Ｏ（３×２５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を一晩空気乾燥させ、分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してリポペプチドを精製した。収量：３７ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝２２．１０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＨＣＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝５．３２分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝９９０．３［Ｍ＋７Ｈ］７＋；８６６．６［Ｍ＋８Ｈ］８＋；７７０．２［Ｍ＋９Ｈ］９＋；６９３．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３１５Ｈ５５７Ｎ７４Ｏ９０ＰＳ２について計算したｍ／ｚ：６９１６．３；観測されたｍ／ｚ：６９１６．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４４】
実施例１３：リポペプチド１０
【０１４５】
【化２１】
この実施例は実施例１２と同じペプチド配列を使用するが、リン脂質に基づいた脂質頭部基の代わりにＰａｍ２‐システインに基づいた脂質頭部基（Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル））を含む。
【０１４６】
リポペプチド９について上述したように、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、アプライドバイオシステムズのＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で直鎖ペプチドを合成した。ペプチド鎖のＮ末端への脂質部分のカップリングについては、樹脂（２８０ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中で３０分間膨潤させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：２）（４．５ｍｌ）中のＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（（ＲＳ）‐２，３‐ジ（パルミトイルオキシ）‐プロピル）‐ＯＨ（１３４ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（７８ｍｇ、１５０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、１５０μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。該混合物を室温で２０時間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×６ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を除去するために、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（４．５ｍｌで２分を５回）で処理した。Ｆｍｏｃ保護基を完全に除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。切り出しおよび側鎖保護基の除去については、樹脂を、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（７５：１０：１０：４：１）（１０ｍｌ）で２．５時間振盪しながら処理した。リポペプチド９について上述したようにして、リポペプチドを沈澱させて精製した。収量：４５ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝２２．７１分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で３０〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．８７分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝８５１．１［Ｍ＋８Ｈ］８＋；７５６．９［Ｍ＋９Ｈ］９＋；６８１．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；６１８．１［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ３１２Ｈ５５２Ｎ７４Ｏ８５Ｓ３について計算したｍ／ｚ：６７９６．４；観測されたｍ／ｚ：６７９８．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４７】
実施例１４：ガンマ‐マレイミドブチリル基を担持する抗原、ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１４８】
【化２２】
ペプチド配列は、主としてマラリア原虫の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質のＮＰＮＡリピート領域から得られるが、該タンパク質はマラリアワクチン候補としての可能性について広く研究されてきたものである［ヘリングトン、Ｄ．Ａ．（Herrington, D. A.）ら、Nature (1987), 328, 257-259］。Ｃ末端には、安定性を改善するために追加のＤ‐アラニンアミド（「ａ‐ＮＨ２」と表示されている）が付加されている。ガンマ‐マレイミドブチリル（ＧＭＢ）基は、リポペプチド９またはリポペプチド１０のシステイン残基とコンジュゲート可能なように付加されている。
【０１４９】
直鎖ペプチドＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡａ‐ＮＨ２（配列番号３０、追加のＤ‐アラニンアミドがＣ末端に付加されている）を、標準的なＦｍｏｃ法およびＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（搭載量０．６９ｍｍｏｌ／ｇ、３６２ｍｇ）、ならびに活性化のためのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡを使用して、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。使用したアミノ酸は、Ｆｍｏｃ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｄ‐Ａｌａ‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｍｔｔ）‐ＯＨおよびＦｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐ＯＨであった。鎖の組み立てが完了して末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂をＤＭＦ（５×６ｍｌ）、ＤＣＭ（５×６ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５×６ｍｌ）で洗浄し、ＫＯＨペレット上で減圧下にて乾燥させた。