コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、調製及び使用方法
本発明は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、及び、コラーゲンマトリックスとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンとを含む改変コラーゲンマトリックスに関し、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、異常型であってもよいし、コラーゲン原線維形成を調節するタンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性を有してもよい。本発明は、また、そのようなコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又は改変コラーゲンマトリックスを含む、キット、化合物、組成物、及び改変グラフト作成物、並びにそれらの調製及び使用のための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、並びにその形成及び使用方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、多くの生物学的シグナルを表し、多くの異なる組織の機械的一体性を維持する、体内で最も豊富なタンパク質である。コラーゲンの分子組織がその機能を決定し、そのことが、コラーゲン原線維形成を多くの研究分野における興味深い話題にしている。コラーゲンは、三次元基質として作用することができるゲルを形成するインビトロ自己会合の能力を有し、細胞増殖の機械的及び生物学的シグナルを提供する。追加の細胞外マトリックス成分を用いる及び用いないコラーゲン原線維形成に対する研究は、コラーゲンと他の細胞外マトリックス分子との相互作用について多くの問題を提起した。現在確認されているだけで２０種類を超えるコラーゲンが存在し、Ｉ型が最も一般的である。腱、靱帯、皮膚、及び骨を含む多くの組織は、主にＩ型コラーゲンから構成されている。これらの構造は、それぞれ他の種類のコラーゲンのプロテオグリカン及びグリコサミノグリカン、並びに骨の場合は無機質も含有するが、主要な成分はＩ型コラーゲンである。これらの構造がそれぞれ示す機械的一体性における顕著な差は、主にコラーゲンの入り組んだ組織及び他の非コラーゲンＩ型成分との相互作用に起因する。
【０００３】
デコリンは、コラーゲン原線維形成に影響を及ぼすことが知られているプロテオグリカンであり、したがって、コラーゲンゲルにおいて機械的及び生物学的情報を修飾することができる。コラーゲン組織における構造変化によりもたらされるシグナル、並びにプロテオグリカンの一部であるグリコサミノグリカン鎖に含有されている特有のシグナルは、細胞挙動を変え、所望の細胞反応を提供するようにコラーゲンマトリックスを設計する機構をもたらす。そこで、発明者たちは、コラーゲン組織に分子レベルで影響を及ぼすコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを開発した。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、例えば、グリコサミノグリカン又は多糖のようなグリカンに結合しているコラーゲン結合性ペプチドに基づいて設計されており、これらの成分によって特定の用途に適合させることができる。本明細書に記載されているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、コラーゲンマトリックスの形態学的、機械的、及び生物学的特性に影響を及ぼし、したがって細胞挙動を変えるので、そのことがこれらの分子を組織工学用途にとって有用なものとしている。
【発明の概要】
【０００４】
一つの実施態様において、コラーゲンマトリックスとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンとを含む改変コラーゲンマトリックスが提供される。この実施態様において、１）コラーゲンは、架橋されていてもよいし、非架橋であってもよい、２）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、タンパク質の若しくはコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とアミノ酸相同性を有してもよいし、又は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンであってもよい、３）改変コラーゲンマトリックスは、外来性の細胞集団を更に含むことができる、４）外来性細胞集団は、非角化若しくは角化上皮細胞から選択されてもよいし、又は内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団から選択されてもよい、５）改変コラーゲンマトリックスは、少なくとも１つの多糖を更に含むことができる、６）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：ＰｎＧｘの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜１０であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、そしてＧはグリカン（例えば、グリコサミノグリカン又は多糖）である、７）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである、８）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである、９）合成ペプチドは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有することができる、１０）合成ペプチドは、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有することができる、１１）ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、１２）グリカンは、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されることができる、１３）グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択されることができる、１４）コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されることができる、１５）グリカンは、グリコサミノグリカン又は多糖であることができる、或いは、１６）本発明は、この段落に記載された特徴の任意の組み合わせを含むことができる。
【０００５】
別の例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの調製方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。この実施態様は、前段落に記載された特徴のいずれかを含むことができる。また、この実施態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの量は、約０．４mg/mL〜約６mg/mLであることができ、コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比は、約１：１〜約４０：１であることができる。
【０００６】
更に別の実施態様において、式：ＰｎＧｘの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜１０であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、そしてＧはグリカンである。
【０００７】
更なる実施態様において、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである。
【０００８】
更に別の例示的な実施態様において、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである。これらの化合物実施態様のいずれかにおいて、リンカーは、式：−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮ＝を含むことができ、グリカンは、グリコサミノグリカン又は多糖であることができ、そして上記に記載された任意の適用可能な特徴も含まれうる。
【０００９】
別の態様において、改変コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変える方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、変更された改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。上記に記載された任意の適用可能な特徴も含まれうる。
【００１０】
別の実施態様において、キットが提供される。本キットは、上記に記載された改変コラーゲンマトリックスのいずれかを含むことができる。この実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを滅菌することができ、キットは更に細胞を含むことができ、ここで細胞は、中皮細胞、滑膜細胞、前駆細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞から選択されうる。改変コラーゲンマトリックスは、上記に記載された化合物のいずれかを含むことができる。
【００１１】
一つの実施態様において、血小板の活性を阻害する方法が記載されるが、本方法は、コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、血小板の活性が阻害される。別の実施態様において、コラーゲンへの血小板の接着を阻害する方法が記載されるが、本方法は、コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、コラーゲンへの血小板の接着が阻害される。別の実施態様において、グリカンがヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される上記のいずれかの方法が提供される。更に別の実施態様において、上記の方法のいずれかに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるペプチドを含む。
【００１２】
更に別の実施態様において、グラフト作成物が提供される。グラフト作成物は、上記に記載された改変コラーゲンマトリックスのいずれかを含む。
【００１３】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／０３９，９３３号（２００８年３月２７日出願）及び米国仮出願第６１／０８１，９８４号（２００８年７月１８日出願）の優先権を請求し、この開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コラーゲンマトリックスの機械的及び整列特性を決定するのに重要である、隣接トロポコラーゲン鎖に近接するプロテオグリカンの間の相互作用の概略図を示す。
【図２】エタノールで脱水した後、実施例１６（１０：１のコラーゲン：処理剤）のように調製したゲル試料の、窒化ケイ素接触モードチップのｋ＝０．０５N/mチップよる走査速度２Hz及び偏位設定ポイント：０〜１ボルトでの接触モードによって作製された、ＡＦＭ画像である。試料は、コラーゲンのみ（コラーゲン）、並びにコラーゲンとデルマタン硫酸（ＤＳ）、コラーゲンとデコリン（デコリン）、デルマタン硫酸−ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ結合体（ＤＳ−ＳＩＬＹ）、及びデルマタン硫酸−ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ結合体（ＤＳ−ＳＹＩＲ）である。
【図３】ＣＭ−３プレートに結合したコラーゲンに結合しているペプチドＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ（ＳＩＬＹ）の、会合モード及び解離モードでの表面プラスモン共鳴走査である。ＳＩＬＹを、１００μM〜１．５μMの異なる濃度で１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に２倍の希釈で溶解した。
【図４】９６ウエル高結合型プレート（透明底で黒色（Costar））において測定された、ダンシル修飾ペプチドＳＩＬＹの、コラーゲンへの結合である。ＰＢＳ 緩衝液のみ；ＢＳＡ ＢＳＡ処理ウエル；コラーゲン コラーゲン処理ウエル。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【図５】図４に記載された蛍光データから誘導されたコラーゲン−ダンシル修飾ＳＩＬＹ結合曲線である。
【図６】試薬であるＰＤＰＨと、最終工程において２−ピリジチオールの放出を示す、システイン含有ペプチドと酸化グリコシルアミノグリコシドの２工程結合の化学についての概略的記載である。
【図７】ＰＤＰＨに結合している酸化デルマタン硫酸の、ＤＴＴ処理前、及びＤＴＴによる処理剤（結合体から２−ピリジチオールを放出する）処理後における、３４３nmでの吸光度の測定である。測定値は、ＰＤＰＨと酸化デルマタン硫酸の比率の決定を可能にする。測定されたΔＡ＝０．３５は、１．１のＰＨＰＨ分子／ＤＳに相当する。
【図８】９６ウエル高結合型プレート（透明底で黒色（Costar））において測定された、本明細書に記載されているデルマタン硫酸に結合したダンシル修飾ペプチドＳＩＬＹの、コラーゲンへの結合である。ＰＢＳ 緩衝液のみ；ＢＳＡ ＢＳＡ処理ウエル；コラーゲン コラーゲン処理ウエル。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【図９】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、１０：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ（ＳＹＩＲ）ペプチド。
【図１０】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１１】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、３０：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１２】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（１．５mg/mLのコラーゲンＩＩＩ、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が５００μmになるまで低下させた。◆−処理剤なし、すなわちコラーゲンＩＩＩのみ；■−コラーゲン＋デルマタン硫酸（１：１）；＋−コラーゲン＋デルマタン硫酸（５：１）；×−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（ＤＳ−ＫＥＬＮ）結合体（１：１）；▲−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体（５：１）；●−コラーゲン＋ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（ＫＥＬＮ）ペプチド。
【図１３】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（１．５mg/mLのコラーゲンＩＩＩ、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が５００μmになるまで低下させた。◆−処理剤なし、すなわちコラーゲンＩＩＩのみ；■−コラーゲン＋デルマタン硫酸（１：１）；＋−コラーゲン＋デルマタン硫酸（５：１）；×−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ（ＤＳ−ＧＳＩＴ）結合体（１：１）；▲−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体（５：１）；●−コラーゲン＋ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ（ＧＳＩＴ）ペプチド。
【図１４】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１０：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１５】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１０：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体。
【図１６】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸１０：１；ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１７】図１４において表されたデータから測定した原線維形成の半減期である。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１８】６０×で１．４ＮＡの水浸レンズを使用するOlympus FV1000共焦点顕微鏡により記録された、実施例１６に従って調製（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）したゲルの、共焦点反射顕微鏡画像である。試料を、４８８nmのレーザー光線で照らし、反射光を、青色反射フィルターを使用する光電子増倍管で検出した。それぞれのゲルをゲルの底から１００μMで画像化し、代表的な試料採取を確実にするため３つの異なる場所を画像化した。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１９】ゲル構造の５０００倍のクライオ走査電子顕微鏡画像である。クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６のとおりに（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。各試料を昇華条件下で２０分間蒸発させた。試料を白金スパッター被覆により１２０分間被覆した。試料を−１３０℃でクライオ載物台に移し、同様の配向の各領域を、処理剤同士を比較するために画像化した。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２０】ゲル構造の５０００倍のクライオ走査電子顕微鏡画像である。クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例２２に記載されているとおりに（１mg/mLのコラーゲン（ＩＩＩ型）；１：１のコラーゲン：処理剤）、ＳＥＭ載物台の上に直接形成した。同様の配向の各領域を、処理剤同士を比較するために画像化した。パネルａ、コラーゲン、処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；パネルｂ、コラーゲン＋デルマタン硫酸；パネルｃ、コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体；パネルｄ、コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体。
【図２１】図２０において示されたクライオＳＥＭ画像から測定された平均空間率である。ａ）コラーゲン、処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ｂ）コラーゲン＋デルマタン硫酸；ｃ）コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体；ｄ）コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体。全ての差はｐ＝０．０５で有意である。
【図２２】図１９において示されたクライオＳＥＭ画像から測定された平均原線維直径である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２３】図１９において示されたクライオＳＥＭ画像から測定されたコラーゲンシート間の平均間隔である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２４】ＰＤＰＨに結合した酸化ヘパリンの処理前、及びＳＩＬＹによる処理（結合体から２−ピリジルチオールを放出し、酸化へパリンに結合したＳＩＬＹペプチドの比率の決定を可能にする）の後の、３４３nmでの吸光度の測定である。測定されたΔＡは、５．４４のＳＩＬＹ分子／酸化ヘパリンに相当する。
【図２５】コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンにより調製されたコラーゲンゲルにおける、ヒト冠動脈平滑筋細胞増殖の測定である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体；ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；及びＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図２６】ＤＳ−ＳＩＬＹ結合の特徴決定である。２時間後、最終ΔＡ３４３nmは、各ＤＳ分子１個に添加されたＳＩＬＹ分子の１．０６個に相当した。注：ｔ＝０は、ＤＳ−ＰＤＰＨへのＳＩＬＹの添加と３４３nmでの溶液の測定との間の僅かな遅れのために、近似的なゼロ時点である。
【図２７】Ｄｃ１３のＤＳへの結合である。３４３nmでの吸光度の増加により測定されたピリジン−２−チオンの生成は、ＤＳポリマー鎖あたり０．９９個のＤｃ１３ペプチドを示す。
【図２８】コラーゲンへのＤＳ−ＺＤｃ１３のマイクロプレート蛍光結合である。ＤＳ−ＺＤｃ１３は、用量依存的にコラーゲン表面に特異的に結合した。
【図２９】混濁度測定によるコラーゲン原線維形成である。ＤＳ−Ｄｃ１３は、原線維形成を遅延し、全体的な吸光度を用量依存的に減少する。対照的に、遊離Ｄｃ１３ペプチドは、コラーゲン：添加剤が１：１の高いモル比でのコラーゲンのみと比較したとき、原線維形成にほとんど影響を与えないように見受けられる。
【図３０】クライオＳＥＭによる平均原線維直径である。Ａ．デコリン及び合成ペプチドグリカンは、コラーゲン又はコラーゲン＋ＤＳよりも原線維直径を有意に減少する。Ｂ．コラーゲンのみと比較すると、遊離ペプチドＤｃ１３は、原線維直径に影響を与えないが、ＳＩＬＹは、原線維直径の減少をもたらす。
【図３１】ゲルの圧縮である。Ａ．及びＢ．それぞれ３及び５日目：デコリン及びペプチドグリカンはコラーゲン及びＤＳと比べると有意であり、＊は、ＤＳ−Ｄｃ１３を示し、ＤＳは、３日目には有意ではない。棒線は有意ではないことを示す。Ｃ．７日目：＋デコリンは、全ての試料に対して有意であり、＃ＤＳは、コラーゲンと比較すると有意である。Ｄ．１０日目：＋＋コラーゲン及びＤＳは有意であり、‡ＤＳ−Ｄｃ１３は、デコリン及びコラーゲンと比較すると有意である。
【図３２】ファスチンアッセイによるエラスチン評価。Ａ．ＤＳ−ＳＩＬＹは、全ての試料においてエラスチン生成を有意に増加させた。ＤＳ及びＤＳ−Ｄｃ１３は、コラーゲンよりもエラスチン生成を有意に低減させた。細胞のない対照試料のコラーゲンゲルは、エラスチン生成を示さなかった。Ｂ．遊離ペプチドは、コラーゲンと比較するとエラスチン生成に僅かな減少をもたらしたが、どの点においても有意ではなかった。
【図３３】多血小板血漿のインキュベートされたスライドのＳＥＭ画像である。ヘパリン−ＳＩＬＹ処理における矢印は、この処理に特有の原線維様構造を示す。尺度目盛り＝１００μm。
【図３４】クライオＳＥＭによる原線維密度である。原線維密度は、原線維含有領域と空間の比として定義される。ＤＳ−ＳＩＬＹ及び遊離ＳＩＬＹペプチドは、有意に大きな原線維密度を有した一方、コラーゲンは有意に低い原線維密度を有した。ＤＳ−Ｄｃ１３はコラーゲンと比較すると有意ではなかった。
【図３５】コラーゲンゲルの貯蔵弾性係数（Ｇ′）である。Ａ．５：１、Ｂ．１０：１及びＣ．３０：１のコラーゲン：添加剤のモル比で、それぞれの添加剤により形成されたコラーゲンゲルのレオロジー機械試験。１．０Paの制御圧力による０．１Hz〜１．０Hzの周波数掃引で実施した。Ｇ′の平均±標準誤差を表す。
【図３６】細胞増殖及び細胞毒性アッセイである。Ａ．CyQuant、Ｂ．生存及びＣ．死亡アッセイにおける全ての添加剤において有意な差は見られなかった。
【図３７】原線維密度のクライオＳＥＭ画像である。コラーゲンゲルを、コラーゲン：添加剤のモル比が１０：１の各添加剤の存在下で形成した。Ａ．ＤＳ、デコリン又はペプチドグリカン。Ｂ．遊離ペプチド。画像を１，０００×で撮り、尺度目盛りは５μmである。
【図３８】コラーゲンゲルのＡＦＭ画像である。コラーゲンゲルを、コラーゲン：添加剤のモル比が１０：１の各添加剤の存在下で形成した。Ｄバンド形成は、全ての添加剤において観察される。画像は１μm２である。
【図３９】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。値を、対照処理剤（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）により放出された活性化因子の量と比較した、処理剤により放出された活性化因子の率として報告する。＊は、未処理（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して差が有意であることを示す。Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳｉｌＹ９ デキストラン−（ＳＩＬＹ）９結合体；Ｈｅｐ ヘパリン；Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体；ＨＡ ヒアルロナン；ＨＡ−ＳＩＬＹ ヒアルロナン−ＳＩＬＹ結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。溶解度の限界のために、Ｈｅｐ、Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ、ＨＡ、及びＨＡ−ＳＩＬＹは２５μMでインキュベートした。他の全ての処理剤は５０μMであった（処理剤を除去した後、プレートを、ＰＲＰの添加の前にＰＢＳで＜１分間洗浄した）。Ｈｅｐ及びＨＡ（ヒアルロン酸）結合体は、多糖１つあたりおよそ４つのペプチドを含有した。
【図４０】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。値を、対照処理剤（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）により放出された活性化因子の量と比較した、処理剤により放出された活性化因子の率として報告する。Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６ デキストラン−（ＳＩＬＹ）６結合体；Ｈｅｐ ヘパリン；Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ ヘパリン−ＧＳＩＴ結合体、ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド、ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。全ての処理剤で測定した値は、ＰＢＳに対して有意である。Ｄｅｘ、ＳＩＬＹ及びＤｅｘ−ＳＩＬＹ６は、２５μMであり、他の全ての処理剤は５０μMである。＊＊は、Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ処理の値が、Ｈｅｐ処理の値に対して有意であり、同様に、Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６処理の値が、ＰＦ４のＤｅｘ処理の値に対して有意であったことを示す。（処理剤を除去した後、プレートを２０分間すすいだ）。Ｈｅｐ結合体は、多糖１つあたりおよそ４つのペプチドを含有した。
【図４１】比色アッセイによるコラーゲンへの血小板結合の阻害である。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。記載されたように調製したマイクロプレートアッセイを、以下の各処理剤と共にプレインキュベートした：コラーゲン ＰＢＳのみ；デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬ６ デキストラン−（ＳＩＬＹ）６；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。＊コラーゲン（処理剤なし）に対して有意。
【図４２】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４３】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：デキストラン。
【図４４】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：デキストラン−ＳＩＬＹ９結合体。
【図４５】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４６】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヒアルロナン。
【図４７】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヒアルロナン−ＳＩＬＹ結合体。
【図４８】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４９】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヘパリン。
【図５０】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体。
【図５１】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図５２】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ＳＩＬＹペプチド。
【図５３】ヒドロキシプロリンにより決定されるコラーゲン分解である。処理剤：Ｃｔｒｌ 添加された細胞なし；Ｃｏｌ 処理剤の添加なしのコラーゲン；ＤＳ デルマタン硫酸；デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−Ｄｃ１３ デルマタン硫酸−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド。
【図５４】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面のＩ及びＩＩＩ型コラーゲンゲルを、各処理剤と共にプレインキュベートし、続いてＰＲＰと共にインキュベートした。血小板活性化は、活性化因子ＰＦ−４及びＮａｐ−２の放出により測定した。処理剤：ＰＢＳ 緩衝液のみ；Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ デキストラン−ＳＩＬＹ結合体；Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ デキストラン−ＧＳＩＴ結合体；Ｄｅｘ−ＫＥＬＮ デキストラン−ＫＥＬＮ結合体；Ｄｅｘ−Ｄｃ１３ デキストラン−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド；ＫＥＬＮ ＫＥＬＮペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ＋Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ；デキストラン−ＳＩＬＹ結合体とデキストラン−ＧＳＩＴ結合体の組み合わせ；ＳＩＬＹ＋ＧＳＩＴ；ＳＩＬＹペプチドとＧＳＩＴペプチドの組み合わせ。＊は、結果が処理剤なし（ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して有意であることを示す。＊＊は、結果がＤｅｘによるコラーゲン表面に対しても有意であることを示す。＊＊＊は、結果が対応するペプチド対照によるコラーゲン表面に対しても有意であることを示す。全てのペプチドグリカンは、処理剤なし（ＰＢＳ）又はデキストラン処理剤と比較して、ＮＡＰ−２放出に有意な低下を引き起こし、同時に、Ｄｅｘ−ＧＳＩＴも、ペプチド対照（ＧＳＩＴ）よりも放出を減少した。Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ及びＤｅｘ−ＫＥＬＮは、処理剤なし（ＰＢＳ）及びデキストラン処理剤に対してＰＦ−４放出を有意に減少し、同時に、Ｄｅｘ−Ｄｃ１３は、処理剤なし（ＰＢＳ）よりもＰＦ−４放出を有意に減少した。
【図５５】比色アッセイによるコラーゲンへの血小板結合（接着）の阻害である。処理剤：ＰＢＳ 緩衝液のみ；Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ デキストラン−ＳＩＬＹ結合体；Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ デキストラン−ＧＳＩＴ結合体；Ｄｅｘ−ＫＥＬＮ デキストラン−ＫＥＬＮ結合体；Ｄｅｘ−Ｄｃ１３ デキストラン−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド；ＫＥＬＮ ＫＥＬＮペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ＋Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ；デキストラン−ＳＩＬＹ結合体とデキストラン−ＧＳＩＴ結合体の組み合わせ；ＳＩＬＹ＋ＧＳＩＴ；ＳＩＬＹペプチドとＧＳＩＴペプチドの組み合わせ。＊処理剤なし（ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して有意。＊＊Ｄｅｘによるコラーゲン表面に対しても有意。＊＊＊対応するペプチド対照によるコラーゲン表面に対しても有意。Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ及びＤｅｘ−ＫＥＬＮは、処理剤なし（ＰＢＳ）又はデキストラン処理剤と比較して血小板接着を有意に減少し、同時に、Ｄｅｘ−ＧＳＩＴも、ペプチド対照処理剤（ＧＳＩＴ）よりも血小板接着を減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において使用されるとき、「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」は、グリカンと合成ペプチドとのコラーゲン結合性の結合体を意味する。「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」は、通常はコラーゲン原線維形成に関与しないタンパク質又はプロテオグリカンの一部とのアミノ酸相同性を有することができる。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、本明細書において「異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と呼ぶ。異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、コラーゲン原線維形成に影響を与える場合も、与えない場合もある。他のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、通常はコラーゲン原線維形成に関与するタンパク質又はプロテオグリカンの一部とのアミノ酸相同性を有することができる。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、本明細書において「原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と呼ぶ。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「改変コラーゲンマトリックス」は、コラーゲンが、所定の条件下で、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンと組み合わされてインビトロで重合される、コラーゲンマトリックスを意味し、ここで条件は、変わりうるものであって、ｐＨ、リン酸濃度、温度、緩衝液組成、イオン強度、並びにコラーゲンの組成及び濃度からなる群より選択されるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「改変グラフト作成物」は、「改変コラーゲンマトリックス」を含むグラフト作成物を意味する。
