コムギの検出方法
【課題】コムギを幅広く、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの反応系でコムギＤＮＡ ５０〜５００ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとするコムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られない、コムギに対して特異性を有するコムギ検出用ＰＣＲプライマーを用いたコムギの検出法及びそのプライマーセットの提供。
【解決手段】特定の塩基配列を有するプライマーと、特定の塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含む、コムギの検出方法。また、特定の塩基配列を有する４種のプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含む、コムギの検出方法。
【解決手段】特定の塩基配列を有するプライマーと、特定の塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含む、コムギの検出方法。また、特定の塩基配列を有する４種のプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含む、コムギの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコムギの検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１では、コムギＤＮＡを特異的に検出するＰＣＲ法が記載されている。この方法では、安定して検出できるコムギＤＮＡの限界量は、ＰＣＲ反応液２５μｌの系で２．５ｐｇ（ＤＮＡの擬似混入試料２５ｎｇを用いた際、１００ｐｐｍ）と記載されている。
特許文献２では、ＩＴＳ−２領域内に設計したプライマーにより、特許文献１と比べてコムギＤＮＡを高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの系で、コムギＤＮＡ ５０ｆｇ）に検知できることが述べられている。また、ＰＣＲシミュレーションソフトAmplifyにより、コムギＤＮＡからのみ特異的に標的増幅産物が得られることが予想されている。しかし、実際にオオムギ、ライムギ、エン麦ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果、オオムギ、ライムギからも、コムギと同様に標的増幅産物が得られてしまい、コムギ検出用としては不満足なものであった。
非特許文献１では、食品中にコムギが０．０１％以上の濃度で含まれていれば検出できるプライマーセットを作製している。しかし、用いているプライマーセットは、５００ｂｐまたは８００ｂｐと、比較的長いＤＮＡを増幅させるため、加工度の高い食品での検査には適さないと思われる。
非特許文献２では、ｒＲＮＡ遺伝子の２５Ｓ−１８Ｓ遺伝子間領域を用いたコムギ検知ＰＣＲ法を開発している。この方法では、コムギＤＮＡを高感度（ＰＣＲ反応液１００μｌの反応系で、コムギＤＮＡ １ｐｇ）に検出できるが、ライムギＤＮＡからも標的増幅産物が得られたと記載されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６８９８９号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−１９９５９９号公報
【非特許文献１】内野昌孝、増渕菜美子、黒澤有希子、野口智弘、高野克己 「小麦検出プライマーセットの開発」 日本食品科学工学会誌 第５４巻 第２号 ２００７年 ２月 ８２〜８６頁
【非特許文献２】Allmann M, Candrian U, Hofelein C, Luthy J.「Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to immunochemical methods assuring safety and quality of food. Detection of wheat contamination in non-wheat food products.」Z Lebensm Unters Forsch. 196, 248-51 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、コムギを幅広く、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの反応系でコムギＤＮＡ ５０〜５００ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとするコムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られない、コムギに対して特異性を有するコムギ検出用ＰＣＲプライマーを用いたコムギの検出法及びそのプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
コムギそれぞれに特異的な配列として、ＩＴＳ−２配列を含む特定の部分を検出対象として選定すれば、混合物中に微量に存在するコムギを高感度で特異的に検出するのに有効であるという知見が得られた。こうして特定されたプライマーを使用することによって特許文献１よりも高感度に、また、特許文献２よりも特異的にコムギＤＮＡを検出できるとの知見も併せ得た。かかる知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
第一の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法である。
第二の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法である。
第三の発明は、コムギが食用コムギである、第一の発明に記載のコムギの検出方法である。
第四の発明は、食用コムギが、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）であることを特徴とする、第三の発明に記載の食用コムギの検出方法である。
第五の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。
第六の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。
第七の発明は、コムギが食用コムギである、第五の発明に記載のコムギ検出用プライマーセットである。
第八の発明は、第五の発明又は第六の発明に記載のコムギ検出用プライマーセットを含むコムギ検出用キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の検出方法は、極微量のコムギの存在を検出することが可能であることから、食品原料や食品中におけるコムギの混入の有無を検出するのに有効である。なお、本発明におけるコムギとは、コムギ属（Triticum）に加えてコムギの原種であるエギロプス属（Aegilops）をも含む。また、本発明の検出方法は、食用コムギの混入の有無を検出するのに有効である。ここで、食用コムギとは、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）のことをいい、以下、同様である。
本発明は、(ｉ)配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを使用してＰＣＲを行う場合、又は(ii)配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを使用してＰＣＲを行う場合を含む。
ＰＣＲに当たっては、例えばSaiki RK, et al., Science, 230：1350-1354(1985)や植物細胞工学別冊、植物のPCR実験プロトコール、島本功・佐々木卓治監修（1995年）等に記載されている通常の方法に基づき、変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度と時間、酵素（DNAポリメラーゼ）の種類と濃度、dNTP濃度、プライマー濃度、塩化マグネシウム濃度、鋳型DNA量等の条件を適宜、変更し最良のものを選択する。
【０００７】
次に、食品原料や製品等の被検査対象試料から抽出したＤＮＡのＰＣＲ後の反応液を、例えば電気泳動によって解析してコムギが被検査対象試料中に存在するか否かを検出する。この検出に当たっては、ＰＣＲ後の反応液中に標的とするサイズのＰＣＲ増幅産物が存在するか否か、存在する場合は当該ＰＣＲ増幅産物がコムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含むものであるか否かを指標とする。すなわち、コムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含む標的とするサイズのＰＣＲ増幅産物が存在すれば、被検査対象試料中にコムギが混入していることになり、反対に、ＰＣＲ増幅産物が存在しないか、又はＰＣＲ増幅産物が存在してもコムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含むＰＣＲ増幅産物が存在しなければ、被検査対象試料中にコムギが混入していないことになる。そして、本発明では、この検出を特異的で高感度、例えばＰＣＲ反応液２５μlの系で、コムギＤＮＡ ５０〜５００ｆｇを検出することを可能とした。
【０００８】