ペプチドを切り出し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）（１０ｍｌ）で４時間処理することにより側鎖保護基を除去した。ペプチドをｉＰｒ２Ｏ（予め−２０°に冷却）で沈澱させてｉＰｒ２Ｏ（３×２５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を減圧下で乾燥させ、分取用Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２８分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜３０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してペプチドを精製した。収量：１６２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２１分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ）：純度＞９５％、ｔＲ＝８．７７分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝３．６１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝６９１．６［Ｍ＋３Ｈ］３＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ８３Ｈ１２７Ｎ３１Ｏ３２について計算したｍ／ｚ：２０７１．１；観測されたｍ／ｚ：２０６９．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５０】
ペプチドにＧＭＢリンカーをカップリングするために、ＴＨＦ（０．５ｍｌ）中の４‐マレイミドブチリル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ‐スクシンイミジル‐４‐マレイミドブチラート、１４．０ｍｇ、４９．２μｍｏｌ、６等量）の溶液を、５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５（０．５ｍｌ）中のペプチド（１７．０ｍｇ、８．２μｍｏｌ）の撹拌中の溶液に少量ずつ添加した。該混合物を４°で２０時間撹拌し、凍結乾燥し、分取用Ｃ１８カラム（ウォーターズ（Waters））を用いる逆相ＨＰＬＣによって、２０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で１０〜４０％ＭｅＣＮのグラジエントを使用して生成物ＧＭＢ‐Ｌ２１を精製した。収量：１０．４ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ：純度＞９５％、ｔＲ＝１３．０２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝３．１５分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝７４６．５［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
【０１５１】
実施例１５：３‐マレイミド‐プロピオニルおよびポリエチレングリコールスペーサ基を担持する抗原、ＰＥＯ８‐Ｌ２１
【０１５２】
【化２３】
ＣＳタンパク質のＮＰＮＡリピート領域に基づいた実施例１４と同じ抗原を、３‐マレイミド‐プロピオニル基およびポリエチレングリコール［Ｏ‐（２‐アミノエチル）‐Ｏ’‐（２‐カルボキシエチル）‐ヘプタエチレングリコール］をベースとしたスペーサ基に付着させる。マレイミド基により、リポペプチドビルディングブロック中のシステイン残基との結合が可能となる。
【０１５３】
上述のようにして実施例１４と同じ直鎖ペプチドを合成した。マレイミドリンカーをカップリングするために、ペプチド（１０．０ｍｇ、４．８μｍｏｌ）を５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ６．５（０．５ｍｌ）に溶解した溶液を、ＴＨＦ（０．５ｍｌ）に溶解したＯ‐［Ｎ‐（３‐マレイミドプロピオニル）‐２‐アミノエチル］‐Ｏ’‐［３‐（Ｎ‐スクシンイミジルオキシ）‐Ｓ‐オキソプロピル］‐ヘプタエチレングリコール（５．０ｍｇ、７．２μｍｏｌ、１．５等量）に添加した。収量：７．２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２１分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５〜３０％ＭｅＣＮ）：純度＞９８％、ｔＲ＝１４．２７分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．３１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝８８２．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
【０１５４】
実施例１６：コンジュゲートＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１５５】
【化２４】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）９にカップリングすることができるかを例示する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＧＭＢ‐Ｌ２１を使用し、これをリポペプチド９のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１５６】
ペプチドＧＭＢ‐Ｌ２１をリポペプチド９にカップリングするために、リポペプチド９（６．９ｍｇ、１．０μｍｏｌ）のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）（０．５ｍｌ）中の溶液を、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ（１：１）中のＧＭＢ‐Ｌ２１の撹拌中の溶液（１ｍｌ、２．７ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１．２等量）に少量ずつ添加した。０．１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ６．５に注意深く調節し、混合物を３時間撹拌した。カップリング反応が完了した後、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ（２ｍｌ）で混合物を希釈し、セミ分取用Ｃ４カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって、１７分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で５０〜１００％ＭｅＣＮのグラジエントを使用してコンジュゲートを精製した。収量：７．１ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１９．９０分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ））：ｔＲ＝４．８３分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１３１０．２［Ｍ＋７Ｈ］７＋；１１４５．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１０１９．０［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９１７．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；８３３．８［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋；７６４．２［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０６Ｈ６９１Ｎ１０６Ｏ１２５ＰＳ２について計算されたｍ／ｚ：９１５２．６；観測されたｍ／ｚ：９１５２．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５７】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２０ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１５８】