【００１８】
本発明の一つの態様において、改変コラーゲンマトリックスが提供される。改変コラーゲンマトリックスは、コラーゲン及びコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む。一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックは非架橋であることができる。別の実施態様において、マトリックスは架橋されていることができる。多様な例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドのような架橋剤、並びにゲニピンなどを含む多様な天然の架橋剤を、溶液中のコラーゲンの重合の前に、その間に、又はその後に、添加することができる。
【００１９】
多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを調製するために本明細書において使用されるコラーゲンは、Ｉ〜ＸＸＶＩＩＩ型のコラーゲンを含む任意の種類のコラーゲンであることができ、単独で又は組み合わせを、例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及び／若しくはＩＶを使用することができる。一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックスは、市販のコラーゲン（例えば、Sigma, St. Louis, MO）を使用して形成される。代替的な実施態様において、コラーゲンを、腸、膀胱又は胃の組織のような粘膜下組織物質から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを尾腱から精製することができる。追加的な実施態様において、コラーゲンを皮膚から精製することができる。多様な態様において、コラーゲンは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンに加えて、フィブロネクチン、又は皮膚タンパク質、糖タンパク質、及び多糖類などのような、内在性又は外来的に加えられた非コラーゲン性タンパク質も含有することができる。本明細書に記載されている方法により調製される改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスは、移植又は注射部位で関連する組織の特徴的形質をとることができる、移植部位の内在組織の再増殖（例えば、生物学的再構築）のための作成物として機能することができる。
【００２０】
多様な例示的な態様において、本発明の改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを形成するのに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む。幾つかの実施態様において、これらのペプチドは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列に対する相同性を有する。多様な実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、及びこれらの１４個のアミノ酸配列のいずれかと、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、又はこれらのいずれかであることができる。合成ペプチドは、コラーゲン結合活性を有し、且つ、フォンウィルブランド因子のコラーゲン結合ドメインと、又は、Chiang, et al.. J. Biol. Chem. 277: 34896-34901 (2002), Huizinga, et al., Structure 5: 1147-1156 (1997), Romijn, et al., Ｊ. Biol. Chem. 278: 15035-15039 (2003)及びChiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets 7: 71-75 (2007)（それぞれ参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている血小板コラーゲンレセプターのコラーゲン結合ドメインと、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の相同性があるペプチドから選択される、５〜４０個のアミノ酸の任意のペプチドであることもできる。
【００２１】
合成ペプチドに結合しているグリカン（例えば、グリコサミノグリカン、略語ＧＡＧ又は多糖）は、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されうる。一つの実施態様において、グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される。
【００２２】
一つの例示的な態様において、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、滅菌されていることができる。本明細書で使用されるとき、「滅菌」又は「滅菌する」又は「滅菌される」は、内毒素、核酸汚染物質、及び感染病原体が含まれるが、これらに限定されない不要な汚染物質を除去することによって、マトリックス又はグラフト作成物を殺菌することを意味する。
【００２３】
多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、グルタルアルデヒドタンニング、酸性ｐＨでのホルムアルデヒドタンニング、プロピレンオキシド又はエチレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ放射線、電子ビーム及び／又は過酢酸のような過酸による滅菌を含む、従来の滅菌技術を使用して、殺菌及び／又は滅菌することができる。マトリックス又は作成物の構造及びバイオトロピック（biotropic）特性に有害な影響を与えないような滅菌技術を使用することができる。例示的な滅菌技術は、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを、過酢酸、１〜４Mラドのガンマ照射（又は１〜２．５Mラドのガンマ照射）、エチレンオキシド処理又はガスプラズマ滅菌に暴露することである。一つの実施態様において、改変グラフト作成物を、１つ以上の滅菌方法に付すことができる。例示的な実施態様において、溶液中のコラーゲンを滅菌又は殺菌することもできる。改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物をプラスチックラップ又はホイルラップを含む任意の種類の容器で包むことができ、更に滅菌することができる。
【００２４】
これらの実施態様のいずれかにおいて、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスは、追加の細胞集団を更に含むことができる。追加の細胞集団は、１つ以上の細胞集団を含むことができる。多様な実施態様において、細胞集団は、非角化若しくは角化上皮細胞の集団又は内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団を含む。多様な実施態様において、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスに、１種類以上の細胞の組み合わせを接種することができる。
【００２５】
多様な態様において、本発明の改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）を含む栄養素、又はラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン若しくはアグレカン、又は上皮増殖因子、血小板誘導増殖因子、形質転換増殖因子ベータ若しくは線維芽細胞増殖因子のような増殖因子、及びデキサメタゾンのようなグルココルチコイド、又はイオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーのような粘弾性変更剤；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー、及びセルロースポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、又は天然と合成の両方の他の高分子作用物質、と組み合わせることができる。他の例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドのような架橋剤、並びにゲニピンなどを含む天然の架橋剤を、細胞の添加の前に、それと同時に、又はその後に、添加することができる。
【００２６】
上記において考察したように、一つの実施態様によると、細胞を、コラーゲン重合の前又はコラーゲン重合の間に、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物に加えることができる。細胞を含む改変コラーゲンマトリックスを、改変グラフト作成物として使用するために、後に宿主に注射又は移植することができる。別の実施態様において、改変コラーゲンマトリックス上の又はその内の細胞を、所定の時間の長さで、インビトロにおいて培養して、宿主への移植又は注射の前に、細胞数を増加させる又は所望の再構築を誘導させることができる。
【００２７】
一つの実施態様によると、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を含むキットが提供される。キットそれ自体は、任意の種類の容器内にあることができ、キットは、キットの構成要素の使用説明書を含有することができる。一つの実施態様において、細胞は、キットの構成要素の１つを構成することができる。多様な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの特性は異なっていてよい。多様な例示的な実施態様において、キットにおける改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンに加えて、非コラーゲンタンパク質及び多糖類を含む多様な他の構成要素も含むことができる。一つの実施態様において、キットは、例えば改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を含有する、器、バイアル、容器、バッグ又はラップを含む。別の実施態様において、キットは、別々の器（例えば、バイアル、容器、バッグ又はラップ）を含み、それぞれ１つ以上の以下の構成要素を含有する：コラーゲン溶液又は凍結乾燥コラーゲン、及び１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン。別の実施態様において、キットは、別々の器を含み、それぞれ以下の構成要素を含有する：コラーゲン溶液又は凍結乾燥コラーゲン、緩衝液、及び１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン。これらの実施態様のいずれかにおいて、キットは、緩衝液、滅菌若しくは殺菌剤、非コラーゲンタンパク質又は多糖類、及び／或いは、キット試薬の使用方法を記載する又は改変コラーゲンマトリックス若しくは改変グラフト作成物の使用方法を記載する指示資料、を更に含むことができる。キットは、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物の不在下で薬理学的作用物質として使用される、１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンも含有することができる。この実施態様において、キットは、任意の種類の容器内にあることができ、キットは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの使用説明書を含有することができる。
【００２８】
更に別の実施態様において、キットは、非角化若しくは角化上皮細胞の集団、又は、内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団が含まれるが、これらに限定されない細胞の容器（例えば、例としてフラスコ、アンプル、バイアル、チューブ又はボトル）を更に含む。別の実施態様において、細胞はプレート上に存在することができる。一つの実施態様において、細胞の容器を１つ以上含むことができ、キットは、１種類以上の細胞及び細胞培養試薬を含むことができる。
【００２９】
一つの例示的な態様において、改変コラーゲンマトリックスの調製方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。多様な実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、通常はコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性を有する異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンであることができる。
【００３０】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンである実施態様において、コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変更する方法が提供される。本明細書で使用されるとき、「変更する」とは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの不在下で重合されたコラーゲンマトリックスと比べて、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下でインビトロにおいて重合されたコラーゲンマトリックスの機械的又は構造特性を変えることを意味する。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン（例えば、異常型又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン）の存在下で重合して、変更されたコラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。
【００３１】
一つの例示的な実施態様において、提供されるコラーゲン溶液は、約０．４mg/ml〜約６mg/mlの範囲のコラーゲン濃度を有することができる。多様な実施態様において、コラーゲン濃度は、約０．５mg/ml〜約１０mg/ml、約０．１mg/ml〜約６mg/ml、約０．５mg/ml〜約３mg/ml、約１mg/ml〜約３mg/ml、及び約２g/ml〜約４mg/mlの範囲であることができる。
【００３２】
上記において考察されたように、多様な例示的な態様において、本発明の改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを形成するのに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列に対する相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸のペプチドを含む。多様な実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、及びこれらの１４個のアミノ酸配列のいずれかと、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、又はこれらのいずれかであることができる。合成ペプチドは、コラーゲン結合活性を有し、且つ、フォンウィルブランド因子のコラーゲン結合ドメインと、又はChiang, et al.. J. Biol. Chem. 277: 34896-34901 (2002), Huizinga, et al., Structure 5: 1147-1156 (1997), Romijn, et al., Ｊ. Biol. Chem. 278: 15035-15039 (2003)及びChiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets 7: 71-75 (2007)（それぞれ参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている血小板コラーゲンレセプターのコラーゲン結合ドメインと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の相同性があるペプチドから選択される、５〜４０個のアミノ酸の任意のペプチドであることもできる。
【００３３】
合成ペプチドに結合しているグリカンは、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されうる。一つの実施態様において、グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される。コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、重合する前に、例えば緩衝液の中又は水中又は塩酸若しくは酢酸のような酸の中で凍結乾燥することができる。一つの例示的な態様において、コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比は、約１：１〜約４０：１であることができる。
【００３４】
重合工程を異なる条件下で実施することができ、条件は、ｐＨ、リン酸濃度、温度、緩衝液組成、イオン強度、存在する特定の構成要素、及び、コラーゲン又は存在する他の構成要素の濃度、からなる群より選択される。一つの例示的な態様において、コラーゲン又はコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む他の構成要素を、重合の前に凍結乾燥することができる。コラーゲン又は他の構成要素を、塩酸又は酢酸のような酸の中で凍結乾燥することができる。
【００３５】
多様な例示的な実施態様において、重合反応は、当業者に既知の生物学的に適合性のある任意の緩衝液を使用して緩衝した溶液の中で実施される。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−ｎ，ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、〔ｎ−（２−アセトアミド）〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸〕（ＨＥＰＥＳ）及び１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン（ビストリスプロパン）からなる群より選択されうる。一つの実施態様において、緩衝液は、ＰＢＳ、トリス又はＭＯＰＳであり、一つの実施態様において、緩衝系はＰＢＳである。
【００３６】
多様な例示的な実施態様において、重合工程は、約５．０〜約１１の範囲から選択されるｐＨで実施され、一つの実施態様において、重合は、約６．０〜約９．０の範囲から選択されるｐＨで実施され、一つの実施態様において、重合は、約６．５〜約８．５の範囲から選択されるｐＨで実施され、別の実施態様において、重合工程は、約７．０〜約８．５の範囲から選択されるｐＨで実施され、別の実施態様において、重合工程は、約７．３〜約７．４の範囲から選択されるｐＨで実施される。
【００３７】
他の例示的な態様において、緩衝された溶液のイオン強度も調節される。一つの実施態様によると、緩衝液のイオン強度は、約０．０５〜約１．５Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１０〜約０．９０Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１４〜約０．３０Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１４〜約０．１７Mの範囲から選択される。
【００３８】
更に他の例示的な実施態様において、重合工程は、約０℃〜約６０℃の範囲から選択される温度で実施される。他の実施態様において、重合工程は、２０℃を超える温度で実施され、典型的には、重合は、約２０℃〜約４０℃の範囲から選択される温度で実施され、より典型的には、温度は、約３０〜約４０℃の範囲から選択される。一つの例示的な実施態様において、重合は、約３７で実施される。
【００３９】
更に他の実施態様において、緩衝液のリン酸濃度は異なる。例えば、一つの実施態様において、リン酸濃度は、約．００５M〜約０．５Mの範囲から選択される。別の例示的な実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．２Mの範囲から選択される。別の実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．１Mの範囲から選択される。別の例示的な実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．０３Mの範囲から選択される。
【００４０】
本発明の、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む改変コラーゲンマトリックスを、重合の前に、その間に、又はその後で、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）を含む栄養素、又はラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン若しくはアグレカンのような他の化合物、又は上皮増殖因子、血小板誘導増殖因子、形質転換増殖因子ベータ、血管内皮増殖因子若しくは線維芽細胞増殖因子のような増殖因子、及びデキサメタゾンのようなグルココルチコイド、又はイオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーのような粘弾性変更剤；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー及びセルロースポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、又は、天然と合成の両方の他の高分子作用物質、と組み合わせることができる。
【００４１】
一つの実施態様によると、細胞を、改変コラーゲンマトリックスの重合の前又は重合の後の最終工程として添加することができる。他の例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドなどのような架橋剤を、重合の前に、その間に、又はその後に、添加することができる。
【００４２】
一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックスは、市販のコラーゲン（例えば、Sigma, St. Louis, MO）を使用して形成される。代替的な実施態様において、コラーゲンを、腸、膀胱又は胃の組織のような粘膜下組織物質から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを尾腱から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを皮膚から精製することができる。
【００４３】
一つの実施態様において、通常はコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性、又は通常は原線維形成を調節しないタンパク質若しくはペプチドの一部とのアミノ酸相同性を有する、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、所望の構造又は機械的特性を有する改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。別の実施態様において、異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、望ましいが変更されている構造又は機械的特性を有する改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。
【００４４】
所望の構造、微細構造、ナノ構造、又は機械的特性には、例示的に、原線維長、原線維直径、原線維密度、原線維体積率、原線維組織、三次元の形状又は形態、及び、粘弾性、引張、剪断又は圧縮挙動（例えば、破壊応力、破壊歪み、及び係数）、浸透性、分解率、膨張性、水和特性（例えば、速度及び膨張）、及びインビボ組織再構築特性、並びに所望のインビトロとインビボの細胞反応、が含まれうる。本明細書に記載されている改変グラフト作成物及び改変コラーゲンマトリックスは、他の所望の特性のうち、所望の生体適合性及びインビトロとインビボ再構築特性を有することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「係数」は、弾性又は直線係数（従来の機械的試験プロトコールを使用して得られた応力−歪み曲線の直線領域の傾き、すなわち剛性、として定義される）、圧縮弾性率、複素弾性係数、又は剪断貯蔵弾性係数であることができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「原線維体積率」は、三次元のマトリックスの断面において原線維が占有する総面積の面積率として定義され、「空間率」は、三次元のマトリックスの断面において原線維が占有しない総面積の面積率として定義される。
【００４７】
本明細書に記載されている改変コラーゲンマトリックスは、コラーゲン原線維を含み、これは典型的には、原線維にその軸に沿って特徴的な線条外観又は分岐状パターンを与える四分の一ねじれパターンで詰められている。多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの定性的及び定量的な微細構造特性は、走査電子顕微鏡検査法、透過型電子顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法、二次高周波発生多光子顕微鏡検査法により決定することができる。別の実施態様において、引張、圧縮、及び粘弾性特性は、流動測定又は引張試験により決定することができる。これらの方法は全て当該技術において既知であるか、又は、本出願の実施例の部分、若しくはRoeder et al., J. Biomech. Eng., vol. 124, pp. 214-222 (2002), in Pizzo et al., J. Appl. Physiol., vol. 98, pp. 1-13 (2004), Fulzele et al., Eur. J. Pharm. ScL, vol. 20, pp. 53-61 (2003), Griffey et al., J. Biomed. Mater. Res., vol. 58, pp. 10-15 (2001), Hunt et al., Am. J. Surg., vol. 114, pp. 302-307 (1967)及びSchilling et al., Surgery, vol. 46, pp. 702-710 (1959)（参照として本明細書に組み込まれる）において更に記載されている。
【００４８】
上記に記載された改変コラーゲンマトリックス、改変グラフト作成物、キット又は方法実施例のいずれかにおいて、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、以下の式のいずれかの化合物であることができる：
Ａ）ＰｎＧｘ、ここで式中、ｎは１〜１０であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｂ）（ＰｎＬ）ｘＧ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｃ）Ｐ（ＬＧｎ）ｘ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
【００４９】
代替的な実施態様において、以下の式のいずれかの化合物が提供される：
Ａ）ＰｎＧｘ、ここで式中、ｎは１〜１０であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｂ）（ＰｎＬ）ｘＧ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｃ）Ｐ（ＬＧｎ）ｘ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
【００５０】
別の実施態様において、ヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５１】
別の実施態様において、ヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、コラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、又はその両方を阻害することができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５２】
別の実施態様において、本明細書に記載されている合成ペプチドを、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含めることにより修飾することができる。当業者には周知であるように、保存的置換によりペプチドの任意の非重要アミノ酸を変更することは、置換するアミノ酸の側鎖が、置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合及び接触を形成することができるはずであるので、ペプチドの活性を有意に変更することはないはずである。
【００５３】
ペプチドのコラーゲン結合活性に過剰に影響を与えない、及び／或いは、コラーゲンマトリックスの構造若しくは機械的特性の変更、血小板活性化の阻害、又はコラーゲンへの血小板接着（例えば、結合）の阻害におけるペプチドの有効性を低減させないのであれば、非保存的置換も可能である。
【００５４】
当該技術において周知であるように、アミノ酸の「保存的置換」又はペプチドの「保存的置換変種」は、１）ペプチドの二次構造；２）アミノ酸の電荷若しくは疎水性；及び３）側鎖の嵩高、又はこれらの特性のいずれか１つ以上、を維持するアミノ酸置換を意味する。例示的には、周知の用語「親水性残基」は、セリン又はトレオニンに関する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニンなどを意味する。「陽性荷電残基」は、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンに関する。「陰性荷電残基」は、アルパラギン酸又はグルタミン酸を意味する。「嵩高側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンなどを意味する。例示的な保存的アミノ酸置換のリストを表１に提示する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
別の実施態様において、ヘパリンに結合している、コラーゲン結合性ペプチドの一部とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合（例えば、接着）を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。別の実施態様において、デキストランに結合しているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。更に別の実施態様において、ヒアルロナンに結合しているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。これらの実施例のいずれかおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５７】
別の実施態様において、例えばヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンのような任意のグリカンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、血小板活性化を阻害すること又は血栓症を抑えることができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５８】
一つの実施態様において、合成ペプチドは、当業者に周知の固相ペプチド合成プロトコールに従って合成される。一つの実施態様において、ペプチド前駆体は、周知のＦｍｏｃプロトコールに従って固体支持体上に合成され、トリフルオロ酢酸により支持体から切断され、当業者に既知の方法に従ってクロマトグラフィーにより精製される。
【００５９】
別の実施態様において、合成ペプチドは、当業者に周知のバイオテクノロジーの方法を利用して合成される。一つの実施態様において、所望のペプチドのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列を、当業者に既知の組み換えＤＮＡ技術により、発現プラスミド（例えば、ペプチドのアフィニティー精製のためのアフィニティータグを組み込んだプラスミド）に連結し、プラスミドを発現のために宿主生物に形質移入し、次にペプチドを宿主生物又は増殖培地から当業者に既知の方法（例えば、アフィニティー精製）により単離する。組み換えＤＮＡ技術法は、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されており、当業者に周知である。
【００６０】
一つの実施態様において、合成ペプチドは、ペプチドの遊離アミノ基をグリカンのアルデヒド官能基と、還元剤の存在下で、当業者に既知の方法を利用して反応させることにより、グリカンと結合され、ペプチドグリカン結合体を生じる。一つの実施態様において、グリカンのアルデヒド官能基（例えば、多糖又はグリコサミノグリカン）は、グリカンをメタ過ヨウ素酸ナトリウムと当業者に既知の方法に従って反応させることにより形成される。
【００６１】
別の実施態様において、合成ペプチドは、グリカンのアルデヒド官能基を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させて中間体グリカンを形成し、更にこの中間グリカンを遊離チオール基を含有するペプチドと反応させることにより、グリカンと結合されて、ペプチドグリカン結合体を生じる。更に別の実施態様において、ペプチドの配列を、グリシン−システインセグメントを含むように修飾して、グリカン又はグリカン−リンカー結合体のための結合点を提供することができる。
【００６２】
特定の実施態様が先行の段落において記載されてきたが、本明細書に記載されているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、ペプチドをグリカン（例えば、多糖又はグリコサミノグリカン）と結合するための当該技術で認められたあらゆる方法を使用して作製することができる。これには、直接的な、又は二価リンカーのような結合基を介する間接的な、共有、イオン又は水素結合を含むことができる。結合体は、典型的には、結合体の対応する構成要素上の、酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ又はヒドラゾ基の間のアミド、エステル又はイミノ結合の形成を介して、グリカンにペプチドを共有結合することにより形成される。これらの方法は全て、当該技術において既知であるか、又は、本出願の実施例の部分、若しくはHermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp.169-186 (1996)に更に記載されている。リンカーは、典型的には、約１〜約３０個の炭素原子、より典型的には約２〜約２０個の炭素原子を含む。低分子量リンカー（すなわち、約２０〜約５００のおよその分子量を有するもの）が典型的に用いられる。