上記プライマーを設計するに当たっては、例えば「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで」（蛋白質・核酸・酵素 臨時増刊号１９９６年 共立出版株式会社）や「バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲ：細胞工学別紙 目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著１９９６年 株式会社秀潤社）、「ＰＣＲテクノロジー−ＤＮＡ増幅の原理と応用−」（Henry A Erlich編、加藤邦之進 監修、宝酒造株式会社）等に基づいて設計すればよい。また、本発明のプライマーは、７０塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーセットを構成するものであり、従って、ＤＮＡが分解して短くなっている可能性がある加工食品であっても、感度よく検出することができると共に、増幅産物のシークエンスを確実に行うことができる。こうしたことを考慮して、プライマーの配列は、検出対象であるコムギおよび他の植物属の種々の植物のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列をＧｅｎＢａｎｋから取得し、アライメントを行い、コムギに共通かつ、特異性の高い領域を特定する。こうようにして特定した領域の中から、コムギと他の植物とを区別できる塩基配列を設定して、プライマー配列を選定することができる。このようにして得られたプライマーの塩基配列は、次のとおりである。
センスプライマー：5'- CAT GGT GGG CGT CCT C -3'（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5'- AAA GGC CAT AAT GCC AGC TG -3'（配列番号２）
アンチセンスプライマー：5'- TGA GGC CGT CAT GCC GGC TG -3'（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'- TGA GGC CAT AAT GTC GGC TG -3'（配列番号４）
【０００９】
これらプライマーから２つのコムギ検出用プライマーセットを設計することができる。一つは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットであり、もう一つは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。前者のプライマーセットは食用コムギの検出用として適しており、後者のプライマーセットはコムギ全体を検出対象としている。このようにして設計したプライマーセットの評価にあたっては、ＰＣＲシミュレーションを利用しても良い。すなわち、設計したプライマーについて、ＰＣＲシミュレーションによって標的とする増幅産物が得られるか否かを確認することができる。なお、上記ＰＣＲシミュレーションに当たっては、ＰＣＲシミュレーションソフトAmplify 1.0（Bill Engels）等のソフトを使用することができる。
なお、上記プライマーセットを用いたＤＮＡ配列の増幅は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法（例えば、Saiki RK, et al., Science, 230：1350-1354(1985)）或いはそれと同等の手段を用いて行うことができる。また、増幅産物の検出方法としては、電気泳動法が一般的であるが、その他の方法も用いることができる。
また、上記プライマーセットはキット化することもでき、当該キットには上記プライマーセットの他に、陽性コントロール（コムギのＩＴＳ−２の標的配列を含むＤＮＡ）、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、SYBR Green等を用いたリアルタイムＰＣＲ試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書等を含んでもよい。
【実施例】
【００１０】
１．コムギＤＮＡ検出用プライマーの設計
（１）コムギの配列
コムギ（Triticum）の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Triticum aestivum (AF438186)
2 : Triticum aestivum (AF438187)
3 : Triticum aestivum (AF438188)
4 : Triticum aestivum (AF438191)
5 : Triticum aestivum (AF440676)
6 : Triticum aestivum (AF440679)
7 : Triticum aestivum (AF521903)
8 : Triticum aestivum (AJ301801)
9 : Triticum aestivum (AM040486)
10 : Triticum aestivum(AY346110)
11 : Triticum aestivum(AY346111)
12 : Triticum aestivum(AY346112)
13 : Triticum aestivum(AY346114)
14 : Triticum aestivum(AY346120)
15 : Triticum aestivum(AY450258)
16 : Triticum aestivum(Z11761)
17 : Triticum araraticum(AJ238920)
18 : Triticum araraticum(AJ238921)
19 : Triticum araraticum(AJ238922)
20 : Triticum boeticum(AJ238901)
21 : Triticum dicoccoides(AJ238911)
22 : Triticum dicoccoides(AJ238913)
23 : Triticum dicoccoides(AJ238915)
24 : Triticum dicoccoides(AJ238916)
25 : Triticum dicoccum(AJ238917)
26 : Triticum dicoccum(AJ301801)
27 : Triticum monococcum(AJ301800)
28 : Triticum timopheevii(AJ238923)
29 : Triticum timopheevii(AJ238924)
30 : Triticum turgidum(AJ238912)
31 : Triticum turgidum(AJ238918)
32 : Triticum turgidum(AJ238919)
33 : Triticum turgidum(AY450266)
34 : Triticum urartu(AJ301803)
【００１１】
（２）エギロプスの配列
コムギの原種であるエギロプス (Aegilops) の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Aegilops bicornis(AF149192)
2 : Aegilops bicornis(AJ238907)
3 : Aegilops biuncialis(AF157003)
4 : Aegilops columnaris(AF156997)
5 : Aegilops comosa(AF149198)
6 : Aegilops comosa(AF149201)
7 : Aegilops crassa(AF157000)
8 : Aegilops cylindrica(AF156993)
9 : Aegilops geniculata(AF156998)
10 : Aegilops juvenalis(AF157001)
11 : Aegilops kotschyi(AF157002)
12 : Aegilops longissima(AF149196)
13 : Aegilops longissima(AJ238908)
14 : Aegilops markgrafii(AF149199)
15 : Aegilops neglecta(AF157004)
16 : Aegilops peregrina(AF156996)
17 : Aegilops searsii(AF149194)
18 : Aegilops sharonensis(AF149195)
19 : Aegilops sharonensis(AJ238905)
20 : Aegilops sharonensis(AJ238906)
21 : Aegilops sharonensis(AJ238909)
22 : Aegilops speltoides(AJ238903)
23 : Aegilops speltoides(AJ238904)
24 : Aegilops speltoides(AJ301804)
25 : Aegilops speltoides(AY450267)
26 : Aegilops speltoides(AY450268)
27 : Aegilops speltoides(Z11762)
28 : Aegilops squarrosa(AF149193)
29 : Aegilops tauschii(AJ238910)
30 : Aegilops triuncialis(AF156994)
31 : Aegilops umbellulata(AF149197)
32 : Aegilops vavilovii(AF156999)
33 : Aegilops ventricosa(AF156995)
【００１２】
（３）オオムギ、ライムギ、エン麦の配列
オオムギ（Hordeum）、ライムギ（Secale）、エン麦（Avena）の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Hordeum vulgare(AF438189)
2 : Hordeum vulgare(AF438190)
3 : Hordeum vulgare(AF438192)
4 : Hordeum vulgare(AF438193)
5 : Hordeum vulgare(AF438194)
6 : Hordeum vulgare(AF438195)
7 : Hordeum vulgare(AF438196)
8 : Hordeum vulgare(AF438197)
9 : Hordeum vulgare(AF440677)
10 : Hordeum vulgare(AJ608145)
11 : Hordeum vulgare(AJ608146)
12 : Hordeum vulgare(AJ608147)