実施例１７：コンジュゲートＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１
【０１５９】
【化２５】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）９にカップリングすることができるかをさらに例示する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＰＥＯ８‐Ｌ２１を使用し、リポペプチド９のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１６０】
カップリングおよび精製は、リポペプチド９（６．０ｍｇ、０．９μｍｏｌ）およびＰＥＯ８‐Ｌ２１（４．５ｍｇ、１．７μｍｏｌ、２等量）を使用して、ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１について上述したようにして実施した。収量：７．２ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９５％、ｔＲ＝１９．８２分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．９３分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１３６６．０［Ｍ＋７Ｈ］７＋；１１９６．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１０６４．０［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９５７．８［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４２４Ｈ７２７Ｎ１０８Ｏ１３３ＰＳ２について計算されたｍ／ｚ：９５６１．１；観測されたｍ／ｚ：９５６１．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６１】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２４ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１６２】
実施例１８：コンジュゲートＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１
【０１６３】
【化２６】
この実施例は、ペプチドまたは他のエピトープミメティックをどのようにリポペプチドビルディングブロック（ＬＢＢ）１０にカップリングすることができるかを例証する。ペプチド（エピトープミメティック）として分子ＧＭＢ‐Ｌ２１を使用し、リポペプチド１０のＣｙｓ残基にカップリングする。
【０１６４】
カップリングおよび精製は、リポペプチド１０（６．８ｍｇ、１．０μｍｏｌ）およびＧＭＢ‐Ｌ２１（２．７ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１．２等量）を使用して、ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１について上述したようにして実施した。収量：７．４ｍｇ。分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム、２５分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中で２５〜１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９７％、ｔＲ＝１９．６４分。ＬＣ‐ＭＳ（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム、１０分間にＨ２Ｏ（＋０．１％ＣＨＯＯＨ）中で５〜１００％ＭｅＣＮ）：ｔＲ＝４．８１分；ＥＳＩ‐ＭＳ ｍ／ｚ＝１１３０．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋；１００５．７［Ｍ＋９Ｈ］９＋；９０５．３［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋；８２２．７［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋；７５４．４［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ：Ｃ４０３Ｈ６８６Ｎ１０６Ｏ１２０Ｓ３について計算されたｍ／ｚ：９０３２．６；観測されたｍ／ｚ：９０３２．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６５】
このリポペプチドコンジュゲートの自己集合特性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した結果、この場合もバッファー水溶液中でＳＶＬＰが形成されることが示された。粒子の粒度分布は単峰性かつ高度に単分散性であり、生理学的条件下で安定な、およそ２０ｎｍの直径を有する高度に秩序立った粒子を示唆している。該粒子は高温（例えば３７°）でも安定であった。
【０１６６】
実施例１９：ＬＢＢ９‐ＧＭＢ‐Ｌ２１、ＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１およびＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１を用いた免疫化
この実施例は、上述のコンジュゲートが、動物に注射すると高度に免疫原性であり、強力な体液性免疫応答を誘発することを示す。実施例１１に記載されているようにして免疫化を実施した。
【０１６７】
したがって先述のように、ニュージーランドホワイト種のウサギ（１群２羽）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（４００μｌ）中で調剤した１５０μｇのリポペプチド（ＬＢＢ９‐ＰＥＯ８‐Ｌ２１またはＬＢＢ１０‐ＧＭＢ‐Ｌ２１のいずれか）を用いて皮下注射により免疫化した。免疫化は第０日、第２８日および第５６日に実施した。採血は第０日、第１４日、第３８日および第６６日に実施した。血清をＩｇＧ反応についてＥＬＩＳＡによって分析した。表３は、達成された終点力価をまとめたものである。これらの免疫化ではアジュバントは使用しなかった。
【０１６８】