【００６３】
加えて、結合体のリンカー部分の修飾が本明細書において考慮される。例えば、天然に生じるアミノ酸、並びに、従来の合成方法により入手可能なものが含まれるがこれらに限定されないアミノ酸が、リンカーに含まれることができ、多数のアミノ酸置換が結合体のリンカー部分において実施されてもよい。別の態様において、ベータ、ガンマ、及びより長い鎖のアミノ酸を、１つ以上のアルファアミノ酸の代わりに使用することができる。別の態様において、リンカーは、それに含まれているアミノ酸の数を変えることにより又はより多くの若しくは少ないベータ、ガンマ若しくはより長い鎖のアミノ酸を含めることにより、短く又は長くなることができる。同様に、本明細書に記載されるリンカーの他の化学フラグメントの長さ及び形状を修飾することができる。
【００６４】
一つの態様において、リンカーは、それぞれ場合により置換されていてもよいアルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、シクロへテロアルキレン、アリーレン、及びヘテロアリーレンからなる群よりそれぞれの場合に独立して選択される、１つ以上の二価フラグメントを含むことができる。本明細書で使用されるとき、ヘテロアルキレンとは、直鎖又は分岐鎖アルキレン基の１個以上の炭素原子が、酸素、窒素、リン、及び硫黄からなる群よりそれぞれの場合に独立して選択される原子に代えられていることによってもたらされる基を表す。
【００６５】
一つの態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、患者（例えば、血栓症に関わるような血小板活性化を阻害する治療が必要な患者）に投与することができる。多様な実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、例えば静脈内に、又は筋肉内又は内臓に、投与することができる。非経口投与に適した経路には、静脈内、動脈内、及び筋肉内送達が含まれる。非経口投与に適した方法には、針（顕微針を含む）注射器、及び注入技術が含まれる。
【００６６】
例示的な実施態様において、ａ）薬学的に活性な量のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン；ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲のｐＨを提供する薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤；ｃ）約０〜約３００ミリモルの濃度範囲のイオン強度調整剤；及びｄ）製剤総重量の約０．２５％〜約１０％の濃度範囲の水溶性粘度調整剤、又はａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）の組み合わせ、を含む、非経口投与用のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンと共に使用される医薬製剤が提供される。
【００６７】
多様な例示的な実施態様において、本明細書に記載されている組成物及び方法に使用されるｐＨ緩衝剤は、当業者に既知の作用物質であり、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、及びリン酸緩衝液、並びに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、及びタンパク質、並びに多様な生物学的緩衝液、例えばＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、トリス、トリシン、ヘペス、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ，カコジル酸塩又はＭＥＳが含まれる。
【００６８】
別の例示的な実施態様において、イオン強度調節剤には、当該技術において既知の作用物質が含まれ、例えば、グリシン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び他の電解質である。
【００６９】
有用な粘度調節剤には、イオン性及び非イオン性の水溶性ポリマー；「カーボマー」ファミリーのポリマーのような架橋アクリル酸ポリマー、例えば、Carbopol（登録商標）の商標のもとで市販されているカルボキシポロアルキレン；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー及びセルロースポリマー誘導体；トラガカント及びキサンタンガムのようなガム；アルギン酸ナトリウム；ゼラチン、ヒアルロン酸、及びその塩、キトサン、ジェラン、又はこれらの任意の組み合わせ、が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、中性又は塩基性作用物質のような非酸性粘度増強剤が、製剤の所望のｐＨを達成するのを促進するために用いられる。
【００７０】
一つの例示的な態様において、非経口製剤を、滅菌非水性液剤として、又は発熱物質無含有滅菌水のような適切なビヒクルと一緒に使用される乾燥形態として、適切に処方することができる。例えば凍結乾燥により、滅菌条件下で非経口製剤を調製することは、当業者に周知の標準的な製剤技術を使用して容易に達成することができる。
【００７１】
一つの実施態様において、非経口製剤の調製に使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの溶解度は、溶解度増強剤の組み込みのような、適切な配合技術を使用して増加することができる。
【００７２】
多様な実施態様において、非経口投与用の製剤を、即時の及び／又は調整された放出となるように処方することができる。調整放出製剤には、遅延、持続、間欠、制御、標的、及びプログラム放出製剤が含まれる。したがって、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、活性化合物の調整放出をもたらす移植デポー剤としての投与のために、固体、半固体又はチキソトロピー液として処方することができる。そのような製剤の例示的な例には、薬剤被覆ステント及び共重合（ＤＬ−乳酸、グリコール）酸（ＰＧＬＡ）微小球が挙げられる。別の実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又はコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む組成物を、適切であれば連続的に投与することができる。
【００７３】
他の実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン及びそれらを含有する組成物を局所的に投与することができる。軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ゲル軟膏剤、プラスター剤（例えば、バップ剤、湿布剤）、液剤、粉末剤などのような多様な剤形、及び基剤を、局所調合剤に適用することができる。これらの調合剤は、下記に記載される従来の薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて、任意の従来の方法により調製することができる。
【００７４】
例えば、軟膏剤の調製において、ワセリン、高級アルコール、ミツロウ、植物油、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。クリーム製剤の調製において、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、脂肪酸エステル、精製水、乳化剤などを使用することができる。ゲル製剤の調製において、ポリアクリル酸塩（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、精製水、低級アルコール、多価アルコール、ポリエチレングリコールなどのような従来のゲル化物質が使用される。ゲル軟膏調合剤の調製において、乳化剤（好ましくは、非イオン性界面活性剤）、油状物質（例えば、流体パラフィン、トリグリセリドなど）などが、上記に記述されたゲル化物質に加えて使用される。バップ剤又は湿布剤のようなプラスター剤は、上記に記述されたゲル調合剤を支持体（例えば、布、不織布）に塗布することにより調製することができる。上記の成分に加えて、パラフィン、スクアラン、ラノリン、コレステロールエステル、高級脂肪酸エステルなどを、場合により使用してもよい。更に、ＢＨＡ、ＢＨＴ、没食子酸プロピル、ピロガロール、トコフェロールなどのような酸化防止剤も組み込むことができる。上記の調合剤及び構成要素に加えて、場合により、任意の他の添加剤が組み込まれた任意の他の従来の製剤を使用してもよい。
【００７５】
本明細書に記載されている製剤のいずれかを使用して、本明細書に記載されている改変コラーゲンマトリックスの不在下又は存在下で、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン（例えば、１種類以上）を投与することができる。
【００７６】
多様な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを伴う又は伴わないコラーゲン結合性合成ペプチドグリカングラフトの投与量は、患者の状態、治療される疾患状態、投与経路、及び組織分布、並びに他の治療処置の併用の可能性に応じて、有意に変わりうる。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重、及び患者の状態に関する医師の評価に基づいている。多様な例示的な実施態様において、有効用量は、約１ng/kg〜約１０mg/kg、１００ng/kg〜約１mg/kg、約１μg/kg〜約５００μg/kg又は約１００μg/kg〜約４００μg/kgの範囲であることができる。これらの実施態様のそれぞれにおいて、用量／kgとは、患者の体重１キログラムあたりの用量を意味する。他の例示的な態様において、有効用量は、１用量あたり約０．０１μg〜約１０００mg、１用量あたり１μg〜約１００mg又は１用量あたり１００μg〜約５０mg又は１用量あたり５００μg〜約１０mg又は１用量あたり１mg〜約１０mgの範囲であることができる。
【００７７】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを投与する任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、単回用量又は多回用量の毎日レジメンとして投与することができる。更に、時差レジメン、例えば１週間あたり１〜５日間を、毎日治療の代替案として使用することができる。
【００７８】
本発明の一つの実施態様において、患者は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの複数回の注射で治療される。一つの実施態様において、患者には、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、例えば１２〜７２時間間隔又は４８〜７２時間間隔で複数回（例えば、約２回から最大約５０回まで）注射する。コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの追加の注射を、最初の注射の後、数日間又は数か月の間隔を置いて患者に投与することができ、追加の注射は、疾患の再発を予防する。あるいは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの最初の注射が、疾患の再発を予防してもよい。
【００７９】
本明細書に記載されている実施態様のいずれかにおいて、ペプチド部分、グリカン部分又はその両方が異なっている２つ以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの組み合わせを、単一のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの代わりに使用できることが理解されるべきである。
【００８０】
前述の実施態様において、化合物、組成物、及び方法の特定の態様は、例示的には１つ以上のＧ及びＰのいずれかにおける選択の場合のように、リストの選択肢として表されていることも理解される。したがって、本発明の多様な代替的実施態様は、これらのリストの個別のメンバー、並びにこれらのリストの多様なサブセットを含むことが理解されるべきである。これらの実施態様は、それぞれ、リストによって本明細書に記載されているということが理解されるべきである。
【００８１】
以下の例示的な実施例において、用語「合成ペプチドグリカン」及び「結合体」は、用語「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と同義的に使用される。
【実施例】
【００８２】
〔実施例１〕
ペプチド合成
全てのペプチドは、Knorr樹脂上でＦＭＯＣプロトコールを利用する、Symphonyペプチド合成機（Protein Technologies, Tucson, AZ）を使用して合成した。粗ペプチドをＴＦＡにより樹脂から分離し、Grace-Vydac 218TP C-18逆相カラム及び水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡの勾配を利用する、AKTAexplorer（GE Healthcare, Piscataway, NJ）の逆相クロマトグラフィーにより精製した。ダンシル修飾ペプチドを、樹脂から分離する前に、ダンシル−Ｇｌｙ（Sigma）との追加のカップリング工程を加えることにより調製した。ペプチド構造を質量分析により確認した。以下のペプチドを上記に記載されたように調製した：ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ダンシル−ＧＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ及びダンシル−ＧＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ。これらのペプチドは、ＳＩＬＹ、ＳＹＩＲ、Ｚ−ＳＩＬＹ及びＺ−ＳＹＩＲと略される。追加のペプチドのＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（略語ＫＥＬＮ）及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ（略語ＧＳＩＴ）を、上記に記載されたように調製するか又は購入した（Genescript, Piscataway, NJ）。
【００８３】
〔実施例２〕
デルマタン硫酸へのＳＹＩＲペプチドの結合
ＳＹＩＲを、Hermansonの方法（Hermanson, 1996）を僅かに改変した方法によりｏｘＤＳに結合した。ペプチドＳＹＩＲを、０．０５Mの炭酸ナトリウム、０．１Mのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５に濃度０．４mg/mLで溶解して５mLの最終容量にした。１０倍のペプチドモル過剰で反応させるために、２９mgのｏｘＤＳ、ＭＷ４１，０００（４１kDaの１．１アルデヒド／ＤＳ分子を含有する酸化デルマタン硫酸は、Celsus Laboratories, Cincinnati, OHから入手可能である）を、ペプチド溶液に溶解した。穏やかに撹拌しながら、５０μLのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応を室温で一晩進行させた。
【００８４】
過剰ペプチドを、Sephadex G-25媒体（GE Health）が充填され、脱イオン水（MiIIiQ）で平衡にしたXK 26-40カラムを使用するAkta Purifierのゲル濾過により分離した。溶離液を２１５nm、２５４nm及び２８０nmでモニタリングした。ＤＳ−ＳＹＩＲを含有する最初の溶離ピークを収集し、更なる試験のために凍結乾燥した。
【００８５】
〔実施例３〕
デルマタン硫酸へのＳＩＬＹの結合
ｏｘＤＳへのＰＤＰＨ結合
スルフヒドリル及びアミン基に反応性である二官能架橋剤のＰＤＰＨ（Pierce）を使用して、ｏｘＤＳにＳＩＬＹを結合した。反応の第１工程において、ｏｘＤＳをカップリング緩衝液（０．１Mのリン酸ナトリウム、０．２５Mの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解して、１．２mMの最終濃度にした。ＰＤＰＨを１０倍モル過剰で加え、反応を室温で２時間進行させた。過剰ＰＤＰＨ（ＭＷ２２９Da）を、Sephadex G-25媒体が充填され、MiIIiQ水で平衡にしたXK 26-40カラムを使用するAkta Purifier上でのゲル濾過により分離した。溶離液を２１５nm、２５４nm及び２８０nmでモニタリングした。ＤＳ−ＰＤＰＨを含有する最初の溶離ピークを収集し、ＳＩＬＹへの結合のために凍結乾燥した。
【００８６】
ＰＤＰＨ含有量の決定
ｏｘＤＳと結合しているＰＤＰＨ分子の数を決定するため、ＤＳ−ＰＤＰＨを１．６mg/mLでカップリング緩衝液に溶解した。１０μLのＤＴＴを１５mg/mLでＤＳ−ＰＤＰＨ溶液に加え、反応を室温で１５分間進行させた。ＰＤＰＨのシステイン反応側のジスルフィド結合を還元すると、ピリジン−２−チオンを放出し、これは３１３nmで見ることができる。３１３nmでの吸光度を、ＤＴＴ添加の前後に測定し、その差を、ピリジン−２−チオンの吸光係数を使用してＰＤＰＨ分子／ＤＳ分子の数を計算するために使用した。図７の結果は、ΔＡ＝０．３５を示し、１．１のＰＨＰＨ分子／ＤＳに相当する。
【００８７】
ＳＩＬＹの結合
ペプチドを５：１モル過剰でカップリング緩衝液に、最終ペプチド濃度のおよそ１mM（ペプチドの溶解度より限定される）で溶解した。反応を室温で一晩進行させ、過剰ペプチドを分離し、ＤＳ−ＳＩＬＹ結合体を、上記に記載されたゲル濾過により単離した。カップリング後のＳＩＬＹ／ＤＳ比の１．０６を示す、図２６を参照すること。
【００８８】
〔実施例４〕
デルマタン硫酸へのＺ−ＳＩＬＹの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、Ｚ−ＳＩＬＹに結合した。
【００８９】
〔実施例５〕
デルマタン硫酸へのＫＥＬＮの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、ＫＥＬＮに結合した。
【００９０】
〔実施例６〕
デルマタン硫酸へのＧＳＩＴの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、ＧＳＩＴに結合した。
【００９１】
〔実施例７〕
デルマタン硫酸へのＺ−ＳＹＩＲの結合
デルマタン硫酸を、実施例２の方法に従って、Ｚ−ＳＹＩＲに結合した。
【００９２】
〔実施例８〕
ヘパリンへのＳＩＬＹの結合
分子１個あたり１つのアルデヒドを含有する酸化ヘパリン（ｏｘＨｅｐ）（ＭＷ＝１９．７kDa）（Celsus Laboratories, Cincinnati, OHから購入した）。追加のアルデヒドを、以下のように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムにおける更なる酸化により形成した。ｏｘＨｅｐを０．１Mの酢酸ナトリウムに、ｐＨ５．５、濃度１０mg/mLで溶解した。次にメタ過ヨウ素酸ナトリウムを２mg/mLの濃度で加え、遮光下にて室温で４時間反応させた。過剰メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、HiTrapサイズ除去カラム（GE Healthcare）を使用して脱塩することにより除去し、ｏｘＨｅｐを、凍結乾燥し、ＰＤＰＨとの結合まで遮光した。
【００９３】
ｏｘＨｅｐを、実施例３のＤＳ−ＰＤＰＨ結合について記載された方法により、ＰＤＰＨに結合した。ＰＤＰＨを５０倍のモル過剰で反応させた。より高いＰＤＰＨ濃度を達成するために、１０mgのＰＤＰＨを７５μLのＤＭＳＯに溶解し、１mLのｏｘＨｅｐ含有カップリング緩衝液と混合した。反応は室温で２．５時間進行し、過剰ＰＤＰＨを脱塩により除去した。ヘパリン含有ＰＤＰＨ（Ｈｅｐ−ＰＤＰＨ）を、ＳＩＬＹと反応させるまで、凍結乾燥粉末として保存した。
【００９４】
ＳＩＬＹを、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹ結合について記載されたとおりに、１０倍モル過剰でＨｅｐ−ＰＤＰＨと反応させた。反応を、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹについて記載されたようにモニタリングしたところ、図２４に示されているように、ヘパリン分子１個あたり５．４４の結合したシリルペプチドを示した。
【００９５】
〔実施例９〕
ヘパリンへのＧＳＩＴの結合
ヘパリンを、実施例８に方法に従って、ＧＳＩＴと結合した（略語Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ）。
【００９６】
〔実施例１０〕
デキストランへのＳＩＬＹの結合
デキストランを、ヘパリンをデキストランに代えて実施例８の方法に従って、ＳＩＬＹと結合した。第１工程におけるメタ過ヨウ素酸ナトリウムによるデキストランの酸化条件の変更は、ＳＩＬＹとデキストランのモル比が異なる結合体の調製を可能にした。例えば、ＳＩＬＹとデキストランのモル比が約６のデキストラン−ＳＩＬＹ結合体及びＳＩＬＹとデキストランのモル比が約９のデキストラン−ＳＩＬＹ結合体を調製した（略語Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６及びＤｅｘ−ＳＩＬＹ９）。
【００９７】
〔実施例１１〕
ヒアルロナンへのＳＩＬＹの結合
ヒアルロナンを、実施例８に方法に従って、ＳＩＬＹと結合した（略語ＨＡ−ＳＩＬＹ）。
【００９８】
〔実施例１２〕
コラーゲンへのＳＩＬＹの結合（Biacore）
Biacore分析を、CM-3チップを使用するBiacore 2000（Biacore, Inc., Piscataway, NJ）により実施した。CM-3チップは、共有結合カルボキシメチル化デキストランで被覆されており、これにより遊離アミン基を介した基質コラーゲンの結合が可能になる。フローセル（ＦＣ）１及び２を使用し、ＦＣ−１を基準セルとし、ＦＣ−２をコラーゲン固定化セルとした。各ＦＣをＥＤＣ−ＮＨＳで活性化し、ｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液中の１mg/mLのコラーゲンを５μL/分で１０分間流し込むことにより、ＦＣ−２上に１５００RUのコラーゲンを固定化した。未反応ＮＨＳ−エステル部位をエタノールアミンでキャップし、対照ＦＣ−１を活性化し、エタノールアミンでキャップした。
【００９９】
ペプチド結合親和性を決定するために、ＳＩＬＹを、１００uM〜１．５μMの異なる濃度で１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Biacore）に２倍の希釈で溶解した。流速を、結合動態を決定するためにMyskaにより提案（Myska, 1997）された範囲内である９０μL/分に保持した。最初の１０回の注射は、系の始動を助ける緩衝液注射であり、続いて無作為な試料注射を３回ずつ行った。解析はBIAevaluationソフトウエア（Biacore）を使用して実施した。代表的な会合／解離曲線を図３に示し、これはＳＩＬＹペプチドがコラーゲンに可逆的に結合することを実証している。ＫＤ＝１．２μMであることが、オンオフ結合動態からの計算により得られた。
【０１００】
〔実施例１３〕
コラーゲンへのＺ−ＳＩＬＹの結合
結合アッセイを、黒色で透明底の９６ウエル高結合型プレート（Costar）で行った。コラーゲンを未処理ウエル及びＢＳＡ被覆ウエルと比較した。コラーゲン及びＢＳＡを、１０mMのＨＣｌ及び１×ＰＢＳそれぞれの中で２mg/mLの濃度で、９０μL／ウエルずつインキュベートすることにより、３７℃で１時間固定した。インキュベート後、各ウエルを１×ＰＢＳで３回洗浄した。Ｚ−ＳＩＬＹを、１００μM〜１０nMの濃度で１×ＰＢＳに１０倍の希釈で溶解した。ウエルを３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、次に９０μLの１×ＰＢＳを充填した。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。結果を図４及び５に示す。ＫＤ＝０．８６μMであることが、平衡動態からの計算により得られた。
【０１０１】
〔実施例１４〕
ＤＳ−ＳＩＬＹの特徴決定
ＤＳに結合したＳＩＬＹ分子の数を決定するために、ピリジン−２−チオンの生成を、Pierceにより提供された変更プロトコールを使用して測定した。１．１のＰＤＰＨ分子が結合しているデルマタン硫酸を０．４４mg/mLの濃度でカップリング緩衝液（０．１Mのリン酸ナトリウム、０．２５Mの塩化ナトリウム）に溶解し、３４３nmでの吸光度を、SpectraMax M5（Molecular Devices）を使用して測定した。ＳＩＬＹを５倍モル過剰で反応させ、吸光度の測定を、ＳＩＬＹの添加の直後と、２時間反応させた後に、繰り返し行った。ＳＩＬＹそれ自体が３４３nmで吸収しないことを確実にするため、０．１５mg/mLのＳＩＬＹを含有するカップリング緩衝液を測定し、緩衝剤のみの吸光度と比較した。
【０１０２】
ＤＳに結合したＳＩＬＹ分子の数を、次の式：（Ａｂｓ３４３／８０８０）×（ＭＷＤＳ／ＤＳmg/mL）を使用して、ピリジン−２−チオンの吸光係数により計算した。結果を図２６に示す。
【０１０３】
〔実施例１５〕
コラーゲン結合、蛍光データ−ＤＳ−ＳＩＬＹ
ペプチド結合体が、ＤＳへの複合の後で、コラーゲンに結合する能力を維持するかを決定するために、蛍光結合アッセイを実施した。蛍光標識型のＳＩＬＹであるＺ−ＳＩＬＹは、ダンシルグリシンをアミン末端に付加することにより合成した。このペプチドをＤＳと結合し、ＳＩＬＹについて記載されたものと同じ方法を使用して精製した。
【０１０４】
結合アッセイを、黒色で透明底の９６ウエル高結合型プレート（Costar）で行った。コラーゲンを未処理ウエル及びＢＳＡ被覆ウエルと比較した。コラーゲン及びＢＳＡを、１０mMのＨＣｌ及び１×ＰＢＳそれぞれの中で２mg/mLの濃度で、９０μL／ウエルずつインキュベートすることにより、３７℃で１時間固定した。インキュベート後、各ウエルを１×ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１０５】
ウエルをＤＳと共に３７℃で３０分間プレインキュベートして、コラーゲンへのＤＳの非特異的結合を排除した。ウエルを、ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹと共にインキュベートする前に、１×ＰＢＳで３回すすいだ。ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹを、１００μM〜１０nMの濃度で１×ＰＢＳに１０倍の希釈で溶解した。ウエルを３７℃で３０分間インキュベートし、３回すすぎ、次に９０μLの１×ＰＢＳを充填した。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【０１０６】
固定コラーゲン、ＢＳＡ及び未処理ウエルへのＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹの蛍光結合を図８で比較する。結果は、ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹが、ＢＳＡ処理ウェル及び未処理ウエルよりもコラーゲン処理ウエルに特異的に結合することを示す。高結合型プレートの未処理ウエルは、陽性対照として設計されたが、コラーゲン処理ウエルと比べてほとんど結合が観察されなかった。これらの結果は、ＳＩＬＹがＤＳへの結合の後でもコラーゲンに結合する能力を維持することを示唆している。ＤＳとのプレインキュベーションは結合を防止せず、結合体がＤＳのみとは別に結合することを示唆している。
【０１０７】
〔実施例１６〕
Ｉ型コラーゲンゲルの調製
ゲルを、４mg/mLの最終コラーゲン濃度でNutragenコラーゲン（Inamed, Freemont, CA）から作製した。Nutragen貯蔵溶液は、１０mMのＨＣｌ中の６．４mg/mLである。ゲル調製を氷上で実施し、新鮮な試料をそれぞれの試験の前に作製した。コラーゲン溶液は、適切な容量の１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、１×ＰＢＳ及び１MのＮａＯＨを加えることにより、生理学的ｐＨ及び塩濃度に調整した。大部分の実験において、ＤＳ、デコリン、ＤＳ−ＳＩＬＹ又はＳＤ−ＳＹＩＲの試料を、試験試料を適切な濃度で溶解した最終１×ＰＢＳ添加（各処理剤を通して等量）により、１０：１のコラーゲン：試料モル比で加えた。この方法により、試料は、ｐＨ７．４及び生理学的塩濃度を常に保持する。コラーゲンのみの試料には、試料が溶解していない１×ＰＢＳを添加した。原線維形成は、中和コラーゲン溶液を、脱水を避けるために加湿チャンバーにおいて３７℃で一晩インキュベートすることによって誘導する。コラーゲン：試料モル比が１０：１以外のゲル溶液を、同様に調製した。
【０１０８】
〔実施例１７〕
ゲルの粘弾性の特徴決定
コラーゲンゲルを実施例１６に記載されたとおりに調製し、加熱する前に、２００μLの各処理剤を疎水性印刷スライド（Tekdon）の可湿性表面にピペットで加えた。ＰＴＦＥ印刷はゲルを２０mm直径の可湿性領域に限定した。機械的試験に先立ち、加湿インキュベーター中で３７℃で一晩かけて、ゲルを形成した。
【０１０９】
スライドを、２０mmのステンレススチール平行平板配置を有するAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）のレオメーター載物台の上で挟み、２０mmのステンレススチール平行平板配置を、形成されたゲルへの過剰な剪断を避けるために、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。圧力及び周波数掃引の反復過程をコラーゲンのみのゲルに実施して、直線範囲を決定した。また、全ての試料を０．１Hz〜１．０Hzの周波数範囲及び１．０Paの制御圧力で試験した。Design Expertソフトウエア（StatEase, Minneapolis, MN）を使用する統計分析を、各周波数で実施し、５方向ＡＮＯＶＡを使用して、各試料を比較した。図９の１０：１、図１０の５：５及び図１１の３０：１で示されている結果は、合成ペプチドグリカンによる処理は、Ｉ型コラーゲンゲルの粘弾性挙動を変更しうることを実証している。
【０１１０】
〔実施例１８〕
ＩＩＩ型コラーゲン含有ゲルの粘弾性の特徴決定
ＩＩＩ型コラーゲンを含有するゲルを、実施例１６と同様に以下の変更を加えて調製した：処理済及び未処理ゲル溶液は、１．５mg/mLのコラーゲン濃度（９０％コラーゲンＩＩＩ（Millipore）、１０％コラーゲンＩ）を使用して調製し、２００μLの試料を、疎水性印刷スライドの２０mm直径の可湿性表面にピペットで加えた。これらの溶液を、３７℃で２４時間ゲル化させた。対照としてのゲルは、コラーゲンのみ、デルマタン硫酸（１：１及び５：１のモル比）で処理したコラーゲン、及びコラーゲンＩＩＩ結合ペプチドのみ（ＧＳＩＴ及びＫＥＬＮ、５：１モル比）で処理したコラーゲンから形成した。処理したゲルは、ペプチドグリカンを（ＤＳ−ＧＳＩＴ又はＤＳ−ＫＥＬＮを１：１及び５：１のモル比で）含有した。全ての比は、コラーゲン：処理剤化合物の比である。試料を０．１Hz〜１．０Hzの周波数範囲、１．０Paの制御圧力で試験したこと以外は実施例１７と同様のようにして、ゲルの特徴決定を行った。図１２及び１３に示されているように、デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体及びデルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体（合成ペプチドグリカン）は、ＩＩＩ型コラーゲンから形成されたゲルの粘弾特性に影響を及ぼすことができる。
【０１１１】
〔実施例１９〕
原線維形成
原線維形成の速度及び原線維の直径に関する情報を提供する、混濁度に関連のある３１３nmでの吸光度を測定することにより、コラーゲン原線維形成をモニタリングした。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、４mg/mLのコラーゲン及び１０：１のコラーゲン：処理剤）に調製し、５０uL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。結果を図１４、１５及び１６に示す。１０：１モル比試料のゲル形成のＴ１／２を図１７に示す。デルマタン硫酸−ＳＩＬＹは、原線維形成の速度を減少する。
【０１１２】
〔実施例２０〕
共焦点反射顕微鏡検査法
ゲルを、上記の実施例１６に記載されているように形成し、一晩インキュベートし、ゲルを、６０×で１．４ＮＡの水浸レンズを使用するOlympus FV1000共焦点顕微鏡により画像化した。試料を、４８８nmのレーザー光線で照らし、反射光を、青色反射フィルターを使用する光電子増倍管で検出した。それぞれのゲルをゲルの底から１００μMで画像化し、代表的な試料採取を確実にするため３つの異なる場所を画像化した。結果を図１８に示す。
【０１１３】
〔実施例２１〕
コラーゲンＩのクライオＳＥＭ測定
クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６のとおりにＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。次に載物台をクライオ保持器中に固定し、液体窒素スラッシの中に投入した。次に試料を、真空下で−１７０℃に冷却したGatan Alto 2500プレチャンバーに移した。自由破面を冷却メスにより作り出し、各試料を昇華条件下で２０分間蒸発させた。試料を白金スパッター被覆により１２０秒間被覆した。試料を−１３０℃のクライオ載物台に移し、処理剤同士を比較するために、同様の配向の各領域を画像化した。５，０００×で画像化した代表的な試料を図１９に示す。画像を分析して平均原線維直径（図２２）及びコラーゲンシート間の平均間隔（図２３）を決定した。原線維直径は、手動で個別の原線維を測定（原線維を横断して線を引き、尺度を正確に設定した後、その長さを測定する）してImageJソフトウエア（NIH）を使用して計算した。３人の観察者が、１処理剤あたり３つの別々の画像について、画像１つあたり１０本の原線維を記録し、１処理剤あたり合計で９０の測定値を得た。シート間隔は、ここでも手動で測定するImageJを使用して計算した。１処理剤あたり１人の観察者で１５の測定値であった。原線維直径及びコラーゲンシート間の間隔は、デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ合成ペプチドグリカンで処理されたゲルにおいて減少した。
【０１１４】
〔実施例２２〕
コラーゲンＩＩＩのクライオＳＥＭ測定
クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６と同様の方法に以下の変更を加え、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。コラーゲン濃度は、１mg/mLであった（９０％のコラーゲンＩＩＩ、１０％のコラーゲンＩ）コラーゲン：ＤＳの比は１：１であり、コラーゲン：ペプチドグリカンの比は１：１であった。画像を実施例２１のとおりに記録した。空間体積と原線維体積の比は、実施例２１の方法の変形を使用して測定した。結果を図２０及び２１に示す。デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ及びデルマタン硫酸−ＧＳＩＴは、処理済コラーゲンゲルにおいて、空間を減少する（原線維直径及び分岐を増加する）。