13 : Hordeum vulgare(AJ608148)
14 : Hordeum vulgare(AY255059)
15 : Hordeum vulgare(Z11759)
16 : Hordeum vulgare(Z68915)
17 : Hordeum vulgare(Z68916)
18 : Hordeum vulgare(Z68917)
19 : Hordeum vulgare(Z68918)
20 : Hordeum vulgare(Z68919)
21 : Hordeum vulgare(Z68920)
22 : Hordeum vulgare(Z68921)
23 : Hordeum vulgare(Z68922)
24 : Hordeum vulgare(Z68923)
25 : Hordeum vulgare(Z69656)
26 : Secale cereale(AF303400)
27 : Secale cereale(AJ409199)
28 : Secale cereale(AJ409200)
29 : Secale cereale(AJ409201)
30 : Secale cereale(AJ409202)
31 : Secale cereale(AJ409203)
32 : Secale cereale(L36504)
33 : Secale montanum(Z11760)
34 : Secale strictum(AJ409205)
35 : Secale strictum(AJ409206)
36 : Secale strictum(AJ409207)
37 : Secale strictum(AJ409208)
38 : Secale strictum(AJ409209)
39 : Secale strictum(AJ409213)
40 : Secale sylvestre(AJ409210)
41 : Secale sylvestre(AJ409212)
42 : Secale vavilovii(AJ409204)
43 : Secale vavilovii(AJ608152)
44 : Avena sativa(AY520821)
45 : Avena sativa(Z96885)
46 : Avena sativa(Z96887)
47 : Avena sativa(Z96889)
48 : Avena sativa(Z96891)
49 : Avena sativa(Z96893)
50 : Avena sativa(Z96895)
【００１３】
（４）プライマー配列
コムギ、エギロプスＩＴＳ−２配列の中から、全配列にハイブリダイズすると予想され、かつコムギ、エギロプスに特異性の高い配列を選定し、配列番号１〜４の塩基配列を有するプライマーを合成した。
センスプライマー
5'− CAT GGT GGG CGT CCT C −3' （配列番号１）
アンチセンスプライマー
5'− AAA GGC CAT AAT GCC AGC TG −3' （配列番号２）
5'− TGA GGC CGT CAT GCC GGC TG −3' （配列番号３）
5'− TGA GGC CAT AAT GTC GGC TG −3' （配列番号４）
これらのプライマーを用いると、コムギ、エギロプスで６４ｂｐの増幅産物が得られると予想される。
【００１４】
２．ＰＣＲの鋳型として用いたＤＮＡ
（１）ＤＮＡ抽出に用いた試料
コムギ（コムギの原種であるエギロプス及び掛け合わせ品種のライコムギを含む。）
1 : 農林61号（市販品）
2 : Triticum aestivum cv. Chinese Spring (KT020-003)
3 : Triticum aestivum cv. Sapporo Haru (KT020-004)（以上、普通コムギ）
2、3については、横浜市立大学木原生物学研究所遺伝資源バンクから種子を分譲してもらったものである。
4 : Triticum turgidum L (KU-147)（リベットコムギ）
5 : Triticum durum Desf (KU-125)（デュラムコムギ）
6 : Triticum monococcum L. (KU-104-2)（一粒コムギ）
7 : Triticum timopheevi Zhuk (KU-107-1)（チモフェービ系）
8 : Aegilops speltoides Tausch (KU-2-1)（クサビコムギ）
9 : Aegilops squarrosa L. (KU-20-1)（タルホコムギ）
4〜9については、京都大学農学研究科栽培植物起原学分野から種子を分譲してもらったものである。
10 : Triticum aestivum-rye amphidiploid (TACBOW0065)（ライコムギ）
10については、鳥取大学農学部植物遺伝育種学研究室から種子を分譲してもらったものである。
種子分譲依頼は、全てＮＢＰＲ−ＫＯＭＵＧＩ（http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/top/top.jsp）を通して行った。
【００１５】
オオムギ、ライムギ、エン麦
1 : オオムギ（みのり種：市販品）
2 : ライムギ（市販品）
3 : エン麦（前進種：市販品）
【００１６】
その他穀物
1 : ハトムギ（市販品）
2 : トウモロコシ（市販品）
3 : ソバ（市販品）
4 : アワ（市販品）
5 : イネ（コシヒカリ：市販品）
6 : ダイズ（鶴の子大豆：市販品）
【００１７】
（２）ＤＮＡ抽出
農林６１号以外のコムギ、オオムギ、ライムギ、エン麦、ハトムギ、トウモロコシは発芽させ、葉からＤＮＡ抽出を行った。他の試料は、種子からＤＮＡ抽出を行った。
ＤＮＡ抽出は、QIAGEN社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料約０．５ｇを５０ｍｌ容チューブに入れ、７．５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ Ｇ２、２０μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）、２００μｌのプロテイナーゼＫ溶液を加え、混合した後、５０℃で２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、４ｍｌのBuffer QCでカラムを洗浄し、１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＦでＤＮＡを溶出させた。イソプロパノール沈殿により沈殿物を回収し、４０μｌの滅菌超純水に溶解して、濃度を測定した。超純水を用いて適宜希釈し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
【００１８】
（実施例１ 配列番号１のプライマーと、配列番号２のプライマーからなるプライマーセットを用いたＰＣＲ）
（１）方法
ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔを用い、同キット添付のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従って以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭの各ｄＮＴＰ）に、配列番号１のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号２のプライマーを終濃度で０．２μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、酵素活性化（９５℃，１０分間）後、（９５℃，０．５分間）−（６８℃，１分間）の反応を４０回繰り返して反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。結果を図１に示す。
【００１９】
（２）特異性の確認
図１から明らかなように、コムギ以外の食用ムギ類であるオオムギ、ライムギ、エン麦、それ以外の代表的な穀物として、ハトムギ、トウモロコシ、ソバ、アワ、イネ、ダイズＤＮＡから標的増幅産物が得られないことが確認された。ポジティブコントロールとして用いたコムギ（農林６１号）は５００ｆｇ、他の穀物は５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として用いた。なお、ここで用いたＤＮＡがＰＣＲ増幅可能レベルの純度であることは、植物葉緑体ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した。
【００２０】
（３）コムギ各品種の検出感度確認
コムギ各品種から抽出したＤＮＡの希釈系列を作製し、ＰＣＲで検出感度確認を行った。各品種は、５ｐｇ、５００ｆｇ及び５０ｆｇのＤＮＡを鋳型として用いた。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、コムギ及びその原種として代表的な９品種中、７品種で５０ｆｇのＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。Triticum monococcum L.と、Aegilops squarrosa L.の２品種については、５ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物は得られなかった。これらの２品種は現在ほとんど栽培されておらず、市場に流通する可能性も考えにくいため、これらを検出できないことで大きな問題はないと思われる。ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列上、これら２品種は、センスプライマー領域は完全一致しているが、アンチセンスプライマー領域は、数塩基がミスマッチしており、これが感度に悪影響を及ぼしている可能性がある。２品種の配列に対応したアンチセンスプライマーを併用することで、これらも高感度に検出可能になると予想される。