さらに、免疫化した動物由来の血清は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト上のＣＳタンパク質に結合する高力価（＞１０，０００）の抗体を含むことが免疫蛍光測定法によって示され、従ってこれらの構築物に対する免疫応答の大部分がＮＰＮＡリピートモチーフを含むペプチド抗原を対象としていることが示された。
【０１６９】
表３．コンジュゲートの免疫原性
各コンジュゲートを用いてそれぞれ２羽のウサギ（ａおよびｂ）を１回（１°）、２回（２°）および３回（３°）免疫化した後に達成されたｌｏｇ１０（終点）力価を示す。免疫前血清試料は、対応する免疫原との有意な反応性を示さなかった。例えば、ｌｏｇ１０（終点）力価５．００は力価１００，０００に相当する。
【０１７０】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖と、該ペプチド鎖に共有結合で連結された、２個または３個の長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分と、該ペプチド鎖に任意選択で連結された抗原とで構成されるリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２】
ペプチド鎖は２１〜８０個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項３】
ペプチド鎖は３〜８個のヘプタドモチーフで構成されるコイルドコイルドメインを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項４】
ペプチド鎖は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を形成するコイルドコイルドメインを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項５】
コイルドコイルドメインにおいて各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ａおよびｄは、大きさが小〜中位の疎水性側鎖、および芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖のうち少なくともいずれか一方を備えたαアミノ酸を有し、すべての位置ａおよびｄのうち０、１、もしくは２箇所は極性で非荷電の残基を備えたアミノ酸、ならびにすべての位置ａおよびｄのうち０もしくは１箇所は極性のカチオン性残基もしくはそのアシル化誘導体を備えたアミノ酸、または極性のアニオン性残基を有するアミノ酸、またはグリシンを有する、請求項３に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項６】
大きさが小〜中位の疎水性側鎖はＲ１であり、Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＳＲ３、‐（ＣＨＲ２）ＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａＳＲ３、‐（ＣＨ２）ａＲ４、または‐ＣＨ（ＣＦ３）２を意味し、式中、Ｒ２は低級アルキル；Ｒ３は低級アルキル；Ｒ４はシクロヘキシル、シクロペンチルまたはシクロブチル；ａは１〜４；ｂは０または１であり；
芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖はＲ５であり、Ｒ５は、‐（ＣＨ２）ａＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＳ（ＣＨ２）ｄＲ６、または‐（ＣＨ２）ｃＮＲ７（ＣＨ２）ｄＲ６を意味し、式中、Ｒ７はＨ、低級アルキル、アリールまたはアリール低級アルキル；Ｒ６は、任意選択で置換された式‐Ｃ６Ｒ８Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２のフェニルまたは式Ｈ１〜Ｈ１４
【化１】
のうち１つのアリール基もしくはヘテロアリール基であって、式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＮＲ７Ｒ１４、Ｎ７ＣＯＲ１４、低級アルキル、アリールまたはＯＲ７；Ｒ１３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、低級アルキル、またはアリール；Ｒ１４は、Ｈ、低級アルキル、またはアリール；ａは１〜４；ｃは１または２；ｄは０〜４であり；
極性で非荷電の残基はＲ１５であり、Ｒ１５は、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＳＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＣＯＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９を意味し、式中、Ｒ１６は、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、‐（ＣＨ２）ａＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９；Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ独立にＨ、低級アルキル、アリール、もしくはアリール低級アルキルであるか、またはＲ１７およびＲ１８はともに‐（ＣＨ２）ｅ‐、‐（ＣＨ２）２‐Ｏ‐（ＣＨ２）２‐、もしくは‐（ＣＨ２）２‐ＮＲ１７‐（ＣＨ２）２‐をなし；Ｒ１９は、低級アルキル、アリール、またはアリール低級アルキルであり；ａ、ｂおよびｄは上記に定義されるような意味を有し、ｅは２〜６であり；
極性のカチオン性残基もしくはそのアシル化誘導体はＲ２０であり、Ｒ２０は、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮ＝Ｃ（ＮＲ２１Ｒ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１Ｃ（＝ＮＲ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＲ１９、または‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＮＲ１７Ｒ１８を意味し、式中、Ｒ２１はＨまたは低級アルキル、かつＲ２２はＨまたは低級アルキルであり；Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は上記に定義されるような意味を有し、ａは１〜４であり；
極性のアニオン性残基はＲ２３であり、Ｒ２３は‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＨを意味し、式中のａは１〜４である、請求項５に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項７】
大きさが小〜中位の疎水性側鎖を備えたαアミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンであり、
芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖を備えたαアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンであり、
極性で非荷電の残基を備えたαアミノ酸は、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリンおよびトレオニンであり、