【０１１５】
〔実施例２３〕
Ｄバンド形成のＡＦＭ確認
ゲル溶液を実施例１６に記載されたとおりに調製し、２０μLの各試料をカバーガラスにピペットで加え、加湿インキュベーターにおいて一晩ゲル化させた。ゲルを段階的エタノール溶液（３５％、７０％、８５％、９５％、１００％）により、各溶液で１０分間処理した。走査速度２Hzの接触モード（Multimode SPM, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA, USA、ＡＦＭチップ窒化ケイ素接触モードチップのｋ＝０．０５N/m、Veeco Instruments）、偏位設定ポイント：０〜１ボルトにて、ＡＦＭ画像を作製した。Ｄバンド形成は、図２及び３８に示されているように、全ての処理剤において確認された。
【０１１６】
〔実施例２４〕
コラーゲン再構築
組織試料の調製
Grassl, et al.の方法（Grassl, et al., Journal of Biomedical Materials Research 2002, 60, (4), 607-612）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に従って、合成ＰＧ模倣体を有する又は有さないコラーゲンゲルを、実施例１６に記載されたとおりに形成した。ヒト大動脈平滑筋細胞（Cascade Biologies, Portland, OR）を、インキュベーションに先立って、中和コラーゲン溶液に４×１０６細胞／mLで加えることによりコラーゲンゲル内に接種した。細胞コラーゲン溶液を、８ウエルLab-Tekチャンバースライドにピペットで移し、加湿した３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ゲル化した後、細胞コラーゲンゲルを、Cascadeにより処方された１mLの培地２３１で覆う。３〜４日毎に、培地を試料から取り出し、標準的ヒドロキシプロリンアッセイ（Reddy, 1996）によりヒドロキシプロリン含有量を測定した。
【０１１７】
ヒドロキシプロリン含有量
培地上清中の分解コラーゲンを測定するために、試料を凍結乾燥し、試料を２MのＮａＯＨにより１２０℃で２０分間加水分解した。冷却した後、クロラミンＴ（Sigma）を添加し、室温で２５分間反応させることにより、遊離ヒドロキシプロリンを酸化した。エールリッヒアルデヒド試薬（Sigma）を加え、６５℃で２０分間反応させ、続いてＭ−５分光高度計（Molecular Devices）により５５０nmで吸光度を読み取った。培地中のヒドロキシプロリン含有量は、分解コラーゲン及び組織再構築可能性の間接的な測度である。培養を３０日間までインキュベートし、各処理剤につき３つの試料を測定した。細胞を添加しないでインキュベートしたゲルを、対照として使用した。遊離ペプチドＳＩＬＹ及びＤｃ１３は、図５３に示されているように、細胞培地中のヒドロキシプロリン含有量で測定すると、コラーゲンのみと比較してより大きなコラーゲン分解をもたらした。
【０１１８】
細胞生存率
細胞生存率は、生／死バイオレット生存／活力キット（Molecular Probes）を使用して決定した。本キットは、カルセイン−バイオレット染料（生細胞）及びアクア蛍光反応性染料（死細胞）を含む。試料を１×ＰＢＳで洗浄し、３００μLの染料溶液と共に室温で１時間インキュベートした。未結合の染料を除去するために、試料を１×ＰＢＳですすいだ。２０×対物レンズのOlympus FV1000共焦点顕微鏡によりフィルター４００／４５２及び３６７／５２６で二次元切片を画像化した後、生細胞及び死細胞をカウントした。全ての試料について、ゲルを代表的な領域において走査し、３つの画像のセットを、ゲル中において等間隔で撮った。
【０１１９】
〔実施例２５〕
ゲル中での細胞増殖
ゲル試料を実施例１６のとおりに調製した（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）。細胞を１．５×１０４細胞／cm２で接種し、増殖培地において４時間インキュベートして細胞をゲルに接着させた。次に増殖培地を吸引除去し、細胞を２４時間処理した。処理剤濃度は、ゲル中でのコラーゲン：処理剤の１０：１モル比に等しかった。細胞を増殖培地において４時間インキュベートして、ゲルに接着させた。増殖培地を吸引により取り除き、新鮮な成長培地に代えた。試料を２４時間インキュベートした。各試料中の細胞の数を、CyQuant細胞増殖アッセイ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して測定した。図２５に示されている結果は、合成ペプチドグリカン及びペプチドが細胞増殖に有害な影響を与えないことを示す。
【０１２０】
〔実施例２６〕
ＤＳ−Ｄｃ１３の調製
Ｄｃ１３ペプチド配列は、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣであり、その蛍光標識形態は、ＺＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣであり、ここでＺはダンシルグリシンを意味する。ヘテロ二官能架橋剤のＰＤＰＨを使用してデルマタン硫酸に結合することは、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹについて記載されたとおりに実施される。図２７に示されているように、結合体（ＤＳ−Ｄｃ１３）におけるＤｃ１３とデルマタン硫酸のモル比は約１であった。
【０１２１】
〔実施例２７〕
ＤＳ−ＺＳＩＬＹの蛍光結合アッセイ
ＤＳ−ＺＳＩＬＹについて記載された蛍光結合アッセイを、ペプチド配列ＺＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ（ＺＤｃ１３）を用いて実施した。結果を図２８に表し、これはＤＳ−ＺＤｃ１３が用量依存的にコラーゲン表面に特異的に結合することを示しているが、飽和は、試験された最高率では達成されなかった。
【０１２２】
〔実施例２８〕
ＤＳ−Ｄｃ１３の原線維形成アッセイ
実施例１９でＤＳ−ＳＩＬＹについて記載された原線維形成アッセイを、結合体ＤＳ−Ｄｃ１３を用いて実施した。図２９に示されている結果は、ＤＳ−Ｄｃ１３が原線維形成を遅延し、全体的な吸光度を用量依存的に減少することを示す。対照的に、遊離Ｄｃ１３ペプチドは、高い１：１コラーゲン：添加剤モル比でコラーゲンのみの場合と比較したとき、原線維形成にほとんど影響を与えない。
【０１２３】
〔実施例２９〕
原線維直径を測定するためのクライオＳＥＭ測定の使用
実施例２１の変更した方法を使用して、原線維直径をクライオＳＥＭにより測定した。２０，０００×で撮ったクライオＳＥＭ画像における原線維直径は、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して測定した。少なくとも４５本の原線維をそれぞれの処理剤について測定した。結果を平均±標準誤差で表す。統計分析を、α＝０．０５でDesignExpertソフトウエア（StatEase）を使用して実施した。結果を図３０に示す。デコリン及び合成ペプチドグリカンは、コラーゲン又はコラーゲン＋デルマタン硫酸よりも原線維直径を有意に減少する。コラーゲンのみと比較すると、遊離ペプチドＤｃ１３は、原線維直径に影響を与えないが、遊離ＳＩＬＹは、原線維直径の減少をもたらす。
【０１２４】
〔実施例３０〕
細胞培養及びゲル圧縮
ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡ ＳＭＣ）（Cascade Biologies）を増殖培地（平滑筋増殖因子を添加した培地２３１）で培養した。第３継代の細胞を全ての実験に使用した。分化培地（１％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地２３１）を、特に示されない限り、全ての実験に使用した。この培地は、ヘパリンを含有しない点において製造元のプロトコールと異なっている。
【０１２５】
コラーゲンゲルを、培地への細胞の添加に適応させるために１×ＰＢＳ例の添加を省略したこと以外は上記のとおりに、それぞれの添加剤を用いて調製した。氷上で３０分間インキュベートした後、分化培地中のＨＣＡ ＳＭＣを、最終濃度１×１０６細胞／mLとなるようゲル溶液に加えた。ゲルの形成を、５００μL／ウエルの分化培地を加える６時間前に、４８ウエルの組織培養処理無しプレート（Costar）を用いて四重に行った。２４時間後に、ゲルをウエルの端から切り離した。培地を２〜３日毎に交換し、比較のための画像を、Gel Doc System（Bio-Rad）を使用して同じ時点で撮った。円形ゲルの断面積（圧縮の度合いに対応する）は、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して決定した。細胞を含有しないゲルを陰性対照として使用し、添加剤無しのコラーゲンゲル中の細胞を陽性対照として使用した。結果を図３１に示す。１０日目までには、全てのゲルが元のゲル面積のおよそ１０％圧縮され、添加剤の間の差は小さかった。ＤＳ−Ｄｃ１３で処理したゲルの圧縮は、デコリン又はコラーゲンで処理したゲルの場合より僅かであるが有意に少なかったが、ＤＳとＤＳ−ＳＩＬＹ処理済ゲルで見られるものとは統計的に同等であった。
【０１２６】
〔実施例３１〕
エラスチンの測定
ＨＣＡ ＳＭＣを接種したコラーゲンゲルを、実施例３０に記載されたとおりに調製した。分化培地を３日毎に交換し、ゲルを１０日間培養した。細胞を含有しないコラーゲンゲルを対照として使用した。ゲルを１×ＰＢＳで一晩すすいで、血漿タンパク質を除去し、製造元のプロトコール（Biocolor, County Atrim, U.K.）に従い、ファスチンエラスチンアッセイを使用して、ゲルをエラスチン含有量について試験した。簡潔には、ゲルを、１００℃で１時間インキュベートすることにより、０．２５Mのシュウ酸において可溶化した。エラスチンを沈殿させ、次に試料を１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した。可溶化したコラーゲンの上清を除去し、エラスチンペレットをファスチン染料試薬により室温で９０分間染色した。試料を１１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清中の未結合の染料を除去した。ファスチン染料解離試薬によりエラスチンペレットから染料を放出させ、１００μLの試料を９６ウエルプレート（Costar）に移した。吸光度を５１３nmで測定し、エラスチン含有量を、α−エラスチン標準曲線から計算した。これらのアッセイの結果を図３２に示す。ＤＳ−ＳＩＬＹによる処理は、全ての試料においてエラスチン生成を有意に増加させた。ＤＳ及びＤＳ−Ｄｃ１３による処理は、未処理コラーゲンよりもエラスチン生成を有意に低減させた。細胞のない対照試料のコラーゲンゲルは、エラスチン生成を示さなかった。
【０１２７】
〔実施例３２〕
血小板相互作用に対するヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹの効果
１０mM ＨＣｌ中２mg/mLのコラーゲンでスライドを３７℃で１時間インキュベートすることにより、カバーガラススライド（１８mm）上にコラーゲンを固定した。次にスライドを、１×ＰＢＳで洗浄し、更なる試験まで、１×ＰＢＳ中に４℃で２４時間保存した。未処理カバーガラススライドを陰性対照として使用した。スライドは、コラーゲン面を上に向けて、４８ウエル無組織培養処理プレート（Costar）の中へ設置した。ヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹを１×ＰＢＳに溶解して１００μMの濃度にし、１００μM／ウエルにて３７℃で３０分間インキュベートした。未結合のヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹを吸引し、表面を１mLの１×ＰＢＳで洗浄した。添加剤を含有しない１×ＰＢＳでインキュベートしたコラーゲン固定化スライドを、陽性対照として使用した。
【０１２８】
ヒトの全血を８００×ｇで１５分間遠心分離し、１００μLの多血小板血漿をバフィコート層から取り出し、各ウエルに加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、多血小板血漿をウエルから除去し、ウエルを１×ＰＢＳで穏やかに洗浄して、未結合細胞を除去した。スライドを５％グルタルアルデヒドにより室温で１時間固定し、すすぎ、画像化の前に凍結乾燥した。スライドを３分間金スパッター被覆し、JEOL 840 SEMにより２００×で画像化した。結果を図３３に示す。この画像は、ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体による処理が、血小板細胞のコラーゲンへの結合に影響を与えることを示す。
【０１２９】
〔実施例３３〕
原線維密度のクライオＳＥＭでの測定
コラーゲンを、実施例１６に記載されたように、各添加剤の１０：１モル比の存在下、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、前記のように処理及び画像化した。原線維密度を計算するため、１０，０００×の画像を分析した。画像を８ビットの白黒に変換し、各画像の閾値を、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して決定した。 閾値は、全ての可視原線維が白色となり、全ての空間が黒色となる値として定義した。白色と黒色の領域の比は、MatLabソフトウエアを使用して計算した。全ての測定値を３回ずつ取り、処理剤について関知しない観察者により閾値を決定した。ゲルの画像を図３７に示し、測定された密度を図３４に示す。
【０１３０】
〔実施例３４〕
Ｄｃ１３及びＤＳ−Ｄｃ１３を含有するゲルの粘弾性の特徴決定
コラーゲンを実施例１６のとおりに調製した。粘弾性特徴決定を、コラーゲンと添加剤（処理剤）の異なる比率で形成されたゲルにおいて、実施例１７に記載されたとおりに実施した。デルマタン硫酸又はデルマタン−Ｄｃ１３結合体による処理は、図３５に示されているように、未処理コラーゲンよりも、得られたコラーゲンゲルの剛性を増加させる。
【０１３１】
〔実施例３５〕
細胞増殖及び細胞毒性アッセイ
実施例３０で調製されたＨＣＡ ＳＭＣを、９６ウエル組織培養用黒色／透明底プレート（Costar）上へ増殖培地にて４．８×１０４細胞／mLで接種し、４時間で接着させた。増殖培地を吸引し、コラーゲンゲル内での濃度と同等の濃度（１．４×１０６M）で各添加剤を含有する６００μLの分化培地を、各ウエルに加えた。細胞を４８時間インキュベートし、次に、製造元のプロトコールに従って、生死及びCyQuant（Invitrogen）アッセイを使用して、細胞毒性及び増殖についてそれぞれ試験した。添加剤を含有しない分化培地中の細胞を対照として使用した。結果を図３６に示し、これは、いずれの処理剤も有意な細胞毒性効果を示さなかったことを示している。
【０１３２】
〔実施例３６〕
Ｉ型コラーゲンに対する血小板結合及び血小板活性化の阻害
マイクロプレートの調製
Ｉ型原線維コラーゲン（Chronolog, Havertown, PA）を等張グルコースに希釈して、２０〜１００μg/mLの濃度にした。５０μLのコラーゲン溶液を、高結合型９６ウエルプレートの各ウエルに加えた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に１×ＰＢＳで３回すすいだ。
【０１３３】
ペプチドグリカンを１×ＰＢＳにより２５μM〜５０μMの濃度に希釈し、５０μLの溶液をコラーゲン被覆ウエルに加えた。対照のＧＡＧ、ペプチド又はＰＢＳも、対照としてコラーゲン被覆ウエルに加えた。各処理剤を、２００rpmで３０分間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。次にウエルを、１×ＰＢＳにより３回すすいだ（２００rpmの振とうによる２０分間のすすぎで未結合の処理剤分子を除去することを含む）。
【０１３４】
血小板の調製及び活性化
認証されたPurdue IRBプロトコールに従い、インフォームドコンセントを得た健康な志願者から、ヒト全血を静脈穿刺により収集した。最初の５mLの血液は、コラーゲン及び他のタンパク質が混入している可能性があるので廃棄し、次におよそ１５mLをクエン酸塩加ガラス製バキュテーナー（BD Bioscience）に収集した。血液をガラス管中で２００×ｇにより２０℃で２０分間遠心分離した。遠心分離された血液の最上層、すなわち多血小板血漿（ＰＲＰ）を、血小板試験に使用した。ＰＲＰ（５０μL／ウエル）をマイクロプレートに加え、振とうすることなく、室温で１時間インキュベートした。
【０１３５】
１時間のインキュベーションの後、ＰＲＰを各ウエルから取り出し、５μLのＥＴＰ（１０７mMのＥＤＴＡ、１２mMのテオフィリン及び２．８μMのプロスタグランジンＥ１）を含有するマイクロ遠心分離管に加えて、更なる血小板活性化を阻害した。これらの管を１９００×ｇにより４℃で３０分間回転して、血小板をペレット化した。上清（血小板血漿）を、血小板活性化マーカーのＰＦ−４及びＮａｐ−２の存在を試験するＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０１３６】
血小板接着
ＰＲＰを、コラーゲン／処理剤で被覆したプレートのウエルから除去した後、ウエルを、２００rpmで振とうしながら、０．９％ＮａＣｌで５分間ずつ３回すすいだ。血小板接着を、比色的に定量化するか又は蛍光的に可視化した。
【０１３７】
比色アッセイ
０．１％のトリトンＸ−１００及び１mg/mLのｐ−ニトロフェニルリン酸を含有する１４０μLのクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（０．１M、ｐＨ５．４）を、各ウエルに加えた。バックグラウンド吸光度を４０５nmで測定した。次にプレートを、２００rmで振とうしながら、室温で４０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００は、細胞に孔を開けるので、ｐ−ニトロフェニルリン酸が血小板の酸性ホスファターゼと相互作用して、ｐ−ニトロフェノールを生成することを可能にする。４０分間のインキュベーションの後、１００μLの２M ＮａＯＨを各ウエルに加えた。ｐＨの変化は、酸性ホスファターゼを不活性化することにより反応を停止させ、また、ｐ−ニトロフェノールを光学的に活性な化合物に変換する。次に吸光度を４０５nmで読み取り、接着した血小板の数と相関させた。結果を図４１に示す。
【０１３８】
蛍光アッセイ
接着血小板を、４％パラホルムアルデヒドと共に室温で１０分間インキュベートすることにより固定した。血小板に０．１％トリトンＸ−１００を５分間浸透させた。血小板アクチンを、１％ＢＳＡを含有するファロイジン−AlexaFluor 488（Invitrogen）と共に３０分間インキュベートすることにより標識した。ウエルを、１×ＰＢＳで３回すすぎ、接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【０１３９】
結果については図４２〜５２を参照すること。未処理コラーゲン表面上の血小板の凝集は、集塊した血小板によりもたらされるぼやけた像により示されている。理論に束縛されることなく、ｚ方向（プレート表面に対して垂直）での血小板の集塊は、一焦点面において像をとらえることを妨げると考えられる。処理済みの表面では、低減された血小板凝集は、集塊の減少（ｚ方向でのより少ない血小板）をもたらし、焦点の合った像をプレート表面においてとらえることができる。これらの画像は、合成ペプチドグリカンがコラーゲンへの血小板細胞の接着を低減することを示す。
【０１４０】
血小板活性化マーカーの検出
血小板のペレット化により得られた上清（血小板血漿）を使用して、放出された活性化因子を決定した。血小板因子４（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）は、血小板活性化により放出される血小板のアルファ顆粒内に含有されている２つのタンパク質である。それぞれのタンパク質を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを利用した。両方のサンドイッチＥＬＩＳＡの構成要素を（R&D Systems）から購入し、提供されたプロトコールに従った。値が直線範囲内になるように、血小板血漿の試料は、１×ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：１０，０００〜１：４０，０００に希釈した。図３９及び４０に示されている結果は、合成ペプチドグリカンによる処理が、コラーゲンＩによる血小板の活性化を減少させることを示す。
【０１４１】
〔実施例３７〕
ＩＩＩ型及びＩ型コラーゲンに対する血小板結合及び血小板活性化の阻害
実施例３６の方法に以下の変更を加えたものを使用した。
【０１４２】
マイクロプレートの調製
Ｉ型コラーゲン（ラット尾コラーゲン、BD Biosciences）及びＩＩＩ型コラーゲン（Millipore）を、氷上でＮａＯＨ、１×ＰＢＳ及び１０×ＰＢＳと混合して、生理学的条件にした。総コラーゲン濃度は、７０％のＩ型コラーゲンと３０％のＩＩＩ型コラーゲンの１mg/mLであった。３０μLのコラーゲン溶液を、９６ウエルプレートの各ウエルにピペットで加えた。プレートを加湿インキュベーターにより３７℃で１時間インキュベートして、原線維コラーゲンから構成されるゲルをウエル中で形成させた。ウエルを１×ＰＢＳで３回すすいだ。
【０１４３】
ペプチドグリカンを１×ＰＢＳにより２５μMの濃度に希釈し、５０μLの溶液をコラーゲン被覆ウエルに加えた。対照のＧＡＧ、ペプチド又はＰＢＳも、対照としてコラーゲン被覆ウエルに加えた。ペプチドグリカン又はペプチドの組み合わせは、１×ＰＢＳ中の２５μMの各分子から構成された。処理剤を、２００rpmで３０分間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。次にウエルを、１×ＰＢＳにより３回すすいだ（２００rpmの振とうによる１０分間のすすぎで未結合の処理剤分子を除去することを含む）。
【０１４４】
図５４に示されている血小板活性化阻害測定の結果は、合成ペプチドグリカンが、Ｉ型とＩＩＩ型のコラーゲン混合物による血小板細胞の活性化を阻害することを実証する。
【０１４５】
図５５に示されている結果は、ペプチドグリカンが、Ｉ型とＩＩＩ型のコラーゲン混合物への血小板細胞の結合を阻害することを実証する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、並びにその形成及び使用方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、多くの生物学的シグナルを表し、多くの異なる組織の機械的一体性を維持する、体内で最も豊富なタンパク質である。コラーゲンの分子組織がその機能を決定し、そのことが、コラーゲン原線維形成を多くの研究分野における興味深い話題にしている。コラーゲンは、三次元基質として作用することができるゲルを形成するインビトロ自己会合の能力を有し、細胞増殖の機械的及び生物学的シグナルを提供する。追加の細胞外マトリックス成分を用いる及び用いないコラーゲン原線維形成に対する研究は、コラーゲンと他の細胞外マトリックス分子との相互作用について多くの問題を提起した。現在確認されているだけで２０種類を超えるコラーゲンが存在し、Ｉ型が最も一般的である。腱、靱帯、皮膚、及び骨を含む多くの組織は、主にＩ型コラーゲンから構成されている。これらの構造は、それぞれ他の種類のコラーゲンのプロテオグリカン及びグリコサミノグリカン、並びに骨の場合は無機質も含有するが、主要な成分はＩ型コラーゲンである。これらの構造がそれぞれ示す機械的一体性における顕著な差は、主にコラーゲンの入り組んだ組織及び他の非コラーゲンＩ型成分との相互作用に起因する。
【０００３】
デコリンは、コラーゲン原線維形成に影響を及ぼすことが知られているプロテオグリカンであり、したがって、コラーゲンゲルにおいて機械的及び生物学的情報を修飾することができる。コラーゲン組織における構造変化によりもたらされるシグナル、並びにプロテオグリカンの一部であるグリコサミノグリカン鎖に含有されている特有のシグナルは、細胞挙動を変え、所望の細胞反応を提供するようにコラーゲンマトリックスを設計する機構をもたらす。そこで、発明者たちは、コラーゲン組織に分子レベルで影響を及ぼすコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを開発した。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、例えば、グリコサミノグリカン又は多糖のようなグリカンに結合しているコラーゲン結合性ペプチドに基づいて設計されており、これらの成分によって特定の用途に適合させることができる。本明細書に記載されているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、コラーゲンマトリックスの形態学的、機械的、及び生物学的特性に影響を及ぼし、したがって細胞挙動を変えるので、そのことがこれらの分子を組織工学用途にとって有用なものとしている。
【発明の概要】
【０００４】
一つの実施態様において、コラーゲンマトリックスとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンとを含む改変コラーゲンマトリックスが提供される。この実施態様において、１）コラーゲンは、架橋されていてもよいし、非架橋であってもよい、２）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、タンパク質の若しくはコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とアミノ酸相同性を有してもよいし、又は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンであってもよい、３）改変コラーゲンマトリックスは、外来性の細胞集団を更に含むことができる、４）外来性細胞集団は、非角化若しくは角化上皮細胞から選択されてもよいし、又は内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団から選択されてもよい、５）改変コラーゲンマトリックスは、少なくとも１つの多糖を更に含むことができる、６）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：ＰｎＧｘの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜１０であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、そしてＧはグリカン（例えば、グリコサミノグリカン又は多糖）である、７）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである、８）コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であることができ、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである、９）合成ペプチドは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有することができる、１０）合成ペプチドは、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有することができる、１１）ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、１２）グリカンは、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されることができる、１３）グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択されることができる、１４）コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されることができる、１５）グリカンは、グリコサミノグリカン又は多糖であることができる、或いは、１６）本発明は、この段落に記載された特徴の任意の組み合わせを含むことができる。
【０００５】
別の例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの調製方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。この実施態様は、前段落に記載された特徴のいずれかを含むことができる。また、この実施態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの量は、約０．４mg/mL〜約６mg/mLであることができ、コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比は、約１：１〜約４０：１であることができる。
【０００６】
更に別の実施態様において、式：ＰｎＧｘの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜１０であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、そしてＧはグリカンである。
【０００７】
更なる実施態様において、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである。
【０００８】
更に別の例示的な実施態様において、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物が提供され、ここで、ｎは１〜５であり、ｘは１〜１０であり、Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＧはグリカンである。これらの化合物実施態様のいずれかにおいて、リンカーは、式：−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮ＝を含むことができ、グリカンは、グリコサミノグリカン又は多糖であることができ、そして上記に記載された任意の適用可能な特徴も含まれうる。
【０００９】
別の態様において、改変コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変える方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、変更された改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。上記に記載された任意の適用可能な特徴も含まれうる。
【００１０】
別の実施態様において、キットが提供される。本キットは、上記に記載された改変コラーゲンマトリックスのいずれかを含むことができる。この実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを滅菌することができ、キットは更に細胞を含むことができ、ここで細胞は、中皮細胞、滑膜細胞、前駆細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞から選択されうる。改変コラーゲンマトリックスは、上記に記載された化合物のいずれかを含むことができる。
【００１１】
一つの実施態様において、血小板の活性を阻害する方法が記載されるが、本方法は、コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、血小板の活性が阻害される。別の実施態様において、コラーゲンへの血小板の接着を阻害する方法が記載されるが、本方法は、コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、コラーゲンへの血小板の接着が阻害される。別の実施態様において、グリカンがヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される上記のいずれかの方法が提供される。更に別の実施態様において、上記の方法のいずれかに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるペプチドを含む。
【００１２】
更に別の実施態様において、グラフト作成物が提供される。グラフト作成物は、上記に記載された改変コラーゲンマトリックスのいずれかを含む。
【００１３】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／０３９，９３３号（２００８年３月２７日出願）及び米国仮出願第６１／０８１，９８４号（２００８年７月１８日出願）の優先権を請求し、この開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コラーゲンマトリックスの機械的及び整列特性を決定するのに重要である、隣接トロポコラーゲン鎖に近接するプロテオグリカンの間の相互作用の概略図を示す。
【図２】エタノールで脱水した後、実施例１６（１０：１のコラーゲン：処理剤）のように調製したゲル試料の、窒化ケイ素接触モードチップのｋ＝０．０５N/mチップよる走査速度２Hz及び偏位設定ポイント：０〜１ボルトでの接触モードによって作製された、ＡＦＭ画像である。試料は、コラーゲンのみ（コラーゲン）、並びにコラーゲンとデルマタン硫酸（ＤＳ）、コラーゲンとデコリン（デコリン）、デルマタン硫酸−ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ結合体（ＤＳ−ＳＩＬＹ）、及びデルマタン硫酸−ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ結合体（ＤＳ−ＳＹＩＲ）である。
【図３】ＣＭ−３プレートに結合したコラーゲンに結合しているペプチドＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ（ＳＩＬＹ）の、会合モード及び解離モードでの表面プラスモン共鳴走査である。ＳＩＬＹを、１００μM〜１．５μMの異なる濃度で１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に２倍の希釈で溶解した。
【図４】９６ウエル高結合型プレート（透明底で黒色（Costar））において測定された、ダンシル修飾ペプチドＳＩＬＹの、コラーゲンへの結合である。ＰＢＳ 緩衝液のみ；ＢＳＡ ＢＳＡ処理ウエル；コラーゲン コラーゲン処理ウエル。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【図５】図４に記載された蛍光データから誘導されたコラーゲン−ダンシル修飾ＳＩＬＹ結合曲線である。
【図６】試薬であるＰＤＰＨと、最終工程において２−ピリジチオールの放出を示す、システイン含有ペプチドと酸化グリコシルアミノグリコシドの２工程結合の化学についての概略的記載である。
【図７】ＰＤＰＨに結合している酸化デルマタン硫酸の、ＤＴＴ処理前、及びＤＴＴによる処理剤（結合体から２−ピリジチオールを放出する）処理後における、３４３nmでの吸光度の測定である。測定値は、ＰＤＰＨと酸化デルマタン硫酸の比率の決定を可能にする。測定されたΔＡ＝０．３５は、１．１のＰＨＰＨ分子／ＤＳに相当する。
【図８】９６ウエル高結合型プレート（透明底で黒色（Costar））において測定された、本明細書に記載されているデルマタン硫酸に結合したダンシル修飾ペプチドＳＩＬＹの、コラーゲンへの結合である。ＰＢＳ 緩衝液のみ；ＢＳＡ ＢＳＡ処理ウエル；コラーゲン コラーゲン処理ウエル。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【図９】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、１０：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ（ＳＹＩＲ）ペプチド。