以上より、現在食用として流通しているコムギを、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの反応系で、コムギＤＮＡ ５０ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとする、コムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られないＰＣＲ法が確立できた。
【００２１】
（実施例２ 配列番号１のプライマーと、配列番号２、３及び４の混合プライマーからなるプライマーセットを用いたＰＣＲ）
（１）方法
ＰＣＲには、センスプライマーとして、配列番号１のプライマーを終濃度で０．２μＭ用い、アンチセンスプライマーとして、配列番号２のプライマーを終濃度で０．１μＭ、配列番号３及び４のプライマーをそれぞれ終濃度で０．０５μＭの混合プライマーを用いた。それ以外の反応溶液組成、温度条件は、３（１）に示した方法と同様に行った。結果を図３に示す。
【００２２】
（２）特異性の確認
図３から明らかなように、コムギ以外の食用ムギ類であるオオムギ、ライムギ、エン麦、それ以外の代表的な穀物として、ハトムギ、トウモロコシ、ソバ、イネ、ダイズＤＮＡから標的増幅産物が得られないことが確認された。ポジティブコントロールとして用いたコムギ（農林６１号）は５００ｆｇ、他の穀物は５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として用いた。なお、ここで用いたＤＮＡがＰＣＲ増幅可能レベルの純度であることは、植物葉緑体ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した。
【００２３】
（３）コムギ各品種の検出感度確認
コムギ各品種から抽出したＤＮＡの希釈系列を作製し、ＰＣＲで検出感度確認を行った。各品種は、５ｐｇ及び５００ｆｇのＤＮＡを鋳型として用い、ｎ＝２でＰＣＲを行った。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、試験した９種全ての品種で５００ｆｇのＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。
以上より、本発明のコムギの検出法により、コムギを幅広く、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの系で、コムギＤＮＡ ５００ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとする、コムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られないことが確認できた。
【００２４】
（比較例１ 特許文献１の検知ＰＣＲ法との比較）
（１）方法
Triticin precursor遺伝子を標的としたコムギ検知ＰＣＲ法である、特許文献１記載のＰＣＲ法との比較を行った。
用いたプライマー配列は以下の通りである。
5'− CAT CAC AAT CAA CTT ATG GTG G −3' （配列番号５）
5'− TTT GGG AGT TGA GAC GGG TTA −3' （配列番号６）
ＰＣＲは、ＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用い、以下の方法で行った。
２．５μｌの１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、１．５μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、２．５μｌの２ｍＭのｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ、０．１２５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（５Ｕ／μｌ）に、配列番号５のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号６のプライマーを終濃度で０．２μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、酵素活性化（９５℃，１０分間）後、（９５℃，０．５分間）−（６０℃，０．５分間）−（７２℃，０．５分間）の反応を４０回繰り返した後、（７２℃，７分間）反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。
【００２５】
（２）コムギ各品種の検出感度確認と特異性確認
コムギ９品種の検知感度確認を行った。結果を図５に示す。鋳型ＤＮＡには、実施例で作製した希釈系列のうち、５０ｐｇ、５ｐｇ及び５００ｆｇを用いた。
図５から明らかなように、T. monococcum L.は５０ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物が得られず、他の８品種は５０ｐｇのＤＮＡが検知限界だった。
また、オオムギ、ライムギ、エン麦を用いて特異性の確認を行ったところ、コムギ以外のサンプルからは増幅産物が得られないことが確認された。
【００２６】
（比較例２ 非特許文献２の検知ＰＣＲ法との比較）
（１）方法
２５Ｓ−１８Ｓ遺伝子間領域を標的としたコムギ検知ＰＣＲ法である、非特許文献２記載のＰＣＲ法との比較を行った。
用いたプライマー配列は以下の通りである。
5'− GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T −3' （配列番号７）
5'− GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A −3' （配列番号８）
ＰＣＲは、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＧｏＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、以下の方法で行った。
５μｌの５×Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの２ｍＭのｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ、０．１μｌのＧｏＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）に、配列番号７のプライマーを終濃度で０．５μＭと、配列番号８のプライマーを終濃度で０．５μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、（９５℃，１分間）−（６８℃，０．５分間）−（７２℃，１０秒間）の反応を３５回繰り返した後、（７２℃，２分間）反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。
【００２７】
（２）コムギ各品種の検出感度確認と特異性確認
コムギ９品種の検知感度確認を行った。結果を図６に示す。鋳型ＤＮＡには、実施例で作製した希釈系列のうち、５ｐｇ、５００ｆｇ及び５０ｆｇを用いた。
図６から明らかなように、T. monococcum L.は５ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物が得られず、A. squarrosa L.は５ｐｇのＤＮＡが検知限界だった。他の７品種は、バンドが薄い場合もあったが、５０ｆｇを検知することができた。
また、実施例２と同様のサンプルを用いて特異性の確認を行ったところ、論文に記載の通り、ライムギＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。
【００２８】
以上より、本発明のコムギ検知PCR法と、既存のPCR法とを比較すると、以下のようになる。
【表１】
【００２９】
実施例１の検知ＰＣＲ法は、食用でないコムギを一部検知できないものの、比較例１と比べると、検知感度が優れており、比較例２と比べると、コムギ特異性が優れていた。実施例２の検知ＰＣＲ法は、試験したコムギ９品種全てを検知できたため、比較例１と比べると、検知範囲と検知感度が優れていた。比較例２と比べると、検知感度は劣るものの、コムギ特異性、検知範囲が優れていた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のプライマーセットの特異性を確認したものである。
【図２】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する本発明のプライマーセットの検出感度を調べたものである。
【図３】本発明の混合プライマーを用いたプライマーセットの特異性を確認したものである。
【図４】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する本発明の混合プライマーを用いたプライマーセットの検出感度を調べたものである。
【図５】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する特許文献１のプライマーの検出感度を調べたものである。
【図６】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する非特許文献２のプライマーの検出感度を調べたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はコムギの検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１では、コムギＤＮＡを特異的に検出するＰＣＲ法が記載されている。この方法では、安定して検出できるコムギＤＮＡの限界量は、ＰＣＲ反応液２５μｌの系で２．５ｐｇ（ＤＮＡの擬似混入試料２５ｎｇを用いた際、１００ｐｐｍ）と記載されている。
特許文献２では、ＩＴＳ−２領域内に設計したプライマーにより、特許文献１と比べてコムギＤＮＡを高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの系で、コムギＤＮＡ ５０ｆｇ）に検知できることが述べられている。また、ＰＣＲシミュレーションソフトAmplifyにより、コムギＤＮＡからのみ特異的に標的増幅産物が得られることが予想されている。しかし、実際にオオムギ、ライムギ、エン麦ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果、オオムギ、ライムギからも、コムギと同様に標的増幅産物が得られてしまい、コムギ検出用としては不満足なものであった。