極性のカチオン性残基を備えたαアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、かつ、
極性のアニオン性残基を備えたαアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸である、請求項５に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項８】
コイルドコイルドメインにおいて各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇは、グリシンを有していないかまたは１個のグリシンを有しており、かつプロリンを有していない、請求項５〜７のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項９】
ペプチド鎖は配列番号１〜２９のペプチドを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１０】
ペプチド鎖は配列番号１〜２７のペプチドを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１１】
ペプチド鎖は配列番号１〜４のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１２】
ペプチド鎖は配列番号２８のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１３】
ペプチド鎖は配列番号２９のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１４】
脂質部分はＺ１〜Ｚ８型、すなわち
【化２】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルまたは長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ＹはＨまたはＣＯＯＨである）、
【化３】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は長鎖ヒドロカルビルであるか、またはＲ１およびＲ２が長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝ＯでＲ３がＨまたはアセチルである）、
【化４】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ｎは１、２、３または４である）、
【化５】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルであり、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１、２、３または４である）、および
【化６】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルである）
のうちの１つであり、上記式中の長鎖ヒドロカルビルは、８〜２５個の炭素原子と、任意選択で鎖の中の１個、２個または３個の二重結合とで構成される、直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニルであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１５】
脂質部分は式Ｚ３のジパルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニルであって、式中のＲ１およびＲ２はパルミトイルでありＲ３はＨまたはアセチルである、請求項１４に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１６】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその近傍で脂質部分ＬＭに共有結合で連結される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１７】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその近傍でリンカーを介して脂質部分ＬＭに共有結合で連結される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１８】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端またはその近傍で式（２）または（３）
【化７】
のようにリンカーを介して脂質部分ＬＭに共有結合で連結され、上記式中、ＬはリンカーＬ１〜Ｌ１０
【化８】
（上記式中、ＸはＯまたはＮＨ、ｍは１〜２０、ｎは１〜２０）
である、請求項１７に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１９】
抗原は、ペプチド鎖の他方の末端に、または該他方の末端の近傍に共有結合で付着される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２０】
抗原は、ペプチド、タンパク質、エピトープミメティック、炭水化物またはハプテンから選択される、請求項１９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロックを２、３、４、５、６または７個含むリポペプチドヘリックスバンドル。
【請求項２２】
請求項２１に記載のリポペプチドヘリックスバンドルで構成される合成ウイルス様粒子。
【請求項２３】
請求項２１および請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子の生産方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロックを水溶液中で平衡化することを特徴とする方法。
【請求項２４】
抗原を担持する請求項２１および請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方を含む医薬製剤。
【請求項２５】
抗原は、マラリア原虫の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質に由来する、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
抗原を担持する、請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルまたは合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方の、ワクチンとしての使用方法。
【請求項２７】
免疫遺伝学的に有効な量の、抗原を担持する請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方を、投与の必要のある患者に投与する、ワクチン接種方法。
【請求項１】
コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖と、該ペプチド鎖に共有結合で連結された、２個または３個の長鎖ヒドロカルビルを含む脂質部分と、該ペプチド鎖に任意選択で連結された抗原とで構成されるリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２】