【図１０】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１１】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（４mg/mLのコラーゲン、３０：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；Ｃｏｌ＋ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１２】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（１．５mg/mLのコラーゲンＩＩＩ、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が５００μmになるまで低下させた。◆−処理剤なし、すなわちコラーゲンＩＩＩのみ；■−コラーゲン＋デルマタン硫酸（１：１）；＋−コラーゲン＋デルマタン硫酸（５：１）；×−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（ＤＳ−ＫＥＬＮ）結合体（１：１）；▲−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体（５：１）；●−コラーゲン＋ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（ＫＥＬＮ）ペプチド。
【図１３】２０mmのステンレススチール平行平板配置のAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）によるゲル試料（１．５mg/mLのコラーゲンＩＩＩ、５：１のコラーゲン：処理剤）のせん断弾性係数の測定であり、２０mmのステンレススチール平行平板配置は、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が５００μmになるまで低下させた。◆−処理剤なし、すなわちコラーゲンＩＩＩのみ；■−コラーゲン＋デルマタン硫酸（１：１）；＋−コラーゲン＋デルマタン硫酸（５：１）；×−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ（ＤＳ−ＧＳＩＴ）結合体（１：１）；▲−コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体（５：１）；●−コラーゲン＋ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ（ＧＳＩＴ）ペプチド。
【図１４】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１０：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１５】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１０：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体。
【図１６】混濁度測定である。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、コラーゲン４mg/mL及びコラーゲン対処理剤１：１）に調製し、５０μL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸１０：１；ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；ＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図１７】図１４において表されたデータから測定した原線維形成の半減期である。Ｃｏｌ 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；デコリン コラーゲン＋デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１８】６０×で１．４ＮＡの水浸レンズを使用するOlympus FV1000共焦点顕微鏡により記録された、実施例１６に従って調製（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）したゲルの、共焦点反射顕微鏡画像である。試料を、４８８nmのレーザー光線で照らし、反射光を、青色反射フィルターを使用する光電子増倍管で検出した。それぞれのゲルをゲルの底から１００μMで画像化し、代表的な試料採取を確実にするため３つの異なる場所を画像化した。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図１９】ゲル構造の５０００倍のクライオ走査電子顕微鏡画像である。クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６のとおりに（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。各試料を昇華条件下で２０分間蒸発させた。試料を白金スパッター被覆により１２０分間被覆した。試料を−１３０℃でクライオ載物台に移し、同様の配向の各領域を、処理剤同士を比較するために画像化した。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２０】ゲル構造の５０００倍のクライオ走査電子顕微鏡画像である。クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例２２に記載されているとおりに（１mg/mLのコラーゲン（ＩＩＩ型）；１：１のコラーゲン：処理剤）、ＳＥＭ載物台の上に直接形成した。同様の配向の各領域を、処理剤同士を比較するために画像化した。パネルａ、コラーゲン、処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；パネルｂ、コラーゲン＋デルマタン硫酸；パネルｃ、コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体；パネルｄ、コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体。
【図２１】図２０において示されたクライオＳＥＭ画像から測定された平均空間率である。ａ）コラーゲン、処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ｂ）コラーゲン＋デルマタン硫酸；ｃ）コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体；ｄ）コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体。全ての差はｐ＝０．０５で有意である。
【図２２】図１９において示されたクライオＳＥＭ画像から測定された平均原線維直径である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２３】図１９において示されたクライオＳＥＭ画像から測定されたコラーゲンシート間の平均間隔である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；Ｃｏｌ＋ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；Ｃｏｌ＋デコリン コラーゲン＋デコリン；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；Ｃｏｌ＋ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体。
【図２４】ＰＤＰＨに結合した酸化ヘパリンの処理前、及びＳＩＬＹによる処理（結合体から２−ピリジルチオールを放出し、酸化へパリンに結合したＳＩＬＹペプチドの比率の決定を可能にする）の後の、３４３nmでの吸光度の測定である。測定されたΔＡは、５．４４のＳＩＬＹ分子／酸化ヘパリンに相当する。
【図２５】コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンにより調製されたコラーゲンゲルにおける、ヒト冠動脈平滑筋細胞増殖の測定である。コラーゲン 処理剤なし、すなわちコラーゲンのみ；ＤＳ コラーゲン＋デルマタン硫酸；ＤＳ−ＳＩＬＹ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−ＳＹＩＲ コラーゲン＋デルマタン硫酸−ＳＹＩＲ結合体；ＳＩＬＹ コラーゲン＋ＳＩＬＹペプチド；及びＳＹＩＲ コラーゲン＋ＳＹＩＲペプチド。
【図２６】ＤＳ−ＳＩＬＹ結合の特徴決定である。２時間後、最終ΔＡ３４３nmは、各ＤＳ分子１個に添加されたＳＩＬＹ分子の１．０６個に相当した。注：ｔ＝０は、ＤＳ−ＰＤＰＨへのＳＩＬＹの添加と３４３nmでの溶液の測定との間の僅かな遅れのために、近似的なゼロ時点である。
【図２７】Ｄｃ１３のＤＳへの結合である。３４３nmでの吸光度の増加により測定されたピリジン−２−チオンの生成は、ＤＳポリマー鎖あたり０．９９個のＤｃ１３ペプチドを示す。
【図２８】コラーゲンへのＤＳ−ＺＤｃ１３のマイクロプレート蛍光結合である。ＤＳ−ＺＤｃ１３は、用量依存的にコラーゲン表面に特異的に結合した。
【図２９】混濁度測定によるコラーゲン原線維形成である。ＤＳ−Ｄｃ１３は、原線維形成を遅延し、全体的な吸光度を用量依存的に減少する。対照的に、遊離Ｄｃ１３ペプチドは、コラーゲン：添加剤が１：１の高いモル比でのコラーゲンのみと比較したとき、原線維形成にほとんど影響を与えないように見受けられる。
【図３０】クライオＳＥＭによる平均原線維直径である。Ａ．デコリン及び合成ペプチドグリカンは、コラーゲン又はコラーゲン＋ＤＳよりも原線維直径を有意に減少する。Ｂ．コラーゲンのみと比較すると、遊離ペプチドＤｃ１３は、原線維直径に影響を与えないが、ＳＩＬＹは、原線維直径の減少をもたらす。
【図３１】ゲルの圧縮である。Ａ．及びＢ．それぞれ３及び５日目：デコリン及びペプチドグリカンはコラーゲン及びＤＳと比べると有意であり、＊は、ＤＳ−Ｄｃ１３を示し、ＤＳは、３日目には有意ではない。棒線は有意ではないことを示す。Ｃ．７日目：＋デコリンは、全ての試料に対して有意であり、＃ＤＳは、コラーゲンと比較すると有意である。Ｄ．１０日目：＋＋コラーゲン及びＤＳは有意であり、‡ＤＳ−Ｄｃ１３は、デコリン及びコラーゲンと比較すると有意である。
【図３２】ファスチンアッセイによるエラスチン評価。Ａ．ＤＳ−ＳＩＬＹは、全ての試料においてエラスチン生成を有意に増加させた。ＤＳ及びＤＳ−Ｄｃ１３は、コラーゲンよりもエラスチン生成を有意に低減させた。細胞のない対照試料のコラーゲンゲルは、エラスチン生成を示さなかった。Ｂ．遊離ペプチドは、コラーゲンと比較するとエラスチン生成に僅かな減少をもたらしたが、どの点においても有意ではなかった。
【図３３】多血小板血漿のインキュベートされたスライドのＳＥＭ画像である。ヘパリン−ＳＩＬＹ処理における矢印は、この処理に特有の原線維様構造を示す。尺度目盛り＝１００μm。
【図３４】クライオＳＥＭによる原線維密度である。原線維密度は、原線維含有領域と空間の比として定義される。ＤＳ−ＳＩＬＹ及び遊離ＳＩＬＹペプチドは、有意に大きな原線維密度を有した一方、コラーゲンは有意に低い原線維密度を有した。ＤＳ−Ｄｃ１３はコラーゲンと比較すると有意ではなかった。
【図３５】コラーゲンゲルの貯蔵弾性係数（Ｇ′）である。Ａ．５：１、Ｂ．１０：１及びＣ．３０：１のコラーゲン：添加剤のモル比で、それぞれの添加剤により形成されたコラーゲンゲルのレオロジー機械試験。１．０Paの制御圧力による０．１Hz〜１．０Hzの周波数掃引で実施した。Ｇ′の平均±標準誤差を表す。
【図３６】細胞増殖及び細胞毒性アッセイである。Ａ．CyQuant、Ｂ．生存及びＣ．死亡アッセイにおける全ての添加剤において有意な差は見られなかった。
【図３７】原線維密度のクライオＳＥＭ画像である。コラーゲンゲルを、コラーゲン：添加剤のモル比が１０：１の各添加剤の存在下で形成した。Ａ．ＤＳ、デコリン又はペプチドグリカン。Ｂ．遊離ペプチド。画像を１，０００×で撮り、尺度目盛りは５μmである。
【図３８】コラーゲンゲルのＡＦＭ画像である。コラーゲンゲルを、コラーゲン：添加剤のモル比が１０：１の各添加剤の存在下で形成した。Ｄバンド形成は、全ての添加剤において観察される。画像は１μm２である。
【図３９】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。値を、対照処理剤（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）により放出された活性化因子の量と比較した、処理剤により放出された活性化因子の率として報告する。＊は、未処理（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して差が有意であることを示す。Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳｉｌＹ９ デキストラン−（ＳＩＬＹ）９結合体；Ｈｅｐ ヘパリン；Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体；ＨＡ ヒアルロナン；ＨＡ−ＳＩＬＹ ヒアルロナン−ＳＩＬＹ結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。溶解度の限界のために、Ｈｅｐ、Ｈｅｐ−ＳＩＬＹ、ＨＡ、及びＨＡ−ＳＩＬＹは２５μMでインキュベートした。他の全ての処理剤は５０μMであった（処理剤を除去した後、プレートを、ＰＲＰの添加の前にＰＢＳで＜１分間洗浄した）。Ｈｅｐ及びＨＡ（ヒアルロン酸）結合体は、多糖１つあたりおよそ４つのペプチドを含有した。
【図４０】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。値を、対照処理剤（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）により放出された活性化因子の量と比較した、処理剤により放出された活性化因子の率として報告する。Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６ デキストラン−（ＳＩＬＹ）６結合体；Ｈｅｐ ヘパリン；Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ ヘパリン−ＧＳＩＴ結合体、ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド、ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。全ての処理剤で測定した値は、ＰＢＳに対して有意である。Ｄｅｘ、ＳＩＬＹ及びＤｅｘ−ＳＩＬＹ６は、２５μMであり、他の全ての処理剤は５０μMである。＊＊は、Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ処理の値が、Ｈｅｐ処理の値に対して有意であり、同様に、Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６処理の値が、ＰＦ４のＤｅｘ処理の値に対して有意であったことを示す。（処理剤を除去した後、プレートを２０分間すすいだ）。Ｈｅｐ結合体は、多糖１つあたりおよそ４つのペプチドを含有した。
【図４１】比色アッセイによるコラーゲンへの血小板結合の阻害である。９６ウエルプレートの表面に固定されたコラーゲンを、それぞれの処理剤と共にプレインキュベートし、続いて多血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートした。記載されたように調製したマイクロプレートアッセイを、以下の各処理剤と共にプレインキュベートした：コラーゲン ＰＢＳのみ；デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬ６ デキストラン−（ＳＩＬＹ）６；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド。＊コラーゲン（処理剤なし）に対して有意。
【図４２】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４３】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：デキストラン。
【図４４】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：デキストラン−ＳＩＬＹ９結合体。
【図４５】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４６】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヒアルロナン。
【図４７】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヒアルロナン−ＳＩＬＹ結合体。
【図４８】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図４９】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヘパリン。
【図５０】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体。
【図５１】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤なし、すなわちＰＢＳで処理したコラーゲン。
【図５２】接着した血小板の蛍光画像である。接着血小板を、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させた４％パラホルムアルデヒドで固定し、血小板のアクチンをファロイジン−AlexaFluor 488で標識した。接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。処理剤：ＳＩＬＹペプチド。
【図５３】ヒドロキシプロリンにより決定されるコラーゲン分解である。処理剤：Ｃｔｒｌ 添加された細胞なし；Ｃｏｌ 処理剤の添加なしのコラーゲン；ＤＳ デルマタン硫酸；デコリン；ＤＳ−ＳＩＬＹ デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ結合体；ＤＳ−Ｄｃ１３ デルマタン硫酸−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド。
【図５４】血小板活性化の阻害である。活性化因子である血小板第４因子（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）の放出を決定することにより測定される。９６ウエルプレートの表面のＩ及びＩＩＩ型コラーゲンゲルを、各処理剤と共にプレインキュベートし、続いてＰＲＰと共にインキュベートした。血小板活性化は、活性化因子ＰＦ−４及びＮａｐ−２の放出により測定した。処理剤：ＰＢＳ 緩衝液のみ；Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ デキストラン−ＳＩＬＹ結合体；Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ デキストラン−ＧＳＩＴ結合体；Ｄｅｘ−ＫＥＬＮ デキストラン−ＫＥＬＮ結合体；Ｄｅｘ−Ｄｃ１３ デキストラン−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド；ＫＥＬＮ ＫＥＬＮペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ＋Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ；デキストラン−ＳＩＬＹ結合体とデキストラン−ＧＳＩＴ結合体の組み合わせ；ＳＩＬＹ＋ＧＳＩＴ；ＳＩＬＹペプチドとＧＳＩＴペプチドの組み合わせ。＊は、結果が処理剤なし（ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して有意であることを示す。＊＊は、結果がＤｅｘによるコラーゲン表面に対しても有意であることを示す。＊＊＊は、結果が対応するペプチド対照によるコラーゲン表面に対しても有意であることを示す。全てのペプチドグリカンは、処理剤なし（ＰＢＳ）又はデキストラン処理剤と比較して、ＮＡＰ−２放出に有意な低下を引き起こし、同時に、Ｄｅｘ−ＧＳＩＴも、ペプチド対照（ＧＳＩＴ）よりも放出を減少した。Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ及びＤｅｘ−ＫＥＬＮは、処理剤なし（ＰＢＳ）及びデキストラン処理剤に対してＰＦ−４放出を有意に減少し、同時に、Ｄｅｘ−Ｄｃ１３は、処理剤なし（ＰＢＳ）よりもＰＦ−４放出を有意に減少した。
【図５５】比色アッセイによるコラーゲンへの血小板結合（接着）の阻害である。処理剤：ＰＢＳ 緩衝液のみ；Ｄｅｘ デキストラン；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ デキストラン−ＳＩＬＹ結合体；Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ デキストラン−ＧＳＩＴ結合体；Ｄｅｘ−ＫＥＬＮ デキストラン−ＫＥＬＮ結合体；Ｄｅｘ−Ｄｃ１３ デキストラン−Ｄｃ１３結合体；ＳＩＬＹ ＳＩＬＹペプチド；ＧＳＩＴ ＧＳＩＴペプチド；ＫＥＬＮ ＫＥＬＮペプチド；Ｄｃ１３ Ｄｃ１３ペプチド；Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ＋Ｄｅｘ−ＧＳＩＴ；デキストラン−ＳＩＬＹ結合体とデキストラン−ＧＳＩＴ結合体の組み合わせ；ＳＩＬＹ＋ＧＳＩＴ；ＳＩＬＹペプチドとＧＳＩＴペプチドの組み合わせ。＊処理剤なし（ＰＢＳ）のコラーゲン表面に対して有意。＊＊Ｄｅｘによるコラーゲン表面に対しても有意。＊＊＊対応するペプチド対照によるコラーゲン表面に対しても有意。Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ及びＤｅｘ−ＫＥＬＮは、処理剤なし（ＰＢＳ）又はデキストラン処理剤と比較して血小板接着を有意に減少し、同時に、Ｄｅｘ−ＧＳＩＴも、ペプチド対照処理剤（ＧＳＩＴ）よりも血小板接着を減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において使用されるとき、「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」は、グリカンと合成ペプチドとのコラーゲン結合性の結合体を意味する。「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」は、通常はコラーゲン原線維形成に関与しないタンパク質又はプロテオグリカンの一部とのアミノ酸相同性を有することができる。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、本明細書において「異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と呼ぶ。異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、コラーゲン原線維形成に影響を与える場合も、与えない場合もある。他のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、通常はコラーゲン原線維形成に関与するタンパク質又はプロテオグリカンの一部とのアミノ酸相同性を有することができる。これらのコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、本明細書において「原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と呼ぶ。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「改変コラーゲンマトリックス」は、コラーゲンが、所定の条件下で、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンと組み合わされてインビトロで重合される、コラーゲンマトリックスを意味し、ここで条件は、変わりうるものであって、ｐＨ、リン酸濃度、温度、緩衝液組成、イオン強度、並びにコラーゲンの組成及び濃度からなる群より選択されるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「改変グラフト作成物」は、「改変コラーゲンマトリックス」を含むグラフト作成物を意味する。
【００１８】
本発明の一つの態様において、改変コラーゲンマトリックスが提供される。改変コラーゲンマトリックスは、コラーゲン及びコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む。一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックは非架橋であることができる。別の実施態様において、マトリックスは架橋されていることができる。多様な例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドのような架橋剤、並びにゲニピンなどを含む多様な天然の架橋剤を、溶液中のコラーゲンの重合の前に、その間に、又はその後に、添加することができる。
【００１９】
多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを調製するために本明細書において使用されるコラーゲンは、Ｉ〜ＸＸＶＩＩＩ型のコラーゲンを含む任意の種類のコラーゲンであることができ、単独で又は組み合わせを、例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及び／若しくはＩＶを使用することができる。一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックスは、市販のコラーゲン（例えば、Sigma, St. Louis, MO）を使用して形成される。代替的な実施態様において、コラーゲンを、腸、膀胱又は胃の組織のような粘膜下組織物質から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを尾腱から精製することができる。追加的な実施態様において、コラーゲンを皮膚から精製することができる。多様な態様において、コラーゲンは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンに加えて、フィブロネクチン、又は皮膚タンパク質、糖タンパク質、及び多糖類などのような、内在性又は外来的に加えられた非コラーゲン性タンパク質も含有することができる。本明細書に記載されている方法により調製される改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスは、移植又は注射部位で関連する組織の特徴的形質をとることができる、移植部位の内在組織の再増殖（例えば、生物学的再構築）のための作成物として機能することができる。
【００２０】
多様な例示的な態様において、本発明の改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを形成するのに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む。幾つかの実施態様において、これらのペプチドは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列に対する相同性を有する。多様な実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、及びこれらの１４個のアミノ酸配列のいずれかと、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、又はこれらのいずれかであることができる。合成ペプチドは、コラーゲン結合活性を有し、且つ、フォンウィルブランド因子のコラーゲン結合ドメインと、又は、Chiang, et al.. J. Biol. Chem. 277: 34896-34901 (2002), Huizinga, et al., Structure 5: 1147-1156 (1997), Romijn, et al., Ｊ. Biol. Chem. 278: 15035-15039 (2003)及びChiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets 7: 71-75 (2007)（それぞれ参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている血小板コラーゲンレセプターのコラーゲン結合ドメインと、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の相同性があるペプチドから選択される、５〜４０個のアミノ酸の任意のペプチドであることもできる。
【００２１】
合成ペプチドに結合しているグリカン（例えば、グリコサミノグリカン、略語ＧＡＧ又は多糖）は、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されうる。一つの実施態様において、グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される。
【００２２】
一つの例示的な態様において、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、滅菌されていることができる。本明細書で使用されるとき、「滅菌」又は「滅菌する」又は「滅菌される」は、内毒素、核酸汚染物質、及び感染病原体が含まれるが、これらに限定されない不要な汚染物質を除去することによって、マトリックス又はグラフト作成物を殺菌することを意味する。
【００２３】
多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、グルタルアルデヒドタンニング、酸性ｐＨでのホルムアルデヒドタンニング、プロピレンオキシド又はエチレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ放射線、電子ビーム及び／又は過酢酸のような過酸による滅菌を含む、従来の滅菌技術を使用して、殺菌及び／又は滅菌することができる。マトリックス又は作成物の構造及びバイオトロピック（biotropic）特性に有害な影響を与えないような滅菌技術を使用することができる。例示的な滅菌技術は、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを、過酢酸、１〜４Mラドのガンマ照射（又は１〜２．５Mラドのガンマ照射）、エチレンオキシド処理又はガスプラズマ滅菌に暴露することである。一つの実施態様において、改変グラフト作成物を、１つ以上の滅菌方法に付すことができる。例示的な実施態様において、溶液中のコラーゲンを滅菌又は殺菌することもできる。改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物をプラスチックラップ又はホイルラップを含む任意の種類の容器で包むことができ、更に滅菌することができる。
【００２４】
これらの実施態様のいずれかにおいて、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスは、追加の細胞集団を更に含むことができる。追加の細胞集団は、１つ以上の細胞集団を含むことができる。多様な実施態様において、細胞集団は、非角化若しくは角化上皮細胞の集団又は内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団を含む。多様な実施態様において、改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスに、１種類以上の細胞の組み合わせを接種することができる。
【００２５】
多様な態様において、本発明の改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）を含む栄養素、又はラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン若しくはアグレカン、又は上皮増殖因子、血小板誘導増殖因子、形質転換増殖因子ベータ若しくは線維芽細胞増殖因子のような増殖因子、及びデキサメタゾンのようなグルココルチコイド、又はイオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーのような粘弾性変更剤；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー、及びセルロースポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、又は天然と合成の両方の他の高分子作用物質、と組み合わせることができる。他の例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドのような架橋剤、並びにゲニピンなどを含む天然の架橋剤を、細胞の添加の前に、それと同時に、又はその後に、添加することができる。
【００２６】
上記において考察したように、一つの実施態様によると、細胞を、コラーゲン重合の前又はコラーゲン重合の間に、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物に加えることができる。細胞を含む改変コラーゲンマトリックスを、改変グラフト作成物として使用するために、後に宿主に注射又は移植することができる。別の実施態様において、改変コラーゲンマトリックス上の又はその内の細胞を、所定の時間の長さで、インビトロにおいて培養して、宿主への移植又は注射の前に、細胞数を増加させる又は所望の再構築を誘導させることができる。
【００２７】
一つの実施態様によると、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を含むキットが提供される。キットそれ自体は、任意の種類の容器内にあることができ、キットは、キットの構成要素の使用説明書を含有することができる。一つの実施態様において、細胞は、キットの構成要素の１つを構成することができる。多様な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの特性は異なっていてよい。多様な例示的な実施態様において、キットにおける改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンに加えて、非コラーゲンタンパク質及び多糖類を含む多様な他の構成要素も含むことができる。一つの実施態様において、キットは、例えば改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物を含有する、器、バイアル、容器、バッグ又はラップを含む。別の実施態様において、キットは、別々の器（例えば、バイアル、容器、バッグ又はラップ）を含み、それぞれ１つ以上の以下の構成要素を含有する：コラーゲン溶液又は凍結乾燥コラーゲン、及び１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン。別の実施態様において、キットは、別々の器を含み、それぞれ以下の構成要素を含有する：コラーゲン溶液又は凍結乾燥コラーゲン、緩衝液、及び１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン。これらの実施態様のいずれかにおいて、キットは、緩衝液、滅菌若しくは殺菌剤、非コラーゲンタンパク質又は多糖類、及び／或いは、キット試薬の使用方法を記載する又は改変コラーゲンマトリックス若しくは改変グラフト作成物の使用方法を記載する指示資料、を更に含むことができる。キットは、改変コラーゲンマトリックス又は改変グラフト作成物の不在下で薬理学的作用物質として使用される、１種類以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンも含有することができる。この実施態様において、キットは、任意の種類の容器内にあることができ、キットは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの使用説明書を含有することができる。