非特許文献１では、食品中にコムギが０．０１％以上の濃度で含まれていれば検出できるプライマーセットを作製している。しかし、用いているプライマーセットは、５００ｂｐまたは８００ｂｐと、比較的長いＤＮＡを増幅させるため、加工度の高い食品での検査には適さないと思われる。
非特許文献２では、ｒＲＮＡ遺伝子の２５Ｓ−１８Ｓ遺伝子間領域を用いたコムギ検知ＰＣＲ法を開発している。この方法では、コムギＤＮＡを高感度（ＰＣＲ反応液１００μｌの反応系で、コムギＤＮＡ １ｐｇ）に検出できるが、ライムギＤＮＡからも標的増幅産物が得られたと記載されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６８９８９号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−１９９５９９号公報
【非特許文献１】内野昌孝、増渕菜美子、黒澤有希子、野口智弘、高野克己 「小麦検出プライマーセットの開発」 日本食品科学工学会誌 第５４巻 第２号 ２００７年 ２月 ８２〜８６頁
【非特許文献２】Allmann M, Candrian U, Hofelein C, Luthy J.「Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to immunochemical methods assuring safety and quality of food. Detection of wheat contamination in non-wheat food products.」Z Lebensm Unters Forsch. 196, 248-51 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、コムギを幅広く、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの反応系でコムギＤＮＡ ５０〜５００ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとするコムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られない、コムギに対して特異性を有するコムギ検出用ＰＣＲプライマーを用いたコムギの検出法及びそのプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
コムギそれぞれに特異的な配列として、ＩＴＳ−２配列を含む特定の部分を検出対象として選定すれば、混合物中に微量に存在するコムギを高感度で特異的に検出するのに有効であるという知見が得られた。こうして特定されたプライマーを使用することによって特許文献１よりも高感度に、また、特許文献２よりも特異的にコムギＤＮＡを検出できるとの知見も併せ得た。かかる知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
第一の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法である。
第二の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法である。
第三の発明は、コムギが食用コムギである、第一の発明に記載のコムギの検出方法である。
第四の発明は、食用コムギが、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）であることを特徴とする、第三の発明に記載の食用コムギの検出方法である。
第五の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。
第六の発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。
第七の発明は、コムギが食用コムギである、第五の発明に記載のコムギ検出用プライマーセットである。
第八の発明は、第五の発明又は第六の発明に記載のコムギ検出用プライマーセットを含むコムギ検出用キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の検出方法は、極微量のコムギの存在を検出することが可能であることから、食品原料や食品中におけるコムギの混入の有無を検出するのに有効である。なお、本発明におけるコムギとは、コムギ属（Triticum）に加えてコムギの原種であるエギロプス属（Aegilops）をも含む。また、本発明の検出方法は、食用コムギの混入の有無を検出するのに有効である。ここで、食用コムギとは、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）のことをいい、以下、同様である。
本発明は、(ｉ)配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを使用してＰＣＲを行う場合、又は(ii)配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを使用してＰＣＲを行う場合を含む。
ＰＣＲに当たっては、例えばSaiki RK, et al., Science, 230：1350-1354(1985)や植物細胞工学別冊、植物のPCR実験プロトコール、島本功・佐々木卓治監修（1995年）等に記載されている通常の方法に基づき、変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度と時間、酵素（DNAポリメラーゼ）の種類と濃度、dNTP濃度、プライマー濃度、塩化マグネシウム濃度、鋳型DNA量等の条件を適宜、変更し最良のものを選択する。
【０００７】
次に、食品原料や製品等の被検査対象試料から抽出したＤＮＡのＰＣＲ後の反応液を、例えば電気泳動によって解析してコムギが被検査対象試料中に存在するか否かを検出する。この検出に当たっては、ＰＣＲ後の反応液中に標的とするサイズのＰＣＲ増幅産物が存在するか否か、存在する場合は当該ＰＣＲ増幅産物がコムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含むものであるか否かを指標とする。すなわち、コムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含む標的とするサイズのＰＣＲ増幅産物が存在すれば、被検査対象試料中にコムギが混入していることになり、反対に、ＰＣＲ増幅産物が存在しないか、又はＰＣＲ増幅産物が存在してもコムギのＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含むＰＣＲ増幅産物が存在しなければ、被検査対象試料中にコムギが混入していないことになる。そして、本発明では、この検出を特異的で高感度、例えばＰＣＲ反応液２５μlの系で、コムギＤＮＡ ５０〜５００ｆｇを検出することを可能とした。
【０００８】
上記プライマーを設計するに当たっては、例えば「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで」（蛋白質・核酸・酵素 臨時増刊号１９９６年 共立出版株式会社）や「バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲ：細胞工学別紙 目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著１９９６年 株式会社秀潤社）、「ＰＣＲテクノロジー−ＤＮＡ増幅の原理と応用−」（Henry A Erlich編、加藤邦之進 監修、宝酒造株式会社）等に基づいて設計すればよい。また、本発明のプライマーは、７０塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーセットを構成するものであり、従って、ＤＮＡが分解して短くなっている可能性がある加工食品であっても、感度よく検出することができると共に、増幅産物のシークエンスを確実に行うことができる。こうしたことを考慮して、プライマーの配列は、検出対象であるコムギおよび他の植物属の種々の植物のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列をＧｅｎＢａｎｋから取得し、アライメントを行い、コムギに共通かつ、特異性の高い領域を特定する。こうようにして特定した領域の中から、コムギと他の植物とを区別できる塩基配列を設定して、プライマー配列を選定することができる。このようにして得られたプライマーの塩基配列は、次のとおりである。
センスプライマー：5'- CAT GGT GGG CGT CCT C -3'（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5'- AAA GGC CAT AAT GCC AGC TG -3'（配列番号２）
アンチセンスプライマー：5'- TGA GGC CGT CAT GCC GGC TG -3'（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'- TGA GGC CAT AAT GTC GGC TG -3'（配列番号４）
【０００９】
これらプライマーから２つのコムギ検出用プライマーセットを設計することができる。一つは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットであり、もう一つは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセットである。前者のプライマーセットは食用コムギの検出用として適しており、後者のプライマーセットはコムギ全体を検出対象としている。このようにして設計したプライマーセットの評価にあたっては、ＰＣＲシミュレーションを利用しても良い。すなわち、設計したプライマーについて、ＰＣＲシミュレーションによって標的とする増幅産物が得られるか否かを確認することができる。なお、上記ＰＣＲシミュレーションに当たっては、ＰＣＲシミュレーションソフトAmplify 1.0（Bill Engels）等のソフトを使用することができる。