ペプチド鎖は２１〜８０個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項３】
ペプチド鎖は３〜８個のヘプタドモチーフで構成されるコイルドコイルドメインを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項４】
ペプチド鎖は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を形成するコイルドコイルドメインを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項５】
コイルドコイルドメインにおいて各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ａおよびｄは、大きさが小〜中位の疎水性側鎖、および芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖のうち少なくともいずれか一方を備えたαアミノ酸を有し、すべての位置ａおよびｄのうち０、１、もしくは２箇所は極性で非荷電の残基を備えたアミノ酸、ならびにすべての位置ａおよびｄのうち０もしくは１箇所は極性のカチオン性残基もしくはそのアシル化誘導体を備えたアミノ酸、または極性のアニオン性残基を有するアミノ酸、またはグリシンを有する、請求項３に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項６】
大きさが小〜中位の疎水性側鎖はＲ１であり、Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａ（ＣＨＲ２）ｂＳＲ３、‐（ＣＨＲ２）ＯＲ３、‐（ＣＨ２）ａＳＲ３、‐（ＣＨ２）ａＲ４、または‐ＣＨ（ＣＦ３）２を意味し、式中、Ｒ２は低級アルキル；Ｒ３は低級アルキル；Ｒ４はシクロヘキシル、シクロペンチルまたはシクロブチル；ａは１〜４；ｂは０または１であり；
芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖はＲ５であり、Ｒ５は、‐（ＣＨ２）ａＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＲ６、‐（ＣＨ２）ｃＳ（ＣＨ２）ｄＲ６、または‐（ＣＨ２）ｃＮＲ７（ＣＨ２）ｄＲ６を意味し、式中、Ｒ７はＨ、低級アルキル、アリールまたはアリール低級アルキル；Ｒ６は、任意選択で置換された式‐Ｃ６Ｒ８Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２のフェニルまたは式Ｈ１〜Ｈ１４
【化１】
のうち１つのアリール基もしくはヘテロアリール基であって、式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にＨ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＮＲ７Ｒ１４、Ｎ７ＣＯＲ１４、低級アルキル、アリールまたはＯＲ７；Ｒ１３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、低級アルキル、またはアリール；Ｒ１４は、Ｈ、低級アルキル、またはアリール；ａは１〜４；ｃは１または２；ｄは０〜４であり；
極性で非荷電の残基はＲ１５であり、Ｒ１５は、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ｄ（ＣＨＲ１６）ｂＳＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＣＯＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９を意味し、式中、Ｒ１６は、低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、‐（ＣＨ２）ａＯＲ１７、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、または‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＲ１９；Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ独立にＨ、低級アルキル、アリール、もしくはアリール低級アルキルであるか、またはＲ１７およびＲ１８はともに‐（ＣＨ２）ｅ‐、‐（ＣＨ２）２‐Ｏ‐（ＣＨ２）２‐、もしくは‐（ＣＨ２）２‐ＮＲ１７‐（ＣＨ２）２‐をなし；Ｒ１９は、低級アルキル、アリール、またはアリール低級アルキルであり；ａ、ｂおよびｄは上記に定義されるような意味を有し、ｅは２〜６であり；
極性のカチオン性残基もしくはそのアシル化誘導体はＲ２０であり、Ｒ２０は、‐（ＣＨ２）ａＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮ＝Ｃ（ＮＲ２１Ｒ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１Ｃ（＝ＮＲ２２）ＮＲ１７Ｒ１８、‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＲ１９、または‐（ＣＨ２）ａＮＲ２１ＣＯＮＲ１７Ｒ１８を意味し、式中、Ｒ２１はＨまたは低級アルキル、かつＲ２２はＨまたは低級アルキルであり；Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は上記に定義されるような意味を有し、ａは１〜４であり；
極性のアニオン性残基はＲ２３であり、Ｒ２３は‐（ＣＨ２）ａＣＯＯＨを意味し、式中のａは１〜４である、請求項５に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項７】
大きさが小〜中位の疎水性側鎖を備えたαアミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンであり、
芳香族もしくはヘテロ芳香族の側鎖を備えたαアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンであり、
極性で非荷電の残基を備えたαアミノ酸は、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリンおよびトレオニンであり、
極性のカチオン性残基を備えたαアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、かつ、
極性のアニオン性残基を備えたαアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸である、請求項５に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項８】
コイルドコイルドメインにおいて各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）の位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇは、グリシンを有していないかまたは１個のグリシンを有しており、かつプロリンを有していない、請求項５〜７のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項９】
ペプチド鎖は配列番号１〜２９のペプチドを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１０】