【００２８】
更に別の実施態様において、キットは、非角化若しくは角化上皮細胞の集団、又は、内皮細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）及び骨形成原細胞からなる群より選択される細胞集団が含まれるが、これらに限定されない細胞の容器（例えば、例としてフラスコ、アンプル、バイアル、チューブ又はボトル）を更に含む。別の実施態様において、細胞はプレート上に存在することができる。一つの実施態様において、細胞の容器を１つ以上含むことができ、キットは、１種類以上の細胞及び細胞培養試薬を含むことができる。
【００２９】
一つの例示的な態様において、改変コラーゲンマトリックスの調製方法が提供される。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。多様な実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、通常はコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性を有する異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン、又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンであることができる。
【００３０】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンである実施態様において、コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変更する方法が提供される。本明細書で使用されるとき、「変更する」とは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの不在下で重合されたコラーゲンマトリックスと比べて、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下でインビトロにおいて重合されたコラーゲンマトリックスの機械的又は構造特性を変えることを意味する。本方法は、コラーゲン溶液を提供する工程、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程、そしてコラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン（例えば、異常型又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン）の存在下で重合して、変更されたコラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。
【００３１】
一つの例示的な実施態様において、提供されるコラーゲン溶液は、約０．４mg/ml〜約６mg/mlの範囲のコラーゲン濃度を有することができる。多様な実施態様において、コラーゲン濃度は、約０．５mg/ml〜約１０mg/ml、約０．１mg/ml〜約６mg/ml、約０．５mg/ml〜約３mg/ml、約１mg/ml〜約３mg/ml、及び約２g/ml〜約４mg/mlの範囲であることができる。
【００３２】
上記において考察されたように、多様な例示的な態様において、本発明の改変グラフト作成物又は改変コラーゲンマトリックスを形成するのに使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、小型でロイシンリッチなプロテオグリカン又は血小板レセプター配列のアミノ酸配列に対する相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸のペプチドを含む。多様な実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、合成ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ、及びこれらの１４個のアミノ酸配列のいずれかと、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる、又はこれらのいずれかであることができる。合成ペプチドは、コラーゲン結合活性を有し、且つ、フォンウィルブランド因子のコラーゲン結合ドメインと、又はChiang, et al.. J. Biol. Chem. 277: 34896-34901 (2002), Huizinga, et al., Structure 5: 1147-1156 (1997), Romijn, et al., Ｊ. Biol. Chem. 278: 15035-15039 (2003)及びChiang, et al., Cardio. & Haemato. Disorders-Drug Targets 7: 71-75 (2007)（それぞれ参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている血小板コラーゲンレセプターのコラーゲン結合ドメインと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の相同性があるペプチドから選択される、５〜４０個のアミノ酸の任意のペプチドであることもできる。
【００３３】
合成ペプチドに結合しているグリカンは、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択されうる。一つの実施態様において、グリカンは、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される。コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、重合する前に、例えば緩衝液の中又は水中又は塩酸若しくは酢酸のような酸の中で凍結乾燥することができる。一つの例示的な態様において、コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比は、約１：１〜約４０：１であることができる。
【００３４】
重合工程を異なる条件下で実施することができ、条件は、ｐＨ、リン酸濃度、温度、緩衝液組成、イオン強度、存在する特定の構成要素、及び、コラーゲン又は存在する他の構成要素の濃度、からなる群より選択される。一つの例示的な態様において、コラーゲン又はコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む他の構成要素を、重合の前に凍結乾燥することができる。コラーゲン又は他の構成要素を、塩酸又は酢酸のような酸の中で凍結乾燥することができる。
【００３５】
多様な例示的な実施態様において、重合反応は、当業者に既知の生物学的に適合性のある任意の緩衝液を使用して緩衝した溶液の中で実施される。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−ｎ，ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、〔ｎ−（２−アセトアミド）〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸〕（ＨＥＰＥＳ）及び１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン（ビストリスプロパン）からなる群より選択されうる。一つの実施態様において、緩衝液は、ＰＢＳ、トリス又はＭＯＰＳであり、一つの実施態様において、緩衝系はＰＢＳである。
【００３６】
多様な例示的な実施態様において、重合工程は、約５．０〜約１１の範囲から選択されるｐＨで実施され、一つの実施態様において、重合は、約６．０〜約９．０の範囲から選択されるｐＨで実施され、一つの実施態様において、重合は、約６．５〜約８．５の範囲から選択されるｐＨで実施され、別の実施態様において、重合工程は、約７．０〜約８．５の範囲から選択されるｐＨで実施され、別の実施態様において、重合工程は、約７．３〜約７．４の範囲から選択されるｐＨで実施される。
【００３７】
他の例示的な態様において、緩衝された溶液のイオン強度も調節される。一つの実施態様によると、緩衝液のイオン強度は、約０．０５〜約１．５Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１０〜約０．９０Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１４〜約０．３０Mの範囲から選択され、別の実施態様において、イオン強度は、約０．１４〜約０．１７Mの範囲から選択される。
【００３８】
更に他の例示的な実施態様において、重合工程は、約０℃〜約６０℃の範囲から選択される温度で実施される。他の実施態様において、重合工程は、２０℃を超える温度で実施され、典型的には、重合は、約２０℃〜約４０℃の範囲から選択される温度で実施され、より典型的には、温度は、約３０〜約４０℃の範囲から選択される。一つの例示的な実施態様において、重合は、約３７で実施される。
【００３９】
更に他の実施態様において、緩衝液のリン酸濃度は異なる。例えば、一つの実施態様において、リン酸濃度は、約．００５M〜約０．５Mの範囲から選択される。別の例示的な実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．２Mの範囲から選択される。別の実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．１Mの範囲から選択される。別の例示的な実施態様において、リン酸濃度は、約０．０１M〜約０．０３Mの範囲から選択される。
【００４０】
本発明の、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む改変コラーゲンマトリックスを、重合の前に、その間に、又はその後で、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）を含む栄養素、又はラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン若しくはアグレカンのような他の化合物、又は上皮増殖因子、血小板誘導増殖因子、形質転換増殖因子ベータ、血管内皮増殖因子若しくは線維芽細胞増殖因子のような増殖因子、及びデキサメタゾンのようなグルココルチコイド、又はイオン性及び非イオン性の水溶性ポリマーのような粘弾性変更剤；アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー及びセルロースポリマー誘導体；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、又は、天然と合成の両方の他の高分子作用物質、と組み合わせることができる。
【００４１】
一つの実施態様によると、細胞を、改変コラーゲンマトリックスの重合の前又は重合の後の最終工程として添加することができる。他の例示的な実施態様において、カルボジイミド、アルデヒド、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、及びマレイミドなどのような架橋剤を、重合の前に、その間に、又はその後に、添加することができる。
【００４２】
一つの実施態様において、改変コラーゲンマトリックスは、市販のコラーゲン（例えば、Sigma, St. Louis, MO）を使用して形成される。代替的な実施態様において、コラーゲンを、腸、膀胱又は胃の組織のような粘膜下組織物質から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを尾腱から精製することができる。更なる実施態様において、コラーゲンを皮膚から精製することができる。
【００４３】
一つの実施態様において、通常はコラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性、又は通常は原線維形成を調節しないタンパク質若しくはペプチドの一部とのアミノ酸相同性を有する、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、所望の構造又は機械的特性を有する改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。別の実施態様において、異常型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又は原線維発生型コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、望ましいが変更されている構造又は機械的特性を有する改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。
【００４４】
所望の構造、微細構造、ナノ構造、又は機械的特性には、例示的に、原線維長、原線維直径、原線維密度、原線維体積率、原線維組織、三次元の形状又は形態、及び、粘弾性、引張、剪断又は圧縮挙動（例えば、破壊応力、破壊歪み、及び係数）、浸透性、分解率、膨張性、水和特性（例えば、速度及び膨張）、及びインビボ組織再構築特性、並びに所望のインビトロとインビボの細胞反応、が含まれうる。本明細書に記載されている改変グラフト作成物及び改変コラーゲンマトリックスは、他の所望の特性のうち、所望の生体適合性及びインビトロとインビボ再構築特性を有することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「係数」は、弾性又は直線係数（従来の機械的試験プロトコールを使用して得られた応力−歪み曲線の直線領域の傾き、すなわち剛性、として定義される）、圧縮弾性率、複素弾性係数、又は剪断貯蔵弾性係数であることができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「原線維体積率」は、三次元のマトリックスの断面において原線維が占有する総面積の面積率として定義され、「空間率」は、三次元のマトリックスの断面において原線維が占有しない総面積の面積率として定義される。
【００４７】
本明細書に記載されている改変コラーゲンマトリックスは、コラーゲン原線維を含み、これは典型的には、原線維にその軸に沿って特徴的な線条外観又は分岐状パターンを与える四分の一ねじれパターンで詰められている。多様な例示的な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスの定性的及び定量的な微細構造特性は、走査電子顕微鏡検査法、透過型電子顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法、二次高周波発生多光子顕微鏡検査法により決定することができる。別の実施態様において、引張、圧縮、及び粘弾性特性は、流動測定又は引張試験により決定することができる。これらの方法は全て当該技術において既知であるか、又は、本出願の実施例の部分、若しくはRoeder et al., J. Biomech. Eng., vol. 124, pp. 214-222 (2002), in Pizzo et al., J. Appl. Physiol., vol. 98, pp. 1-13 (2004), Fulzele et al., Eur. J. Pharm. ScL, vol. 20, pp. 53-61 (2003), Griffey et al., J. Biomed. Mater. Res., vol. 58, pp. 10-15 (2001), Hunt et al., Am. J. Surg., vol. 114, pp. 302-307 (1967)及びSchilling et al., Surgery, vol. 46, pp. 702-710 (1959)（参照として本明細書に組み込まれる）において更に記載されている。
【００４８】
上記に記載された改変コラーゲンマトリックス、改変グラフト作成物、キット又は方法実施例のいずれかにおいて、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、以下の式のいずれかの化合物であることができる：
Ａ）ＰｎＧｘ、ここで式中、ｎは１〜１０であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｂ）（ＰｎＬ）ｘＧ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｃ）Ｐ（ＬＧｎ）ｘ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
【００４９】
代替的な実施態様において、以下の式のいずれかの化合物が提供される：
Ａ）ＰｎＧｘ、ここで式中、ｎは１〜１０であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｂ）（ＰｎＬ）ｘＧ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
或いは
Ｃ）Ｐ（ＬＧｎ）ｘ、ここで式中、ｎは１〜５であり；
ｘは１〜１０であり；
Ｐは、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌはリンカーであり；そして
Ｇはグリカンである。
【００５０】
別の実施態様において、ヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５１】
別の実施態様において、ヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、コラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、又はその両方を阻害することができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５２】
別の実施態様において、本明細書に記載されている合成ペプチドを、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含めることにより修飾することができる。当業者には周知であるように、保存的置換によりペプチドの任意の非重要アミノ酸を変更することは、置換するアミノ酸の側鎖が、置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合及び接触を形成することができるはずであるので、ペプチドの活性を有意に変更することはないはずである。
【００５３】
ペプチドのコラーゲン結合活性に過剰に影響を与えない、及び／或いは、コラーゲンマトリックスの構造若しくは機械的特性の変更、血小板活性化の阻害、又はコラーゲンへの血小板接着（例えば、結合）の阻害におけるペプチドの有効性を低減させないのであれば、非保存的置換も可能である。
【００５４】
当該技術において周知であるように、アミノ酸の「保存的置換」又はペプチドの「保存的置換変種」は、１）ペプチドの二次構造；２）アミノ酸の電荷若しくは疎水性；及び３）側鎖の嵩高、又はこれらの特性のいずれか１つ以上、を維持するアミノ酸置換を意味する。例示的には、周知の用語「親水性残基」は、セリン又はトレオニンに関する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニンなどを意味する。「陽性荷電残基」は、リシン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンに関する。「陰性荷電残基」は、アルパラギン酸又はグルタミン酸を意味する。「嵩高側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンなどを意味する。例示的な保存的アミノ酸置換のリストを表１に提示する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
別の実施態様において、ヘパリンに結合している、コラーゲン結合性ペプチドの一部とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合（例えば、接着）を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。別の実施態様において、デキストランに結合しているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。更に別の実施態様において、ヒアルロナンに結合しているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、血小板活性化を阻害すること、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、若しくは血栓症を抑えること、又は改変コラーゲンマトリックスを形成することができる。これらの実施例のいずれかおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５７】
別の実施態様において、例えばヘパリン、デキストラン又はヒアルロナンのような任意のグリカンに結合している、コラーゲン結合性ペプチド（例えば、コラーゲン結合性タンパク質又はプロテオグリカンのアミノ酸配列の一部）とアミノ酸配列相同性を有する約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドを含む、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを使用して、コラーゲンへの血小板結合を阻害すること、血小板活性化を阻害すること又は血栓症を抑えることができる。これらの実施例のいずれにおいても、上記記載の化合物のいずれかも使用することができる。
【００５８】
一つの実施態様において、合成ペプチドは、当業者に周知の固相ペプチド合成プロトコールに従って合成される。一つの実施態様において、ペプチド前駆体は、周知のＦｍｏｃプロトコールに従って固体支持体上に合成され、トリフルオロ酢酸により支持体から切断され、当業者に既知の方法に従ってクロマトグラフィーにより精製される。
【００５９】
別の実施態様において、合成ペプチドは、当業者に周知のバイオテクノロジーの方法を利用して合成される。一つの実施態様において、所望のペプチドのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列を、当業者に既知の組み換えＤＮＡ技術により、発現プラスミド（例えば、ペプチドのアフィニティー精製のためのアフィニティータグを組み込んだプラスミド）に連結し、プラスミドを発現のために宿主生物に形質移入し、次にペプチドを宿主生物又は増殖培地から当業者に既知の方法（例えば、アフィニティー精製）により単離する。組み換えＤＮＡ技術法は、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されており、当業者に周知である。
【００６０】
一つの実施態様において、合成ペプチドは、ペプチドの遊離アミノ基をグリカンのアルデヒド官能基と、還元剤の存在下で、当業者に既知の方法を利用して反応させることにより、グリカンと結合され、ペプチドグリカン結合体を生じる。一つの実施態様において、グリカンのアルデヒド官能基（例えば、多糖又はグリコサミノグリカン）は、グリカンをメタ過ヨウ素酸ナトリウムと当業者に既知の方法に従って反応させることにより形成される。
【００６１】
別の実施態様において、合成ペプチドは、グリカンのアルデヒド官能基を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させて中間体グリカンを形成し、更にこの中間グリカンを遊離チオール基を含有するペプチドと反応させることにより、グリカンと結合されて、ペプチドグリカン結合体を生じる。更に別の実施態様において、ペプチドの配列を、グリシン−システインセグメントを含むように修飾して、グリカン又はグリカン−リンカー結合体のための結合点を提供することができる。
【００６２】
特定の実施態様が先行の段落において記載されてきたが、本明細書に記載されているコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンは、ペプチドをグリカン（例えば、多糖又はグリコサミノグリカン）と結合するための当該技術で認められたあらゆる方法を使用して作製することができる。これには、直接的な、又は二価リンカーのような結合基を介する間接的な、共有、イオン又は水素結合を含むことができる。結合体は、典型的には、結合体の対応する構成要素上の、酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ又はヒドラゾ基の間のアミド、エステル又はイミノ結合の形成を介して、グリカンにペプチドを共有結合することにより形成される。これらの方法は全て、当該技術において既知であるか、又は、本出願の実施例の部分、若しくはHermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp.169-186 (1996)に更に記載されている。リンカーは、典型的には、約１〜約３０個の炭素原子、より典型的には約２〜約２０個の炭素原子を含む。低分子量リンカー（すなわち、約２０〜約５００のおよその分子量を有するもの）が典型的に用いられる。
【００６３】
加えて、結合体のリンカー部分の修飾が本明細書において考慮される。例えば、天然に生じるアミノ酸、並びに、従来の合成方法により入手可能なものが含まれるがこれらに限定されないアミノ酸が、リンカーに含まれることができ、多数のアミノ酸置換が結合体のリンカー部分において実施されてもよい。別の態様において、ベータ、ガンマ、及びより長い鎖のアミノ酸を、１つ以上のアルファアミノ酸の代わりに使用することができる。別の態様において、リンカーは、それに含まれているアミノ酸の数を変えることにより又はより多くの若しくは少ないベータ、ガンマ若しくはより長い鎖のアミノ酸を含めることにより、短く又は長くなることができる。同様に、本明細書に記載されるリンカーの他の化学フラグメントの長さ及び形状を修飾することができる。
【００６４】
一つの態様において、リンカーは、それぞれ場合により置換されていてもよいアルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、シクロへテロアルキレン、アリーレン、及びヘテロアリーレンからなる群よりそれぞれの場合に独立して選択される、１つ以上の二価フラグメントを含むことができる。本明細書で使用されるとき、ヘテロアルキレンとは、直鎖又は分岐鎖アルキレン基の１個以上の炭素原子が、酸素、窒素、リン、及び硫黄からなる群よりそれぞれの場合に独立して選択される原子に代えられていることによってもたらされる基を表す。
【００６５】
一つの態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、患者（例えば、血栓症に関わるような血小板活性化を阻害する治療が必要な患者）に投与することができる。多様な実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、例えば静脈内に、又は筋肉内又は内臓に、投与することができる。非経口投与に適した経路には、静脈内、動脈内、及び筋肉内送達が含まれる。非経口投与に適した方法には、針（顕微針を含む）注射器、及び注入技術が含まれる。
【００６６】
例示的な実施態様において、ａ）薬学的に活性な量のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカン；ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲のｐＨを提供する薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤；ｃ）約０〜約３００ミリモルの濃度範囲のイオン強度調整剤；及びｄ）製剤総重量の約０．２５％〜約１０％の濃度範囲の水溶性粘度調整剤、又はａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）の組み合わせ、を含む、非経口投与用のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンと共に使用される医薬製剤が提供される。
【００６７】
多様な例示的な実施態様において、本明細書に記載されている組成物及び方法に使用されるｐＨ緩衝剤は、当業者に既知の作用物質であり、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、及びリン酸緩衝液、並びに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、及びタンパク質、並びに多様な生物学的緩衝液、例えばＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、トリス、トリシン、ヘペス、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ，カコジル酸塩又はＭＥＳが含まれる。
【００６８】
別の例示的な実施態様において、イオン強度調節剤には、当該技術において既知の作用物質が含まれ、例えば、グリシン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び他の電解質である。
【００６９】
有用な粘度調節剤には、イオン性及び非イオン性の水溶性ポリマー；「カーボマー」ファミリーのポリマーのような架橋アクリル酸ポリマー、例えば、Carbopol（登録商標）の商標のもとで市販されているカルボキシポロアルキレン；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、及びポリビニルアルコールのような親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びエーテル化セルロースのようなセルロースポリマー及びセルロースポリマー誘導体；トラガカント及びキサンタンガムのようなガム；アルギン酸ナトリウム；ゼラチン、ヒアルロン酸、及びその塩、キトサン、ジェラン、又はこれらの任意の組み合わせ、が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、中性又は塩基性作用物質のような非酸性粘度増強剤が、製剤の所望のｐＨを達成するのを促進するために用いられる。
【００７０】
一つの例示的な態様において、非経口製剤を、滅菌非水性液剤として、又は発熱物質無含有滅菌水のような適切なビヒクルと一緒に使用される乾燥形態として、適切に処方することができる。例えば凍結乾燥により、滅菌条件下で非経口製剤を調製することは、当業者に周知の標準的な製剤技術を使用して容易に達成することができる。
【００７１】
一つの実施態様において、非経口製剤の調製に使用されるコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの溶解度は、溶解度増強剤の組み込みのような、適切な配合技術を使用して増加することができる。
【００７２】
多様な実施態様において、非経口投与用の製剤を、即時の及び／又は調整された放出となるように処方することができる。調整放出製剤には、遅延、持続、間欠、制御、標的、及びプログラム放出製剤が含まれる。したがって、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、活性化合物の調整放出をもたらす移植デポー剤としての投与のために、固体、半固体又はチキソトロピー液として処方することができる。そのような製剤の例示的な例には、薬剤被覆ステント及び共重合（ＤＬ−乳酸、グリコール）酸（ＰＧＬＡ）微小球が挙げられる。別の実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン又はコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを含む組成物を、適切であれば連続的に投与することができる。
【００７３】
他の実施態様において、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン及びそれらを含有する組成物を局所的に投与することができる。軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ゲル軟膏剤、プラスター剤（例えば、バップ剤、湿布剤）、液剤、粉末剤などのような多様な剤形、及び基剤を、局所調合剤に適用することができる。これらの調合剤は、下記に記載される従来の薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて、任意の従来の方法により調製することができる。
【００７４】
例えば、軟膏剤の調製において、ワセリン、高級アルコール、ミツロウ、植物油、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。クリーム製剤の調製において、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、脂肪酸エステル、精製水、乳化剤などを使用することができる。ゲル製剤の調製において、ポリアクリル酸塩（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、精製水、低級アルコール、多価アルコール、ポリエチレングリコールなどのような従来のゲル化物質が使用される。ゲル軟膏調合剤の調製において、乳化剤（好ましくは、非イオン性界面活性剤）、油状物質（例えば、流体パラフィン、トリグリセリドなど）などが、上記に記述されたゲル化物質に加えて使用される。バップ剤又は湿布剤のようなプラスター剤は、上記に記述されたゲル調合剤を支持体（例えば、布、不織布）に塗布することにより調製することができる。上記の成分に加えて、パラフィン、スクアラン、ラノリン、コレステロールエステル、高級脂肪酸エステルなどを、場合により使用してもよい。更に、ＢＨＡ、ＢＨＴ、没食子酸プロピル、ピロガロール、トコフェロールなどのような酸化防止剤も組み込むことができる。上記の調合剤及び構成要素に加えて、場合により、任意の他の添加剤が組み込まれた任意の他の従来の製剤を使用してもよい。
【００７５】
本明細書に記載されている製剤のいずれかを使用して、本明細書に記載されている改変コラーゲンマトリックスの不在下又は存在下で、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン（例えば、１種類以上）を投与することができる。
【００７６】
多様な実施態様において、改変コラーゲンマトリックスを伴う又は伴わないコラーゲン結合性合成ペプチドグリカングラフトの投与量は、患者の状態、治療される疾患状態、投与経路、及び組織分布、並びに他の治療処置の併用の可能性に応じて、有意に変わりうる。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重、及び患者の状態に関する医師の評価に基づいている。多様な例示的な実施態様において、有効用量は、約１ng/kg〜約１０mg/kg、１００ng/kg〜約１mg/kg、約１μg/kg〜約５００μg/kg又は約１００μg/kg〜約４００μg/kgの範囲であることができる。これらの実施態様のそれぞれにおいて、用量／kgとは、患者の体重１キログラムあたりの用量を意味する。他の例示的な態様において、有効用量は、１用量あたり約０．０１μg〜約１０００mg、１用量あたり１μg〜約１００mg又は１用量あたり１００μg〜約５０mg又は１用量あたり５００μg〜約１０mg又は１用量あたり１mg〜約１０mgの範囲であることができる。
【００７７】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを投与する任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、単回用量又は多回用量の毎日レジメンとして投与することができる。更に、時差レジメン、例えば１週間あたり１〜５日間を、毎日治療の代替案として使用することができる。
【００７８】