なお、上記プライマーセットを用いたＤＮＡ配列の増幅は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法（例えば、Saiki RK, et al., Science, 230：1350-1354(1985)）或いはそれと同等の手段を用いて行うことができる。また、増幅産物の検出方法としては、電気泳動法が一般的であるが、その他の方法も用いることができる。
また、上記プライマーセットはキット化することもでき、当該キットには上記プライマーセットの他に、陽性コントロール（コムギのＩＴＳ−２の標的配列を含むＤＮＡ）、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、SYBR Green等を用いたリアルタイムＰＣＲ試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書等を含んでもよい。
【実施例】
【００１０】
１．コムギＤＮＡ検出用プライマーの設計
（１）コムギの配列
コムギ（Triticum）の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Triticum aestivum (AF438186)
2 : Triticum aestivum (AF438187)
3 : Triticum aestivum (AF438188)
4 : Triticum aestivum (AF438191)
5 : Triticum aestivum (AF440676)
6 : Triticum aestivum (AF440679)
7 : Triticum aestivum (AF521903)
8 : Triticum aestivum (AJ301801)
9 : Triticum aestivum (AM040486)
10 : Triticum aestivum(AY346110)
11 : Triticum aestivum(AY346111)
12 : Triticum aestivum(AY346112)
13 : Triticum aestivum(AY346114)
14 : Triticum aestivum(AY346120)
15 : Triticum aestivum(AY450258)
16 : Triticum aestivum(Z11761)
17 : Triticum araraticum(AJ238920)
18 : Triticum araraticum(AJ238921)
19 : Triticum araraticum(AJ238922)
20 : Triticum boeticum(AJ238901)
21 : Triticum dicoccoides(AJ238911)
22 : Triticum dicoccoides(AJ238913)
23 : Triticum dicoccoides(AJ238915)
24 : Triticum dicoccoides(AJ238916)
25 : Triticum dicoccum(AJ238917)
26 : Triticum dicoccum(AJ301801)
27 : Triticum monococcum(AJ301800)
28 : Triticum timopheevii(AJ238923)
29 : Triticum timopheevii(AJ238924)
30 : Triticum turgidum(AJ238912)
31 : Triticum turgidum(AJ238918)
32 : Triticum turgidum(AJ238919)
33 : Triticum turgidum(AY450266)
34 : Triticum urartu(AJ301803)
【００１１】
（２）エギロプスの配列
コムギの原種であるエギロプス (Aegilops) の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Aegilops bicornis(AF149192)
2 : Aegilops bicornis(AJ238907)
3 : Aegilops biuncialis(AF157003)
4 : Aegilops columnaris(AF156997)
5 : Aegilops comosa(AF149198)
6 : Aegilops comosa(AF149201)
7 : Aegilops crassa(AF157000)
8 : Aegilops cylindrica(AF156993)
9 : Aegilops geniculata(AF156998)
10 : Aegilops juvenalis(AF157001)
11 : Aegilops kotschyi(AF157002)
12 : Aegilops longissima(AF149196)
13 : Aegilops longissima(AJ238908)
14 : Aegilops markgrafii(AF149199)
15 : Aegilops neglecta(AF157004)
16 : Aegilops peregrina(AF156996)
17 : Aegilops searsii(AF149194)
18 : Aegilops sharonensis(AF149195)
19 : Aegilops sharonensis(AJ238905)
20 : Aegilops sharonensis(AJ238906)
21 : Aegilops sharonensis(AJ238909)
22 : Aegilops speltoides(AJ238903)
23 : Aegilops speltoides(AJ238904)
24 : Aegilops speltoides(AJ301804)
25 : Aegilops speltoides(AY450267)
26 : Aegilops speltoides(AY450268)
27 : Aegilops speltoides(Z11762)
28 : Aegilops squarrosa(AF149193)
29 : Aegilops tauschii(AJ238910)
30 : Aegilops triuncialis(AF156994)
31 : Aegilops umbellulata(AF149197)
32 : Aegilops vavilovii(AF156999)
33 : Aegilops ventricosa(AF156995)
【００１２】
（３）オオムギ、ライムギ、エン麦の配列
オオムギ（Hordeum）、ライムギ（Secale）、エン麦（Avena）の配列として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている下記配列中のＩＴＳ−２領域を用いた。
1 : Hordeum vulgare(AF438189)
2 : Hordeum vulgare(AF438190)
3 : Hordeum vulgare(AF438192)
4 : Hordeum vulgare(AF438193)
5 : Hordeum vulgare(AF438194)
6 : Hordeum vulgare(AF438195)
7 : Hordeum vulgare(AF438196)
8 : Hordeum vulgare(AF438197)
9 : Hordeum vulgare(AF440677)
10 : Hordeum vulgare(AJ608145)
11 : Hordeum vulgare(AJ608146)
12 : Hordeum vulgare(AJ608147)
13 : Hordeum vulgare(AJ608148)
14 : Hordeum vulgare(AY255059)
15 : Hordeum vulgare(Z11759)
16 : Hordeum vulgare(Z68915)
17 : Hordeum vulgare(Z68916)
18 : Hordeum vulgare(Z68917)
19 : Hordeum vulgare(Z68918)
20 : Hordeum vulgare(Z68919)
21 : Hordeum vulgare(Z68920)
22 : Hordeum vulgare(Z68921)
23 : Hordeum vulgare(Z68922)
24 : Hordeum vulgare(Z68923)
25 : Hordeum vulgare(Z69656)
26 : Secale cereale(AF303400)
27 : Secale cereale(AJ409199)
28 : Secale cereale(AJ409200)
29 : Secale cereale(AJ409201)
30 : Secale cereale(AJ409202)
31 : Secale cereale(AJ409203)
32 : Secale cereale(L36504)
33 : Secale montanum(Z11760)
34 : Secale strictum(AJ409205)
35 : Secale strictum(AJ409206)
36 : Secale strictum(AJ409207)
37 : Secale strictum(AJ409208)
38 : Secale strictum(AJ409209)
39 : Secale strictum(AJ409213)
40 : Secale sylvestre(AJ409210)
41 : Secale sylvestre(AJ409212)
42 : Secale vavilovii(AJ409204)
43 : Secale vavilovii(AJ608152)
44 : Avena sativa(AY520821)