ペプチド鎖は配列番号１〜２７のペプチドを含む、請求項１または２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１１】
ペプチド鎖は配列番号１〜４のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１２】
ペプチド鎖は配列番号２８のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１３】
ペプチド鎖は配列番号２９のペプチドを含む、請求項９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１４】
脂質部分はＺ１〜Ｚ８型、すなわち
【化２】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルまたは長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ＹはＨまたはＣＯＯＨである）、
【化３】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は長鎖ヒドロカルビルであるか、またはＲ１およびＲ２が長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝ＯでＲ３がＨまたはアセチルである）、
【化４】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビル‐Ｃ＝Ｏであり、ｎは１、２、３または４である）、
【化５】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルであり、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１、２、３または４である）、および
【化６】
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は長鎖ヒドロカルビルである）
のうちの１つであり、上記式中の長鎖ヒドロカルビルは、８〜２５個の炭素原子と、任意選択で鎖の中の１個、２個または３個の二重結合とで構成される、直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニルであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１５】
脂質部分は式Ｚ３のジパルミトイル‐Ｓ‐グルセリルシステイニルであって、式中のＲ１およびＲ２はパルミトイルでありＲ３はＨまたはアセチルである、請求項１４に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１６】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその近傍で脂質部分ＬＭに共有結合で連結される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１７】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその近傍でリンカーを介して脂質部分ＬＭに共有結合で連結される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１８】
ペプチド鎖ＰＣは、Ｎ末端またはその近傍で式（２）または（３）
【化７】
のようにリンカーを介して脂質部分ＬＭに共有結合で連結され、上記式中、ＬはリンカーＬ１〜Ｌ１０
【化８】
（上記式中、ＸはＯまたはＮＨ、ｍは１〜２０、ｎは１〜２０）
である、請求項１７に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１９】
抗原は、ペプチド鎖の他方の末端に、または該他方の末端の近傍に共有結合で付着される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２０】
抗原は、ペプチド、タンパク質、エピトープミメティック、炭水化物またはハプテンから選択される、請求項１９に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロックを２、３、４、５、６または７個含むリポペプチドヘリックスバンドル。
【請求項２２】
請求項２１に記載のリポペプチドヘリックスバンドルで構成される合成ウイルス様粒子。
【請求項２３】
請求項２１および請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子の生産方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のリポペプチドビルディングブロックを水溶液中で平衡化することを特徴とする方法。
【請求項２４】
抗原を担持する請求項２１および請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方を含む医薬製剤。
【請求項２５】
抗原は、マラリア原虫の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質に由来する、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
抗原を担持する、請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルまたは合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方の、ワクチンとしての使用方法。
【請求項２７】
免疫遺伝学的に有効な量の、抗原を担持する請求項２２に記載のリポペプチドヘリックスバンドルおよび合成ウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方を、投与の必要のある患者に投与する、ワクチン接種方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５１２３０８（Ｐ２０１０−５１２３０８Ａ）
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３９６６３（Ｐ２００９−５３９６６３）
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１０６０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６８０１７
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９１６１０８２）ウニヴェルジテート チューリッヒ プロレクトラート フォルシュング (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵＥＲＩＣＨ ＰＲＯＲＥＫＴＯＲＡＴ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１０６０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６８０１７
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９１６１０８２）ウニヴェルジテート チューリッヒ プロレクトラート フォルシュング (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵＥＲＩＣＨ ＰＲＯＲＥＫＴＯＲＡＴ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]