本発明の一つの実施態様において、患者は、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの複数回の注射で治療される。一つの実施態様において、患者には、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを、例えば１２〜７２時間間隔又は４８〜７２時間間隔で複数回（例えば、約２回から最大約５０回まで）注射する。コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの追加の注射を、最初の注射の後、数日間又は数か月の間隔を置いて患者に投与することができ、追加の注射は、疾患の再発を予防する。あるいは、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの最初の注射が、疾患の再発を予防してもよい。
【００７９】
本明細書に記載されている実施態様のいずれかにおいて、ペプチド部分、グリカン部分又はその両方が異なっている２つ以上のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの組み合わせを、単一のコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの代わりに使用できることが理解されるべきである。
【００８０】
前述の実施態様において、化合物、組成物、及び方法の特定の態様は、例示的には１つ以上のＧ及びＰのいずれかにおける選択の場合のように、リストの選択肢として表されていることも理解される。したがって、本発明の多様な代替的実施態様は、これらのリストの個別のメンバー、並びにこれらのリストの多様なサブセットを含むことが理解されるべきである。これらの実施態様は、それぞれ、リストによって本明細書に記載されているということが理解されるべきである。
【００８１】
以下の例示的な実施例において、用語「合成ペプチドグリカン」及び「結合体」は、用語「コラーゲン結合性合成ペプチドグリカン」と同義的に使用される。
【実施例】
【００８２】
〔実施例１〕
ペプチド合成
全てのペプチドは、Knorr樹脂上でＦＭＯＣプロトコールを利用する、Symphonyペプチド合成機（Protein Technologies, Tucson, AZ）を使用して合成した。粗ペプチドをＴＦＡにより樹脂から分離し、Grace-Vydac 218TP C-18逆相カラム及び水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡの勾配を利用する、AKTAexplorer（GE Healthcare, Piscataway, NJ）の逆相クロマトグラフィーにより精製した。ダンシル修飾ペプチドを、樹脂から分離する前に、ダンシル−Ｇｌｙ（Sigma）との追加のカップリング工程を加えることにより調製した。ペプチド構造を質量分析により確認した。以下のペプチドを上記に記載されたように調製した：ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ダンシル−ＧＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ及びダンシル−ＧＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ。これらのペプチドは、ＳＩＬＹ、ＳＹＩＲ、Ｚ−ＳＩＬＹ及びＺ−ＳＹＩＲと略される。追加のペプチドのＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ（略語ＫＥＬＮ）及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣ（略語ＧＳＩＴ）を、上記に記載されたように調製するか又は購入した（Genescript, Piscataway, NJ）。
【００８３】
〔実施例２〕
デルマタン硫酸へのＳＹＩＲペプチドの結合
ＳＹＩＲを、Hermansonの方法（Hermanson, 1996）を僅かに改変した方法によりｏｘＤＳに結合した。ペプチドＳＹＩＲを、０．０５Mの炭酸ナトリウム、０．１Mのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５に濃度０．４mg/mLで溶解して５mLの最終容量にした。１０倍のペプチドモル過剰で反応させるために、２９mgのｏｘＤＳ、ＭＷ４１，０００（４１kDaの１．１アルデヒド／ＤＳ分子を含有する酸化デルマタン硫酸は、Celsus Laboratories, Cincinnati, OHから入手可能である）を、ペプチド溶液に溶解した。穏やかに撹拌しながら、５０μLのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応を室温で一晩進行させた。
【００８４】
過剰ペプチドを、Sephadex G-25媒体（GE Health）が充填され、脱イオン水（MiIIiQ）で平衡にしたXK 26-40カラムを使用するAkta Purifierのゲル濾過により分離した。溶離液を２１５nm、２５４nm及び２８０nmでモニタリングした。ＤＳ−ＳＹＩＲを含有する最初の溶離ピークを収集し、更なる試験のために凍結乾燥した。
【００８５】
〔実施例３〕
デルマタン硫酸へのＳＩＬＹの結合
ｏｘＤＳへのＰＤＰＨ結合
スルフヒドリル及びアミン基に反応性である二官能架橋剤のＰＤＰＨ（Pierce）を使用して、ｏｘＤＳにＳＩＬＹを結合した。反応の第１工程において、ｏｘＤＳをカップリング緩衝液（０．１Mのリン酸ナトリウム、０．２５Mの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解して、１．２mMの最終濃度にした。ＰＤＰＨを１０倍モル過剰で加え、反応を室温で２時間進行させた。過剰ＰＤＰＨ（ＭＷ２２９Da）を、Sephadex G-25媒体が充填され、MiIIiQ水で平衡にしたXK 26-40カラムを使用するAkta Purifier上でのゲル濾過により分離した。溶離液を２１５nm、２５４nm及び２８０nmでモニタリングした。ＤＳ−ＰＤＰＨを含有する最初の溶離ピークを収集し、ＳＩＬＹへの結合のために凍結乾燥した。
【００８６】
ＰＤＰＨ含有量の決定
ｏｘＤＳと結合しているＰＤＰＨ分子の数を決定するため、ＤＳ−ＰＤＰＨを１．６mg/mLでカップリング緩衝液に溶解した。１０μLのＤＴＴを１５mg/mLでＤＳ−ＰＤＰＨ溶液に加え、反応を室温で１５分間進行させた。ＰＤＰＨのシステイン反応側のジスルフィド結合を還元すると、ピリジン−２−チオンを放出し、これは３１３nmで見ることができる。３１３nmでの吸光度を、ＤＴＴ添加の前後に測定し、その差を、ピリジン−２−チオンの吸光係数を使用してＰＤＰＨ分子／ＤＳ分子の数を計算するために使用した。図７の結果は、ΔＡ＝０．３５を示し、１．１のＰＨＰＨ分子／ＤＳに相当する。
【００８７】
ＳＩＬＹの結合
ペプチドを５：１モル過剰でカップリング緩衝液に、最終ペプチド濃度のおよそ１mM（ペプチドの溶解度より限定される）で溶解した。反応を室温で一晩進行させ、過剰ペプチドを分離し、ＤＳ−ＳＩＬＹ結合体を、上記に記載されたゲル濾過により単離した。カップリング後のＳＩＬＹ／ＤＳ比の１．０６を示す、図２６を参照すること。
【００８８】
〔実施例４〕
デルマタン硫酸へのＺ−ＳＩＬＹの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、Ｚ−ＳＩＬＹに結合した。
【００８９】
〔実施例５〕
デルマタン硫酸へのＫＥＬＮの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、ＫＥＬＮに結合した。
【００９０】
〔実施例６〕
デルマタン硫酸へのＧＳＩＴの結合
デルマタン硫酸を、実施例３の方法に従って、ＧＳＩＴに結合した。
【００９１】
〔実施例７〕
デルマタン硫酸へのＺ−ＳＹＩＲの結合
デルマタン硫酸を、実施例２の方法に従って、Ｚ−ＳＹＩＲに結合した。
【００９２】
〔実施例８〕
ヘパリンへのＳＩＬＹの結合
分子１個あたり１つのアルデヒドを含有する酸化ヘパリン（ｏｘＨｅｐ）（ＭＷ＝１９．７kDa）（Celsus Laboratories, Cincinnati, OHから購入した）。追加のアルデヒドを、以下のように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムにおける更なる酸化により形成した。ｏｘＨｅｐを０．１Mの酢酸ナトリウムに、ｐＨ５．５、濃度１０mg/mLで溶解した。次にメタ過ヨウ素酸ナトリウムを２mg/mLの濃度で加え、遮光下にて室温で４時間反応させた。過剰メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、HiTrapサイズ除去カラム（GE Healthcare）を使用して脱塩することにより除去し、ｏｘＨｅｐを、凍結乾燥し、ＰＤＰＨとの結合まで遮光した。
【００９３】
ｏｘＨｅｐを、実施例３のＤＳ−ＰＤＰＨ結合について記載された方法により、ＰＤＰＨに結合した。ＰＤＰＨを５０倍のモル過剰で反応させた。より高いＰＤＰＨ濃度を達成するために、１０mgのＰＤＰＨを７５μLのＤＭＳＯに溶解し、１mLのｏｘＨｅｐ含有カップリング緩衝液と混合した。反応は室温で２．５時間進行し、過剰ＰＤＰＨを脱塩により除去した。ヘパリン含有ＰＤＰＨ（Ｈｅｐ−ＰＤＰＨ）を、ＳＩＬＹと反応させるまで、凍結乾燥粉末として保存した。
【００９４】
ＳＩＬＹを、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹ結合について記載されたとおりに、１０倍モル過剰でＨｅｐ−ＰＤＰＨと反応させた。反応を、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹについて記載されたようにモニタリングしたところ、図２４に示されているように、ヘパリン分子１個あたり５．４４の結合したシリルペプチドを示した。
【００９５】
〔実施例９〕
ヘパリンへのＧＳＩＴの結合
ヘパリンを、実施例８に方法に従って、ＧＳＩＴと結合した（略語Ｈｅｐ−ＧＳＩＴ）。
【００９６】
〔実施例１０〕
デキストランへのＳＩＬＹの結合
デキストランを、ヘパリンをデキストランに代えて実施例８の方法に従って、ＳＩＬＹと結合した。第１工程におけるメタ過ヨウ素酸ナトリウムによるデキストランの酸化条件の変更は、ＳＩＬＹとデキストランのモル比が異なる結合体の調製を可能にした。例えば、ＳＩＬＹとデキストランのモル比が約６のデキストラン−ＳＩＬＹ結合体及びＳＩＬＹとデキストランのモル比が約９のデキストラン−ＳＩＬＹ結合体を調製した（略語Ｄｅｘ−ＳＩＬＹ６及びＤｅｘ−ＳＩＬＹ９）。
【００９７】
〔実施例１１〕
ヒアルロナンへのＳＩＬＹの結合
ヒアルロナンを、実施例８に方法に従って、ＳＩＬＹと結合した（略語ＨＡ−ＳＩＬＹ）。
【００９８】
〔実施例１２〕
コラーゲンへのＳＩＬＹの結合（Biacore）
Biacore分析を、CM-3チップを使用するBiacore 2000（Biacore, Inc., Piscataway, NJ）により実施した。CM-3チップは、共有結合カルボキシメチル化デキストランで被覆されており、これにより遊離アミン基を介した基質コラーゲンの結合が可能になる。フローセル（ＦＣ）１及び２を使用し、ＦＣ−１を基準セルとし、ＦＣ−２をコラーゲン固定化セルとした。各ＦＣをＥＤＣ−ＮＨＳで活性化し、ｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液中の１mg/mLのコラーゲンを５μL/分で１０分間流し込むことにより、ＦＣ−２上に１５００RUのコラーゲンを固定化した。未反応ＮＨＳ−エステル部位をエタノールアミンでキャップし、対照ＦＣ−１を活性化し、エタノールアミンでキャップした。
【００９９】
ペプチド結合親和性を決定するために、ＳＩＬＹを、１００uM〜１．５μMの異なる濃度で１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Biacore）に２倍の希釈で溶解した。流速を、結合動態を決定するためにMyskaにより提案（Myska, 1997）された範囲内である９０μL/分に保持した。最初の１０回の注射は、系の始動を助ける緩衝液注射であり、続いて無作為な試料注射を３回ずつ行った。解析はBIAevaluationソフトウエア（Biacore）を使用して実施した。代表的な会合／解離曲線を図３に示し、これはＳＩＬＹペプチドがコラーゲンに可逆的に結合することを実証している。ＫＤ＝１．２μMであることが、オンオフ結合動態からの計算により得られた。
【０１００】
〔実施例１３〕
コラーゲンへのＺ−ＳＩＬＹの結合
結合アッセイを、黒色で透明底の９６ウエル高結合型プレート（Costar）で行った。コラーゲンを未処理ウエル及びＢＳＡ被覆ウエルと比較した。コラーゲン及びＢＳＡを、１０mMのＨＣｌ及び１×ＰＢＳそれぞれの中で２mg/mLの濃度で、９０μL／ウエルずつインキュベートすることにより、３７℃で１時間固定した。インキュベート後、各ウエルを１×ＰＢＳで３回洗浄した。Ｚ−ＳＩＬＹを、１００μM〜１０nMの濃度で１×ＰＢＳに１０倍の希釈で溶解した。ウエルを３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、次に９０μLの１×ＰＢＳを充填した。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。結果を図４及び５に示す。ＫＤ＝０．８６μMであることが、平衡動態からの計算により得られた。
【０１０１】
〔実施例１４〕
ＤＳ−ＳＩＬＹの特徴決定
ＤＳに結合したＳＩＬＹ分子の数を決定するために、ピリジン−２−チオンの生成を、Pierceにより提供された変更プロトコールを使用して測定した。１．１のＰＤＰＨ分子が結合しているデルマタン硫酸を０．４４mg/mLの濃度でカップリング緩衝液（０．１Mのリン酸ナトリウム、０．２５Mの塩化ナトリウム）に溶解し、３４３nmでの吸光度を、SpectraMax M5（Molecular Devices）を使用して測定した。ＳＩＬＹを５倍モル過剰で反応させ、吸光度の測定を、ＳＩＬＹの添加の直後と、２時間反応させた後に、繰り返し行った。ＳＩＬＹそれ自体が３４３nmで吸収しないことを確実にするため、０．１５mg/mLのＳＩＬＹを含有するカップリング緩衝液を測定し、緩衝剤のみの吸光度と比較した。
【０１０２】
ＤＳに結合したＳＩＬＹ分子の数を、次の式：（Ａｂｓ３４３／８０８０）×（ＭＷＤＳ／ＤＳmg/mL）を使用して、ピリジン−２−チオンの吸光係数により計算した。結果を図２６に示す。
【０１０３】
〔実施例１５〕
コラーゲン結合、蛍光データ−ＤＳ−ＳＩＬＹ
ペプチド結合体が、ＤＳへの複合の後で、コラーゲンに結合する能力を維持するかを決定するために、蛍光結合アッセイを実施した。蛍光標識型のＳＩＬＹであるＺ−ＳＩＬＹは、ダンシルグリシンをアミン末端に付加することにより合成した。このペプチドをＤＳと結合し、ＳＩＬＹについて記載されたものと同じ方法を使用して精製した。
【０１０４】
結合アッセイを、黒色で透明底の９６ウエル高結合型プレート（Costar）で行った。コラーゲンを未処理ウエル及びＢＳＡ被覆ウエルと比較した。コラーゲン及びＢＳＡを、１０mMのＨＣｌ及び１×ＰＢＳそれぞれの中で２mg/mLの濃度で、９０μL／ウエルずつインキュベートすることにより、３７℃で１時間固定した。インキュベート後、各ウエルを１×ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１０５】
ウエルをＤＳと共に３７℃で３０分間プレインキュベートして、コラーゲンへのＤＳの非特異的結合を排除した。ウエルを、ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹと共にインキュベートする前に、１×ＰＢＳで３回すすいだ。ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹを、１００μM〜１０nMの濃度で１×ＰＢＳに１０倍の希釈で溶解した。ウエルを３７℃で３０分間インキュベートし、３回すすぎ、次に９０μLの１×ＰＢＳを充填した。蛍光読み取り値は、励起／発光波長がそれぞれ３３５nm／４９０nmのM5 Spectramax Spectrophotometer（Molecular Devices）により得た。
【０１０６】
固定コラーゲン、ＢＳＡ及び未処理ウエルへのＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹの蛍光結合を図８で比較する。結果は、ＤＳ−Ｚ−ＳＩＬＹが、ＢＳＡ処理ウェル及び未処理ウエルよりもコラーゲン処理ウエルに特異的に結合することを示す。高結合型プレートの未処理ウエルは、陽性対照として設計されたが、コラーゲン処理ウエルと比べてほとんど結合が観察されなかった。これらの結果は、ＳＩＬＹがＤＳへの結合の後でもコラーゲンに結合する能力を維持することを示唆している。ＤＳとのプレインキュベーションは結合を防止せず、結合体がＤＳのみとは別に結合することを示唆している。
【０１０７】
〔実施例１６〕
Ｉ型コラーゲンゲルの調製
ゲルを、４mg/mLの最終コラーゲン濃度でNutragenコラーゲン（Inamed, Freemont, CA）から作製した。Nutragen貯蔵溶液は、１０mMのＨＣｌ中の６．４mg/mLである。ゲル調製を氷上で実施し、新鮮な試料をそれぞれの試験の前に作製した。コラーゲン溶液は、適切な容量の１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、１×ＰＢＳ及び１MのＮａＯＨを加えることにより、生理学的ｐＨ及び塩濃度に調整した。大部分の実験において、ＤＳ、デコリン、ＤＳ−ＳＩＬＹ又はＳＤ−ＳＹＩＲの試料を、試験試料を適切な濃度で溶解した最終１×ＰＢＳ添加（各処理剤を通して等量）により、１０：１のコラーゲン：試料モル比で加えた。この方法により、試料は、ｐＨ７．４及び生理学的塩濃度を常に保持する。コラーゲンのみの試料には、試料が溶解していない１×ＰＢＳを添加した。原線維形成は、中和コラーゲン溶液を、脱水を避けるために加湿チャンバーにおいて３７℃で一晩インキュベートすることによって誘導する。コラーゲン：試料モル比が１０：１以外のゲル溶液を、同様に調製した。
【０１０８】
〔実施例１７〕
ゲルの粘弾性の特徴決定
コラーゲンゲルを実施例１６に記載されたとおりに調製し、加熱する前に、２００μLの各処理剤を疎水性印刷スライド（Tekdon）の可湿性表面にピペットで加えた。ＰＴＦＥ印刷はゲルを２０mm直径の可湿性領域に限定した。機械的試験に先立ち、加湿インキュベーター中で３７℃で一晩かけて、ゲルを形成した。
【０１０９】
スライドを、２０mmのステンレススチール平行平板配置を有するAR-G2レオメーター（TA Instruments, New Castle, DE）のレオメーター載物台の上で挟み、２０mmのステンレススチール平行平板配置を、形成されたゲルへの過剰な剪断を避けるために、０．２５Nの垂直力制御を使用して間隙の幅が６００μmになるまで低下させた。圧力及び周波数掃引の反復過程をコラーゲンのみのゲルに実施して、直線範囲を決定した。また、全ての試料を０．１Hz〜１．０Hzの周波数範囲及び１．０Paの制御圧力で試験した。Design Expertソフトウエア（StatEase, Minneapolis, MN）を使用する統計分析を、各周波数で実施し、５方向ＡＮＯＶＡを使用して、各試料を比較した。図９の１０：１、図１０の５：５及び図１１の３０：１で示されている結果は、合成ペプチドグリカンによる処理は、Ｉ型コラーゲンゲルの粘弾性挙動を変更しうることを実証している。
【０１１０】
〔実施例１８〕
ＩＩＩ型コラーゲン含有ゲルの粘弾性の特徴決定
ＩＩＩ型コラーゲンを含有するゲルを、実施例１６と同様に以下の変更を加えて調製した：処理済及び未処理ゲル溶液は、１．５mg/mLのコラーゲン濃度（９０％コラーゲンＩＩＩ（Millipore）、１０％コラーゲンＩ）を使用して調製し、２００μLの試料を、疎水性印刷スライドの２０mm直径の可湿性表面にピペットで加えた。これらの溶液を、３７℃で２４時間ゲル化させた。対照としてのゲルは、コラーゲンのみ、デルマタン硫酸（１：１及び５：１のモル比）で処理したコラーゲン、及びコラーゲンＩＩＩ結合ペプチドのみ（ＧＳＩＴ及びＫＥＬＮ、５：１モル比）で処理したコラーゲンから形成した。処理したゲルは、ペプチドグリカンを（ＤＳ−ＧＳＩＴ又はＤＳ−ＫＥＬＮを１：１及び５：１のモル比で）含有した。全ての比は、コラーゲン：処理剤化合物の比である。試料を０．１Hz〜１．０Hzの周波数範囲、１．０Paの制御圧力で試験したこと以外は実施例１７と同様のようにして、ゲルの特徴決定を行った。図１２及び１３に示されているように、デルマタン硫酸−ＧＳＩＴ結合体及びデルマタン硫酸−ＫＥＬＮ結合体（合成ペプチドグリカン）は、ＩＩＩ型コラーゲンから形成されたゲルの粘弾特性に影響を及ぼすことができる。
【０１１１】
〔実施例１９〕
原線維形成
原線維形成の速度及び原線維の直径に関する情報を提供する、混濁度に関連のある３１３nmでの吸光度を測定することにより、コラーゲン原線維形成をモニタリングした。ゲル溶液は、実施例１６に記載されているとおり（特に指示のない限り、４mg/mLのコラーゲン及び１０：１のコラーゲン：処理剤）に調製し、５０uL／ウエルを４℃で３８４ウエルプレートに加えた。プレートを、原線維形成を開始する前に、４℃で４時間保持した。３７℃でSpectraMax M5を使用して、３１３nmにより３０秒間隔で６時間吸光度を測定した。結果を図１４、１５及び１６に示す。１０：１モル比試料のゲル形成のＴ１／２を図１７に示す。デルマタン硫酸−ＳＩＬＹは、原線維形成の速度を減少する。
【０１１２】
〔実施例２０〕
共焦点反射顕微鏡検査法
ゲルを、上記の実施例１６に記載されているように形成し、一晩インキュベートし、ゲルを、６０×で１．４ＮＡの水浸レンズを使用するOlympus FV1000共焦点顕微鏡により画像化した。試料を、４８８nmのレーザー光線で照らし、反射光を、青色反射フィルターを使用する光電子増倍管で検出した。それぞれのゲルをゲルの底から１００μMで画像化し、代表的な試料採取を確実にするため３つの異なる場所を画像化した。結果を図１８に示す。
【０１１３】
〔実施例２１〕
コラーゲンＩのクライオＳＥＭ測定
クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６のとおりにＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。次に載物台をクライオ保持器中に固定し、液体窒素スラッシの中に投入した。次に試料を、真空下で−１７０℃に冷却したGatan Alto 2500プレチャンバーに移した。自由破面を冷却メスにより作り出し、各試料を昇華条件下で２０分間蒸発させた。試料を白金スパッター被覆により１２０秒間被覆した。試料を−１３０℃のクライオ載物台に移し、処理剤同士を比較するために、同様の配向の各領域を画像化した。５，０００×で画像化した代表的な試料を図１９に示す。画像を分析して平均原線維直径（図２２）及びコラーゲンシート間の平均間隔（図２３）を決定した。原線維直径は、手動で個別の原線維を測定（原線維を横断して線を引き、尺度を正確に設定した後、その長さを測定する）してImageJソフトウエア（NIH）を使用して計算した。３人の観察者が、１処理剤あたり３つの別々の画像について、画像１つあたり１０本の原線維を記録し、１処理剤あたり合計で９０の測定値を得た。シート間隔は、ここでも手動で測定するImageJを使用して計算した。１処理剤あたり１人の観察者で１５の測定値であった。原線維直径及びコラーゲンシート間の間隔は、デルマタン硫酸−ＳＩＬＹ合成ペプチドグリカンで処理されたゲルにおいて減少した。
【０１１４】
〔実施例２２〕
コラーゲンＩＩＩのクライオＳＥＭ測定
クライオＳＥＭ用のゲルを、実施例１６と同様の方法に以下の変更を加え、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、３７℃で一晩インキュベートした。コラーゲン濃度は、１mg/mLであった（９０％のコラーゲンＩＩＩ、１０％のコラーゲンＩ）コラーゲン：ＤＳの比は１：１であり、コラーゲン：ペプチドグリカンの比は１：１であった。画像を実施例２１のとおりに記録した。空間体積と原線維体積の比は、実施例２１の方法の変形を使用して測定した。結果を図２０及び２１に示す。デルマタン硫酸−ＫＥＬＮ及びデルマタン硫酸−ＧＳＩＴは、処理済コラーゲンゲルにおいて、空間を減少する（原線維直径及び分岐を増加する）。
【０１１５】
〔実施例２３〕
Ｄバンド形成のＡＦＭ確認
ゲル溶液を実施例１６に記載されたとおりに調製し、２０μLの各試料をカバーガラスにピペットで加え、加湿インキュベーターにおいて一晩ゲル化させた。ゲルを段階的エタノール溶液（３５％、７０％、８５％、９５％、１００％）により、各溶液で１０分間処理した。走査速度２Hzの接触モード（Multimode SPM, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA, USA、ＡＦＭチップ窒化ケイ素接触モードチップのｋ＝０．０５N/m、Veeco Instruments）、偏位設定ポイント：０〜１ボルトにて、ＡＦＭ画像を作製した。Ｄバンド形成は、図２及び３８に示されているように、全ての処理剤において確認された。
【０１１６】
〔実施例２４〕
コラーゲン再構築
組織試料の調製
Grassl, et al.の方法（Grassl, et al., Journal of Biomedical Materials Research 2002, 60, (4), 607-612）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に従って、合成ＰＧ模倣体を有する又は有さないコラーゲンゲルを、実施例１６に記載されたとおりに形成した。ヒト大動脈平滑筋細胞（Cascade Biologies, Portland, OR）を、インキュベーションに先立って、中和コラーゲン溶液に４×１０６細胞／mLで加えることによりコラーゲンゲル内に接種した。細胞コラーゲン溶液を、８ウエルLab-Tekチャンバースライドにピペットで移し、加湿した３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ゲル化した後、細胞コラーゲンゲルを、Cascadeにより処方された１mLの培地２３１で覆う。３〜４日毎に、培地を試料から取り出し、標準的ヒドロキシプロリンアッセイ（Reddy, 1996）によりヒドロキシプロリン含有量を測定した。
【０１１７】
ヒドロキシプロリン含有量
培地上清中の分解コラーゲンを測定するために、試料を凍結乾燥し、試料を２MのＮａＯＨにより１２０℃で２０分間加水分解した。冷却した後、クロラミンＴ（Sigma）を添加し、室温で２５分間反応させることにより、遊離ヒドロキシプロリンを酸化した。エールリッヒアルデヒド試薬（Sigma）を加え、６５℃で２０分間反応させ、続いてＭ−５分光高度計（Molecular Devices）により５５０nmで吸光度を読み取った。培地中のヒドロキシプロリン含有量は、分解コラーゲン及び組織再構築可能性の間接的な測度である。培養を３０日間までインキュベートし、各処理剤につき３つの試料を測定した。細胞を添加しないでインキュベートしたゲルを、対照として使用した。遊離ペプチドＳＩＬＹ及びＤｃ１３は、図５３に示されているように、細胞培地中のヒドロキシプロリン含有量で測定すると、コラーゲンのみと比較してより大きなコラーゲン分解をもたらした。
【０１１８】
細胞生存率
細胞生存率は、生／死バイオレット生存／活力キット（Molecular Probes）を使用して決定した。本キットは、カルセイン−バイオレット染料（生細胞）及びアクア蛍光反応性染料（死細胞）を含む。試料を１×ＰＢＳで洗浄し、３００μLの染料溶液と共に室温で１時間インキュベートした。未結合の染料を除去するために、試料を１×ＰＢＳですすいだ。２０×対物レンズのOlympus FV1000共焦点顕微鏡によりフィルター４００／４５２及び３６７／５２６で二次元切片を画像化した後、生細胞及び死細胞をカウントした。全ての試料について、ゲルを代表的な領域において走査し、３つの画像のセットを、ゲル中において等間隔で撮った。
【０１１９】
〔実施例２５〕
ゲル中での細胞増殖
ゲル試料を実施例１６のとおりに調製した（４mg/mLのコラーゲン；１０：１のコラーゲン：処理剤）。細胞を１．５×１０４細胞／cm２で接種し、増殖培地において４時間インキュベートして細胞をゲルに接着させた。次に増殖培地を吸引除去し、細胞を２４時間処理した。処理剤濃度は、ゲル中でのコラーゲン：処理剤の１０：１モル比に等しかった。細胞を増殖培地において４時間インキュベートして、ゲルに接着させた。増殖培地を吸引により取り除き、新鮮な成長培地に代えた。試料を２４時間インキュベートした。各試料中の細胞の数を、CyQuant細胞増殖アッセイ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して測定した。図２５に示されている結果は、合成ペプチドグリカン及びペプチドが細胞増殖に有害な影響を与えないことを示す。
【０１２０】
〔実施例２６〕
ＤＳ−Ｄｃ１３の調製
Ｄｃ１３ペプチド配列は、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣであり、その蛍光標識形態は、ＺＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣであり、ここでＺはダンシルグリシンを意味する。ヘテロ二官能架橋剤のＰＤＰＨを使用してデルマタン硫酸に結合することは、実施例３のＤＳ−ＳＩＬＹについて記載されたとおりに実施される。図２７に示されているように、結合体（ＤＳ−Ｄｃ１３）におけるＤｃ１３とデルマタン硫酸のモル比は約１であった。
【０１２１】
〔実施例２７〕
ＤＳ−ＺＳＩＬＹの蛍光結合アッセイ
ＤＳ−ＺＳＩＬＹについて記載された蛍光結合アッセイを、ペプチド配列ＺＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ（ＺＤｃ１３）を用いて実施した。結果を図２８に表し、これはＤＳ−ＺＤｃ１３が用量依存的にコラーゲン表面に特異的に結合することを示しているが、飽和は、試験された最高率では達成されなかった。
【０１２２】
〔実施例２８〕
ＤＳ−Ｄｃ１３の原線維形成アッセイ
実施例１９でＤＳ−ＳＩＬＹについて記載された原線維形成アッセイを、結合体ＤＳ−Ｄｃ１３を用いて実施した。図２９に示されている結果は、ＤＳ−Ｄｃ１３が原線維形成を遅延し、全体的な吸光度を用量依存的に減少することを示す。対照的に、遊離Ｄｃ１３ペプチドは、高い１：１コラーゲン：添加剤モル比でコラーゲンのみの場合と比較したとき、原線維形成にほとんど影響を与えない。
【０１２３】
〔実施例２９〕
原線維直径を測定するためのクライオＳＥＭ測定の使用
実施例２１の変更した方法を使用して、原線維直径をクライオＳＥＭにより測定した。２０，０００×で撮ったクライオＳＥＭ画像における原線維直径は、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して測定した。少なくとも４５本の原線維をそれぞれの処理剤について測定した。結果を平均±標準誤差で表す。統計分析を、α＝０．０５でDesignExpertソフトウエア（StatEase）を使用して実施した。結果を図３０に示す。デコリン及び合成ペプチドグリカンは、コラーゲン又はコラーゲン＋デルマタン硫酸よりも原線維直径を有意に減少する。コラーゲンのみと比較すると、遊離ペプチドＤｃ１３は、原線維直径に影響を与えないが、遊離ＳＩＬＹは、原線維直径の減少をもたらす。
【０１２４】
〔実施例３０〕
細胞培養及びゲル圧縮
ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡ ＳＭＣ）（Cascade Biologies）を増殖培地（平滑筋増殖因子を添加した培地２３１）で培養した。第３継代の細胞を全ての実験に使用した。分化培地（１％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地２３１）を、特に示されない限り、全ての実験に使用した。この培地は、ヘパリンを含有しない点において製造元のプロトコールと異なっている。
【０１２５】
コラーゲンゲルを、培地への細胞の添加に適応させるために１×ＰＢＳ例の添加を省略したこと以外は上記のとおりに、それぞれの添加剤を用いて調製した。氷上で３０分間インキュベートした後、分化培地中のＨＣＡ ＳＭＣを、最終濃度１×１０６細胞／mLとなるようゲル溶液に加えた。ゲルの形成を、５００μL／ウエルの分化培地を加える６時間前に、４８ウエルの組織培養処理無しプレート（Costar）を用いて四重に行った。２４時間後に、ゲルをウエルの端から切り離した。培地を２〜３日毎に交換し、比較のための画像を、Gel Doc System（Bio-Rad）を使用して同じ時点で撮った。円形ゲルの断面積（圧縮の度合いに対応する）は、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して決定した。細胞を含有しないゲルを陰性対照として使用し、添加剤無しのコラーゲンゲル中の細胞を陽性対照として使用した。結果を図３１に示す。１０日目までには、全てのゲルが元のゲル面積のおよそ１０％圧縮され、添加剤の間の差は小さかった。ＤＳ−Ｄｃ１３で処理したゲルの圧縮は、デコリン又はコラーゲンで処理したゲルの場合より僅かであるが有意に少なかったが、ＤＳとＤＳ−ＳＩＬＹ処理済ゲルで見られるものとは統計的に同等であった。
【０１２６】
〔実施例３１〕
エラスチンの測定
ＨＣＡ ＳＭＣを接種したコラーゲンゲルを、実施例３０に記載されたとおりに調製した。分化培地を３日毎に交換し、ゲルを１０日間培養した。細胞を含有しないコラーゲンゲルを対照として使用した。ゲルを１×ＰＢＳで一晩すすいで、血漿タンパク質を除去し、製造元のプロトコール（Biocolor, County Atrim, U.K.）に従い、ファスチンエラスチンアッセイを使用して、ゲルをエラスチン含有量について試験した。簡潔には、ゲルを、１００℃で１時間インキュベートすることにより、０．２５Mのシュウ酸において可溶化した。エラスチンを沈殿させ、次に試料を１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した。可溶化したコラーゲンの上清を除去し、エラスチンペレットをファスチン染料試薬により室温で９０分間染色した。試料を１１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清中の未結合の染料を除去した。ファスチン染料解離試薬によりエラスチンペレットから染料を放出させ、１００μLの試料を９６ウエルプレート（Costar）に移した。吸光度を５１３nmで測定し、エラスチン含有量を、α−エラスチン標準曲線から計算した。これらのアッセイの結果を図３２に示す。ＤＳ−ＳＩＬＹによる処理は、全ての試料においてエラスチン生成を有意に増加させた。ＤＳ及びＤＳ−Ｄｃ１３による処理は、未処理コラーゲンよりもエラスチン生成を有意に低減させた。細胞のない対照試料のコラーゲンゲルは、エラスチン生成を示さなかった。
【０１２７】
〔実施例３２〕
血小板相互作用に対するヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹの効果
１０mM ＨＣｌ中２mg/mLのコラーゲンでスライドを３７℃で１時間インキュベートすることにより、カバーガラススライド（１８mm）上にコラーゲンを固定した。次にスライドを、１×ＰＢＳで洗浄し、更なる試験まで、１×ＰＢＳ中に４℃で２４時間保存した。未処理カバーガラススライドを陰性対照として使用した。スライドは、コラーゲン面を上に向けて、４８ウエル無組織培養処理プレート（Costar）の中へ設置した。ヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹを１×ＰＢＳに溶解して１００μMの濃度にし、１００μM／ウエルにて３７℃で３０分間インキュベートした。未結合のヘパリン又はヘパリン−ＳＩＬＹを吸引し、表面を１mLの１×ＰＢＳで洗浄した。添加剤を含有しない１×ＰＢＳでインキュベートしたコラーゲン固定化スライドを、陽性対照として使用した。
【０１２８】
ヒトの全血を８００×ｇで１５分間遠心分離し、１００μLの多血小板血漿をバフィコート層から取り出し、各ウエルに加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、多血小板血漿をウエルから除去し、ウエルを１×ＰＢＳで穏やかに洗浄して、未結合細胞を除去した。スライドを５％グルタルアルデヒドにより室温で１時間固定し、すすぎ、画像化の前に凍結乾燥した。スライドを３分間金スパッター被覆し、JEOL 840 SEMにより２００×で画像化した。結果を図３３に示す。この画像は、ヘパリン−ＳＩＬＹ結合体による処理が、血小板細胞のコラーゲンへの結合に影響を与えることを示す。