45 : Avena sativa(Z96885)
46 : Avena sativa(Z96887)
47 : Avena sativa(Z96889)
48 : Avena sativa(Z96891)
49 : Avena sativa(Z96893)
50 : Avena sativa(Z96895)
【００１３】
（４）プライマー配列
コムギ、エギロプスＩＴＳ−２配列の中から、全配列にハイブリダイズすると予想され、かつコムギ、エギロプスに特異性の高い配列を選定し、配列番号１〜４の塩基配列を有するプライマーを合成した。
センスプライマー
5'− CAT GGT GGG CGT CCT C −3' （配列番号１）
アンチセンスプライマー
5'− AAA GGC CAT AAT GCC AGC TG −3' （配列番号２）
5'− TGA GGC CGT CAT GCC GGC TG −3' （配列番号３）
5'− TGA GGC CAT AAT GTC GGC TG −3' （配列番号４）
これらのプライマーを用いると、コムギ、エギロプスで６４ｂｐの増幅産物が得られると予想される。
【００１４】
２．ＰＣＲの鋳型として用いたＤＮＡ
（１）ＤＮＡ抽出に用いた試料
コムギ（コムギの原種であるエギロプス及び掛け合わせ品種のライコムギを含む。）
1 : 農林61号（市販品）
2 : Triticum aestivum cv. Chinese Spring (KT020-003)
3 : Triticum aestivum cv. Sapporo Haru (KT020-004)（以上、普通コムギ）
2、3については、横浜市立大学木原生物学研究所遺伝資源バンクから種子を分譲してもらったものである。
4 : Triticum turgidum L (KU-147)（リベットコムギ）
5 : Triticum durum Desf (KU-125)（デュラムコムギ）
6 : Triticum monococcum L. (KU-104-2)（一粒コムギ）
7 : Triticum timopheevi Zhuk (KU-107-1)（チモフェービ系）
8 : Aegilops speltoides Tausch (KU-2-1)（クサビコムギ）
9 : Aegilops squarrosa L. (KU-20-1)（タルホコムギ）
4〜9については、京都大学農学研究科栽培植物起原学分野から種子を分譲してもらったものである。
10 : Triticum aestivum-rye amphidiploid (TACBOW0065)（ライコムギ）
10については、鳥取大学農学部植物遺伝育種学研究室から種子を分譲してもらったものである。
種子分譲依頼は、全てＮＢＰＲ−ＫＯＭＵＧＩ（http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/top/top.jsp）を通して行った。
【００１５】
オオムギ、ライムギ、エン麦
1 : オオムギ（みのり種：市販品）
2 : ライムギ（市販品）
3 : エン麦（前進種：市販品）
【００１６】
その他穀物
1 : ハトムギ（市販品）
2 : トウモロコシ（市販品）
3 : ソバ（市販品）
4 : アワ（市販品）
5 : イネ（コシヒカリ：市販品）
6 : ダイズ（鶴の子大豆：市販品）
【００１７】
（２）ＤＮＡ抽出
農林６１号以外のコムギ、オオムギ、ライムギ、エン麦、ハトムギ、トウモロコシは発芽させ、葉からＤＮＡ抽出を行った。他の試料は、種子からＤＮＡ抽出を行った。
ＤＮＡ抽出は、QIAGEN社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料約０．５ｇを５０ｍｌ容チューブに入れ、７．５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ Ｇ２、２０μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）、２００μｌのプロテイナーゼＫ溶液を加え、混合した後、５０℃で２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、４ｍｌのBuffer QCでカラムを洗浄し、１ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＦでＤＮＡを溶出させた。イソプロパノール沈殿により沈殿物を回収し、４０μｌの滅菌超純水に溶解して、濃度を測定した。超純水を用いて適宜希釈し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
【００１８】
（実施例１ 配列番号１のプライマーと、配列番号２のプライマーからなるプライマーセットを用いたＰＣＲ）
（１）方法
ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔを用い、同キット添付のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従って以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭの各ｄＮＴＰ）に、配列番号１のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号２のプライマーを終濃度で０．２μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、酵素活性化（９５℃，１０分間）後、（９５℃，０．５分間）−（６８℃，１分間）の反応を４０回繰り返して反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。結果を図１に示す。
【００１９】
（２）特異性の確認
図１から明らかなように、コムギ以外の食用ムギ類であるオオムギ、ライムギ、エン麦、それ以外の代表的な穀物として、ハトムギ、トウモロコシ、ソバ、アワ、イネ、ダイズＤＮＡから標的増幅産物が得られないことが確認された。ポジティブコントロールとして用いたコムギ（農林６１号）は５００ｆｇ、他の穀物は５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として用いた。なお、ここで用いたＤＮＡがＰＣＲ増幅可能レベルの純度であることは、植物葉緑体ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した。
【００２０】
（３）コムギ各品種の検出感度確認
コムギ各品種から抽出したＤＮＡの希釈系列を作製し、ＰＣＲで検出感度確認を行った。各品種は、５ｐｇ、５００ｆｇ及び５０ｆｇのＤＮＡを鋳型として用いた。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、コムギ及びその原種として代表的な９品種中、７品種で５０ｆｇのＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。Triticum monococcum L.と、Aegilops squarrosa L.の２品種については、５ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物は得られなかった。これらの２品種は現在ほとんど栽培されておらず、市場に流通する可能性も考えにくいため、これらを検出できないことで大きな問題はないと思われる。ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列上、これら２品種は、センスプライマー領域は完全一致しているが、アンチセンスプライマー領域は、数塩基がミスマッチしており、これが感度に悪影響を及ぼしている可能性がある。２品種の配列に対応したアンチセンスプライマーを併用することで、これらも高感度に検出可能になると予想される。
以上より、現在食用として流通しているコムギを、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの反応系で、コムギＤＮＡ ５０ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとする、コムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られないＰＣＲ法が確立できた。
【００２１】
（実施例２ 配列番号１のプライマーと、配列番号２、３及び４の混合プライマーからなるプライマーセットを用いたＰＣＲ）
（１）方法
ＰＣＲには、センスプライマーとして、配列番号１のプライマーを終濃度で０．２μＭ用い、アンチセンスプライマーとして、配列番号２のプライマーを終濃度で０．１μＭ、配列番号３及び４のプライマーをそれぞれ終濃度で０．０５μＭの混合プライマーを用いた。それ以外の反応溶液組成、温度条件は、３（１）に示した方法と同様に行った。結果を図３に示す。
【００２２】
（２）特異性の確認
図３から明らかなように、コムギ以外の食用ムギ類であるオオムギ、ライムギ、エン麦、それ以外の代表的な穀物として、ハトムギ、トウモロコシ、ソバ、イネ、ダイズＤＮＡから標的増幅産物が得られないことが確認された。ポジティブコントロールとして用いたコムギ（農林６１号）は５００ｆｇ、他の穀物は５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として用いた。なお、ここで用いたＤＮＡがＰＣＲ増幅可能レベルの純度であることは、植物葉緑体ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した。
【００２３】
（３）コムギ各品種の検出感度確認
コムギ各品種から抽出したＤＮＡの希釈系列を作製し、ＰＣＲで検出感度確認を行った。各品種は、５ｐｇ及び５００ｆｇのＤＮＡを鋳型として用い、ｎ＝２でＰＣＲを行った。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、試験した９種全ての品種で５００ｆｇのＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。