【０１２９】
〔実施例３３〕
原線維密度のクライオＳＥＭでの測定
コラーゲンを、実施例１６に記載されたように、各添加剤の１０：１モル比の存在下、ＳＥＭ載物台の上に直接形成し、前記のように処理及び画像化した。原線維密度を計算するため、１０，０００×の画像を分析した。画像を８ビットの白黒に変換し、各画像の閾値を、ImageJソフトウエア（NIH）を使用して決定した。 閾値は、全ての可視原線維が白色となり、全ての空間が黒色となる値として定義した。白色と黒色の領域の比は、MatLabソフトウエアを使用して計算した。全ての測定値を３回ずつ取り、処理剤について関知しない観察者により閾値を決定した。ゲルの画像を図３７に示し、測定された密度を図３４に示す。
【０１３０】
〔実施例３４〕
Ｄｃ１３及びＤＳ−Ｄｃ１３を含有するゲルの粘弾性の特徴決定
コラーゲンを実施例１６のとおりに調製した。粘弾性特徴決定を、コラーゲンと添加剤（処理剤）の異なる比率で形成されたゲルにおいて、実施例１７に記載されたとおりに実施した。デルマタン硫酸又はデルマタン−Ｄｃ１３結合体による処理は、図３５に示されているように、未処理コラーゲンよりも、得られたコラーゲンゲルの剛性を増加させる。
【０１３１】
〔実施例３５〕
細胞増殖及び細胞毒性アッセイ
実施例３０で調製されたＨＣＡ ＳＭＣを、９６ウエル組織培養用黒色／透明底プレート（Costar）上へ増殖培地にて４．８×１０４細胞／mLで接種し、４時間で接着させた。増殖培地を吸引し、コラーゲンゲル内での濃度と同等の濃度（１．４×１０６M）で各添加剤を含有する６００μLの分化培地を、各ウエルに加えた。細胞を４８時間インキュベートし、次に、製造元のプロトコールに従って、生死及びCyQuant（Invitrogen）アッセイを使用して、細胞毒性及び増殖についてそれぞれ試験した。添加剤を含有しない分化培地中の細胞を対照として使用した。結果を図３６に示し、これは、いずれの処理剤も有意な細胞毒性効果を示さなかったことを示している。
【０１３２】
〔実施例３６〕
Ｉ型コラーゲンに対する血小板結合及び血小板活性化の阻害
マイクロプレートの調製
Ｉ型原線維コラーゲン（Chronolog, Havertown, PA）を等張グルコースに希釈して、２０〜１００μg/mLの濃度にした。５０μLのコラーゲン溶液を、高結合型９６ウエルプレートの各ウエルに加えた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に１×ＰＢＳで３回すすいだ。
【０１３３】
ペプチドグリカンを１×ＰＢＳにより２５μM〜５０μMの濃度に希釈し、５０μLの溶液をコラーゲン被覆ウエルに加えた。対照のＧＡＧ、ペプチド又はＰＢＳも、対照としてコラーゲン被覆ウエルに加えた。各処理剤を、２００rpmで３０分間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。次にウエルを、１×ＰＢＳにより３回すすいだ（２００rpmの振とうによる２０分間のすすぎで未結合の処理剤分子を除去することを含む）。
【０１３４】
血小板の調製及び活性化
認証されたPurdue IRBプロトコールに従い、インフォームドコンセントを得た健康な志願者から、ヒト全血を静脈穿刺により収集した。最初の５mLの血液は、コラーゲン及び他のタンパク質が混入している可能性があるので廃棄し、次におよそ１５mLをクエン酸塩加ガラス製バキュテーナー（BD Bioscience）に収集した。血液をガラス管中で２００×ｇにより２０℃で２０分間遠心分離した。遠心分離された血液の最上層、すなわち多血小板血漿（ＰＲＰ）を、血小板試験に使用した。ＰＲＰ（５０μL／ウエル）をマイクロプレートに加え、振とうすることなく、室温で１時間インキュベートした。
【０１３５】
１時間のインキュベーションの後、ＰＲＰを各ウエルから取り出し、５μLのＥＴＰ（１０７mMのＥＤＴＡ、１２mMのテオフィリン及び２．８μMのプロスタグランジンＥ１）を含有するマイクロ遠心分離管に加えて、更なる血小板活性化を阻害した。これらの管を１９００×ｇにより４℃で３０分間回転して、血小板をペレット化した。上清（血小板血漿）を、血小板活性化マーカーのＰＦ−４及びＮａｐ−２の存在を試験するＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０１３６】
血小板接着
ＰＲＰを、コラーゲン／処理剤で被覆したプレートのウエルから除去した後、ウエルを、２００rpmで振とうしながら、０．９％ＮａＣｌで５分間ずつ３回すすいだ。血小板接着を、比色的に定量化するか又は蛍光的に可視化した。
【０１３７】
比色アッセイ
０．１％のトリトンＸ−１００及び１mg/mLのｐ−ニトロフェニルリン酸を含有する１４０μLのクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（０．１M、ｐＨ５．４）を、各ウエルに加えた。バックグラウンド吸光度を４０５nmで測定した。次にプレートを、２００rmで振とうしながら、室温で４０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００は、細胞に孔を開けるので、ｐ−ニトロフェニルリン酸が血小板の酸性ホスファターゼと相互作用して、ｐ−ニトロフェノールを生成することを可能にする。４０分間のインキュベーションの後、１００μLの２M ＮａＯＨを各ウエルに加えた。ｐＨの変化は、酸性ホスファターゼを不活性化することにより反応を停止させ、また、ｐ−ニトロフェノールを光学的に活性な化合物に変換する。次に吸光度を４０５nmで読み取り、接着した血小板の数と相関させた。結果を図４１に示す。
【０１３８】
蛍光アッセイ
接着血小板を、４％パラホルムアルデヒドと共に室温で１０分間インキュベートすることにより固定した。血小板に０．１％トリトンＸ−１００を５分間浸透させた。血小板アクチンを、１％ＢＳＡを含有するファロイジン−AlexaFluor 488（Invitrogen）と共に３０分間インキュベートすることにより標識した。ウエルを、１×ＰＢＳで３回すすぎ、接着血小板を、ＤＡＰＩフィルターを使用する直立型蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【０１３９】
結果については図４２〜５２を参照すること。未処理コラーゲン表面上の血小板の凝集は、集塊した血小板によりもたらされるぼやけた像により示されている。理論に束縛されることなく、ｚ方向（プレート表面に対して垂直）での血小板の集塊は、一焦点面において像をとらえることを妨げると考えられる。処理済みの表面では、低減された血小板凝集は、集塊の減少（ｚ方向でのより少ない血小板）をもたらし、焦点の合った像をプレート表面においてとらえることができる。これらの画像は、合成ペプチドグリカンがコラーゲンへの血小板細胞の接着を低減することを示す。
【０１４０】
血小板活性化マーカーの検出
血小板のペレット化により得られた上清（血小板血漿）を使用して、放出された活性化因子を決定した。血小板因子４（ＰＦ−４）及びβ−トロンボグロブリン（Ｎａｐ−２）は、血小板活性化により放出される血小板のアルファ顆粒内に含有されている２つのタンパク質である。それぞれのタンパク質を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを利用した。両方のサンドイッチＥＬＩＳＡの構成要素を（R&D Systems）から購入し、提供されたプロトコールに従った。値が直線範囲内になるように、血小板血漿の試料は、１×ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：１０，０００〜１：４０，０００に希釈した。図３９及び４０に示されている結果は、合成ペプチドグリカンによる処理が、コラーゲンＩによる血小板の活性化を減少させることを示す。
【０１４１】
〔実施例３７〕
ＩＩＩ型及びＩ型コラーゲンに対する血小板結合及び血小板活性化の阻害
実施例３６の方法に以下の変更を加えたものを使用した。
【０１４２】
マイクロプレートの調製
Ｉ型コラーゲン（ラット尾コラーゲン、BD Biosciences）及びＩＩＩ型コラーゲン（Millipore）を、氷上でＮａＯＨ、１×ＰＢＳ及び１０×ＰＢＳと混合して、生理学的条件にした。総コラーゲン濃度は、７０％のＩ型コラーゲンと３０％のＩＩＩ型コラーゲンの１mg/mLであった。３０μLのコラーゲン溶液を、９６ウエルプレートの各ウエルにピペットで加えた。プレートを加湿インキュベーターにより３７℃で１時間インキュベートして、原線維コラーゲンから構成されるゲルをウエル中で形成させた。ウエルを１×ＰＢＳで３回すすいだ。
【０１４３】
ペプチドグリカンを１×ＰＢＳにより２５μMの濃度に希釈し、５０μLの溶液をコラーゲン被覆ウエルに加えた。対照のＧＡＧ、ペプチド又はＰＢＳも、対照としてコラーゲン被覆ウエルに加えた。ペプチドグリカン又はペプチドの組み合わせは、１×ＰＢＳ中の２５μMの各分子から構成された。処理剤を、２００rpmで３０分間振とうしながら、３７℃でインキュベートした。次にウエルを、１×ＰＢＳにより３回すすいだ（２００rpmの振とうによる１０分間のすすぎで未結合の処理剤分子を除去することを含む）。
【０１４４】
図５４に示されている血小板活性化阻害測定の結果は、合成ペプチドグリカンが、Ｉ型とＩＩＩ型のコラーゲン混合物による血小板細胞の活性化を阻害することを実証する。
【０１４５】
図５５に示されている結果は、ペプチドグリカンが、Ｉ型とＩＩＩ型のコラーゲン混合物への血小板細胞の結合を阻害することを実証する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンマトリックスとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンとを含む改変コラーゲンマトリックス。
【請求項２】
コラーゲンが架橋されている、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項３】
コラーゲンが非架橋である、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項４】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、コラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカン又はタンパク質のアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性を有する、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項５】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、コラーゲン原線維形成を調節しないコラーゲン結合性タンパク質の一部とのアミノ酸相同性を有する、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項６】
外来性細胞集団を更に含む、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項７】
外来性細胞集団が、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、前駆細胞、多能性前駆細胞、グリア細胞、滑膜細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、幹細胞、及び骨形成原細胞からなる群より選択される、請求項６記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項８】
少なくとも１つの多糖を更に含む、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項９】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：ＰｎＧｘの化合物であって、式中、ｎが１〜１０であり、
ｘが１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１０】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１１】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１２】
グリカンがグリコサミノグリカンである、請求項９、１０又は１１に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１３】
合成ペプチドが、小型ロイシンリッチプロテオグリカン又は血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１４】
合成ペプチドが、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１５】
ペプチドが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１６】
グリカンが、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１７】
グリカンが、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１８】
改変コラーゲンマトリックスを調製する方法であって、
コラーゲン溶液を提供する工程；
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程；及び
コラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程
を含む方法。
【請求項１９】
コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
コラーゲン溶液中のコラーゲンの量が、約０．４mg/mL〜約６mg/mLである、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比が、約１：１〜約４０：１である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：ＰｎＧｘの化合物であって、式中、
ｎが１〜１０であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
グリカンがグリコサミノグリカン又は多糖である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ｎが１〜１０であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：ＰｎＧｘの化合物。
【請求項２７】
ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物。
【請求項２８】
ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物。
【請求項２９】
グリカンがグリコサミノグリカン又は多糖である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
合成ペプチドが、小型ロイシンリッチプロテオグリカン又は血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
合成ペプチドが、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
ペプチドが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
グリカンが、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択される、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
グリカンが、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３５】
リンカーが、式：−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮ＝を含む、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
改変コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変更する方法であって、
コラーゲン溶液を提供する工程；
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程；
コラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、変更された改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程
を含む方法。
【請求項３７】
コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物である、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
コラーゲン溶液中のコラーゲンの量が、約０．４mg/mL〜約６mg/mLである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比が、約１：１〜約４０：１である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜５又は８〜１７のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックスを含むキット。
【請求項４２】
改変コラーゲンマトリックスが滅菌されている、請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
細胞を更に含む、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４４】
細胞が、フラスコ、アンプル、バイアル、チューブ又はボトルの中にある、請求項４３記載のキット。
【請求項４５】
細胞がプレート上にある、請求項４３記載のキット。
【請求項４６】
容器の中にある、請求項４１記載のキット。
【請求項４７】
細胞が、前駆細胞、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、グリア細胞、滑膜細胞、中皮細胞、軟骨細胞、腱細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞からなる群より選択される、請求項４３記載のキット。
【請求項４８】
請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物を含む、請求項４１記載のキット。
【請求項４９】
使用説明書を更に含む、請求項４１記載のキット。
【請求項５０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックスを含む改変グラフト作成物。
【請求項５１】
請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤若しくは希釈剤又はその組み合わせとを含む組成物。
【請求項５２】
局所使用に適合された形態の、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
局所用形態が、粉末剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、プラスター剤、及び局所液剤からなる群より選択される、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
非経口投与に適合された、請求項５１記載の組成物。
【請求項５５】
非経口投与が、静脈内又は動脈内への投与である、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
血小板の活性を阻害する方法であって、
コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、血小板の活性が阻害されている、方法。
【請求項５７】
ペプチドグリカンのグリカン成分が、ヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ペプチドグリカンのペプチド成分が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
ペプチドグリカンのペプチド成分が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６項記載の方法。
【請求項６０】
コラーゲンへの血小板の接着を阻害する方法であって、
コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、コラーゲンへの血小板の接着が阻害されている、方法。
【請求項６１】
ペプチドグリカンのグリカン成分が、ヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ペプチドグリカンのペプチド構成要素が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項１】
コラーゲンマトリックスとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンとを含む改変コラーゲンマトリックス。
【請求項２】
コラーゲンが架橋されている、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項３】
コラーゲンが非架橋である、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項４】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、コラーゲン原線維形成を調節するプロテオグリカン又はタンパク質のアミノ酸配列の一部とのアミノ酸相同性を有する、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項５】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、コラーゲン原線維形成を調節しないコラーゲン結合性タンパク質の一部とのアミノ酸相同性を有する、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項６】
外来性細胞集団を更に含む、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項７】
外来性細胞集団が、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、前駆細胞、多能性前駆細胞、グリア細胞、滑膜細胞、中胚葉誘導細胞、中皮細胞、幹細胞、及び骨形成原細胞からなる群より選択される、請求項６記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項８】
少なくとも１つの多糖を更に含む、請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項９】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：ＰｎＧｘの化合物であって、式中、ｎが１〜１０であり、
ｘが１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１０】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１１】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１２】
グリカンがグリコサミノグリカンである、請求項９、１０又は１１に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１３】
合成ペプチドが、小型ロイシンリッチプロテオグリカン又は血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１４】
合成ペプチドが、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１５】
ペプチドが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１６】
グリカンが、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１７】
グリカンが、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックス。
【請求項１８】
改変コラーゲンマトリックスを調製する方法であって、
コラーゲン溶液を提供する工程；
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程；及び
コラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程
を含む方法。
【請求項１９】
コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
コラーゲン溶液中のコラーゲンの量が、約０．４mg/mL〜約６mg/mLである、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比が、約１：１〜約４０：１である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：ＰｎＧｘの化合物であって、式中、
ｎが１〜１０であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物であって、式中、ｎが１〜５であり、
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
グリカンがグリコサミノグリカン又は多糖である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ｎが１〜１０であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：ＰｎＧｘの化合物。
【請求項２７】
ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：（ＰｎＬ）ｘＧの化合物。
【請求項２８】
ｎが１〜５であり；
ｘが、１〜１０であり；
Ｐが、コラーゲン結合ドメインの配列を含む約５〜約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
Ｌがリンカーであり；そして
Ｇがグリカンである、
式：Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物。
【請求項２９】
グリカンがグリコサミノグリカン又は多糖である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
合成ペプチドが、小型ロイシンリッチプロテオグリカン又は血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
合成ペプチドが、血小板コラーゲンレセプター配列のアミノ酸配列とのアミノ酸相同性を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
ペプチドが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
グリカンが、アルギン酸塩、アガロース、デキストラン、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、及びヒアルロナンからなる群より選択される、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
グリカンが、デルマタン硫酸、デキストラン、及びヘパリンからなる群より選択される、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３５】
リンカーが、式：−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮ＝を含む、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
改変コラーゲンマトリックスの構造又は機械的特性を変更する方法であって、
コラーゲン溶液を提供する工程；
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程；
コラーゲンをコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンの存在下で重合して、変更された改変コラーゲンマトリックスを形成させる工程
を含む方法。
【請求項３７】
コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンが、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物である、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
コラーゲン溶液中のコラーゲンの量が、約０．４mg/mL〜約６mg/mLである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
コラーゲンとコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンのモル比が、約１：１〜約４０：１である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜５又は８〜１７のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックスを含むキット。
【請求項４２】
改変コラーゲンマトリックスが滅菌されている、請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
細胞を更に含む、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４４】
細胞が、フラスコ、アンプル、バイアル、チューブ又はボトルの中にある、請求項４３記載のキット。
【請求項４５】
細胞がプレート上にある、請求項４３記載のキット。
【請求項４６】
容器の中にある、請求項４１記載のキット。
【請求項４７】
細胞が、前駆細胞、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、グリア細胞、滑膜細胞、中皮細胞、軟骨細胞、腱細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞からなる群より選択される、請求項４３記載のキット。
【請求項４８】
請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物を含む、請求項４１記載のキット。
【請求項４９】
使用説明書を更に含む、請求項４１記載のキット。
【請求項５０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の改変コラーゲンマトリックスを含む改変グラフト作成物。
【請求項５１】
請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤若しくは希釈剤又はその組み合わせとを含む組成物。
【請求項５２】
局所使用に適合された形態の、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
局所用形態が、粉末剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、プラスター剤、及び局所液剤からなる群より選択される、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
非経口投与に適合された、請求項５１記載の組成物。
【請求項５５】
非経口投与が、静脈内又は動脈内への投与である、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
血小板の活性を阻害する方法であって、
コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、血小板の活性が阻害されている、方法。
【請求項５７】
ペプチドグリカンのグリカン成分が、ヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ペプチドグリカンのペプチド成分が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
ペプチドグリカンのペプチド成分が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲＧＣ、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭＧＣ、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱＧＣ、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ、ＴＫＫＴＬＲＴＧＣ、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭＧＣ、ＳＱＮＰＶＱＰＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＧＣ、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴ、ＫＥＬＮＬＶＹＴＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６項記載の方法。
【請求項６０】
コラーゲンへの血小板の接着を阻害する方法であって、
コラーゲンに接触するコラーゲン結合性合成ペプチドグリカンを提供する工程を含み、ここで、コラーゲン結合性合成ペプチドグリカンがコラーゲンに結合し、コラーゲンへの血小板の接着が阻害されている、方法。
【請求項６１】
ペプチドグリカンのグリカン成分が、ヒアルロナン、ヘパリン、及びデキストランからなる群より選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ペプチドグリカンのペプチド構成要素が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ、及びＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＧＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６０記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０ａ】
【図２０ｂ】
【図２０ｃ】
【図２０ｄ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０ａ】
【図２０ｂ】
【図２０ｃ】
【図２０ｄ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【公表番号】特表２０１１−５１５４９９（Ｐ２０１１−５１５４９９Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２１０７（Ｐ２０１１−５０２１０７）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０９９５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０９９５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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