以上より、本発明のコムギの検出法により、コムギを幅広く、高感度（ＰＣＲ反応液２５μｌの系で、コムギＤＮＡ ５００ｆｇ）に検出でき、オオムギ、ライムギを始めとする、コムギ以外の穀物からは標的増幅産物が得られないことが確認できた。
【００２４】
（比較例１ 特許文献１の検知ＰＣＲ法との比較）
（１）方法
Triticin precursor遺伝子を標的としたコムギ検知ＰＣＲ法である、特許文献１記載のＰＣＲ法との比較を行った。
用いたプライマー配列は以下の通りである。
5'− CAT CAC AAT CAA CTT ATG GTG G −3' （配列番号５）
5'− TTT GGG AGT TGA GAC GGG TTA −3' （配列番号６）
ＰＣＲは、ＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用い、以下の方法で行った。
２．５μｌの１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、１．５μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、２．５μｌの２ｍＭのｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ、０．１２５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（５Ｕ／μｌ）に、配列番号５のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号６のプライマーを終濃度で０．２μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、酵素活性化（９５℃，１０分間）後、（９５℃，０．５分間）−（６０℃，０．５分間）−（７２℃，０．５分間）の反応を４０回繰り返した後、（７２℃，７分間）反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。
【００２５】
（２）コムギ各品種の検出感度確認と特異性確認
コムギ９品種の検知感度確認を行った。結果を図５に示す。鋳型ＤＮＡには、実施例で作製した希釈系列のうち、５０ｐｇ、５ｐｇ及び５００ｆｇを用いた。
図５から明らかなように、T. monococcum L.は５０ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物が得られず、他の８品種は５０ｐｇのＤＮＡが検知限界だった。
また、オオムギ、ライムギ、エン麦を用いて特異性の確認を行ったところ、コムギ以外のサンプルからは増幅産物が得られないことが確認された。
【００２６】
（比較例２ 非特許文献２の検知ＰＣＲ法との比較）
（１）方法
２５Ｓ−１８Ｓ遺伝子間領域を標的としたコムギ検知ＰＣＲ法である、非特許文献２記載のＰＣＲ法との比較を行った。
用いたプライマー配列は以下の通りである。
5'− GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T −3' （配列番号７）
5'− GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A −3' （配列番号８）
ＰＣＲは、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＧｏＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、以下の方法で行った。
５μｌの５×Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの２ｍＭのｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ、０．１μｌのＧｏＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）に、配列番号７のプライマーを終濃度で０．５μＭと、配列番号８のプライマーを終濃度で０．５μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブ、または９６穴ＰＣＲプレートに入れた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００により、（９５℃，１分間）−（６８℃，０．５分間）−（７２℃，１０秒間）の反応を３５回繰り返した後、（７２℃，２分間）反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２．５％アガロースゲル電気泳動に供して、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳにより解析した。
【００２７】
（２）コムギ各品種の検出感度確認と特異性確認
コムギ９品種の検知感度確認を行った。結果を図６に示す。鋳型ＤＮＡには、実施例で作製した希釈系列のうち、５ｐｇ、５００ｆｇ及び５０ｆｇを用いた。
図６から明らかなように、T. monococcum L.は５ｐｇのＤＮＡからも標的サイズの増幅産物が得られず、A. squarrosa L.は５ｐｇのＤＮＡが検知限界だった。他の７品種は、バンドが薄い場合もあったが、５０ｆｇを検知することができた。
また、実施例２と同様のサンプルを用いて特異性の確認を行ったところ、論文に記載の通り、ライムギＤＮＡから標的サイズの増幅産物が得られた。
【００２８】
以上より、本発明のコムギ検知PCR法と、既存のPCR法とを比較すると、以下のようになる。
【表１】
【００２９】
実施例１の検知ＰＣＲ法は、食用でないコムギを一部検知できないものの、比較例１と比べると、検知感度が優れており、比較例２と比べると、コムギ特異性が優れていた。実施例２の検知ＰＣＲ法は、試験したコムギ９品種全てを検知できたため、比較例１と比べると、検知範囲と検知感度が優れていた。比較例２と比べると、検知感度は劣るものの、コムギ特異性、検知範囲が優れていた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のプライマーセットの特異性を確認したものである。
【図２】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する本発明のプライマーセットの検出感度を調べたものである。
【図３】本発明の混合プライマーを用いたプライマーセットの特異性を確認したものである。
【図４】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する本発明の混合プライマーを用いたプライマーセットの検出感度を調べたものである。
【図５】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する特許文献１のプライマーの検出感度を調べたものである。
【図６】コムギ及びその原種として代表的な９品種に対する非特許文献２のプライマーの検出感度を調べたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法。
【請求項２】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法。
【請求項３】
コムギが食用コムギである、請求項１記載のコムギの検出方法。
【請求項４】
食用コムギが、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）である請求項３記載のコムギの検出方法。
【請求項５】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセット。
【請求項７】
コムギが食用コムギである、請求項５記載のコムギ検出用プライマーセット。
【請求項８】
請求項５又は６記載のコムギ検出用プライマーセットを含むコムギ検出用キット。
【請求項１】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法。
【請求項２】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得る工程と、該増幅産物の存在を指標としてコムギの存在を判定する工程とを含むことを特徴とするコムギの検出方法。
【請求項３】
コムギが食用コムギである、請求項１記載のコムギの検出方法。
【請求項４】
食用コムギが、普通コムギ（Triticum aestivum）、リベットコムギ（T. turgidum）、デュラムコムギ（T. durum Desf）、ライコムギ（Triticum aestivum-rye amphidiploid）である請求項３記載のコムギの検出方法。
【請求項５】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表わされる塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表わされる塩基配列を有するプライマー及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するプライマーによる混合プライマーとからなる、コムギ検出用プライマーセット。
【請求項７】
コムギが食用コムギである、請求項５記載のコムギ検出用プライマーセット。
【請求項８】
請求項５又は６記載のコムギ検出用プライマーセットを含むコムギ検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−８２１２５（Ｐ２００９−８２１２５Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４４０４８（Ｐ２００８−４４０４８）
【出願日】平成２０年２月２６日（２００８．２．２６）
【出願人】（０００１１１４８７）ハウス食品株式会社 (262)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２６日（２００８．２．２６）
【出願人】（０００１１１４８７）ハウス食品株式会社 (262)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]